Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование участия каспаз зрелого мозга крыс в механизмах памяти и обучения

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование участия каспаз зрелого мозга крыс в механизмах памяти и обучения"

На правах рукописи УДК 612 018 391 833

МАРКИНА Елена Вячеславовна /

ИССЛЕДОВАНИЕ УЧАСТИЯ КАСПАЗ ЗРЕЛОГО МОЗГА КРЫС В МЕХАНИЗМАХ ПАМЯТИ И ОБУЧЕНИЯ

03 00 13 - физиология

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□316893В

Москва - 2008

003168936

Работа выполнена в лаборатории функциональной нейрохимии ГУ НИИ нормальной физиологии им П К Анохина РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Владимир Вячеславович Шерстнев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Наталья Валериановна Гуляева

доктор биологических наук,

Ольга Николаевна Серова

Ведущая организация:

Кафедра физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им М В Ломоносова

Защита состоится 2008 г в часов

на заседании Диссертационного совета Д 001 008 01 при ГУ НИИ нормальной физиологии им П К Анохина РАМН Адрес 125009, Москва, ул Моховая, д 11, стр 4

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке НИИ НФ РАМН Автореферат разослан «$/>>/$'////¥¿$.00%г

Ученый секретарь Диссертационного совета, ^ кандидат медицинских наук / 1/~\/\ В.А. Гуменюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы

Исследования апоптоза (программированной гибели клеток) в мозге относятся к числу наиболее приоритетных и актуальных в современной нейробиологии Одним из центральных звеньев в процессе апоптоза являются каспазы - семейство цистеинсодержащих протеолитических ферментов, расщепляющих пептидную связь у остатка аспартата (Chinnaiyan et al, 1996) Особое внимание уделяют каспазе-3, которую считают узловым фактором терминальной стадии апоптотической гибели нервных и глиальных клеток (Nunez, 1998, Robert et а), 2003, Yuan, Yankner, 2000, Timmer, Salvesen, 2007)

Получены убедительные свидетельства важной роли каспазозависимых процессов апоптоза в патогенезе многих распространенных заболеваний нервной системы (цереброваскулярные, нейродегенеративные заболевания и др) (Гомазков 2006, Diamini et al, 2004) Разрабатываются и применяются в клинике новые препараты, оказывающие специфическое воздействие на активность цистеиновых протеаз, в частности, созданные на основе ингибиторов каспаз (Barut et al , 2005, Liu et al, 2005, Narkilahti et al, 2003)

В настоящее время изучение роли каспаз в механизмах обучения и памяти находится на этапе все более активного экспериментального поиска (Гуляева 2003, Sherstnev et al, 2004, 2006, Gemma et al, 2005, Stepamchev et al, 2005, Huesmann, Clayton, 2006) Значительные сложности в разработке данной проблемы обусловлены тем, что факторы, вовлеченные в регуляцию апоптоза, могут принимать участие в других клеточно-молекулярных событиях, протекающих в нервной системе Это в полной мере касается каспаз, которые непосредственно вовлечены в регуляцию клеточной гибели по типу апоптоза и, вместе с тем, регулируют клеточный цикл, пролиферацию, дифференцировку, а также пластические перестройки клеток мозга (Гуляева, 2003, Cohen, 1997,

Concha and Abdel-Meguid, 2002,) При экспериментальном изучении указанных вопросов широко используются ингибиторы активности каспаз (Fan et al, 2004) В ряде работ исследовано влияние ингибиторов каспаз на обучение, поведение и память Так, ингибитор каспазы-1 нарушал выработку обстановочного условнорефлекторного страха у крыс (Gemma et al, 2005) Установлено, что у птиц привыкание к видоспецифической песне сопровождается быстрым (в течение нескольких минут) повышением уровня каспазы-3 в синаптических зонах дендритов нейронов тех отделов переднего мозга, активация которых связана с процессом привыкания (Huesmann, Clayton, 2006) Обнаружено, что ингибитор каспазы-3 блокирует длительную потенциацию в срезах гиппокампа и предотвращает развитие долговременного облегчения синаптической связи идентифицированных нейронов ЦНС виноградной улитки (Bravarenko et al, 2006) При введении в мозг зрелых крыс специфический ингибитор каспазы-3 подавляет консолидацию долговременной пространственной памяти в водном лабиринте Морриса, не оказывая действия на кратковременную память (Dash at al, 2000)

Несмотря на очевидную теоретическую и практическую значимость, работы посвященные изучению участия и роли каспаз мозга в механизмах обучения и памяти сравнительно немногочисленны, а результаты их противоречивы До сих пор не изучен вопрос о закономерности участия каспаз в нейрохимических механизмах интегративной деятельности мозга, а так же особенности вовлечения этих ферментов в обеспечение различных форм поведения и памяти Практически отсутствуют данные о действии ингибиторов каспаз на показатели развития и гибели клеток в зрелом мозге Остается неясным, связаны ли центральные эффекты ингибиторов с изменениями «неапоптозных» функций каспаз, в частности, свойств нейропластичности или влиянием на неонейрогенез и апоптоз

Цели п задачи исследования.

Целью данной работы явилось исследование участия цистеиновых протеаз - каспаз мозга в механизмах обучения и памяти у взрослых животных

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи

1 Изучить влияние ингибиторов активности каспаз при внутримозговых введениях на различные виды поведения и формы памяти у взрослых крыс

2 Провести сравнительный анализ действия ингибитора активности каспаз широкого спектра действия г-УАО-йпк и специфического ингибитора каспазы-3 г-ОЕУО-йпк на обучение и память у половозрелых крыс

3 Выявить эффекты интрацеребровентрикулярного введения специфического ингибитора каспазы-3 на биохимические маркеры апоптоза -межнуклеосомальную фрагментацию ДНК и активность каспазы-3 в различных структурах зрелого мозга крыс

Научная новизна работы.

В работе впервые исследовано влияние ингибитора активности каспазы широкого спектра действия и специфического ингибитора каспазы-3 на различные виды поведения и формы памяти у взрослых животных Впервые проведено одновременное количественное определение биохимических маркеров апоптоза - активности каспазы-3 и межнуклеосомальной фрагментации ДНК в различных отделах зрелого мозга при действии специфического блокатора каспазы-3 Установлено, что каспазы мозга избирательно вовлекаются в молекулярные механизмы, обеспечивающие формирование, хранение и воспроизведение различных поведенческих навыков у крыс Выявлены избирательные и гетерохронные изменения биохимических маркеров апоптоза в релевантных структурах мозга при интрацеребровентрикулярном введении специфического ингибитора каспазы-3

в дозе, вызывающей облегчение формирования долговременной памяти Получены новые экспериментальные свидетельства участия каспазы-3 как в процессах апоптоза, так и нейрональной пластичности в зрелом мозге Научно-практическое значение работы.

Результаты работы расширяют и уточняют современные представления о молекулярных основах обучения и памяти, а также роли процессов программированной клеточной гибели в обеспечении интегративной деятельности зрелого мозга Полученные данные помогут в понимании роли каспаз в механизмах апоптоза и нейрональной пластичности в норме и при развитии заболеваний нервной системы Результаты работы могут быть использованы при разработке новых фармакологических средств коррекции нарушений когнитивных функций на основе направленного воздействия на активность каспаз Научно-теоретические положения работы могут быть привлечены в качестве дополнительного материала в учебно-педагогическом процессе в высших учебных заведениях медицинского и биологического профиля

Основные положения, выносимые на защиту.

Каспазы мозга, в частности, каспаза-3, которая играет ключевую роль в центральных эффектах семейства цистеиновых протеаз, избирательно и гетерохронно вовлекаются в обеспечение нейрохимических механизмов обучения и памяти у взрослых животных, участвуя в процессах программированной клеточной гибели (апоптоза) и нейрональной пластичности

Апробация диссертации.

Материалы диссертации были представлены на научной конференции «Интеграция НИИ - ВУЗ - клиника», (г Москва, апрель 2004), XIX всероссийском съезде физиологического общества им И П Павлова (г

Екатеринбург, сентябрь 2004), Всероссийской конференции «Нейрохимия фундаментальные и прикладные аспекты» (г Москва, апрель 2005), Международном симпозиуме «Гиппокамп и память» (г Пущино, июль 2006), Всероссийском съезде физиологического общества им И П Павлова (г Москва, июнь 2007), итоговых сессиях НИИ НФ им П К Анохина (г Москва, 2004, 2005, 2006) Диссертационная работа была апробирована на совместном заседании лаборатории функциональной нейрохимии, лаборатории мотивации, лаборатории боли ГУ НИИ НФ им П К Анохина 26 октября 2007 г

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, 3 из которых - статьи в российских журналах и 4 - тезисы в материалах международных и российских научных конференций

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 120 страницах, включает разделы введение, обзор литературы, характеристика методов исследования, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы Работа иллюстрирована 20 рисунками и 7 таблицами Список цитируемой литературы включает 175 источников 148 из них на иностранных языках

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на половозрелых крысах - самцах линии Вистар (п = 240), массой 280-300 г, с соблюдением этических принципов (БелоусовЮ Б,2005)

В опытах были использованы ингибиторы каспаз z-VAD-fmk (ингибитор каспаз широкого спектра действия) и z-DEVD-fmk (специфический ингибитор каспазы-3) (Sigma, США) Ингибиторы разведены в 0,5% диметилсульфоксиде За три дня до начала экспериментов проводимых на модели водного лабиринта Морриса и условно-рефлекторного замирания, наркотизированным хлоралгидратом крысам (0,5 мг/кг массы тела) унилатерально были

установлены направляющие канюли (АР -1,5, L±2, Н 3,5) (Paxinos Watson, 1984) z-VAD-fmk вводили в дозе 40 мкг/мкл и объеме 2 мкл, z-DEVD-fmk - 5 мкг/мкл и объеме 2 мкл, контрольным животным инъецировали 2 мкл 0,5% диметилсульфоксида

Экспериментальная работа проводилась с использованием нескольких методик оценки поведения животных условно-рефлекторное замирание, водный лабиринт Морриса, угашение акустической стартл-реакции (АСР)

Обучение в лабиринте Морриса и инъекции ингибитора проводили с использованием четырех различных схем В первой серии экспериментов изучали влияние панкаспазного ингибитора на формирование памяти в условиях однократного введения за 30 минут до обучения В ходе эксперимента животных помещали в воду с 6 разных случайно выбранных точек лабиринта После достижения животным платформы его оставляли на ней на 30 с , после чего помещали в домашнюю клетку на 30 с В каждой пробе фиксировали время, необходимое для достижения платформы Крыс обучали в течение трех дней с перерывом между сеансами в 24 часа Положение платформы было неизменным в течение первых 2 дней и во время первой пробы третьего сеанса, после чего проводили переделку навыка Для этого положение платформы изменяли и проводили еще 5 проб Поскольку максимальный стимулирующий эффект ингибитора проявлялся в третий день, то во второй серии экспериментов z-VAD-fmk вводили за 3 дня до начала эксперимента и обучали животных в течение трех дней как описано выше

Для изучения влияния z-VAD-fmk на «рабочую» память крыс обучали в течение 3-х дней, ежедневно изменяя положение платформы, а ингибитор вводили однократно за 30 минут до первого сеанса обучения

С целью оценки адекватности используемых методов и сопоставления полученных результатов с данными литературы была выполнена серия

экспериментов по протоколу, использованному в работе Dach et al, (2000) животных в течение одного сеанса обучали до критерия - 3-х кратное достижение платформы за 10 секунд, а инъекции ингибитора осуществляли сразу после обучения Тестирование проводили через 48 часов после введения z-VAD-fmk

На модели условно-рефлекторного замирания с целью изучения влияния указанных веществ на формирование, хранение и воспроизведение поведения замирания ингибиторы каспаз z-VAD-fmk и z-DEVD-fmk вводили за 30 мин до и после обучения, и спустя 24 часа после обучения соответственно Обучение и тестирование животных проводили по стандартному протоколу (Fanselow et al, 1993)

При исследовании влияния специфического ингибитора каспазы-3 на формирование, консолидацию и воспроизведение угашения АСР и поведение замирания z-DEVD-fmk апплицировали на кору червя мозжечка через предварительно приготовленное отверстие, расположенное на 3 мм каудальнее лямбды на продолжении стреловидного шва, при глубине погружения иглы 3 мм (Paxinos Watson, 1984) В качестве экспериментальной модели использовали кратковременное и долговременное угашение стартл-реакции на звуковой стимул с одновременной регистрацией поведения замирания Перед началом эксперимента были сформированы следующие группы животных 1 - крысы, которым вводили ингибитор каспазы-3 за 1 час до обучения, 2 - животные, которым инъецировали z-DEVD-fmk через 2 часа после обучения, 3 - крысы, которым вводили z-DEVD-fmk за 1 час до тестирования

Для проведения биохимического анализа маркеров апоптоза (активности каспазы-3 и межнуклеосомальной фрагментации ДНК) структуры головного мозга интактных крыс выделяли при +4°С и гомогенизировали в охлажденном лизирующем буфере в соотношении ткань/буфер 1 10 (=10 мг белка на 1 мл

супернатанта) на гомогенизаторе Heidolph DIAX 100 (Германия) при 5000 об/мин в течение 15 сек Активность каспазы-3 определяли, инкубируя аликвоты супернатанта (-300 мкг белка) в присутствии 200 мкМ субстрата каспазы-3 (Sigma, США) в объеме 350 мкл при +37°С в течение 3 часов Высвобождение в реакционную среду субстрата каспазы-3 оценивали через каждые 30 минут в 96-луночных плоскодонных полистирольных планшетах на фотометре Униплан (Пикон, Россия) при 405 нм Активность каспазы-3 рассчитывали по скорости высвобождения субстрата каспазы-3 в пмоль/мин в пересчете на 1 мг белка Белок определяли в тех же аликвотах супернатанта, что и активность каспазы-3, при 600 нм спектрофотометрически в присутствие пирогаллолового красного и молибдата натрия по образованию цветного аддукта реакции, интенсивность поглощения которым была прямо пропорциональна содержанию белка в пробе

Межнуклеосомальную фрагментацию ДНК выявляли методом горизонтального электрофореза в агарозном геле с прокрашиванием ДНК SYBR Green II Электрофорез фрагментов ДНК проводили в камере SE-2 производства «Хеликон» (Россия) в 2% агарозном геле Время электрофореза 55 минут, напряжение - 200 В при +4°С Фрагментацию ДНК наблюдали в УФ-свете при 254 и 312 нм на трансиллюминаторе TFX20MC (Vilber Lourmat, Франция), с последующим документированием изображений в электронном виде при помощи видеокамеры ССТВ (Samsung, ЮК) и программы Gel Imager (Россия)

Цифровую обработку изображений фрагментированной ДНК проводили в программе Bioprofil Е-САРТ (Vilber Lourmat, Франция), с последующим переносом результатов в Microsoft Excell и их окончательной количественной обработкой В качестве маркерной ДНК использовали коммерческий препарат

(Sigma, США) с фрагментами от 50 пар оснований (по) до 4000 по и инкрементом в 50 п о

Фрагментация ДНК, характерная для погибающих или уже распавшихся на апоптозные «тельца» клеток, и отражающая временные этапы апоптотического процесса, анализировалась по ряду параметров суммарное содержание фрагментированной ДНК, количество фрагментов ДНК 200-3000 п о («короткие» фрагменты) и уровень фрагментов 4000 по и более («длинные» фрагменты)

Статистическую обработку результатов осуществляли в программе STAT1STICA 6 0 с применением регрессионного анализа, двустороннего t-критерия Стьюдента, дисперсионного анализа с повторными измерениями, U-критерия Манна-Уитни Различия считали достоверными при р < 0 05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Влияние ингибитора активности каспаз z-VAD-fmk на формирование и консолидацию/хранение пространственного навыка в водном лабиринте Морриса.

При анализе данных, полученных в эксперименте при изучении влияния z-VAD-fmk на формирование пространственного навыка в лабиринте Морриса, обнаружено, что в течение первых двух дней обучения скорость снижения латентного периода достижения платформы у контрольных и экспериментальных крыс не различались Так, коэффициент регрессии латентного периода реакции от номера пробы в первый день составил у контрольных животных -6,33±1,45, а у крыс, получавших инъекции ингибитора он равнялся -7,89±1,20 (р>0,1), во второй день обучения -соответственно -3,66±1,26 и -3,64±1,32 Вместе с тем, снижение времени достижения платформы в первой попытке между 1-м и 3-м сеансами у

животных, получавших г-У/Ш-Апк, было выражено значительно больше, чем в контроле - показатели регрессии составляли соответственно -17,58±1,27 и -4,78±2,71 (р<0,01) (рис 1)

Рнс 1 Время достижения платформы с постоянным положением в первой пробе сеансов обучения у крыс в условиях внутримозгового введения z-VAD-fmk за 30 минут до начала обучения По оси абсцисс - дни обучения, по оси ординат - время достижения платформы в первой попытке сеанса обучения в сек среднее ±SEM (стандартная ошибка среднего) Пунктирная линия - контроль, сплошная линия - введение z-VAD-fmk * - р<0,05 отличия от контроля в динамике снижения латентного периода по результатам дисперсионного анализа с повторяющимися измерениями (repeated measures one-way ANOVA) Л - p<0,05 отличия от контроля в динамике снижения латентного периода по результатам регрессионного анализа Количество животных в каждой из групп п=10

После перемены места положения платформы достоверных различий в динамике показателей обучения между контрольной и экспериментальной группами не обнаружено

Полученные результаты позволяют предположить, что введение в желудочки мозга ингибитора каспаз широкого спектра действия облегчает формирование долговременной пространственной памяти, не оказывая влияния на кратковременную пространственную память

Поскольку обнаруженное стимулирующее действие z-VAD-fmk на долговременную память максимально проявлялось к третьему дню после инъекции, во второй серии экспериментов введение ингибитора проводили за 3 суток до начала обучения В этих условиях различий между экспериментальной

и контрольной группами в показателях формирования долговременной памяти обнаружено не было (рис 2)

Рис 2 Динамика достижения платформы с постоянным положением в первой пробе сеансов обучения у крыс в условиях внутримозгового введения г-УАО-Ьпк за 3 дня до начала обучения По оси абсцисс - дни обучения, по оси ординат - время достижения платформы в первой попытке сеанса обучения в сек среднее ±БЕМ (стандартная ошибка среднего) Пунктирная линия - контроль, сплошная линия - введение г-УАВ-йпк Количество животных в каждой из групп п=9

В экспериментах по изучению «рабочей» памяти (3-х дневное обучение при переменном положении платформы) не было выявлено влияния ингибитора активности каспаз на кратковременную пространственную память динамика времени достижения платформы в течение каждого из трех сеансов не различалась у контрольных и экспериментальных животных Вместе с тем, во второй день обучения время достижения платформы в первой пробе у животных с инъекциями г-УЛБ-йпк было достоверно ниже, чем в контроле (рис 3)

1 2 3

Рис 3 Динамика достижения платформы с переменным положением в первой пробе сеансов обучения у крыс в условиях внутримозгового введения z-VAD-fmk за 30 минут до начала обучения По оси абсцисс - дни обучения, по оси ординат - время достижения платформы в первой попытке сеанса обучения в сек среднее ±SEM (стандартная ошибка среднего) Пунктирная линия - контроль, сплошная линия - введение z-VAD-fmk * - р<0,05 по сравнению с контролем (двусторонний t-критерий Стьюдента) Количество животных в каждой из групп n=l 1

В опытах, проведенных по схеме, использованной в работе Dash et al (2000), с введением z-VAD-fmk после обучения, выявлено нарушение консолидации/хранения выработанного пространственного навыка при тестировании латентный период достижения платформы крысами экспериментальной группы был достоверно выше, чем в контроле (рис 4)

Рис 4 Влияние г-УАО-Апк в условиях внутримозгового введения на консолидацию/хранение долговременной пространственной памяти в лабиринте Морриса у взрослых крыс По оси абсцисс - номер пробы в сеансе тестирования, по оси ординат -время достижения платформы в сек среднее ±8ЕМ (стандартная ошибка среднего) Пунктирная линия - контроль, сплошная линия - введение г-УАО-Лпк * - р<0,05 по

сравнению с контролем (двусторонний ¡-критерий Стыодента) Количество животных в каждой из групп п=10

Таким образом, результаты экспериментов свидетельствуют об избирательном влиянии ингибитора каспаз широкого спектра действия на различные формы памяти при обучении крыс в водном лабиринте г-УАО-йпк стимулирует формирование долговременной пространственной памяти, не оказывает влияния на кратковременную пространственную память и нарушает процессы консолидации/хранения сформированного памятного следа 2. Действие ингибиторов каспаз г-УАО-/тк и г-ЬЕУО-рпк па формирование, консолидацию/храпение и воспроизведение поведения замирания у крыс.

«Панкаспазный» ингибитор г-УАБ-Апк вводимый за 30 мин до начала обучения, не оказывал действия на исходное время замирания крыс, как до подачи звука, так и во время его предъявления Вместе с тем, при оценке полученных данных через 48 часов после обучения по критерию Стьюдента и с помощью АМОУЛ/МАИОУЛ обнаружено возрастание времени замирания при тестировании звуковым стимулом у экспериментальных животных по сравнению с контролем (Р=7 32, р<0 03) При тестировании обстановочным стимулом значимых различий между группами животных обнаружено не было (Р=0 34, р=0 58) (табл 1)

Таблица 1 Влияние ингибиторов каспаз z-VAD-fmk и DEVD-fmk на

формирование поведения замирания у крыс

условный стимул ^ч^Группа ^чживотных время замирания контроль время, с z-VAD-fmk время, с контроль время, с z-DEVD-fmk время, с

звук Исходное 3 5±1 1 0 3 8±1 1 3 2±1 4

при тестировании 6 2±3 7 19±4 3* 7 7±2 6 16 3±3 3*

обстановка исходное 0 2 0±0 8 2 0±1 1 1 8±1 1

при тестировани 62 5±242 44 1±20 1 62±16 7 54±8 8

* - р<0 05 по сравнению с контролем (дисперсионный анализ с повторными измерениями)

Сходный результат был получен в опытах с использованием

специфического ингибитора каспазы-3 г-ОЕУБ-йпк при его введении за 30 мин до начала обучения Двухфакторный анализ выявил достоверные различия в динамике формирования поведения замирания на звуковой сигнал между испытуемыми группами ^=5 61, р<0 04) Вместе с тем, г-БЕУВ-йпк инъецированный за 30 минут до обучения не оказал влияния на выработку поведения замирания на обстановочный условный стимул (табл 1)

Таблица 2 Влияние ингибиторов каспаз г-УАЭ-йпк и г-ОЕУО-Лпк на хранение поведения замирания у крыс

условный стимул ^\Группа ^%5|ШВ0ТНЫХ время замирания контроль время, с z-VAD-fmk время, с контроль время, с z-DEVD-fmk время, с

звук исходное 2 5±1 04 2 0±0 9 1 2±1 0 2 5±2 2

при тестировании 17 8±4 7 8 3±4 01 12 5±5 9 10 0±3 5

обстановка исходное 3 5±3 2 21±20 1 0 2 5±2 02

при тестировании 68±28 7 78±268 42±3 5 39±5 7

Данные представленные в табл 2 и 3 свидетельствуют, что ингибиторы каспаз г-УАО-А-пк и г-ОЕУБ-йпк при введении в желудочки мозга не

оказывали действия на хранение/консолидацию и воспроизведение поведения замирания у крыс

Таблица 3 Влияние ингибитора каспазы-3 г-ОБУБ-Апк на воспроизведение поведения замирания у крыс

условный стимул .Труппа ^Х<(ШВОТНЫХ время замирания —_ контроль время, с z-DEVD-fmk время, с

звук исходное 3 3±3 3 00

при тестировании 11 0±3 0 6 7±2 5

обстановка исходное 3 3±3 3 3 2±2 0

при тестировании 12 8±1 9 8 4±1 5

Таким образом, результаты проведенных нами экспериментов демонстрируют сходные и однонаправленные эффекты изученных ингибиторов активности каспаз в условиях их центрального действия на процессы обучения и памяти г-ВЕУБ-йпк и г-УАО-йпк облегчают формирование поведения замирания на предъявление ключевого стимула (звука), не оказывая влияния на формирование обстановочной памяти, а также на процессы консолидации/хранения и воспроизведения пассивнооборонительного поведения у крыс в модели условно-рефлекторного замирания 3. Влияние специфического ингибитора каспазы-3 г-ОЕ УВ-/тк на формирование, хранение и воспроизведение долговременного угашения АСР и условного страха у крыс.

Как было показано ранее, предъявление серии сильных звуковых раздражителей вызывает у крыс стартл-реакцию, амплитуда которой снижается по мере предъявления повторных стимулов, т е наблюдается феномен кратковременного угашения АСР При предъявлении животному спустя 24 часа тестирующей серии звуковых раздражителей отмечается снижение средней амплитуды первого ответа по сравнению с аналогичным

показателем во время обучения и ускоренное снижение амплитуды ответа при последующем предъявлении стимула - феномен долговременного угашения АСР (Pletnicov et al, 1996, Storozheva, Pletnicov, 1994) Продолжительность замирания у крыс увеличивается при повторном (через 24 часа после первого сеанса) помещении их в экспериментальную камеру, что обусловлено формированием условного страха на экспериментальную обстановку Рядом авторов показано, что привыкание АСР и формирование условного страха связаны с функциями мозжечка (Sacchetti et al, 2005, Storozheva, Pletnicov, 1994, Supple et al, 1988)

Нами обнаружено, что аппликация специфического ингибитора каспазы-3 на червь мозжечка за 1 час до обучения стимулирует долговременное угашение АСР, не оказывая влияния на исходную амплитуду реакции и кратковременное угашение Облегчение долговременного угашения АСР при введении z-DEVD-fmk происходит в основном за счет ускорения снижения амплитуды ответа при повторной звуковой стимуляции через 24 часа после обучения Так, наблюдаемые различия в амплитуде АСР между контрольной и экспериментальной группами достигают уровня достоверности лишь к концу сеанса тестирования (табл 4) Действия ингибитора на динамику поведения замирания (основной показатель обстановочного страха) не отмечено, однако выявлено уменьшение выраженности стереотипий и одновременное увеличение времени груминга в сеансе тестирования у животных экспериментальной группы по сравнению с контролем Это указывает на изменение под действием ингибитора структуры эмоционального поведения животных, вызванного помещением в обстановку ассоциированную с аверсивной стимуляцией В ходе экспериментов не обнаружено влияния ингибитора каспазы-3 в условиях аппликации на червь мозжечка на консолидацию/хранение и воспроизведение АСР и поведения замирания

Таблица 4 Эффект ингибитора каспазы-3 г-ОБУБ-йпк при его аппликации на червь мозжечка взрослых крыс на формирование, хранение и воспроизведение долговременного угашения АСР и условного страха

Режим введения группа животных Обучение

Амшипуда 1-й АСР Амплшуда 10-й АСР Время замирания Грум! II1Г Стереотипия

За 1 час до обучения Контроль 18 9 ±3 7 17 5 ±4 3 36 5 ±11 6 42 2 ±24 2 102 5 ±129

г-ОЕУО-йпк 18 0 ±3 5 14 7 ±4 2 37 8 ±13 5 100 9 ±19 8 71 2 ±144

Через 2 часа после обучения Контроль г-БЕУО-йпк 12 1 ±2 1 3 8±1 4 49 2 ±8 0 47 8 ±9 8 46 0 ±106

За 1 час до теста Контроль г-ОЕУО-1шк 9 5 ±2 7 1 3 ±0 5 36 0 ±8 7 84 0 ±109 58 9 ±11 3

Тестирование через 24 часа

За 1 час до обучения Контроль 164 ±2 9 13 5 ±3 5 64 5 ±129 49 0^ ±14 4* 84 4^ ±10 7*

г-ОЕУО-йпк 13 1 ±2 6 52 ±0 7* 52 2 ±129 112 4^ ±22 2* 33 ±11 0*

Через 2 часа после обучения Контроль 75 ±3 9 33 ±2 4 57 7 ±10 5 43 8 ±186 52 2 ±153

г-БЕУБ-йпк 80 ±3 0 1 9 ±0 6 26 5 ±5 6 52 2 ±124 50 4 ±149

За 1 час до теста Контроль 11 8 ±4 2 08 ±0 4 77 0 ±13 5 194 ±12 77 5 ±12 3

г-ОЕУБ-йпк 44 ±1 5 1 2 ±0 2 50 7 ±179 60 4 ±24 6 59 7 ±10 2

*- р<0 05 по сравнению с контролем (двухсторонний ^критерий Стьюдента)

Данные получение с использованием модели угашения АСР указывают, что специфический ингибитор каспазы-3 при аппликации на червь мозжечка стимулирует формирование угашения АСР, не оказывает влияния на его

хранение и воспроизведение, а также на поведение замирания у крыс и, вместе с тем, снижает выраженность стереотипий, увеличивая время грумминга 4 Эффекты интрацсребровентрикулярного введения ингибитора касназы-3 на межнуклеосомалъную фрагментацию ДНК и активность каспазы-3 в различных структурах мозга крыс.

Средняя величина активности каспазы-3 у крыс контрольной группы в исследованных отделах мозга равнялась 15 пмоль/мин/мг белка При этом активность фермента в коре мозга была ниже - 4,71±0,49 пмоль/мин/мг белка, чем в гиппокампе и амигдале - 8,31±1,51 и 9,74±1,74 пмоль/мин/мг белка, соответственно (р<0 05), что согласуется с ранее полученными результатами (Шерстнев и др , 2005, ЗЬегБ^еу е1 а!, 2006)

Таблица 5 Активность каспазы-3 (пмоль/мин/мг белка) в исследованных отделах мозга крыс

Группа животных Отделы мозга

гиппокамп амигдала кора

Контроль 831±1 51 9 74±1 74 4 71±0 49*

1 ч после введения 12 48±0 91** 6 37±1 1** 5 31±0 35

24 ч после введения 10 03±1 14 11 27±1 28 4 76±0 92

* р < 0 05 - достоверность различим в сравнении с гиппокампом и амигдалой внутри группы контрольных животных (АИОУА)

** р < 0 05 - достоверность различий по сравнению со значениями у контрольных животных (А№ЭУА)

В амигдале через 1 час после введения ингибитора Ас-ВЕУО-А1 активность фермента снижалась на 50% по сравнению с контролем, а через 24 часа возвращалась к исходному уровню, выявляемому в данной структуре у контрольных животных В гиппокампе, при этом наблюдалось увеличение активности каспазы-3 на 50% Через 24 часа активность фермента не отличалась от уровня его активности у контрольных животных (р<0 05) В

префронтальной коре активность каспазы-3 на обоих временных сроках не изменялась после введения ингибитора (табл 5)

Таблица 6. Содержание ДНК размером от 200 до 3000 п о в пг/мг ткани в исследованных отделах мозга крыс

Группа животных Отделы мозга

гиппокамп амнгдала кора

Контроль 582±149 728±107 955±281

1 ч после введения 1051±128* 1955±152* 1362±24

24 ч после введения 593±145 1445±216* 1173±226

* р < 0 05 - достоверность различий по сравнению со значениями у контрольных животных (ANOVA)

Фрагменты ДНК размером 200-3000 п о («короткие фрагменты»), были обнаружены во всех исследованных структурах мозга у контрольных животных, при этом, их количественное содержание не отличалось друг от друга (р<0 05) Содержание «коротких» фрагментов в гиппокампе возрастало в 2 раза после ведения ингибитора и возвращалось через 24 часа к исходному уровню (р<0 05) В амигдале документировано увеличение количества «коротких» фрагментов в 2,5 раза через 1 час после введения ингибитора, а спустя 24 часа - в 2 раза в сравнении с контрольными крысами (р<0 05) Введение Ас-ОЕУО-А1 не влияло на содержание «коротких» фрагментов ДНК в коре мозга, уровень которых оставался неизменным (табл 6)

Обнаружено, что уровень фрагментов ДНК более 4000 п о в гиппокампе контрольных животных превышал таковой в 3 и 2 раза (р<0 05) в амигдале и в коре мозга, соответственно (табл 7)

Таблица 7. Содержание ДНК размером более 4000 п о (пг/мг ткани) в исследованных отделах мозга крыс

Группа животных Отделы мозга

гиппокамп амигдала кора

Контроль 998±94 ЗЗб±4Г 568±180

1 ч после введения 519±30* 1089±68* 603±27

24 ч после введения 554±130* 778±95* 530±120

х р < 0 05 - достоверность различий в сравнении с пшпокампом и корон внутри группы контрольных животных

* р < 0 05 - достоверность различий по сравнению со значениями у контрольных животных (АЫОУА)

В амигдале через 1 час после введения ингибитора выявлялось 3-кратное, а через 24 часа - 2-кратное превышение уровня «длинных» фрагментов ДНК в сравнении с контролем (р<0 05) Их содержание в гиппокампе было снижено в 2 раза как через 1 час, так и через 24 часа после введения ингибитора каспазы-3 (р<0 05) В коре мозга Ас-ВЕУО-А1 не вызывал изменений в количественном содержании «длинных» фрагментов ДНК на всех этапах опыта

Суммарное содержание фрагментированной ДНК у контрольных крыс было наименее выражено в амигдале - 1094±261 пг/мг ткани в отличие от значений данного параметра в коре и гиппокампе 1523±459 и 1580±221 пг/мг ткани, соответственно После введения ингибитора каспазы-3 суммарное содержание фрагментированной ДНК в коре мозга не изменялось на всех этапах опыта, однако уменьшалось в гиппокампе на 25% через 24 часа и достоверно возрастало в амигдале через 1 и 24 часа (р<0 05)

Таким образом, нами обнаружены гетерогенные и разновременные изменения активности каспазы-3 и межнуклеосомальной фрагментации ДНК в исследованных структурах мозга крыс в условиях внутрижелудочкового введения специфического ингибитора каспазы-3 в дозе, оказывающей влияние на формирование поведения замирания у крыс в ответ на условный стимул

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В экспериментах, выполненных на модели водного лабиринта Морриса, нами было установлено, что введение в желудочки мозга ингибитора активности каспаз г-УАЭ-Апк облегчает формирование долговременной пространственной памяти, не влияя на кратковременную память Отмечено также, что стимулирующее действие г-УАО-йпк на долговременную пространственную память проявляется только в условиях, когда обучение происходит через 30 мин после введения ингибитора Анализ биохимических маркеров апоптоза показал, что в гиппокампе активность каспазы-3, достоверно возрастала через 1 час после введения ингибитора При этом наблюдалось увеличение количества «коротких» фрагментов ДНК -показателя терминальной стадии апоптоза, содержание которых непосредственно зависит от активности каспазы-3 (Епап е1 а1, 1998) Вместе с тем, стимулирующий эффект ингибитора на пространственную память был максимально выражен на 3 день после инъекции ингибитора По данным литературы обучение крыс в лабиринте Морриса приводит к повышению выживаемости в гиппокампе новых клеток, возраст которых составляет 2-4 дня, в то время как выживаемость более «молодых» и более зрелых клеток снижается (АтЬгс^пи е1 а1, 2004, Ьеипег е! а1, 2006) Можно полагать, что действие ингибитора активности каспаз широкого спектра действия при введении в желудочки мозга взрослых животных на долговременную пространственную память связано с влиянием на программируемую гибель вновь образованных нейронов в гиппокампе что указывает на возможное вовлечение процессов нейрогенеза-апоптоза в зрелом мозге в нейрохимические механизмы обучения и памяти

При изучении влияния ингибитора каспаз на «рабочую» память документировано, что животные, получавшие г-УАО-Апк, быстрее находят

платформу, положение которой им неизвестно На наш взгляд выявленные эффекты обусловлены стимулирующим действием ингибитора на «пластичность» навыка, т е способность к его переделке на начальных стадиях формирования, что, как известно, тесно связано с функциями гиппокампа (Виноградова, 1975) Некоторые авторы высказывают мнение, что одним из основных условий, обеспечивающих возможность переделки навыка, является наличие вновь образованных дифференцированных нейронов в зубчатой фасции гиппокампа (Leuner et al, 2006)

Ингибитор активности каспаз z-VAD-fmk, вводимый после обучения по схеме, приведенной в работе Dash et al (2000), вызывает нарушение процесса консолидации/хранения долговременной пространственной памяти Это, по видимому, может быть связано как с нарушением «неапоптотических» функций каспаз, что предполагали Dash et al, 2000, так и с воздействием на процессы нейрогенеза-апоптоза Об этом свидетельствует тот факт, что интервал между введением z-VAD-fmk и процессом тестирования в этих экспериментах составлял 48 часов - период, достаточный для образования новых нейронов, не вовлеченных в формирование памятного следа (Abrous et al, 2005, Prickaerts et al 2004) Увеличение количества выживших вновь образованных нейронов в гиппокампе при угнетении активности каспаз в мозге может явиться причиной снижения уровня выполнения навыка в сеансе тестирования

Нами показано избирательное влияние «панкаспазного» ингибитора z-VAD-fmk на различные виды и стадии памяти Интрацеребровентрикулярное введение z-VAD-fmk облегчает формирование долговременной пространственной памяти, не оказывает влияния на кратковременную пространственную память и нарушает консолидацию/хранение долговременной пространственной памяти у крыс в водном лабиринте

В выполненных нами экспериментах на модели условно-рефлекторного замирания получены свидетельства избирательного влияния ингибиторов каспаз на процессы обучения и памяти Обнаружено, что специфический ингибитор каспазы-3, вводимый внутрь желудочков мозга в дозе 5 мкг/мкл, стимулирует формирование условного замирания на условный сигнал - форму памяти, связанную с функциями амигдалы В биохимических исследованиях выявлено, что аналогичная доза ингибитора инициирует выраженное снижение активности каспазы-3 в амигдале через 1 час после введения и значимое усиление суммарной фрагментации ДНК При этом равномерное увеличение количества «коротких» и «длинных» фрагментов ДНК указывает на выраженную апоптотическую гибель клеток и позволяет предположить, что в амигдале подавление активности каспазы-3 возможно стимулирует каспазанезависимые механизмы фрагментации ДНК Не исключено также, что при этом проявляются каспаза-3-зависимые механизмы сдерживания гибели клеток, возможно за счет инактивации катепсинов, калпаинов и калпостатинов, а также активации каспазы-7 в зрелом мозге крыс В пользу последнего предположения свидетельствуют данные о том, что Ac-DEVD-Al может эффективно подавлять активность каспазы-7, которой приписывается функция инактивации каспазы-3 (Moriya et al, 2000, Clements et al, 2005)

Таким образом, изменения активности каспазы-3 и фрагментации ДНК в амигдале после интрацеребровентрикулярного введения ингибитора каспазы-3, с одной стороны, и, наблюдаемая в аналогичных условиях стимуляция зависимого от функций амигдалы поведения указывают на участие процессов программируемой гибели клеток амигдалы в механизмах формирования этой формы поведения у взрослых крыс

Специального внимания заслуживает обнаруженный нами факт, что «панкаспазный» ингибитор и специфический ингибитор каспазы-3 в условиях

интрацеребровентрикулярного введения оказывают сходное действие на процессы обучения и памяти, изучаемые в модели условно-рефлекторного замирания Этот факт согласуется с результатами исследований выполненных на других поведенческих моделях (Dash et al, 2000, Stepanichev et al, 2005) Показано так же, что «панкаспазный» ингибитор подавляет активность каспазы-3 и оказывает сходное со специфическими игибиторами каспазы-3 влияние на различные тканевые процессы (Chan, Mattson, 1999, Mattson, Duan, 1999) Таким образом, указанные экспериментальные данные подтверждают высказанное ранее представление о ведущем значении каспазы-3 в реализации эффектов семейства цистеиновых протеаз в зрелом мозге

Результаты наших опытов демонстрируют, что аппликация ингибитора каспазы-3 на червь мозжечка оказывает избирательное действие на формирование поведения связанного с функциями мозжечка - стимулирует долговременное угашение АСР, не оказывая влияния на исходную амплитуду реакции и кратковременное угашение, способствует уменьшению выраженности стереотипий и увеличению времени груминга Полученные с использованием модели угашения АСР данные, по нашему мнению, отражают влияние z-DEVD-fmk на неапоптотические функции каспаз в мозжечке В пользу такого предположения свидетельствует следующее эффект ингибитора каспазы-3 на поведение животных наблюдался через 24 часа после его аппликации, при этом не обнаружено его действия через 2 часа Вместе с тем, в предыдущих исследованиях нами документировано, что активность каспазы-3 в коре червя мозжечка значимо снижается через 24 часа после выработки угашения АСР, тогда как содержание «коротких» фрагментов ДНК -показателя терминальной стадии апоптотических процессов - остается неизменным (Шерстнев и др , 2005) Согласно литературным данным, одним из основных нейрохимических механизмов пластичности в коре мозжечка

считается снижение эффективности синаптической глутаматэргической передачи в результате интернализации АМРА-рецепторов (Но, 2001) В то же время, показано вовлечение каспазы-3 в регуляцию активности АМРА- и NMDA-peцeптopoв глутамата (Типшег, Закезеп, 2007), а также в процесс ЫМОА-зависимой интернализации АМРА-глутаматных рецепторов (Ме1г1ег й а1, 2007) Можно полагать, что изменения активности каспазы-3 при аппликации ингибитора модулируют эту специфическую для мозжечка форму пластичности и формирование поведения, связанного с функциями данной структуры мозга

Анализ внутри и межструктурной взаимосвязи и сопряженности биохимических показателей апоптоза в зрелом мозге крыс в условиях использованной нами экспериментальной ситуации выявил, что специфический ингибитор каспазы-3 при интрацеребровентрикулярном введении вызывает гетерогенные и гетерохронные изменения активности каспазы-3 и межнуклеосомальной фрагментации ДНК в различных отделах мозга Документированные изменения не во всех случаях обнаруживают зависимость активности каспаз и фрагментации хроматина в соответствии с "классическим" сценарием апоптоза что указывает на неапоптотические функции этого фермента, в частности, его участие в долговременных пластических перестройках Работы, проведенные на клеточном уровне, свидетельствуют о связи каспазы-3 с нейропластическими процессами в синапсах (Гуляева 2003, Кудряшова и др 2005, Ьи е1 а1, 2006) Показано избирательное действие ингибиторов различных каспаз на ответы командного нейрона оборонительного поведения виноградной улитки, вызванные раздражением различных синаптических «входов» при выработке ноцицептивной сенситизации (Козырев, Никитин, Шерстнев, 2008)

Таким образом, полученные в нашем исследовании результаты и данные литературы позволяют считать, что каспазы мозга, в частности, каспаза-3, вовлекаются в обеспечение процессов памяти и обучения на основе специфичности и гетерохронии - системных принципов нейрохимической организации интегративной деятельности мозга (Анохин 1986,1978, Шерстнев 1999, Шерстнев и др, 2001) Участие каспазы-3, которая является ключевым ферментом семейства цистеиновых протеаз, в нейрохимических механизмах поведения, обучения и памяти у взрослых животных реализуется как посредством апоптоза, так и нейрональной пластичности

ВЫВОДЫ

1 Ингибитор каспаз широкого спектра действия г-УАВ-Апк, вводимый внутрь желудочков мозга, оказывает избирательное влияние на разные формы и стадии памяти облегчает формирование долговременной пространственной памяти, нарушает процессы консолидации/хранения долговременной пространственной памяти, не действуя на кратковременную пространственную память в модели водного лабиринта Морриса

