Исследование регуляции Н +-АТФазы плазматических мембран высших растений белками 14-3-3 при абиотическом стрессе

Шанько, Андрей Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование регуляции Н +-АТФазы плазматических мембран высших растений белками 14-3-3 при абиотическом стрессе
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование регуляции Н +-АТФазы плазматических мембран высших растений белками 14-3-3 при абиотическом стрессе"

На правах рукописи

ШАНЬКО Андрей Викторович

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯЦИИ 1Г-АТФазы ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ БЕЛКАМИ 14-3-3 ПРИ АБИОТИЧЕСКОМ СТРЕССЕ

Специальность 03.00.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выплачена в лаборатории гормональной регуляции онтогенеза сельскохозяйственных растений Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной баотехнолт ии Российской академии сельскохозяйственных наук.

Нщ'чцыцруководитель доктор биологических наук, профессор Бабаков АЛ.

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор Балнокнн Ю.В.

кандидат биологических наук Ладыженская Э.П.

"рами^Н* Институт физико-химической биологии

им. А.Н. Белозерского, МГУ

Ъщимасостпится « ^ 2003 г. в. К часов на заседании

диссертационного совета Д 006.027,01 при ВНИИСБ РАСХН по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 42 тел.211-3810 факс. 977-0947

Автореферат, разослан « <16» С 2003

года

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИСБ РАСХН

Ученый секретарь диссертационного совета

к.б.н. Мелнкова С.А.

<2 33

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Низкая температура, засуха и высокие концентрации соли - основные стрессовые факторы, неблагоприятно воздействующие на рост и развитие растений и снижающие урожайность сельскохозяйственных культур. Исследование молекулярных механизмов восприятия сигналов внешней среды и передачи их в клетке для активации адаптивного ответа - одна из фундаментальных задач современной биологии растений. Понимание молекулярных основ адаптации растений к стрессу имеет значение в селекции и биотехнологии, для проведения рационального скрещивания при выведения новых сортов и получении трансгенных растений.

Ведущую роль в поддержании гомеостаза клеток растений при абиотическом стрессе играет Н*-АТФаза плазматических мембран, а одними из известных регуляторов активности фермента являются белки 14-3-3. Белки 14-3-3 представляют собой семейство гидрофильных, консервативных регуляторных белков, широко распространенных в клетках животных и растений. В аминокислотной последовательности белков 14-3-3 имеется консервативная центральная область, ответственная за связывание с белками-мишенями, и вариабельная область С-колца, обладающая изоформ-специфичными функциями [Рег1, 1996]. Комплексобразованне между белками 14-3-3 и Н*-АТФазоЙ происходит при фос формировании специфического мотива С-концевого автоингибиторного домена Н^АТФазы, при этом фермент активируется [Оескп^ е1 а!. 1997]. Активация фермента приводит к гиперполяризации плазматической мембраны, увеличению разности рН между цитоплазмой и апопластом и, следовательно, к возрастанию движущей силы для потоков ионов и метаболитов внутрь клеток. Ранее в нашей лаборатории было обнаружено участие 14-3-3 белков в регуляции активности Н^АТФазы в плазматических мембранах протопластов и клетках суспензионной культуры сахарной свеклы при абиотическом стрессе [СЪе1узЬеуа е1 а1. 1999, ВаЬакоу ег а1. 2000]. В настоящей работе основное внимание уделено регуляции Н1-

4 лг

АТФазы плазматических мембран белками 14-3-3 в целых растениях при ответе на различные абиотические стрессы — солевой, осмотический и

холодовой.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было: изучение регуляции Н*-АТФазы плазматических мембран 14-3-3 белками при абиотическом стрессе в органах и тканях целого растения при различной сортовой и видовой стрессоустойчивости. Были поставлены следующие задачи:

• исследовать динамику изменения активности Н*-АТФазы плазматических мембран и количества 14-3-3 белков при солевом и осмотическом стрессах в корнях проростков ячменя сортов с различной устойчивостью к высоким концентрациям ЫаС!;

• исследовать изменения экспрессии генов изоформ 14-3-3 белков в корнях проростков ячменя при солевом стрессе;

• исследовать динамику изменения транспортной активности Н"-АТФазы плазматических мембран и количества 14-3-3 белков при солевом стрессе по длине корня проростков кукурузы;

• исследовать изменение транспортной активности Н*-АТФазы плазматических мембран растений томатов с различной сортовой устойчивостью к высоким концентрациям ЫаС1;

• исследовать изменение транспортной активности Н^-АТФазы плазматических мембран в растениях с различной устойчивостью к низким температурам: озимой пшеницы, томата и огурца.

Научная новизна и практическая значимость, Установлено, что 14-3-3 белки регулируют транспортную активность Н*-АТФазы плазматических мембран целых растений при абиотическом стрессе. На примере сортов ячменя, контрастных по устойчивости к высоким концентрациям N301, впервые показано, что при внезапном солевом стрессе процесс адаптации в устойчивом сорте протекает быстрее, чем в неустойчивом. На примере

проростков кукурузы впервые установлено, что наибольшие изменения при увеличении активности Н*-АТФазы при осмотическом стрессе в корне происходят в апикальной зоне. Впервые показано, что при адаптации к абиотическому стрессу транспортная активность I-Г-АТФазы выше у сортов с повышенной устойчивостью к низким температурам или к высоким концентрациям NaCI. Это говорит о том, что изменение транспортной активности Н^-АТФазы с помощью белков 14-3-3 может является частью механизма стрессоустоЙчивости высших растений.

Структура и объем диссертации* Диссертационная работа состоит из введения; 4-х глав: обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение; заключения, выводов, списка использованной литературы, содержащего 244 ссылки и списка иллюстраций. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, включая 29 рисунков, 5 таблиц и 2 фотографии.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были: 7-ми дневные проростки ячменя Hordeum disticum L, сортов Московский-12] (М-121) и Эльф; 3-х дневные проростки кукурузы Zea mays L, сорт КОСС; растения озимой пшеницы Triticum aestivum L, сорт Мироновская 808 в фазе кущения; 3-х дневные проростки озимой пшеницы Triticum aestivum L, сорт Мироновская 808; растения томата Lycopersicort esculentum L сортов: Ранний китайский (штамбовый), Москвич, Лидия и Микадо; 10-ти дневные растения томата Lycopersicon esculentum L, сорт Сибирский скороспелый и огурца Cucumis sativus L, сорт Конкурент.

Выращивание растений и создание абиотических стрессов. Растения ячменя выращивали в водной культуре в климатической камере Gallenkamp Fi-totron 6ООН (Великобритания) 7 суток при температуре 23 °С днем и 21 °С ночью на 1/5 среды Кнопа. Солевой стресс создавали добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 0.15 М или добавлением LiCl до конечной концентрации 5мМ, осмотический стресс создавали добавлением сорбита до конечной концентрации 0.3М.

Семена кукурузы проращивали на фильтровальной бумаге, смоченной дистиллированной водой с 20 мкг/мл нистатина в темноте при температуре 25 °С в течение 3-х дней. Все эксперименты проводили на корнях длиной 30 мм. Солевой стресс создавали добавлением хлорида натри» до конечной концентрации 0.15 M или добавлением LiCI до конечной концентрации 5мМ, осмотический стресс создавали добавлением сорбита до конечной концентрации 0.3М.

Растения озимой пшеницы выращивали и закаливали в ящиках с почвой на закрытой вегетационной площадке Института физиологии растений РАН в течение 2-х месяцев. Пробы листьев и узлов кущения и пелые растения для определения морозостойкости брали в первой декаде ноября (вариант -закаленные растения). Растения, выращенные в этих же условиях, но за неделю до анализа помещенные в оранжерею с естественным освещением при 20 °С, служили контролем {незакаленные растения).

Растения огурца Cucumis sativus L, сорт Конкурент, и томата Licopersicon esculentwn L, сорт Сибирский скороспелый, используемые в экспериментах с холодовым стрессом, были выращены в почвенной культуре в климатической камере до фазы 5 настоящих листьев (10 дней). Условия холодового стресса - 7 суток при температуре 6 °С. Для экспериментов у растений брали 3 лист, стебель между 2 и 3 листом и корни.

Растения томата Lycopersicon esculentum L сортов: Ранний китайский (штамбовый), Москвич, Лидия и Микадо были выращены на закрытой вегетационной площадке Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева и доведены до урожая. Соль вносили в виде 150мМ раствора NaCl в фазе бутонизации.

Измерение выхода протонов m корней проростков ячменя. Выход протонов измеряли рН-метром, соединенным с самописцем при постоянной аэрации в термостатируемой ячейке (25вС, 5 мл), заполненной буфером, содержащим 2мМ Mes - бнс-Трис-пропан (pH 6.2), Î мМ CaSO«, 2.5 мМ K2S04.

Выделение плазматических мембран из растений. Плазматические мембраны очищали распределением фракции микросом в двухфазной полимерной системе декстранТ 500/ПЭГ 3350 [Larsson, 1994],

Определение количества фузикокцин-сеязшающ их сайтов (ФКСС).

Количество ФКСС определяли по связыванию плазматических мембран с [3Н]дигидрофузикокцином ([}Н]дигидроФК). От не связавшейся метки освобождались вакуумной фильтрацией на фильтрах GF-C («Whatman», Великобритания), предварительно выдержанных в 1%-ном растворе полиэтиленимина Р [De Bour et al. 1989].

А ТФ-гидролазную активность Н*-А ТФазы измеряли в сопряженной системе смеси ферментов пируваткиназыУлактатдегидрогеказы. Образование АДФ определяли спектрофотометрически (Shimadzu UV-160А, Япония) при 340 им.

Вестерн блоттинг. Электрофоретическое разделение белков плазматических мембран в ДСН-ПААГ и перенос полипептидов на нейлоновую мембрану проводили согласно протоколу Hoefer (Hoefer, protein electrophoresis 1994). Визуализировали полипептидные полосы с помощью набора реактивов для хемолюминисценции - ECL, (Amersham, Великобритания). Поликлональные антитела против белков 14-3-3 были любезно предоставлены Клычниковым О.И,, ВНИИСБ; антитела, специфичные к изоформам А, В, С 14-3-3 белков ячменя - доктором A. De Boer, Свободный Университет, Амстердам, Нидерланды; вторые антитела, конъюгированые с пероксидазой хрена, были получены от Promega, США.

Выделение тотальной РНК. Тотальную РНК из корней проростков ячменя выделяли методом фенольной экстракции, используя набор "Рибозоль-Микро" (ЦНИИ Эпидемиологии РАМН, Россия) согласно протоколу производителя.

Синтез кДНК. к ДНК синтезировали реакцией обратной транскрипции, согласно протоколу Molecular Cloning [Sambrok and Russell, 2001], используя олиго-дТТФ в качестве затравки и РНК-зависимую ДНК-полимеразу вируса лейкоза мышей Молони (M-MLV).

ПЦР проводили, согласно протоколу Molecular Cloning [Sambrok and Russell, 2001], в амллифихаторе "Терцик" (ДНК-технология, Россия).

Измерение экспрессии генов 14-3-3 белков. Экспрессию генов 14-3-3 белков определяли методом дот-гибридизации, согласно протоколу Molecular Cloning [Sambrok and Russell, 2001]. Ампликоны фрагментов генов изоформ 14-3-3 белков, полученные полимеразной цепной реакцией (ПЦР), ковалентно связывались под действием УФ с нейлоновой мембраной Ну bond N (Amersham, Великобритания). Меченную кДНК получали реакцией обратной транскрипции в присутствии [а32Р]дАТФ. Гибридизацию проводили при 65°С в камере Hybridization Oven/Shaker (Amersham, Великобритания).

Определение меристемы и зоны перехода клеток к растяжению в корнях проростков кукурузы. На продольных срезах корней измеряли длину последовательных клеток в рядах метаксилемы. Место перехода клеток к растяжению определяли по резкому увеличению длины клеток как функции расстояния от кончика корня [Ivanov and Maximov,1999], Для определения границ меристемы использовали фиксированные (этанол-ледяная уксусная кислота, 3 : 1) продольные срединные срезы корня. Срезы окрашивали раствором 4,6-диамидино-2-фенилиндола и фотографировали поля зрения последовательные от корневого чехлика под элифлуоресцентным микроскопом (Reichert Jung, Австрия).

Определение содержания ионов Na* в растительных тканях. Содержание ионов натрия после озоления навески растительного материала определяли на пламенном атомно-адсорбционном спектрометре Carl Zeiss AAS-30 (Германия). Содержание натрия выражали в % от сухой массы.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Действие солевого и осмотического стрессов на растения ячменя.

Семидневные проростки двух контрастных по солеустойчивости сортов

ячменя были охарактеризованы по накоплению натрия в корнях и по скорости

выхода протонов из отделенных корней. Измерения показали, что за 4 часа

солевого стресса не было разницы между двумя сортами по накоплению NaT в

тканях корня. К 9-ти часам солевого стресса в корнях ячменя неустойчивого сорта Эльф накапливалось Na4 на 15% больше, чем в корнях сорта М-121, устойчивого к высоким концентрациям NaCl.

Эксперименты по измерению тока протонов из отделенных корней проростков ячменя показали, что в течение первого часа солевого стресса транспортная активность Н^-АТФазы возрастала примерно в два раза у обоих сортов (рис. I, слева). Далее активность фермента падала практически до нуля: у сорта М-121 это происходило к 3 -му часу, у сорта Эльф - к 9-ому и оставалась низкой вплоть до 24-го часа воздействия солевого стресса.

Для разделения действия солевого стресса на осмотическую и ион-токсическую компоненты использовали 300 мМ раствор сорбита, изоосмотичный 150 мМ раствору NaCl, и 5 мМ раствор LiCl, цитотоксический эффект которого эквивалентен токсическому действию 150 мМ NaCl. При добавлении сорбита в среду инкубации транспортная активность НГ-АТФазы значительно возрастала и оставалась высокой у обоих сортов в течении 9 часов стресса. Добавление LiCl в среду инкубации отделенных корней вызывало уменьшение транспортной активности фермента, причем у сорта М-121 это падение происходило гораздо быстрее, чем у сорта Эльф (рис. I, справа).

