Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование влияния цинка, кадмия, кобальта и сульфатного заселения на зеленые водоросли

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Исследование влияния цинка, кадмия, кобальта и сульфатного заселения на зеленые водоросли"

4 МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА,ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РКВОЛЩИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗШЫЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

биологический факультет

на правах рукописи

ИБРАГИМ МАГДИ АЛЬ-САЛЬМАН

УДК 574.3 : 574.632.017

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЦИНКА, КАДГШ,КОБАЛЬТА И СУЛЬФАТНОГО ЗАСОЛЕНИЯ НА ЗЕЛЁНЫЕ ВОДОРОСЛИ.

экология 03.00.16 гидробиология 03.00.18

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 1988

Работа выполнена на кафедре общей экологии и гидробиологии биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова

Научный руководитель'.доктор биологических наук, профессор

М.М.Телитченко

Научный консультант:кандидат биологических наук,старший научный сотрудник С.Е.Плеханов

Официальные о;шоненты:доктор биологических наук,профессор

С.А.Патин

кандидат биологических наук,старший научный сотрудник Н.С.Золотарёва

Ведущее учреждение:Лаборатория мониторинга природной среды и климата Госкомгидромета СССР

Защита состоится " 1988 г.

в 15 час.30 мин. в ЕБА биологического факультета МГУ ик.М.В.Ломоносова на ааседании специализированного Совета Д 053.05.71

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им.Ы.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 1988 г.

' Отзывы в двух экземплярах просим направлять по адресу: 119892,Москва,Ленинские Горы, МГУ,биологический (факультет, специализированный Совет Д 053.05.71

Учёный секретарь специализированного Совета V '

с, " ^

Д 053.05.71 кандидат биологических наук > Н.В.Белова

м . ч'пГ'г" ¡'

| Общая характеристика работы

-1- 1-"' ]игтуальность_теш. Проблема загрязнения' окружающей среды (сг^яжёлЛга металлами /ТМ/ тлеет глобальный характер и затрагивает не только промышленно развитые страны,но и развивающиеся. Такие ТМ как цинк,кадмий,кобальт»выделяемые в качестве приоритетных

с

/Мур,Рамамурти,19а7/,достигают в водоёмах Ирака концентраций 10 М и выше /№гЫак et а1.,1980 ,Сухер,Астаа,1985/. Рост концентраций ТМ превращает их из гшкроэлементов, необходимых растениям,-в токсиканты,что существенно влияет на продуктивность водоёмов/Патин,Морозов, 1974/, деформируя естественные процессы формирования биологически полноценной воды/Гелитченко,1974/. Развитая сеть каналов и -водохранилищ в Ираке,высокий уровень потребления воды для сельского хозяйства подчёркивают актуальность проведения исследований влияния загрязнения ТМ на качество воды,биопродуктивность водоёмов как составную часть работ по изучению и контролю загрязнений окружающей среды.

Дело, в значительной отепени осложняется тем,что водоёмы Ирака расположены в аридной -зоне и характеризуется сульфатно-хлоридным засолением с. преобладанием сульфатного,достигающего величин 10~% и выше /Джаш^дь,1984,Сухер и др.,1984/. Следовательно,загрязнение водной среды ТМ происходит на фоне сульфатного засоления,которое, очевидно,следует рассматривать как естественный экологический фон с различными уровнями.

Процессы новообразования органического вещества и уровень первичной продукции оказываются в зависимости от физико-химической обстановки в водоёмах,связанной с антропогенным загрязнением ТМ и естественным засолением среды. Основой формирования первичной продукции является физиологическая активность фотосинтезирующих орга-1-1Я1

низмов первого звена трофической цепи,в частности.фитопланктона /Фёдоров,1979/. Важнейшую роль в фотосинтетических /ФС/процессах играют первичные ФС реакции / lavorel,Etienne,1977 /. Действие загрязнений на ФС аппарат продуцентов опосредовано функционированием внешних клеточных мембран,регулирующих взаимоотношения водорослей и водных растений с внешней средой.

¡Очевидно,при изучении действия ТМ и сульфатного засоления на ФС организмы необходимо исследовать широкий диапазон концентраций этих агентов.включая реально встречающиеся,подобрать удачные тест-объекты и те их биологические реакции,которые могут объективно указать на степень повревдения организмов,а также приблизить нас к определению механизмов действия.

Анализ литературы показывает,что влияние ТМ на водоросли изучается довольно широко:исследователи определяют действие ТМ на отдельные физиологические характеристики водорослей - рост численности клеток,интенсивность фотосинтеза /Натин,1979, Rai et al., 1981 /.поглощение и выведение ТМ клетками /Горюнова и др.,1984/. Имеются работы по оценке эффектов комбинированного действия ТМ на водоросли Долдаков,1985/,по влиянию некоторых ТМ на мембранную систему клеток харовых водорослей /Маеедунскене.Жилюкас,1982/. Небольшое количество работ посвящено действию сульфатного засоления на ФС процессы /Гарусов И др.,1971, Malkin, Siderer, 1977 /.

