Изучение Ca2+/рековерин-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой

Чурюмова, Валерия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение Ca2+/рековерин-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение Ca2+/рековерин-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой"

московский государственный университет

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет 003454 12^

На правах рукописи

ЧУРЮМОВА Валерия Александровна

ИЗУЧЕНИЕ Са2+/РЕКОВЕРИН-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ РОДОПСИНА, КАТАЛИЗИРУЕМОГО РОДОПСИНКИНАЗОЙ

03.00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

21 гпл:::]

Москва - 2008

003454124

Работа выполнена в отделе сигнальных систем клетки НИИ физико-химической биологии им А.Н. Белозерского МГУ им М.В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор П П Филиппов кандидат химических наук, старший научный сотрудник И И Сенин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор H.H. Чернов

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник E.H. Иомдина

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

JtrW

Защита диссертации состоится 8 декабря 2008 г. в ' на заседании Диссертационного совета Д 501 001.71 при Московском государственном университете им. М.В Ломоносова по адресу. 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им M В. Ломоносова.

Автореферат разослан 7 ноября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук

М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ионы кальция служат универсальным регулятором самых разнообразных процессов, протекающих в живой клетке. Воздействие ионов кальция на эти процессы в большинстве случаев опосредовано Са2+ -связывающими белками. За связывание иопов кальция у большинства Са2+-связывающих белков отвечает специальная структура, получившая название "EF-hand". Многие из белков, содержащих EF-hand-структуру, служат сенсорами ионов кальция для различных мишеней в клетках различных типов, например, в нейронах. Так, в настоящее время известно более сорока представителей EF-hand-содержащих Са2'-связывающих белков, специфичных для нервной ткани, которые составляют семейство нейрональных Са2+-сенсоров (neuronal calcium sensors, NCS). Белки семейства нейроналышх Са2+-сенсоров выполняют регулягорную роль в отношении различных внутриклеточных белков-мишеней таких, как: протеинкиназы, гуанилатциклазы, аденилатциклазы и ионные каналы. Изменение внутриклеточной концентрации Са2+ определяет комлартментализацию (раствор/мембрана) многих белков этого семейства, что в свою очередь модулирует их взаимодействие с сигнальными партнерами.

Типичным представителем семейства нейрональных Са2+-сенсоров является рекове-рин, высокоспецифичный для фоторецепторных клеток сетчатки, представляющих собой высокоспециализированные нейроны Функция рековерина в фоторецепторной клетке заключается в Са2+-зависимой регуляции десенситизации фотоактивированного рецептора (родопсина) путем его фосфорилирования, катализируемого ферментом родопсинкиназой. При высокой концентрации ионов кальция рековерин находится в комплексе с фоторецепторной мембраной и взаимодействует с родопсинкиназой, что приводит к ингибированшо фермента Тогда как при низких концентрациях катиона комплекс родопсинкиназа-рековерин диссоциирует и ингибирование снимается Процесс Са2+-зависимого ингибирования фосфорилирования родопсина происходит на фоторецепторной мембране при непосредственном взаимодействии рековерина и родопсинкиназы.

Актуальность данной работы обусловлена тем, что в настоящее время отсутствует полная информация о механизме Са2+-зависимого взаимодействия рековерина и его внутриклеточной мишени родопсинкиназы, а также роли фосфолипидпого матрикса фоторецепторной мембраны в функционировании этих белков

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение механизмов Са2+-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина родопсинкиназой. В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи.

• Выявление сайтов родопсинкиназы и рековерина, ответственных за взаимодействие

этих двух белков

• Изучение влияния состава фоторецепторной мембраны на регуляцию фосфорилиро-

вания родопсина

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе выявлен участок молекулы родопсинкиназы, принимающий участие во взаимодействии с ее внутриклеточным регулятором рековерином. Установлено, что заполнение Са2+-связывающего центра EF2 ре-коверина ионами кальция непосредственно контролирует экспонирование гидрофобного "кармана" и миристоильного остатка, и, как следствие, взаимодействие рековсрина с его мишенью - родопсинкиназой. Продемонстрировано влияние изменения содержания холестерина в составе фоторецепторных мембран на Са2+-зависимое связывание рековерина с мембранами. Показано, что повышение концентрации холестерина в составе мембран увеличивает способность рековерина ингибировать родопсинкиназу в результате сдвига полумакси-малыюго эффекта ингибирования в сторону низких концентраций свободного Са2+ и рековерина.

Практическая ценность работы заключается в том, что рековерин является одним из ключевых белков-регуляторов процесса фототрансдукции в фоторецепторной клетке, нарушение которого приводит к целому ряду зрительных патологий Понимание молекулярных механизмов передачи зрительного сигнала необходимо для разработки эффективных методов лечения заболеваний зрения.

Апробация работы Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ, на семинарах отдела сигнальных систем клетки НИИФХБ МГУ, на 7-й Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2003), международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2005) и на XVIII международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2006). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ. Структура и объбм работы. Диссертация изложена на 169 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 37 рисунками и 4 таблицами. Библиографический указатель включает 209 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Родопсинкиназа, или GRK.1, фермент, фосфорилирующий родопсин, представляет собой первую обнаруженную протеинкиназу семейства GRK [Lorenz et al, 1991]. Как и другие представители этого семейства протеинкиназ, родопсинкиназа фосфорилирует только сти-

мулированную (светоактивированную) форму родопсина (Rho*) На основании первичной структуры фермента и гомологии с другими представителями семейства Ser/Thr-протеинкиназ в молекуле родопсинкиназы (RK) вьщсляют три основных домена: центральный каталитический домен (RKig4-4M)> ограниченный N- и С- концевыми регуляторными доменами (соответственно RK.M83 и RK455.561)- С-концсвой домен родопсинкиназы содержит СААХ-мотив (CysValLeuSer561), который служит сигналом для присоединения фарнезильной группы к остатку цистеина, и сайты аутофосфорилирования (Ser448, Thr489).

Регуляция родопсинкиназы происходит при участии Са2+-связывающего белка рековерина, специфично экспрессирующегося в клетках сетчатки Молекула рековерина содержит 4 потенциальных Са2+-связывающих центра типа EF-hand, из которых только два, а именно второй и третий (EF2 и EF3 соответственно) способны связывать ионы кальция. Основными следствиями связывания ионов кальция с рековерином, белком, в котором функционирует Са2+ -миристоильный переключатель" (calcium-myristoyl switch), является: а) экспонирование гидрофобного "кармана" рековерина и б) экспонирование миристоильпого остатка, ковалентно присоединенного к N-концевому остатку рековерина. Это придает рекове-рину способность Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фоторецепторными мембранами и ингибировать его внутриклеточную мишень - родопсинкиназу.

Предыдущие исследования [Klenchm ct al., 1995] показали, что ингибирование родопсинкиназы под действием рековерина происходит при непосредственном взаимодействии этих двух белков. Однако механизм этого взаимодействия изучен не был, в частности, оставались неизвестными структурные участки, ответственные за связывание рековерина с его внутриклеточной мишенью. Кроме того, не было исследовано влияние фосфолипидного окружения (состава фоторецепторных мембран) на функционирование рековерина и родопсинкиназы Используя мутантные формы рековерина и рекомбинантные фрагменты родопсинкиназы, мы попытались ответить на эти вопросы в настоящей работе.

1. Влияние содержания холестерина фоторецепторных мембран па взаимодействие рековерина с мембранами и регуляцию фосфорилирования родопсина.

Большинство процессов, имеющих отношение к фототранедукции и ее регуляции, происходят непосредственно на мембране. Поэтому в основе обнаруженной способности рековерина ингибировать родопсипкиназную активность может лежать как прямое взаимодействие рековерина с родопсинкиназой, так и механизмы, вовлекающие фоторецепторную мембрану.

Известно, что в мембране фоторецепторных дисков, содержащихся в наружных сегментах палочки (НСП), обнаружена пространственная гетерогенность содержания холесте-

рина. Так, на новообразованные диски у основания НСП (базальные диски) приходится подавляющая часть массы холестерина, что составляет приблизительно 30% от общего количества липидов, в то время как на диски у окончания НСП (апикальные диски) - всего лишь 5% [Воезге-ВаИ^Иа е1 а1., 1990]. К моменту начала настоящей работы имелись данные, указывающие на пространственную неоднородность процессов передачи сигнала в НСП. Обнаружено, что ответ на единичный фотон, регистрируемый на конце НСП, имеет меньшую амплитуду, чем ответ, регистрируемый у его основания [8с1тар£ 1983]. Можно предположить, что эти различия кинетики фотоответа обусловлены составом фоторецепторной мембраны и, в частности, различным содержанием холестерина.

Для изучения влияния холестерина на регуляцию фосфорилирования светоактивиро-ванного родопсина мы получили фоторецепторные мембраны с различным содержанием холестерина: от 4,1 до 29,6%; при том, что нативные мембраны НСП содержат в среднем 14% холестерина. С использованием полученных мембран мы провели измерение влияния содержания холестерина на взаимодействие миристоилированяого рековерина с мембранами НСП и фосфолипидными везикулами при насыщающих концентрациях Са2+. (Исследование неми-ристоилированных форм не проводились, т.к. они с фоторецепторными мембранами не взаимодействуют.) В результате установлено, что с увеличением содержания холестерина от 4,1% до 29,6% количество рековерина, связанного с мембранами НСП, повышается (рис. 1А).

I 1.1% ХОЛССТСр;п!Е1

14% холестерина 29,6% холестерину

[родопсин], мкМ холестеоин. %

Рис. 1. Связывание рековерина с фоторецепторными мембранами и фосфолипидными везикулами, содержащими различное количество холестешна.

Далее мы исследовали взаимодействие рековерина с фосфолипидными везикулами, содержащими фосфатидилзтаноламин (РЕ) и фосфатидилхолин (РС) в соотношении 50:50 с градиентом содержания холестерина (5-50%) при насыщающих концентрациях Са2+. Обна-

ружено, что связывание рековерина с фосфолипидными везикулами увеличивается при возрастании концентрации холестерина по сравнению с везикулами, не содержащими холестерин (рис. 1Б).

Таким образом, результаты нашего исследования взаимодействия рековерина с фото-рецепторными мембранами и фосфолипидными везикулами, содержащими различные концентрации холестерина, позволяют сделать вывод о том, что связывание рековерина с мембранами зависит от содержания в них холестерина.

Для подтверждения полученных результатов по влиянию холестерина на взаимодействие рековерина с мембранами мы использовали альтернативный метод - спектроскопию поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance, SPR). С помощью метода SPR мы исследовали влияние холестерина на взаимодействие рековерина с иммобилизованным фосфолипидным бислоем. В этих экспериментах мы использовали систему "рековерин -искусственная фосфолипидная мембрана". В этой системе искусственный липидный бислой образует однородную поверхность на SPR-чипе и присутствует в неподвижной фазе в течение хода эксперимента, в то время как рековерин находится в составе растворимой фазы, подвижной относительно иммобилизованного липидного бислоя.

Для иммобилизации на гидрофобный сенсорный чип мы приготовили смесь фосфо-липидов двух типов: а) РЕ и PC (50:50) и б) РЕ, PC и холестерина (25:25:50). Полученные чипы использовали для измерения взаимодействия рековерина с иммобилизованными липи-дами в присутствии насыщающей концентрации Са2+. При иммобилизации смеси липидов, содержащей холестерин, максимальная амплитуда сигнала связывания возрастала приблизительно в 2 раза по сравнению с сигналом в отсутствие холестерина (рис. 2).

PR: PC : холсстсрии

Рис. 2. ЭРЯ-сенсограммы, отражающие взаимодействие рековерина с иммобилизованным липидным бислоем. Концентрация СаСЬ составляла 200 мкМ, рековерина - 5 мкМ. Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение которого в подвижной фазе отсутствует (не закрашено) и присутствует (закрашено черным) рековерин.

Варьирование концентрации рековерина в условиях насыщающих концентраций ионов кальция привело к такому же результату: в присутствии холестерина максимальная амплитуда сигнала связывания была в 2 раза выше, чем без него (рис. 3).

2500

э 2000

as «

1 1500 u s

| 1000 г s

e 500

О 20 40 SO 80 1О0

(рековерин], мкМ

Рис. 3. Зависимость связывания рековерина с иммобилизованным липидным бислоем от концентрации белка. Липидный бислой содержал РЕ:РС в соотношении 50 50 или РЕ:РС:холестерин в соотношении 25:25:50.

Далее мы изучили зависимость ингибирования активности родопсинкиназы от концентрации рековерина и Саг+ при различных концентрациях холестерина в мембранах НСП. Полумаксимальная константа ингибирования (Kjo) родопсинкиназы составила 6,6 мкМ рековерина в присутствии мембран НСП с исходным содержанием холестерина, равным 14%. В то время как в присутствии мембран НСП, содержащих 29,6% холестерина, значение К50 составляло 4,5 мкМ рековерина (таблица 1). Изменение содержания холестерина в мембранах НСП также оказывает влияние на зависимость ингибирования родопсинкиназы от концентрации ионов кальция: при увеличении концентрации холестерина от 4,1% до 29,6% величина К.50 для ионов кальция сдвигается в область более низких значений концентрации свободного кальция ([Ca2+]f), а именно уменьшается от 4,31 мкМ до 0,82 мкМ [Ca2+]f (таблица 1)

Таблица 1. Зависимость активности родопсинкиназы от концентрации рековерина и свободного кальция при различном содержании холестерина в мембранах.

Содержание холестерина в мембране НСП

4,1% 14% 29,6%

К5о [рековерин] 10,4мкМ 6,6 мкМ 4,5 мкМ

Ки [Ca¿+lr 4,31 мкМ 2,43 мкМ 0,82 мкМ

В настоящее время в литературе широко обсуждается влияние специфических мембранных доменов, нерастворимых в детергенте, (так называемых, рафт-структур) на процес-

сы, имеющие отношение к клеточной сигнализации [Nair et al., 2002] Рафт-структуры, обнаруженные в НСП, характеризуются высоким содержанием холестерина [Martin et al., 2005]. Наши результаты, демонстрирующие увеличение сродства рековерина к мембранам с повышенным содержанием холестерина, указывают на возможность нахождения рековерина и родопсинкиназы в составе рафт-структур Поскольку мы показали что, Са2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы усиливается при условии высокого содержания холестерина в мембранах НСП, можно предположить, что этот процесс происходит более эффективно в рафт-струкгурах, чем в мембранах вне этих структур. Для подтверждения нашего предположения мы сравнили ингибирование активности родопсинкиназы в присутствии фоторецеп-торных мембран и рафт-структур, изолированных из мембран НСП.

Из графика зависимости активности родопсинкиназы от концентрации рековерина, представленного на рисунке 4А, следует, что ингибирование родопсинкиназы в присутствии рафт-структур происходит при немного меньших концентрациях рековерина по сравнению с мембранами НСП (К50 = 4,9 мкМ в рафт-структурах и 5,3 мкМ в фоторецепторных мембранах) Однако при исследовании зависимости активности родопсинкиназы от концентрации Са2+ мы обнаружили существенный сдвиг К50 в сторону низких концентраций Са2+ в присутствии рафт-структур (рис. 4Б). Это говорит о том, что Са2+-зависимое ингибирование реко-верином фосфорилирования родопсина более эффективно в рафт-структурах по сравнению с нативными фоторецепторными мембранами (К50 = 0,76 мкМв рафт-структурах и 1,91 мкМ в фоторецепторных мембранах).

Рис. 4. Зависимость активности родопсинкиназы от концентрации рековерина (А) и Са2+ (Б) в присутствии фоторецепторных мембран и рафт-структур.

Полученные нами данные говорят о том, что а) высокая концентрация холестерина способствует связыванию рековерина с мембранами и б) холестерин увеличивает эффективность ингибирования активности родопсинкиназы рековерином.

В одной из последних работ по изучению светозависимой транслокации сигпальных белков в фоторецепторной клетке обнаружены факты, указывающие на наличие градиента концентрации рековерипа в НСП [Stnssel et al., 2005]. В этой работе показано, что более высокая концентрация рековерина присутствует в базальной части НСП, т е. градиент концентрации рековерина в НСП аналогичен таковому в случае холестерина. В соответствии с нашими данными можно полагать, что именно градиент концентрации холестерина в мембранах НСП обусловливает наблюдаемый градиент концентрации рековерина. Как уже было сказано выше, в НСП существует градиент концентрации холестерина: для базальных дисков до 30%, для апикальных - до 5% По нашим данным, эффективность ингибирования родоп-синкиназной активности рековерином также является гетерогенным процессом, тк. в базальной части НСП эффективность ингибирукяцего действия рековерина выше, чем в апикальной области в результате сдвига значения полумаксимального эффекта ингибирования фермента в сторону низких концентраций свободного Са2+ и рековерипа. Результаты наших экспериментов, полученные в условиях in vitro, объясняют описанные ранее наблюдения т vivo [Schnapf, 1983] о том, что выключение передачи светового сигнала в базальной части НСП происходит медленнее, чем в их апикальной области

2. Исследование роли Са2+-связывающих центров рековерина в ингибнровании ро-допсинкиназы.

К началу настоящей работы в нашей лаборатории были получены две мутантные формы рековерина, у которых не функционировал один из двух работающих в рековерине дикого типа (vvr-рековерине) Са2+-связывающих центров (рис. 5). Это - мутант RcES5Q, у которого не функционирует центр EF2 вследствие замены остатка глутаминовой кислоты в 85-м положении на остаток глутамина. и мутант у которого не функционирует центр

EF3 из-за аналогичной замены в 121-м положении В дальнейшем при изучении мутантных

форм рековерина с модифицированными Са2+-связывающими центрами было показано, что 2+

заполнение Са -связывающих центров катионами происходит последовательно Сначала заполняется центр EF3 и лишь затем - центр EF2, при этом координация катионов центром EF3 является необходимым условием для последующего связывания ионов кальция в центре EF2 Механизм последовательного заполнения Са2+-связывающих центров ионами кальция функционирует только в миристоилированном рековерине и не действует в его немиристоилиро-ванной форме [Permyakov et al., 2000, Senin et al., 2002].

Рековерин действует как Са2+-сеисор родопсинкиназы, ингибируя ее при относительно высоких концентрациях катиона Связывание ионов кальция с молекулой рековерина приводит к экспонированию его гидрофобного "кармана", в результате чего рековерин ста-

новится способным взаимодействовать с родопсинкиназой и ингибировать этот фермент [Та-сЫЬапаЬ е1 а1., 2000]. Как уже было сказано выше, молекула рековерина содержит два функционирующих Са2 '-связывающих центра, в то же время роль каждого из этих центров в ин-гибировании родопсинкиназы оставалась неустановленной. Казалось бы, ответ на этот вопрос мог быть получен с использованием мутантов рековерина, один из которых способен связывать ионы кальция во втором Са2+-связывающем центре, а другой - в третьем Са2+-связывающем центре Однако из-за того, что в миристоилированном рековерине функционирует вышеописанный механизм последовательного заполнения Са2+-связь:вающих центров ионами кальция, миристоилированныи мутант Яс0215 с нефупкциониругощим третьим Са -связывающим центром ионы кальция вообще не связывает [Зешп й а1, 2002]. Поскольку в немиристоилированном рековерине связывание ионов кальция с его Са2+-связывающими центрами происходит независимо [Атез е1 а1, 1995], мы попытались ответить на вопрос о роли каждого из двух Са2+-связывающих центров рековерина в экспонировании его гидрофобного "кармана" и, соответственно, в ингибировании родопсинкиназы, используя немири-стоилированные формы мутантов рековерина (содержит "испорченный" центр ЕБ2) и

Яс121214 (содержит "испорченный" центр ЕРЗ).

и^-рековерин

мутант Лс

ЕР1

ЕР2

4 ■» > «у

ЕРЗ

109

121

ЕБ4

159

170

мутант 1{сЕШ13

Е850

сги—щ>-

кшд

Рис. 5. Схема локализации Са2+-связывающих центров в и^-рековерине и его мутантах по второму (мутант 11сЕ85<3) и третьему (мутант Лс6'2"3) центрам типа ЕР-Ьапс!. Центры, способные (Е5в8) и не способные (I I) связывать Са2+, обозначены прямоугольниками

Ранее было показано, что немиристоилированная форма мутанта ЯсЕ85д, который содержит "испорченный" Са2+-связывающий центр ЕР2, способна связывать ионы кальция за счет Са2+-связывающего центра ЕРЗ [\Veiergraber е1 а1., 2003]. Используя радиоактивный изотоп 45Са2ь, мы показали, что немиристоилированная форма мутанта рековерина Яс612"3, не-

смотря на то, что в ней присутствует "испорченный" Са2+-связывающий центр ЕРЗ, способна, в отличие от миристоилированной форма этого мутанта, связывать ионы кальция за счет Са2+-связывающего центра ЕБ2 (рис. 6). При этом величина константы диссоциации (Ко) для ионов кальция составила 6,4 мкМ, что совпадает со значением Кс для Са2+-связывакпцего центра ЕР2 в рековерине дикого типа по данным в работе [Атев й а!., 1995].

Показателем экспонирования гидрофобного "кармана" рековерина может служить его способность взаимодействовать с гидрофобным носителем фенилсефарозой [Рйапв е1 а1, 1991] В связи с этим мы исследовали связывание немиристоилированных форм мутантов рековерина Яс и и рековерина дикого типа с фенилсефарозой. Исследуемые фор-

мы рековерииа инкубировали в присутствии суспензии фенилсефарозы в диапазоне [Са2+]г от 10 нМ до 100 мкМ; степень связывания указанных форм рековерина с носителем определяли по количеству белка, оставшегося в растворе после осаждения фенилсефарозы.

Рис. 6. Связывание 45Са2+ с немиристоилированной формой мутанта КсЕ121<3.

Как было показано ранее [вепт е1 а1., 2002], миристоилированный ту?-рековерин Са2+-зависимым образом взаимодействует с фенилсефарозой, тогда как миристоилироваппые мутанты КсЕ85С! и ИсШ1<;! такой способностью не обладают. Это говорит о том, что оба мутанта в присутствии ионов кальция не экспонируют гидрофобные аминокислотные остатки, необходимые для взаимодействия с гидрофобной матрицей Используя немиристоилированные формы рековерина, мы показали, что немиристоилированный и^-рековерин способен, подобно миристоилированной форме белка, Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фенилсефарозой (рис. 7). Оказалось, что немиристоилированный мутант 11сЕП1С!, несмотря на отсутствие в нем функционального центра ЕРЗ, взаимодействует с фенилсефарозой аналогично к^-рсковерину. При этом взаимодействие происходит в том же диапазоне [Са2+]г, что и при заполнении катионом нативного Са2+-связывающего центра ЕБ2 в м4-рековерине, В от-

личие от мутанта Ясы21у, немиристоилированный 11сЕ85С!, хотя и связывает ионы кальция за счет центра ЕРЗ, с фенилсефарозой не взаимодействует.