Бремя экспозиции, час Время экспозиции, час

Рисунок 1. Влияние солевого и осмотического стрессов на изменение выхода протонов из отделенных отрезков корней проростков ячменя. Слева: 1 - сорт М-121 (150мМКаС1), 2 - сорт Эльф (150мМ ЫаС1). Справах 1-сорт М-121 (5мМ 1ЛС1), 2 - сорт Эльф (5мМ 1ЛС1), 3 - одинаковые показания для обоих сортов (ЗООмМ сорбит).

Чтобы связать наблюдаемые изменения транспортной активности ЬГ-АТФазы с регуляторной функцией 14-3-3 белков, из корней проростков ячменя были выделены плазматические мембраны и измерены » них АТФ-гидролазная активность и количество белка ьГ-АТФазы, количество ФКСС и белков 14-3-3.

В изолированных плазматических мембранах растений ячменя сорта М-121 за первый час воздействия стресса АТФ-гидролазная активность Н'-АТФазы увеличивалась на 20%, а через 24 ч - уменьшалась по сравнению с контролем на 30%. Оптимум рН фермента не изменялся и составлял в обоих случаях 6.6. Существенных различий между двумя сортами по изменению активности ИГ-АТФазы не обнаружено,

£ 2 Рисунок 2. Влияние солевого стресса на изменение количества ФКСС в препаратах плазматических мембран, выделенных из корней проростков ячменя, 150мМ№С1: 1 - сорт М-121,2-сорт Эяьф.

На рисунке 2 показано изменение количества комплексов между белками 14-3-3 и Н*-АТФазоЙ, или ФКСС в плазматичесхих мембранах корней ячменя при солевом стрессе. У обоих сортов за первые 30-60 мин стресса количество комплексов увеличивалось, в дальнейшем количество комплексов уменьшалось. У солеустойчивого сорта М-121 достижение максимума ФКСС и последующее его падение происходило быстрее, чем у сорта Эльф.

Иммунодетекщпо белков 14-3-3 в плазматических мембранах, выделенных из корней проростков ячменя, проводили, используя 2 типа антител: к консервативному домену, одинаковому для большинства высших растений, и к вариабельной части, высоко специфичной для пзоформ А, В и С ячменя. Результаты экспериментов показали, что за 30 мин. воздействия солевого стресса в плазмалемме обоих сортов возрастает количество белков 14-3-3 (рис. 3,1 и II). Через 24 ч действия солевого стресса количество белков

0 05 1 9 Время экспозиции, час

14-3-3 существенно уменьшалось по сравнению с контролем. В экспериментах с растениями сорта М-121 в дополнение к основной полосе белков 14-3-3 с молекулярной массой 30 кД через 24 ч солевого стресса на иммун облоге появлялась полоса, соответствующая белку с мол. массой 35 кД (рис. 3, Щ), Появление белковой полосы 35 кД не было специфично по отношению к какой-либо из изоформ белков 14-3-3. Дополнительную полосу 35 кД не наблюдали на иммуноблоте белков плазматических мембран, выделенных из растений сорта Эльф. Иммунодетекция Н^-АТФазы показала, что при солевом стрессе за 1час в препаратах плазматических мембран, выделенных из корней проростков ячменя, количество молекул Н*-АТФаз не меняется.

ЗОкД Рисунок 3. Иммунодетекция белков

14-3-3 ассоциированных с

плазматическими мембранами при

солевом стрессе,

' о 0.5 24' I-сорт М-121,

Время экспозиции, час п ~~ С0РТ Эльф, _ Ш-сортМ-121, изоформы А, В иС.

Изо формы белков 14-3-3 Методом дог-гибридизации был

' С. .■ . З5кд определен уровень экспрессии генов

111 ^Ц ^ Ш ^'Д изоформ белков 14-3-3. Для этого,

0 24 0 24 0 24 предварительно, было произведено

Время экспозиции, час

выравнивание последовательностей

генов 14-3-3 белков с целью обнаружения консервативных и вариабельных

участков. В качестве изоформ-специфичных прямых и обратных праймеров

для ПЦР были выбраны концевые участки последовательности наиболее

вариабельной 3'-концевой области. Ампликоны имели следующую длину: 14-

З-ЗА - 435 п.н„ 14-З-ЗВ - 374 п.н., 14-З-ЗС - 348 пл. На рисунке 4 показаны

обобщенные данные денситометрни радиоавтографов, характеризующие

измерение уровней экспрессии генов 3-х изоформ 14-3-3 белков ячменя при

солевом стрессе в динамике. У солеустойчивого сорта М-121 экспрессия 14-3-

ЗА резко падает за 2 часа воздействия ЫаС1 и остается такой же низкой к 4

часам воздействия. Примерно такая же картина наблюдается с изоформой 14-

З-ЗВ. Уровень экспрессии изоформы 14-З-ЗС у сорта М-121 меняется

незначительно. У неустойчивого сорта Эльф экспрессия 14-3-ЗА увеличивается в пределах ошибки. Значительно изменяются уровни экспрессии дооформ 14-З-ЗВ и особенно 14-З-ЗС. Уровень экспрессия 14-3-ЗВ за 2 часа воздействия соли увеличился в 2 раза и оставался таким и к 4 часам воздействия. Уровень экспрессии 14-З-ЗС за 2 часа увеличился более чем в 2 раза н несколько уменьшился к 4 часам воздействия 150мМ КаС1.

Московский-121 Эльф

14-3 ЗА М-З-ЗВ 14-З-ЗС актин Н-З-ЗА Н-З-ЭВ 14-З-ЗС актин

контроль ?73 2 часа 4 часа

Рисунок 4. Обобщенные данные денситометрии радиоавтографов, характеризующие изменение уровней экспрессии генов 14-3-3 белков ячменя сортов Московский-121 и Эльф при солевом стрессе.

Действие солевого и осмотического стрессов на апекс корня проростков

кукурузы. Для более детального изучения регуляции Н^-АТФазы

плазматических мембран в корнях при солевом стрессе работа была

продолжена на проростках кукурузы. Были исследованы первые 1 Омм апекса

корня. Цитологический анализ показал, что в корнях 3-дневных проростков

кукурузы длина корневого чехлика составляла около 370-420 мкм (рис. 6, а).

Подъем митотической активности начинался на расстоянии 400 мкм от

кончика корня, и основная масса митозов приходилась на отрезок от 400 до

1600 мкм, хотя единичные мнтотическне фигуры можно было обнаружить

вплоть до 1900 мкм (рис. 5, б). Переход клеток к растяжению наблюдали на

расстоянии 1650-1800 мкм от кончика корня, и процесс резко ускорялся в

районе 2000 мкм. Основное растяжение клеток приходилось на область между

2000 мкм и 5000 мкм (рис. 6, г). Растяжение клеток прекращалось на

расстоянии 6.5-8 мм от кончика корня. Для дальнейшего исследования корни

проростков разрезали на последовательные 800-мкм части; 0-800 мкм (1-й отрезок) - корневой чехлик с апикальной частью меристемы; 800-1600 мкм (2-й отрезок) - основная часть меристемы; 1600-2400 мкм (3-й отрезок) -область, представленная клетками в стадии растяжения; от 2400 мкм до 6400

мкм (4-8-Й отрезки) - остаток клеток в стадии растяжения и начало области

созревания. Как видно из рисунка 5в в норме клетки 1-го сегмента корня явно подщелачивали инкубационную среду, а 2-й и 3-й сегменты подкисляли инкубационную среду.

Для того чтобы выяснить, какая часть первого отрезка определяет подщелачивание среды, были отделены первые 400 мкм, т. е. корневые чехлики. № данных рисунка 5г видно, что корневой чехлик значительно подщелачивал среду, а оставшиеся без него отрезки 400-1200 мкм и 1200-2000 мкм активно закисляли. Характерная для сегментов апекса корня картина транспорта протонов менялась под действием солевого стресса (150 мМ NaCl, 2 ч): 1-й сегмент вместо подщелачивания среды примерно с такой же скоростью выделял протоны, скорость выделения протонов из 2-го сегмента оставалась почти неизменной, а из 3-го сегмента в условиях солевого стресса протоны выделялись в 2.7 раза быстрее (рис. 5д).

Рисунок 5. Ростовые параметры и скорости протонных потоков вдоль апекса корня кукурузы.

а - фотография объекта, б — длина клеток и количество митозов по длине корня, в - выход протонов из последовательных 800мкм отрезках апекса корня в норме, г - выход протонов при удаленном корневом чехлике,

д - выход протонов при солевом стрессе, 150мМ NaCl,

Выход протонов непосредственно связан с транспортной

активностью Н1-

АТФазы плазматических мембран, поскольку обработка корней диэтилстильбестролом (DES, ингибитором ЬГ-АТФазы плазмалеммы) приводила к снижению скорости выхода протонов с 19.5 ± 1.3 до 3.5 ± 1.0 мкмоль/ м2 мин, а обработка корней ФК (активатором Н^АТФазы плазмалеммы) повышала скорость выхода протонов до 35.1 ± 6.8 мкмоль/ м2 мин, для 3-го отрезка. Далее было выяснено, какой компонент NaCl-солевого стресса - токсичность ионов или гиперосмотичность внешней среды -активирует скорость выхода протонов. Действие NaCl на скорость выхода протонов из 1-го отрезка было аналогично влиянию сорбита, a LiCl не оказывал достоверно отличимого от контроля эффекта, по крайней мере, в первые 30 мин. Также было исследовано пространственное распределение 143-3 белков в растущей части корня кукурузы. Рисунок 6, б представляет

результаты вестерн-блотгинга 14-3-3 белков в микросомальной фракции

О 800 1600 2400

Расстояние от кончика корня, мкм

мембран, изолированных из последовательных 800-мкм сегментов корня. Количество белков с мол. м. ~ 29-31 кД, выявленных антителами против 14-33 белков, во 2-м и 3-ем сегментах возрастало в 4 и 10 раз соответственно, по сравнению с 1-м сегментом (рис. 6, б и в).

Рисунок 6. Доля 14-3-3 белков в общем белке м икросомальных мембран апекса корня кукурузы, а - электрофорез тотальных белков в последовательных 800мкм отрезках апекса корня кукурузы, б - иммуноблот 14-3-3 белков в

последовательных 800мкм отрезках апекса корня кукурузы, * -полоса белка 35кДа, в - отношение содержания 14-3-3

г-Н* поток в отдельных 800мкм отрезках корня (справа) и отношение длины клетки (1п) к длине корня за вычетом данной клетки (Ь^, слева).

Рисунок 6 также демонстрирует, что увеличение количества 14-3-3 белков в микросомах идет параллельно с увеличением транспортной активности Н^АТФазы в последовательных сегментов корня (рис. 6.г) и достигает максимального уровня в 5-6-м сегментах корня, после которых количество 14-3-3 белков значительно уменьшается.

Низкое содержание 14-3-3 белков в плазмалемме клеток 1-го сегмента повышается в условиях осмотического стресса. Так, повышение осмоляриости внешней среды до 0.3 Осм не только вызывало активный выход протонов из 1 • го сегмента корня, но сопровождалось параллельным увеличением 14-3-3 белков в плазмалемме (рис. 7). Эффект был хорошо заметен после 30-мин предынкубации проростков в 150-мМ растворе ЫаС1 перед выделением

аШШШЯШшшш

^^^■м» Щ да « В зада

Расстояние от кончика корня, мкм белков к обшему белку корня по 800мкм отрезкам,

плазмалеммы из 1-го сегмента корня, а после 1.5-ч солевой предынкубации количество 14-Э-З белков возрастало в 2.5 раза (рис. 7, б и 7, в).

Рисунок 7. Действие 150мМ 29кДа ИаС! на количество 14-3-3 белков в плазмалемме первого 800-мкм отрезка апекса корня кукурузы, а - электрофорез тотального белка в плазматических мембранах первого отрезка апекса корня, б - иммуноблот 14-3-3 белков в плазматических мембранах первого отрезка апекса корня, в — отношение количества 14-3-3 белков к общему белку плазматических мембран: 1 ~ контроль, 2-30 минут солевого стресса, 3 — 90 минут солевого стресса.

Действие солевого стресса на растения томата. В предварительных экспериментах у сортов томатов контрастных по устойчивости к высоким концентрациям №С! была определена всхожесть семян (% прорастания семян) и урожайность при солевом стрессе (150мМ N801). По результатам экспериментов сорта томата были разделены на 2 группы: 1-я группа, солеустойчивые - Ранний китайский и Москвич; 2-я группа, не солеустойчивые - Микадо и Лидия (табл. 1).

Сорта

Урожай на солевом фоне, % от контроля

Количество ФКСС, пмоль/мг белка

150мМ №С1

Контроль

150мМ №С1/

Микадо Лидия

25.6

0.07

0.13

0.02

0.04

3.05

3.3

Таблица 1. Характеристика сортов томата по урожаю на солевом фоне (150мМ ЫаСЗ) и изменению количества ФКСС при 7-ми дневном солевом стрессе, 150мМ№С1. * - отсутствие урожая.

В растениях томата не солеустойчивого сорта Лидия было определенно содержание ионов Ыа+. Ионы натрия проникают в корень растения за 30 минут солевого стресса, содержание ионов натрия в других частях растения (верхние листья, стебель и нижние листья) не различалось н значительно увеличивалось только к 24 часам стресса. За 7 суток все показатели выравнивались и превышали уровень контроля в 8-10 раз.