Несмотря на несомненную важность указанных направлений и работ, необходимо отметить почти полное цтсутствие данных литературы, касающихся влияния цинка,кадмия,кобальта на первичные ФС реакции зелёных водорослей,состояние-внешних клеточных мембран при использовании -широкого диапазона концентраций ТМ,включая реально встре-

- 2 -

чающиеся и «зачастую признаваемые предельно допустимыми. В доступной литературе не имеется сведений по действию сульфатного засоления на первичные ФС процессы зелёных планктонных водорослей, на проницаемость внешних клеточных мембран клеток харовых водорослей как представителей донных растений,на общий уровень их метаболизма. Наконец, не произведена оценка комбинированного действия ТМ на какие-либо параметры зелёных водорослей,которые были бы связаны с продукционными характеристиками, й ^ъИТок

Цоль_работн, .в связи о вышеизложенным,заключается в исследовании влияния ТМ и сульфатов на физиологические и функциональные характеристики зелёных планктонных и донных водорослей,с точки зрения эффективности ФС процессов,уровня метаболизма клеток,совершенствования способов диагностики и биотестирования,а также в оценке эффектов комбинированного действия ТМ и сульфатного засоления.

Задачи_иоследованил можно.сформулировать следущим образом: I/ оценить действие широкого диапазона концентраций цинка,кадмия, кобальта и сульфата,опираясь на уровни содержания этих агентов в поверхностных водах внутренних водоёмов Ирака, на зелёные водоросли и определить критические концентрации,вызывающие необратимые нарушения в функционировании клеток; 2/ исследовать действие ТМ и сульфатов на флуоресцентные характеристики нативных клеток планктонных водорослей для определения эффективности первичных ФС процессов; 3/сделать попытку определить возможные механизмы действия изучаемых веществ на уровне проницаемости внешних мембран клеток донных харовых водорослей; 4/оценить количественно эффекты комбинированного действия ТМ и сульфатного засоления на первичные ФС процессы зелёных планктонных водорослей.

- 3-

Нщщаз доня^на работы опредеддется впервые проанализированными в обобщёнными данными по физико-химической обстановке внутренних водоёмов Ирака с точки зрения их загрязнённости. Приведены оригинальные данные по биотестированию ТМ в широком диапазоне концентраций по эффективности первичных ФС реакций планктонных водороолей,энергозавиоимым параметрам донных водорослей - скорости движения протрдлазмы /СДП/, разности электрических потенциалов /РЭП/,электрическому сопротивление цдазыалеммы с объяснением пред-пецшгаемых механизмов действия. По аналогичной схеме исследовано влияние -сульфатов на: зелёные, водоросли. Впервые проведена оценка эффектов комбинированного действия ТМ на эффективность первичных ФС реакций планктонных водорослей в условиях сульфатного засоле-' ния.

Практачеакш_значимость- представленных материалов заклячает-ся в возможности использовать экспериментальные данные в экспресс--даагноотике загрязнения ТМ водной среды,её сульфатного засоления и при биотестировании. Результаты и методические подходы могут быть использованы также при. организации мониторинга внутренних водоёмов, затапливаемых сельскохозяйственных земель,для разработки мер по повышению продуктивности водоёмов и их охраны от загрязнений. Предложенный комплекс научно-методических подходов можно целиком применить в Ираке в работе учреждений,занимающихся пробле -мами окружающей среды.

Ст£укт£р§ дассерщадии традиционца: введение,обзор литературы, материалы и методы исследования,результаты и обсуждение,выводы, список литератур!. Объём работы -1 °3 стр.

Экспериментальные данные получены автором самостоятельно.

- 4 -

Апробация £аботы_. Основные положения диссертации были доложены на заседании кафедры общей экологии и гидробиологии биологического (факультета МГУ им.М.В.Ломоносова Д985 г./.заседагши секции гидробиологии и ихтиологии Московского общества испытателей природы /1988 г./,заседании кафедры гидробиологии биологического факультета (ЛГУ им.М-.В.Ломоносова /1988 г./, научных семинарах группы санитарной гидробиологии кафедры гидробиологии МГУ им.М.В. Ломоносова /1985,1986,1987,1988 г.г./.

Объекты и методы исследования.

Объекты исследования : I/ альгологически и бактериально чистая культура Soenedesmus quadxlcauda Brey. из коллекции кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносо-ва. Микроводоросли выращивали на 10 % среде Тамия / Tamija,I957 / в конических колбах объёмом-500 мл в люминостате при 28°С и круглосуточном освещении лампами ЛД-8 с освещённостью 2000 ин-тернодальные клетки харовых водорослей Hitella.flexiiis длиной 3-4 см. Водоросли культивировали на искусственной прудовой воде /Воробьёв,1965/ в аквариумах объёмом 6 л при комнатной температуре в условиях средней освещённости.

Характер кривой роста численности клеток микроводорослей определяли колориметрически с помощью ФЭК-56М по изменению оптической плотности суспензии в области поглощения хлорофилла 640 -- 700 нм. Параметры быстрой флуоресценции исследовали на кванто -метрической установке с фотоумножителем ФЭУ-79. Возбуждение производили светом интенсивностью 0,5 вт/см^ через оветофильтр СЗС-22, излучение регистрировали через светофильтр KC-I5 потенциометриче-ски с записью на самопишущем потенциометре КСП-4. Блокирование

- К -

электронного транспорта производили добавками стандартного инги-

с

битора - диурона в концентрации ЮМ. Замедленную флуоресценцию суспензии клеток изучали с помощью двухдискового фосфороскопа Баккиреля. Интенсивность возбувдения 56 вт/м^,промежуток медду возбуждением и регистрацией - 3 мсек. Регистрация замедленной флуоресценции - через ФЭУ-79 и квантометрическую установку,работающую в токовом режиме. Фотоиндуцированное выделение кислорода для оценки скорости электронного транспорта регистрировали электродом закрытого типа с помощью полярографа. Скорость движения протоплазмы клеток харовых водорослей определяли методом оптической регистрации под бинокуляром МБС-2 с окулярной сеткой,калиброванной по объект-микрометру. Разность электрических потенциалов между вакуолью клеток и внешним раствором,электрическое сопротивление плазмалеммы исследовали с применением стандартной микроэлектродной техники /Первис,1983/.

