Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизма действия макроциклических трихотеценов из Dendrodochium toxicum Pidopl. et Bilai.

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизма действия макроциклических трихотеценов из Dendrodochium toxicum Pidopl. et Bilai."

1НСТИТУТ М1КР0БЮЛ0ГН I В1РУС0Л0ГН IM. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

г_рАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРАШИ

csr О

CD

с.д сэ

СЧ1

cl.

г?с

Тугай Тетяна ÎBanimia

УДК 582.288:615.334

ВИВЧЕННЯ МЕХАНВМУ Д1Г МАКРОЦИКЛ 1ЧНИХ ТРИХОТЕЦЕН1В 13 DENDRODOCHIUM TOXICUMTJDOPL. ET BILAI

03. 00. 07 - мкробюлогк

АВТОРЕФЕРАТ дисертаци на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук

Кшв-2000

Дисертащею е рукопис

Робота виконана в Гнституп ткробюлот i в]русологп

iM. Д.К. Заболотного HAH Украши

Науковин кершнвк: доктор бюлопчних наук, професор

Зайченко Олексавдр Максимович, 1нститут мжробюлогй i Bipyconorii iM. Д.К. Заболотного HAH Украши, KepißHHK лабораторп вторинних метаболтв мшромщетш

Офщшт опопеити: доктор бюлопчних наук, старший науковий сшвробггник Варбанець Людмила Дмитр1вна, 1нститут мйсробюлогп i в1русолоп1 iM. Д.К. Заболотного HAH Украши, завщувач вщдшу 6ioxiMii MiKpoopram3MiB

доктор бюлопчних наук, професор Воёцщький Володимир Михайлович, Кшвсышй Нацюнальний университет iMeHi Тараса Шевченка, професор кафедри öioxiMii

Провщна органвацш: 1нститут ботанки iM. М.Г.Холодного HAH Украши, вщдш мшологй, м. Кшв

Захист вщбудеться " 19 " квггня 2000 року о 10 годин! на засщанш спещатзовано! вчено! ради Д 26.233.01 1нституту М1кроб1ологй i Bipyconorii' ¿м. Д.К. Заболотного HAH Украши за адресою:

03143, Кшв - 143, вул. Заболотного, 154

3 дисертащею можна ознайомитись у бiблioтeцi 1нституту мйсробюлоги i вирусолога ¿м. Д.К. Заболотного HAH Украши за адресою:...

03143, м. Ки1в, вул. Заболотного, 154

Автореферат розюлашш " j'jf- " березня 2000 р.

Вчений секретар спещагизовано! вчено'1 ради кандидат бioлoriчниx наук

ПуршЛ.М.

Загальна характеристика робота

Актуалыисть проблемы. Серед велико} групп мшотокстпв трихотецени аймають одне з провщних ьпсць за юльгастю токсижшв, яю вони викликають, i за пупенем ix уражуючо! до [Билай, Пидопличко, 1970, Ueno, 1986, Wilson et al., 993].

Макроциюпчш трихотецени (МЦТЦ) е причинними агентами таких тяжких ахворювань людини i гварин як дендродохю-, \иротец10- i стах1ботр1отоксикози Билай, Пидопличко, 1970, Forgacs et al., 1972, Croft et al., 1985, Etzel et al., 1998, 'irng et al., 1998]. Цим сполукам притамашпш широкий спектр бюлопчного впли-¡у - фгготоксична, фунгщидна, цитотоксична та шли активносп [Bamburg, Strong, 971, Okazaki et al., 1989, Зайченко, Нагорната íh., 1992, Nikulin et al., 1997].

Впродовж останшх дecятиpiч досить добре дослдасена xÍMÍ4Ha структура як гростих, так i макроцикшчних трихотецешв [Jarvis, Mazzola, 1982, Anderson et al., 989, Hughes et al., 1990, Jarvis et al., 1995, Зайченко, Рубежняк, 1999], розроблеш i гостшно удосконалюються метода ix анал1зу та ¡денгифнсаци [Cole et al., 1986, ¡pringer, 1986, Hacketal., 1988,Mogar, 1989].

Анал1з даних лггератури свщчить про те, що найменш вивченим е питания [еханвм1в ушкоджуючо'1 до МЦТЦ. Вони обмежеш здебшьшого дослвдженнями подо вшшву окремих представнигав uiei групи токсишв на етап трансляцй синтезу ¡iraca [Carrasco, 1973, Hernandez, Cannon, 1982]. Вщомосп щодо шлих аспекпв [ехашзму до МЦТЦ малочиселыи [Pavlovkin et al., 1983, 1993, Бабичев, 1984, )kazaki et al., 1989, Кириллова, Зайченко, 1995, 1996], i не дають змоги вщтвори-и загальну картину до цих сполук на кштшшому píbhí, охарактеризувати наяв-icTb чи вадсутшсть Ix специфЬтно'1 до на окрем1 процеси обмшу речовин. Власне [я обставина i визначила напрямок наших дослщженъ.

Для створення концепцп MexaHÍ3MÍB дй МЦТЦ необхщга шформащя, завдя-и якш можна було б розробити шдходи до даагностики, профшактики та лгкуван-

Я вщповщних t0kchk03íb.

Зв'язок роботи з науковпми програмамн, планами, темами. Робота вико-:ана у вцщовщносп з напрямком науково-дослщних po6ÍT iHcnnyiy мкробюлогй в1русологп ím. Д.К. Заболотного НАНУ, зокрема з темами: "Вивчити утворення i юлопчну даю ф^зюлопчно активних метаболтв мжромщета" (№ державно! рее-грацн 01. 82. 9010969); "Бюлопчна доя метаболтв мнсромщеттв в нормальних i кстремальних умовах" (№ державно! реестрацй' 01.84.0021695); "Вивчення еколо-о-ф1зюлопчних особливостек видового складу мкромщета, трансформуючих oni- i мономеры субстрата, з метою отримання нових 6Í0n0rÍ4H0 активних мета-олтв" (№ державно! реестрацй 01.88. 00.52).

Мета i завданпя робот Метою дано! робота було вивчення мехштшв j МЦТЦ, яьа сингезуються Dendrodochium toxicum Pidopl. et Bilai 5800, з викор» танням комплексу тест-культур та тест-систем, адекватних специфпц бюлопчт дц цих сполук (ашифунгально!, фшшжсично!, вшшву на теплокровних).

Виконання робота передбачало виргшення настуттних завдань:

- дослщити доо комплексного препарату дендродохшу i видшених з ньог шдивщуальних компонент МЦТЦ на pier тест-культур, синтез у них бшка та ir клешових кислот;

- вивчити вплив МЦТЦ на актившсть видшеши нами ДНК - залежно! РНК полшерази дрЬкджв;

- провести nopißffimbHe вивчення вшшву МЦТЦ на синтез тгменпв у хлор« ли (хлорофши a i в, каротинощи) при р1зних умовах üi' культивування;

- дослвдити вплив МЦТЦ на синтез АТФ клпинами хлорели;

- вивчити даю МЦТЦ на Са2+ АТФ-азну актившсть i проникшстъ мембра саркоплазматичного ретикулуму (моделью! системи скорочення м'яз!в).

Наукова новизна одержаннх результата. Вперше для вивчення мехашзм да МЦТЦ використано комплекс тест-культур та тест-систем, адекватних щодо i бкшопчно! дц. Показана жхшфункцюнальшсть до дендродохшу, верукарину А рорщишв А та Н на актившсть метабол1чних процеав в систем! еукар1от та прока

pioT.

Встановлено, що МЦТЦ пригшчують синтез бшса i нуклешових кислот ; доипджених представниюв еукар1от, в той час як у npoKapioT низыа концентрат токсишв активують синтез цих макромолекул.

Показано, що мехашзм до МЦТЦ на бшок-сингезуючу систему у дрЬкдш пов'язаний з порушенням активно cri ДНК - залежно? РНК - теяимерази - юпочово го ферменту етапу транскрипцп. Одержан! даш суттево доповнюють ¡снуюч! уяв лення щодо МЦТЦ як шпбпхрв окремих стадй етапу трансляцй' в бшок синтезуючш систем! систем! еукарют.

Вгогелена стимулююча доя МЦЩ на синтез хлорофивв a i в та каротино'щй у Chlorella vulgaris при темновому режим! культивування i шпбуюча д!я токсинй на picT хлорели i синтез шгментш при культивуванш в умовах освплення. Встано влено зниження сумарного BMicry АТФ у Chlorella vulgaris гад даею цих токсишв Показано, що екзогенне внесения АТФ на фош МЦТЦ вщновлюе синтез шгментй i pier клгган водоросп при освпленш, що свщчить про порушення процес1в фото фосфорилювання гад доею цих метаболтв.

Анал1з отриманих результатов дозволив обгрунтувати явшце контрактурр скелетних м'яз1в при дендродохютоксикоз!, яке базуеться на здатносп МЦТЦ гад-вшцувати проникшстъ мембран фракцш саркоплазматичного ретикулуму для ioaii калыцю, що супроводжуеться розсиованням його град1снту на мембран!.

Теоретична i практична значгопсть. Результата достдження молекуляр-них MexaHi3Mie да МЦТЦ на мкрооргашзми можугь махи значения для розумшня 6ioxi.\ii4HHx процесш, що вщбуваються при мпсотоксикозах. Одержат результата можугь бути основою для розробкн наукових щцходов до доагностики, лжування i профилактики токсикоз1в, обумовлених МЦТЦ, а також для спрямовано! розробки методав та 3aco6ie запобягання та зменшення прояву токсикоз1в.

Поряд з цим, одержат дат свщчать про можлотпсть використання МЦТЦ як специ(}нчних реагенпв при вивченш окремих етатв синтезу бшка, синтезу тгмен-пв та процесгв мембраетого транспорту в р1зних бгалопчних системах.

Особистий внесок здобувача. Особиста участь дисертанта полягала в роз-робщ методичних щцходов, експериментальному обгрунтувант та проведены комплексу лабораториях дослщжень, aнaлiзi та узагальнешп одержаних результа-пв та даних лгсератури. Отримаш експериментальт дат опрацьовувались статас-гачно.

Апробацш результата дисертацЕ Результата робота були представлеш на VI з"(зда Украшського мкробюлопчного товариства (Донецьк, 1984), на V з'гзда Украшського 6ioxiMi4Horo товариства (Гвано-Франювськ, 1987), на Всесоюзнш <онференцп "Антропогенна еколоия мкромщепв, аспекта математичного моде-тювання i охорона оточуючого середовища" (КМв, 1990).

Публжаци. За матер1алами дисертаци опубликовано 15 наукових праць з тах 8 статей.

Структура та обсяг робота. Загальний обсяг робота становить 193 сторшки машинописного тексту. Вона складаеться з вступу, огляду лтератури, експери-ленталъно! частини, висновив, списку вюсористаних джерел (329 найменувань, з пшх 246 - ¡ноземних). Робота шострована 4 таблицями та 38 рисунками.

РОЗД1Л1. Огляд лггератури

У даному роздш, що представлений 5 тдроздшами, дана коротка характе-)истика xiMi4Hoi будови МЦТЦ та особливостей ix синтезу. Розглянута iх бюлоп-ша актив теть та юнуюч! уявлення про мехашзми ди. Пщкреслюеться недостат-псть ведомостей щодо мехатзму дн цих метаболтв, подаеться критичний анашз атературних даних з проблеми, що вивчаеться. Окреслюються перспективш на-фямки дослщжень.

РОЗД1Л 2. Матер1али та метода дослвджень

Головними об'ектами дослвджень були МЦТЦ, що синтезуються lendrodochium toxicum 5800: комплексний препарат дендродохш та вилучеш з [ього шдашдуалып компонента (верукарин А, рорщини А та Н). D. toxicum 5800 ¡ув отриманий з колекцц вщдщу ф!зюлогп i систематики мифомщелв. При

вивченш мехашзму да МЦТЦ як тест-культури використовували: Acholeplasn laidlawii PG-8, люб'язно надана в наше розпорядження докг.бюл. наук 1.Г. Скр; палем, Saccharomyces cerevisias "Феодос1я" - вихщна культура, що зберя-алася музе! вщцшу ф1зюлогй' i систематики мкромщепв, Chlorella vulgaris L ( люб'язно надана в наше розпорядження канд. бюл.наук Н.В. Зольниковою ( Ц] сшьськогосподарсько! шкробюлогй, м. Пушкш, Pock). Як модельна система б] також використаний саркоплазматичний ретикулум (CP), якнй вилучали 3i скеле них м'язгв кроля.

Метода дослщжень. D. toxicum 5800 вирощували на стандартному серед( випц Чапека. Дендродохш екстрагували i3 культуральних фшьтраттв хлорофо] мом. Екстракти об'еднували i випаровували шд зниженим тиском до одержат маслянистого залишку. Такий неочищений препарат в подалыпому використов; вали для вилучення гндаввдуальних компоненте МЦТЦ в аналогично чистому bi гляда. Гндивщуальш токсини люб'язно надаш в наше розпорядження докт. 6io: наук О.М.Зайченко, за що ми йому щиро вдячш.

Ддождаа вирощували глибинним методом в експериментально вущрацьов; них умовах (глюкозо-амошйне середовище). Хлорелу вирощували глибинним м< тодом на редкому середовшщ [Метода..., 1978] в р1зних умовах освплення: пр пом1рному освггленш (4000 лк) та в темновому режим! Протопласта др1ждж! отримували з використанням ферментного препарату, вилученого нами з виногр; дного слимака Helix pomatia за методом Горлова та Кирилово! (1978). Були ексш риментально шдабраш умови максимального виходу протопласт. Видшення i очистку ДНК-залежно! РНК-пол1мерази проводили, виходячи з метода описаних nrrepaiypi [Roeder et al., 1969, Adman et al., 1972, Weil, Blatti, 1975, Valenzuela < al., 1976] 3 нашими модафжащями. Афшну хроматографто РНК-пол1мерази прс водили на гепарин-сефароз! 4В [Rato, Anfinsen, 1969], юнообмшну - на ДЕАЕ сефадеюл [Schwartz, Roeder, 1974]. Контроль активних фракцШ пол1мерази провс дили спектрофотометрично за bmi'ctom бшка [Bradford, 1986], а також за наявшсп РНК - псхшмеразно! активносп, яку визначали за включениям [3Н] УТФ в кислоте нерозчинний осад РНК [Adman et al., 1972]. Чистоту видшених препарата контре лювали за допомогою гель-електрофорезу в ПААГ [Laemmli, 1970] та чутливост до а-амаштину [Valenzuela et al., 1976].

Видшення препарату загально! фракцй мембран CP, "важкоГ i "легко!" фра кщй проводили згщно з методами, описаними Дядюшею i Курським (1985). Паси вне навантаження мембран фракцш CP та реестрацто виходу кальцш з везикул С проводили за В.А Тугай та ш. (1989).

При визначенш включения м1чених попередшшв в ДНК, РНК i бшок вике ристовували [2 ИС] тимш (0,5 мкЮ/мл), [2 !4С] урацил (1 мкКУмл), [2,3 3Н] лейци; (1мкЮ/мл), вщповщно. Визначення BMicry АТФ в юнтинах хлорели визначали ви

користовуючи бюлюмшесцентний метод в люцеферш-лгоциферазно! реакцц [Kiminich et al, 1975]. Визначення Са2+-АТФ-азно'1 акгивносп фракци мембран CP проводили за Weber et al. (1966). Концентрацию неоргашчного фосфору визначали за Fiske, Subbarow (1925). Результата досладв обробляли статистично [Лаюн, 1973].

РОЗД1Л 3. Вивчення динамжи росту тест-оргашзмзв та визначення дно-чих концентраций дослщжуваних токсшпв

В основу виявлення мехашзмш да МЦТЦ (дендродохшу, верукарину А, ро-рщину A i рорщину Н) покладено використання комплексу тест-культур, адекват-них особливостям ix бхолопчно1 активносп. Тест-культури мали сутгев1 вцщпшос-ri в функщонуванш бшок-синтезуючо! системи та в процесах енергозабезпечення штини: др»ждаа (вихщна культура та три адаптоваш до високих концентраций цендродохшу Bapiairra) та хлорела - як представники еукарют, та мшлшазми -найпростшпш представник прокарют.

Вплив pi3HHX концентр аци МЦТЦ на pier тест-культур дослщжували для штин, що знаходились в середиш еспоненцШно! фази росту.

Параметри росту A. laidlawii були дослдаеш ранше [Скрипаль та ш., 1984]. Вивчення динамки росту шлих тест-культур на середовипц без токсишв показа-то, що вихщний ютам дрпкдшв S.cerevisiae досягае стада експоненщйного росту та 12-14 год., а адаптоваш Bapiawra - на 18 год. При вирощуваша Chi. vulgaris на -етеротрофному середовипц в режго.« noMipHoro освготення час досягнення сере-дани експоненцшно! фази складав 24 год., в темновому режим! - 33 год., на авто-грофному середовищ! - 40 год.

Встановлено, що дендродохш в концентращях вщ 2 до 100 мкг/мл пропорцию пригшчуе pier A. laidlawii, при цьому 5 мкг/мл викликае 30% приппчення, >0 мкг/мл - 50%, а 100 мкг/мл - 75%. Дк шдивщуальних компонента верукарину рорщину A i рорщину Н на pier A. laidlawii була менш вираженою шж при ви-сористанш комплексного препарату дендродох!ну.

Не спостер!галося сутгевих розб!жностей в чутливост! дослщжуваних куль-ур др1ждж!в щодо дендродохшу. Дендродохш (10 мкг/мл) призводив до'пригш-[ення росту вихщно! культури на 65% i адалтованих BapiamiB 2а i 5а - на 75%. Ця >бставина обумовила доцшьшетъ використання в подалыпих дослщженнях лише ¡ихщно! культури S. cerevisiae.

При культивуванш хлорели спостер^галась виражена ¿нпбуюча да МЦТЦ на tier культури, пропорцшна концеетраци дослщжуваних токсишв. При концешра-lii шдивщуальних токсишв 0,05 мкг/мл спостер!галось 30% приппчення росту, а |ри 0,10 мкг/мл - 55 - 60%. Для досягнення аналогичного результату концентращя ;ендродохшу мала бути на порядок вищою.

Таким чином експериментально були встановлеш таи концентраций МЦП яи вшошкали 30 - 50 % пригшчення росту у дослщжуваних тест-культур (мкг/мл A. laidlawii - 2 - 50; S. cereñsiae - 1 - 100; Chi vulgaris - 0,05 - 1,0. Отже, МЦТ харакгеризувались найбшьш вираженою ф!тотоксичною даею i найменш вираж( ною даею щодо мкоплазм.

РОЗДЫ 4. Вшшв дослщжуваних макроцшаичннх трихотецетв на cm тез бйка та нуклешових кислот у тест-оргашзтв

Зпдно з даним яигерагури, окрем! представники МЦТЦ (верукарин А) з ступеней йшбггорно! да на синтез бшка, як правило, близью до циклогексимщ [Carrasco, 1973, Ueno, 1973, 1986]. В дашй роботт ставилось завдання дослщит вшшв як комплексного препарату дендродохшу так i його шдивщуальних компс не!шв на синтез макромолекул у кожног з обраних нами тест-культур, яю мал cyrreei вдашносп в процесах синтезу бшка та енергозабезпечення клпин, що нг давало можлшмсть одержання бшьш повжи картини пошкоджуючог да дошвдж> ваних МЦТЦ в системах прокарют i еукарют.

Встановлено, що лише дендродохш пригшчував як синтез бшка, так i синте нуклешових кислот у AJaidlawii. Щ результата узгоджуються з даними, одержа ними при вивченш впливу комплексного препарату МЦТЦ на pier AJaidlawii, Be рукарин А, рораднн А та рорвдин Н (1-10 мкг/мл) активували синтез РНК ; AJaidlawii. Верукарин A i рорщин А також значно активували синтез ДНК, a popi динН- пригшчував сшггез ДНК (рис. 1).

Гндиввдуальш МЦТЦ справляли рпний вплив на синтез бшка. Так, дая веру карину А була найменш вираженою, рорщш А - пригшчував, а рорщин Н - акта вував цей процес. Проте слад зазначитя, що величина як активуючо1, так i шлбу ючох да МЦТЦ на сшггез бдаса не перевищувала 30%, в той час як величина акти ваци синтезу нуклешових кислот досягала 200 %. Таким чином, найменш чутли вим до да досладжуваних МЦТЦ у A. laidlawii був процес синтезу бшка. Встанов лений нами вперше факт сутгево! активацц синтезу ДНК i РНК у ахолеплазма вка зуе на те, що у m'ci культури вплив токсишв на бшок-синтезуючу систему вадбува еться вже на етага транскрипци.

Bei дослщжеш МЦТЦ пригшчували синтез бшка, РНК, ДНК у представники еукарют. У хлорели найбшьш чутливим до да МЦТЦ був синтез ДНК, за ним ■ синтез бшка i, наренгп, синтез РНК. Однак розб1жносп в чутливосп до да МЦТ1 спостерц-алися лише при концентращях токсишв ввд 0,05 до 0,50 мкг/мл, a npi 0,50 мкг/мл МЦТЦ enoerepirara 90% пригшчення синтезу як бшка, так i нуклешових кислот (рис.2.).

Концентращя мшотоксяшв, мкг/мл

Рис. 1. Залежтсть синтезу ДНК (А), РНК (Б) та быка (В) у Acholeplasma lidlawii В1д концентраци МЦТЦ

1 - верукарин А; 2- рорщин А; 3- рорщин Н; 4- дендродохш.

Рис. 2. Залежтсть синтезу ДНК (А), РНК (Б) та бшка (В) у Chlorella ulgaris ввд концентраци МЦТЦ

- верукарин А; 2 - рорщин А; 3 - рорщин Н; 4 - дендродохш.

' дрЬадяав найбшып чутливим до дп токсишв виявився процес синтезу бшка, айменш чутливим - синтез ДНК. Слщ зазначити, що концентращя МЦТЦ 0,50 кг/мл, що викликала у хлорели пригщчення включения м1чених попередниюв ■с в бшок, так i в нукле'шов! кислота на 90%, не вшшвала на qi процеси у S. '.revisiae (рис.3.).

02 ЯЗ 04 В5

Рис. 3. Залежтсть синтезу биша (А), ДИК (Б), РНК (В) у БассНаготусе. сегеутае вад концентраци МЦТЦ

1 - контроль; 2 - верукарин А; 3- рорщин А; 4- рорщин Н; 5- дендродохш.

Щд лдею токсишв у дршсдаав порушуеться процес синтезу РНК, що мож! свщчити про те, що вплив МЦТЦ вщбуваеться вже на еташ транскршщй, якш регулюе синтез РНК. Даш щодо до вказаних токсишв на цей етап синтезу бшка ] достушпй нам лператур1 вщсутш. Виходячи з того, що дослщжуваш токсшн справляли незначний вплив на синтез ДНК, ми припустили, що основною мшен ню дп МЦТЦ в цьому випадку може бути юпочовий фермент цього етапу - ДНК залежна РНК-гошмераза.

РОЗД1Л 5. Вплив дослщжуваних макроцшиичних трихотецешв на акта втсть ДНК-залежно! РНК-иолшерази

ДНК-залежна PHK-пoлiмepaзa була видшена нами з чутливо! до дендродо хшу культури Б. сегем1$1ае "Феодосш" з використанням юную чих методичних щд ходав [Уа1еп2ие1а е1 а1., 1976] з деякими нашими модифшащями. Схему видиенн: цього ферменту можна представши наступним чином:

Культивування др1ждаав (глюкозо-амошйне середовище)

Отримання протопласт (ПСУ)

I

Руйнування протопласта (рвдкий азот) Эксгракцш РНК-пол1мераз1^(буфер А + 150мМ сульфату амошю)

I

Осадження РНК-пол1мерази (шшмш Р)

I

Висолювання (насичений розчин сульфату амонш) Д1ал13

I

Афшна хроматограф1Я (гепарш-сефароза) ¡онообмшна хроматографья (ДЕАЕ-сефадекс)

Елюцш з ДЕАЕ-сефадексу дозволила виявити три тки ферменгативно! ак-•ивносп, яю елюювались при концентрацц сульфату амонш в розчшп 0,16-0,18 фракщя I), 0,22-0,25 (фракщя П), 0,29 - 0,31 М (фракщя Ш), вщгсвщно 1 мали р1з-гу чутливють щодо дн а- амангтину. Отримаш результата узгоджуються з даними птератури 1 дають шдстави для ствердження, що видшена нами фракщя I вщповь [ае РНК-пол1мераз11, фракщя П - РНК-полмераз1 И, фракщя Ш - РНК-шшмераз1 П.

Показано, що дендродохш пригшчуе загальну РНК-пол1меразну актившсть га 30%, що добре узгоджуеться з нашими даними щодо впливу дендродохшу на ¡умарний синтез РНК. Встановлено також, що дослщжуваш МЦТЦ по р1зному (пливали на кожну з трьох форм ферменту.

Дослщжуваш МЦТЦ (рис. 4) проявляли активуючу дш на РНК-пол1меразу I ( концентращях 1-80 мкг/мл. Максимальна акгиващя верукарином А спостерц-а-гась в концентращях вщ 20 до 70 мкг/мл, рорщином А - вщ 20 до 50 мкг/мл, а (ендродохшом - 50мкг/мл. При до рорщину Н спостер^алась акгиващя фермен-у, пропорцшна його концентрадй (до 160% вщ контролю при концентрацц рорь цпгу Н 100 мкг/мл).

Верукарин А пригшчував, а рорщин А активував РНК-пол1'меразу П в кон-[ентращях вщ 5 до 50 мкг/мл. Рорщин Н в даапазош концентрацш вщ 5 до 50 шг/мл пригшчував актившсть ферменту (до 40%).

Дендродохш у тому ж даапазош концентрацш спричиняв активуючу дно, еличина яко! сягала 130%. При концентращях рорвдшу Н1 дендродох]'ну вщ 50 [о 100 мкг/мл, перший - активував, а другий - пригшчував актившсть РНК-кшмерази П, а максимальна величина цих ефекпв складала близько 40%.

Дослщжуваш МЦТЦ приппчували актившсть РНК-полтмерази Ш (рис.4). За тупенем зростання шпбуючо! до 1х можна розм1стити в ряд: дендродохш < веру-арин А < рорщин Н < рорщин А, а величини пригшчення при використашп кон-[ентраци 100 мкг/мл складали: 30%, 40%, 50%, 60%, вщповщю

А

Б

1ЛП .V

В

40

20

О 30 100

0 50 И» -о-1-й-2-л-3-х-4

0 50 100

Концентр ащя мкотоксишв, мкг/мл

Рис. 4. Вплив МЦТД на актившсть ДНК-зал ежно! РНК - пол1мерази (А), полшерази П (Б), полшерази Ш (В)

1 - верукарин А; 2 - рорщин А; 3 - рорщин Н; 4 - дендродохш.

Одержаш результата дозволяють стверджувати, що дослщжуваш МЦГ впливають на бкок-синтезуючу систему др1яуршв вже на еташ транскришщ.

Притшчення активноот РНК-пол1мерази Ш визначае зниженнх синтезу я тРНК, так i 5S - РНК. При цьому спостер1гаеться активащя РНК-пол1мерази I, вц повщальноГ за синтез рРНК. Таким чином, вщбуваеться порушення сшввщноше! ня форм РНК, яке й приводить до подалыпих порушень в бшок-синтезуючш си< тем1 др1ждоюв.

МЦТЦ в1дом1 як шпбпори процесхв швдаци етапу трансляцп [Carrasc< 1973, Cimdliffe, 1974, 1977, Wei, 1974, McLaughlin, 1977]. Отримаш результата я] нам здасться, суттево доповнюють лггературш дан! i розпшрюють наш уявленн про вплив МЦТЦ на бшок-сшггезуючу систему у представшшв еукарют.

РОЗД1Л 6. Вплив макроциюнчних трихотецешв на синтез фотосинтет» чних шгмент1в у Chlorella vulgaris

При вивченш впливу МЦТЦ на picT i бшок-синтезуючу систему хлорели пр культивуванш i"i на гетеротрофному середовишд з пом1рним осветлениям 4000л! був встановленин факт депщментацц, який може бути пов'язаний з порушення] синтезу шгмемчв. Дослщження впливу токсшав проводили з використанням ве рукарину А; рорщину A i рорщину Н. 1х вплив на процеси, що вивчалися, був пра ктично однаковий, тому дан1 наводиться по одному з токсшпв - рорщину А. Щ

доею токсишв спостер1галося зниження синтезу хлорофшв a i в та каротинодав, пропорщйне концентрацц дослщжуваних токсишв.

Слщ зазначити, що синтез пигмента значно чутлившшй до до токсишв тж синтез бшка. Так, при концентращ!" токсишв 0,05 мкг/мг ( 0,1 мкМ) приблизно на 50% шпбуегься синтез бшка, а синтез шгменпв - на 80%.

Поршняльний анал1з впливу МЦТЦ на pier i синтез шгмекпв в динами» культивування виявив, що пригшчення синтезу тгменттв спостер^аегься на 12 год. культивування, а пригшчення росту - на ЗОгод.

Таким чином, МЦТЦ проявляют^, значну дою на шгмент-бшковий комплекс - порушуючи, хоча i в р1знш Mipi, як синтез бшка, так i синтез шгменпв.

Така доя МЦТЦ може бути наслщком порушення реакцш, пов'язаних з синтезом попередниив шгменпв, або ж сумарних енергетичних npoaeciB, що забез-печуються системами фотофосфорилювання та(або) окислювального фосфоршпо-вання. Внесения в середовище для культивування хлорели на фош до МЦТЦ по-передника синтезу шгмитв - ацетил-КоА не перешкоджало шлбуючому впливу мкотоксишв.

Для бшыц детального вивчення да МЦТЦ на синтез шгменпв хлорели були проведеш дослщження щодо вшшву р1зних умов культивування: темнового режиму на гетеротрофному середовипц та свшгового на гетеротрофному та автотроф-ному середовщцах (Рис. 5). Показано, що при культивувагап хлорели у темновому режим1 на гетеротрофному середовипц, коли енергетичне забезпечення клшши

а б в

Концентрац1Я мкотоксину, мкг/мл □ -1 Ш-2 И -3

Рис. 5. Вплив рорщину А на вшст хлорофиу а (А), хлорофшу в (Б) та гаротинощв (В) у Chlorella vulgaris при pi3imx режимах культивування

1 - гетеротрофне середовище, освклешсть 4000 лк; 2 - автотрофне середо->шце, освплешсть 4000 лк; 3 - гетеротрофне середовище, темновий режим.

вщбуваетъся за рахунок процеив окислговального фосфорюповання [Kaadlei 1966], рорцщн А не впливав на pier хлорели при век дослвджуваних концентр ащ ях, а в даапазош концентр ашй вщ 0,01 до 0,05 мкг/мл не впливав на синтез гагмен ■пв. При шдвшценш концентрацй' рорщину А вщ 0,05 до 0,15 мкг/мл cnocrepira лась активащя синтезу хлорофшв a i в, яка досягала в середньому 175% вщ кош ролю. Активуючий вшшв на синтез каротинощш в межах наведених концентрацй досягав 250%. Пояснения цього феномену потребуе подальших досладжень. Од ною з гшотез, що може в якшсь Mipi дати пояснения цього явища, е допущенн можливосп штерференцц м1ж МЦТЦ з одного боку i шгменгами - з другого, як базуеться на сшльносп шляxia бюсинтезу цих метабол!™, а, вдаювщно, i наявно cri сшльних струкгурних елемевгпв [Bamburg, Strong, 1971].

При культивуванш хлорели в свггловому peжимi ж на автотрофному, так на гетеротрофному середовшщ, спостерггався сильно виражений шпбуючш вшшв рорщину А на pier хлорели i синтез шгмента. При концентрацй рорщину / 0,05 мкг/мл enoerepiranoeb в середньому 30% пригшчення росту та 50% i 80% ш пбування синтезу тгменттв при культивуванш на гетеротрофному i автотрофном; середовшщ, вщговщю.

В зв'язку з тим, що пригшчення синтезу шгменпв год даею рорщину А вщ бувалося в свшювому режим! культивування, коли енергозабезпечення клшщ здшснюеться за рахунок фотофосфорилювання [Urbach, 1964], необходю було до слщити вшшв МЦТЦ на синтез АТФ в юнтинах хлорели.

Встановлено, що токсини шгибували синтез АТФ до 30% (Рис. 6.). В пли доелвджуваних МЦТЦ на р1вень АТФ можна nopiBffirra з даею такого роз'еднувач; фотофосфорилювання, як карбоншциашдхлорфешлгщразина (КЦХФГ) над даек

якого, зпдно з даними лтератури, ршень АТ<] при оевллекш у одноклпинних водоростей, ] тому чист i у хлорели, значно зменшуетьс. [Jeanjean, 1976].

Рис. 6. Вшшв рорщину А на вмаст АТФ в клатинах Chlorella -vulgaris К - контроль (без токсину)

Для з'ясування poni зниження синтез; АТФ шд даею рорщину А в порушенш функщ онування клтши, а саме у синтез1 хлорофийв каротинощв, вивчали вшшв екзогенно внесе но! АТФ (0,2 мМ) у середовшце для культиву вання хлорели одночасио з рорщином А (Рис. 7.). Показано, що внесения АТФ

К

100

80

2 §

&

о к

.3 601

404

0 0.05 0.1

Концентращя мкотоксину, мкг/мл

викликало вщновлювальну дао щодо синтезу гагмештв на фош до токсишв, це добре узгоджуеться з даними лггератури про те, що екзогенна АТФ може "вщнов-лювати" фотосинтез хлорели, шсля ттригшчення роз'еднувачем КЦХФГ [Глаголева, 1987]. Слзд зазначити, що у наших експериментах екзогенно внесена АТФ проявляла вщновлювальну дда на синтез тгаенйв як енергетичний екв1валент, бо ек-зогенне внесения АДФ в ттй сашй концентращ! не викликало "вщновлювальноГ да на синтез шгменпв.

Рис.7. Вплив АТФ та АДФ на 1нпбування вшсту шгменпв в клгганах Chlorella vulgaris

А - рорщин А(0,1мкг/мл); В - popi-дин А +АТФ (0,2 мМ); С - рорадин А + АДФ (0,2 мМ); К - контроль; 1 - хлорофш а; 2 - хлорофш в; 3 - каротинощи.

Таким чином, ¡нлбуюча дм рорщину А спрямована лише на процеси, яю вщбуваються в юнти-нах хлорели при освпленш, тобто вони пов'язаш з порушенням процеов фотофо-сфорилювання.

РОЗД1Л 7. Вплив дослщжуваних МЦТЦ на АТФ-азну актившсть р1зних фракций саркоплазматичного ретикулуму

Зпдно з даними лггератури при дендродоиотоксикоз! спостерц-аеться контрактура м'яз1в [Пщошнчко, Бшай, 1970], одшею з можливих причин яко! може буга порушення функцц скорочення скелетних ы'ят.

Цикл "скорочення - розслаблення", як вщомо, регулюеться локальною зм1-аою концентраци ¡ошв калыцю. В цьому циюпчному процеи головну роль вико-яують мембрани CP, яю в АТФ-залежному npoueci тракшортують кальцш до по-эожнин ретикулуму проти концентрацшного градоенту, забезпечуючи розслаблен-и [Ebashi, 1961], i шд доею нервового ¡мпульсу звшьняють кальцш в цитоплазму Hios, Pizzarro, 1988] для шщтали процесу скорочення.

Дошдження вшшву резнях концентрахцй дендродох1ну на величину АТФ-13Н01 активностт показало, що в сумарнш фракцц мембран не виявлено достов!р-шх змш акгивносп ферменту. Враховуючи той факт, що сумарна фракщя мемб-)ан CP складаеться з "легко!" та "важкоГ фракцш мембран, що разняться за акти-¡шстю Mg24, Ca 2+- АТФ-ази (Kay, Norma, 1989), при проведет даних дослщжень

IV

10080

I 60

х о

к 40

.3 40

" 20 0

2

1 fffi?

Ш

(«И

81

Ж

в

шщлбно було роздшгга сумарну фракцш на й складов! з метою виявлення мож пиво! да дендродохшу на одну з них.

Встановлено, що дендродохш в концентращях 100 - 200 мкг/мл активу Mg2'1", Са2+- АТФ-азну активность фракцш мембран CP, збагачено!" термшальним; цистернами ("важка" фракцш), i не впливае на Mg2*, Са2+- АТФ -азну актившст фракцш мембран, ни походять з продовгуватих трубочок ("легка" фракцш). U розб1жност!, можливо, пов'язан! з характерними властивостями субфракщй мемб ран CP, а саме: сшввщношення лшщ/бшок у фракцй мембран, яи походять з тер мшальних цистерн складае 0,94, а в фракцп мембран, яи походять з продовгува тих трубочок - 0.39. Число оберпв ферменту "важко'Г' фракцп вище, шж "легко!" складае 640 i 440 об/хв, вщповщно [Van Winlde, 1982].

Виходячи з наведених даних литература, можна припустити, що пщвшценн Mg2"1", Са2+- АТФ-азно! акгавносп фракцц мембран CP, збагачено! термшальним; цистернами гад впливом дендродох!ну, може бути обумовлене частковим шдвв щенням BMicry вшьних лнвдв внаслщок порушення бшок-лшщкй взаемодй ni, вшшвом дендродохшу, який мае яскраво виражеш гщрофобш властивосп. Tai порушення часто призводять до збшьшення проникнос-ri мембран. Для nepeeipK цього припущення був вивчений вплив дослщжуваних токсишв на проникшст мембран СР.

На модел1 замкнених мембран CP дослвджували ix проникшсть для Са2+ умовах розсювання градаенту цього катюна i вплив токсишв на цей процес. В! складаегься з двох фаз (Caswell, Brandt, 1981), ям вщр!зняються за швидистю. ] першу, швидку фазу вщбуваеться рух кальцию по специф!чним каналам, тоде я бшып повшьна фаза вщображае дифуз!йний процес.

Встановлено (Рис.8.), що з пщвищенням концентраци мкотоксишв в сере довшщ ввд 25 до 100 мкг/мл шдвшцуегься швидмсть виходу кальцио 13 СР. Hai бшышш вплив на звшьнення кальцио з везикул CP справляв верукарин А. Йог дая, як i шших дослщжуваних токсишв, вщбувалась у першу швидку фазу, що мс же свщчити про вплив токсишв на канальну провщшстъ мембран. В той же ча токсини не вплив али на швидость виходу кальцио в другу фазу, обумовлену да фуз!ею кальцш кр!зь мембрани СР.

Одержан! нами результата щодо впливу дослщжуваних МЦТЦ на транспор тш процеси в мембранах CP узгоджуються з да ею вщомого калыдевого юнофор А 23187, в присутносп якого зростае акгавшсть Mg24", Са2+ - АТФ-ази ¡з-за гада щено! проникносп мембран для Са2+ (Scarpa et al., 1972). Сутшсть цього явшц полягае в тому що, по Mipi накопичення Са2+ в CP в АТФ-залежному процес! кип ысгь Са2+ в порожнинах ретикулуму збшьшуеться i вщповщно зростае його град ент. При цьому, коли проникшсть мембрани CP шд впливом А 23187 збшынуеп

ся, то градонг Са2+ розспоеться, i акгившсть ферменту в такому випадку збшыпу-

ЕТЬСЯ.

А Б В

Час, с

—О—К -0-25МКГ -^50мкг ~>^100мкг

Рис.8 Кшетика виходу 45Са1+ « везикул фрагментованого саркоплазма-■ичного ретикулуму шд вшпгоом р1зних концешращй рорщину А(А), рорцщ-ry Н (Б), верукарину А (В)

Можна припустити, що встановлена спрямовашсть змтн в акгавносп фер-[енту шд впливом МЦТЦ обумовлена не прямою дою токсишв на актившсть «рменту, а вщбуваеться за рахунок збш.шенням проникносгп мембрани CP для альщю. ГБдвшцення проникносп для Са2+сприяе його накопиченню в цитоплаз-ii, що i супроводжуеться контрактурою м'яз^в, як це мае Miene при дендродохю-

ОКСИКОЙ.

висновки

1. Встановлет концентрат дослщжуваних МЦТЦ: дендродохшу та видшених нього шдивщуальних компонента верукарину А, рор1дину A i рорщину Н, що шгикають 30-50% пригшченяя росту тест-культур - Acholeplasma laidlawii PG-8, iccharomyces cerevisiae «Феодош», Chlorella vulgaris L 62. Показано, що кон-гнтрацш верукарину А, яка викликае 30% пригачення росту у мкоплазм стано-пъ 50 мкг/мл, а у хлорели - 0,05 мкг/мл.

2. Дендродохш проявляв шпбуючу даю на синтез бшка i нуклешових кислот у choleplasma laidlawii, а верукарин А, рорщин А спричиняли значну активуючу ю (до 200%) на синтез ДНК i РНК при концентращях ввд 1 до 20 мкг/мл.

3. Дендродсшн, верукарин А, рорщин A i рорщин Н пригшчують синтез бита нуклешових кислот у дослщжених представнигав eyKapioT Chlorella vulgaris Saccharomyces cerevisiae. Встановлено, що у Chlorella vulgaris найбшьше чутл1 вим до да токсишв (0,05 i 0,5 мкг/мл) е синтез ДНК, а найменш чутливим - синт бшка. У Saccharomyces cerevisiae процеси синтезу макромолекул по чутливосп; да токсишв (10 мкг/мл) можна розташувати в такому порядку - синтез бшеа, си тез РНК, синтез ДНК (до 25%, 40%, 70% шпбування, вщповщно).

4. Дослщжуваш МЦТЦ шпбують синтез бйка в Saccharomyces cerevisiae i еташ транскрипцн, що встановлено нами вперше. Вони акгивують ДНК-залеш РНК-пол1меразу I, в залежносп вщ концентрацп активують або шпбують РШ пол^меразу II, шпбують РНК-иол1меразу III.

5. Дослщжуваш токсини активують синтез хлорофшв a i в (до 175% вщ кон ролю) i каротинощв (до 250% вщ контролю) при темновому режим! культавува) ня Chlorella vulgaris i шпбують при свггловому режим1 культивування на гетеро' рофному i автотрофному середовшцах (на 50% i 80% вщ контролю, вщповщно).

6. Дослщжуваш МЦТЦ знижують сумарний вмют АТФ у клшшах Chloreh vulgaris при культивувата в умовах освплеиня. Екзогенне внесения АТФ в koi центраци 0,2 мМ на фош да цих метаболтв спричиняе вщновлювальну даю на п гмент-сшггезуючу акгившстъ.

7. Вперше представлене експериментальне обгрушування прояву контрактур скелетних м'язш у тварин, що спостери-аеться при дендродохютоксикозь МЦТ гадвищують проникшсть мембран саркоплазматичного ретикулуму для юшв каш цйо. При цьому розсйоегься ix градаент на мембраш i не наступае розслабленв

м'я31в.

8. Встановлено, що для дослщжуваних МЦТЦ верукарину А, рорщину A i pop дину Н характерна пол1функщональшсть в да на актившсть метаболлних проц< eis у представнимв eyxapioT i npoKapioT.

Список осповних опубл1кованих ираць

1. Скрипаль И.Г., Зайченко А.М., Бабичев В.В., Тугай Т.Н., Малиновская Л.Г О механизме действия 12,13-эпокситрихотеценов на синтез макромолекул у мога кутов //Микробиол. журн. - 1988. - 50, № 4. - С. 38 - 44.

2. Zaichenko А.М., Tugai T.I., Pavlovkin J. Effects of macrocyclic trichothecenes о bleaching m Chlorella vulgaris // Biologia (Bratislava). - 1989. - 44, N 11. - P. 1097 1105.

3. Tugai T.I., Zaichenko A.M., Pavlovkin J. Some aspects of the phytotoxic action с macrocyclic trichothecenes // Biologia (Bratislava). - 1989. - 44, N 11. - P. 1107 1112.

4. Зайченко А.М., Тугай Т.И., Шляховой В.В. Биосинтез 14С-макроциклических трихотеценов //Микробиол.журн. - 1989. - 51, № 2. - С. 71 -74.

5. Тугай Т.Н., Тугай В.А. Влияние макроциклических трихотеценов на фраг-менггированный саркоплазматический ретикулум скелетных мышц // Вюник проб-тем бюлогн i медицини. -1999. - 4. - С. 50 - 56.

5. Тугай Т.И. Новые данные о механизме действия некоторых макроциклических трихотеценов // Ред. ж. "Проблемы современной биологии" МГУ, Москва, 1986 - 4 с. Деп. в ВИНИТИ. - 1986, № 6642 -В 86.

7. Зайченко А.М., Тугай Т.И., Павловкин Я. О развитии "альбинизма" у "hlorella vulgaris под влиянием некоторых макроциклических трихотеценов // Ред. к. «Микробиолог, журн.» - Киев, 1989 - 16 с. Деп. в ВИНИТИ 30.08.88 г., № 6961 -В 88.

Тугай Т.И., Зайченко А.М., Павловкин Я. Некоторые особенности механиз-лов фитотоксического действия макроциклических трихотеценов из Dendrodochium toxicum // Ред. ж. «Микробиологический журнал» - Киев, 1989 -: 1 с. Деп. в ВИНИТИ. 30.08.88 г., № 6923-В 88.

». Зайченко А.М., Полищук Т.И., Шляховой В.В. Об ингибировании синтеза »елка и нуклеиновых кислот у Saccharomyces "vini некоторыми трихотеценовыми шкотоксинами // Тез. докл. VI съезда Укр.микробиол.об-ва- Киев: Наукова Дума.- 1984. -С. 60-61.

0. Зайченко А.М., Тугай Т.И. Современные представления о механизме дейст-ия трихотеценовых микотоксинов // Тез.докл. V съезда Укр.биохим.об-ва - Ив,->ранковск: Наукова Думка. 1987. - С. 58 - 59.

1. Тугай Т.И. Некоторые аспекты механизма действия макроциклических три-отеценов в их приложении к микотоксикозам //Тез.докл. Всесозн.конф. Антропогенная экология микромицетов, аспекты математического моделировала и охрана окружающей среды" - Киев. 1990. - С. 70.

Тугай Тетяна 1вашвна. Вивчення мехашзму да макроциклганих трнхо-тецешв i3 Dendrodochium toxicum Fi d op), et Bilai. - Рукопис.

Дисертащя на здобутгя наукового ступеня кандидата бюлопчних наук за спещальшстю 03.00.07 - мжробюлопя. - 1нститут мкробюлот i в1русолоп1 НАН Украшя, Кш'в, 2000.

Дисертащя присвячена вивчению деяких аспекта мехашзму да макрошвдп-чних трихотецешв, яю синтезуютъся Dendrodochium toxicum, щодо тест-культур i модельних систем.

Вивчено вплив МЦТЦ на синтез бшка i нуклешових кислот у тест-оргашзм1в. Показано, що дослвджуваш токсини в залежносп ,вщ концентрацп

спричиняють як жгибуючу, так i активуючу дао на ix синтез у найпроспшс представника npoKapioT Acholeplasma laidlawii i шгибуючу даю на синтез q сполук у представштв eyKapior Saccharomyces cerevisiae та Chlorella vulgark

Вперше показано, що дооиджуваш МЦТЦ впливають на синтез бшка др1 дшв на еташ транскрипцп, порушуючи функщонування основного фермен цього етапу ДНК-залежно! РНК-гашмерази.

Проведений пор1вняльний анализ дй дослдасуваних токсишв на pier i сшп шгмектв у хлореля при р1зних умовах культивування.

Виявлено зниження сумарного вмкяу АТФ в клатинах хлорели при оса ленш шд да ею дослщжуваних МЦТЦ.

Встановлена здатшеть до&шджуваних токсишв шдвищувати проникшс мембран саркоплазматичного ретикулуму для юшв калыцю, порушуючи йо градаент на мембраш, аналогично до впливу вщомого кальщевого юнофору 23187.

Knwuoei слова, Dendrodochium toxicum, макроциюпчш трихотецен комплекс тест-систем, механизм до, погамеразна актившеть.

Tugay Tetyana Ivanb na. Study of the mode of action of macrocyclic trichothecen from Dendrodochium toxicum Pidopl. et Bilai. - Manuscript. Thesis on coi

petition of the candidate of biological sciences scientific degree on a speciality 03.00.1 - microbiology. - D.K.Zabolotny Institute of microbiology and virology, National Аса emy of Sciences of Uloraine, Kiev, 2000.

The thesis is dedicated to analysis of some aspects of the mode of inhibitory a tion of the Dendrodochium toxicum macrocyclic trichothecenes, in relation to the test с ganisms and model systems.

Depending on concentration macrocyclic trichothecenes in rendered both activation ai inhibition of the protein and nucleic acid syntheses in the primitive prokaryotic represe tative Acholeplasma laidlawii, and inhibition of the syntheses of these compounds eukaryotic representatives Saccharomyces cerevisiae and Chlorella vulgaris.

For the first time it was shown, that studied macrocyclic trichothecenes influenc< the protein syntheses in yeasts at the stage of transcription, inhibiting the key enzyme > this stage DNA-dependeat RNA-polymerase.

Comparative analysis of action of investigated toxins on growth and on synthes of pigments in chlorella at different conditions was conducted.

The total ATP content in cells of chlorella decreased during lightening when stin ied mycotoxins were applied.

The ability of investigated toxins to increase the permeability of membranes i sarcoplasma reticulum for ions of calcium was established. Dissipation of the calciu

gradient across the membrane due to the mycotoxins was similar to influence of known ;alcium ionophore A 23187.

Keywords: Dendrodochium toxicum , macrocyclic trichothecenes, complex of sst-systems, mode of action, polymerase activity.

Тугай Татьяна Ивановна. Изучение механизма действия макроцикличе-скнх трихотеценов ш Dendrodochium toxîcum PidopL et Bilai. - Рукопись.

Диссертация на соискание тучной степени кандидата биологических наук [0 специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и виру-ологии им. Д. К. Заболотного HAH Украины, Киев, 2000.

Впервые в сравнительном аспекте изучена разноплановость биохимического ействия метаболитов Dendrodochium toxicum 5800 - дендродохина, веррукарина s роридина А и роридина H с использованием комплекса тест-культур и модель-ых систем, отражающих специфику различных сторон биологического действия гих токсинов.

При изучении действующих концентраций микотоксинов по отношении к зждой тест-культуре установлено, что наиболее ярко выражено фитотоксическое ействие, наименее - действие на микоплазмы, различия в концентрациях дости-ши трех порядков.

Показано, что все исследуемые токсины оказывали влияние на синтез белка, НК и ДНК у изученных тест-культур. У Acholeplasma laidlawii величина активи-дощего и ингибирующего действия на синтез белка не превышала 30%, в то )емя как величина активации синтеза нуклеиновых кислот достигала 200% от «ггроля, что свидетельствует о влиянии исследуемых токсинов на белок-штезирующую систему у простейшего представителя прокариот на этапе транс-шпции.

Установлено, что исследуемые МЦТЦ оказывали ингибирующее действие I синтез белка и нуклеиновых кислот у Chlorella vulgaris и Saccharomeces revisiae. Действующие концентрации токсинов по отношению к этим тест-'льтурам различаются в 10 - 15 раз.

Впервые установлено, что исследуемые МЦТЦ влияют на синтез белка у южжей на этапе транскрипции, нарушая функционирование ключевого фермен-этого этапа ДНК-зависимой РНК-полимеразы.

Проведено сравнительное изучение влияния исследуемых токсинов на рост синтез пигментов у хлореллы при различных режимах культивирования, когда ергообеспечение клетки осуществляется за счет либо окислительного (темновой жим) либо фотофосфорилирования (световой режим). Показано, что при темном режиме культивирования, исследуемые токсины не оказывали влияния на ст водоросли при всех исследуемых концентрациях, а в диапазоне концентра-

ций от 0,01 до 0.05 мкг/мл не влияли на синтез пигментов. Однако при даль» шем увеличении концентрации токсинов от 0,05 до 0,15 мкг/мл наблюдалась щественная активация синтеза хлорофиллов а и в и каротиноидов.

Установлено, что при световом режиме культивирования хлореллы набл дается сильно выраженное ингибирующее действие исследуемых МЦТЦ на рос синтез пигментов, а именно: при концентрации 0,05 мкг/мл наблюдалось 30% I гибирование роста и 80% ингибирование синтеза пигментов.

Показано, что изучаемые токсины снижают суммарное содержание АТС клетках хлореллы на свету. Экзогенное внесение АТФ на фоне действия токсш восстанавливает синтез пигментов. Такое действие подобно влиянию на хлорег протонофора карбонилцианидхлорфенилгидразина.

Установлено, что исследуемые токсины повышают проницаемость мембр саркоплазматического ретикулума для ионов кальция, разрушая его градиент мембране. Повышение проницаемости для ионов кальция способствует его нак< лению в цитоплазме, что, возможно, и приводит к контрактуре мышц при денд] дохиотоксикозе. Такое действие токсинов аналогично влиянию известного ка циевого ионофора А 23187.

Ключевые слова: Оепс1го<1осИшт Юх1сит, макроциклические трихотецеь комплекс тест-систем, механизм действия, полимеразная активность.

Подяка. Автор виражае щиру подяку член-кореспондешу НАНУ, доктс бюлолчних наук Скрипалю 1.Г. 1 кандидату бюлопчних наук Баб1чеву В.В. корисга консультацц 1 методичну допомогу при вивченш впливу МЦТЦ АсИо1ер1аята ШсИсмп Рв -.8. Автор виражае щиру подяку доктору бюлопчн наук, провщному науковому ствробтшку 1нституту бюх1ми НАНУ Тугаю В.А. методичну 1 практичну допомогу у проведенш дослщжень щодо впливу МЦТЦ фрагментований саркоплазматичний ретикулум.