Количество ФКСС было измерено в мембранных препаратах, выделенных из растений томата сортов Ранний китайский, Москвич, Микадо и Лидия, находящихся в фазе бутонизации. Образцы листьев собирали через 30 минут, 1, 6, 24 часа и 7 суток после внесения соли. Количество ФКСС в плазматических мембранах при солевом стрессе за 30 минут, 1 час, 6 часов и 24 часа менялось незначительно. Основные изменения проявились только на 7-е сутки стресса (табл. 1). При этом количество ФКСС в плазматических мембранах солеустойчивых сортов Ранний китайский и Москвич выросло в 12 и 29 раз соответственно, а у несолеустойчивых сортов Микадо и Лидия в 3 раза.

Действие холодового стресса на растения томата, огурца и озимой пшеницы. Моделирование второй фазы осеннего закаливания значительно повысило устойчивость озимой пшеницы в фазе кущения к низким отрицательным температурам. Количество незакаленных растений выживших после промораживания в холодильной камере при температуре -5 "С, составило 10%, при дальнейшем понижении температуры не закаленные растения не выживали. Аналогичное моделирование первой фазы закаливания (низкие положительные температуры, 7 суток при 2 °С), 4-х дневных проростков озимой пшеницы привело также к снижению индекса повреждения на 30%.

ростки корни

■■ 1 сутки

^ 3 ^ ток ШШ 7 С^ПЖ

томат огурец

пшеница

Рисунок 8. а - влияние закаливания (2°С) на изменение количества ФКСС в микросомальных мембранах, выделенных из надземной части н корней 4-х дневных проростков пшеницы, б - влияние холодового стресса на изменение количества ФКСС в плазматических мембранах выделенных из различных органов озимой пшеницы, томата и огурца, 7 суток при б °С: 1 - корни, 2 -стебли, * - участок стебля с узлом кущения, 3 — листья. Вставка: изменение количества белков 14-3-3 в плазматических мембранах, выделенных из узлов кущения озимой пшеницы.

При прохождении первой фазы закаливания (семь суток при 2°С) 4-х дневных проростков пшеницы было измерено количество ФКСС в микросомах. Как видно из рисунка 8.а количество ФКСС ощутимо меняется только в конце фазы закаливания, на седьмые сутки - в надземной части количество ФКСС увеличивалось вдвое, а в корнях в 1.7 раза. Дальнейшим шагом в исследовании регуляции 3-Г-АТФазы при холодовом стрессе было сравнение количества ФКСС в мембранах, выделенных из различных частей растений, контрастных по устойчивости к низким температурам, а именно озимой пшенице, томатах и огурце. '

Как видно из рисунка 8.6 при холодовом стрессе (7 суток при 6°С) наибольшие изменения в количестве ФКСС наблюдались в препаратах «

плазматических мембран, выделенных из узлов кущения (стеблей) озимой пшеницы - увеличение в 2 раза по сравнению с контролем. Изменения в растениях томата и огурца аналогичны изменениям в растениях озимой пшеницы, но выражены в меньшей степени - у томата увеличение в 1.5 раза по сравнению с контролем, у огурца - не превышает 10%. Изменение

количества ФКСС в узлах кущения озимой пшеницы коррелирует с изменением количества белков 14-3-3 на иммуноблоте (рис. 8.6, вставка). По окончании закаливания, на 7-ой лень, происходит двукратное увеличение количества белков 14-3-3, ассоциированных с плазматическими мембранами.

ОБСУЖДЕНИЕ

Действие холодового стресса на растения томата, огурца и озимой пшеницы.

Озимая пшеница, томат и огурец - виды растений, контрастные по способности адаптации к низким температурам. Озимая пшеница является наиболее холодостойкой культурой, огурец наименее холодостойкой, а томат занимает промежуточное положение [Климов и др, 1997]. Как видно из результатов экспериментов, двукратное увеличение количества комплексов между белками 14-3-3 и ЬГ-АТФазой в микросомальных мембранах проростков на 7-е сутки холодового стресса коррелирует с окончанием периода закаливания пшеницы (рис, 8а). Вероятная гиперполяризация плазматической мембраны в этот момент способствует притоку в клетку осмолитов, повышая тем самым осмотический потенциал цитоплазмы. В дополнение к этому, при зачислении апогшаста из клеточной стенки, которая обладает ионообменными свойствами, высвобождаются ионы Са1++, повышая осмотический потенциал среды и понижая, тем самым, температуру кристаллизации. Если рассмотреть более детально изменения в количестве комплексов между 14-3-3 белками и 1-Г-АТФазой при холодовом стрессе, то видно, что максимальные изменения наблюдаются в узлах кущения пшеницы. В узлах кущения количество комплексов при стрессе увеличилось а 2 раза, а в корнях практически не изменилось. С увеличением количества комплексов коррелирует увеличение количества 14-3-3 белков, ассоциированных с плазмалеммой, выделенной также из узлов кущения пшеницы. Показателен тот факт, что активация плазмалеммарной ЬГ-АТФазы, как защитное действие, проявляется в растущей, жизненно важной части растения, точке

роста, повреждение которой от низких температур означает гибель всего организма независимо от степени повреждения других частей.

Результаты по измерению количества ФКСС в различных частях растений при холодовом стрессе хорошо отражают холодостойкость представленных видов (рис. 86). Наибольшие изменения в количестве ФКСС выявились в стеблях озимой пшеницы - растения обладающего наибольшей холодостойкостью из представленных. В корнях, стеблях и листьях огурца количество ФКСС уменьшилось ниже контрольного уровня. Как по изменению количества ФКСС, так и по холодостойкости томат занимает промежуточное положение.

Ранее в исследованиях, проведенных на суспензионной культуре сахарной свеклы, было показано, что в плазматических мембранах, выделенных из протопластов, в ответ на понижение температуры (до 0°С) в 2 раза увеличивается количество ФКСС, а в препаратах мембран, выделенных из клеток - в 1.6 раза [С11е1уз11еуа Я а!., 1999]. В нашем случае на целых растениях полностью отсутствует активация ЬГ-АТФазы или увеличение количества ФКСС при раннем ответе на холодовой стресс. С одной стороны, это может свидетельствовать о том, что в отличии от осмотического стресса активация Н*-АТФазы при раннем ответе на холодовой стресс не играет большой роли, С другой стороны, это увеличение транспортной активности 1-Г-АТФазы плазматических мембран на 7 сутки холодового стресса совпадает по времени с окончанием периода закаливания растений, что позволяет рассматривать активацию Н^-АТФазы как часть общего механизма закаливания растений.

Действие солевого и осмотического стресса на растения ячменя.

Из особенностей образования и свойств рГ-АТФазного комплекса с белками 14-3-3 следует, что количество ФКСС в плазматических мембранах отражает количество активированных молекул Н^-АТФаз. Если обратиться к рисунку 2, то можно видеть, что у обоих сортов ячменя в изолированных плазматических мембранах заметно возрастает количество ФКСС в течение

первого часа солевого стресса. При дальнейшей стресс-экспозиции количество ФКСС уменьшается ниже уровня контроля и эти изменения совпадают с изменениями количества белков 14-3-3, ассоциированных с плазматической мембраной (рис. 3,1 и II). Совокупность этих данных, а также корреляция количества ФКСС и скорости выхода протонов при солевом стрессе (рис. 1, слева) указывают на то, что в основе наблюдаемых изменений транспортной активности фермента лежит ассоциация и диссоциация комплекса НГ-АТФазы с белками 14-3-3. Эксперименты с действием 0.3 М сорбита свидетельствуют в пользу того, что первоначальное увеличение скорости выхода протонов из отделенных корней ячменя, а также увеличение количества ФКСС в плазматических мембранах при солевом стрессе связано с ростом осмотичности среды. Последующее падение скорости выхода протонов и количества ФКСС обусловлено, вероятно, токсическим действием повышенной концентрации ионов Ыа+ в цитоплазме, что подтверждается действием 1лС1 (рис. 1, справа) и кинетикой накопления ионов натрия в корнях. Ко 2-му часу воздействия 150мМ КаС1, когда начинает снижаться скорость выхода протонов, в корнях уже накапливалось до 60-70% ионов натрия от максимально наблюдаемого.

Количественные расхождения в изменениях скорости выхода протонов и гидролазной активности КГ-АТФазы в плазматических мембранах при солевом стрессе вероятно связаны с изменением сопряжения в НГ-АТФазе между транспортом протонов и гидролизом АТФ, чем с изменением ее гидролазной активности. Подобную картину ранее наблюдали при осмотическом стрессе у суспензионной культуры клеток сахарной свеклы [ВаЬакоу а а1., 2000].

По результатам вестерн-блотгинга видно, что количество белков изоформ 14-3-3 в плазматических мембранах при солевом стрессе уменьшалось одинаковым образом (рис. 3,1П). Однако по наличию мажорной полосы белка 14-З-ЗВ можно сказать, что наибольшее количество именно этой изоформы представлено в плазматических мембранах. Возможно, что

изоформа белка 14-З-ЗВ по сравнению с другими более пригодна на роль белка-регулятора работы Н^-АТФазы.

В ряде случаев на иммуноблоте белков 14-3-3 (рис. 3, III) из плазматических мембран корней ячменя сорта М-121, подвергнутых солевому стрессу, была выявлена белковая полоса с мол. массой 35 кД. Возрастание кажущейся молекулярной массы полипептида (14-3-3 белка) на 4-5 кД вероятно связано с его фосфорилированием [Korthout and de Bout, 1998], которое может вызвать диссоциацию комплекса между 14-3-3 белками и Н4"-АТФаэой.

В научной периодике уже появлялись сведения об изменении экспрессии генов 14-3-3 белков при абиотическом стрессе in vitro. Например, в клетках суспензивной культуры табака, адаптированных к высокой концентрации NaCl (428мМ), уменьшается уровень экспрессии мРНК всех изоформ 14-3-3 белков [Chen et al., 1994]. Наши исследования посвящены измерению экспрессии генов 14-3-3 белков изоформ А, В н С на целых растениях, с учетом сортовых различий в устойчивости к стрессу. Очевидно, что экспрессия генов изоформ белков 14-3-3 меняется по разному. Также есть различия при сравнении 2-х сортов ячменя. Так как у сорта М-121 экспрессия 14-З-ЗВ падает в 2 раза за 2 часа стресса, а у сорта Эльф увеличивается в 2 раза. Исследование функций каждой из изоформ 14-3-3 белков является предметом дальнейших исследований.

Анализируя динамику сортовых различий транспортной активности Н^-АТФазы (рис. 1, слева) и количества ФКСС (рис. 2) в корнях проростков ячменя при солевом стрессе, можно отметить, что у солеустойчивого сорта М-121 все изменения протекают быстрее, чем у несолеустойчивого сорта Эльф. Сортовые различия в быстроте реакции организма на солевой стресс были установлены при сравнении 2-х различных по солеустойчивости сортов риса [Kawasaki et al., 2001]. В этой работе показано, что у солеустойчивого сорта риса профиль экспрессии генов через 15 минут солевого стресса совпадает с профилем экспрессии генов у неустойчивого сорта при 45 минутной

экспозиции. Т.е. «отставание» в экспрессии генов составляет 30 минут, что может иметь летальные последствия для неустойчивого растения. В связи с этим можно предположить, что быстрота, с которой комплекс ЬГ-АТФазы с белками 14-3-3 на плазматической мембране отвечает на осмотический стресс, может являться важным элементом в механизме солеустойчивости ячменя

Действие солевого стресса на растения томата.

Предварительные эксперименты по определению солеустойчивости сортов томата показали деление всего списка сортов на две контрастные группы (табл. 1). Для дальнейших исследований сорта томата Ранний китайский и Москвич приняты нами как солеустойчивые (первая группа), а сорта Микадо и Лидия как неустойчивые (вторая группа)

Накопление ионов натрия в различных частях растений томата на примере сорта Лидия проходит несколько иначе, чем у растений ячменя. Быстрое проникновение ионов натрия в клетки растения может говорить о довольно сильном различии в солеустойчивости этих культур - то, что томат является гликофитом, а ячмень занимает промежуточное положение между гликофитами и галофитами. Вероятно с быстрым накоплением ионов натрия связанно отсутствие реакции ФК-рецепторов на осмотический стресс.

В корнях проростков солеустойчивого сорта Ранний китайский при солевом стрессе наблюдалось снижение количества ФКСС на 40%. Это коррелирует с уменьшением количества ФКСС в корнях проростков ячменя солеустойчивого сорта М-121 при стрессе более 1 часа (рис. 2). Снижение активности Н*-АТФазы в корнях при солевом стрессе приводит к уменьшению накопления ионов натрия и тем самым к снижению токсического действия соли на растения. Возможно поэтому мы не наблюдаем снижения количества ФКСС в проростках не солеустойчивого сорта томата Микадо.

Иначе нужно рассматривать изменение количества ФКСС в плазматических мембранах растений при солевом стрессе длительностью 7 суток. Увеличение количества ФКСС в опытных вариантах по сравнению с контролем связанно, по видимому, с адаптацией растений к стрессу. И здесь

четко прослеживается деление 4 сортов томата на 2 группы по солеустойчивости и способности к адаптации, которое коррелирует с урожайностью при солевом стрессе. Поэтому можно предположить, что регуляция транспортной активности Н*-АТФазы белками 14-3-3 является частью механизма адаптации томата к солевому стрессу.

Действие солевого и осмотического стресса на апекс корня кукурузы.

Изменения транспортной активности Н*-АТФазы в корнях проростков ячменя при солевом стрессе наблюдались в корне без учета анатомического строения. Поэтому было интересно более детально рассмотреть изменения происходящие в апексе активного корня при солевом стрессе. Наше внимание сосредоточилось на первых 10 мм корня проростков кукурузы, как объекта наиболее подходящего для цитологического исследования.

При исследовании скорости протонных потоков в последовательных 800-мкм сегментах корня кукурузы установлено, что первый сегмент эащелачявает внешнюю среду, второй н третий закисляют. Цитологический анализ показал, что первый отрезок (0-800мкм) соответствует зоне корневого чехлика, второй (800-1600мкм) - основная часть меристемы, третий (16002400 мкм) - началу зоны роста клеток растяжением (рис. 5 .в). При 2-х часовом солевом стрессе происходит закисление по всей длине корня (рис. 5.г). При этом в 3-м отрезке транспортная активность Н*-АТФазы увеличивалась в 2 раза, а в первом в 5-6 раз. Для того, чтобы выяснить, что влияет на изменение транспортной активности Н*-АТФазы - токсичность ионов или гиперосмотичность внешней среды - использовали 300 мМ раствор сорбита изоосмотичный 150 мМ раствору N301 для создания осмотического стресса, и 5мМ раствор 1ДС1. Действие ШС! на скорость выхода протонов аналогично влиянию сорбита, а 1лС1 не оказывал достоверно отличимого от контроля эффекта.

Результаты экспериментов по иммунодетекции показывают, что вдоль корня кукурузы существует сложный профиль 14-3-3 белков, количество которых варьирует от минимума в микросомах из 1-го 800-мкм сегмента

корня до Количества в 50 раз большего в 6-м сегменте (рис. б.в). Эти данные пространственно коррелируют с максимальной скоростью выброса протонов и максимальным увеличением длины клеток (рис, 6.г). Таким образом, можно предположить, что активаторами Н*-АТФазы плазмалеммы в зоне роста клеток растяжением являются 14-3-3 белки.

Возможно, суммарно направленный внутрь поток протонов в корневом чеюшке (рис. 5. г) определяется низкой протон-транспортирующей активностью Н^-АТФазы. Это положение подтверждается данными иммунодегекции белков 14-3-3 в микросомах изолированных из 1-го сегмента корня, где представленность этих белков была наименьшей (рис. б.в). Присутствующие среди микросомапьных белков 1-го сегмента корня белки с мол. м, ~ 35 кД (рис. 6.6, помечено снежинкой на треке I), как уже обсуждалось выше, могут представлять собой фосфорилиро ванную форму белка 14-3-3 с низкой способностью связываться с Н*-АТФазой. Надо отметить, что гиперосмотический стресс (0.3 Осм) приводит к становлению суммарно направленного наружу потока протонов (закисления, рис. 5.д), сопровождающегося накоплением 14-3-3 белков в плазмалемме клеток (рис, 7,). Таким образом, регуляция при абиотическом стрессе Н*-АТФазы плазмалеммы белками 14-3-3 является тканеспецифичной, а наибольшие изменения транспортной активности фермента при изменении осмотичности среды наблюдаются в апикальной зоне.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволяют сформулировать общие представления о регуляция 1-Г-АТФазы плазматических мембран высших растений белками 14-3-3 при абиотическом стрессе. На ранних этапах солевого стресса в течение 30-60 мин в корнях проростков ячменя в ответ на повышение осмотичности среды происходит ассоциация димера белков 14-3-3 с С-концевым доменом 1-Г-АТФазы, Следствием этого является многократное увеличение транспортной активности фермента, обусловленное, вероятно, возрастанием сопряжения между выходом протонов и гидролазной

активностью Н^-АТФазы. В дальнейшем по мере накопления ионов Ыа+ в корнях проростков ячменя происходит диссоциация комплексов Н*-АТФазы с белками 14-3-3. Причиной которой является, по-видимому, фосфоршшрование белков 14-3-3. Диссоциация комплексов 1Г-АТФазы с белками 14-3-3 в проростках ячменя в ответ на солевой стресс происходит быстрее у солеустойчивого сорта Московский-121 по сравнению с неустойчивым сортом Эльф.

Рисунок 9. Схема рефляции Н^АТФаэы плазматических мембран высших растений при абиотическом стрессе.

В отличие от проростков ячменя в растениях томата количество комплексов Н*-АТФазы с белками 14-3-3 значительно возрастает при большей длительности (7 дней) солевого стресса. Существенно, что рост количества комплексов по величине коррелирует с устойчивостью сортов к высоким концентрациям ШС1.

При холодовом стрессе озимой пшеницы, томата и огурца ассоциация Н*-АТФазы с белками 14-3-3, а, следовательно, увеличение транспортной активности фермента наблюдается в наибольшей мере у растений озимой пшеницы и совпадает по времени с периодом закаливания.

На примере апекса корня проростков кукурузы установлено, что регуляция Н^-АТФазы плазматических мембран имеет тканеспецифический характер, а наибольшие изменения в транспортной активности фермента при ответе на изменение осмотичности среды происходят в зоне корневого 1 чехлика.

Корреляция между стрессоустойчивостъю растений и ассоциацией Н*-АТФазы с белками 14-3-3 указывает на то, что регулирование транспортной активности 1-Г-АТФаэы плазматических мембран белками 14-3-3 является неотъемлемой частью процесса адаптации высших растений к абиотическому стрессу.

ВЫВОДЫ

1. При внезапном солевом стрессе в ответ на изменение осмотичности среды в корнях проростков ячменя транспортная активность ЬГАТФазы плазматических мембран возрастает, а по мере накопления ионов натрия в тканях растения падает. Падение транспортной активности фермента у ячменя сорта Московский-123, устойчивого к высоким концентрациям ЫаС1, происходит быстрее, чем у неустойчивого сорта Эльф, что, возможно, свидетельствует о более быстрой адаптации растений устойчивого сорта к стрессу.

2. Экспрессия генов 14-3-3 белков в корнях проростков ячменя при солевом стрессе меняется изоформ-специфически. Наиболее контрастные изменения происходят в экспрессии гена изоформы 14-З-ЗВ - в устойчивом сорте Московский-121 экспрессия уменьшается в 2 раза, а в неустойчивом Эльф - увеличивается в 2 раза.

А,

3. На примере корня проростка кукурузы установлено, что регуляция Н*-АТФазы плазматических мембран белками 14-3-3 имеет тканеспецифический характер. Впервые показано, что наибольшие изменения в транспортной активности Н^-АТФазы в корнях проростков кукурузы в ответ на изменения осмотичности среды происходят в апикальной зоне.

4, Показано, что а плазматических мембранах растений томата и озимой пшеницы в ответ на абиотический стресс увеличивается количество комплексов Н*-АТФазы с белками 14-3-3.

5. Наблюдаемая корреляция между видовой, или сортовой стрессоустойчивостью растений и возрастанием количества комплексов Н*-АТФазы с белками 14-3-3 указывает на то, что регуляция Н+-АТФазы плазматических мембран белками 14-3-3 является частью механизма адаптации высших растений к абиотическому стрессу.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

!. Шанько A.B., Бабаков A.B. // Белки 14-3-3 регулируют активность 1-Г-насоса плазматических мембран корней ячменя Hordeum disticum L при солевом стрессе. 2002, Физ. раст. Т.49, № б, с. 847-853.

2. Шанько A.B., Месенко М.М., Клычников О.И., Носов A.B., Иванов В.Б. // Активность протонной помпы в растущей части корня кукурузы: корреляция с 14-3-3 белками и изменения при осмотическом стрессе. Биохимия (Москва), 2003,68, httpjn.bio.m5u.ru/bi0khimiva/jnpress/inttex btm]

3. Челышева В.В., Шанько A.B., Павлова З.Н., Бабаков A.B. И Генетическое разнообразие генов белков 14-3-3 и устойчивость растений к абиотическим стрессам. 11 Международная конференция "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", Москва, 18-19 октября, 2000 года.

4. Шанько A.B., Рогожин И.А., Кузовкина И.Н. // Реакция рецепторного комплекса фузикокцина в плазматических мембранах растений на солевой и холодовой стрессы. V Международная конференция "Регуляторы роста и развития растений", Москва, 29 июня - 1июля, 1999.

Усл. печ. я. 1,6_Зак. 421_Тираж 100 экз.

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

РНБ Русский фо

2006-4 37236

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шанько, Андрей Викторович

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Стратегия восприятия стресса у растений.

1.2. Передача сигнала при абиотическом стрессе.

1.3. Воздействие солевого и осмотического стрессов на растения.

1.4. Воздействие низких температур на растения.

1.5. 14-3-3 белки — клеточные регуляторы растительного метаболизма.

1.6. 14-3-3 белки как активаторы Н*-АТФазы плазматических мембран.

1.7. Цели и задачи исследования.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Выращивание растений и создание абиотических стрессов.

2.3. Определение морозостойкости озимой пшеницы.

2.4. Определение солеустойчивости сортов ячменя.

2.5. Определение содержания ионов N0 в тканях растений.

2.5. Измерение транспортной активности Н*-АТФазы в корнях проростков ячменя.

2.6. Выделение плазматических мембран из растений.

2.7. Измерение количества ФКСС в плазматических мембранах растений.

2.8. Измерение АТФ-гидролазной активности Н' -АТФазы в плазматических мембранах растений.

2.9. Вестерн блоттинг белков 14-3-3.

2.10. Выделение РНК из растений.

2.11. Синтез кДНК (реакция обратной транскрипции).

2.12. Дизайн праймеров.

2.13. ПЦР.

2.14. Измерение экспрессии генов 14-3-3 белков.

2.15. Определение меристемы и зоны перехода клеток к растяжению в корнях проростков кукурузы.

2.16. Определение зон закисления и зощелачивания внешней среды апексом корня кукурузы.

2.17. Измерение транспортной активности Н*-АТФазы в корнях проростков кукурузы.

2.18. Выделение мембран, ДСН-ПААГЭ и иммунодетекция 14-3-3 белков из корней проростков кукурузы.

2.19. Статистическая обработка данных.

2.20. Реактивы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. ДЕЙСТВИЕ СОЛЕВОГО И ОСМОТИЧЕСКОГО СТРЕССОВ НА РАСТЕНИЯ ЯЧМЕНЯ НОЯОЕим Ш8Т1СиМ Ь

3.1.1. Определение солеустойчивости сортов ячменя.

3.1.2. Накопление ионов Ыа* в корнях проростков ячменя при солевом стрессе.

3.1.3. Измерение выхода протонов из отделенных отрезков корней проростков ячменя.

3.1.4. Измерение АТФ-гидролазной активности Н -АТФазы, количества ФКСС, количества белка Н -АТФазы и белков 14-3-3 в препаратах плазматических мембран из корней проростков ячменя.

3.1.5. Измерение экспрессии изоформ генов 14-3-3 белков в корнях проростков ячменя.

3.2. Действие солевого и осмотического стрессов на апекс корня проростков кукурузы

3.2.1. Определение меристемы и зоны перехода к растяжению клеток апекса корня проростков кукурузы.

3.2.2. Измерение тока протонов в отрезках апекса корня проростков кукурузы.

3.2.3. Иммунодетекция белков 14-3-3 по длине апекса корня проростков кукурузы.

3.3. Действие солевого стресса на растения томата.

3.3.1. Определение солеустойчивых сортов томата и накопления ионов Иа в растениях при солевом стрессе.

3.3.2. Измерение количества ФКСС в целых растениях томата, количества ФКСС и ингибирования роста корня в проростках томата при солевом стрессе.

3.4. Действие холодового стресса на растения томата, огурца и озимой пшеницы.

3.4.1. Определение морозостойкости пшеницы.

3.4.2. Измерение количества ФКСС в проростках озимой пшеницы при холодовом стрессе.

3.4.3. Измерение количества ФКСС в томатах, огурцах и пшенице при холодовом стрессе.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Действие холодового стресса на растения томата, огурца и озимой пшеницы.

4.2. Действие солевого и осмотического стресса на растения ячменя.

4.3. Действие солевого стресса на растения томата.

4.4. Действие солевого и осмотического стресса на апекс корня кукурузы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование регуляции Н +-АТФазы плазматических мембран высших растений белками 14-3-3 при абиотическом стрессе"

Низкая температура, засуха и высокие концентрации соли - основные стрессовые факторы, неблагоприятно воздействующие на рост и развитие растений и снижающие урожайность сельскохозяйственных культур. Исследование молекулярных механизмов восприятия сигналов внешней среды и передачи их внутри клетки для активации адаптивного ответа — одна из фундаментальных задач современной биологии растений. Понимание молекулярных основ адаптации растений к стрессу имеет значение в селекции и биотехнологии, для проведения рационального скрещивания при выведении новых сортов и получении трансгенных растений.

Ведущую роль в поддержании гомеостаза клеток растений при абиотическом стрессе играет Н-АТФаза плазматических мембран, а одними из известных регуляторов активности фермента являются белки 14-3-3. Белки 14-3-3 представляют собой семейство гидрофильных, консервативных регуляторных белков, широко распространенных в клетках животных и растений. В аминокислотной последовательности белков 14-3-3 имеется консервативная центральная область, ответственная за связывание с белками-мишенями, и вариабельная область С-конца, обладающая изоформ-специфичными функциями |Тег1, 2000]. Комплексобразование между белками 14-3-3 и Н+-АТФазой происходит при фосфорилировании специфического мотива С-концевого автоингибиторного домена Н+-АТФазы, при этом фермент активируется [Оески^ ег а1. 1997]. Активация фермента приводит к гиперполяризации плазматической мембраны, увеличению АрН между цитоплазмой и периплазмой и, следовательно, к возрастанию движущей силы для потоков ионов и метаболитов внутрь клеток. Ранее в нашей лаборатории было обнаружено участие 14-3-3 белков в регуляции активности Н+-АТФазы в плазматических мембранах протопластов и клетках суспензионной культуры сахарной свеклы при абиотическом стрессе [СЬе^Ьеуа ег а1. 1999, ВаЬакоу е1 а1. 2000]. В настоящей работе основное внимание уделено регуляции Н -АТФазы плазматических мембран белками 14-3-3 в целых растениях при ответе на различные абиотические стрессы - солевой, осмотический и холодовой.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Стратегия восприятия стресса у растений

Абиотический стресс - негативное воздействие на растение избытка или недостатка физических и (или) химических факторов окружающей среды. Исходя из современной теории стрессоустойчивости растений, как способности организма выживать в условиях стресса, устойчивость (resistance) состоит из 2-х механизмов: механизма избежания стресса (stress avoidance) и механизма сопротивления, или непосредственно устойчивости (stress tolerance) [Biochemistry & mol.biol. of plants, 2000]. Примером использования механизма избежания стресса могут служить некоторые растения пустыни. Например, верблюжья колючка, широко распространенная в аридных областях, имеет корни длинной до 20м, которые достигают водоносного горизонта на большой глубине. Растения эфемеры засушливых областей, например тюльпаны, также являются примером стрессоустойчивости избежанием. Примером стрессоустойчивости (tolerance) может служить суккулент Cereus giganteus. Этот гигантский кактус имеет фотосинтезирующий стебель, насыщенный водой, запасы которой помогают пережить довольно продолжительный засушливый сезон [Biochemistry & mol.biol. of plants, 2000]. Различные приспособления, помогающие переносить стресс, такие как глубоко разросшаяся корневая система, наполненный водой стебель, опушенная нижняя сторона листьев являются постоянными, генетически определенными чертами, присущие виду и вне состояния стресса. Данная устойчивость - адаптация (adaptations) является свойством, как организма, так и популяции. В селекции, при выведении новых сортов растений, способных произрастать в неблагоприятных условиях, используют генетически закрепленные адаптационные изменения.

Устойчивость растений к абиотическому стрессу может быть классифицирована по разным уровням структурной организации растений (от организменного до молекулярного). На каждом уровне организации существуют разнообразные приспособления адаптации к стрессу или избежания стресса.

Другой механизм устойчивости называется закаливанием (ассНтайоп). Это процесс изменения индивидуального организма в ответ па изменения факторов окружающей среды. В течение процесса закаливания организм изменяет свой гомеостаз в отвег на постепенно усиливающийся стресс-фактор. Например, растения умеренного климата, изменяющие свой метаболизм каждое время года. Зимующие злаки, летом не способные выдерживать даже слабые заморозки, осенью проходят период реорганизации, как на клеточном уровне, так и на тканевом, после которого они легко переносят даже сильные морозы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шанько, Андрей Викторович

6. ВЫВОДЫ

1. При внезапном солевом стрессе в ответ на изменение осмотичности среды в корнях проростков ячменя транспортная активность Н+АТФазы плазматических мембран возрастает, а по мере накопления ионов натрия в тканях растения падает. Падение транспортной активности фермента у ячменя сорта Московский-121, устойчивого к высоким концентрациям NaCl, происходит быстрее, чем у неустойчивого сорта Эльф, что, возможно, свидетельствует о более быстрой адаптации растений устойчивого сорта к стрессу.

3. На примере корня проростка кукурузы установлено, что регуляция Н+-АТФазы плазматических мембран белками 14-3-3 имеет тканеспецифический характер. Впервые показано, что наибольшие изменения в транспортной активности Н+-АТФазы в корнях проростков кукурузы в ответ на изменения осмотичности среды происходят в апикальной зоне.

4. Показано, что в плазматических мембранах растений томата и озимой пшеницы в ответ на абиотический стресс увеличивается количество комплексов Н+-АТФазы с белками 14-3-3.

5. Наблюдаемая корреляция между видовой, или сортовой стрессоустойчивостью растений и возрастанием количества комплексов Н+-АТФазы с белками 14-3-3 указывает на то, что регуляция Н+-АТФазы плазматических мембран белками 14-3-3 является частью механизма адаптации высших растений к абиотическому стрессу.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволяют сформулировать общие представления о регуляции Н-АТФазы плазматических мембран высших растений белками 14-3-3 при абиотическом стрессе. На ранних этапах солевого стресса в течение 30-60 мин в корнях проростков ячменя в ответ на повышение осмотичности среды происходит ассоциация димера белков 14-3-3 с С-концевым доменом 1Г-АТФазы. Следствием этого является многократное увеличение транспортной активности фермента, обусловленное, вероятно, возрастанием сопряжения между выходом протонов и гидролазной активностью Н-АТФазы. В дальнейшем по мере накопления ионов !Ма" в корнях проростков ячменя происходит диссоциация комплексов Н -АТФазы с белками 14-3-3. Причиной которой является, по-видимому, фоефорилировапие белков 14-3-3. Диссоциация комплексов Н -АТФазы с белками 14-3-3 в проростках ячменя в ответ на солевой стресс происходит быстрее у солеустойчивого сорта Московский-121 по сравнению с неустойчивым сортом Эльф.

24 часа ячмень траюиентная ассоциация комплекса Н"-АТФа)ы с белками 14-3-3

7 дней томат ассоциация комплекса Н'-АТФачы с белками 14-3-3 томат слабое увеличенне количества комплексов Н*-АТФазы с белками 14-3-3

7 дней озимая пшеница 017рец существенное увеличение паление количества комплексов количества комплексов Н-АТФазы с белками 14-3-3

Н~-АТФачы с телками 14-3-3

Рисунок 5.1. Схема регуляции Н+-АТФазы плазматических мембран высших растений при абиотическом стрессе.

В отличие от проростков ячменя в растениях томата количество комплексов Н+-АТФазы с белками 14-3-3 значительно возрастает при большей длительности (7 дней) солевого стресса. Существенно, что рост количества комплексов по величине коррелирует с устойчивостью сортов к высоким концентрациям №С1.

При холодовом стрессе озимой пшеницы, томата и огурца ассоциация Н+-АТФазы с белками 14-3-3, а, следовательно, увеличение транспортной активности фермента наблюдается в наибольшей мере у растений озимой пшеницы и совпадает по времени с периодом закаливания.

На примере апекса корня проростков кукурузы установлено, что регуляция Н -АТФазы плазматических мембран имеет тканеспецифический характер, а наибольшие изменения в транспортной активности фермента при ответе на изменение осмотичности среды происходят в зоне корневого чехлика.

Корреляция между стрессоустойчивостью растений и ассоциацией Н+-АТФазы с белками 14-3-3 указывает на то, что регулирование транспортной активности Н+-АТФазы плазматических мембран белками 14-3-3 является неотъемлемой частью процесса адаптации высших растений к абиотическому стрессу.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шанько, Андрей Викторович, Москва

1. Abarca D., Madueno F., Martinez-Zapater J.M., Salinas J. (1999) Dimerization of Arabidopsis 14-3-3 proteins: Structural requirements •within the N-terminal domain and effect of calcium. FEBS Lett. 462. 377-382.

2. Aducci P., Marra M. (1997) Phytotoxins as molecular signals, in Signal Transduction in Plants (Aducci, P., ed.), pp. 83-105, Birkhauser Verlag.

3. Aducci P., Marra M., Fogliano V., Fullioni M.R. (1995) Fusicoccin Receptors: Perception and Transduction of the Fusicoccin Signal. J. Exp. Bot. V. 46. P. 14631478.

4. Aguilar P.S., Hernandez-Arriaga A.M., Cybulski L.E., Erazo A.C., de Mendoza D., (2001) Molecular basis of thermosensing: a two-component signal transduction thermometer in Bacillus subtilis. EMBO J. 20: 1681-1691.

5. Aitken A. (1996) 14-3-3 and its possible role in co-ordinating multiple signalling pathways. Trends Cell Biol. 6: 341-347.

6. Aitken A., Howell S., Jones D., Madrazo J., Patel Y. (1995a) 14-3-3 a and 6 are the phosphorylated forms of Raf-activating 14-3-3 p and J. Biol. Chem. 270: 5706-5709.

7. Alscher R.G., Donahue J.L., Cramer C.L. (1997) Reactive oxygen species and antioxidants: relationships in green cells. Physiol. Plant. 100: 224-233.

8. Antikainen M., Griffith M. (1997) Antifreeze protein accumulation in freeze-tolerant cereals. Physiol. Plant. 99: 423-432.

9. Antikainen M., Griffith M., Zhang J., Hon W.-L., Yang D.S.C., Pihakaski-Maunsbach K. (1996) Immunolocalization of Antifreeze Proteins in Winter Rye Leaves, Crowns, and Roots by Tissue Printing. 110:845-857.

10. Apse M.P., Aharon G.S., Snedden W.A., Blumwald E. (1999) Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+ antiport in Arabidopsis. Science 285: 1256-1258.

11. Athwal G.S. et al. (1998) Biological significance of divalent metal ion binding to 14-33 proteins in relationship to nitrate reductase inactivation. Plant Cell Physiol. 39. 10651072.

12. Athwal, G.S., Huber, J.L., and Huber, S.C. (1998b). Phosphorylated nitrate reductase and 14-3-3 proteins: Site of interaction, effects of ions, and evidence for an amp-binding site on 14-3-3 proteins. Plant Physiol. 118, 1041-1048.

13. Ayala F., O'Leary J.W., Schumaker K.S. (1996) Increased vacuolar and plasma membrane H+-ATPase activities in Salicornia bigelovii Torr. in response to NaCl. J. Exp. Bot. 294-.25-32.

14. Babakov A.V., Chelysheva V.V., Klychnikov O.I., Zorinyanz S.E., Trofimova M.S., De Bour A.H. Involvement of 14-3-3 Proteins in the Osmotic Regulation of H+-ATPase in Plant Plasma Membranes // Planta. 2000. V. 211. P. 446-448.

15. Bachmann M. et al. (1996) The inhibitor protein of phosphorylated nitrate reductase from spinach (Spinacia oleracea) leaves is a 14-3-3 protein. FEBS Lett. 387. 127-131.

16. Bachmann M. et al. (1996c) Identification of Ser-543 as the major regulatory phosphorylation site in spinach leaf nitrate reductase. Plant Cell 8. 505-517.

17. Ballesteros E., Blumwald E., Donaire J.P., Belver A. (1997) Na+/H+ antiport activity in tonoplast vesicles from sunflower roots induced by NaCl stress. Physiol. Plant. 99: 328-334.

18. Bartolo M.H. and Carter J.V. (1991) Effect of microtubule stabilization on the freezing tolcrancc ofmcsophyll cells of spinach. Plant.Physiol. 97:403.

19. Binzel M.L. (1995) NaCl-induced accumulation of tonoplast and plasma membrane H+-ATPase message in tomato. Physiol. Plant. 94: 722-728.

20. Binzel M.L., Hess F.D., Bressan R.A., Hasegawa P.M. (1988) Intracellular compartmentation of ions in salt adapted tobacco cells. Plant Physiol. 86: 607-614.

21. Biochemistry & Molecular Biology of Plants. 2000. Buchanan B.B., Gruissem W., Jones R.L. ASPP. 1367p.

22. Blumwald E., Poole R.J. (1987) Salt tolerance in suspension cultures of sugar beet. Induction of Na+/H+ antiport activity at the tonoplast by growth in salt. Plant Physiol. 83: 884-887.

23. Botrel A. and Kaiser W.M. (1997) Nitrate reductase activation state in barley roots in relation to the energy and carbohydrate status. Planta. 201. 496-501.

24. Bowler C. Montagu M V. Inxe D. (1992) Superoxide Dismulase and Stress Tolerance Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology Vol. 43, 83-1 16.

25. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.

26. Braselmann S. and McCormick F. (1995) Bcr and Raf form a complex in vivo via 14-3-3s. EMBO J. 14. 4839-4848.

27. Bremberger C., Liittge U. (1992) Dynamics of tonoplast proton pumps and other tonoplast proteins of Mesembryanthemum crystallinum L. during the induction of crassulacean acid metabolism. Planta 188: 575-580.

28. Bunney T.D., van Walraven H.S., de Boer A.H. (2001) 14-3-3 protein is a regulator of the mitochondrial and chloroplast ATP synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98. 4249-4254.

29. Camoni L., Harper J.F., Palmgren M.G. (1998) 14-3-3 proteins activate a plant calcium dependent protein kinase (CDPK). FEBS Lett. 430: 381-384.

30. Camoni, L., Visconti, S., Marra, M., and Aducci. P. (2001) Adenosine 5'-Monophosphate Inhibits the Association of 14-3-3 Proteins wilh Ihe Plant Plasma Membrane H+-ATPase. J. Biol. Chcm., 276. 31709-31712.

31. Chen H.H., Li P.H., Brenner M.L. (1983) Involvement of abscisic acid in potato cold acclimation. Plant Physiol. 71: 362-65.

32. Chen T.H.H., Gusta L.V. (1983) Abscisic acid-induced freezing resistance in cultured plant cells. Plant Physiol. 73: 71-75.

33. Chung H., Sehnke P.C., Ferl R.J. (1999) The 14-3-3s: cellular regulators of plant metabolism. Trends Plant Sci. 4. 367-371.

34. Chung H.-J., Sehnke P.C., Ferl R.J. (1999) The 14-3-3 proteins: cellular regulators of plant metabolism. Trends Plant Sci. 4: 367-371.

35. Close T.J. (1997) Dehydrins: a commonalty in the response of plants to dehydration and low temperature. Physiol. Plant. 100: 291-296.

36. Cloutier Y., Andrews C.J. (1984) Efficiency of cold hardiness induction by desiccation stress in four winter cereals. Plant Physiol. 76: 595-98.

37. Colombo R., Cerana R. (1993) Enhanced activity of tonoplast pyrophosphatase in NaCl-grown cells of Daucus carota. J. Plant Physiol. 142: 226-229.

38. Cotelle, V., Meek, S.E., Provan, F., Milne, F.C., Morrice, N., MacKintosh, C. (2000). 14-3-3s regulate global cleavage of their diverse binding partners in sugar-starved Arabidopsis cells. EMBO J. 19, 2869-2876.

39. Crawford N.M. (1995) Nitrate: nutrient and signal for plant growth. Plant Cell 7. 859-868.

40. Dalai, S.N., Schweitzer, C.M., Gan, J., and DeCaprio, J.A. (1999). Cytoplasmic localization of human cdc25C during interphase requires an intact 14-3-3 binding site. Mol. Cell. Biol. 19,4465-4479.