Исследованные металлы - цинк,кадмий,кобаЛлг применяли в виде хлоридов,засоление среды производили серюкислым натрием. Вещества в длительных опытах вносили на 5 - 7 сутки после посева микроводорослей, в краткосрочных экспериментах - непосредственно во время регистрации исследуемых параметров.

Эффекты комбинированного действия ТМ на фоне сульфатного засоления с учётом фактора времени оценивали в 3 - недельных длительных опытах по характеристикам переменной флуоресценции суспензии культуры микроводорослей по плану полного факторного эксперимента /ПФЭ/ 24 по Максимову /1980/.

Опыты проводили в основном в 3 кратной повторности. Результаты обрабатывали статистически /Плохинский,1980,Максимов,1980/.

- 6 -

Результаты и обсуждение.

I. Действие тяжёлых металлов на микроводоросли £>сепе1езтц.з диайгл.саш1а.

Рост_числешюсти_меток культуры З^иас1г1саиаа в условиях

40-суточных опытов показал заметное ингибируадее влияние ТМ для

Л -6

концентраций цинка - начиная с 10 М, кадмия - с 10 М, кобальта

- Ингибируиций рост численности клеток эффект усиливался

—2

с увеличением концентраций металлов: концентрации цинка 10 М, кадмия кобальта практически останавливали рост чис-

ленности. Общим для этих концентраций является замедление формирования кривой роста сразу после внесения токсических агентов /бсутки/. Примерно одинаковый токсический эффект наблвдали к 40-м суткам опыта для цинка в концентрации ТО^М, кадмия - 10~%, кобальта - 10~®М. Этот эффект выражался в снижении численности клеток на 25 - 30 % относительно контроля. Более низкие концентрации ТМ / до 10~9М / не приводили к изменениям в кривой роста,достоверно отличным от контроля.

Следовательно,по своему действию на характер кривой роста культуры з.^иайг1оаис1а .определяемой по изменению оптической плотности суспензии клеток,исследованные ТМ можно расположить в ряд по убыванию ингибирования роста:кадмий,кобальт,цинк,причём кадмий эффективнее цинка примерно в 100 раз,кобальта - в 5-10 раз.

Эффективность первичных ФС_п£Оцессов культуры з.циааг1саиа.а при действии ТМ изучали в условиях краткосрочных /до 2 суток/ и длительных /30 суток/ экспериментов по характеристикам флуоресценции. Быстрая флуоресценция у ФС организмов отражает состояние реакционных центров фотосистемы II и их взаимодействие со свето-

- 7 -

собиранщим хлорофилл а/в белковым комплексом / lavorei,Etienne, 1977/. Выход флуоресценции может изменяться от минимального уровня Ф0,который отражает излучательные потериэнергии света при миграции её к открытым реакционным центрам,способным к разделению зарядов, до максимального уровня Фмакс.,отражающего потери поглощённой энергии при закрытых реакционных центрах,не способных к разделению зарядов,т.к. в этих центрах восстановлен первичный хинон-ный акцептор электронов. Таким образом,переменная флуоресценция Фдер =ФмаЕС>-^0 являет собой эквивалент той части поглощённой световой энергии,которая непосредственно используется в фотохимических актах реакционных центров, а отношение Фцер /Ф^^ может служить показателем эффективности использования энергии поглощённого света в фотосистеме II, т.е. показателем эффективности первичных реакций фотосинтеза / MalfcLn,Siaerer, 1977 /.Эффективность первичных процессов фотосинтеза определяет эффективность конечных реакций / Sanmelson,Oquist, 1977 /,и,таким образом,влияет на уровень первичной продукции. /Lorenzen, 1966, Oquist et al.,1982 /.

Реакция суспензии клеток S.quadrlcauâa на введение металлов в реакционную ячейку была однотипной' для цинка,кадмия и кобальта /рис.1/. Водоросли быстро реагировали на появление металлов, что выражалось в резком снижении выхода переменной флуоресценции в первые минуты опыта,затем выход флуоресценции увеличивался практически до контрольного уровня. В дальнейшем наблвдали связанные со временем воздействия и зависимые от применяемого металла и его концентрации эффекты снижения выхода переменной флуоресценции,а» следовательно,эффективности первичных ФС реакций,в том числе и до величин,свидетельствупцих о полной инактивации клеток,и,возможно,

- 8 -

их гибели, ¡.¡лшшальнш уровень этого параметра при действии цин-

Т —2

ка в концентрации ЮМ наблвдали через 12 час, 10, М - через

2 суток, 10"% вызывала на 2 сутки 40 % ингибирувдий эффект.

