Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование связи между замедленной флуоресценцией и продукционными характеристиками морских микроводорослей

ВАК РФ 03.00.18, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование связи между замедленной флуоресценцией и продукционными характеристиками морских микроводорослей"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

\!\ 8 ОД

' . ; биологический факультет

На правах рукописи захарков сергей петрович

удк:574.55:543.426 ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗИ МЕЖДУ ЗАМЕДЛЕННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИЕЙ И ПРОДУКЦИОННЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМ! МОРСКИХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

Специальность 03.00.18 - гидробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Тихоокеанском океанологическом институте ДВО РАН, Кафедре биофизики Биологического факультета МГУ.

Научный руководитель: доктор биологических наук , в.н. сотр. Маторин Д.Н.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Абакумов A.B. кандидат биологических наук. ст.н.сотр. Ведерников В.И.

заседании диссертационного совета Д.053.05.71 в Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Воробьевы горы. Биологический факультет, С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Ведущая организация: ВНИРО

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

А.Г.Дмитриевг

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Превращение энергии и круговорот веществ в экосистемах определяется первичной продукцией и ее потреблением на разных уровнях трофической цепи. Поэтому в экологических исследованиях количественная оценка фотосинтеза имеет большое значение.

В океане подавляющая часть первичной продукции (ПП) синтезируется микроводоросляш - фитопланктоном (Кобленц-Мишке, Ведерников. 1977). Известно, что фитопланктон является первичным накопителем и одним из важнейших переносчиков загрязнений таких, например, как тяжелые металлы.

Однако используемые на практике методические приемы получения количественных оценок продукционных характеристик фитопланктона весьма трудоемки и отличаются рядом ограничений. Поэтому в последнее время все большее распространение получают методы, основанные на измерении флуоресценции хлорофилла (раТкоивкп ,ко!Ьег. 1 995', Карабашев.1996), Флуоресцентные методы, благодаря высокой чувствительности, позволяют быстро получать информацию о фотосинтезе без предварительной концентрации проб воды.

Большой интерес представляет метод регистрации замедленной флуоресценции (ЗФ) водорослей, возникающей в ходе обратных реакций рекомбинации первично разделенных зарядов в фотосинтетических реакционных центрах (маноп. 1977.Веселовский .Веселова. 1990, Маторин. 199?.). Интенсивность ЗФ клеток пропорциональна концентрации реакционных центров фотосистемы 11 с разделенными зарядами (Атевг,Уап йогкот. 1978). Последняя в свою очередь определяется скоростью переноса электронов в электронно-транспортной цепи. Поэтому разработка методических подходов и аппаратуры на базе ЗФ представляется весьма важной для изучения фотосинтетической продуктивности водных экосистем,

Цепь и задачи исследования. Целью данной работы являлось выявление закономерностей, связывающих параметры ЗФ и продукционные характеристики морских микроводорослей; и на этой основе разработка практических рекомендаций по использованию ЗФ в гидробиологических и токсикологических работах. Для достижения

поставленной цели решались следующие задачи:

1. Разработать аппаратуру и методы определения продукционных характеристик фитопланктона с использованием ЗФ хлорофилла.

2. Исследовать связь параметров ЗФ и продукционных характеристик морских микроводорослей в культуре и природных популяциях фитопланктона и перифитона при антропогенных воздействиях.

3. Исследовать возможность использования ЗФ для изучения распределения фитопланктона и его ПП в различных гидрологических условиях.

Научная новизна. Впервые проведены комплексные исследования по изучению связи между ЗФ, концентрацией пигментов и ПП сообществ фитопланктона в различных районах Мирового Океана, в том числе олиготрофных. Определялся суточный ход ЗФ, отношений ЗФ к концентрации пигментов и ПП фитопланктона. На основе полученных результатов разработаны метод для определения ПП в столбе воды с помощью регистрации ЗФ и устройство для его осуществления (а.с.й 1235008 от 1986г). Предложено использовать декамиллисекундную компоненту ЗФ для выявления тяжелых металлов и других загрязнений в природных и сточных водах. Разработан экспресс-метод определения эффективности защиты поверхностей от обрастания, основанный на регистрации ЗФ перифитона (а.с.№ 1382851 от 1987г).

Практическая ценность. Результаты экспериментальных работ по определению ПП и распределению фитопланктона методом ЗФ использовались в биогеохимических исследованиях эстуарных зон и открытых районов Мирового Океана,' проводимых в Тихоокеанском океанологическом институте. Этот метод применен в отделе геохимии океана ТОЙ ДВО РАН, а также внедрен в Тихоокеанском институте рыбного хозяйства и океанографии. Экспресс-метод оценки эффективности защиты поверхностей от обрастания, основанный на измерении ЗФ перифитона, внедрен на Станции коррозии Института Химической Физики АН РАН. Метод биотестирования с использованием различных компонент ЗФ микроводорослей может быть использован для оценки влияния загрязнения на ПП и прогнозирования отдаленных последствий загрязнения морских экосистем, а также для контроля степени очистки сточных вод промышленных предприятий.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были были представлены на 4 Всесоюзной конференции "Мировой океан", г.Владивосток, 1983 г, 5 съезде Всесоюзного гидробиологического общества, г.Тольяти, 1986 г,; Симпозиуме специалистов стран-членов СЭВ "Комплексные методы контроля качества природной среда",г.Москва, 1986 г,; 3 съезде советских океанологов, г. Ленинград, 1987 г.; 3 Всесоюзн. конференции по морской биологии, г.Севастополь, 1988 г.; Расширенном семинаре отделения физики океана ТОЙ ДВО РАН, г.Владивосток, 1993 г.; Семинаре кафедры гидробиологии Биологического факультета МГУ, Г.Москва, 1993 г.; 45 th Arctic conference "Bridges of the science...", Vladivostok, 1994; 12 th International Symposium on Okhotsk Sea & Sea ice, Mombetsu, Hokkaido, Japan, 1997.

Публикации .По материалам диссертации опубликовано 14 печатных

работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, трех глав экспериментальной части, выводов, списка литературных источников, включающего 145 наименований, из которых 81 иностранных, и приложения.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В качестве объекта исследований использовались следующие культуры массовых ВИДОВ морских микроводорослей: Dunal.iella salina Teod, Nephrochloris salina Cart , Pavlova lutheri Droop, Pbaeodactylum tricornutum Bohl in, Platymonas viridis Rorich.H водоросль космополит Chlorella sp.sp. Альгологически чистые культуры выращивались в среде Гольдберга (Кабанова 1961) или на морской воде, отобранной с глубины 300 - 400 м, обогащенной биогенными элементами. Культуры водорослей выращивали либо в условиях естественного рассеянного света, либо при освещении люминесцентными лампами, создающими освещенность 3-8 кЛк, при температуре 20+2°С (Ланская.1971).

Количество клеток в растущей культуре определяли стандартным счетным методом под микроскопом в камере Горяева или Фукса- Розен-таля. Процент жизнеспособных клеток определяли методом высева на

чашки Петри с агаризированной средой Гольдберга. Образовавшеся микроколонии, принимаемые за потомство живых клеток, подсчитывали к концу 2 суток под микроскопом. В качестве токсикантов при проведении опытов использовали водные растворы тяжелых металлов и сточных вод. Расчет концентраций тяжелых металлов проводили по катионам, а сточных вод - по навескам. Токсикологические опыты проводились как правило в 3-кратной повторности. За интенсивность ЗФ принимался максимум индукционной кривой послесвечения , выраженный в относительных единицах, калибруемых по свечению эталона. Для сравнительных исследований ЗФ нормировалась на численность клеток микроводорослей.

Работа с природными популяциями фитопланктона проводились в 6 рейсах НИС РАН^морских экспериментальных станций* 'Витязь" и 'Остров Попова'.

Пробы фитопланктона отбирались с разных горизонтов клапанными пластмассовыми батометрами (Стародубцев и др. 1976). Для удаления зоопланктона пробы фильтровали через мельничный газ Л 36 и для избежания фотодеструкции затенялись. На глубоководных станциях пробы воды отбирали обычно с 8 горизонтов:0, 10, 25 , 50, 75, 100, 125, 150 м.

Для изучения циркадного ритма фотосинтеза морского фитопланктона использовали 'микрокосм', который в судовых условиях был выполнен в виде полиэтиленового мешка емкостью 0,25 м^, размещенного в открытом ящике серо-голубого цвета с боковыми стенками. В него заливалась отфильтрованная через мельничный газ Л- 36 морская вода с поверхностного горизонта объемом 0,2 м3. 'Микрокосм' размещался на палубе при естественной освещенности. Температура в 'микрокосме' поддерживалась такая же, как и в месте отбора пробы с точностью +1°С. В условиях морских экспериментальных станций "Витязь" и "Остров Попова" "микрокосм" выполнялся большего размера и заполнялся отфильтрованной от зоопланктона морской водой объемом от 0,2 до 1,5 м3. Экспонирование его проводилось в море на глубине 0,5 м от поверхности, В суточных экспериментах пробы из "микрокосма" отбирались с интервалом 2-3 часа.

ПП измеряли радиоуглеродным методом и выражали в мг СДр'час, мг С/м3, сутки либо в относительных измерениях - в имп./мин. ПП определялась как правило в 2-х светлых и одной темной склянках с

каждого горизонта (иногда в 4-х светлых и 2-х темных склянках-при низких концентрациях фитопланктона). Приготовление раствора изотопа и определение его исходной активности производилось в соответствии с методическим пособием (Методическое пособие.1960). Большая часть измерений в столбе воды было выполнено по схеме Сорокина (Сорокин. 1959) Определялась ПП на поверхности Сфц, и отдельно учитывались вертикальное распределение фотосинтетически активного фитопланктона Кр и зависимость фотосинтеза от величины проникающей солнечной радиации Кр. При определении коэффициента распределения Кр пробы экспонировались 3-6 часов при "оптимальной освещенности" 10-12 кЛк, создаваемой лампами дневного света ЛД-20, в аквариуме с проточной забортной водой. ПП. определяемая только на поверхности при тех же условиях, называлась потенциальной ПП. Последняя, отнесенная к мг хлорофилла'а" (хл. "а"), называлась ассимиляционным числом (АЧ). Кроме того, пробы с поверхности параллельно экспонировались либо сутки, либо световой день на палубе в аквариуме для определения фотосинтеза на поверхности.

ЗФ измерялась 2-3 раза в каждой пробе после предварительной темновой адаптации 5-20 минут и выражалась в относительных единицах с использованием соответствущего эталона свечения.

В токсикологических экспериментах опыты выполнялись в 2-3 повторностях.

Коэфффициенты линейных регрессионных уравнений, связывающих изучаемые продукционные параметры и коэффициенты синусоида

суточного хода ЗФ и ПП, вычислялись методом наименьших квадратов (Поллард,1982).

Концентрация пигментов и феопигментов фитопланктона определялась по стандартной методике (scor-unesсо 1966).

Для регистрации интенсивности ЗФ была изготовлена лабораторная установка, представляющая усовершенствованный вариант установки, описанной в работе (Маторин и др.1974). Для увеличения светосбора измеряемый объект был максимально приближен к фотокатоду ФЭУ. За счет этого чувствительность установки увеличилась почти вдвое. Кроме того, нами был разработан погружной зонд для непрерывного измерения ЗФ "in situ", защищенный а.с. n 1235008 от 1986 г.