41. Dave R.S. Mitra R.K. (1998) A low temperature induccd apoplastic protein isolated from Arachis in-pogaea.PhytocIiemistry. 49:623.

42. Davezac, N., Baldin, V., Gabrielli, B., Forrest, A., Theis-Febvre, N., Yashida, M., and Ducommun, B. (2000). Regulation of CDC25B phosphatases subcellular localization. Oncogene 19,2179-2185.

43. Desikan, R., Mackerness, S.A.H., Hancock, J.T., and Neill, S.J. (2001) Regulation of the Arabidopsis transcriptome by oxidative stress. Plant Physiol. 127, 159-172.

44. Emi T., Kinoshita T., Shimazaki K. (2001) Specific Binding of vfl4-3-3a Isoform tothe Plasma Membrane H+-ATPase in Rsponse to Blue Light and Fusicoccin in Guard Cell of Broad Bean. Plant Physiol. V. 125 P. 1115-1125.

45. English, D. (1996). Phosphatidic acid: A lipid messenger involved in intracellular and extracellular signaling. Cell. Signal. 8: 341-347.

46. Epstein E. (1998) How Calcium Enhances Plant Salt Tolerance. Science. V. 280. P. 1906-1907.

47. Erickson, R. O., Sax, K. B. (1956) Rates of cell division and cell elongation in the growth of the primary root of/ea mays. Proc. Anier. Phil. Soc. 100. 499-514.

48. Fasano. J. M. Swanson, S. J. Blancaflor. E. B., Dowd, P. E. Kao, 1.-11. and Gilrov. S. (2001) Changes in Root Cap pH Are Required for the Gravity Response of the

49. Arabidopsis Root. Plant Cell, 13, 907-921.

50. Feldman. L. (1984) Regulation of root development. Annu. Rev. Plant Physiol. 35: 223-242.

51. Felle. H. H. (1998) The apoplastic pH of the Zea mays root cortex as measured with pll-sensitive microelcctrodcs: aspects of regulation. J. Exp. Bot., 49. 987-995.

52. H 62.Ferl R.J. (1996) 14-3-3 proteins and signal transduction. Annu. Rev. Plant Physiol.

53. Plant Mol. Biol. 47:49-73.

54. Feyerabend M. and Weiler E.W. (1988) Characterization and localization of fusicoccin-binding sites in leaf tissues probed with a novel radioligand. Planta 174: 115-122.

55. Finnie C., Borch J., Collinge D.B. (1999) 14-3-3 proteins: eukaryotic regulatory ^ proteins with many functions. Plant Mol. Biol. 40: 545-554.

56. Foyer C.I I., Dcscourviercs P. Kuncrt K.J. (1994) Protection against oxygen radicals: an important defence mechanism studied in transgenic plants. Plant Cell and Environ. Plant. Cell Environ. 17:507.

57. Foyer, C.H. et al. (1998) Drought-induced effects on nitrate reductase activity and mRNA and on the coordination of nitrogen and carbon metabolism in maize leaves, Plant Physiol. 117, 283-292.

58. Frank, W., Munnik, T., Kerkmann, K., Salamini, F., and Bartels, D. (2000). Water deficit triggers phospholipase D activity in the resurrection plant Craterostigma plantagineum. Plant Cell 12, 111-123.

59. Fullone M.R. et al. (1998) Fusicoccin effect on the in vitro interaction between plant 14-3-3 proteins and plasma membrane H+-ATPase. J. Biol. Chem. 273, 7698-7702.

60. Garbarino J., DuPont F.M. (1988) Rapid induction of Na+/H+ exchange activity in barley root tonoplast. Plant Physiol. 89: 1-4.

61. Greenway H, Munns R (1980) Mechanisms of salt tolerance in nonhalophytes. Annu. Rev. Plant. Physiol. 31: 149-190.

62. Greenway H, Munns R (1980) Mechanisms of salt tolerance in nonhalophytes. Annu. Rev. Plant. Physiol. 31: 149-190.

63. Gregersen P.L., Thordal-Christensen H., Förster H., Collinge D.B. (1997) Differential gene transcript accumulation in barley leaf epidermis and mesophyll in response to attack by Blumeria graminis f. sp. hordey. Physiol. Mol. Plant Path. 51: 85-97.

64. Griffith M., Antikainen M., Hon W.-C., Pihakaski-Maunsbach K., Yu X.-M., Chun Y.U., Yang S.C. (1997) Antifreeze proteins in winter rye. Physiol. Plant. 100: 327-332.

65. Guy C.L. (1990) Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 41: 187-223.

66. Halfter U., Ishitani M., Zhu J.K., (2000) The Arabidopsis SOS2 proteinkinase physically interacts with and is activated by the calcium-binding protein SOS3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3730-3734.

67. Harmon, A.C., Gribskov, M., Gubrium, E., and Harper, J.F. (2001) The CDPK superfamily of protein kinase. NewPhytol. 151, 175-183.

68. Hasegawa P.M., Bressan R.A., Zhu J.K., Bohnert H.J., (2000) Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annu. Rev. Plant Mol. Plant Physiol. 51: 463499.

69. Hassidim M., Braun Y., Lerner H.R., Reinhold L. (1990) Na+/H+ and K+/H+ antiport in root membrane vesicles isolated from the halophyte Atriplex and the glycophyte cotton. Plant Physiol. 94: 1795-1801.

70. Hepburn H.A., Nylor F.L., Stokes D.I. (1986). Electrolyte leakage from winter barley tissue as indicator of winterhardiness. Ann. Appl. Biol. 108: 164-165.

71. Hirayama T., Ohto C., Mizoguchi T., Shinozaki K. (1995) A gene encoding phosphatidylinosotol-specific phospholipase C is induced by dehydration and salt stress in Arabidopsis thaliana. PNAS 92: 3903-3907.

72. Holtman W.L., Roberts M.R., Oppedijk B.J., Testerink C., van Zeijl M.J., Wang M. (2000b) 14-3-3 proteins interact with a 13-lipoxygenase, but not with a 9-lipoxygenase. FEBS Lett. 474 48-52.

73. Holtman W.L., Roberts M.R., Wang M. (2000a) 14-3-3 proteins and a 13-lipoxygenase form associations in a phosphorylation-dependent manner. Biochem. Soc. Trans. 28. 834-836.

74. Huber S.C. and Huber J.H. (1996) Role and regulation of sucrose-phosphate synthase in higher plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47. 431-444.

75. Huber, S.C. et al. (1996) Post-translational regulation of nitrate reductase activity: a role for Ca2+ and 14-3-3 proteins. Trends Plant Sci. 1. 432-438.

76. Hughes M.A., Dunn M.A. (1990) The effect of temperature on plant growth and development. Biotechnol. Gen Engin Rev 8: 161-88.

77. Hughes M.A., Dunn M.A. (1996) The molecular biology of plant acclimation to low temperature. J. Exp. Bot. 47: 291-305.

78. Igarashi, D., Ishida, S., Fukazawa, J., and Takahashi, Y. (2001). 14-3-3 proteins regulate intracellular localization of the bZIP transcriptional activator RSG. Plant Cell 13, 2483-2497.

79. Ishitani M., Liu J., Halfter U., Kim C.S., Wei M., Zhu J.K., (2000) SOS3 function in plant salt tolerance requires myristoylation and calcium-binding. Plant Cell 12: 16671677.

80. Ivanov, V. B. and Maximov. V. N. (1999) The change in the relative rate of cell elongation along the root meristcm and the apical region of the elongation zone. Russ. J. Plant Physiol. 46. 73-82.

81. Jacob, T., Ritchie, S., Assmann, S.M., and Gilroy, S. (1999). Abscisic acid signal transduction in guard cells is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 9, 12192-12197.

82. Jahn T., Fuglsang A.T., Olsson A., Brüntrup I.M., Collinge D.B., Volkman D., Sommarin M., Palmgren M.G., Larsson C. (1997) The 14-3-3 protein interacts directly with the C-terminal region of the plasma membrane H+-ATPase. Plant Cell 9: 18051814.

83. Jahn, T. Baluska. F., Michalkc, W. Harper, J. F. and Volkmann D. (1998) Identification of a calmodulin-rcgulated calcium ATPase in the ER. Physiol. Plant. 104, 311-316.

84. Jeffree C.E., Read N.D., Smith J.A.C., Dale J.E. (1987) Water droplets andice deposits in leaf intercellular spaces: redistribution of water during cryofixation for scanning electron microscopy. Planta 172: 20-37.

85. Jelich-Otlmann, C., Weiler. E. W. and Oecking. C. (2001) Binding of regulatory 14-33 proteins to the C-terminus of the plant plasma membrane i P-ATPase involves part of ist autoinhibitory domain. J. Biol. Chcm. 276, 39852-39857.

86. Jonak C., Kiegerl S., Ligterink W., Baker P.J., Huskisson N.S., Hirt H. (1996) Stress signaling in plants: A mitogen-activated protein kinase pathway is activated by cold and drought. PNAS 93: 11274-11279.

87. Jones D.H.A., Ley S., Aitken A. (1995) Isoforms of 14-3-3 protein can forn gomo-and heterodimers in vivo and in vitro: implications for functions as adaptor protein. FEBS Lett. 368. 55-58.

88. Katz A., Pick U., Avron M. (1992) Modulation of Na+/H+ antiporter activity by extreme pH and salt in the halotolerant alga Dunaliella salina. Plant Physiol. 100: 1224-1229.

89. Kawasaki S., Borchrt C., Deyholos M., Wang H., Brazille S., Kawai K., Galbraith D., Bohnert H.J. (2001) Gene expression profiles during the initial phase of salt stress in rice. Plant Cell 00-0448 revised.

90. Keith C.N., McKersie B.D. (1986) The effect of abscisic acid on the freezing tolerance of callus cultures of Lotus corniculatus L. Plant Physiol. 80: 766-70.

91. Kerr G.P. Carter J.V. (1990) Relationship between freezing tolerance of root-tip cells and cold stability of microtubules in rye (Secale cereale. L. cv Puma). Plant Physiol. 93:77.

92. Klimov S.V. Astahova N.V. Trunova T.l. (1999) Changes in Photosynthesis. Dark Respiration Rales and Photosynthetic Carbon Partitioning in Winter Rye and Wheat Seedlings during Cold Hardening. J. Plant Physiol. 155:734.

93. Knight H., (2000) Calcium signaling during abiotic stress in plants. Int. Rev. Cytol. 195: 269-325.

94. Knight H., Trewavas A J., Knight M.R. (1996) Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation. Plant Cell 8: 489-503.

95. Kopka J., Pical C., Gray J.E., Muller-Rober B. (1998). Molecular and enzymatic characterization of three phosphoinositide-speciflc phospholipase C isoforms from potato. Plant Physiol. 116: 239-250.

96. Korthout H.A.A.J. and de Boer A.H. (1994) A fiisicoccin binding protein belongs to the family of brain protein horologes. Plant Cell. 6. 1682-1692.

97. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

98. Larsson C., Sommarin M., Widell S. (1994) Isolation of highly purified plasma membrane and the separation of inside out and right-side out vesicles. Methods Enzymol. 226:451-469.

99. Lee Y., Choi Y.B., Suh J., Lee J., Assmann S.M., Joe C.O., Keller J.F., Crain R.C. (1996). Abscisic acid-induced phosphoinositide turnover in guard cell protoplasts of Viciafaba. Plant Physiol. 110: 987-996.

100. Levitt J. (1980) Responses of plants to environmental stresses. V.2. NY. Acad. Press. 607p.

101. Liu J., Ishitani M., Halfter U., Kim C.S., Zhu J.K. (2000) The Arabidopsis thaliana SOS2 gene encodes a protein kinase that is required for salt tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3735-3740.

102. Liu J., Zhu J.K. (1998) A calcium sensor homolog required for plant salt tolerance. Science 280: 1943-1945.

103. Liu J., Zhu J.K., (1997a) An Arabidopsis mutant that requires increased calcium for potassium nutrition and salt tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 14960-14964.

104. Liu Y.-C., Liu Y., Elly C„ Yoshida H„ Lipkowitz S., Altman A. (1997) Serine phosphorylation of Cbl induced by phorbol ester enhances its association with 14-3-3 proteins in T cells via a novel serine-rich motif. J. Biol. Chem. 272: 9979-9985.

105. Livingston D.P. Ill, Henson C.A. (1998) Apoplastic Sugars, Fructans, Fructan Exohydrolase, and Invertase in Winter Oat: Responses to Second-Phase Cold1. Hardening. 116:403-408.

106. Lu G. DeLisle A., de Vetten N.C., Ferl R.G. (1992) Brain proteins in plants: an Arabidopsis homolog to neurotransmitter pathway activators is part of a DNA binding complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89. 11490-11494.

107. Lu G. et al. (1994) Phosphorylation and calcium binding properties of an Arabidopsis GF14 brain protein homolog. Plant Cell 6. 501-510.

108. LUttge U. (1993) The role of crassulacean acid metabolism (CAM) in the adaptation of plants to salinity. New Phytologist 125: 59-71.

109. MacKintosh, C., and Meek, S.E. (2001). Regulation of plant NR activity by reversible phosphorylation, 14-3-3 proteins and proteolysis. Cell. Mol. Life Sci. 58, 205-214.

110. Malerba, M., and Bianchetti, R. (2001). 14-3-3 protein-activated and autoinhibited ♦ forms of plasma membrane H-ATPase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 286, 984990.

111. Martin, M.L., and Busconi, L. (2001). A rice membrane-bound calcium-dependentprotein kinase is activated in response to low temperature. Plant Physiol. 125, 14421449.

112. Martin, M.L., and Busconi, L. (2001). A rice membrane-bound calcium-dependent protein kinase is activated in response to low temperature. Plant Physiol. 125, 14421449.

113. Matsumoto H., Chung G.C. (1988) Increase in proton-transport activity as anadaptive response of barley roots to NaCl stress. Plant Cell Physiol. 29 : 1133-1140.

114. Meyer C., Waldkotter R., Sprenger A., Schlosser U.G., Lether M.,

115. Weiler E.W. (1993) Survey of the taxonomic and tissue distribution of microsomal binding sites for the non-host selective fungal phytotoxin, fusicoccin. Zeitschrift fur Naturforschung 48c: 595-602.

116. Meyer K., Leube M.P., Grill E. (1994) A protein phosphatase 2C involved in ABA signal transduction in Arabidopsis thaliana. Science 264: 1452-1455.

117. Mikami K„ Katagiri T., Luchi S., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (1998) A gene encoding phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase is induced by water stress and abscisic acid in Arabidopsis thaliana. Plant J. 15: 563-568.

118. Monroy A. F., Dhindsa R.S. (1995) Low-temperature signal transduction: induction of cold acclimation-specific genes of alfalfa by calcium at 25°C. Plant Cell 7: 321-331.

119. Monroy A.F., Sangwan V., Dhindsa R.S. (1998) Low temperature signal transduction during cold acclimation: protein phosphatase 2A as an early target for cold-inactivation. Plant J. 13: 653-660.

120. Monroy A.F., Sarhan F., Dhindsa R.S. (1993) Cold-induced changes in freezing tolerance, protein phosphorilation and gene expression. Plant Physiol. 102: 1227-35.

121. Moorhead G., Douglas P., Morrice N., Scarabel M., Aitken A., MacKintosh C. (1996) Phosphorylated nitrate reductase from spinach leaves is inhibited by 14-3-3 proteins and activated by fusicoccin. Curr. Biol. 6: 1104-1113.

122. Munnik T., Irvine R.F., Musgrave A. (1998). Phospholipid signaling in plants. Biochim. Biophy. Acta 1389: 222-272.

123. Munnik, T„ Meijer, H.J.G., ter Riet, B., Frank, W., Bartels, D., and Musgrave, A. (2000). Hyperosmotic stress stimulates phospholipase D activity and elevates the levels of phosphatidic acid and diacylglycerol pyrophosphate. Plant J. 22, 147-154.

124. Murata Y., Obi I., Yoshihashi M., Noguchi M, Kakutani T. (1994) Reduced permeability to K+ and Na+ ions of K+ channels in the plasma mambrane of tobacco cells in suspension after adaptation to 50 mM NaCl. Plant Cell Physiol. 35: 8792.

125. Muslin A.J., Tanner J.W., Allen P.M., Shaw A.S. (1996) Interaction of 14-3-3 with signalling proteins is mediated by the recognition of phosphoserine. Cell 84: 889-897.

126. Muslin, A.J., and Xing, H. (2000). 14-3-3 proteins: Regulation of subcellular localization by molecular interference. Cell. Signal. 12, 703-709.

127. Narasimhan M. L., Binzel M.L., Perez-Prat E., Chen Z., Nelson D.E., Singh N.K., Bressan R.A., Hasegawa P.M. (1991) NaCl regulation of tonoplast H+-ATPase 70-kD subunit mRNA in tobacco cells. Plant Physiol. 97: 562-568.

128. Niu X., Bressan R.A., Hasegawa P.M., Pardo J.M. (1995) Ion homeostasis in NaCl stress environments. Plant Physiol. 109: 735-742.

129. Niu X., Narasimhan M.L., Salzman R.A., Bressan R.A., Hasegawa P.M. (1993a) NaCl regulation of plasma membrane H+-ATPase gene expression in a glycophyte and a halophyte. Plant Physiol. 103: 713-718.

130. Niu X., Zhu J.-K., Narasimhan M.L., Bressan R.A., Hasegawa P.M. (1993b) Plasma membrane H+-ATPase gene expression is regulated by NaCl in cells of halophyte Atriplex nummularia L. Planta 190: 433-438.

131. Obsil, T., Ghilando, R., Klein, D.C., Ganguly, S., and Dyda, F. (2001). Crystal structure of the 14-3-3:serotinin ¿V-acetyltransferase complex: A role for scaffolding in enzyme regulation. Cell 105, 257-267.

132. Oecking C., Eckerskorn C., Weiler E.W. (1994) The fusicoccin receptor of plants is a member of the 14-3-3 superfamily of eucaryotic regulatory proteins. FEBS Letters 352: 163-166.

133. Oecking C., Piotrowski M., Hagemeier J., Hagemann K. (1997) Topology and target interaction of the fusicoccin-binding 14-3-3 homologs of Commelina communis. Plant J. 12: 441-453.

134. Olsson A., Svennelid F., Ek B., Sommarin M., Larsson C. (1998) A phosphothreonine residue et the C-terminal end of the plasma membrane H+-ATPase is protected by fusicoccin-induced 14-3-3 binding. Plant Physiol. 118: 551-555.

135. Palmgren M. G., Sommarin M., Larsson C. (1990) Proteolytic Activation of Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Removal of a Terminant Segment. J. Biol. Chem. V. 265. P. 13423-13426.

136. Palmgren M.G., Sommarin M., Serrano R., Larsson C. (1991) Identification of an Autoinhibitory Domain in the C-terminal Region of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase. J. Biol. Chem. V. 266 P. 20740-20745.

137. Palta J.P., Whitaker B.D., Weiss L.S. (1993) Plasma membrane lipids associated with genetic variability in freezing tolerance and cold acclimation of Solarium species. Plant Physiol. 103:793-803.

138. Pan S.Q., Sehnke P.C., Ferl R.J., Gurley W.B. (1999) Specific interactions with TBP and TFIIB in vitro suggest that 14-3-3 proteins may participate in the regulation of transcription when part of a DNA binding complex. Plant Cell 11. 1591-1602.

139. Parcts-Solcr. A., Pardo. J. M. and Serrano, R. (1990) Immunocytolocalization of plasma membrane H+-ATPasc. Plant Physiol. 93, 1654-1658.

140. Pei, Z.M., Murata, Y., Benning, G., Thomine, S., Klusener, B., Allen, G.J., Grill, E., and Schroeder, J.I. (2000). Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signaling in guard cells. Nature 406, 731-734.

141. Perez-Prat E., Narasimhan M.L., Niu X., Botella M.A., Bressan R.A., Valpuesta V., Hasegawa P.M., Binzel M.L. (1993) NaCl induction of plasma membrane H+-ATPase mRNA accumulation in tobacco cells. Plant Cell Environ. 17: 327-333.

142. Peters. W. S. and Fcllc, 11. 11. (1999) The Correlation of Profiles of Surface pll and Elongation Growth in Maize Roots. Plant Physiol. 121. 905-912.

143. Pilot. P. E. Versel, J. M. and Mayor. G. (1983) Growth distribution and surface pH patterns along maize roots. Planta. 158, 398-402.

144. Piotrowski M., Morsomme P., Boutry M., Oecking C. (1998) Complementation of the Saccharomyces cerevisiae plasma membrane H+-ATPase by a plant H+-ATPase generates a highly abundant fusicoccin binding site. J. Biol. Chem. 273: 30018-30023.

145. Piotrowski M., Oecking C. (1998) Five new 14-3-3 isoforms from Nicotiana tabacum L.: implications for the phylogeny of plant 14-3-3 proteins. Planta 204: 127130.

146. Plieth C., Hansen U.-P., Knight H., Knight M.R. (1999) Temperature sensing by plants: the primary characteristics of signal perception and calcium response. Plant J. 18(5): 491-497.

147. Rains D.W. & Epstein E. (1967) Sodium absorption by barley roots. Its mediation by mechanism 2 of alkali cation transport. Plant Physiol. 42: 319-323.

148. Reuveni M., Bennett A.B., Bressan R.A. Hasegawa P.M.(1990) Enhanced FT transport capacity and ATP hydrolysis activity of the tonopalst H+-ATPase after NaCl adaptation. Plant Physiol.94: 524-530.

149. Roberts M.R., Bowles D.J. (1999) Fusicoccin, 14-3-3 proteins, and defense response in tomato plants. Plant Physiol. 119: 1243-1250.

150. Rock, C.D- (2000). Pathways to abscisic acid-regulated gene expression. New Phytol. 148, 357-396.

151. Romeis, T., Piedras, P., and Jones, J.D.G. (2000). Resistance gene-dependent activation of a calcium-dependent protein kinase (CDPK) in the plant defense response. Plant Cell 12, 803-815.

152. Saijo, Y., Hata, S., Kyozuka, J., Shimamoto, K., and Izui, K. (2000) Overexpression of a single Ca2+-dependent protein kinase confers both cold and salt/drought tolerance on rice plants. Plant J. 23, 319-327.

153. Sambrok J. and Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition). CSHL Press, 2001.

154. Sanchez J.P., and Chua N.H. (2001). Arabidopsis PLC1 is required for secondary responses to abscisic acid signals. Plant Cell 13: 1143-1154.

155. Sangwan V., Foulds I., Singh J., Dhindsa R.J., (2001) Coldactivation of Brassica napus BN115 promoter is mediated by structural changes in membranes and cytoskeleton, and requires Ca2 influx. Plant J. 27: 1-12.

156. Schachtman D.P. & Schroeder J.I. (1994) Structure and transport mechanism of a high-affinity potassium uptake transporter from higher plants. Nature 370: 655-658.

157. Schachtman D.P., Tyerman S.D., Terry B.R. (1991) The K+/Na+ selectivity of a cation channel in the plasma membrane of root cells does not differ in salt-tolerant and salt-sensitive wheat species. Plant Physiol. 97: 598-605.

158. Schultz T.F., Medina J., Hill A., Quatrano R.S. (1998) 14-3-3 proteins are part of an abscisic acid-VIVIPAROUSl (VP1) response complex in the Em promoter and interact with VP1 and EmBPl. Plant Cell 10. 837-847.

159. Seehaus K., Tenhaken R. (1998) Cloning of genes by mRNA differential display induced during hypersensitive reaction of soybean after inoculation with Pseudomanas syrinrae pv. glycinea. Plant Mol. Biol. 38: 1225-1234.

160. Sehnke P.C., Chung H.J., Wu K., Ferl R.J. (2001) Regulation of starch accumulation by granule-associated plant 14-3-3 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98. 765-770.

161. Sehnke P.S., DeLille J.M., Ferl R.J. (2002S) Consummating Signal Transduction: The Role of 14-3-3 Proteins in the Completion of Signal-Induced Transitions in Protein Activity. Plant Cell, Supplement, S339-S354.

162. Sehnke, P.C., and Ferl, R.J. (2000). Plant 14-3-3s: Omnipotent metabolic phosphopartners. Science's STKE. http://www.stke.org/cgi/content/full/OCsigtrans; 2000. 56. pel.

163. Senlenac. H. and Grignon. C. (1987) Effect of H1 excretion on the surface pH of corn root cells evaluated by using weak acid influx as a pll probe. Plant Physiol. 84. 1367-1372.

164. Serrano R., Mulet J.M., Rios G., Márquez J.A., de Larrinoa I.F., Leube M.P., Mendizabal I., Pascual-Ahuir A., Proft M., Montesinos R.R. (1999) A glimpse of the mechanisms of ion homeostasis during salt stress. J. Exp. Bot. 50: 1023-1036.

165. Serrano R., Rodriguez-Navarro A., (2002) Plant, genes and ions. EMBO reports. 31: 116-119.

166. Serrano, R. (1990) in: The Plant Plasma Membrane (Larsson, C. and Moller, I. M., Eds), pp. 127-153, Springer-Verlag, Berlin.

167. Shi H., Ishitani M., Wu S.-J., Kim C.-S., Zhu J.K. (2000) The Arabidopsis thaliana salt tolerance gene SOS1 encodes a putative Na+/H+ antiporter. PNAS 97: 6896-6901.

168. Shi H., Xiong L., Stevenson B., Lu T., Zhu J.K., (2002) The arabidopsis salt overly sensitive 4 mutant uncover a critical role for vitamin B6 in plant salt tolerance. Plant Cell. 14: 575-588.

169. Shinozaki K. & Yamaguchi-Shinozaki K. (1997) Gene expression and signal transduction in water-stress response. Plant Physiol. 115: 327-334.

170. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (1996) Molecular responses to drought and cold stress. Cur. Opin. Biotechnol. 7: 161-167.

171. Siminovich D. & Cloutier Y. (1982) 24-hour induction of freezing and drought tolerance in plumules of winter rye seedlings by desiccation stress at room temperature in the dark. Plant Physiol. 69: 250-55.

172. Staal M., Maathuis F.J.M., Elzenga J.T.M., Overbeek J.H.M., Prins H.B.A. (1991) Na+/H+ antiport activity in tonoplast vesicles from roots of the salt-tolerant Plantago maritima and salt-sensitive Plantago media. Physiol. Plant 82: 179-184.

173. Steffen K.L., Arora L., Palta J.P. (1989) Relative sensitivity of photosynthesis and respiration to freeze-thaw stress in herbaceous species. Plant Physiol 89: 1372-79.

174. Stenz. H. G. Heumann. H. G. and Weisenseel, M. H. (1993) High Concentration of Plasma Membrane H+-ATPasc in Root Caps of Lepidium sativum L. N at ur \ v i s s e n s c h a flen 80. 317-319.

175. Steponkus P.L. (1984) Role of the plasma membrane in freezing injury and cold acclimation. Annu. Rev. Plant Physiol. 35: 543-84.

176. Stevenson J.M., Perera I.Y., Heilman I., Person S., and Boss W.F. (2000). Inositol signaling and plant growth. Trends Plant Sci. 5: 252-258.

177. Suzuki I., Los D.A., Kanesaki Y., Mikami K., Murata N., (2000) The pathway for perception and transcription of low-temperature signals in Synechocystis. EMBO J. 19: 1327-1334.

178. Sze H., Li X., Palmgren M.G. (1999) Energization of plant cell membranes by KT-pumping ATPases: regulation and biosynthesis. Plant Cell 11: 677-689.

179. Taylor, I.B., Burbidage, A., and Thompson, A.J. (2000). Control of abscisic acid synthesis. J. Exp. Bot. 51, 1563-1574.

180. Testerink C., Van der Meulen R.M., Oppedijk B.J., De Boer A.H., Heimovaara-Dijkstra S., Kijne J.W., Wang M. (1999) Differences in Spatial Expression between 143-3 Isoforms in Germinating Barley Embiyos. Plant Physiol. V. 121 P. 81-87.

181. Testerink C., Van Zeijl M.J., Drumm K., Palmgren M.G., Collinge D.B., Kijne J.W., Wang M. (2002) Post-translational modification of barley 14-3-3A is isoform-specific and involves removal of the hypervariable C-terminus. Plant Mol. Biol. 50. 535-542.

182. Thomashow M.F. (1998) Role of cold-inducible genes in plant freezing tolerance. Plant Physiol. 118: 1-7.

183. Thompson G.A. (Jr) Environ, stress plants: biochem. and physiol. mech. (Proc. NATO Adv. Res. Workshop. Norwich, 1987.) Berlin etc., 1989. P. 249.

184. Toker A., Sellers L.A., Amess B., Patel Y., Harris A., Aitken A. (1992) Multiple isoforms of a protein kinase C inhibitor (KCIP-1/14-3-3) from sheep brain: Amino acid sequence of phosphorylated forms. Eur. J. Biochem. 206. 453-461.

185. Toroser D. and Huber S.C. (1997) Protein phosphorylation as a mechanism for osmotic-stress activation of sucrose-phosphate synthase in spinach leaves. Plant Physiol. 114.947-955.

186. Toroser D. et al. (1999) Site-directed mutagenesis of serine 158 demonstrates its role in spinach leaf sucrose-phosphate synthase modulation. Plant J. 17. 407-413.

187. Toroser D., Athwal G.S., Huber S. (1998) Site-specific regulatory interaction between spinach leaf sucrose-phosphate syntase and 14-3-3 protein interaction. Plant J. 24. 171-181.

188. Trewavas A., Gilroy S. (1991) Signal transduction in plant cells. Trends Genet. 7: 356-361.

189. Tsiantis M.S., Bartholomew D.M., Smith J.A.C (1996) Salt regulation of transcript levels of a leaf vacuolar H+-ATPase in the halophyte Mesembryanthemum crystallinum. Plant J. 9: 729-736.

190. Urao T., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (2000) Two-component systems in plant signal transduction. Trends Plant Science 5: 67-74.

191. Van Zeijl M.J., Testerlink C., Keijne J.W., Wang M. (2000) Subcellular differences in post-translational modification of barley 14-3-3 proteins. FEBS Lett. 473. 292-296.

192. Vera-Estrella R., Barkla B.J., Higgins V.J., Blumwald E. (1994) Plant defense response to fungal pathogens: activation of host-plasma membrane H+-ATPase by elicitor-induced enzyme dephosphorylation. Plant Physiol. 104: 209-215.

193. Wang Q.Y., and Nick P., (2001) Cold acclimation can induce microtubular cold stability in a manner distinct from abscisic acid. Plant Cell Physiol. 42: 999-1005.

194. Wang, X. (1999). The role of phospholipase D in signaling cascades. Plant Physiol. 120: 645-651.

195. Watad A.A., Reuveni M., Bressan R.A., Hasegawa P.M. (1991) Enhanced net K+ uptake capacity ofNaCl-adapted cells. Plant Physiol. 95: 1265-1269.

196. Wu J., Seliskar D.M. (1998) Salinity adaptation of plasma membrane H+-ATPase in the salt marsh plant Spartina patens: ATP hydrolysis and enzyme kinetics. J. Exp. Bot. 323: 1005-1013.

197. Wu K., Lu G., Sehnke P., Ferl R.J. (1997) The heterologous interactions among plant 14-3-3 proteins and identification of regions that are important for dimerization. Arch. Biochem. Biophys. 339. 2-8.

198. Xiong L., Schumaker K.S., Zhu J.-K. (2002) Cell Signaling during Cold, Drought, and Salt Stress. Plant Cell, Supplement, S165-S183.

199. Xiong, L., and Zhu, J.K. (2002). Molecular and genetic aspects of plant responses to osmotic stress. Plant Cell Environ. 25, 131-139.

200. Yaffe M.B., Rittinger K., Volinia S., Caron P.R., Aitken A., Leffers H., Gamblin S.J., Smerdon S.J., Cantley L.C. (1997) The structural basis for 14-3-3: phosphopeptide binding specificity. Cell 91: 961-971.

201. Yang, J., Winkler, K., Yoshida, M., and Kornbluth, S. (1999). Maintenance of G2 arrest in the Xenopus oocyte: A role for 14-3-3-mediated inhibition of Cdc25 nuclear import. EMBO J. 18,2174-2183.

202. Yuasa, T., Ichimura, К., Mizoguchi, T., and Shinozaki, К. (2001) Oxidative stress activates ATMPK6, an Arabidopsis homologue of MAP kinase. Plant Cell Physiol. 42, 1012-1016.

203. Zhang H.X., Blumwald E., (2001) Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit. Nature biotech. 19: 765-768.

204. Zhu J.K., (2001) Plant salt tolerance. Trends Plant Sei. 6: 66-71.

205. Бобылев Г.С., Тимонина В.H. Сорокин Е.М. (1992) Лабильность мембранной системы хлоропластов при адаптации растений к температуре. Физ. расг. 39:541.

206. Зеленева И. В. (1977) Система адениловых нуклеотидов и энергетический заряд в эмбриогенезе и при прорастании семян кукурузы. Онтогенез. 8:289-296.

207. Иванов В. Б. Максимов В. Н. (1999) Изменения относительной скорости роста клеток корня на протяжении меристемы и начала зоны растяжения. Физиология растений. 46:87-97.

208. Йошида С. Холодостойкость растений. М.: Колос, 1989. С.97.

209. Кислюк И.М. (1985) Адаптивные и деструктивные реакции растительеных клеток на изменения тумпературы среды: автореф. дисс. .д-ра биол.наук. JL: Ин-т цитологии АН СССР. 140с.

210. Климов C.B. (1997) Биоэнергетическая концепция устойчивости растений к низким температурам. Успехи современной биологии. 117:133.

211. Климов C.B. (2001) Пути адаптации растений к низким температурам. Успехи современной биологии. 121:3-22.

212. Климов C.B. Астахова 11.В., Бочарова М.А., Трунова Т.Н. (1996) Различия в холодостойкости томата и огурца связанны с низкотемпературной устойчивостью фотосинтеза и характером углеродного метаболизма. Физиол. раст. 43:906.

213. Климов C.B. Астахова II.В. Кузанян P.C. Райхман Л.А. Трунова Т.И. (1990) Влияние холодового закаливания на структуру и функцию хлоропластов озимой пшеницы. Физиол. расг. 37:756.

214. Климов C.B., Астахова U.U. Трунова Т.И. (1993) Структурно-функциональная адаптация фотосинтетического аппарата озимой пшеницы к низким температурам. Журн. общ. биол. 54:30.

215. Климов C.B. Астахова H .В. Трунова Т.И. (1997) Связь холодоустойчивоети растений с фотосинтезом и ультраструктурой хлороплаетов и клеток. Физ. рает. 44:879.

216. Лось Д. А. (1997) Десатуразы жирных кислот: адаптивная экспрессия и принципы регуляции. Физ. раст. 44:528-540.

217. Мирославов Е.А. Алексеева O.A. Наумова JT.B. (1992) К проблеме обновления хлороплаетов. Цитология. 34:28.

218. Попов A.C. Физиологий криоустойчивости и криосохранения культивируемых in vitro клеточных штамов растений: Автореф. Дис. .д-ра биол. наук. М.: ИФР РАН. 1998. 192с.

219. Самыгин Г.А. (1997) Образование льда в растениях. Физ.рас г. 44:275.

220. Силаева A.M. (1984) Ультраструктурная организация фотосинтетического аппарата и ее адаптационные и патологические изменения: автореф. дисс. .д-ра. биол. наук. Киев.: Ин-т физиол. раст. АН УССР. 48с.

221. Трофимова М.С., Драбкин A.B., Клычников О.И., Зоринянц С.Э., Адолфи А., Эвиденте А., Бабаков A.B. (1997) Предполагаемая роль фузикокцин-связывающих белков в адаптации растений к стрессовым воздействиям. Физ. раст. 44: 652-657.

222. Трунова Т.И. (1967) Метод определения морозостойкости озимых растений // Методы определения морозостойкости растений / Под ред. Туманова И.И. М. Наука. 57с.

223. Челышева В.В., Зоринянц С.Э., Смоленская И.Н., Бабаков A.B. Регуляция Н+-насоса в плазматических мембранах растений при осмотическом стрессе: роль белков 14-3-3 // Физиология растений. 2001. Т. 48. С. 325-333.8. СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ1. Рисунки

224. Рисунок 1.1. Схематическое изображение восприятия абиотического стресса растением.6

225. Рисунок 1.2. Общая схема передачи сигнала внутри растительной клетки.7

226. Рисунок 1.3. Повторения Са2+ всплесков (осцилляции) при восприятии и передачи первичного сигнала.9

227. Рисунок 1.4. Пути трансдукции сигналов абиотического стресса (модифицировано из Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 1997). 14

228. Рисунок 1.5. Схема защитного действия пролина в клетке при солевом стрессе.15

229. Рисунок 1.6. Общая структура аминокислотной последовательности 14-3-3 белков Sehnke and Ferl, 1999. Цифрами показан процент гомологии среди 10 изоформ 14-3-3 белков арабидопсиса. С-конец обладает наибольшей вариабельностью.26

230. Рисунок 1.7. Структура молекулы димера 14-3-3 белка.27

231. Рисунок 1.8 Схема регуляции плазмалеммарной Н+-АТФазы белками 14-3-3 и образование сайта связывания ФК, при фосфорилировании консенсус-мотива Н+-АТФазы и в присутствии ионов Mg2+.38

232. Рисунок 3.1. Накопление ионов Na+ в корнях проростков ячменя при солевом стрессе. 1 сорт Московский-121,2-сорт Эльф.58

233. Рисунок 3.2. Закисление внешней среды кусочками корней проростков ячменя при солевом стрессе, 1 сорт М-121, 2 - сорт Эльф.59

234. Рисунок 3.3. Закисление внешней среды отрезками корней проростков ячменя при солевом и осмотическом стрессах, 1 сорт М-121(5мМ LiCl), 2 - сорт Эльф (5мМ LiCl), 3 - одинаковые показания для обоих сортов (ЗООмМ сорбит).60

235. Рисунок 3.4. Изменение АТФ гидролазной активности Н+-АТФазы в препаратах плазматических мембран корней проростков ячменя сорта М-121, 1 при солевом стрессе (150мМ NaCl) 1 час, 2 - в контроле, 3 -при солевом стрессе (150мМ NaCl) 24 часа.61

236. Рисунок 3.5. Изменение количества ФКСС в препаратах плазматических мембран из корней проростков ячменя при солевом стрессе, 1 — сорт М-121, 2 сорт Эльф.61

237. Рисунок 3.6. Иммунодетекция белков 14-3-3 ассоциированных с плазматическими мембранами при солевом стрессе, I сорт М-121, II - сорт Эльф, III - сорт М-121, изоформы А, В и С.63

238. Рисунок 3.7. Иммунодетекция белка Н+-АТФазы в плазматических мембранах, выделенных из корней проростков ячменя сорта М-121 в контроле (1) и подвергнутых солевому стрессу с экспозицией 1 час (2).63

239. Рисунок 3.8. Дот-гибридизация мРНК генов изоформ белков 14-3-3 в растениях ячменя сорта М-121 при солевом стрессе. Внутренний контроль постоянная экспрессия гена актина ячменя.66

240. Рисунок 3.9. Влияние солевого стресса на уровень экспрессии генов изоформ белков 14-3-3 ячменя сортов Московский-121 и Эльф.67

241. Рисунок 3.11. Слева: скорость тока протонов из третьего 800мкм отрезка корня проростка кукурузы в контроле и при изменении рабочего буфера. Справа: прирост корня за 4 часа в контроле и при изменении рабочего буфера.72

242. Рисунок 3.12. Влияние различных компонентов среды на выход протонов из первого 800мкм отрезка апекса корня кукурузы.72

243. Н+ поток в отдельных 800мкм отрезках корня (справа) и отношение длины клетки (1п) кдлине корня за вычетом данной клетки (L^) (слева).73

244. Рисунок 3.15. Накопление ионов Na+ в различных органах томата сорта Лидия при солевом стрессе.76

245. Рисунок 3.16. Влияние солевого стресса на рост корня проростков томата.76

246. Рисунок 3.17. Влияние солевого стресса (48 часов) на количество ФКСС в препаратах плазматических мембран, выделенных из надземной части и корней проростков томата, различных по солеустойчивости.77

247. Рисунок 3.18. Влияние солевого стресса на количество ФКСС в плазматических мембранах, выделенных из корней растений томата сортов контрастных по солеустойчивости.78

248. Рисунок 3.19. Влияние закаливания (2°С) на количество ФКСС в микросомальных мембранах, выделенных из надземной части и корней 4-х дневных проростков пшеницы.79

249. Рисунок 5.1. Схема регуляции Н+-АТФазы плазматических мембран высших растений при абиотическом стрессе.921. Таблицы

Информация о работе

Шанько, Андрей Викторович
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.03

Диссертация

Исследование регуляции Н +-АТФазы плазматических мембран высших растений белками 14-3-3 при абиотическом стрессе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы