Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение состояния фотосинтетического аппарата с помощью метода индукции флуоресценции хлорофилла

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение состояния фотосинтетического аппарата с помощью метода индукции флуоресценции хлорофилла"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

Корнєєв Дмитро Юрійович

УДК 581.132

ВИВЧЕННЯ СТАНУ ФОТОСИНТЕТИЧНОГО АПАРАТУ ЗА ДОПОМОГОЮ МЕТОДУ ІНДУКЦІЇ ФЛУОРЕСЦЕНЦІЇ

ХЛОРОФІЛУ

03.00.12 - фізіологія рослин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1997

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор Кочубей Світлана Михайлівна Інститут фізіології рослин і генетики НАН України зав. відділом

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук, професор Сіренко Лідія Якимівна,

Інститут гідробіології НАН України головний науковий співробітник

кандидат біологічних наук Китаєв Олег Ігоревич Інститут садівництва УААН старший науковий співробітник

Провідна установа - Національний університет ім. Тараса Шевченка,

біологічний факультет, Міністерство освіти України, м.

Захист відбудеться 25 грудня 1997 р. о 10 годині на засц спеціалізованої вченої ради Д 50.09.01 при Інституті фізіології рослин і гене НАН України за адресою: 252022, Київ-22, вул. Васильківська 31/17

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології рої

і генетики НАН України, Київ, вул. Васильківська 31/17

Автореферат розісланий * 2.0 " листопаді 1997 р

Вчений секретар спеціалізованої ради

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми.

Дослідження стану фотосинтетичного апарату (ФСА), його змін у відповідь на »акторів зовнішнього середовища та відмінностей, обумовлених особливостями ипу фотосингезуючих об'єктів, є важливим завданням фізіології рослин. Одним з гивних методів, що використовуються для вирішення цього завдання, є запис їх індукції флуоресценції хлорофілу (ІФХ). Він належить до непошкоджуючих вних) методів, відрізняється високою чутливістю до змін фізіологічного стану ін та дозволяє стежити за фізіологічними процесами в Тх динаміці. Велике ння для успішного використання методу має подальше удосконалення існуючих >зробка нових методичних підходів до аналізу стану фотосинтетичного апарату на

іі вивчення кривих ІФХ. Дана дисертаційна робота присвячена, головним чином, цій проблемі.

В ході роботи були виконані також експерименти, в яких вивчали ряд інших пьних питань, що стосуються проблем гетерогенності фотосистеми 2 (ФС2), змін ФСА за умов фосфорилування мембранних білків хлоропластів або при дії іиятливих факторів навколишнього середовища. Це дозволило певною мірою лрити уявлення про початкові фази розвитку різних типів стресу на рівні рон-транспортного ланцюга, а також розробити підходи, за допомогою яких з оцінювати чутливість генотипів до цих стресів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Роботу виконано в рамках тематики відділу біохімії фотосинтезу (програми ментальних досліджень ‘Вивчити регуляторну роль мембранних фосфопротеїнів пластів у зв’язку з направленістю первинного процесу фотосинтезу", № авної реєстрації 01.85.0.013470; “Вивчити особливості регуляції фотосинтетич-іпарату у С3 та С4-рослин у різних умовах вирощування”, 2.28.6) а також проектів (“Дослідження регуляторної функції світлозбираючого комплексу фотосинтетич-апарату вищих рослин", реєстраційний № 5.1/166, “Вивчення ролі гліколатного у в регуляції фотосинтетичного метаболізму вуглецю в клітинах СЗ-рослин", № “Регуляція взаємозв'язку світлових процесів і вуглецевого метаболізму в :интезуючих клітинах: роль мембранних фосфопротеТнів", No 5.2/38; “Досліджен-зємозв'язку регенераційної здібності культури клітин in vitro із сформованістю та ністю фотосинтетичного апарату", № 5.3/263, “Дослідження гетерогенності ізації і функціонування фотосистеми 1 в мембранах СЗ-рослин", № 5.4/69}

Мета і задачі дослідження.

Метою даної роботи було розробити нові підходи до аналізу стану ФО допомогою методу ІФХ та використати ці підходи у вивченні змін організації ФС об'єктах різного рівня складності під впливом модифікацій умов навколишн середовища та в залежності від генотипу рослин.

У зв'язку з цим були поставлені такі задачі:

1) розробити нові параметри на основі кривих ІФХ для отримання інформації про < ФСА;

2) використовуючи субхлоропластні фрагменти, вивчити стан ФС2 в різних діпя тилакоїдної мембрани та його зміни у контактуючих зі стромою зонах тилакоі мембрани в результаті фосфорилування мембранних білив хлоропластів підвищення температури вирощування;

3) провести дослідження змін стану ФСА у хлоропластах внаслідок фосфорилу» мембранних білків хлоропластів, а також збільшення або зменшення темперам навколишнього середовища, зниження рівня освітленості;

4) дослідити залежність параметрів кривої ІФХ від регенераційної здатності калусі наявності ядерно-цитоплазматичної несумісності у цибридних рослин;

5) вивчити вплив варіацій складу атмосфери під час освітлення листків світлом вис інтенсивності на стан ФСА проростків пшениці різних за посухостійкістю сортів.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше показано, що при фосфорилуванні мембранних протеїнів здійснюс міграція комплексів ФС2 з СЗЬ-відновлюючими реакційними центрами на діл? тилакоїдів, що експоновані у строму. Показано, що вони здатні транспорту! електрони до ФС1. Це явище спостерігалось для гороху та кукурудзи, я» представниками С3 та С4-рослин.

Вперше за допомогою методу ІФХ встановлено, що ОЬ-відновлюючі комгии ФС2, які розташовані на крайових (маргінальних) ділянках гранальних тилакоі мають менший розмір світлозбираючої антени, ніж ті, що розташовані у внутрії ділянках.

Вперше показано, що відхилення температури вирощування рослин оптимальної (як її збільшення, так і зменшення) викликає зростання частки невідновлюючих комплексів ФС2 в мембранах хлоропластів.

Вперше встановлено, що неповний розвиток ФСА в калусній тканині кукуру призводить до підвищення частки ОЬ-невідновлюючих комплексів ФС2. Аналогіч наслідок викликається наявністю ядерно-цитоплазматичної несумісності у цибрия рослин томату.

з

Практичне значення одержаних результатів.

Запропоновані нові параметри для тестування стану ФСА, які базуються на іхунку похідних від кривих ІФХ. Розроблені процедури оцінки ефективного ру свгтлозбираючої антени ОЬ-відновлюючих комплексів ФС2 та середньої хлі акцепторів електронів, яка припадає на один реакційний центр цих тексів. Показано, що параметр (Рр!-Ро)/Р/, який використовують для визначення сної кількості ОЬ-невідновлюючих комплексів ФС2, може бути використаний для вання наявності стресового навантаження та для відбору генотипів, стійких до дії х стресів.

Особистий внесок здобувача.

Дисертант особисто проробив відповідну літературу та оволодів необхідними іами досліджень, приймав участь у плануванні дослідів, підготовці матеріалів до Експериментальні криві ІФХ та результати їх аналізу, які наведені в зтаційній роботі, одержані здобувачем самостійно.

Апробація результатів дисертації.

Основні результати роботи були представлені на V та VI конференціях молодих їх "Актуальні проблеми фізіології рослин та генетики" (Київ, 1992 та 1996), II українського товариства фізіологів рослин (Київ, 1993), конференції молодих їх та спеціалістів ’Наукові основи ведення сільського господарства в сучасних їх” (Чабани, 1994), І з'їзді українського біофізичного товариства (Київ,- 1994), іродній нараді ‘Актуальні питання фізіології рослин в аспекті екологічних проблем ни” (Чернівці, 1995), міжнародній конференції ‘Біоенергетика фотосинтезу” но, 1996), XX Конгресі федерації Европейських товариств фізіологів рослин зенція, 1996), VI молодіжній конференції ботаніків (Санкт-Петербург, 1997), III ззіумі Російського товариства фізіологів рослин “Фізико-хімічні основи фізіології ін та біотехнологія” (Москва, 1997).

Публікації.

Результати дисертації опубліковані в 4 статтях у наукових журналах та в 15 тезах зренцій.

Структура дисертації.

Дисертація складається із вступу, 5 розділів основної частини, висновків, списку >истаних джерел, який включає 178 найменувань. Робота викладена на 173 іках друкованого тексту, містить 20 ілюстрацій та 12 таблиць.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Рослини гороху (Pisum sativum L) сорту Рапорт, кукурудзи (Zea mays) інбре, ліній П340 та F7, пшениці (Triticum tungidum L, Triticum dicoccum Shuebl., ряд a Triticum aestivum L) вирощували на вегетаційній площадці в посудинах, наповн грунтом та піском у співвідношенні 2:1, при середній інтенсивності світла в деі період 300 Вт/м2 та температурі 12-25°С. В окремих дослідах рослини го вирощували при температурах 15°С та 28°С в кліматичних камерах ВК (інтенсивність світла ЗО Вт/м2).

Калу сні тканини кукурудзи (Zea mays L) ліній П346, П502, С455 були отри від Т.М.Чеченевої (відділ цитогенетики ІФРГ НАН України). Рослини то (Lycopersicon esculentum сорту Quedlinburger Früne Libe, L peruvianum var. dent лінії 3767 та їх цитоплазматичний гибрид клона 1C, який мав геном L esculentum та плазмагени L. peruvianum var. dentatum Dun.) були надані А.С.Кочевенко (ві клітинної селекції Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України).

Для отримання хлоропластів використовували листки середнього ярусі тижневих проростків гороху. Хлоропласти другого класу виділяли за методі (Островська та інш.,1975). Середовище виділення складалось із 40-50 мМ трицино (NaOH, pH 7,5) або фосфатного (pH 7,8) буферу, 0,4 М сахарози та 5 мМ МдСІ2.

Фосфорилування мембранних білків хлоропластів в аеробних умовах прово; в середовищі, яке містило 0,1 мМ сахарози, 5 мМ MgCfe, 10 мМ NaCI, 10 мМ триї NaOH (pH 7,5), 0,2 мМ АТФ та 10 ммоль/л NaF (інгибітор фосфатази) при освітл білим світлом (70 Вт/м2) на протязі 15 хвилин. При анаеробному фосфорилувань реакційної суміші додавали 20 мМ глюкози та 2 мг/мл глюкозооксидази.

Субхлоропластні фрагменти отримували шляхом дигітонінової фрагментац послідовного центрифугування. Використовували осади при 20 ОООхд, 70 000х 100 ОООхд - фракції Фр1, Фр2 та ФрЗ, відповідно. В дослідах з фосфорилуванням < при 100 ОООхд одержували з супернатанту після 20 ОООхд. Час центрифугування всіх фракцій - ЗО хвилин.

Експозицію на світлі високої інтенсивності проводили, використав) невідокремлені від рослин пшениці листки, розміщуючи їх у термостатов плексигласових камерах з різним складом атмосфери.

Кінетичні зміни флуоресценції записували на однопроменевій устані Флуоресценцію збуджували випромінюванням ртутної дугової лампи ДРШ-250-2, пропускали крізь фотозатвор (час відкриття - 3 мс), синьо-зелений фільтр СЗС-кювегу з 2% розчином C11SO4. Флуоресценцію фіксували за допомогою монохрома МДР-2 на довжині хвилі 685 нм. Сигнал від фотопомножувача ФЕП-79 подавал

л’ятовуючий осцилограф С8-13 або через аналого-цифровий перетворювач на И (максимальна частота запису даних дорівнювала 9,09 кГц).

Для здійснення комп’ютерного визначення параметрів кривих ІФХ були облені способи математичної обробки експериментальних даних. Момент гнення рівня Ро визначали за допомогою мінімуму другої похідної (рис.1). ення РрІ визначали як рівень сигналу у момент часу, який відповідав першому уму на графіку першої похідної (рис.2). Використання похідних для аналізу кривих дозволило ввести нові параметри - часові інтервали від початку освітлення до и другого максимуму (Тгтахіа)' другого Огтіпіа) Та третього (Т3тіпій) мінімумів рафіку першої похідної (див.рис.2 та рис.З). Ці екстремуми відповідають ільшим швидкостям зміни флуоресценції під час основних індукційних переходів.

Іфл., відн. од.

Рис.1 Крива ІФХ хлоропластів гороху (1) та графік другої похідної від неї (2).

Іфл., відн. од.

¿Іфл./сіі, відн. од.

- 6

з

Рис.2 Крива ІФХ листка кукурудзи (1) та графік першої похідної від неї (2). Тривалість темнової

адаптації - 15 хвилин.

Інтенсивність ДІЮЧОГО

темнової

І

2

світла- 15 Вт/м .

"^2тахісі

Рис.З Крива по фази ІФХ листка кук (1) та графік і похідної від неї Інтенсивність і світла - 45 Вт/м2 .

ІНДУКЦІЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦІЇ СУБХЛОРОПЛАСТНИХ ФРАГМЕНТІВ

Були вивчені криві ІФХ субхлоропластних фрагментів, які походили з різних /: нок тилакоїдної мембрани. Для фракції, яка містила фрагменти гранальних тнпакс (Фр1), було характерне найбільше значення нормованої варіабельної флуороецї (Ру/Ятах), порівняно з іншими фракціями (рис.4 Та табл.1), що свідчить про біль вміст комплексів ФС2 у Фр1. Найбільше зниження величини параметру Ру/Впах у і сутності акцептору електронів з ФС1 (метилвіологену), яке спостерігали для с вказує на те, що комплекси ФС2 в цьому випадку мали найбільш ефективний ф ціонзіїьний зв’язок з ФС1, який здійснювався через транспорт електронів. Фракції різнялись за вмістом ОЬ-невідновлюючих комплексів ФС2, відносну кількість яких (¡¡овали за допомогою параметру (РрІ-Ро)/пл Зауважимо, що експоненційне зрості рівня флуоресценції від Ро до РрІ пов’язують з відновленням Оа в ОЬ-песідновлюя комплексах ФС2, а сигмоїдальну фазу (від РрІ до Рітшх) - з відновленням Оа в відновлюючих комплексах ФС2. У Випадку ФрЗ майже всі комплекси ФС2 були невідновлюючимй, про що свідчить форма кривих ІФХ цих фрагментів (див. рис.4).

Середню кількість акцепторів електронів на один ОЬ-відновлюючий комп ФС2 розраховували за допомогою модифікованої методики Занкеля та Кока (15 згідно з якої середній розмір пулу акцепторів для всіх комплексів ФС2, без врахуа Іа здатності відновлювати ОЬ, дорівнює величині співвідношення між площами кривими ІФХ у відсутності та присутності діурону (параметр Н). Була введена попр для врахування вмісту ОЬ-невідновлюючих. комплексів ФС2, для яких Я=1. Величи для зразків, в яких містяться як ОЬ-відновлюючі, так і ОЬ-невідновлюючі компл

Рис.4. Криві ІФХ субхлоро-пластних фрагментів (А), нормовані за рівнем Ро. Інтенсивність діючого світла - 5 Вт/м2

Таблиця 1.

Параметри кривих ІФХ субхлоропластиих фрагментів, отриманих після гітоніновоі фрагментації хлоропластів гороху. Наведені середні арифметичні з 3-5 зпериментів та стандартні похибки. Інтенсивність діючого світла - 5 Вт/м2

Параметри Фракції субхлоропластних фрагменів Хлоропласти

кривої ІФХ Фр1 Фр2 ФрЗ •

Ру/Ртах (-МВ) 0,77+0,02 0,55+0,11 0,23±0,05 0,78+0,01

Ру/Ртах (-мв) - (+МБ) .100% (-МВ) 2+1 14±4 9±3 10+4

(РрІ-Ро)/Ру 0,17+0,02 0,49+0,11 0,93±0,15 0,15+0,02

Я 11,2+1,3 6,9+2,5 1,3+0,4 21,9+2,4

X 13,3+1,4 12,6+2,7 - 25,6±2,5

Т2тах1сІ- с 0,20±0,04 0,63±0,07 - 0,21±0,02

мтої:

В - метилвіологек.

ередні арифметичні співвідношень величин параметру ру/ртах у присутності та утності метилвіологену були розраховані для кожного досліду окремо, а кривих ІФХ ФрЗ сигмоїдальна фаза у більшості випадків була відсутня, тому іметри Тгтахісі та X не визначали.

ФС2 можна виразити за допомогою рівняння: R=(Fpl-Fo)/Fv+X(1-(Fpl-Fo)/Fv), де кількість акцепторів, що припадають на один Qb-відновлюючий комплекс ФС2. ' X=(R-(Fpl-Fo)/Fv)/(1-(Fpl-Fo)/Fv). Як видно з табл.1, значення параметру X для Фр Фр2 майже однакові, тобто, Qb-відновлюючі комплекси ФС2, які містяться в фракціях, не відрізняються за розміром пулу акцепторів, з яким вони взаємодіють.

Параметр T2maxid характеризує швидкість зростання флуоресценції сигмоїдальній ділянці кривої ІФХ, що залежить від розмірів як пулу акцепторів, і саітлозбираючої антени Qb-відновлюючих комплексів ФС2. Оскільки параметр X допомогою якого оцінювали пул акцепторів для Qb-відновлюючих комплексів ФС2, однаковий для Фрі та Фр2, різниця у значеннях параметру для цих фра

може бути обумовлена розмірами світлозбираючої антени Qb-відновлюк комплексів, яка була більшою у випадку Фр1, про що свідчить менша величина І2т (див. табл.1).

Перевірка цього висновку була проведена шляхом використання розроблеї нами способу порівняльної оцінки ефективного розміру світлозбираючої антени відновлюючих комплексів ФС2. Вивчали залежність величини 1/T2maxld ВІД інгені ності діючого світла (Ісв) (рис.5). Величина коефіцієнту, яка визначає кут на: прямої l/TanaxId^O08) і залежить від розмірів світлозбираючої антени, була більї для Фр1, порівняно з Фр2, що відповідає більшим розмірам світлозбираючої ані Qb-відновлюючих комплексів ФС2, які містились в цій фракції.

Субхлоропластні частинки з ФрЗ були ідентифіковані як фрагм( міжгранальних тилакоїдів, тому що комплекси ФС2, які в них містились були Qb-неі

Рис.5. Залежність величини парам 1 Агтахісі В'Д інтенсивності діючого сі для кривих ІФХ фракцій Фр1 та Фр2. Рівняння екстраполяційних прямих:

1/T2max1d=0,260+0,350 Ісв для Фр1;

l/T2max1d=0,627+0,022 Ісв для Фр2.

(г2=0,96)

(г =0,99)

юючими, що характерно саме для міжгранальних тилакоїдів (Непгузэоп, БипсіЬу, Ю). Оскільки характеристики комплексів ФС2 для Фр2 відрізнялись від таких для

1 (гранальних тилакоїдів) та ФрЗ, ці частинки було ідентифіковано як фрагменти ійових (маргінальних) ділянок гранальних тилакоїдів.

Були вивчені зміни параметрів кривих ІФХ фрагментів хлоропластів, обумовлені сфорилуванням мембранних білків хлоропластів гороху та впливом підвищеної іператури вирощування рослин (табл.2). В дослідах використовували фрагменти хранальних тилакоїдів та крайових ділянок гранальних тилакоїдів. Помічено, ці агменти, отримані з хлоропластів рослин, які вирощувались при підвищеній •пературі, мали більший загальний вміст комплексів ФС2 порівняно з контрольним йантом, при цьому частка ОЬ-відновлюючих ФС2 також збільшувалась. Зміни «метрів кривих ІФХ для двох варіантів фосфорилування свідчать про збільшення сту ФС2, головним чином тих, які здатні відновлювати ОЬ та підтримувати інспорт електронів на ФС1. Це може бути пояснено міграцією комплексів ФС2 з шми характеристиками до експонованих в строму ділянок тилакоїдних мембран за

Таблиця 2.

заметри індукційних кривих “легких" субхлоропластних фрагментів, отриманих з »ропластів гороху після процедури фосфорилування мембранних білків. Наведені зедні арифметичні з 3-6 біологічних повторностей та стандартні відхилення.

мпера-ра виро-/вання «лин Варіант досліду Параметри індукційної кривої

Ру/Ртах у відсутності метил віологену Ру/Ртах у присутності метилвіологену (РрІ-Ро)/РУ Я

15°С контроль 0,11+0,01 0,11±0,01 1,00+0,10 1,0+0,2

аеробне фосфорилування 0,18±0,01 0,13±0,02 0,72±0,10 1,9±0,4

анаеробне фосфорилування 0.21 ±0,01 0,13±0,02 0,62+0,08 2,3±0,4

28°С контроль 0,35±0,12 0,34±0,11 0,58+0,11 6,5±1,4

аеробне фосфорилування 0,47±0,10 0,4210,09 0,49+0,10 9,610,3

анаеробне фосфорилування 0,48±0,09 0,42±0,09 0,48±0,11 7,5±1,2

Примітка.

Значення (РрІ-Ро)/ТУ для варіанту з температурою вирощування рослин 15вС

розраховані як співвідношення величин параметру Ру/Ртах у присутності та

. 2 відсутності метилвюлогену. Інтенсивність діючого світла - 5 Вт/м

умов фосфорилування мембранних білків хлоропластів. Якщо фосфорилуваї здійснювали в анаеробних умовах, яй посилюють включення міченого фосфору білив комплексу ФС2 (Кочубей та інш., 1994), описані вище зміни параметрів кри ІФХ були більш помітними.

Подібні результати отримані для фрагментів крайових ділянок гранальї тилакоїдів з хлоропластів мезофілу кукурудзи (лінії Г1346 та ?7).

КРИВІ ІНДУКЦІЇ ФЛУОРЕСЦЕНЦІЇ ХЛОРОПЛАСТІВ

Було вивчено вплив фосфорилування мембранних білків на параметри кри ІФХ хлоропластів гороху та кукурудзи. За цих умов спостерігається зменшеї В^/Впах та збільшення (РрІ-Ро)/Вл Завдяки порівнянню світлових кривих параме 1Д2тахісІ індукційних кривих хлоропластів контрольного варіанту та варіанту анаеробним фосфорилуванням з’ясовано, що умови фосфорилування впливають ефективний розмір світлозбираючої антени ОЬ-відновлюючих ФС2, зменшуючи й (рис.6). Це підтверджує гіпотезу про відокремлення фосфорилованого СЗК2 від Ф яке може не супроводжуватись перетворенням ОЬ-відновлюючих комплексів ФС: ОЬ-невід новлюючі.

Вивчали зміни параметрів кривих ІФХ у відповідь на збільшення темпераг вирощування проростків гороху. Встановлено, що параметр (РрІ-Ро)Дл/ був в 1,3 р більшим у випадку, коли хлоропласти виділяли з рослин, вирощених при 28 порівняно з контролем (15°С). ■

Рис.6. Залежність величини параметру 1Д; від інтенсивності світла під час запису к індукції флуоресценції хлоропластів г Рівняння екстраполяційних прямих:

1А2та*1сі=1.06+3.48Ісв (^=0,90)

для контрольного варіанту,

1А2тах1<і=-0,03+1,09Ісв (Ґ^О.ВО) для варіанту з фосфорилуванням.

10-годинне витримування проростків кукурудзи, вирощених при 28°С, у

аттичних камерах при температурі 5°С також призводило до збільшення параметру Д,ослі/1, коит^ль

Роі/Рч. Співвідношення лвиїрвяь/давияд дорівнювало 1,8 для лінії П346 та 2,0 для Р7.

Зміни (РрІ-Ро)Дл/ при відхиленні температури вирощування від оптимальної, ють про збільшення вмісту ОЬ-невідновлюючих ФС2 в хлоропластах. Це може бути іовлено безпосереднім впливом несприятливих умов на здатність комплексів ФС2 жлювати ОЬ та (або) на функціонування реакцій циклу репарації ФС2, під час з відбувається перетворення ОЬ-невідновлючих комплексів ФС2 з пошкодженим >м 01 на ОЬ-відновлюючі.

Залєжность параметру ІДгтахІсІ ВІД інтенсивності діючого світла було ристано для вивчення змін розмірів світлозбираючої антени ОЬ-відновлюючих

з хлоропластів мезофілу кукурудзи лінії П346 за умов зниження рівня освітленості

. 2 2 вирощуванні рослин (300 Вт/м - контроль, 30 Вт/м - дослід). Співвідношення

. А^сліЛ.І

соефіціснтами, які визначають кути нахилу екстраполяційних прямих в квтфетп та

Мі

зді дорівнювало 1,4, тобто розмір світлозбираючої антени ОЬ-відновлюючих ФС2 ііиується при затіненні.

КРИВ! ІНДУКЦІЇ ФЛУОРЕСЦЕНЦІЇ НАТИВНИХ ОБ’ЄКТІВ

Проведено аналіз кривих ІФХ калусів кукурудзи. Для дослідів використовували гочки калусної тканини з рівномірним забарвленням (густо-зеленим для калусів С455 тз Л346 та слабко-зеленим для П502). Виявилось, що для ліній з високою

5) та середньою (П346) регенераційною здатністю величини параметрів [ були більші, а параметру (РрІ-Ро)Дл/ - менші, порівняно з лінією П502, яка мала ку регенераційну здатність та слабо розвинений фотосинтетичний апарат.

Встановлено, що криві ІФХ листків цибридних рослини томату з ознаками но-цитоплазматичної несумісності відрізнялись від кривих ІФХ листків ківських форм більшими значеннями параметру (РрІ-Ро)/Ру. Це свідчить про шення транспорту електронів від ФС2 до ФС1, вірогідно, за рахунок збільшення си ОЬ-невідновлюючих ФС2.

Вивчено вплив світла високої інтенсивності на стан ФСА рослин пшениці різних ¡в. Виявилось, що нові параметри, які базуються на розрахунку першої похідної від цінної кривої Палілій та Тз^-^), в ряді випадків були чутливими до змін стану »синтетичного апарату за цих умов. В дослідах з експозицією рослин на світлі кої інтенсивності при різній температурі та складі повітря навколо листка човлено, що відсутність С02 та 02 більше посилює пошкодження ФСА, ніж

відсутність одного лише СОг (табл.З). Це видно, головним чином, по зменшеї параметрів Fv/Fo. який відображує рівень фотохімічної активності ФС2, та Fp/Fl, залежить від ефективності реакцій темнової фази фотосинтезу. Параметри Vmax та (максимально можлива середня швидкість спаду інтенсивності флуоресценції мінімальний час індукції при максимально можливій середній швидкості сп флуоресценції, відповідно) характеризують здатність ФСА переходити із стан мінімальним фотосинтезом та максимальною флуоресценцією у стан з максималы фотосинтезом та певним стаціонарним рівнем флуоресценції (Нестеренко, Сіді 1993). Величина Vmax зменшувалась, a збільшувалась в результаті експозиції світлі високої інтенсивності, особливо за умов відсутності С02та О2 (див. табл.З).

Підвищення температури під час експозиції на світлі високої інтенсивності та спричиняло збільшення пошкодження ФСА проростків пшениці. При цьому реаі ФСА залежала від генотипу. Зменшення параметрів Fv/Fo та Fp/Ft у варіанта підвищеною температурою (35°С) та (або) без СО2 по відношенню до контрк (експозиція на світлі високої інтенсивності при звичайному складі повітря температурі 25°С) було більш помітним для кривих ІФХ листків рослин пшениці сс Білоцерківська 47 з низькою посухостійкістю, порівняно з Миронівською 808 Одеською 117 з середньою та високою посухостійкістю, відповідно (табл.4).

Таблиця З

Вплив складу атмосфери на параметри кривої ІФХ листків проростків пшеї (Triticum dicoccum L.) під час експозиції на протязі 2,5 годин на світлі інтенсивні 400 Вт/м2. Наведені середні з 3 біологічних повторностей та стандартні відхилеї Інтенсивність діючого світла - 100 В г/м2.

Варіант досліду Параметри кривої ІФХ

Fv/Fo Fp/Ft T2min1d> с T3min1d> с V си vmaxi ь ^min' с

До експозиції 1,06+0,24 4,2t0,3 7,5±0,7 40,0±2,8 0,01910,001 54,3+4

Після експозиції в звичайній атмосфері 0,96±0,01 4,6±0,5 7,0±0,1 38,0±1,1 0,018±0,001 55,9±2,і

Після експозиції в атмосфері без С02 0,79±0,13 4,0±0,4 5,5±0,7 21,5±2,1 0,017±0,002 58,7±7,-

Після експозиції в атмосфері без СО? та 02 0,08±0,01 1,7+0,3 22,5±3,5 92,5±3,5 0,00710,002 145,2±31

Таблиця 4.

ив складу повітря та температури навколишнього середовища на зміни параметрів

вої ІФХ листків проростків пшениці в результаті дії підвищеної інтенсивності

2 2 тлення (400 Вт/м на протязі 4 годин). Інтенсивність діючого світла - 100 Вт/м .

едені середні з 3 біологічних повторностей та стандартні відхилення.

Параметри Варіант досліду

Сорт кривої ІФХ Звичайне повітря Повітря без СОг

25°С 35°С 25°С 35°С

юцергівська 47 Р*/¥о 0,6010,02 0,3610,02 0,24±0,01 0,10+0,02

Рр/П 4,24±0,31 3,16+0,60 2,24+0,17 2,14+0,13

іронівська 808 Рч/Го 0.79Ю.01 0,61±0,07 0,09±0,01 0,1510,02

Ъ/п 3,9210,28 3,32+0,08 1,15±0,10 2,13±0,33

іеська 117 РуДчэ 0,45±0,01 0,47±0,07 0,16±0,01 0,1910,02

РрДЧ 3,4±0,36 3,53±0,50 1,79+0,10 1,9410,03

ВИСНОВКИ

1 .Фосфорилування мембранних білків хлоропластів гороху та кукурудзи

і водить до збільшення частки ОЬ-відновлюючих комплексів ФС2 на експонованих у •му ділянках тилакоїдних мембран, що може бути спричиненим латеральною ацією цих комплексів в умовах фосфорилування їх поліпептидів. •

2 Відхилення температури вирощування рослин від оптимальної (як її ьшення, так і зменшення) призводить до зростання частки ОЬ-невідновлюючих іпексів ФС2 в мембранах хлоропластів.

3. Неповний розвиток ФСА в калусних тканинах кукурудзи лінії П502 та наявність жо-цитоплазматичної несумісності в клітинах цибридних рослин томату юводжуються підвищенням величини параметру (РрІ-Ро)/Ру, який дає оцінку частки

{©ВІДНОВЛЮЮЧИХ КСМПЛ9КСІ8 ФС2.

4. Пошкодження ФСА, яке тестується по зменшенню параметрів Ру/Тю та Рр/ТЧ, є нльшим за відсутністю вуглекислого газу та кисню в навколишньому середовищі час експозиції рослин пшениці на світлі високої інтенсивності. Ступінь кодження зменшується за відсутністю одного лише вуглекислого газу та стає ще ним при нормальному складі атмосфери.

5. Ступінь пошкодження ФСА рослин пшениці в результаті дії світла високої їсивності в умовах підвищеної температури та відсутності вуглекислого газу жить від генотипу. Найбільше пошкодження ФСА спостерігається у рослин нищ чутливих до посухи сортів.

Список опублікованих основних праць за темою дисертації.

1. Кочубей С.М., Корнеев Д.Ю. Изменения вариабельной флуоресцени хлоропластов при фосфорилировании мембранных белков в анаэробных условиях Физиология растений.-1994.-№1.-С.21-23.

2. Стасик О.О., Корнеев Д.Ю. Вплив високотемпературного стресу та дефіщ COz на кінетику індукції флуоресценції хлорофілу в листках проростків різних посухостійкістю сортів озимої пшениці // Доп. НАН У країни.-1996.-№1.-С.107-109.

3. Кочевенко A.C., Ратушняк Я.И., Корнеев Д.Ю., Стасик О.О., Шевченко В. Кочубей С.М., Сидоров В.А. Параметры фотосинтетического аппарата ци плазматического гибрида культурного томата Lycopersicon esculentum хлоропластами L peruvianum var. dentatum // Доп. HAH України - 1997. -№2.-C.57-61

4. Корнеев Д.Ю. Использование производных для анализа индукционных крив флюоресценции хлорофилла // Физиология и биохимия культ, растений.-1997.-№ С.146-151.

5. Шевченко В.В., Корнеев Д.Ю., Дыкун М.О. Особенности формирован фотосинтетического аппарата в каяпусных тканях различных инбредных лин кукурузы // Тезисы докл. V конференции молодых ученых “Актуальные проблеї физиологии растений и генетики”,- Киев,- 1992.- С.7.

6. Корнеев Д.Ю. Аналіз форми кривих індукції флуоресценції хлорофілу допомогою розрахунку похідних // Тези доп. І з’їзду Укр. біофізичного товариств Київ.- 1994.-С. 125-126.

7. Порубльова Л.В., Корнеев Д.Ю. Вплив низької температури на сі фотосинтетичного апарату проростків кукурудзи різних генетичних ліній // Тези д< міжнародної наради “Актуальні питання фізіології рослин в аспекгі екологічі проблем України",- Чернівці.-1995.-С.44.

8. Куфрик Г.І., Корнеев Д.Ю., Шевченко В.В. Вивчення впливу фосфорилуват мембранних білків на флуоресцентні характеристики субхлоропластних фрагмен кукурудзи // Тези доп. VI конференції молодих вчених "Актуальні проблеми фізіол< рослин і генетики". -Київ.-1996. -С.11-12.

9. Корнеев Д.Ю., Порублева Л.В., Шевченко В.В. Исследование состоян фотосистемы 2 в субхлоропластных фрагментах, выделенных из разных участе тмлакоидньїх мембран // Тезисы докл. VI конференции молодых ученых "Акгуальн проблемы физиологии растений и генетики’. - Киев,- 1996. -С.14-16.

10. Корнеев Д.Ю. Изменение функционального состояния фотосистемы 2 различных участках мембранной системы хлоропластов гороха (Pisum sativum) п

ышении температуры выращивания // Тезисы докл. VI молодежной конференции іников,- Санкт-Петербург,- 1997.-С.55.

11. Корнеев Д.Ю., Порублева Л.В., Сктник С.К. Оценка размеров

гособирающей антенны ОЬ-восстанавливающих ФС2 в различных

слоропластных частицах // Тезисы докл. III симпозиума Российского общества иологов растений 'Физико-химические основы физиологии растений и технология’. - Москва.- 1997.-С.23.

Корнеев Д.Ю. Вивчення стану фотосинтетичного апарату за допомогою методу кції флуоресценції хлорофілу.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за ііальністю 03.00.12 - фізіологія рослин.- Інститут фізіології рослин та генетики НАН іїни, Київ, 1997.

Дисертацію присвячено розробці нових підходів до вивчення стану синтетичного апарату з використанням методу індукції флуоресценції хлорофілу, юпоновані нові кінетичні параметри, визначення яких базується на розрахунку утих від індукційних кривих. Розроблені підходи до оцінки розмірів юзбираючої антени та пулу акцепторів для ОЬ-відновлюючих комплексів хзистеми 2. Отримані характеристики функціонального стану фотосистеми 2 в лоропластних фрагментах, які походять з різних ділянок тилакоїдних мембран, ііджені зміни цих характеристик за умов фосфорилування мембранних білків опластів. Вивчено вплив несприятливих умов навколишнього середовища та зкгів біосинтезу на стан фотосинтетичного апарату.

Ключові слова: фотосинтетичний апарат, індукція флуоресценції хлорофілу, юистема 2.

Корнеев Д.Ю. Изучение состояния фотосинтетического аппарата с помощью да индукции флуоресценции хлорофилла,- Рукопись.

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук по иальности 03.00.12 - физиология растений.- Институт физиологии растений и гики НАН Украины, Киев, 1997.

Диссертация посвящена разработке новых подходов к изучению состояния синтетического аппарата с использованием метода индукции флуоресценции

хлорофилла. Предложены новые кинетические параметры, определение кото основано на расчете производных от индукционных кривых. Разработаны подход оценке размеров светособирающей антены и пула акцепторов для восстанавливающих комплексов фотосистемы 2. Получены характерней функционального состояния фотосистемы 2 в субхлоропластных фрагментах, кото происходят из различных участков тилакоидных мембран. Исследованы измене этих характеристик в условиях фосфорилирования мембранных белков хлороплас Изучено влияние неблагоприятных условий окружающей среды и дефе! биосинтеза на состояние фотосинтетического аппарата.

Ключевые слова: фотосингетический аппарат, индукция флуоресцен

хлорофилла, фотосистема 2.

Komyeyev D.Yu. Studying the photosynthetic apparatus state by means of the metho chlorophyll fluorescence induction.- Manuscript.'

Thesis for Ph.D. (Biology) by speciality 03.00.12 - Plant Physiology.- Institute of F Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1997.

The dissertation is devoted to the development of new approaches to studying photosynthetic apparatus state by means of the method of the chlorophyll fluoresct induction. The new kinetic parameters, the determination of which is based on calculation of the derivatives from the induction curves, have been proposed, approaches to the estimation of the sizes of the light-harvesting antennae and the po< the electronic acceptors for the Qb-reducing photosystem 2 complexes have I developed. The characteristics of the functional state of the photosystem 2 complexe subchloroplast fragments originated from different regions of the thylakoid membrane I been obtained. Changes of these characteristics have been investigated under condil when membrane proteins of chloropats are phosphorylated. The influence of unfavorable environmental conditions and the defects of the biosynthesis on photosynthetic apparatus state have been studied.

Key words: photosynthetic apparatus, chlorophyll fluorescence indue

photosystem 2.