2 Специфический ингибитор каспазы-3 г-БЕУО-Гтк при аппликации на червь мозжечка избирательно модулирует различные виды поведения -стимулирует формирование угашения АСР, не оказывает влияния на поведение замирания, снижает выраженность стереотипий и увеличивает время грумминга у крыс

3 Ингибитор активности каспаз гЛЛММтк и специфический ингибитор каспазы-3 г-БЕУО-йпк в условиях центрального введения вызывают избирательные, сходные по выраженности и направленности эффекты на процессы обучения и памяти в модели условно-рефлекторного замирания Это подтверждает представление о ведущей роли каспазы-3 в реализации действия цистеиновых протеаз в зрелом мозге

4 Ингибитор каспазы-3 при интрацеребровентрикулярном введении в дозе, оказывающей влияние на формирование долговременной памяти, инициирует гетерогенные и разновременные изменения биохимических маркеров апоптоза - активности каспазы-3 и межнуклеосомальной фрагментации ДНК в амигдале и гиппокампе крыс, что указывает на участие каспазозависимых и каспазонезависимых процессов апоптоза, протекающих в лимбических структурах мозга, в обеспечение механизмов памяти

5 Полученные экспериментальные результаты свидетельствуют, что каспазы мозга, в частности, каспаза-3, вовлекаются в обеспечение молекулярных механизмов обучения и памяти на основе принципов специфичности и гетерохронии, участвуя как в процессах программированной клеточной гибели, так и нейрональной пластичности

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Маркина Е В , Сторожева 3 И , Юрасов В В , Шерстнев В В Ингибиторы каспаз при центральном введении облегчают формирование поведения замирания у крыс Бюлл эксперим биол и мед 2007 143(5) с 497-501

2 Юрасов В В , Грудень М А , Яковлева Н Е , Сторожева 3 И , Маркина Е В , Шаров В И , Шерстнев В В Эффекты ингибитора каспазы-3 на биохимические показатели апоптоза в зрелом мозге при его центральном введении Нейрохимия 2007 24(4) с 304-311

3 Маркина Е В , Сторожева 3 И , Шерстнев В В Изучение процессов памяти и обучения у взрослых крыс в условиях внутримозгового введения ингибиторов каспаз Рос физиол журн им И М Сеченова 2008 94(4)

4 Маркина Е В , Сторожева 3 И , Шерстнев В В Влияние блокады активности каспазы в мозге на пространственное обучение и память у крыс Труды

Межведомственного Научного совета РАМН по экспериментальной и прикладной физиологии 2004 (12) с 408

5 Маркина Е В , Сторожева 3 И , Шерстнев В В Пространственное обучение у крыс в условиях блокады активности каспаз в мозге Тезисы XIX Съезда физиологического общества им И П Павлова 19-24 сентября 2004 90(8) с 263

6 Markina Е V , Storozheva Z I, Sherstnev V V Effects of brain caspase activity on elaboration and consolidation "hippocampus-dependant" and "hippocampus-independent" memory Тезисы международной конференции «Hippocampus and memoiy» 25-29 июня 2006 с 70

7 Маркина E В , Сторожева 3 И, Шерстнев В В Центральные эффекты ингибитора каспаз z-VAD-fmk на процессы обучения памяти у крыс Тезисы докладов и стендовых сообщений конференции «Нейрохимия фундаментальные и прикладные аспекты» 14-16 марта 2005 с 24

Заказ № 67/04/08 Подписано в печать 09 04 2008 Тираж 100 экз Уел m 175

О- ООО "Цнфровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www cfr ru , e-mail info@cfr ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маркина, Елена Вячеславовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Общая характеристика апоптоза.

1.1. Роль апоптоза в многоклеточном организме.

1.2. Морфологические процессы при апоптозе.

1.3. Молекулярные процессы при апоптозе.

1.3.1. Каспазы и их участие в апоптозе клеток.

1.3.2. Пути реализации программированной клеточной гибели.

2. Нейрогенез и апоптоз в зрелом мозге.

3. Неапоптотические функции каспаз в нервной ткани.

4. Участие каспаз в обеспечении механизмов памяти и обучения.

III. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Экспериментальные животные и условия их содержания.

2. Протокол использования веществ.

3. Экспериментальные модели оценки поведения животных.

3.1. Экспериментальные исследования на модели водного лабиринта Морриса.

3.2. Экспериментальные исследования с использованием метода условно-рефлекторного замирания.

3.3. Экспериментальные исследования с использованием методики угашения акустической стартл-реакции.

4. Методы количественного определения активности каспазы-3 и межнуклеосомальной фрагментации ДНК в образцах ткани зрелого мозга крыс.

5. Статистический анализ данных.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Влияние ингибитора активности каспаз z-VAD-fmk на формирование и консолидацию/хранение пространственного навыка в водном лабиринте Морриса.

2. Действие ингибиторов каспаз z-VAD-fmk и z-DEVD-fmk на формирование, консолидацию/хранение и воспроизведение поведения замирания у крыс.

3. Влияние специфического ингибитора каспазы-3 z-DEVD-fmk на формирование, хранение и воспроизведение долговременного угашения АСР и условного страха у крыс.

4. Эффекты интрацеребровентрикулярного введения ингибитора каспазы-3 на биохимические показатели апоптоза в различных структурах зрелого мозга крыс.

V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование участия каспаз зрелого мозга крыс в механизмах памяти и обучения"

Исследования апоптоза (программированной гибели клеток) в мозге относятся к числу наиболее приоритетных и актуальных в современной нейробиологии. Одним из центральных звеньев процесса апоптоза являются каспазы - семейство цистеинсодержащих протеолитических ферментов, расщепляющих пептидную связь у остатка аспартата (Chinnaiyan et al., 1996). Особое внимание уделяют каспазе-3, которую считают узловым фактором терминальной стадии апоптотической гибели нервных и глиальных клеток (Nunez, 1998, Robert et al., 2003, Yuan, Yankner, 2000, Timmer, Salvesen, 2007).

Получены убедительные свидетельства важной роли каспазозависимых процессов апоптоза в патогенезе многих распространенных заболеваний нервной системы (цереброваскулярные, нейродегенеративные заболевания и др.) (Гомазков 2006, Dlamini et al., 2004). Разрабатываются и применяются в клинике новые препараты, оказывающие специфическое воздействие на активность цистеиновых протеаз, в частности, созданные на основе ингибиторов каспаз (Barut et al., 2005; Liu et al., 2005; Narkilahti et al., 2003).

В настоящее время изучение роли каспаз в механизмах обучения и памяти находится на этапе все более активного экспериментального поиска (Гуляева 2003, Sherstnev et al., 2004, 2006; Gemma et al., 2005, Stepanichev et al., 2005; Huesmann, Clayton, 2006). Значительные сложности в разработке данной проблемы обусловлены тем, что факторы, вовлеченные в регуляцию апоптоза, могут принимать участие в других клеточно-молекулярных событиях, протекающих в нервной системе. Это в полной мере касается каспаз, которые непосредственно вовлечены в регуляцию клеточной гибели по типу апоптоза и, вместе с тем, регулируют клеточный цикл, пролиферацию, дифференцировку, а также пластические перестройки клеток мозга (Гуляева, 2003, Cohen, 1997, Concha and Abdel-Meguid, 2002). При экспериментальном изучении указанных вопросов широко используются ингибиторы активности каспаз (Fan et al., 2004). В ряде работ исследовано влияние ингибиторов каспаз на обучение, поведение и память. Так, ингибитор каспазы-1 нарушал выработку обстановочного условнорефлекторного страха у крыс (Gemma et al., 2005). Установлено, что у птиц привыкание к видоспецифической песне сопровождается быстрым (в течение нескольких минут) повышением уровня каспазы-3 в синаптических зонах дендритов нейронов тех отделов переднего мозга, активация которых связана с процессом привыкания (Huesmann, Clayton, 2006). Обнаружено, что ингибитор каспазы-3 блокирует длительную потенциацию в срезах гиппокампа и предотвращает развитие долговременного облегчения синаптической связи идентифицированных нейронов ЦНС виноградной улитки (Bravarenko et al., 2006). При введении в мозг зрелых крыс специфический ингибитор каспазы-3 подавляет консолидацию долговременной пространственной памяти в водном лабиринте Морриса, не оказывая действия на кратковременную память (Dash at al., 2000).

Несмотря на очевидную теоретическую и практическую значимость, работы посвященные изучению участия и роли каспаз мозга в механизмах обучения и памяти сравнительно немногочисленны, а результаты их противоречивы. До сих пор не изучен вопрос о закономерности участия каспаз в нейрохимических механизмах иптегративной деятельности мозга, а так же особенности вовлечения этих ферментов в обеспечение различных форм поведения и памяти. Практически отсутствуют данные о действии ингибиторов каспаз на показатели развития и гибели клеток в зрелом мозге. Остается неясным, связаны ли центральные эффекты ингибиторов с изменениями «неапоптозных» функций каспаз, в частности, свойств нейропластичности или влиянием на неонейрогенез и апоптоз.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы явилось исследование участия цистеиновых протеаз - каспаз мозга в механизмах обучения и памяти у взрослых животных.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить влияние ингибиторов активности каспаз при внутримозговых введениях на различные виды поведения и формы памяти у взрослых крыс.

2. Провести сравнительный анализ действия ингибитора активности каспаз широкого спектра действия z-VAD-fmk и специфического ингибитора каспазы-3 z-DEVD-fmk на обучение и память у половозрелых крыс.

3. Выявить эффекты интрацеребровентрикулярного введения специфического ингибитора каспазы-3 на биохимические маркеры апоптоза - межнуклеосомальную фрагментацию ДНК и активность каспазы-3 в различных структурах зрелого мозга крыс.

Научная новизна работы.

В работе впервые исследовано влияние ингибитора активности каспазы широкого спектра действия и специфического ингибитора каспазы-3 на различные виды поведения и формы памяти у взрослых животных. Впервые проведено одновременное количественное определение биохимических маркеров апоптоза - активности каспазы-3 и межнуклеосомальной фрагментации ДНК в различных отделах зрелого мозга при действии специфического блокатора каспазы-3. Установлено, что каспазы мозга избирательно вовлекаются в молекулярные механизмы, обеспечивающие формирование, хранение и воспроизведение различных поведенческих навыков у крыс. Выявлены избирательные и гетерохронные изменения биохимических маркеров апоптоза в релевантных структурах мозга при интрацеребровентрикулярном введении специфического ингибитора каспазы-3 в дозе, вызывающей облегчение формирования долговременной памяти. Получены новые экспериментальные свидетельства участия каспазы-3 как в процессах апоптоза, так и нейрональной пластичности в зрелом мозге.

Научно-практическое значение работы.

Результаты работы расширяют и уточняют современные представления о молекулярных основах обучения и памяти, а также роли процессов программированной клеточной гибели в обеспечении интегративной деятельности зрелого мозга. Полученные данные помогут в понимании роли каспаз в механизмах апоптоза и нейрональной пластичности в норме и при развитии заболеваний нервной системы. Результаты работы могут быть использованы при разработке новых фармакологических средств коррекции нарушений когнитивных функций на основе направленного воздействия на активность каспаз. Научно-теоретические положения работы могут быть привлечены в качестве дополнительного материала в учебно-педагогическом процессе в высших учебных заведениях медицинского и биологического профиля.

Основные положения, выносимые на защиту.

Каспазы мозга, в частности, каспаза-3, которая играет ключевую роль в центральных эффектах семейства цистеиновых протеаз, избирательно и гетерохронно вовлекаются в обеспечение нейрохимических механизмов обучения и памяти у взрослых животных, участвуя в процессах программированной клеточной гибели (апоптоза) и нейрональной пластичности.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Маркина, Елена Вячеславовна

ВЫВОДЫ

1. Ингибитор каспаз широкого спектра действия z-VAD-fmk, вводимый внутрь желудочков мозга, оказывает избирательное влияние на разные формы и стадии памяти: облегчает формирование долговременной пространственной памяти, нарушает процессы консолидации/хранения долговременной пространственной памяти, не действуя на кратковременную пространственную память в модели водного лабиринта Морриса.

2. Специфический ингибитор каспазы-3 z-DEVD-fmk при аппликации на червь мозжечка избирательно модулирует различные виды поведения — стимулирует формирование угашения АСР, не оказывает влияния на поведение замирания, снижает выраженность стереотипий и увеличивает время груминга у крыс.

3. Ингибитор активности каспаз z-VAD-fmk и специфический ингибитор каспазы-3 z-DEVD-fmk в условиях центрального введения вызывают избирательные, сходные по выраженности и направленности эффекты на процессы обучения и памяти в модели условно-рефлекторного замирания. Это подтверждает представление о ведущей роли каспазы-3 в реализации действия цистеиновых протеаз в зрелом мозге.

4. Ингибитор каспазы-3 при интрацеребровентрикулярном введении в дозе, оказывающей влияние на формирование долговременной памяти, инициирует гетерогенные и разновременные изменения биохимических маркеров апоптоза — активности каспазы-3 и межнуклеосомальной фрагментации ДНК в амигдале и гиппокампе крыс, что указывает на участие каспазозависимых и каспазонезависимых процессов апоптоза, протекающих в лимбических структурах мозга, в обеспечение механизмов памяти.

5. Полученные экспериментальные результаты свидетельствуют, что каспазы мозга, в частности, каспаза-3, вовлекаются в обеспечение молекулярных механизмов обучения и памяти на основе принципов специфичности и гетерохронии, участвуя как в процессах программированной клеточной гибели, так и нейрональной пластичности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маркина, Елена Вячеславовна, Москва

1. Анохин П.К. (1968) Биология и физиология условного рефлекса. М.: «Медицина», 548с.

2. Анохин П.К. (1974) Системный анализ интегративной деятельности нейрона. Успехи физиол. наук 5(2): 5-92

3. Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.В. (2006) Электронномикроскопическая характеристика нейроэндокринных нейронов миндалевидного тела мозга у самцов и самок на разных стадиях астрального цикла. Морфология, 130(6):25-9.

4. Балабан П.М., Гуляева Н.В. (2006) Общность молекулярных механизмов нейропластичности и нейропатологии: интегративный подход. Рос. физиол. журн.им. И.М. Сеченова, 92(2): 145-151.

5. Белоусов Ю.Б. (2005) Этическая экспертиза биомедицинских исследований. Практические рекомендации. «Российское общество клинических исследователей» М. 157с.

6. Бойко А.Г. (2007) Дифференцировка клеток радиальной глии в астроциты вероятный механизм старения млекопитающих. Журнал общей биологии, 68(1):35-51.

7. Виноградова О.С. (1975) Гиппокамп и память. М.: «Наука» 322с.

8. Гомазков О.А. (2006) Нейротрофическая регуляция и стволовые клетки мозги мозга. М.: «Икар», 332с.

9. Гуляева Н.В. (2003) Неапоптотические функции каспазы-3 в нервной ткани. Биохимия, 68(11): 1459-1470.

10. Залесский В.Н., Гавриленко Т.И., Фильченков А.А. (2002) Апоптоз при ишемии и реперфузии миокарда. Врачебное дело, 1:8-15.

11. Козырев С.А., Никитин В.П., Шеретнев В.В. (2008) Синапс-специфическая пластичность в командных нейронах при обучении виноградных улиток в условиях действия ингибиторов каспаз. Бюлл. эксперим. биол. и мед. 144(12):604.

12. Кудряшов И.Е., Яковлев А.А., Кудряшова И.В., Гуляева Н.В. (2003) Ингибировапие каспазы-3 блокирует длительную потенциацию в срезах гиппокампа. Журнал высшей нервной деятельности, 53(5):537-540.

13. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. (2001) Гибель клетки (апоптоз). М.: «Медицина», 192с.

14. Пальцев М.А. (2002) Молекулярная медицина и прогресс фундаментальных наук. Вестник российской академии, 72(1): 13-21.

15. Робинсон М.В., Труфакин В.А. (1999) Апоптоз и цитокииы. Успехи совр. Биол., 119(4):359-367.

16. Самуилов В.Д. (2001) Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных. СОЖ, 10:18-25.

17. Скворцов И.А., Ермоленко Н.А. (2003) Развитие нервной системы у детей в норме и патологии. М.: «МЕДпресс-информ», 368с.

18. Степаничев М.Ю., Кудряшова И.В., Яковлев А.А., Воронцова О.Н., Лазарева Н.А., Гуляева Н.В. (2006) Влияние ингибитора активности каспазы-3-Z-DEVD-FMK на поведение крыс при введении в желудочки мозга. Журн. Высш. Нервн. Деят., 56(2):247-56.

19. Уманский С.Р. (1996) Апоптоз: молекулярный клеточный механизм. Журнал молекулярной биологии, 30(3):487-502.

20. Шерстнев В. В. (1998) Гетерохрония нейрохимической организации процессов обучения и памяти. Труды научного совета РАМН по экспериментальной и прикладной физиологии, 7:194-204.

21. Шерстнев В.В., Грудень М.А., Сторожева З.И., Прошин А.Т. (2001) Гетерохрония участия нейротрофических факторов в нейрохимической организации процессов обучения и памяти в зрелом организме. Рос. физиол. журн. Им. И.М. Сеченова, 87(6):752-761.

22. Шерстнев В.В., Юрасов В.В., Сторожева З.И., Грудень М.А., Яковлева Н.Е. (2005) Биохимические маркеры апоптоза в различных отделах мозга при обучении. Журн. Высш. Нерв. Деят., 55(6):729-33.

23. Яковлев А.А., Онуфриев М.В., Степаничев М.Ю., Браун К., Гуляева Н.В. (2001) Активность каспазы-3 в отделах мозга грызунов разных видов. Нейрохимия, 18(1):41-43.

24. Яковлев А.А., Семенова Т.П., Онуфриев М.В., Михалев C.JL, Гуляева Н.В. (2002) Изменение активности каспазы-3 в отделах мозга сусликов citellus undulatus в течение гибернационного цикла. Нейрохимия, 19(1):33-36.

25. Ярилин А.А. (1998) Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме. Пат. физиол., 2:38-48.

26. Abrous D.N., Koehl М., Le Moal М. (2005) Adult neurogenesis: from precursors to network and physiology. Physiol Rev. 85(2):523-69.

27. Agasse F., Roger M., Coronas V. (2004) Neurogenic and intact or apoptotic non-neurogenic areas of adult brain release diffusible molecules that differentially modulate the development of subventricular zone cell culture. Eur J Neurosci, 19(6): 1459-68.

28. Aleksandrov Y.I. (2006) Learning and memory: traditional and systems approaches. Neurosci Behav Physiol., 36(9):969-85.

29. Ambrogini P., Orsini L., Mancini C., Ferri P., Ciaroni S., Cuppini R. (2004) Learning may reduce neurogenesis in adult rat dentate gyrus. Neurosci Lett., 359(l-2):13-6.

30. Barinaga M. (2003) Newborn Neurons Search for Meaning. Science, 299(5603):32-4.

31. Barut S., Unlu Y.A., Karaoglan A., Tuncdemir M., Dagistanli F.K., Ozturk M., Colak A. (2005) The neuroprotective effects of z-DEVD-fmk, a caspase-3 inhibitor, on traumatic spinal cord injury in rats. Surg Neurol., 64(3):213-20.

32. Bernier P.J., Bedard A., Vinet J., Levesque M., Parent A. (2002) Newly generated neurons in the amygdala and adjoining cortex of adult primates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(17): 11464-11469.

33. Bissada N., Cheng K., Roder J.C., Wang Y.T., Hayden M.R. (2007) NMDA receptor function and NMDA receptor-dependent phosphorylation of huntingtin is altered by the endocytic protein HIP1. J. Neurosci., 27(9):2298-308.

34. Bravarenko N.I., Onufriev M.V., Stepanichev M.Y., Ierusalimsky V.N., Balaban P.M., Gulyaeva N.V. (2006) Caspase-like activity is essential for long-term synaptic plasticity in the terrestrial snail Helix. Eur. J. Neurosci. 23(l):129-40.

35. Brojatsch J., Naughton J., Rolls M.M., Zingler K., Young J.A. (1996) CAR1, a TNFR-related protein, is a cellular receptor for cytopathic avian leukosis-sarcoma viruses and mediates apoptosis. Cell., 87(5):845-55.

36. Bruel-Jungerman E., Laroche S., Rampon C. (2005) New neurons in the dentate gyrus are involved in the expression of enhanced long-term memory following environmental enrichment. Eur. J. Neurosci., 21(2):513-21.

37. Cande C., Cecconi F., Dessen P., Kroemer G. (2002) Apoptosis-inducing factor (AIF): key to the conserved caspase-independent pathways of cell death? J. Cell. Sci., 115(24):4727-34.

38. Chadashvili Т., Peterson D.A. (2005) Cytoarchitecture of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR-2) immunoreactivity in astrocytes of neurogenic and non-neurogemic regions of young adult and aged rat brain. Neuroscience, 136(2):579-91.

39. Chambers R.A., Potenza M.N., Hoffman R.E., Miranker W. (2004) Simulated apoptosis/neurogenesis regulates learning and memory capabilities of adaptive neural networks. Neuropsychopharmacology, 29(4):747-58.

40. Chan S.L., Mattson M.P. (1999) Caspase and calpain substrates: roles in synaptic plasticity and cell death. J. Neurosci. Res. 58(1): 167-90.

41. Cheng H.-Y., Clayton D.F. (2004) Activation and Habituation of Extracellular Signal-Regulated Kinase Phosphorylation in Zebra Finch Auditory Forebrain during Song Presentation. The Journal of Neuroscience, 24(34):7503-7513.

42. Chinnaiyan A.M., Dixit V.M. (1996) The cell-death machine. Curr Biol., 6:555-562.

43. Clements K.M., Burton-Wurster N., Nuttall M.E., Lust G. (2005) Caspase-3/7 inhibition alters cell morphology in mitomycin-C treated chondrocytes. J. Cell Physiol., 205(1): 133-40.

44. Cohen G.M. (1997) Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J., 326(1): 1-16.

45. Concha N.O., Abdel-Meguid S.S. (2002) Controlling apoptosis by inhibition of caspases. Curr. Med. Chem., 9(6):713-26.

46. Dash K., Blum S., Moore A.N. (2000) Caspase activity plays an essential role in long-term memory. NeuroReport, 11:2811-2816.

47. Del Rio L.A., Pastori G.M., Palma J.M., Sandalio L.M., Sevilla F., Corpas F.J., Jimenez A., Lopez-Huertas E., Hernandez J.A. (1998) The activated oxygen role of peroxisomes in senescence. Plant Physiol., 116:1195-1200.

48. Dlamini Z., Mbita Z., Zungu M. (2004) Genealogy, expression, and molecular mechanisms in apoptosis. Pharmacol. Ther. 101(1):1-15.

49. Enari M., Sakahira H., Yokoyama H., Okawa K., Iwamatsu A., Nagata S. (1998) A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis and its inhibitor ICAD. Nature, 391:43-50.

50. Fan T.J., Han L.H., Cong R.S., Liang J. (2004) Caspase family proteases and apoptosis. Acta. Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai), 37(ll):719-27.

51. Fanselow M.S., DeCola J.P., Young S.L. (1993) Mechanisms responsible for reduced contextual conditioning with massed unsignaled unconditional stimuli. J. Exp. Psychol. Anim. Behav. Process, 19(2): 121-37.

52. Fath A., Bethke P.C., Jones R.L. (1999) Barley aleurone cell death is not ap opto tic: characterization of nuclease activities and DNA degradation. Plant J., 20:305-315.

53. Font E., Desfilis E., P6rez-Canellas M.M., Garcfa-Verdugo J.M. (2001) Neurogenesis and neuronal regeneration in the adult reptilian brain. Brain Behav. Evol., 58(5):276-95.

54. Fukuda H. (1997) Tracheary Element Differentiation. Plant Cell., 9:11471156.

55. Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A. (1992) Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol., 119(3):493-501.

56. Gemma C., Fister M., Hudson C., Bickford P.C. (2005) Improvement of memory for context by inhibition of caspase-1 in aged rats. Eur. J. Neurosci. 22(7): 1751-6.

57. Goldman S.A., (1998) Adult neurogenesis: from canaries to the clinic. J. Neurobiol., 36(2):267-86.

58. Goldman S.A., Nottebohm F. (1983) Neuronal production. Migration and differentiation in a vocal control nucleus of the adult famale canary brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80(8):2390-2394.

59. Gould E., Beylin A., Tanapat P., Reeves A., Shors T.J. (1999) Learning enhances adult neurogenesis in the hippocampal formation. Nat. Neurosci., 2(3):260-5.

60. Gould E., Reeves A.J., Graziano M.S., Gross C.G. (1999) Neurogenesis in the neocortex of adult primates. Science, 286(5439):548-52.

61. Gould E. (1999) Serotonin and hippocampal neurogenesis. Neuropsychopharmacology, 21 (2):46S-51S.

62. Gould E., Gross C.G. (2002) Neurogenesis in adult mammals: some progress and problems. J. Neurosci., 22(3):619-623.

63. Grahame J., Coleman C.C.A., Bernard Ora Bernard. (1999) Bcl-2 transgenic mice with increased number of neurons have a greater learning capacity. Brain Research, 832:188-194.

64. Green D.R., Beere H.M. (2001) Apoptosis. Mostly dead. Nature, 412:133135.

65. Green D.R., Reed J.C. (1998) Mitochondria and Apoptosis. Science, 281:1309-1312.

66. Greenberg J.T. (1997) Programmed cell death in plant-pathogen interactions. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:525-545.

67. Grimaldi P., Rossi F. (2006) Lack of neurogenesis in the adult rat cerebellum after Purkinje cell degeneration and growth factor infusion. Eur. J. Neurosci., 23(10):2657-68.

68. Groover A., DeWitt H., Jones A. (1997) Programmed cell death of plant tracheary elements differentiating in vitro. Protoplasma, 196:197-211.

69. Gross A., McDonnell J.M., Korsmeyer S.J. (1999) BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Genes Dev., 13(15): 1899-911.

70. He C.-J., Morgan P.W., Drew M.C. (1996) Transduction of an Ethylene Signal Is Required for Cell Death and Lysis in the Root Cortex of Maize during Aerenchyma Formation Induced by Hypoxia. Plant Physiol., 112:463472.

71. Heath M.C. (1998) Apoptosis, programmed cell death and the hypersensitive response. Eur. J. Plant Physiol., 104:117-124.

72. Hengartner M.O. (2000) The biochemistry of apoptosis. Nature, 407:770-776.

73. Hengartner M.O., Horvitz H.R. (1994) C. elegans cell survival gene ced-9 encodes a functional homolog of the mammalian proto-oncogene bcl-2. Cell, 76(4):665-76.

74. Hockenbery D.M. (1995) bcl-2, a novel regulator of cell death. Bioessays., 17(7):631-8.

75. Huesmann G.R., Clayton D.F. (2006) Dynamic role of postsynaptic caspase-3 and BIRC4 in zebra finch song-response habituation. Neuron., 52(6): 1061-72.

76. Ito. M. (2001) Cerebellar Long-Term Depression: Characterization, Signal Transduction, and Functional Roles. Physiologycal. reveiws., 81(3): 11431195.

77. Jacobson M.D., Weil M., Raff M.C., (1997) Programmed cell death in animal development. Cell. 88(3):347-54.

78. Kariagina A., Romanenko D., Ren S.G., Chesnokova V., (2004) Hypothalamic-pituitary cytokine network. Endocrinology, 145(1): 104-112.

79. Keilhoff G., Becker A., Grecksch G., Bernstein H.G., Wolf G. (2006) Cell proliferation is influenced by bulbectomy and normalized by imipramine treatment in a region-specific manner. Neuropsychopharmacology, 31(6): 1165-76.

80. Kempermann G., van Praag H., Gage F.H. (2000) Activity-dependent regulation of neuronal plasticity and self repair. Prog. Brain Res., 127:35-48.

81. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. (1972) Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Brit. J. Cancer, 26:239-257.

82. Kihara S., Shiraishi Т., Nakagawa S., Toda K., Tabuchi K. (1994) Visualization of DNA double strand breaks in the gerbil hippocampal CA1 following transient ischemia. Neurosci. Lett., 175(1-2): 133-6.

83. Koketsu D., Mikami A., Miyamoto Y., Hisatsune T. (2003) Nonrenewal of neurons in the cerebral neocortex of adult macaque monkeys. J. Neurosci., 23(3):937-42.

84. Kudryashov I.E., Onufriev M.V., Kudryashova I.V., Gulyaeva N.V. (2001) Periods of postnatal maturation of hippocampus: synaptic modifications and neuronal disconnection. Dev. Brain. Res., 132:113-120.

85. Kudryashova I.V., Kudryashov I.E., Gulyaeva N.V. (2006) Long-term potentiation in the hippocampus in conditions of inhibition of caspase-3: analysis of facilitation in paired-pulse stimulation. Neurosci. Behav. Physiol., 36(8):817-24.

86. Lavezzi A.M., Ottaviani G., Terni L., Matturri L. (2006) Histological and biological developmental characterization of the human cerebellar cortex. Int. J. Dev. Neurosci., 24(6):365-71.

87. LeBlanc A.C. (2003) Natural cellular inhibitors of caspases. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry., 27(2):215-29.

88. LeDoux J.E., Iwata J., Cicchetti P., Reis D.J.J (1998) Different projections of the central amygdaloid nucleus mediate autonomic and behavioral correlates of conditioned fear. Neurosci., 8(7):2517-29.

89. Leist M., Single В., Castoldi A.F., Kuhnle S., Nicotera P. (1997) Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J. Exp. Med., 185:1481-1486.

90. Leuner В., Gould E., Shors TJ. (2006) Is there a link between adult neurogenesis and learning? Hippocampus. 16(3):216-24.

91. Levine A., Pennell I., Alvarez M.E., Palmer R., Lamb C. (1996) Calcium-mediated apoptosis in a plant hypersensitive disease resistance response. Curr. Biol., 6:427-437.

92. Liu S.Z., Mao J.F., Wen D., Tan X.P., Fu C.Y. (2005) The treatment of retinal apoptosis by Caspase-3 inhibitor Ac-DEVD-CHO in experimental myopia. Zhonghua. Yan. Ke. Za. Zhi., 41(5):428-33.

93. Lowenstein D.H., Parent J.M. (1999) Brain, heal thyself. Science, 283:11261127.

94. Luzzati F., De Marchis S., Fasolo A., Paretto P. (2006) Neurogenesis in the caudate nucleus of the adult rabbit. J. Neurosci., 26(2):609-621.

95. MacManus J.P., Linnik M.D. (1997) Gene expression induced by cerebral ischemia: an apoptotic perspective. J. Cereb. Blood Flow. Metab., 17(8):815-32.

96. Male D., Cooke A., Owen M., Trowsdale J., Champion B. (1996) Antigen receptor molecules. Advanced Immunology, 2.1-2.2.

97. Matalova E., Tucker A.S., Sharpe P.T. (2004) Death in the life of a tooth. J. Dent Res., 83(1): 11-6.

98. Mattson M.P., Keller J.N., Begley J.G. (1998) Evidence for synaptic apoptosis. Exp. Neurol., 153:35-48.

99. Mattson M.P., Duan W. (1999) Apoptotic" biochemical cascades in synaptic compartments: roles in adaptive plasticity and neurodegenerative disorders. J. Neurosci. Res., 58(1): 152-66.

100. Metzler M., Gan L., Wong T.P., Liu L., Helm J., Georgiou J., Wang Y. (2007) NMDA receptor function and NMDA receptor-dependent phosphorylation of huntingtin is altered by the endocytic protein HIP1. J. Neurosci., 27(9):2298-308.

101. Mohapel P., Mundt-Petersen K., Brundin P., Frielingsdorf H. (2006) Working memory training decreases hippocampal neurogenesis. Neuroscience, 142(3): 609-613.

102. Moriya R., Uehara Т., Nomura Y. (2000) Mechanism of nitric oxide-induced apoptosis in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. FEBS Lett., 484(3):253-60.

103. Nagata S. (1997) Apoptosis mediated by Fas and its related diseases. Nippon Ika Daigaku Zasshi, 64(5):459-62.

104. Nagata S. (2000) Apoptotic DNA fragmentation. Exp. Cell Res., 256(1): 12-8.

105. Nakagawa Т., Zhu H., Morishima N., Li E., Xu J., Yankner B.A., Yuan J. (2000) Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta. Nature, 403:98-103.

106. Narkilahti S., Nissinen J., Pitkanen A. (2003) Administration of caspase 3 inhibitor during and after status epilepticus in rat: effect on neuronal damage and epileptogenesis. Neuropharmacology, 44(8): 1068-88.

107. Ng P.C., Lam C.W., Li A.M., Wong C.K., Cheng F.W., Leung T.F. (2004) Inflammatory cytokine profile in children witch severe acute respiratory syndrome. Pediatrics, 113(1-1):7-14.

108. Nicholson D.W. (1999) Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death. Cell Death Differ., 6:1028-1042.

109. Nicotera P., Leist M. (1997) Energy supply and the shape of death in neurons and lymphoid cells. Cell Death Differ., 4:435-442.

110. Nottabohm F. (2002) Why are some neurons replaced in adult brain? J. Neurosci., 22(3):624-628.

111. Nunez G., Benedict M.A., Hu Y., Inohara N. (1998) Caspases: the proteases of the apoptotic pathway. Oncogene, 17:3237-3245.

112. Oliver F.J., Menissier-de Murcia J., de Murcia G. (1999) Poly(ADP-ribose) polymerase in the cellular response to DNA damage, apoptosis, and disease. Am. J. Hum. Genet., 64:1282-1288.

113. Onteniente B. (2004) Natural and synthetic inhibitors of caspases: targets for novel drugs. Curr. Drug. Targets CNS Neurol. Disord., 3(4):333-40.

114. Pan G., O'Rourke K., Chinnaiyan A.M., Gentz R., Ebner R., Ni J., Dixit V.M. (1997) The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL. Science, 276(5309): 1113.

115. Paxinos Watson. (1984) Rat brain in stereotaxic coordinates. Academic Press, 438.

116. Pennell R.I., Lamb C. (1997) Programmed Cell Death in Plants. Plant Cell, 9:1157-1168.

117. Pletnicov M.V., Storozheva Z.I., Sherstnev V.V. (1996) Relationship between memory and fear: Developmental and pharmacological studies. Pharmac. Biochem. and Behavior, 54(l):93-8.

118. Ponti G., Peretto P., Bonfanti L. (2006) A subpial, transitory germinal zone forms chains of neuronal precursors in the rabbit cerebellum. Dev. Biol., 294(l):168-80.

119. Pop C., Timmer J., Sperandio S., Salvesen G.S. (2006) The apoptosome activates caspase-9 by dimerization. Mol. Cell, 22(2):269-75.

120. Poulsen F.R., Meyer M., Rasmussen J.Z. (2003) Generation of new nerve cells in the adult human brain. Ugeskr. Laeger., 165(14): 1443-7.

121. Prickaerts J., Koopmans G., Blokland A., Scheepens A. (2004) Neurobiol. Learn. Mem. 81(1): 1-11.

122. Renatus M., Stennicke H.R., Scott F.L., Liddington R.C., Salvesen G.S. (2001) Dimer formation drives the activation of the cell death protease caspase-9. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(25): 14250-5.

123. Riedl S.J., FuentesPrior P., Renatus M., Kairies N., Krapp S., Huber R., Salvesen G.S., Bode W. (2001) Structural basis for the activation of human procaspase-7. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:14790-14795.

124. Robert M., Friedlander M.D. (2003) Apoptosis and Caspases in Neurodegenerative Diseases. N. Engl. J. Med., 348:1365-1375.

125. Ruoslahti E., Reed J. (1999) New way to activate caspases. Nature, 397:479480.

126. Sacchetti В., Scelfo В., Strata P. (2005) The cerebellum: synaptic changes and fear conditioning. Neuroscientist., 11(3):217-27.

127. Salvesen G.S., (2002) Caspases: opening the boxes and interpreting the arrows. Cell Death Differ., 9:3-5.

128. Sanders M.J., Wiltgen B.J., Fanselow M.S. (2003) The place of the hippocampus in fear conditioning. Eur. J. Pharmacol., 463(1-3):217-23.

129. Saxe M.D., Malleret G., Vronskaya S., Mendez I., Garcia A.D., Sofroniew M.V., Kandel E.R., Hen R. (2007) Paradoxical influence of hippocampal neurogenesis on working memory. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(11): 4642-2626.

130. Sherstnev V.V. (2004) The role of cellular development and cell death in neurochemical organization and integrative brain functions—normal and pathological. Med. Pregl., 57(3-4): 120-4.

131. Sherstnev V.V., Yurasov V.V., Storozheva Z.I., Gruden' M.A., Yakovleva N.E. (2006) Biochemical markers of apoptosis in different parts of the brain during learning. Neurosci. Behav. Physiol., 36(9):915-9.

132. Shi Y. (2002) Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. Mol. Cell, 9:459^70.

133. Shimohama S., Tanino H., Fujimoto S. (2001) Differential expression of rat brain caspase family proteins during development and aging. Biochem. Biophys. Res. Commun., 289:1063-1066.

134. Shimohama S., Tanino H., Fujimoto S. (2001) Differential subcellular localization of caspase family proteins in the adult rat brain. Neurosci. Lett., 315:125-128.

135. Shors T.J., Miesegaes G., Beylin A., Zhao M., Rydel Т., Gould E. (2001) Neurogenesis in the adult is involved in the formation of trace memories. Nature, 410(6826):314-5.

136. Simon W., Day C.L., Hinds M.G., Huang D.C.S., (2003) The Bcl-2-regulated apoptotic pathway. J. of Cell Science, 16:4053-4056.

137. Soutschek J., Zupanc G.K, (1996) Apoptosis in the cerebellum of adult teleost fish, Apteronotus leptorhynchus. Brain Res. Dev. Brain Res. 23;97(2):279-86.

138. Squier M.K.T., Miller A.C.K., Malkinson A.M., Cohen J.J. (1994) Calpain activation in apoptosis. J. Cell. Physiol., 159:229-237.

139. Steller H. (1995) Mechanisms and genes of cellular suicide. Science, 267(5203): 1445-9.

140. Stepanichev M.YU., Kudryashova I.V., Yakovlev A.A. (2005) Central administration of a caspase inhibitor impairs shuttle-box performance in rats. Neuroscience, 136:579-591.

141. Storozheva Z.I., Pletnicov M.V. (1994) Habituation of acoustic startle in rats -a functional ablation study. NeuroReport, 5:2065-9.

142. Supple W.F.J, Cranney J., Leaton R. (1988) Effects of lesions of cere-bellar vermis on VMH lesion-induced hyperdefensiveness, spontaneous mouse killing and fgeezing in rats. Physiol. Behavior, 42(2): 145-153.

143. Takahashi A., Musy P.Y., Martins L.M., Poirier G.G., Moyer R.W., Earnshaw W.C., (1996) CrmA/SPI-2 inhibition of an endogenous ICE-related protease responsible for lamin A cleavage and apoptotic nuclear fragmentation. J. Biol. Chem. 271(51):32487-90.

144. Tartaglia L.A., Ayres T.M., Wong G.H., Goeddel D.V. (1993) A novel domain within the 55 kd TNF receptor signals cell death. Cell, 74(5):845-53.

145. Timmer J.C., Salvesen G.S. (2007) Caspase substrates. Cell Death and differ., 14:66-72.

146. Tobita M., Nagano I., Nakamura S., Itoyama Y., Kogure K. (1995) DNA single-stxand breaks in postischemic gerbil brain detected by in situ nick translation procedure. Neurosci. Lett., 200(2):129-32.

147. Tomei L.D., Shapiro J.P., Cope F.O. (1993) Apoptosis in C3H/10T1/2 mouse embryonic cells: evidence for internucleosomal DNA modification in the absence of double-strand cleavage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(3):853-7.

148. Troy C.M., Salvesen G.S. (2002) Caspases on the brain. J. Neurosci. Res., 69:145-150.

149. Tsujimoto Y. (1997) Apoptosis and necrosis: intracellular ATP level as a determinant for cell death modes. Cell Death Differ., 4:429-434.

150. Van Praag H., Kempermann G., Gage F.H. (1999) Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus. Nat. Neurosci. 2(3):266-270.

151. Walczak H., Degli-Esposti M.A., Johnson R.S., Smolak P.J., Waugh J.Y., Boiani N., Timour M.S., Gerhart M.J., Schooley K.A., Smith C.A., Goodwin R.G., Rauch C.T. (1997) TRAIL-R2: a novel apoptosis-mediating receptor for TRAIL. EMBO J. 16(17):5386-97.

152. Wang E.C., Kitson J., Thern A., Williamson J., Farrow S.N., Owen M.J. (2001) Genomic structure, expression, and chromosome mapping of the mouse homologue for the WSL-1 (DR3, АроЗ, TRAMP, LARD, TR3, TNFRSF12) gene. Immunogenetics, 53(l):59-63.

153. Weil M., Jacobson M.D., Raff M.C., (1997) Is programmed cell death required for neural tube closure? Curr. Biol., 7(4):281-4.

154. Winner В., Cooper-Kuhn C.M., Aigner R., Winkler J., Kuhn H.G. (2002) Long-term survival and cell death of newly generated neurons in the adult rat. Eur. J. Neurosci., 16(9): 1681-9.

155. Wojtaszek P. (1997) Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection. Biochem. J., 322:681-692.

156. Wolf B.B., Schuler M., Echeverri F., Green D.R. (1999) Caspase-3 is the primary activator of apoptotic DNA fragmentation via DNA fragmentation factor-45/inhibitor of caspase-activated DNase inactivation. J. Biol. Chem., 274(43):30651-6.

157. Wolf B.B., Green D.R. (1999) Suicidal tendencies: apoptotic cell death by caspase family proteinases. J. Biol. Chem., 274(29):20049-52.

158. Wu D., Chen P.J., Chen S., Hu Y., Nunez G., Ellis R.E. (1999) C. elegans MAC-1, an essential member of the AAA family of ATPases, can bind CED-4 and prevent cell death. Development, 126:2021-2031.

159. Wyllie A.H. (1980) Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature, 284(5756):555-6.

160. Yamashima Т., Tonchev A.B., Yukie M. (2007) Adult hippocampal neurogenesis in rodents and primates: endogenous, enhanced, and engrafted. Rev Neurosci., 18(l):67-82.

161. Yan X.X., Najbauer J., Woo C.C., Dashtipour K., Ribak C.E., Leon M. (2001) Expression of active caspase-3 in mitotic and postmitotic cells of the rat forebrain. J. Сотр. Neurol., 433(l):4-22.

162. Yuan J., Yankner B.A. (2000) Apoptosis in the nervous system. Nature, 407(6805):802-9.

163. Zhang Y., Center D.M., Wu D.M., Cruikshank W.W., Yuan J., Andrews D.W., Kornfeld H. (1998) Processing and activation of pro-interleukin-16 by caspase-3. Processing and activation of pro-interleukin-16 by caspase-3. J. Biol. Chem., 273(2): 1144-9.

164. Zhou Q., Salvesen G.S. (1997) Activation of pro-caspase-7 by serine proteases includes a non-canonical specificity. Biochem. J., 324:361-364.

165. Zupanc G.K. (1999) Neurogenesis, cell death and regeneration in the adult gymnotiform brain. J. Exp. Biol., 202(10): 1435-46.

166. Zupanc G.K. (2006) Neurogenesis and neuronal regeneration in the adult fish brain. J. Сотр. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol., 192(6):649-70.