В зависимости от скорости вращения модулятора установка позволяла измерять ЗФ через 1 и 20 мс после прекращения освещения. При измерении ПП методом ЗФ использовалась как правило,

17 19 18

Рис.1. Погружной зонд для измерения замедленной флуоресценции фитопланктона.

1 - герметичная камера

2 - проточная камера

3 - модулятор

4 - 1-ая группа отверстий

5 - 2-ая группа отверстий

6 - концевой отражатель

7 - источник излучения

8 - объектив

9 - светофильтр

10 - плоское зеркало

11,14 - иллюминаторы

12 - плоский отражатель

13 -ФЭУ 79

15 - отражатель

16 - блок регистрации

17 - датчик глубины

18 - датчик освещенности

19 - иллюминатор

20 - адаптационнный лабиринт

21 - приспособление для

прокачивания жидкости

22 - светонепроницаемый

лабиринт

23 - пучок возбуждающего

излучения

24 - поле зрения ФЭУ

25 - исследуемый объем

миллисекундная компонента со временем между возбуждением и регистрацией ЗФ около i мс.

Погружной зонд для непрерывного измерения ЗФ "in situ", изображен на рис.1. Поток воды с фитопланктоном с определенной скоростью, задаваемой приспособлением(21), через вход поступает в лабиринт(20),пройдя через который, выдерживается в темноте в течение 5 минут.и попадает в объем(25). Здесь он подвергается воздействию возбуждающего излучения. При этом световой поток от галогенной лампы и поток, отраженный концевым отражателем(6), коллимируется объективом(8) в параллельный пучок. Последний проходит через светофильтр(9), выделяющий спектральный интервал в полосе поглощения хл."а" х >600 нм; плоское зеркало(10) направляет поток возбуждающего излучения при открытом отверстии(4) модулятора(3) через иллюминатор(11). Далее пучок(23) возбуждающего излучения дважды пересекает исследуемый объем(25) и, отражась от плоского отражателя(12), возвращается к источнику возбуждающего излучения по тому же оптическому пути.

Излучение ЗФ в исследуемом объеме(25) распространяется в различные стороны. Часть его непосредственно проходит через иллюминатор(14), регистрируется ФЭУ(13) при открытом отверстии(5) и закрытом отверстии(4) вращающегося модулятора(3), Другая часть излучения ЗФ проходит по этому же оптическому пути после отражения в параболическом отражателе(15), Отверстие (5) открывается после полного закрытия отверстия(4).

Электронный блок регистрации 16), связанный с фотоприемником (13), датчиком глубины погружения(17) и датчиком освещенности(18), преобразует полученные сигналы и передает их на поверхностные регистрирующие устройства. В приповерхностном слое воды расположен датчик освещенности, аналогичный расположенному в погружном устройстве и также связанный с поверхностными регистрирующими устройствами.

ЛАБОРАТОРНЫЕ КУЛЬТУРЫ ВОДОРОСЛЕЙ И ПЕРИФИТОН при различных воздействиях Исследования, проведенные на монокультурах водорослей, показали прямую связь между зф и концентрацией клеток в фазе логарифмического роста культуры. Коэффициент пропорциональности различался для разных видов водорослей. с увеличением размеров

клеток выход ЗФ, нормированный на число клеток, несколько увеличивался. Для близких по размерам клеток paviova Luther i и Nephrochloris sali па(10-13х5-10мкм коэффициенты пропорциональности были близки. Но при переходе от одной фазы роста к другой наблюдались изменения коэффициента пропорциональности .Более подробно эти изменения были изучены нами в экспериментах с Nephrochloris salina (рис.2). Для этого брали культуру на стационарной фазе роста и пересевали в новую среду. Далее она экспонировалась 48 суток при естественном рассеянном освещении. В начале логарифмической фазы пересеянной культуры наблюдалось увеличение выхода ЗФ, нормированного на концентрацию клеток. Вероятно, это связано как с относительным уменьшением численности мертвых клеток, так и с возможным возрастанием фотосинтетической активности живых, активно делящихся клеток. В логарифмической фазе роста и начальной стадии стационарной фазы роста коэффициент пропорциональности между ЗФ и концентрацией оставался постоянным, несмотря на возрастание общей численности клеток водорослей. В конечной стадии стационарной фазы роста наблюдается падение выхода ЗФ. Это , очевидно, связано с уменьшением численности живых клеток, вызванным исчерпанием биогенных элементов и самозатенением водорослей.

Мы наблюдали изменения ЗФ культур водорослей при воздействии ультразвука и токсикантов. Прямая связь между ЗФ и концентрацией живых, неповрежденных клеток особенно наглядно проявляется в тех случаях, когда фотосинтетически-активные клетки легко внешне отделяются от поврежденных. При воздействии ультразвука частотой 0.88 Мгц на культуру микроводорослей численность живых клеток изменялась одинаково с изменением выхода миллисекундой компоненты ЗФ(рис.З).

В токсикологических экспериментах ЗФ также коррелировала с числом живых клеток, определенных по выживаемости при посеве на чашки Петри. Однако относительное изменение общей численности клеток значительно отставало от уменьшения интенсивности миллисекундной ЗФ при воздействии антропогенных загрязнений ( см.Табл.1).

В краткосрочных и хронических экспериментах было показано, что высокую чувствительность к действию загрязнений, наряду с миллисекундной ЗФ, выявляет компонента со временем жизни 10-50 мсек (декамиллисекундная ЗФ). Действие солей тяжелых металлов и

Рис. 2. Изменение • -концентрации С(кл/мл)х 10

и А - удельного выхода ЗФ/С(огн.ед./1сл/мл) культуры водоросли МерЪгосЫопз в. Т время опита сутки.

Рис.3. Кинетическая кривая разрушения клеток

Nehprochloris. s. ультразвуком (частота 880 кГц, ^ мощность 0,5 Вт) ■ -ЗФ(отн.ед.), Q - С(кл/мл)х10 концентрация неповрежденных клеток просчитанная под микроскопом. Т - время озвучивания, сек.

стоков на физиологическую активность водорослей выявляется по ЗФ через 1 час, тогда как общее количество клеток, измеряемое микроскопически, уменьшалось при значительно более длительной инкубации. Предложено использовать декамиллисекундную компоненту ЗФ для биотестирования различных загрязнений, т.к. она может регистрироваться более простыми проточными системами.

Таблица 1

Действие сточных вод на относительные, в Л от контроля параметры монокультур одноклеточных водорослей

Культура Время, Интенсивность Интенсивность Числен-

часы миллисекундой декамиллисекунд- ность

компоненты ной компоненты клеток

Dunal теПа salina 1 18 87+3 82+5 89+2 71+4 100

24 84+6 87+4 93+2

Platimonas viridis 1 18 7Ь+3 75+3 ш±г 75+2 1UU

24 71+4 84+4 95+2

Pavlova "luthery 1 18 24 УОШ 75+4 78+5 79+2 87+4 80+3 100 96+2

i-ieDhrocnl on s salina 1 01Г4 1И4+0 1UO

18 89+5 152+12 -

24 8815 127+14 105

представленного преимущественно диатомовыми водорослями, также наблюдается прямая связь между ЗФ и концентрацией активных клеток. Результаты изучения скоростей развития перифитона на поверхностях, защищенных от обрастания различными покрытиями, приведены в Табл.2. Через семь дней экспозиции концентрация клеток перифитона на контрольных незащищенных пластинах превышала концентрацию клеток на пластинах, покрытых краской ХВ-53, в 2.5 раза, в то время, как ЗФ на контрольных пластинах была выше более, чем в 200

-и-

раз, так как большая часть клеток на пластине, покрытой краской ХВ-53, погибла.

Известно,что диатомовые водоросли появляются на ранних стадиях сукцессии обрастания в первые 2-3 дня, вслед за бактериями. Учитывая это обстоятельство, а также то, что резистентность диатомовых водорослей к тяжелым металлам (основному токсическому компоненту современных антиобрастащих покрытий) перекрывается с резистентностью к ним остальных членов сообщества обрастания (Патин.1973), и исходя из полученных нами результатов мы разработали способ экспрессного определения эффективности защиты поверхностей от обрастания, основанный на регистрации ЗФ.

Таблица 2

Определение эффективности защиты поверхности от обрастания. Экспозиция 7 суток.

и0ра3цу

Контрольный Защищенный евин- защищенный незащищенный цовым суриком ХВ-53

ЗФ смыва 108 53 0.5

перифитона,отн.ед.

Концентрация клеток перифитона, 3.8 2.9 1.5 тыс/кв.см

На основании экспериментов с культурами водорослей и

перифитоном выявлено, что параметры ЗФ связаны с размерами клеток и функциональным состоянием микроводорослей, определяемым либо фазой развития, либо воздействием на них различных загрязнений и ультразвука.

Показано ,что интенсивность ЗФ коррелирует с количеством живых активных клеток микроводорослей, а характеристики индукционной кривой флуоресценции могут быть использованы как чувствительные показатели изменения физиологического состояния водорослей при внешних воздействиях.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ФИТОПЛАНКТОНА Параллельные измерения ЗФ и концентрации пигментов фитопланктона в океане выполнены нами в 6 рейсах на НИСах РАН СССР и прибрежных МЭС "Витязь" и МЭС 'О.Попова'.

Показано, что интенсивность ЗФ отражает распределение

фитопланктона в океане. Это следует из близких по форме кривых распределения с глубиной ЗФ и концентрации пигментов, а также из значимых положительных коэффициентов корреляции мевду этими параметрами для разных районов Мирового Океана.

В таблице 3 приведены оценки характеристик распределения по горизонтам ЗФ и пигментов, а также коэффициентов корреляции между ними, рассчитанные для различных горизонтов в районе течения Куросио. Параметры, приведенные в таблице 3, являются типичными для северных и умеренных широт. На более низких тропических широтах для поверхностных горизонтов коэффициенты корреляции между ЗФ и пигментами как правило ниже ,что связано с низкими абсолютными значениями концентрации пигментов в поверхностном слое и, как следствие, с большими ошибками при их определении, приводящими к падению коэффициентов корреляции (Айвазян и др.1985), а также с большой амплитудой суточного хода отношения ЗФ и хл. " а".

Выяснение суточного хода продукционных характеристик фитопланктона важно как для понимания механизмов, связывающих эти параметры, так и для определения их среднесуточных значений. Результаты эпизодических наблюдений в различных районах Мирового океана показали, что интенсивность быстрой флуоресценции, потенциальной ПП и фотосинтеза фитопланктона может меняться в течение суток в несколько раз. Максимальные значения быстрой флуоресценции наблюдаются обычно около полуночи и минимальные около полудня (Kiefer. 1973; Loftus,setger.1975 ; Карабашев,Соловьев.1976; Карабашев. 1996). Суточный ход потенциальной ПП является антибатным ходу (флуоресценции, т.е. максимальные величины отмечаются чаще около полудня, минимальные -около полуночи (Ведерников.1980; Harding et al.1982; Pichard et al.1996). При ЭТОМ В ряде случаев отмечались два или несколько максимумов A4 фитопланктона в течение дня (капа et ai.1976; Beдерникоь.1980;Стельмах.1984).

Данных о суточном ходе ЗФ фитопланктона в литературе нами не обнаружено, кроме работы (Цвылев.Ткаченко.1977) по изучению связи ЗФ со скоростью ассимиляции углерода, где . показано, что эти параметры изменяются в течении суток одинаково.

Нами был исследован суточный ритм ЗФ и ПП в "микрокосмах". Опыты, проведенные в "микрокосмах", показали, что форма кривой, описывающей суточный ход ЗФ и потенциальной ПП, может быть близка к синусоидальной (рис.4). Это позволило нам использовать для

Таблица 3

Распределение по горизонтам параметров ЗФ и концентрации

пигментов в районе течения Куросио

горизонт м Сзф Кзф СУ «у rxlOO А

0 11.0 8.7 383 272 71 0.01 30

ЗФ и 10 13.8 8.2 475 235 79 0.01 31

хлоро- 25 18.4 10.6 584 354 46 0.01 27

филл 50 8.7 5.0 268 103 65 0.01 26

'а" 100 2.0 2.6 94 61 64 0.22 26

150 1.3' 2.1 88 86 5 1.05 19

2 9.0 8.9 307 272 77 0.00 27

0 10.0 8.4 472 351 71 0.02 40

ЗФ и 10 12.5 7.5 623 340 82 0.02 46

суша 25 15.? 10.7 802 579 61 0.01 45

хлорофил- 50 8.4 5.3 387 168 69 0.01 38

ЛОБ 100 1.8 2.7 129 106 70 0.34 41

150 0.9 2.0 138 316 9 4.00 38

8.1 8.4 411 400 75 0.00 41

ЗФ и ка-ротинои-да

о ю

25 50 103 150 2

11.0 13.8 18.4

8.7 2.0 1.3 9.0

8.7 8.2 10.6

5.0 2.6

2.1 8.9

310 431 520 190 125 161 278

262 243 438 99 134 20? 279

54 21 37 19 37 5 54

0.01 0.01 0.01 0.01

0.30 2.30 0.00

23

24

25 17 34 29 23

Примечание: С3ф,Су-средние значения соответственно ЗФ (отн.ед. ) и концентрации пигментов(мг/м3х1000);

Кзф,Ку-среднеквадратичные отклонения соответственно ЗФ и концентрации пигментов;

г - коэффициент корреляции между ЗФ и концентрацией пигментов; А0,А~ коэффициенты линейных регрессионных уравнений вида: Су = А0 + А х С3ф. Объем выборок >/23.

ЗФ

80-

26-

20-

* *

15- х/

/Ч

10- /

5 -

0 -

ппп

-10

о

16 20 0 4 8 12 16 20 т час

Рис.4, а,- ЗФ (отн.ед.), потенциальная первичная продукция (ППП) (тыс.имп./мин) популяции фито -

планктона и аппроксимация суточного хода--ЗФ,

—.— -ППП гармоникой с периодом 24 часа.

описания суточного ритма этих параметров уравнения вида:

п

ф(.ь) = в0 + в х 31Ы(тг и + р))

где в0 - среднее значение изучаемого параметра;

(1).

в - амплитуда изме-г - местное время.

ненения данного параметра, р - временной сдвиг,

Значения коэффициентов в0, в, р вычислялись по методу наименьших квадратов. Проверка значимости этой регрессии проводилась по методике, описанной в работе (Поллард.1982). Рассчитывался р-критерий:

средний квадрат регрессии средний квадрат отклонения

(2),

где V - число коэффициентов регрессии (в нашем случае -3); к - число измерений.

Если критерий был значим, т.е. больше рт,п (где т, п соответственно равны V-), к-ч) при доверительном интервале 0,95, то делался вывод о значимости регрессии и значимом отличии коэффициентов регрессии от нуля. В описанном эксперименте

коэффициент р был значимо велик для всех измерений. При этом суточный ход ЗФ описывался уравнением (1) существенно лучше, чем потенциальная ПЛ. Максимальные значения ЗФ наблюдались ночью, а потенциальной ПП - даем. Суточные ритмы этих параметров были в

противофазе, т.е. при возрастании ЗФ наблюдался спад потенциальной ПП и наоборот.

Нами были выполнены эксперименты по определению суточного хода ЗФ в "микрокосмах" для различных районов Мирового океана в пробах, отобранных с поверхности(Табл.4).

Все данные достаточно хорошо аппроксимировались гармоникой с периодом 24 часа, т.е. р-критерий в 5 экспериментах был значимо велик и варьировал от 6,93 при 16 измерениях в Южно-Китайском море до 24,8 при 15 измерениях в Средиземном море. Максимальные значения ЗФ также отмечались примерно от 22 часов до 4 часов местного времени(Ттах в таб.4). Отношение амплитуды к среднесуточному значению (в/в0) кривых, аппроксимирующих суточный ход ЗФ, варьировало от 0,11 для пробы, отобранной с 50 метров в районе течения Куросио, до 0,84 для пробы с поверхности в Красном море. В части этих экспериментов параллельно с ЗФ измерялась потенциальная ПП. Суточный ход потенциальной ПП аппроксимировался гармоникой с периодом 24 часа хуже, чем ЗФ. р критерий изменялся от 3.2 при ? измерениях в районе течения Куросио до 5.6 при 15 измерениях в Средиземном море. Вероятно, это связано с тем, что ПП в изолированных объемах воды может иметь ритм с периодом, близким К 12 часам аедепсЗге е! а1.1985).

На дрейфовых и якорных станциях в верхнем перемешанном слое суточный максимум ЗФ проявлялся так же, как и в изолированных пробах воды в ночное время от 21 до 3 часов. Под слоем скачка плотности воды время максимума сдвигалось на дневное время . Это явление могло быть вызвано как более активным ночным "выеданием" фитопланктона зоопланктоном, так и тем, что во время дрейфа изменялась глубина залегания пикноклина. Суточный ход ЗФ аппроксимировался в среднем значительно хуже, чем в экспериментах в "микрокосмах". Аналогично ЗФ суточный ход ПП на дрейфовых и якорных станциях аппроксимировался синусоидой хуже, чем в "микрокосмах". Максимальные значения АЧ так же, как и ПП наблюдались в дневное время.

Таблица 4

Аппроксимация суточного хода ЗФ гармоникой с периодом 24 часа в экспериментах с "микрокосмом".

Рейс, район Гориз.Дата м во в в ~®о ттах г числ изм. к

IV рейс Ш1С

"Ак.Лаврентьев"

Балтийское море 0 25.05 48,18 24,45 0,50 1.43 12,9 8

Пролив Ла-Манш 0 29.05 11,80 2,89 0,25 4.02 2,53 14

Средиземное море 0 3.06 5,56 3,56 0,67 1.50 24,80 15

Красное море 0 10.06 14,77 12,44 0,84 1.20 15,90 15

II рейс НИС

"Ак.Виноградов"

Южно-Китайское

море 0 18.01 6,54 4,47 0,68 0.02 6,93 16

хи рейс НИС

"Ак.Несмеянов"

Район течения

Куросио 0 29.06 4,00 2,32 0,57 21.35 11,20 12

- я - 50 15.08 16,90 1,91 0,11 21.42 2,48 22

Примечание. в0- среднесуточное значение ЗФ; в - амплитуда ЗФ; ттах- время, соответствующее максимуму ЗФ; р - критерий Фишера.

Особенностью данных, полученных на разных станциях в одной области океана, является высокая вариабильность гидрологических, гидрохимических и, как следствие, гидробиологических параметров. Поэтому при анализе суточного хода ЗФ для контроля рассматривался и суточный ход отношения ЗФ к концентрации хл. "а", менее подверженного колебаниям абиотических факторов. Наблюдения за суточными ритмами были проведены в районах течения Куросио и Сейшельских островов.

В районе Сейшельских островов отмечена более высокая изменчивость ЗФ с глубиной и по времени, по сравнению со съемками в районе течения Куросио. Точность аппроксимации суточного хода синусоидой с периодом 24 часа оказалась на Сейшельском полигоне

ниже, чем на полигоне в районе Куросио. Вероятно, это связано как с наличием в районе Сейшельских островов длиннопериодных внутренних волн с амплитудой около 50 метров, так и с низкими, сравнимыми с ошибкой измерения величинами ЗФ и хл. "а" на поверхностных горизонтах.

При нормировании данных ЗФ на концентрацию хл. 'а" происходит сглаживание профилей по глубине . Так отношение максимальных величин к минимальным для среднесуточных величин ЗФ больше 15, а для ЗФ, нормированной на хл. "а", меньше 1,5. Аналогичное, хотя не столь резкое уменьшение вариации ЗФ по глубине наблюдается и для относительной амплитуда. Временной интервал, в котором наблюдаются максимальные значения, также уже для ЗФ, нормированной на хл. "а.

Исследования связи ПП и ЗФ были проведены в двух рейсах 1982 и 1983 гг. НИС "Ак.Несмеянов". Затем эти измерения были продолжены в первом рейсе НИС "Ак.Виноградов"(май-июнь 1983),В последнем рейсе измерения выполнялись примерно в одно и то же местное время суток (с 7 до 8 утра корабельного времени) в пробах, отобранных с поверхности, при переходе судна из г.Риги в г.Владивосток, т.е. в разных гидрологических условиях, Было выявлено, что коэффициент корреляции между ЗФ и скоростью ассимиляции С14 при постоянной освещенности был высок и составлял 0.998 , Это связано, вероятно, с тем, что пробы отбирались практически в одно и то же время суток и суточный ход отношения этих параметров не влиял на степень их линейной связи. Кроме того, высокие значения ПП и ЗФ, отмеченные на нескольких станциях с близкими гидрологическими условиями, так же влияли на коэффициент корреляции в сторону увеличения, Так, при исключении из этого массива данных двух станций с максимальными значениями параметров коэффициент корреляции снизился с 0.998 до 0,945. Однако при выполнении станций даже в одно и то же время суток на поверхности. но в различные сезоны, коэффициент корреляции снижался,

Для определения возможности использования ЗФ при оценке ПП в столбе воды была изучена связь ЗФ со скоростью ассимиляции в пробах воды, отобранных с различных горизонтов и экспонировавшихся при 'оптимальной" освещенности 8-17 кЛк. Последняя величина используется в расчетном методе определения ПП. Ее принято называть коффициентом вертикального распределения фото-синтетически активного фитопланктона Кр(Сорокин. 1959).

Кр/8Ф 100°/

80 60 40 20

0

0.1 1.0 3.2 10 100% я Рис.б Связь Кр/ЗФ с вертикальной устойчивостью водного столба и освещеностью. Q - освещен ость в % от поверхностной. Кр/ЗФ отношение параметров в % от максимального. Устойчивость водного столба ------0.1<АО<1,------АОЫ.

При анализе отношения Кр/ЗФ установлено уменьшение его с глубиной, причем резкий спад отношения наблюдался в слое температурного скачка или под ним. Для выяснения зависимости вертикальных изменений отношения Кр/ЗФ от устойчивости водного столба и освещенности мы построили гистограммы распределения этого отношения при различных сочетаниях устойчивости водного столба и освещенности. В качестве показателя устойчивости водного столба, залегающего выше исследуемого горизонта, использовались абсолютные величины разностей условной плотности на даннном горизонте и в поверхностном слое: Да = (ег2-о-о) Наиболее вероятные величины использовались для построения зависимости (рис. 5). Для того, чтобы исключить суточный ход параметров, использовались величины соотношения Кр/ЗФ, выраженные в I от максимального отношения. В хорошо перемешанных водах (Ас примерно 0.1) отношение Кр/ЗФ достаточно постоянно и близко к максимальному во всей фотической зоне. У фитопланктона, находящегося у основания столба воды с умеренной устойчивостью 0.1< Лег <1.0, отношение Кр/ЗФ начинает резко падать при освещенности меньше, чем 3-55 от поверхностной. Для фитопланктона, расположенного у основания столба вода с высокой устойчивостью До- >1, падение отношения происходит прир

более высокой освещенности, достигающей 8-15)1 от поверхностной.

Различия в ассимиляционной активности глубинного и поверхностного фитопланктона могут быть, как отмечалось ранее (Ведерников 1982), серьезной помехой метода косвенного расчета ПП с использованием коэффициента Кр.

На нескольких станциях одновременно определелялась ПП в столбе воды тремя различными методами: с использованием ЗФ, Кр и in situ. При этом было выявлено, что при залегании основной массы фитопланктона ниже скачка плотности данные по ЗФ лучше согласуются с результатами in situ, чем по Кр.

На основании изложенных фактов мы полагаем, что интенсивность ЗФ является более достоверным параметром, отражающим распределение фотосинтетичееки активного фитопланктона, чем применяющийся до сих пор коэффициент Кр.

Полученные подробные экспериментальные данные о суточном ходе ЗФ, о ее вертикальном и пространственном распределении и коэффициентах связи с продукционными характеристиками фитопланктона позволили разработать алгоритм для оценки ГШ в столбе воды.

Для каждого исследуемого полигона определяется суточный ход ЗФ на горизонтах с максимальными концентрациями фитопланктона. Если суточный ход ЗФ проявляется статистически достоверно, то вводится поправка на него.

Затем устанавливается корреляция между ЗФ и величиной ПП при 'оптимальной* освещенности и вычисляется коэффициент пропорциональности между этими параметрами " d" . С помощью этого коэффициента все значения ЗФ переводятся в величины ПП. Методика измерения такова, что все полученные значения, измеренные радиоуглеродным методом и пересчитанные по ЗФ, соответствуют одинаковой, насыщающей фотосинтез интенсивности света.

Существует довольно много уравнений, описывающих фотосинтез в зависимости от освещенности, основанных как на эмпирических, так и на механизменных моделях фотосинтеза . Для упрощения расчетов можно представить световую зависимость фотосинтеза в виде ломаной линии с точкой перелома при интенсивности ik. ik - это интенсивность света, соответствующая точке пересечения продолжения линейного участка и плато световой кривой(Толлинг.1957). ik определялась для изучаемых районов либо из собственных измерений, либо данных из литературы.

Согласно разработанному нами алгоритму. ПП для различных горизонтов, можно расчитать следующим образом: если интенсивность света i>ik, то ПП = (ЗФ/d) х т;

при i<ik, ПП = (ЗФ/D) х (Шк) х т (где т - продолжительность светового дня для средней интенсивности) .

Рассчитанные по данному алгоритму профили ПП на основании ЗФ хорошо воспроизводят профили ПП, измеренные радиоуглеродным методом in situ.

В качестве примера использования метода ЗФ можно привести изучение изменчивости распределения хл."а1 и ПП фитопланктона в теплом вихре Куросио (Рис.6). Слежение за динамикой такого обширного(свыше 150 миль в диаметре) и сложного образования как вихрь Куросио традиционными гидробиологическими методами практически невозможно. Поэтому для изучения продукционных характеристик вихря использовались определения ЗФ. .х

При расчетах среднесуточных концентраций хл. "а* для всех параллельных определений ЗФ и хл 'а' вычислялись их отношения. Полученные величины погоризонтно аппроксимировались методом наименьших квадратов, гармоникой с периодом 24 часа по формуле (1)

ЗФ/хл."а"(t) = в0 + в х sin(^-(t+p)), где ЗФ/хл. "a" (t) - величина отношения в момент времени t, в0 -среднесуточное значение отношения ЗФ/хл."а", в - амплитуда отношения ЗФ/хл."а", <р - сдвиг фазы колебаний в часах, t - поясное время в часах. Если полученные зависимости удовлетворяли критерию Фишера для 95? доверительного интервала, то суточный ход учитывался при вычислении значения хл "а". На горизонтах, где отсутствовал суточный ход хл " а", его концентрация определялась из линейного регрессионного уравнения(2).

хл. 'а" = А0 + А х ЗФ, где А и А0- коэффициенты линейного регрессионного уравнения, вычисленные методом наименьших квадратов. ПП измерялась, согласно вышеописанной методике.

В наших наблюдениях было обнаружено хорошее совпадение результатов экспрессного метода определения хл."а" и ПП с данными, полученными традиционными методами (Табл.3), Использование метода ЗФ в районе со сложной динамикой водных масс позволило выявить тонкую структуру природной популяции фитопланктона и проследить ее

Рис.6 Распределение продукционных характеристик фитопланктона н верхнем 100 м слое измеренных с помощью метода ЗФ , А - содержание Хл"а" (мг/м2) и Б - ПП (мг С /м2 * сут.)

-- -■■■■--полярный фронт

----- граница вихря

- гидробиологические станции

пространственно-временную изменчивость. Проведенные исследования показали перспективность использования метода ЗФ в гидробиологических исследованиях динамических характеристик водных масс в обширных акваториях Мирового Океана при изучении состояния продуктивности природных сообществ фитопланктона.

ВЫВОДЫ. •

1. Разработана высокочувствительная аппаратура, позволяющая регистрировать ЗФ(замедленную флуоресценцию) фитопланктона на борту судна и in situ в открытых районах Мирового океана.

2.Изучено изменение параметров ЗФ и продукционных характеристик микроводорослей в разных фазах развития культур и при воздействии загрязнений и ультразвука. Показано ,что интенсивность ЗФ коррелирует с количеством живых активных клеток микроводорослей, а характеристики индукционной кривой флуоресценции могут быть использованы как чувствительные показатели изменения физиологического состояния водорослей при внешних воздействиях.

3.Установлено, что в районах океана с однородными гидрологическими параметрами (в высоких и умеренных широтах -во всей фотической зоне, а в низких тропических широтах -в средней и нижней частях фотической зоны) между амплитудой миллисекундной компоненты ЗФ и концентрацией пигментов фитопланктона существует линейная положительная корреляция.

4.Исследованы суточные изменения ЗФ и первичной продукции(ПП) фитопланктона в природных условиях в различных районах Мирового океана. Выявлено противофазное изменение этих параметров в верхних горизонтах.

5.Разработан алгоритм для оценки ПП в столбе воды по интенсивности миллисекундной компоненты ЗФ и освещенности с учетом их суточного хода.

6.Испытания метода ЗФ, проведение в экспедиционных условиях, показали большую перспективность использования разработанного метода и аппаратуры для выявления тонких и подробных структур в распределении пигментов и ПП фитопланктона в районах Мирового океана со сложными гидрологическими характеристиками,

СПИСОК РАБОТ , ОПУБЛИКОВАННЫХ- ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Диденко Ю.Т.,Аникиев В.В..Ильичев В.И., Захарков С.П.Лекмасова Н.М. Исследование влияния ультразвуковой кавитации на монокультуры водорослей методом замедленной флуоресценции// Биофизика.- 1985,- т.30.- вып.1,- С. 100-103.

2. Захарков С.П., Маторин Д.Н., Стародубцев Е.Г., Васильев И.Р..Венедиктов П.С. Изучение распределения фитопланктона в океане с помощью метода измерения интенсивности замедленной флуоресценции. // Научн. докл. высш. школы. Биологич. науки.- 1985.- ЛЗ.-С.100-105

3.А.с. 1 235 008 СССР МКИ3 с 12 q i/18 /Устройство для измерения замедленной флуоресценции фитопланктона. Захарков С. П.,

Матвеев Ю.В, (СССР). - 4 С., ил. - 1986.

4.Маторин Д.Н., Васильев И.Р..Венедиктов П.С. .Захарков С.П. Метод непрерывного зондирования фитопланктона в водоемах путем регистрации замедленной флуоресценции, // Гидробиологический журнал,- 1986,- нЗ . - С.87-89.

5.Стародубцев Е.Г.,Захарков С.П, Использование замедленной флуоресценции для определения первичной продукции в океане //5 съезд Всесоюзного Гидробиологического Общества. Тольятти, сент. 1986г.: Тез.докл. - 4.1.-С.213.

6,Захарков С.П.,Стародубцев Е.Г.,Петрова Н. В. Использование милли- и декамиллисекундных компонент замедленной флуоресценции одноклеточных водорослей для биотестирования. // Симпозиум специалистов стран -членов СЭВ "Комплексные методы контроля

качества природной среды". Москва, ноябрь 1986г.: Тез.докл.- С.52.

7.Захарков С.П..Стародубцев Е.Г.. Использование замедленной флуоресценции морских микроводорослей для биотестирования // Всесоюзное совещание 'Охрана природной среды морей и устьев рек".г.Владивосток, сентябрь 1986г.: Тез.докл. - С.8?

8.А. с. 1 382 851 СССР МКИ3 a oi к 7э/оо /Способ определения эффективности защиты подводной поверхности от обрастания. Захарков С.П. .Маторин Д.Н.,Чернов Б.Б. (СССР). - 4 С.,ил.- 1987

9.Захарков С.П..Аникиев В.В..Стародубцев Е.Г. Использование метода замедленной флуоресценции для лучения распределения фитопланктона в. океане и 'Vjpeделения его первичной продукции см-зл советских оксгтологов.Ленинград» декабрь 1987г.: Тез.

докл. - Ч.З.- С. 17. 10. Захарков С. П., Бадюль А. А., Шумилин Е. Н.,Земнухсва Л. А., Земскова Л.А..Першко А. А. .Пешеходько В.М.,Селин Н.И. Первичная продукция, концентрация пигментов фитопланктона и гидрохимическая структура водных масс в районе Куросио. //3 Всесоюзная конференция по морской биологии. Севастополь, октябрь 1988г.: Тез.докл. - 4.2. - С. 14-15. 11.Захарков С.П.Использование замедленной флуоресценции фитопланктона и перифитона для биотестирования // 3 Всесоюзная конференция по морской биологии. Севастополь,, октябрь 1988г.: Тез.докл. - С.159.

12.Гладышев С.В., Захарков С.П. Изменчивость концентрации хлорофилла "а" и первичной продукции теплого вихря Куросио. // Океанология. - 1992. - Т. 32.- вып.6. - С. 1082-1092.

13.Zakharkov S.P. Determination of the primary production of phytoplankton using the delayed fluorescence tecknique in the Sea of Okhotsk and in Kuroshio Warm Corn Eddy. 45 th Arctic science conference "Bridges of the science".25-2 7 Aug.1994, Anchorage, Alaska; 29 Aug.-2 Sept.1994, Vladivostok, Russia.-Abstracts, Book 1 .-Vlad.,-Dalnauka.- 1994.-P.90.

14.Zakharkov S.P.,Orlova T.Yu.,Sovetnikova L.N. The distribution of phytoplankton on Okhotsk Sea shelf after ice thawing. The 12 th International Symposium on Okhotsk Sea & Sea ice. 2-5 Febr.1997. Mombetsu, Hokkaido, Japan.-P.310-318.