о о

Высокие концентрации кадмия и кобальта /10 и 10 М соответственно/приводили к резкому снижению эффективности первичных ФС реакций через 6 и'24 час. соответственно. Цинк,кадмий и кобальт при использовании их в краткосрочных опытах -в .диапазонах концентраций Ю-4 - Ю-8, Ю"5 -Ю-6, Ю-6 - Ю-8 М соответственно не вызывали достоверных эффектов снижения или увеличения эффективности первичных ФС реакций относительно контроля /рис.1/. Динамика изменений флуоресцентных характеристик для различных ТМ была сходной.

Для изучения аффектов действия ТМ в условиях длительного инкубирования их с шкроводорослямк бшш использованы ТМ в концентрациях, которые в краткосрочных опытах вызывали значительный зн-гибирующий эффект - 30 - 40 % /ТМ вносили в колбы на 5 сутки после посева/. Било установлено,что цинк'в концентрации 10~®М приводил в.дальнейшем к полному ингибированию первичных ФС реакций через 8 суток, кадмий в концентрации - через I сутки,

—Я

кобальт в концентрации 10 М - через 8 суток / табл.1 /. в условиях длительного воздействия цинк, кадмий,кобальт в концентрациях соответственно ниже Ю-4, Ю-6, 10"^ М не проявляли существенного ингибирущего эффекта /включая и указанные концентрации/ по отношению к первичным ФС процессам,определяемым по флуоресцент--ным характеристикам.

Следует отметить,что ряд токсйчности ТМ,полученный по их действию па кривую роста 3^иайг1оапйа в целом совпадает о ря-3-/Г/* - 9 -

дом по влиянию на выход переменной флуоресценции /кадмий.кобальт цинк - по убыванию величины аффекта/.

ТаблЛ_ Время достижения минимального уровня выхода переменной флуоресценции при действии ТМ на культуру Б. аиайг1сш1йа.

цинк кадмий кобальт

С/и/ время 1 с/м/ 1 время 1 с/м/ | время

1 1 _ 1 _ J .

иг1 1 1 12 час. 1 ю~2 1 2 час. 1 Ю-2 | I сут.

ю-2 ' 2 сут. 1 Ю-3 | 6 час. . ; ю-3 ; 8 сут.

ю-3 1 8 сут. ! 10-4 1 I сут. 1 ю-4 1 1 | 12 сут.

1 1 1 Ю-5 1 1 1 12 сут. 1 1 1 1

В опытах продолжительностью 30 мин.,т.е.при измерении флуоресцентных характеристик при непосредственном введении ТМ в реакционную ячейку достоверных отличий в действии металлов в разных концентрациях и зависимости их действия от времения обнаружено не было. Тем не менее,очевидно, что ТМ оказывают влияние на ФС аппарат достаточно быстро и тех же 30 минут достаточно для повышения флуоресценции на уровне Ф0,что свидетельствует об увеличении излучательных потерь световой энергии при её миграции к реакционным центрам.

Нами экспериментально показано,что ТМ приводят к увеличению скорости электронного транспорта,определяемого по скорости фотойндуцированного выделения кислорода суспензией клеток. Воз- 10 -

можно, ТМ оказывают влияние на ФС аппарат водорослей на уровне кислородвыделявдей системы и,как было сказано ранее электрон-транспортной цепи. Примечательно,что влияние ТМ на характеристики флуоресценции обнаруживается значительно раньше во времени, чем на кривую роста численности. Очевидно,используя быструю флуоресценцию суспензии зелёных микроводорослей для целей биотестирования ТМ, можно ограничиться экспериментами сроком 2 суток, достаточным для получения оценки возможных последствий действия ТМ на зелёные планктонные микроводоросли на уровне изменений в функционировании ФС аппарата вблизи фотосистемы II.

2. Влияние тяжёлых металлов на харовые водоросли И. flexil!s.

При'исследовании токсических,эффектов ТМ важен удачный выбор тест-объекта и тех его биологических реакций,которые позволили бы объективно оценить количественную сторону повреждений,в том числе при действии малых концентраций ТМ, а также приблизиться к объяснению механизмов их действия. С этой целью нами были исследованы энергозависише физиологические и электрофизиологические параметры гигантских клеток харовых водорослей - донных растений, характерных для чистых пресных вод.

Скорость_движения протоплазмы клеток харовых водорослей в контроле колебалась во времени около величины 34 мкм/сек. Цинк, кадмий,кобальт в концентрациях выше Ю-6, Ю~9, Ю-8 М соответственно вызывали кратковременную остановку движения гранул при контакте с клетками. Более низкие концентрации ТМ незначительно стимулировали движение протоплазмы,причём характер изменений СДП во времени имел сложную колебательную'форму /рис.2/. В дальнейшем,

- II -

®пер./Ф макс./отн.ед/ 0,75 •

4 . 4 Ц 0.Ь 1 часы сутки

Рис.1 Выход переменной флуоресценции культуры микроводорослей

при действии ТМ /на примере кобальта/.

СДП /ит/сек/ 40 +

са * 10~9м

Со <с ю^м

ю-6» са » ю-9 м-

ю 2>гп^10~5м

са ^ ю~5, со ю-2», г п ^ ю~2 и

120 Йо 180

время/мин/

30 60 90 Рис.2 Общий характер изменений СДД клеток харовых водорослей в связи с действующей концентрацией ТМ

в зависимости от концентрации металла, устанавливался новый стационарный уровонь СДД или, после кратковременного вооотаковлшгая движения протоплазш, наблюдали повторную остановку движения. Уровень СДП выше контрольного зарегистрирован для концентраций

а а

кадмия Ю М, кобальта Ю М, шше контрольного длг цинка в концентрациях 10"° - Ю-2 М, кадмия Ю-8 - Ю-6 М, кобальта Ю~7 -- 10 М. Критические концентрации ТМ, приводящие к повторной остановке движения протоплазш в условиях 3-ыинутного тестирования,

Г) С А

т-шели значения : Ю М цинк, Ю М кадмий, Ю М кобгушт /рис.2/.

СДП клеток водорослей характеризует уровень метаболизма /Камня, 1962/ и является знергозависимым параметром - двилуцая селя перемещения протоплазмы возникает за счёт энергии АТФ на грацице между зкто- и эндоплазмой при взаимодействии специфических оокра-тительных белков /Саламатова,1983/. Как известно,металлы имеют высокое химическое сродство к функциональным группам белков,что может частично объяснить их влияние на СДП. Влияние металлов на энергетические процессы подтверждается данными о прямом взаимодействии .например, кадмия, с белковым компонентом внутриклеточных мембран и нарушением структуры митохондрий /Скулачёв,1972, йИтег-1976 /,об ингибировании ФС процессов цшжом, кадмием /эа_ 71ез,81еерД979,Ися^,Вигп1воп,1979 /• В кмещихся работала также приведенных вше наших данных содержатся сведения об ингибировании ТМ фотосинтеза на уровне первичных физико-химических процессов фотосинтеза,сопряжении фотосистем I и П,электрон-транспорт-еой цепи.

На наш взгляд,важное значение в токсических эффектах ТМ могут иметь первичные процессы их взаимодействия с поверхностью клеток,

- 13 -

\

внешними клеточными мембран гили, т.к. ранее было показано,что процесс поступления металлов в клетки водорослей связан с сорбцией их на поверхности, пассивной диффузией и метаболически обусловленным поглощением / Hai ot al.,I98l .Горюнова и др.,1984 /.

Энерго^ависимые биоэлект£ичес1ше_характе£цстики клеток харовых водорослей при появлении во внешнем растворе,омывающем клетку, цинка,кадмия,кобальта, изменялись следующим образом. Цинк в концентрациях 10-7-1(Г% не оказал достоверного влияния на РЭП и электрическое сопротивление плазмалеммы, но дальнейшее увеличение

его концентрации привело к резкое падению этих величин. Кадмий и

v *

кобальт в концентрациях 10 и ЮМ соответственно вызывали гиперполяризацию мембраны,что сменялось монотонным снижением РЗП.если увеличивали концентрации этих металлов в растворе. Электрическое сопротивление значительно уменьшалось в диапазоне концентраций кадмия Ю^-Ю^М, кобальта - IO^-IO^M /рис.3/. Эти концентрации соответствуют критическим,установленным по СДП клеток/рис.2/.

По изменениям РЭП трудно судить о концентрациях ТМ,приводящих к началу процесса увеличения пассивной проницаемости внешних мембран,за исключением,пожалуй,опытов с цинком,поскольку кадмий и кобальт не вызывали скачкообразных падений РЭП ни до уровня калиевого равновесного потенциала,ни ниже его величины. Скорее все-то,действие металлов в концентрациях,ниже критических, на РЭП и сопротивление плазмалеммы связано и опосредовано конкуренцией за катионобменный резерв клеточной оболочки и изменением проницаемости для основных потенциалопределяющих ионов - калия и натрия /Воробьёв, 1980/. Затем,по мере поглощения в слой цитоплазмы, ТМ действуют как ингибиторы процессов фотосинтеза и дыхания. Более вы- 14 -

сокзе концентрации приводят к увеличению пассивной проницаемости, что отчётливо проявляется в падении величин РЭП и сопротивления до значений,свидетельствующих о неспецнфических повреждениях мембран и гибели клеток вследствие их необратимых нарушений.-

СДП, РЭП и сопротивление плазмалеммы клеток харовых водорослей оказались высокочувствительны!® параметрами по отношению к ТМ. Для СДП чувствительность к действию металлов - до 10""%. Обратимые эффекты остановки движения протоплазмы наблвдали при концентрациях цинка 10~®-10~®М, кадмия - ИГ^-Ю^М, кобальта - Ю-5-

о

-ЮМ. Полная остановка движения гранул'происходила при следую-

О с

щих критических концентрациях: цинка 10 М,кадмия 10М,кобальта 10"%. По электрического сопротивлению плазмалеммы эти величины составили Ю~3-Ю~2!Л цинк, ТО^-Ю-5!.! кадмий, Ю^-Ю^М ко -бальт.

3. Влияние сульфатного засоления на культуру планктонных водорослей Бавпейвзшив чиа&г^саийа. Иссл§цованне_К£Ивой шста культуры Б.аиа4г!саис1а по изменении оптической плотности суспензии показало,что сульфатное засоление приводит к ингибированию роста численности клеток при всех исследованных концентрациях . Эффект ингибирования

развивается во времени и достигает максимального значения к 6 суткам после внесения сульфата в культуральную среду /сульфат вносили на 7 сутки после посева/. Затем,до 20 суток 30-35 % эффект ингибирования сохраняется для концентраций М^-Ю-2!.! так же, как и 55-£0 % эффект для концентрации 10~*М.

Анализ кривой роста в координатах скорость роста численности--конценграцня сульфат-ионов позволил выявить 3 характерных времен. - 15 -

них уздогка изменений физиологического состояния культуры. На 1-й учаотке /1-5 о утки/ скорооть роста минимальная и не зависит от концентрации соли, на 2-м /5 - 13 оутки/ и 3-м /13 - 19 суткз/ скорость роста выше и не зависит от содержания сульфата так же как ц на 1-м участке для концентраций I0~2-I0"^fi /рис.4/. Концентрация вызывает почти полную остановку роста для

всех временных участков,очевидно,в связи с невозможностью адаптации культуры к резка изменившимся физико-химическим условиям среда к насиецифичеоташи нарушениями в клетках. Возможно,в диапазоне концентраций 1(Г2-10~% культура находится в стрессовом состоянии, своеобразного ростового покоя,когда,за счёт снижения скорости роста повышается устойчивость клеток,что способствует сохранению популяции /Александров,1985/.

Иа^шще_2арш:те]шстик_ф^0рвсден1щи культуры s.quadric&uda также позволило обнаружить 3 временных интервала,соответствующих опиоаннш ранее по.скорости роста численности. На 1-м интервале выход переменной флуоресценции суспензии культуры надает при всех концентрациях сульфата, на 2-м возрастает,иногда, с превышением контрольного уровня, на 3-м вновь падает и становится геше уровня 1-го временного интервала /рис.5/. Сопоставляя выход переменной флуоресценции со скоростью роста,можно отметить,что в течение первых двух временных интервалов наблюдается соответствие мезду изменениями физиологического состояния культуры /скорости роста/ и функциональной активностью ФС аппарата / эффективностью нервкчйых ФС процессов/.' На 3-м временном участке сохранение скорости роста на достаточно высоком уровне сопровождается,напротив,резким снижением выхода переменной флуоресценции,что означает опережение изые-

- 16 -

РЭП/-мв/

ю;7 кг* 1о-ь 10-4 ■ кг3 ю-2 с/м/

Рис.3 РЭП и Е мембран клеток харовых водорослей при действии ТМ.

скорость роста /ед.опт.плотн./сутки/

Рис.4 Скорость роста численности клеток культуры микроводорослей в условиях засоления сульфатом.

нений в функционировании ФС аппарата вблизи фотосистемы II по отношению к изменениям ростовых характеристик. Это происходит,очевидно, в связи с прямым действием засоления на ФС процессы.

Исследование флуоресцентных характеристик при прямом введении сульфата в реакционную ячейку показало увеличение флуоресценции на уровне Ф0 в течение 1,5 г.тлп. Это время,по-видимому,является необходимым и достаточным для проникновения сульфат-ионов в клетки и контакта их с ФС системой. Появление сульфата в ячейке быстро приводит к существенному уменьшению эффективности первичных ФС реакций на 25-40 % /табл.2/.

Табл_12_ Реакция характеристик переменной флуоресценции на введение сульфат-ионов в ячейку с суспензией клеток,Б.quaДricauda /число опытов - 3/.

1 концентрация . , , , 10 сульфата/М/ 1 | ТО"3 | М-2 | 1- -1 -1 1 1 1 1 5-Ю"2 | 1 _ Л -1 ИГ1

^пер./ ®макс.,1 175,3*2,0 % от контроля/) 1 |77,3*1,5 1 74,7*2,5 1 1 1 1 1 65*3,1 1 1 1 60*0,9

Опыты по изучению влияния сульфата на замедленную флуоресценцию суспензии клеток подтвердили возможность быстрого воздействия сульфат-ионов на ФС аппарат клеток зелёных микроводорослей. Замедленная флуоресценция,как и быстрая,характеризует функциональную активность электрон-транспортной цепи вблизи фотосистемы II и связана с энергизацией фотосинтетических мембран /Венедиктов,1969/.

- 18 -

Засоление среды может приводить к нарушениям в кативши структуре

хлоропластов /Таруозв к др.,1971/,что должно вызывать изменения в

замедленной флуоресценции. Введение сульфат-ионов в измерительную

ячейку вызывало резкое увеличение уровня послесвечения /вспышку/.

Вспышка возникала при достаточно высоких концентрациях сульфата -_т _о

- 10 - 10 М и сменялась постепешшм снижением свечения в течение 12-15 мин. до уровня,близкого к контрольному. Это явление,очевидно, обусловлено различной проницаемостью аниона и катиона соли для мембран тилакоидов и связью между интенсивностью послесвече -ния и энергизованностью мембран.

Следовательно,сульфатное засоление быстро и непосредственно воздействует на ФС систему микроводорослей,оказывая влияние на её функционирование вблизи фотосистемы II и снижает эффективность первичных ФС процессов,что сказывается в дальнейшем на ростовых характеристиках и,конечно,продуктивности. Состояние ростового покоя при действии сульфата при некоторых его концентрациях,очевидно,является защитной реакцией культуры в нефизиологических условиях.

4. Влияние сульфат-ионов на клетки харовых водорослей н.АохШо, Изменения скорости_^гщижешя протоплазмы клеток харовых водорослей при действии сульфата показали,что концентрации 10~* и

о

10 М после значительной стимуляции СДП в 2 раза в первые 30 мин, затем приводили к остановке движения протоплазш через I, 2,5 час. соответственно. Далее СДП восстанавливалась,превышая контрольный уровень. К 14 суткам опыта СДП принимала значения,достаточно стабильные, ниже контрольного уровня для всех концентраций в диапазоне 10-1-Ю-^. Изменения СДП во всех случаях имели сложный колебатель-

- 19 -

дай характер, природа которого неяона.

Таким образом,сульфатное'эаоолеше онижает общий уровень метаболизма клеток харовых водорослей,что следует из наших данных по СДП,подтверждается ранее выполненными работами по СДП /Камия, 1962/ и биохимическими данными /nelson, 1976 /.

Зшшоишоть ^зностц_пото1^здов_и_сод^тивления мембран клеток B.fiexlliB от концентрации сульфат-ионов в растворе, ош-вахг(ем клетку, оказалась лршейной. В диапазоне концентраций оуль-. фата величина РЭП падала от -170 до -НО мв. Увеличе-

ше концентрации сульфата во внешнем растворе привело лишь к незначит вдьноцу снижению электрического сопротивления плазмаЛемш /с 15 до II козд* /рис.6/. Очевидно,сульфат-ионы вызывают изменения калий-натриевой проницаемости внешней мембраны,на что указывает монотонное снижение РЭП и наличие сульфат-функции. Уменьшение алектричеокого сопротивления свидетельствует о незначительном- увеличении проницаемости плазмалеммы.

с т

Следовательно, в диапазоне концентраций 10 -10 М сульфат-• -ионы снижают общий уровень метаболизма клеток харовых водорослей, вызывают значительную деполяризацию внешней клеточной' мембраны и

слабо действуют на проводимость плазмалемш.Скорее всего,сульфат-

)

ное засоление действует на зелёные водоросли через ФС аппарат.

5. Комбинированное действие цинка,кадмия, кобальта и сульфата на эффективность первичных ФС процессов зелёных планктонных микроводорослей S quairicauda.

Исследовшшо_и_расчёт_эф^ектов_комбинированного действия ТМ и оульфатного засоления проводили в условиях длительного инкуби-

фпер /Фмакс./отн.ед./

время,

8 12 16 20* сутки'

Рис.5 Эффективность первичных ФС процессов культуры микроводорослей при действии сульфата.

§ Т

и го Яч

100+ 120

140..

160.. 180-

■10"

сульфат, С/М/

10"

10'

,-3

10' —^

~2 Ю-1

-1-

.16

о

Г Л

..14 о

-12

Рис.6 Зависимость РЭП и Е. мембран клеток харовых водорослей от концентрации сульфат-понов.

рования мккроводорослей Б.^иаалгхсаийи в течение 21 суток после внесения на 5 день от посева культуры различных комбинаций ТМ и сульфата по схеме полного факторного эксперимента /ПФЭ/ 24 /¡.¡аксимов,1980/. В качестве факторов служили ТМ - кадмий,цинк, кобальт,а также сульфат, закодированные как Хр^.^зД^. Факторы варьировали на 2-х уровнях:нижний уровень - отсутствие фактора,

верхний уровень - кадмий в концентрации 10""%,цинк - 10~%, кос —?

бальт - ЮМ, сульфат - 10 М. Верхние уровни факторов подбирали, опираясь на их примерно одинаковый ингибирукщий эффект по отношению к исследованным ранее физиологическим и функциональным характеристикам зелёных водорослей,но не достигающий пороговых, или критических величин. В качестве исследуемой функции использовали выход переменной флуоресценции,отражающий эффективность первичных ФС процессов Фдер /Фк1акс ,который измеряли каждые 3 суток, что дало возможность при ДФЭ 24 и варьровании фактора времени на 8 уровнях получить 128 контрастов или 127 эффектов. Расчёт коэффициентов регрессии проводили с использованием алгоритма Йейтса /Jates, 1937 /. Статистическую значимость коэффициентов регрессии определяли с использованием 1/2-нормального графика,руководствуясь положениями монографии по многофакторному эксперименту в биологии /Максимов,1980/..

Итоговое уравнение регрессии имело вид: 100 У = 34,367 - 12,047Хз " 5'34Х1Хз + 5,34X3X4 + 5,516ХзХ4 + + 5,172Х1Х2Х4 - 7,953Х1Х2Х3 + 7,328X2X3X4 + /0,952X^4 -- 0,978X4 - 1,437Х1 - 1,379X2 - 1,153Х1Х3 - 1,17/Т + + 0,2543 Дз-Хд - Х^/Т2 , где Т - время /I/

Для исследования попарных взаимодействий отдельных ТМ с суль-- 22 -

фатом,принимаем неиспользуемые факторы равными - I.. Тогда, для взаимодействия кобальт-сульфат во времени,принимаем Xj=Xg= -I и 100 У = 3*1,367 - 14,66X3 - ОД68Х4 - 1,812X3X4 + Т/1,646 +

+ 1,153Хз - 1,93X4/ + 0,2543Т2/Х4 - Хд/ /2/

Для определения эффектов взаимодействия цинк-сульфат Х^=Хд= -I : 100 У = 41,074 - 7,953X2 - 5,516X4 - 7,16X3X4 + Т/ -886 -1,379Х2 -

- 1,93X4/ + °'2543т2/ 1 - / /3/ Для оценки взаимодействия кадмий-сульфат принимаем Xg=Xg= -I и 100 У = 46,414 - 2,6I3Xj - 3,528Х4 - 5,172X^4 + Т/ 0,209 -

- 0,284Xj - 0,978X4 + 0,952XjX4/ + 0,2543Т2/Х4 -Xj/ /4/

Анализ уравнения /I/ поназывает,что кобальт,кадмий ,цинк и

сульфат-ио1ш снииаот эффективность первичных ФС процессов,причём действие 3-х последних со .временем усиливается. Как свидетельствуют коэффициенты двойных взаимодействий,кобальт модифицирует действие других факторов,причём для пары кадмий-кобальт характерен усиливающийся со временем синергизм,а для пары кобальт-сульфат /2/ антагонизм: Антагонистически действуют также цинк с сульфатом /3/ и кадмий с сульфатом /4/.

Основные выводы.

1.Анализ данных литературы по экологической обстановке внутренних водоёмов Ирака с точки зрения их загрязнённости ТМ показал отрывочность и разобщённость данных,отсутствие работ,связывающих физико-химическую обстановку в водоёмах,естественный фой сульфатного засоления и продуктивность.

2.Ингкбирование роста численности клеток s.qua&ricauda ТМ на 25-30 % наблюдали при концентрациях:цинка Ю""^!, кадмия 10~®М,ко-

с

бальта 10 'М, кадмий эффективнее цинка в 100 раз,кобальта в 10 раз.

- 23 -

3.ТЫ дейотвуат на 1С аппарат Б.(1иайх1саийа уже через 30 шв.,вдшя на скорость аяектронного транспорта.Для целей битссти-рования ТН по флуоресцентным характеристикам достаточно 2-х суточных окспериыовтов.Полное ингибирование первичных ФС процессов происходит через 8 сут.для цинка 10""%,через 12-сут.для кадмия

для кобальта 10~%.

4.По СДД.РЭП и сопротивлению мембран клеток н.гхехШв установлена, что цинк,кадмий,кобальт в концентрациях ТО-6, Ю-9,10""% соответственно вызывали обратимые эффекты остановки СДН,а критические концентрации Ю-2,Ю-5,10"% - необратимую останову дввдонкя гранул.Эти концентрации *ТМ приводили к падению РЭП и сопротивления .с нарушением пассивной проницаемости мембран,более низкие концентрации, очевидно,действуют через изменения калий-натриевой проницаемости, конкурируя за катионобыенный резерв клеточной оболочки.

5.Засоление культуральной среда сульфатом в концентрациях Ю-4 - 10~% ингибирует рост численности клеток культуры э.^иааг!-сапйа на 30-60 % в зависимости от концентрации. Скорость роста численности различна на разных временных .участках, на которых она не зависит от концентрации сульфата Ростовой кокой,

видимо,способствует повышению устойчивости клеток к засолению.

6.Эффективность первичных ФС процессов культуры 5^иа&г1саи-аа щи действии сульфата снижается на 25-40 % в зависимости от его концентрации. Время проникновения сульфат-ионов в метки - 1,5мин, Сульфатное засоление в Ю^-Ю^М неблагоприятно для функционирования ФС аппарата клеток вблизи фотосистемы II.

7.СДП клеток харовых водорослей под влиянием сульфата к 14 руткам опыта принимала значения ниже контрольного уровня для кон- 24 -

с Г

центраций 10-10 М,что свидетельствует о снижении уровня мета-

болизма. РШ меток линейно падала от -170 до -II0 мв,электрическое сопротивление менялось незначительно,что говорит в пользу незначительных изменений проницаемости внешних мембран.

8.Эффекты комбинированного действия цинка,кадмия,кобальта и сульфатного засоления на эффективность первичных ФС процессов показывают, что действие кадмия,цинка и сульфата со временем

усиливается.Для пары кадмий-кобальт характерен синергизм, для пар кобальт-сульфат и цинк-сульфат - антагонизм.

Следовательно,ГМ й сульфатное засоление оказывают ингибирую-щее действие на ФС процессы зелёных водорослей,на функционирование внешних клеточных мембран,что может отрицательно сказываться на уровне первичной продукции и продуктивности водоёмов.

1Лате£иалы диссертации с од е^жат ся_в_работ ах^ I .Аль-Сальман И.¡л. .Светлова E.H..Веселовский В.А..Плеханов С,Е. Сульфат-стресс у культуры зелёных планктонных водорослей//Био-логические науки /в печати/.

2.Аль-Сальман Н.М..Плеханов C.S. Делитченко М.М. Исследование влияния сульфатов и некоторых металлов на харовые водоросли// Доклады МОИЛ.Общая биология /в печати/.

3.Плеханов С.Е.,Аль-Сальман И.М. .Телитченко М.М. Биотестирование цинка, кадмия, кобальта по физиологическим реакциям клеток харо-вых водорослей//Гидробиологический журнал /в печати/.

4.Плеханов С.U.,Аль-Сальман ¿1.М./Телитченко jvi.M. Влияние сульфат-ионов на рост и эффективность первичных процессов фотосинтеза

//Гидробиологический журнал