• - Ш-рековерип

А -Яс"'4

в_КсЕш<г

__—*— —I

|Са'*|„»кМ

Рис. 7. Са -зависимое связывание немиристадлированных форм рековерина с фенилсефарозой За 100% принято общее количество рековерина в пробе Величина К50 для рековерина дикого типа составила 1,19 мкМ, для ИсЕ'21® - 1,48 мкМ.

Следовательно, можно сделать вывод, что заполнение ионами кальция центра ЕР2, но не ЕРЗ, определяет способность рековерина взаимодействовать с фенилсефарозой и что координация ионов кальция именно в Са2+-связывающем центре ЕБ2 необходима для экспонирования гидрофобного "кармана" рековерина Этот вывод в свою очередь предполагает, что координация ионов кальция в Са2+-связывающем центре ЕР2 необходима для придания ре-коверииу способности ингибировать родопсинкиназу. Правильность этого предположения подтвердили наши последующие эксперименты по исследованию способности нсмиристои-лированных форм М-рековерина и мутантов ЯсЬ85<3 и ЕсЕ12|<3 ингибировать родопсинкиназу Са2+ -зависимым образом.

В этих экспериментах активность родопсинкиназы измеряли по включению радиоактивного фосфата [у32Р]-АТФ в родопсин в реконструированной системе, содержащей отмытые мочевиной фоторецепторные мембраны, очищенную родопсинкиназу и исследуемые формы рековерина. Концентрацию свободного кальция варьировали в диапазоне от 1 нМ до 100 мкМ. Как следует из рис. 8, немиристоилированный мутант 11сш,д, который содержит "испорченный" Са2+-связывающий центр ЕРЗ и, соответственно, координирует ионы кальция только за счет Са2+ -связывающего центра ЕР2 способен ингибировать родопсинкиназу Са -зависимым образом. При этом величина К50 по Са2+ для данного мутанта близка к таковой для и>г-рековерина, хотя и несколько сдвинута в область более высоких концентраций ионов кальция. В то же время, немиристоилированный мутант КсЕ85°, в котором "испорчен" Са2+-

связывающий центр ЕБ2 и который координирует ионы кальция только за счет Са2+-связывающего центра ЕРЗ, не способен ингибировать родопсинкиназу.

• 60 *чТ Чкт

р • - wt-рековепин i.. т Ч

S А - Rc Q Hi

| 40- B.RC^

0001

0 01

100

|Ca Jf, mkM

Рис. 8. Са2+-зависимое ингибирование активности родопсинкиназы немиристоилированными формами wr-рековерина и мутантами RcE85Q и RcE121Q. За 100% принята активность родопсинкиназы в отсутствие рековерина Величина К50 для рековерина дикого типа составила 0,8 мкМ, для Rce - 3 мкМ.

Таким образом, описанные эксперименты прямо показывают, что именно связывание ионов кальция в Са2+-связывающем центре EF2 обеспечивают взаимодействие рековерина с родопсинкиназой и ее ингибирование.

3. Выявление сайтов родопсинкиназы, ответственных за ее взаимодействие с реко-верипом.

Биохимические эксперименты на препаратах НСП in vitro продемонстрировали, что рековерин ингибирует фосфорилирование родопсина, взаимодействуя с родопсинкиназой [Klenchin et al., 1995, Senm et al, 2005], Можно предположить два механизма ингибирования Согласно первому механизму, рековерин непосредственно действует на каталитическую активность родопсинкиназы, взаимодействуя с ее каталитическим доменом. Согласно второму, рековерин с1ерически препятствует формированию фермент-субстратного комплекса родопсинкиназы с фотоактивированным родопсином, не затрагивая активный центр фермента. В предыдущих работах показано, что родопсинкиназа в присутствии рековерина теряет способность фосфорилировать светоактивированный родопсин. При этом рековерин не оказывает влияния на процесс фосфорилировааия родопсинкиназой 11-членного пептидного субстрата, гомотетичного фрагменту родопсина, который содержит сайты фосфорилирования. Эти данные предполагают, что рековерин блокирует участок родопсинкиназы, необходимый

для узнавания светоактивированного родопсина, не оказывая влияние на каталитическую активность фермента как такового Рековерин ингибирует родопсинкиназу посредством взаимодействия с участком, удаленным от каталитического центра, следовательно, потенциальными сайтами связывания рековерина могут быть участки, находящиеся в регуляторных N- и С-концевых доменах родопсинкиназы.

Целью настоящего раздела работы было выяснение локализации участков родопсинкиназы, отвечающих за ее взаимодействие с рековерином. Для ответа на этот вопрос нами была получена рскомбинантная родопсинкиназа, а также рекомбинантные фрагменты фермента, соответствующие его N-концевому (ШС].ш) и С-концевому (RK455.561) доменам, и изучено их взаимодействие с рековерином.

3 1. Клонирование, идентификация и экспрессия полноразмерного гена родопсинкиназы и фрагментов гена родопсинкиназы.

Исходная конструкция, предположительно содержащая полноразмерный ген родопсинкиназы, была любезно предоставлена доктором М. Ахтаром (Department of Biochemistry, University of Southampton, United Kingdom) На первом этапе работы нами было проведено секвенирование гена и показано, что предоставленная кДНК соответствует гену родопсинкиназы

Для проведения экспрессии гена родопсинкиназы нами была выбрана система экспрессии под контролем РНК-полимеразы фага Т7, предложенная Студиером [Studier et al, 1986] С этой целью ген родопсинкиназы клонировали в вектор рТ7-7, содержащий последовательность промотора фага 11, и трансформировали полученной конструкцией клетки штамма Е coli BL21 (DE3), в хромосоме которых имеется последовательность гена Т7 РНК-полимеразы под контролем 1ас-промотора. Наличие 1ас-промотра позволяет индуцировать экспрессию гена Т7 РНК-полимеразы и, как следствие, гена, клонированного в рТ7-7, добавлением в культуральпую среду синтетического аналога лактозы изопропил-13-D-тиогалактозида (ИПТГ).

Электрофореграмма экстракта клеток Ecoli BL21(DE3) после проведения аналитической экспрессии полноразмерного гена родопсинкиназы, представленная на рис. 9, демонстрирует наличие белка с кажущейся молекулярной массой - 67 кДа, соответствующего ро-допсинкиназс. Уровень экспрессии полноразмерной родопсинкиназы в клетках Е coli, как следует из электрофореграммы, оказался невысоким. Последующие попытки выделения ре-комбинантного белка были безрезультатными из-за низкого уровня экспрессии. Вследствие этого для проведения экспериментов нами было принято решение получить рекомбинантные фрагменты родопсинкиназы, соответствующие ее доменам

м -шпг+ишт

тш

Рис. 9. Экспрессия полноразмерного гена родопсинкиназы. Экстракт клеток Е.соИ ВЬ21(ОЕЗ), трансформированных плазмидой рТ7-7-ЮС, до индукции ИПТГ (-ИПТГ) и после индукции 0,1 мМ ИПТГ (+ИПТГ). «М» - стандарты молекулярной массы.

Для получения рекомбинантных фрагментов родопсинкиназы нами был выбран нлаз-мидный вектор рОЕХ5х-1 (Amersham Biosciences), содержащий ген глутатион S-трансферазы (КФ 2.5.1.18) из Schistosoma japonicum. Данная экспрессионная система позволяет проводить экспрессию генов в виде химерных белков, слитых в рамке считывания с глутатион S-трансферазой (GST), что облегчает выделение белков из клеточного экстракта с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном глутатионе [Smith, Johnson, 1988]. Нами были получены генетические конструкции, которые содержат фрагменты гена родопсинкиназы, кодирующие N-концевой домен (pGEX5x-l-N) и С-концевой домен (pGEX5x-l-C), слитые в рамке считывания с геном GST. Экспрессию генов химерных белков проводили в прокариотической системе с использованием штамма Е. coli BL21. После индукции экспрессии генов с помощью ИПТГ образование белков анализировали с помощью SDS-электрофореза экстрактов клеток (рис. 10). Данные, приведенные на рис. 10, указывают на образование рекомбинантных белков с молекулярной массой около 45 кДа и 38 кДа, что соответствует молекулярным массам белков, соответствующих N- и С- концевым доменам родопсинкиназы, экспрессирующимся в одной рамке считывания с GST (GST-N и GST-C).

Уровень экспрессии генов GST-N и GST-C оказался достаточно высоким, но основная часть данных белков накапливалась в форме нерастворимых телец включения. Причиной образования нерастворимых белков может быть как очень высокий уровень экспрессии генов, так и восстановление дисульфидных связей в белках [Lobe] et al., 2001]. Для увеличения образования растворимой формы белков нами был проведен ряд экспериментов по оптимизации условий экспрессии, направленных на уменьшение скорости трансляции по следующим параметрам: температуре роста клеток в диапазоне 20-37°С, оптической плотности клеточной культуры в диапазоне Абоо от 0,5 до 1 до индукции и времени индукции в диапазоне от 30 минут до 3 часов. Однако любые попытки увеличить выход растворимой формы белка на

стадии биосинтеза в бактериальных клетках не привели к успеху - количества растворимого химерного белка не превышали 100 мкг на 1 литр среды, в результате чего выделение химерных белков из клеточного экстракта оказалось невозможным. По этой причине нами было принято решение о выделении рекомбинантных белков GST-N и GST-C из образующихся телец включения. Мы опробовали действие ряда детергентов: Тритона Х-100, Твина-80 и лаурилсаркозина натрия на примере выделения GST-N. При этом было установлено, что наибольшее количество экстрагируемого химерного белка GST-N получается при солюбили-зации телец включения в растворе, содержащем 1,5% лаурилсаркозин натрия и 2% Тритона Х-100. Поэтому в дальнейшем мы использовали именно эти детергенты для выделения фрагментов родопсинкиназы, слитых в рамке считывания с GST.

GST-N GST-C

М -ИПТГ +ИТТГГ -ИПТГ1 иптг

Рис. 10. Экспрессия рекомбинантных генов GST-Nh GST-C. Экстракт клеток E.coli BL21, трансформированных плазмидой pGEX5x-l-N (GST-N) и pGEX5x-l-C (GST-C), до индукции ИПТГ (-ИПТГ) и после индукции 0,1 мМ ИПТГ (+ИПТГ). «М» - стандарты молекулярной массы.

С учетом полученных данных нами был разработан и оптимизирован метод получения и выделения химерных белков GST-N и GST-C, продуцируемых Е. coli в виде нерастворимых телец включения. Метод состоит из следующих процедур: первая экстракция - удаление растворимых белков в нативных условиях, вторая экстракция выделение нерастворимых белков в присутствии 1,5% лаурилсаркозииа натрия и 2% Тритона Х-100 и последующая очистка химерных белков на иммобилизованном глутатионе. Фракции белков после каждой стадии выделения анализировали методом SDS-электрофореза (рис. 11).

3.2. Выявление доменов и сайтов родопсинкиназы. ответственных за ее взаимодействие с рековемном.

Следующим этапом нашей работы было установление доменов родопсинкиназы, ответственных за ее взаимодействие с рековерином. С этой целью мы использовали следую-

щую систему. К суспензии глутатионсефарозы, на которой предварительно иммобилизовали очищенный химерный белок, содержащий GST, добавляли рековерин при конечной концентрации Са2' в системе, равной 2 мМ. После инкубации реакционной смеси в течение 1 часа при 4°С глутатионсефарозу трижды промывали буфером, содержащим 2 мМ СаСЬ. Затем белки элюировали с помощью 1% SDS и полученные фракции анализировали методом SDS-электрофореза.

Рис. 11. Выделение и очистка рекомбинантных белков GST-N (А) и GST-C (Б). «М» -стандарты молекулярной массы, «ЭК» - экстракт клеток E.coli BL21, «Р» - фракция растворимых внутриклеточных белков, «Н» - фракция нерастворимых внутриклеточных белков, солюбилизированных в растворе, содержащем 1,5% лаурилсаркозин натрия и 2% Тритон Х-100, «Элюат» - фракция белков после хроматографической очистки на глутагионсе-фарозе, элюирование 10 мМ глутатионом.

Перед началом исследования взаимодействия белков GST-N и GST-C, с рековерином с использованием описанной системы, мы провели контрольные эксперименты по изучению взаимодействия GST с рековерином, из которых однозначно следует, что рекомбинантный белок GST сам по себе с рековерином не взаимодействует. Таким образом, данная система может быть использована для изучения взаимодействия белков GST-N и GST-C с рековерином.

Результаты эксперимента по связыванию химерных белков GST-N и GST-C с рековерином представлены ка рис. 12. Как видно из представленных данных, N-концевой домен родопсинкиназы в составе химерного белка взаимодействует с рековерином. Напротив, взаимодействия между С-концевым доменом родопсинкиназы и рековерином не наблюдается.

Для более точной локализации участка N-концевого домена родопсинкиназы, вовлеченного во взаимодействие с рековерином, мы провели исследования с использованием синтетических пептидных фрагментов родопсинкиназы ЮСц-гб и RK2.i6. Эксперимент заключал-

ся в выяснении способности данных пептидных фрагментов конкурировать с иммобилизованным И-концевьш доменом родопсинкиназы за связывание с рековерином. Выбор пептидов обусловлен нашими предварительными результатами, из которых следует, что фрагмент родопсинкиназы полученный путем ограниченного протеолиза фарнезилиро-

ванного белка в присутствии Авр-Ы-эндопротеиназы, теряет способность взаимодействовать с рековерином. Из этого следует, что во взаимодействие с рековерином вовлечен участок 123 регулягорного ^концевого домена родопсинкиназы.

М Ис 1 -1{с +13 1 -Ис +11С1

94,6

бва тт

' ШШ- Шк

45,0 , шрр Шт ц^

31,0 .!'-'. - - : : гг"*

21,5

14,4

***

Рис. 12. Взаимодействие химерных белков СЭТ-Ы и вйТ-С с рековерином. «М» - стандарты молекулярной массы; «Яс» - очищенный препарат рековерина; «-Яс» - фракция белков элюированных с глутатионсефарозы 1% ЭОЭ в отсутствие рековерина в инкубационной смеси; я+Яс» фракция белков элюированных с глутатионсефарозы 1% ЭОЭ в присутствии рековерина в инкубационной смеси.

• Эксперимент проводили в соответствии со следующей схемой. К суспензии глутатионсефарозы, на которую предварительно иммобилизовали очищенный химерный белок ОЭТ-N. добавляли рековерин при конечной концентрации Са2+ в системе 2 мМ. После инкубации реакционной смеси в течение 1 часа при 4°С глутатионсефарозу трижды промывали буфером, содержащим 2 мМ СаС'Ь. Элюирование рековерина проводили одним из трех буферов, содержащих: (а) 1 мМ пептид RK.ii.26» (б) 1 мМ пептид RK2.1t, или (в) 2 мМ Са2+ (в качестве контроля, чтобы исключить неспецифическое элюирование рековерина). Для определения количества рековерина, оставшегося связанным с иммобилизованным 1Ч-концевым доменом родопсинкиназы после элюирования в каждом из трех экспериментов, препарат глутатионсефарозы обрабатывали буфером, содержащим 2 мМ ЭГТА.

На рис. 13 представлены результаты но Са2+-зависимому связыванию рековерина с Ы-концевым доменом родопсинкиназы в присутствии и в отсутствие пептидных фрагментов родопсинкиназы КК2-16 и ЯК] | _2ь-

Как следует из рис. 13, рековерин взаимодействует с М-концевым доменом родопсин-киназы в присутствии Са2+ (дорожка 3), тогда как при последующем элюировании буфером, содержащим ЭГТА, рековерин диссоциирует из комплекса с фрагментом родопсинкиназы (дорожка 4). Добавление синтетического пептида, соответствующего амнокислотным остаткам 11-26 родопсинкиназы (ЫСи-гб), полностью предотвращает взаимодействие рековерина с иммобилизованным М-концевым доменом родопсинкиназы (дорожка 7), т.к. последующая обработка ЭГТА не приводит к дополнительному элюированию рековерина (дорожка 8). Однако добавление пептида ЯКг-ш практически не влияет на взаимодействие между рековери-ном и И-концевым доменом родопсинкиназы (дорожка 5), о чем свидетельствует значительное количество рековерина во фракции белков после элюции ЭГТА (дорожка 6).

ЭлюагСа2+ Элюяг 16 Эяюаг ККП

п г

М С,8>Ш 1 ЭГТА 1 1 ЭГТА 1 1 ЭГТА1 ас 94,6 «да •■..:■

бед «т

45,0 а

21,5 -Щ

1234567 8 9

Рис. 13. Конкуренция между химерным белком бЭТ^ и пептидами ТЖц-26 и КК2_16 за взаимодействие с рековерином.

Таким образом, на основании наблюдаемой в ходе эксперимента конкуренции между фрагментом Ы-концевого домена ИКц.2(, и цельм И-концевым доменом родопсинкиназы за взаимодействие с рековерином можно заключить, что участок ИКи-аб регуляторного 1М-концевого домена родопсинкиназы вносит основной вклад во взаимодействие родопсинкиназы и рековерина.

выводы

1. Сродство рековерина к фоторецепторным мембранам возрастает при увеличении в них концентрации холестерина.

2. Повышение содержания холестерина в фоторецепторных мембранах приводит к уменьшению уровня фосфорилирования содержащегося в них родопсина вследствие усиления Са2+-зависимо1 о ингибирования родопсинюшазы рековсрином.

3. Связывание ионов кальция с Са2+-связывающим центром рековерина ЕР2, но не ЕРЗ, обусловливает экспонирование неполярных боковых цепей гидрофобного "кармана" белка и тем самым - Са2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы

4. За взаимодействие родопсинкиназы с рековсрином отвечает регуляторный 14-концевой домен фермента, причем основной вклад вносит ее фрагмент ИСц.гб

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Ваганова С.А , Сенин И.И., Чурюмова В А . Зинченко Д.В., Заргаров А А., Липкин В М , Koch К -W. Механизм Са2+ -зависимого ингибирования рековерином фосфо-рилирования светоактивированного родопсина, катализируемого родопсинкина-зой. Тезисы докладов VI чтений, посвященных памяти академика Ю.А Овчинникова Москва - Пущино, 25 ноября - 2 декабря, 2002, с.78

2. Чурюмова В.А . Ваганова С А., Зинченко Д.В., Заргаров А.А., Сенин И.И Белковый дизайн Са2+-связывающего белка рековерина' создание искусственного каль-ций-связывающего участка в молекуле рековерина Тезисы докладов 7-й Пущин-ской конференции молодых ученых. Пущино, 14-18 апреля, 2003, с. 390

3. Senin I.I., Hoppner-Heitmann D„ Polkovnikova O.O., Churumova V.A. Tikhomirova N K., Philippov P.P., Koch К -W. Recoverin and rhodopsin kinase activity in detergent-resistant membrane rafts from rod outer segments. J. Biol Chem. 2004; v. 279 (47); p. 48647-53.

4. Senm 11., Hoeppner-Heitmann D., Polkovnikova O.O., Churumova V A.. Tikhomirova N.K., Philippov P.P., and Koch K.-W. Recoverin and rhodopsin kinase activity in detergent-resistant membrane rails from rod outer segments. 8th European symposium on calcium binding proteins in normal and transformed cells Cambridge, UK, 30 July - 2 August, 2004, p. 83.

5 Komolov K.E , Zinchenko D.V , Churumova V A.. Vaganova S.A., Weiergraber О H , Senm 11., Philippov P.P., Koch K.-W. One of the Ca2+ binding sites of recoverin exclusively controls interaction with rhodopsin kinase. Biol. Chem. 2005, v. 386 (3); p. 285289.

6. Чурюмова B.A.. Комолов K.E., Сенин И.И, Филиппов П.П., Koch K.-W. Роль Са2+-связывающих центров рековерина в Са2+-зависимой регуляции родопсинкиназы. Тезисы докладов международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 6-9 июня, 2005, с. 220-222.

7. Чурюмова В А.. Сенин И.И., Hoeppner-Heitmann D., Тихомирова Н К., Филиппов П.П., Koch K-W. Изучение влияния содержания холестерина в составе фоторецеп-торных мембран на процесс фосфорилирования родопсина, катализируемый ро-допсинкиназой. Тезисы докладов XVIII международной зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 7-10 февраля, 2006, с 70

8. Weiergraber O.H., Senin I.I., Zenui E.Y., Chummova V.A.. Kovaleva N.A., Nazipova A.A., Permyakov S.E., Permyakov E.A., Philippov P.P., Granzin J., Koch K.-W. Timing of a neuronal calcium sensor. J. Biol Chem 2006; v. 281 (49); p 37594-37602.

9. Senin I.I., Churumova V A. Philippov P.P., Koch K.-W. Membrane binding of the neuronal calcium sensor recoverin - modulatory role of the charged carboxy-terminus. BMC Biochem. 2007; v. 22; p. 24.

10. Komolov K.E, Senin I.I., Kovaleva N.A., Chnstoph M., Churumova V.A.. Gngoriev I.I., Philippov P.P., Koch K.-W. Mechanism of rhodopsin kinase regulation by recoverin. 13,h International conference on retinal proteins. Barcelona, June 15- 19, 2008, p. 101.

Отпечатано в копицентре « С Г ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprmt ru e-mail: 2akaz@stpr1nt.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 05.11.2008 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чурюмова, Валерия Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Родопсинкиназа - представитель семейства протеинкиназ рецепторов, сопряженных с G-белками".

1. Общая схема зрительной трансдукции.

1.1. Передача зрительного сигнала.

1.2. Восстановление темнового состояния фоторецепторной клетки

2. Семейство протеинкиназ рецепторов, сопряженных с G-белками.

2.1. Тканевая и внутриклеточная локализация.

2.2. Организация генов семейства GRK.

2.3. Структурные особенности протеинкиназ семейства GRK.

2.3.1. Характеристика доменов.

2.3.2. Посттрансляционные модификации.

2.3.3. Кристаллические структуры представителей семейства GRK.

2.4. Регуляция GRK.

2.4.1. Регуляция активности GRK при участии

Ca -связывающих белков.

2.4.2. Регуляция активности и клеточная локализация.

2.4.3. Фосфорилирование GRK другими протеинкиназами.

2.4.4. Взаимодействие GRK с кавеолином и другими лигандами.

2.4.5. Регуляция экспрессии GRK.

2.4.6. Аутофосфорилирование GRK.

2.5. Регуляция рецепторов независимо от их фосфорилирования под действием GRK.

2.6. Физиологическая роль протеинкиназ семейства GRK и их участие в патологических процессах.

3. Десенситизация родопсина путем фосфорилирования родопсинкиназой.

3.1. Механизм фосфорилирования родопсина родопсинкиназой.

3.2. "Фосфорилирование родопсина с высоким выходом".

3.3. Са2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы рековерином.70 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Реактивы.

2. Выделение плазмидной ДНК из клеток штамма Е.соН ХЬ2.

3. Получение генетических конструкций, кодирующих химерные белки ОБ™ и ОЭТ-С.

4. Приготовление компетентных клеток.

5. Трансформация клеток Е.соН плазмидной ДНК.

6. Отбор мутантных клонов.

7. Секвенирование ДНК.

8. Экспрессия гена ОЗТ, выделение и очистка рекомбинантного белка

9. Экспрессия генов 08Т-№ и ОБТ-С, выделение и очистка химерных белков.

10. Экспрессия рековерина и его мутантов в клетках Е.соН.

11. Выделение рекомбинантного рековерина дикого типа и его мутантных форм.

12. Приготовление кальциевых буферов и измерение [Са ]{.

13. Определение количества кальция, связанного с рековерином.

14. Взаимодействие рековерина с фенилсефарозой.

15. Выделение НСП.

16. Выделение рафт-структур из мембран НСП.

17. Получение отмытых мочевиной фоторецепторных мембран.

18. Приготовление липосом.

19. Изменение содержания холестерина в мембранах НСП.

20. Связывание рекомбинантного рековерина с отмытыми мочевиной мембранами НСП и искусственными фосфолипидными везикулами.

21. Выделение родопсинкиназы.

22. Определение активности родопсинкиназы.

23. SPR-спектроскопия.

23.1. Иммобилизация липосом.

23.2. Измерение связывания рековерина с SPR-чипом и обработка экспериментальных данных.

24. Связывание рекомбинантных белков GST, GST-N и GST-C с рековерином.

25. Изучение влияния пептидных фрагментов родопсинкиназы на связывание N-концевого домена родопсинкиназы с рековерином.

26. Аналитические процедуры.

26.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

26.2. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле.

26.3. Определение концентрации белков.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Влияние содержания холестерина фоторецепторных мембран на взаимодействие рековерина с мембранами и регуляцию фосфорилирования родопсина.

1.1. Исследование влияния холестерина на взаимодействие рековерина с мембранами.

1 Л I

1.2. Влияние содержания холестерина на Са /рековерин-зависимую регуляцию фосфорилирования родопсина.

2. Исследование роли Са -связывающих центров рековерина в ингибировании родопсинкиназы.

2.1. Исследование роли

-связывающих центров рековерина в экспонировании гидрофобного "кармана".114.

2.2. Исследование роли Са2+ -связывающих центров рековерина в ингибировании родопсинкиназы.

3. Выявление сайтов родопсинкиназы, ответственных за взаимодействие с рековерином.

3.1. Клонирование, идентификация и экспрессия полноразмерного гена родопсинкиназы.

3.2. Клонирование, экспрессия и выделение N- и С-концевых доменов родопсинкиназы.

3.3. Выявление доменов и сайтов родопсинкиназы, ответственных за взаимодействие с рековерином.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение Ca2+/рековерин-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой"

Ионы кальция служат универсальным регулятором самых разнообразных процессов, протекающих в живой клетке. Воздействие ионов кальция на эти процессы в большинстве случаев опосредовано fj I [

Ca -связывающими белками. За связывание ионов кальция у многих Са2+-связывающих белков отвечает специальная структура, получившая название "EF-hand". Многие из белков, содержащих EF-hand-структуру, служат сенсорами ионов кальция для различных мишеней в клетках определённых типов, например, в нейронах. Так, в настоящее время известно более сорока представителей EF-hand

94содержащих Ca -связывающих белков, специфичных для нервной ткани, которые составляют семейство нейрональных Са2+-сенсоров

94neuronal calcium sensors, NCS). Нейрональные Ca -сенсоры выполняют регуляторную роль в отношении различных внутриклеточных белков-мишеней таких, как: протеинкиназы, гуанилатциклазы, аденилатциклазы и ионные каналы. Изменение внутриклеточной концен

2+ трации Ca определяет компартментализацию (раствор/мембрана) многих белков этого семейства, что в свою очередь модулирует их взаимодействие с сигнальными партнерами.

Типичным представителем семейства нейрональных Са2+-сенсоров является рековерин, высокоспецифичный для фоторецеп-торных клеток сетчатки, которые представляют собой высокоспециализированные нейроны. Функция рековерина в фоторецепторной клетке заключается в Са2+-зависимой регуляции десенситизации фотоактивированного рецептора (родопсина) путём его фосфорилирова-ния, катализируемого ферментом родопсинкиназой. При высокой концентрации ионов кальция рековерин находится в комплексе с фоторецепторной мембраной и взаимодействует с родопсинкиназой, что приводит к ингибированию фермента. Тогда как при низких концентрациях катиона комплекс родопсинкиназа-рековерин диссоциирует и ингибирование снимается. Са -зависимое ингибирование фосфори-лирования родопсина происходит при непосредственном взаимодействии родопсинкиназы и рековерина.

К моменту начала настоящей работы отсутствовала информация, касающаяся участков связывания этих двух белков. Кроме того, процесс десенситизации родопсина, так же как и большинство процессов, имеющих отношение к фототрансдукции, происходит на мембране. Влияние фоторецепторных мембран на регуляцию фосфорили-рования родопсина, катализируемого родопсинкиназой, ранее не изучалось. Настоящая работа посвящена исследованию влияния состава фоторецепторных мембран на процесс Са2+-зависимого ингибирова-ния фосфорилирования родопсина и выявлению сайтов взаимодействия родопсинкиназы и рековерина.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ "Родопсинкиназа - представитель семейства протеинкиназ рецепторов, сопряженных с С-белками"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Чурюмова, Валерия Александровна

выводы

2. Повышение содержания холестерина в фоторецепторных мембранах приводит к уменьшению уровня фосфорилирования содержащегося в них родопсина вследствие усиления Са2+-зависимого ин-гибирования родопсинкиназы рековерином.

3. Связывание ионов кальция с

Са -связывающим центром рековерина ЕВ2, но не ЕБЗ, обусловливает экспонирование неполярных боковых цепей гидрофобного "кармана" белка и тем самым - Са -зависимое ингибирование родопсинкиназы.

4. За взаимодействие родопсинкиназы с рековерином отвечает регу-ляторный Ы-концевой домен фермента, причем основной вклад вносит ее фрагмент ЮСц.^.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чурюмова, Валерия Александровна, Москва

1. Филиппов П.П., Аршавский В.Ю., Дижур A.M. (1987). Биохимия зрительной рецепции. Итоги науки и техники. ВИНИТИ, т.26.

2. Philippov, Р. (2000). Phototransduction and calcium. Membr. Cell. Biol. 13, 195-206.

3. Schwartz, E.A. (1981). First events in vision: the generation of responses in vertebrate rods. J. Cell Biol. 90, 271-278.

4. Chabre, M. (1985). Trigger and amplification mechanisms in visual phototransduction. Ann. Rev. Biophys. Chem. 14, 331-360.

5. Абдулаев, Н.Г. и Артамонов, И.Д. (1984). Биоорганическая химия зрительного процесса. Биол. мембраны. 1, 775-793.

6. Dratz, E.A. and Hargrave, P.A. (1983). The structure of rhodopsin and the rod outer segment disk membrane. Trends Biochem. Sci. 8, 128-131.

7. Hamm, H.E. and Bownds, M.D. (1986). Protein complement of rod outer segments of frog retina. Biochemistry 25, 4512-4525.

8. Ovchinnikov, Y.A. (1982). Rhodopsin and bacteriorhodopsin: structure function relationships. FEBS Lett. 148, 179-191.

9. Mullen, E. and Akhtar, M. (1982). Topographic and active site studies on bovine rhodopsin. FEBS Lett. 132, 261-264.

10. Ovchinnikov, Y.A., Abdulaev, N.G. and Bogachuk, A.S. (1988). Two adjacent cysteine residues in the C-terminal cytoplasmic fragment of bovine rhodopsin are palmitylated. FEBS Lett. 230, 1-5.

11. Menon, S.T., Han, M. and Sakmar, T.P. (2001). Rhodopsin: structural basis of molecular physiology. Physiol. Rev. 81, p. 1659-1688.

12. Applebury, M. A. (1991). Molecular determinants of visual pigment function. Curr. Opin. Neurobiol., 1, p. 263-269.

13. Fotiadis, D., Liang, Y., Filipek, S., Saperstein, D.A., Engel, A., Palc-zewski, K. (2003). Atomic-force microscopy: Rhodopsin dimers in native disc membranes Nature, 421(6919), p. 127-128.

14. Kuhn, H. (1980). Light- and GTP-regulated interaction of GTPase and other proteins with bovine photoreceptor membranes. Nature, 283, p. 587589.

15. Stryer, L. (1985). Molecular design of an amplification cascade in vision. Biopolymeres. 24, p. 29-47.

16. Stryer, L., Hurley, J.B. and Fung, B.K. (1981). First stage of amplification in the cyclic nucleotide cascade of vision. Trends Biochem. Sci. 6, p. 245-247.

17. Hurley, J.B. (1992). Signal transduction enzymes of vertebrate photoreceptors. J. Bioenerg. and Biomemb. 24, p. 219-226.

18. Janz, J.M., Farrens, D.L. (2004). Rhodopsin activation exposes a key hydrophobic binding site for the transducin alpha-subunit C terminus. J. Biol. Chem. 279, p. 29767-29773.

19. Arshavsky, V.Y., Dizhoor, A.M., Shestakova, I.K. and Philippov, P.P. (1985). The effect of rhodopsin phosphorylation on the light-dependent activation of phosphodiesterase from bovine rod outer segments. FEBS Lett. 181, p. 264-266.

20. Hurley, J.B. and Stryer, L. (1982). Purification and characterization of the gamma regulatory subunit of the cGMP phosphodiesterase from retinal rod outer segments. J. Biol. Chem. 257, p. 11094-11099.

21. Florio, S.K., Prusti, R.K and Beavo, J.A. (1996). Solubilization of membrane-bound phosphodiesterase by the rod phosphodiesterase recombinant 5 subunit. J. Biol. Chem. 271, p. 24036-24047.

22. Palczewski, K. and Saari, J.C. (1997). Activation and inactivation steps in the visual transduction pathway. Curr. Opin. Neurobiol., 7, p. 500-504.

23. Lipkin, V.M., Dumler, I.L., Muradov, K.G., Artemyev, N.O. and Etin-gof, R.N. (1988). Active sites of the cyclic GMP phosphodiesterase gam-ma-subunit of retinal rod outer segment. FEBS Lett. 234, p. 287-290.

24. Kaupp, U.B., Seifert, R. (2002). Cyclic nucleotide-gated ion channels. Physiol. Rev. 82(3), p. 769-824

25. Stryer, L. (1986). Cyclic GMP cascade of vision. Annu. Rev. Neurosci. 9, p. 87-119.

26. Cook, N.J., Hanke, W. and Kaupp, U.B. (1987). Identification, purification and functional reconstitution of the cyclic GMP-dependent channel from rod photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, p. 585-589.

27. Yau, K.-W. and Baylor, D.A. (1989). Cyclic GMP-activated conductance of retinal photoreceptor cells. Annu. Rev. Neurosci. 12, p. 289-327.

28. Pfister, С., Chabre, M., Plouet, J., Tuyen, V.V., De Kozak, Y., Faure J.P., Kuhn, H. (1985). Retinal S antigen identified as the 48K protein regulating light-dependent phosphodiesterase in rods. Science 228, p. 891-893.

29. Kuhn, H. and Wilden, U. (1987). Deactivation of photoactivated rho-dopsin by rhodopsin kinase and arrestin. J. Recept. Res. 7, p. 283-298.

30. Gurevich, V.V. andBenovic, J.L. (1992). Cell-free expression of visual arrestin. Truncation mutagenesis identifies multiples domains involved in rhodopsin interaction. J. Biol. Chem. 267, p. 21919-21923.

31. Palczewski, K., Buczylko, J., Ohguro, H., Annan, R.S., Carr, S.A., Crabb, J.W., Kaplan, M.W, Johnson, R.S., Walsh, K.A. (1994). Characterization of a truncated form of arrestin isolated from bovine rod outer segments. Protein Sci. 3(2), p. 314-324.

32. Pulvermuller, A., Maretzki, D., Rudnicka-Nawrot, M., Smith, W.C., Palczewski, K., Hofmann, K.P. (1997). Functional differences in the interaction of arrestin and its splice variant, p44, with rhodopsin. Biochemistry. 36(30), p. 9253-9260.

33. Ascano, M., Robinson, P.R. (2006). Differential phosphorylation of the rhodopsin cytoplasmic tail mediates the binding of arrestin and its splice variant, p44. Biochemistry, 45, p. 2398-2407.

34. Arshavsky, V.Y. and Bownds, M.D. (1992). Regulation of deactivation of photoreceptor G protein by its target enzyme and cGMP. Nature, 357, p. 416-417.

35. Faurobert, E. and Hurley, J.B. (1997). The core domain of new retina specific RGS protein stimulates the GTPase activity of transducin in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, p. 2945-2950.

36. Ross, E.M., Wilkie, T.M. (2000). GTPase-activating proteins for hete-rotrimeric G proteins: regulators of G protein signaling (RGS) and RGS-like proteins. Annu. Rev. Biochem. 69, p. 795-827.

37. He, W., Cowan, C.W. and Wensel, T.G. (1998). RGS9, a GTPase accelerator for phototransduction. Neuron, 20, p. 95-102.

38. Tsang, S.H., Burns, N.E., Calvert, P.D., Gouras, P., Baylor, D.A., Goff, S.P. and Arshavsky, V.Y. (1998). Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science, 282, p. 117-121.

39. Yamazaki, A., Bondarenko, V.A., Dua, S., Yamazaki, M., Usukura, J., Hayashi, F. (1996). Possible stimulation of retinal rod recovery to dark state by cGMP release from a cGMP phosphodiesterase non catalytic site. J. Biol. Chem. 51, p. 32495-32498.

40. Lee, R.H., Lieberman, B.S. and Lolley, R.N. (1987). A novel complex from bovine visual cells of a 33,000-dalton phosphoprotein with beta and gamma transducin: purification and subunit structure. Biochemistry, 28, p. 3983-3990.

41. Willardson, B.M., Wilkins, J.F., Yoshida, T. and Bitensky, M.W. (1996). Regulation of phosducin phosphorylation in retinas rods by Ca2+/calmodulin-dependent adenylyl cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, p. 1475-1479.

42. Calvert, P.D., Strissel, K.J., Schiesser, W.E., Pugh, E.N., Jr., Arshavsky, V.Y. (2006). Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell. Biol. 16(11), p. 560-568.

43. Strissel, K.J., Sokolov, M., Trieu, L.H., Arshavsky VY. (2006). Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. J. Neurosci. 26, p. 1146-1153.

44. Lobanova, E.S., Finkelstein, S., Song, H., Tsang, S.H., Chen, C.K., So-kolov, M., Skiba, N.P., Arshavsky, V.Y. (2007). Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPaseactivating complex. J. Neu-rosci. 27, p. 1151-1160.

45. Sommer, M.E., Farrens, D.L. (2006). Arrestin can act as a regulator of rhodopsin photochemistry. Vision Research, 46, p. 4532-4546.

46. Dohlman, H.G., Thorner, J., Caron, M.G., and Lefkowitz, R.J. (1991). Model systems for the study of seven-transmembrane-segment receptors. Annu. Rev. Biochem. 60, p. 653-688.

47. Wise, A., Jupe, S.C., Rees, S. (2004). The identification of ligands at orphan G-protein coupled receptors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, p. 43-66.

48. Watson, S., Arkinstall, A. (1994). The G-Protein Linked Receptor Facts Book. San Diego: Academic Press.

49. Pitcher, J.A., Freedman, N.J., Lefkowitz, R.J. (1998). G proteincoupled receptor kinases. Annu Rev Biochem. 67, p. 653-692.

50. Krupnick, J.G., Benovic, J.L. (1998). The role of receptor kinases and arrestins in G protein-coupled receptor regulation. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 38, p. 289-319.

51. Kohout, T.A., Lefkowitz, R.J. (2003). Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol. Pharmacol. 63, p. 9-18.

52. Maeda, T., Imanishi, Y., Palczewslci, K. (2003). Rhodopsin phosphorylation: 30 years later. Prog. Retin. Eye Res. 22(4), p. 417-434.

53. Chen, C.K., Zhang, K., Church-Kopish, J., Huang, W., Zhang, H., Chen, Y.J., Frederick, J.M., Baehr, W. (2001). Characterization of human GRK7 as a potential cone opsin kinase. Mol. Vis. 7, p. 305-313.

54. Benovic, J.L., DeBlasi, A., Stone, W.C., Caron, M.G., Lefkowitz, R.J. (1989). Beta-adrenergic receptor kinase: primary structure delineates a multigene family. Science. 246, p. 235-240.

55. Benovic, J.L., Onorato, J.J., Arriza, J.L., Stone, W.C., Lohse, M., et al. (1991). Cloning, expression, and chromosomal localization of beta-adrenergic receptor kinase 2. A new member of the receptor kinase family. J. Biol. Chem. 266, p. 14939-14946.

56. Premont, R.T., Macrae, A.D., Stoffel, R.H., Chung, N., Pitcher, J.A., et al. (1996). Characterization of the G protein-coupled receptor kinase GRK4. Identification of four splice variants. J. Biol. Chem. 271, p. 64036410.

57. Kunapuli, P., Benovic, J.L. (1993). Cloning and expression of GRK5: a member of the G protein-coupled receptor kinase family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, p. 5588-5592.

58. Premont, R.T., Koch, W.J., Inglese, J., Lefkowitz, R.J. (1994). Identification, purification, and characterization of GRK5, a member of the family of G protein-coupled receptor kinases. J. Biol. Chem. 269, p. 6832-6841.

59. Benovic, J.L., Gomez, J. (1993). Molecular cloning and expression of GRK6. A new member of the G protein-coupled receptor kinase family. J. Biol. Chem. 268, p. 19521-19527.

60. Cassill, J.A., Whitney, M., Joazeiro, C.A., Becker, A., Zuker, C.S. (1991). Isolation of Drosophila genes encoding G protein-coupled receptor kinases. PNAS. 88, p. 11067-11070.

61. Kiklcawa, S., Yoshida, N., Nakagawa, M., Iwasa, T., Tsuda, M. (1998). A novel rhodopsin kinase in octopus photoreceptor possesses a pleckstrinhomology domain and is activated by G protein /3y-subunits. J. Biol. Chem. 273, p. 7441-7447.

62. Mayeenuddin, L.H., Mitchell, J. (2001). cDNA cloning and characterization of a novel squid rhodopsin kinase encoding multiple modular domains. Vis. Neurosci. 18, p. 907-915.

63. Weiss, E.R., Raman, D., Shirakawa, S., Ducceschi, M.H., Bertram, P.T., Wong, F., Kraft, T.W., Osawa, S. (1998). The cloning of GRK7, a candidate cone opsin kinase, from cone- and rod-dominant mammalian retinas. Mol. Vis. 4, p. 27.

64. Zhao, X., Haeseleer, F., Fariss, R.N., Huang, J.,Baehr, W., Milam, A.H., Palczewski, K. (1997). Molecular cloning and localization of rhodopsin kinase in the mammalian pineal. Vis. Neurosci. 14, p. 225-232.

65. Imanishi, Y., Hisatomi, O., Yamamoto, S., Satoh, T., Kotaka, S., Ko-bayashi, Y., Tokunaga, F. (2007). A third photoreceptor-specific GRK found in the retina of Oryzias latipes (Japanese killifish). Zoolog Sci., 24(1), p. 87-93.

66. Gagnon, A.W., Benovic, J.L. (1997). Identification and chromosomal localization of a processed pseudogene of human GRK6. Gene, 184(1), p. 13-19.

67. Penn, R.B., Benovic, J.L. Structure of the human gene encoding the be-ta-adrenergic receptor kinase. (1994). J. Biol. Chem., 269(21), p. 1492414930.

68. Peppel, K., Boekhoff, I., McDonald, P., Breer, H., Caron, M.G., Lef-kowitz, R.J. (1997). G protein-coupled receptor kinase 3 (GRK3) gene disruption leads to loss of odorant receptor desensitization. J. Biol Chem. 272(41), p. 25425-25428.

69. Khani, S.C., Abitbol, M., Yamamoto, S., Maravic-Magovcevic, I., Dry-ja, T.P. (1996). Characterization and chromosomal localization of the gene for human rhodopsin kinase. Genomics. 35(3), p. 571-576.

70. Zhao, X., Huang, J., Khani, S.C., Palczewski, K. (1998). Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). J. Biol. Chem. 273(9), p. 51245131.

71. Moepps, B., Vatter, P., Frodl, R., Waechter, F., Dixkens, C., Hameister, H., Gierschilc, P. (1999). Alternative splicing produces transcripts encoding four variants of mouse G-protein-coupled receptor kinase 6. Genomics. 60(2), p. 199-209.

72. Palczewski, K., Buczylko, J., Lebioda, L., Crabb, J.W., Polans, A.S. (1993). Identification of the N-terminal region in rhodopsin kinase involved in its interaction with rhodopsin. J. Biol. Chem. 268, p. 6004-6013.

73. Day, P.W., Wedegaertner, P.B., Benovic, J.L. (2000). Analysis of G-protein-coupled receptor kinase RGS homology domains. Methods Enzy-mol. 390, p. 295-310.

74. Gan, X., Ma, Z., Deng, N., Wang, J., Ding, J., Li, L. (2004). Involvement of the C-terminal prolinç-rich motif of G protein-coupled receptor kinases in recognition of activated rhodopsin. J. Biol. Chem. 279, p. 4974149746.

75. Penela, P., Ribas, C., Mayor, F. Jr. (2003). Mechanisms of regulation of the expression and function of G protein-coupled receptor kinases. Cell. Signal. 15(11), p. 973-981.

76. Lemmon, M.A., Ferguson, K.M., Schlessinger, J. (1996). PH domains: diverse sequences with a common fold recruit signaling molecules to the cell surface. Cell. 85, p. 621-624.

77. Pronin, A.N., Carman, C.V., Benovic, J.L. (1998). Structure-function analysis of G protein-coupled receptor kinase-5. Role of the carboxyl terminus in kinase regulation. J. Biol. Chem. 273(47), p. 31510-31518.

78. Thiyagarajan, M.M., Stracquatanio, R.P., Pronin, A.N., Evanko, D.S., Benovic, J.L., Wedegaertner, P.B. (2004). A predicted amphipathic helix mediates plasma membrane localization of GRK5. J. Biol. Chem. 279(17), p. 17989-17995.

79. Lodowski, D.T., Pitcher, J.A., Capel, W.D., Lefkowitz, R.J., Tesmer, J.J. (2003). Keeping G proteins at bay: a complex between G proteincoupled receptor kinase 2 and Gbetagamma. Science. 300(5623), p. 12561262.

80. Lodowski, D.T., Barnhill, J.F., Pyskadlo, R.M., Ghirlando, R., Sterne-Marr, R, Tesmer, J.J. (2005). The role of G beta gamma and domain interfaces in the activation of G protein-coupled receptor kinase 2. Biochemistry. 44(18), p. 6958-6970.

81. Tesmer, V.M., Kawano, T., Shankaranarayanan, A., Kozasa, T., Tesmer J.J.G. (2005). Snapshot of Activated G Proteins at the Membrane: The Gcd/q-GRK2-Gi87 Complex. Science, 310, p. 1686-1690.

82. Lodowski, D.T., Tesmer, V.M., Benovic, J.L., Tesmer, J.J. (2006). The structure of G protein-coupled receptor kinase (GRK)-6 defines a second lineage of GRKs. J. Biol. Chem. 281(24), p. 16785-16793.

83. Sallese, M., Iacovelli, L., Cumashi, A., Capobianco, L., Cuomo, L., De Blasi, A. (2000). Regulation of G protein-coupled receptor kinase subtypes by calcium sensor proteins. Biochim. Biophys. Acta, 1498(2-3), p. 112121.

84. Ikura, M. (1996). Calcium binding and conformational response in EF-hand proteins. Trends Biochem. Sci., 21(1), p. 14-17.

85. Nef, P. (1996). Neuron-specific calcium sensors (the NCS subfamily). Guidebook to the calcium-binding proteins. Oxford University Press, New York, p. 94-98.

86. Klenchin, V.A., Calvert, P.D., Bownds, M.D. (1995). Inhibition of rho-dopsin kinase by recoverin. Further evidence for a negative feedback system in phototransduction. J. Biol. Chem., 270(27), p. 16147-16152.

87. Chen, C.K., Inglese, J., Lefkowitz, R.J., Hurley, J.B. (1995). Ca(2+)-dependent interaction of recoverin with rhodopsin kinase. J. Biol. Chem. 270(30), p. 18060-6.

88. Levay, K., Satpaev, D.K., Pronin, A.N., Benovic, J.L., Slepak, V.Z. (1998). Localization of the sites for Ca2+-binding proteins on G proteincoupled receptor kinases. Biochemistry. 37(39), p. 13650-13659.

89. Pronin, A.N., Satpaev, D.K., Slepak, V.Z., Benovic, J.L. (1997). Regulation of G protein-coupled receptor kinases by calmodulin and localization of the calmodulin binding domain. J. Biol. Chem. 272(29), p. 18273-18280.

90. Chuang, T.T. Paolucci, L., De Blasi, A. (1996). Inhibition of G protein-coupled receptor kinase subtypes by Ca2+/calmodulin. J. Biol Chem. 271(45), p. 28691-28696.

91. Kabbani, N., Negyessy, L., Lin, R., Goldman-Rakic, P., Levenson, R. (2002). Interaction with neuronal calcium sensor NCS-1 mediates desensi-tization of the D2 dopamine receptor. J. Neurosci. 22(19), p. 8476-8486.

92. DebBurman, S.K., Ptasienski, J., Boetticher, E., Lomasney, J.W., Benovic, J.L., Hosey, M.M. (1995). Lipid-mediated regulation of G proteincoupled receptor kinases 2 and 3. J. Biol. Chem.270(l 1), p. 5742-5747.

93. Sarnago, S., Roca, R., de Blasi, A., Valencia, A., Mayor, F. Jr., Murga, C. (2003). Involvement of intramolecular interactions in the regulation of G protein-coupled receptor kinase 2. Mol. Pharmacol. 64(3), p. 629-639.

94. Johnson, L.R., Scott, M.G., Pitcher, J.A. (2004). G protein-coupled receptor kinase 5 contains a DNA-binding nuclear localization sequence. Mol Cell Biol., 24(23), p.10169-10179.

95. Yang, X.L., Zhang, Y.L., Lai, Z.S., Xing, F.Y., Liu, Y.H. (2003). Pleckstrin homology domain of G protein-coupled receptor kinase-2 binds to PKC and affects the activity of PKC kinase. World J. Gastroenterol. 9(4), p. 800-803.

96. Pronin, A.N., Benovic, J.L. (1997). Regulation of the G proteincoupled receptor kinase GRK5 by protein kinase C. J. Biol. Chem. 272(6), p. 3806-3812.

97. Horner, T.J., Osawa, S., Schaller, M.D., Weiss, E.R. (2005). Phosphorylation of GRK1 and GRK7 by cAMP-dependent protein kinase attenuates their enzymatic activities. J. Biol. Chem. 280(31), p. 28241-28250.

98. Carman, C.V., Lisanti, M.P., Benovic, J.L. (1999). Regulation of G protein-coupled receptor kinases by caveolin. J. Biol. Chem. 274(13), p. 8858-8864.

99. Salim, S., Eikenburg, D.C. (2007). Role of 90-kDa heat shock protein (Hsp 90) and protein degradation in regulating neuronal levels of G protein-coupled receptor kinase 3. J. Pharmacol. Exp. Ther. 320(3), p. 11061112.

100. Willets, J.M., Challiss, R.A., Nahorski, S.R. (2003). Non-visual GRKs: are we seeing the whole picture? Trends Pharmacol. Sci. 24(12), p. 626-633.

101. Palczewski, K., Buczylko, J., Van Hooser, P., Carr, S.A., Huddleston, M.J., Crabb, J.W. (1992). Identification of the autophosphorylation sites in rhodopsin kinase. J. Biol. Chem., 267(26), p. 18991-18998.

102. Satpaev, D.K., Chen, C.K., Scotti, A., Simon, M.I., Hurley, J.B., Sle-pak, V.Z. (1998). Autophosphorylation and ADP regulate the Ca2+-dependent interaction of recoverin with rhodopsin kinase. Biochemistry, 37(28), p. 10256-10262.

103. Kunapuli, P., Gurevich, V.V., Benovic, J.L. (1994). Phospholipid-stimulated autophosphorylation activates the G protein-coupled receptor kinase GRK5. J. Biol. Chem. 269(14), p. 10209-10212.

104. Loudon, R.P., Benovic, J.L. (1994). Expression, purification, and characterization of the G protein-coupled receptor kinase GRK6. J. Biol. Chem. 269(36), p. 22691-22697.

105. Pao, C.S., Benovic, J.L. (2002). Phosphorylation-independent desensi-tization of G protein-coupled receptors? Sci STKE. (153), PE42.

106. Perroy, J., Adam, L., Qanbar, R., Chenier, S., Bouvier, M. (2003). Phosphorylation-independent desensitization of GABA(B) receptor by GRK4. EMBO J. 22(15), p. 3816-3824.

107. Dhami, G.K., Anborgh, P.H., Dale, L.B., Sterne-Marr, R., Ferguson, S.S. (2002). Phosphorylation-independent regulation of metabotropic glutamate receptor signaling by G protein-coupled receptor kinase 2. J. Biol. Chem. 277(28), p. 25266-25272.

108. Metaye, T., Gibelin, H., Perdrisot, R., Kraimps, J.L. (2005). Pathophysiological roles of G-protein-coupled receptor kinases. Cell. Signal. 17(8), p. 917-928.

109. Premont, R.T., Gainetdinov, R.R. (2007). Physiological roles of G protein-coupled receptor kinases and arrestins. Annu. Rev. Physiol. 69, p. 511-534.

110. Farber, D.B., Danciger, M. (1997). Identification of genes causing photoreceptor degenerations leading to blindness. Curr Opin Neurobiol. 7(5), p. 666-673.

111. Kuhn, H. and Dreyer, W.J. (1972). Light dependent phosphorylation of rhodopsin by ATP. FEBS Lett. 20, p. 1-6.

112. Sitaramayya, A., Liebman, P. A. (1983). Phosphorylation of rhodopsin and quenching of cyclic GMP phosphodiesterase activation by ATP at weak bleaches. J. Biol. Chem. 258(20), p. 12106-12109.

113. Brown, N.G., Fowles, C., Sharma, R., Akhtar, M. (1992). Mechanistic studies on rhodopsin kinase. Light-dependent phosphorylation of C-terminal peptides of rhodopsin. Eur. J. Biochem. 208, p. 659-667.

114. Dean, K.R., Akhtar, M. (1996). Novel mechanism for the activation of rhodopsin kinase: implications for other G protein-coupled receptor kinases (GRK's). Biochemistry 35, p. 6164-6172.

115. McCarthy, N.E., Akhtar, M. (2002). Activation of rhodopsin kinase. Biochem. J. 363, p. 359-364.

116. Dean, K.R. and Akhtar, M. (1993). Phosphorylation of solubilized dark-adapted rhodopsin. Insights into the activation of rhodopsin kinase. Eur. J. Biochem. 21, p. 881-890.

117. Metaye, T., Gibelin, H., Perdrisot, R., Kraimps, J.L. (2005). Pathophysiological roles of G-protein-coupled receptor kinases. Cell. Signal. 17(8), p. 917-928.

118. Palczewski, K., McDowell, J.H., Hargrave, P.A. (1988). Purification and characterization of rhodopsin kinase. J. Biol. Chem. 263, p. 1406714073.

119. Wilden U., Kuhn H. (1982). Light-dependent phosphorylation of rhodopsin: number of phosphorylation sites. Biochemistry, 21, p. 3014-3022.

120. McDowell, J.H., Nawrocki, J.P., Hargrave, P.A. (1993). Phosphorylation sites in bovine rhodopsin. Biochemistry, 32, p. 4968-4974.

121. Papac, D.I., Oatis Jr., J.E., Crouch, R.K., Knapp, D.R. (1993). Mass spectrometric identification of phosphorylation sites in bleached bovine rhodopsin. Biochemistry, 32, p. 5930-5934.

122. Pullen, N, Akhtar, M. (1994). Rhodopsin kinase: studies on the sequence of and the recognition motif for multiphosphorylations. Biochemistry, 33(48), p. 14536-14542.

123. Mendez, A., Burns, M.E., Roca, A., Lem, J,, Wu, L.W., Simon, M.I., Baylor, D.A., Chen, J. (2000). Rapid and reproducible deactivation of rhodopsin requires multiple phosphorylation sites. Neuron, 28, p. 153-164.

124. Palczewski, K., McDowell, J.H., Hargrave, P.A. (1988). Rhodopsin kinase: substrate specificity and factors that influence activity. Biochemistry, 27(7), p. 2306-2313.

125. McDowell, J.H., Kuhn, H. (1977). Light-induced phosphorylation of rhodopsin in cattle photoreceptor membranes: substrate activation and inac-tivation. Biochemistry, 16(18), p. 4054-4060.

126. Fowles, C., Sharma. R., Akhtar, M. (1988). Mechanistic studies on the phosphorylation of photoexcited rhodopsin. FEBS Lett., 238, p. 56-60.

127. Frank, R.N., Buzney, S.M. (1975). Mechanism and specificity of rhodopsin phosphorylation. Biochemistry, 14(23), p. 5110-5117.

128. Senin, I.I., Koch, K.-W., Akhtar, M. and Philippov, P.P. (2002). Ca2+-dependent control of rhodopsin phosphorylation: recoverin and rhodopsin kinase. Photoreceptors and Calcium, p. 24-32.

129. Palczewski, K., Buczylko, J., Kaplan, M.W., Polans, A.S., Crabb, J.W. (1991). Mechanism of rhodopsin kinase activation. J. Biol.Chem. 266, p. 12949-12955.

130. Langen, R., Cai, K., Altenbach, C., Khorana, H.G., Hubbell, W.L. (1999). Structural features of the C-terminal domain of bovine rhodopsin: a site-directed spin-labeling study. Biochemistry 38, p. 7918-7924.

131. Senin, I.I., Zargarov, A.A., Alekseev, A.M., Gorodovikova, E.N., Lipkin, V.M. and Philippov, P.P. (1995). N-myristoylation of recoverin enhances its efficiency as an inhibitor of rhodopsin kinase. FEBS Lett. 376, p. 87-90.

132. Binder, B.M., OConnor, T.M., Bownds, M.D., Arshavsky, V.Y. (1996). Phosphorylation of non-bleached rhodopsin in intact retinas and living frogs. J. Biol. Chem. 271, p. 19826-19830.

133. Kawamura, S. (1993). Rhodopsin phosphorylation as a mechanism of cyclic GMP phosphodiesterase regulation by S-modulin. Nature 362, p. 855-857.

134. Kawamura, S., Hisatomi, O., Kayada, S., Tokunaga, F. and Kuo, C.H.1993). Recoverin has S-modulin activity in frog rods. J. Biol. Chem. 268, p. 14579-14582.

135. Tachibanaki, S., Tsushima, S., Kawamura, S. (2001). Low amplification and fast visual pigment phosphorylation as mechanisms characterizing cone photoresponses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98(24), p. 14044-14049.

136. Flaherty, K.M., Zozulya, S., Stryer, L. and McKay, D.B. (1993). Three-dimensional structure of recoverin, a calcium sensor in vision. Cell 75, p. 709-716.

137. Senin, I.I., Fischer, T., Komolov, K.E., Zinchenko, D.V., Philippov, P.P. and Koch, K.W. (2002). Ca2+-myristoyl switch in the neuronal calcium sensor recoverin requires different functions of Ca2+-binding sites. J. Biol. Chem. 277(52), p. 50365-50372.

138. Zozulya, S., Stryer, L. (1992). Calcium-myristoyl protein switch. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, p. 11569-11573.

139. Ames, J.B., Ishima, R., Tanaka, T., Gordon, J.I., Stryer, L., Ikura, M. (1997). Molecular mechanics of calcium-myristoyl switches. Nature, 389(6647), p. 198-202.

140. Gorodovikova, E.N., Gimelbrant, A.A., Senin, I.I., Philippov, P.P.1994). Recoverin mediates the calcium effect upon rhodopsin phosphorylation and cGMP hydrolysis in bovine retina rod cells. FEBS Lett. 349(2), p. 187-190.

141. Gorodovikova, E.N., Senin, I.I., Philippov, P.P. (1994). Calcium-sensitive control of rhodopsin phosphorylation in the reconstituted systemconsisting of photoreceptor membranes, rhodopsin kinase and recoverin. FEBS Lett. 353(2), p. 171-172.

142. Gorodovikova, E.N., Philippov, P.P. (1993). The presence of a calcium-sensitive p26-containing complex in bovine retina rod cells. FEBS Lett. 335, p. 277-279.

143. Kawamura, S., Cox, J.A., Nef, P. (1994). Inhibition of rhodopsin phosphorylation by non-myristoylated recombinant recoverin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 203(1), p. 121-127.

144. De Castro, E., Nef, S., Fiumelli, H., Lenz, S.E., Kawamura, S. and Nef, P. (1995). Regulation of rhodopsin phosphorylation by a family of neuronal calcium sensors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 216 (1), p. 133-140.

145. Dizhoor, A.M., Chen, C.K., Olshevskaya, E., Sinelnikova, V.V., Phil-lipov, P., Hurley, J.B. (1993). Role of the acylated amino terminus of recoverin in Ca(2+)-dependent membrane interaction. Science, 259(5096), p. 829-832.

146. Sanada, K., Shimizu, F., Kameyama, K., Haga, K., Haga, T., Fukada, Y. (1996). Calcium-bound recoverin targets rhodopsin kinase to membranes to inhibit rhodopsin phosphorylation. FEBS Lett., 384(3), p. 227230.

147. Gray-Keller, M.P., Detwiler, P.B. (1996). Ca2+ dependence of dark-and light-adapted flash responses in rod photoreceptors. Neuron, 17(2), p.323-331.

148. Erickson, M.A., Lagnado, L., Zozulya, S., Neubert, T.A., Stryer, L., Baylor, D.A. (1998). The effect of recombinant recoverin on the photores-ponse of truncated rod photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 95(11), p. 6474-6479.

149. Nikonov, S., Lamb, T.D., Pugh, E.N., Jr. (2000). The role of steady phosphodiesterase activity in the kinetics and sensitivity of the light-adapted salamander rod photoresponse. Gen. Physiol., 116(6), p. 795-824.

150. Makino, C.L., Dodd, R.L., Chen, J., Burns, M.E., Roca, A., Simon, M.I., Baylor, D.A. (2004). Recoverin regulates light-dependent phosphodiesterase activity in retinal rods. J. Gen. Physiol., 123(6), p. 729-741.

151. Ladant, D. (1995). Calcium and membrane binding properties of bovine neurocalcin delta expressed in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 270, p. 3179-3185.

152. Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, p. 248-254.

153. Nair, K.S., Balasubramanian, N., Slepak, V.Z. (2002). Signal-dependent translocation of transducin, RGS9-l-Gbeta5L complex, and arrestin to detergent-resistant membrane rafts in photoreceptors. Curr. Biol., 12(5), p. 421-425.

154. Shichi, H. and Somers, R.L. (1978). Light-dependent phosphorylation of rhodopsin. J. Biol. Chem. 253, p. 7040-7046.

155. Niu, S.-L., Mitchell, D.C., Litman, B.J. (2002). Manipulation of cholesterol levels in rod disk membranes by methyl-beta-cyclodextrin: effects on receptor activation. J. Biol. Chem., 277(23), p. 20139-20145.

156. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, p. 680-685.

157. Fliesler, S.J., Anderson, R.E. (1983). Chemistry and metabolism of lipids in the vertebrate retina. Prog. Lipid Res., 22, p. 79-131.

158. Boesze-Battaglia, K., Schimmel, R. (1997). Cell membrane lipid composition and distribution: implications for cell function and lessons learned from photoreceptors and platelets.J. Exp. Biol., 200(23), p. 29272936.

159. Boesze-Battaglia, K., Hennessey, T., Albert, A.D. (1990). Cholesterol heterogeneity in bovine rod outer segment disk membranes. J. Biol. Chem., 264(14), p. 8151-8155.

160. Boesze-Battaglia, K., Fliesler, S.J., Albert, A.D. (1990). Relationship of cholesterol content to spatial distribution and age of disc membranes in retinal rod outer segments. J. Biol. Chem., 265, p. 18867-18870.

161. Boesze-Battaglia, K. and Albert, A.D. (1990). Cholesterol modulation of photoreceptor function in bovine retinal rod outer segments. J. Biol. Chem., 265(34), p. 20727-20730.

162. Albert, A.D. and Boesze-Battaglia, K. (2005). The role of cholesterol in rod outer segment membranes. Prog. Lipid Res., 44(2-3), p. 99-124.

163. Schnapf, J.L. (1983). Dependence of the single photon response on longitudinal position of absorption in toad rod outer segments. J. Physiol., 343, p. 147-59.

164. Stenberg, E., Persson, H., Roos, H. and Urbaniczky, C. (1991). Quantitative determination of surface concentration of protein with surfaceplasmon resonance by using radiolabeled proteins. J. Colloid Interface Sci. 143, p. 513-526.

165. Brown, B.M., Carlson, B.L., Zhu, X., Lolley, R.N., Craft, C.M. (2002). Light-driven translocation of the protein phosphatase 2A complex regulates light/dark dephosphorylation of phosducin and rhodopsin. Biochemistry, 41(46), p. 13526-13538.

166. Martin, R.E., Elliott, M.H., Brush, R.S., Anderson, R.E. (2005). Detailed characterization of the lipid composition of detergent-resistant membranes from photoreceptor rod outer segment membranes. Invest. Ophthalmol. Vis.Sci., 46(4), p. 1147-1154.

167. Strissel, K.J., Lishko, P.V., Trieu, L.H., Kennedy, M.J., Hurley, J.B., Arshavsky, V.Y. (2005). Recoverin undergoes light-dependent intracellulartranslocation in rod photoreceptors. J. Biol. Chem., 80(32), p. 2925029255.

168. Nikonov S, Lamb TD, Pugh EN Jr. (2000). The role of steady phosphodiesterase activity in the kinetics and sensitivity of the light-adapted salamander rod photoresponse. Gen Physiol., 116(6), p. 795-824.

169. Ames, J.B., Hamasaki, N., Molchanova, T. (2002) Structure and calcium-binding studies of a recoverin mutant (E85Q) in an allosteric intermediate state. Biochemistry, 41(18), p. 5776-5787.

170. Tanaka, Т., Ames, J.B., Harvey, T.S., Stryer, L. and Ikura, M. (1995). Sequestration of the membrane-targeting myristoyl group of recoverin in the calcium-free state. Nature 376, 444-447.

171. Alekseev A.M., ShuFga-Morskoy S.V., Zinchenko D.V., Suchkov D.V., Vaganova S.A., Senin I.I., Zargarov A.A., Lipkin V.M., Akhtar M, PhilippovP.P. (1998) Obtaining and Characterization of EF-hand mutants of recoverin. FEBS Lett., 440 (1-2), p. 116-118.

172. Strynadka, N.C.J., James, M.N.G. (1989) Crystal structures of the helix-loop-helix calcium-binding proteins. Annu. Rev. Biochem. 58, p. 951998.

173. Moncrief, N.D., Kretsinger, R.H. and Goodman, M. (1990). Evolution of EF-hand calcium-modulated proteins. I. Relationships based on amino acid sequences. J. Mol. Evol. 30, p. 522-562.

174. Weiergraber, O.H., Senin, I.I., Philippov, P.P., Granzin, J., Koch, K.W. (2003). Impact of N-terminal myristoylation on the Ca2+-dependent conformational transition in recoverin. J. Biol. Chem., 278(25), p. 2297222979.

175. Ames, J.B., Porumb, T., Tanaka, T., Ikura, M., Stryer, L. (1995) Ami-no-terminal myristoylation induces cooperative calcium binding to recoverin. J. Biol. Chem., 270(9), p. 4526-4533.

176. Polans, A.S., Buczylko, J., Crabb, J. and Palczewski, K. (1991). A photoreceptor calcium binding protein is recognized by autoantibodies obtained from patients with cancer-associated retinopathy. J. Cell. Biol. 112, p. 981-989. |

177. Kawamura, S., Takamatsu, K. and Kitamura, K. (1992). Purification and characterization of S-modulin, a calcium-dependent regulator on cGMP phosphodiesterase in frog rod photoreceptors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 186, p. 411-417.

178. Tachibanaki, S., Nanda, K., Sasaki, K., Ozalci, K. and Kawamura, S. (2000) Amino acid residiues of S-modulin responsible for interaction with rhodopsin kinase. J. Biol. Chem. 275, p. 3313-3319.

179. Carman, C.V., Som, T., Kim, C.M., Benovic, J.L. (1998). Binding and phosphorylation of tubulin by G protein-coupled receptor kinases. J. Biol. Chem., 273(32), p. 20308-20316.

180. Studier, F.W. and Moffatt, B.A. (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol., 189(1), p. 113-130.

181. Tabor, S., Richardson, C.C. (1985). A bacteriophage T7 RNA poly-merase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proc. Natl. Acad. Sci U S A., 82(4), p. 1074-1078.

182. Stevens, R.C. (2000). Design of high-throughput methods of protein production for structural biology. Structure, 8(9), p. 77-85.

183. Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988). Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene, 67(1), p. 31-40.

184. Prinz, W.A., Aslund, F., Holmgren, A., Beckwith, J. (1997). The role of the thioredoxin and glutaredoxin pathways in reducing protein disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm. J. Biol. Chem., 272(25), p. 1566115667.

185. Palczewski, K., Ohguro, H., Premont, R.T., Inglese, J. (1995). Rho-dopsin kinase autophosphorylation. Characterization of site-specific mutations. J. Biol. Chem. 270(25), p. 15294-15298.

Информация о работе

Чурюмова, Валерия Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Изучение Ca2+/рековерин-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина, катализируемого родопсинкиназой - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы