Исследование прогностических биохимических и молекулярно-генетических маркеров эмбриогенеза человека

Гутникова, Людмила Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование прогностических биохимических и молекулярно-генетических маркеров эмбриогенеза человека
ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Исследование прогностических биохимических и молекулярно-генетических маркеров эмбриогенеза человека"

0046121

На правах рукописи

ГУТНИКОВА Людмила Валерьевна

Исследование прогностических биохимических и молекулярно-генетических маркеров эмбриогенеза человека

03.03.05 - биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 НОЯ 2010

Ставрополь - 2010

004612039

Работа выполнена в федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южный федеральный университет»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Шкурат Татьяна Павловна.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Водолажская Маргарита Геннадьевна;

доктор биологических наук, профессор Асланян Марлен Мкртичович.

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Росздрава РФ.

Ъщига диссертации состоится ^& _2010 г.

в .-/¿я ¿Х^часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан __2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Ржепаковскии И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важной проблемой понимания процессов эмбрионального развития человека являются вопросы прогностического значения. Высокая пластичность организма в раннем периоде делает эмбрион более чувствительным к различным факторам среды, с другой стороны, существует возможность воздействия на него в целях коррекции. Существующие биохимические маркеры развития плода, такие как альфа-фетопротеин, хорионический гонадотропин и свободный эстриол, достоверны в прогнозе синдрома Дауна и пороков развития нервной трубки, и малоэффективны в прогнозе врожденных пороков развития других соматических органов и наследственных заболеваний, а также в прогнозе развития гипоксии и гипотрофии плода. История разработки биохимических маркеров развития плода насчитывает более 40 лет, тем не менее, большинство современных исследований направлено на изучение узкого круга патологий - хромосомных анеуплоидий, грубых врожденных пороков развития. В то же время существует необходимость дальнейшего углубленного изучения механизмов развития ранних этапов эмбриогенеза и разработки методов прогноза течения беременности на основе индивидуальных особенностей генотипов родителей.

Успехи молекулярной генетики, достигнутые в последние годы, сделали возможным изучение генной природы и молекулярных механизмов многофакторной патологии. Например, все метаболические процессы инактивации токсичных веществ контролируются генотипом и зависят от его индивидуальных особенностей (Van Lieshout, е.а., 1998; Баранов B.C., 2007; Coto, е.а., 2010). В группу генов предрасположенности к невынашиванию беременности, относят гены системы биотрансформации ксенобиотиков - любых чужеродных токсичных веществ, поступающих в организм. Повреждающее действие ксенобиотиков может реализоваться как в ходе гаметогенеза, так и при оплодотворении, имплантации, синцитилизации, плацентации и последующих стадиях эмбриогенеза.

Дальнейшая оптимизация программы пренатальной диагностики плода может быть направлена как на поиск новых маркеров, так и на повышение чувствительности уже используемых маркеров.

Актуальность проблемы, стремление теоретически и практически обосновать применение новых маркеров для оценки состояния плода с позиций современной эмбриологии, используя новые биохимические и молекулярно - генетические подходы, обусловило выполнение настоящей работы.

Цель работы: проведение исследований по оценке эффективности существующего биохимического пренатального скрининга, разработка способов его оптимизации, поиск новых биохимических и молекулярно-генетических маркеров крови беременных женщин для оценки развития плода.

Задачи исследования.

1. Провести ретроспективный и проспективный анализ биохимического пренатального скрининга у беременных Ростовской области в период с 2006 по 2009 гг. Исследовать региональные медианы понедельного развития плода по сывороточным маркерам, определяемым иммуноферментным и иммунофлуо-

ресцентным методами, с целью оптимизации существующего пренатального скрининга.

2. Исследовать прогностическую значимость биохимических показателей эмбрионспецифических белков и гормонов (АФП, ХГЧ, св. эстриола, ТБГ, прогестерона, тестостерона, кортизола, ДГЭА-С, 17-ОН-прогестерона) в сыворотке матерей, родивших детей с низкой массой тела.

3. Исследовать прогностическую значимость показателей окислительного статуса крови матерей, родивших детей с низкой массой тела.

4. Изучить вклад однонуклеотидных замен генов матери и плода системы гемостаза в процессе эмбриональных потерь.

5. Изучить вклад однонуклеотидных замен генов матери и плода системы детоксикации (первой и второй фазы) в процессе эмбриональных потерь.

Научная новизна работы. Впервые, опираясь на большой статистический материал (более 30000 беременностей и их исходов), доказана целесообразность внедрения в существующий пренатальный скрининг региональных медиан для сывороточных маркеров крови независимо от их метода исследования. Введение региональных медиан сывороточных маркеров для беременных Ростовской области увеличивает чувствительность пренатального скрининга в среднем на 10%. Впервые показано, что увеличение уровня прогестерона, тестостерона, кортизола, хорионического гонадотропина человека и снижение концентрации свободного эстриола в крови матери во втором триместре достоверно ассоциировано с рождением детей с низким весом. Впервые показано, что снижение уровня антиоксидантных ферментов во втором триместре беременности может служить прогностическим маркером рождения ребенка с низкой массой тела. Впервые показано, что сочетание материнского и эмбрионального гетерозиготного носительства полиморфного аллеля А114У гена глутати-он-Б-трансферазы Р1 ассоциировано с увеличением риска эмбриональной гибели плода. Впервые показано, что суммарное носительство в супружеской паре более трех полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков приводит к достоверному увеличению риска эмбриональных потерь.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Введение региональных норм для медиан альфа-фетопротеина, свободного эстриола и хорионического гормона человека повышает эффективность пренатального скрининга независимо от метода определения - иммуноферментного или иммунофлуоресцентного анализа.

2. Определение повышенного уровня хорионического гонадотропина человека во втором триместре беременности в сочетании с увеличением уровня кортизола, прогестерона, тестостерона и снижением уровня свободно эстриола является прогностическим алгоритмом для оценки риска развития гипотрофии плода.

3. Снижение уровня супероксиддисмутазы в сыворотке крови женщин во втором триместре беременности более чем на 35% ассоциировано с низкой массой тела новорожденного.

4. Риск ранних эмбриональных потерь увеличивается при гетерозиготном но-сительстве как матерью, так и эмбрионом полиморфного аллеля A114V гена глутатион-З-трансферазы Р1.

5. Риск гибели эмбриона увеличивается при наличии у него более трех полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков.

Теоретическое и практическое значение работы. В общетеоретическом плане, полученные результаты расширяют представления о патобиохимических процессах эмбрионального развития человека и открывают новые перспективы их практического применения в пренатальной диагностике плода. Выполненная работа расширяет существующие представления о прогностических биохимических и молекулярно-генетических маркерах эмбриогенеза человека.

В результате проведения комплексных исследований по поиску биохимических и молекулярно-генетических прогностических маркеров эмбриогенеза человека получены новые данные, позволяющие существенно оптимизировать существующий пренатальный скрининг, расширить спектр выявляемых нарушений развития плода и прогнозировать раннюю летальность эмбриона по генотипам родителей. Разработан алгоритм прогноза рождения детей с низким весом по уровню гормонов (хорионический гонадотропин, кортизол, прогестерон, тестостерон, свободный эстриол) и уровню антиоксидантов в крови матери во втором триместре беременности. Доказана целесообразность определения носительства аллеля глутатионтрасферазы GSTP1 Alai 14Val у обоих супругов с целью прогноза эмбриональной гибели плода. Предложен и внедрен способ оптимизации существующего биохимического пренатального скрининга в Ростовской области на основе расчета региональных медиан. Полученные в работе новые экспериментальные данные используются при чтении лекций в спецкурсах «Эмбриология человека», «Медико-генетическое консультирование», «Свободные радикалы в живых системах», «Предиктивная медицина».

Работа выполнена в рамках научной тематики НИИ биологии ЮФУ «Изучение механизмов окислительного стресса», и в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2009-2012» по теме «Разработка технологии мониторинга репродуктивной функции человека и развития плода с использованием новых геномных и постгеномных маркеров», государственный контракт № 02.740.11.0501, в рамках АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2020 гг)» проект № 2.2.3.3/2370, а также в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2009-2012» по теме «Создание и апробация нового способа FIAV для быстрой идентификации аллельных вариантов генов» № 02.740.11.5015 и ФЦП МОН РФ ЦКП научным оборудованием «Высокие технологии» № 02552.11.7072.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научных сессиях биолого-почвенного факультета ЮФУ (2005, 2008, 2009); на междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегральной медицине» (Судак-2006); на II международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008); на заседании Ростовского отделения об-

щества ВОГиС (2009); на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 11 работ, в том числе одна из них в периодическом издании из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 59 отечественных и 101 зарубежных источника, приложения. Работа содержит 23 таблицы, иллюстрирована 25 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования

Материалом для исследования сывороточных маркеров АФП, ХГЧ и св. эст-риола послужили образцы крови 33792 беременных, обратившихся в клинико-диагностические лаборатории города Ростова-на-Дону и Ростовской области (КДЛ «Наука» и КДЛ Ростовской областной больницы) с целью проведения пренатального скрининга, в период с 2006-2009 гг. (табл. 1).

Таблица 1 - Количество обследованных беременных (п) на разных сроках гестации в зависимости от метода определения сывороточных маркеров_

Срок гестации (недели, дни) Иммуноферментный метод 1 группа (п) Иммунофлуоресцентный метод 2 группа (п)

14-14,6 169 965

15-15,6 928 5923

16-16,6 2088 9344

17-17,6 1518 6843

18-18,6 822 3258

19-19,6 404 1074

20-20,6 153 303

Итого: 6082 27710

Для оценки эмбрионспецифических белков и гормонов и показателей окислительного статуса было обследовано 86 беременных на сроке 15-18 недель (57 женщин составили контрольную группу и 29 женщин родивших детей с низкой массой тела).

Методом иммуноферментного анализа определяли уровень альфа-фетопротеина, хорионического гормона человека, прогестерона, тестостерона, кортизола с использованием тест-систем «Алкор Био» (СПб), свободного эст-риола, 17-ОН-прогестерона с использованием тест-систем «ЭЯО» (Германия) на автоматическом иммуноферментном анализаторе «ДЫБЕ! (¿Б» (Италия). Уровень трофобластический бета-гликопротеин определяли с использованием тест систем «Вектор Бест» (Новосибирск), супероксиддисмутазу - «Вепс1ег-

MedSystems» (Австрия). Иммунофлуоресцентным методом определяли АФП, P-free-ХГЧ, свободного эстриола с использованием тест-систем «Delfia» (Финляндия) на многофункциональном анализаторе «Victor». Колориметрическим методом определяли МДА (Стальная И.Д., 1977), общую концентрацию перекисей с использованием тест-системы OxyStat «Biomedica» (Вена).

Материалом для исследования полиморфизма генов детоксикации и генов коагуляции служила ДНК, выделенная из тканей плода (хорион) и матери (эндометрий) стандартными методами. Было проанализировано 56 образцов полученных от женщин с неразвивающийся беременностью и самопроизвольным абортом. Полиморфизм генов определяли с использованием реагентов фирмы «Литех» методом ПЦР, детекцию продуктов амплификации проводили в ага-розном геле методом горизонтального электрофореза. Анализ электрофоре-грамм проводили под УФ на трансиллюминаторе GelDoc «BioRad» (США).

Статистический анализ результатов проводили с использованием программного пакета Excel 2007 и Statistica v.6.0. Сравнение различных данных проведено с использованием критерия Стъюдента и Пирсона (у 2). Различия признаков считались достоверными при 95% уровне значимости (р<0,05). Для определения взаимосвязи явлений применялся корреляционный анализ по Спирмену с вычислением коэффициента корреляции (г).

Результаты и обсуждения Исследование региональных медиан биохимических маркеров развития плода с целью оптимизации существующего нренатального скрининга

Пренатальная диагностики в России проводится для беременных женщин с целью профилактики наследственных и врожденных заболеваний у детей. По данным разных авторов, информативность «тройного теста», включающего определение альфа-фетопротеина (АФП), хорионического гонадотропина (ХГЧ) и св. эстриола в сыворотке крови беременной во втором триместре в выявлении синдрома Дауна у плода составляет 60-70% (Золотухина Т.В., 2006; Кащеева Т.К., 2007). Для совершенствования метода и повышения его чувствительности мы сравнили два основных метода исследования пренатального скрининга -иммуноферментный и иммунофлуоресцентный, рассчитали региональные понедельные медианы.

Как видно из данных представленных на рисунках 1-3 значения региональных медиан для АФП, ХГЧ и св. эстриола, независимо от метода исследования, отличались от медиан производителя на всех сроках гестации. При этом обращено внимание, что на 16 и 17 неделях беременности зарегистрированы максимальные различия. Так, значение медианы для АФП, полученное методом им-муноферментного анализа, для беременных на 16 неделе, выше на 22%, а на 17 - на 24%. Значения медиан содержания АФП, полученные с использование им-мунофлуоресцентного метода (рис. 1) также достоверно отличались от медианы производителя.

Понедельные региональные медианы ХГЧ у беременных Ростовской области, определяемые иммуноферментным анализом, ниже медиан производителей на 12-38%. Различия значений медиан p-free ХГЧ, выполненного с использова-

нием иммунофлуоресцентного метода (рис. 2), составили менее 10% и также смещены в сторону низких значений относительно медиан производителя. Исключение составили значения, полученные на 19-20-ой неделе, где наблюдалось повышение уровня региональной медианы до 38%.

¿» ль ¿0 счЬ

>' ч*3' \Ь- ч?'

ЧУ Л Л' .Л

л- Л'

V -ч0 V срок гестации: недели, дни

МЛ —• -МП

14- 15- 16- 17- 18- 19- 2014,6 15,6 16,6 17,6 18,6 19,6 20,6

срок гестации: недели, дни

Рисунок 1 - Медианы уровня АФП в сыворотке беременных на разных сроках гестации: (а) иммуноферментный метод, б) иммунофлуоресцентный метод

14- 15- 16- 17- 18- 19- 2014,6 15,6 16,6 17,6 18,6 19,6 20,6 срок гестации: недели, дни

а б

Рисунок 2 - Медианы уровня ХГЧ в сыворотке беременных на разных сроках гестации: (а) иммуноферментный метод, б) иммунофлуоресцентный метод

Определение понедельных региональных медиан св. эстриола у беременных Ростовской области, выявило различия значений на 15-20 неделях, которые были направлены в сторону снижения региональных медиан по сравнению с нормами, предлагаемыми производителями иммуноферментных тест-систем (рис. 3). Региональные медианы для св. эстриола для иммунофлуоресцентного метода, превышают значения медиан, представленных производителем на всех сроках гестации на 6-40%.

-МП

14- 15- 16- 17- 18- 19- 2014,6 15,6 16,6 17,6 18,6 19,6 20,6 срок гестации: недели, дни

а б

Рисунок 3 - Медианы уровня св. эстриола в сыворотке беременных на разных сроках гестации: (а) иммуноферментный метод, б) иммунофлуоресцентный метод

Проведенный анализ полученных результатов показал наиболее значимые различия региональных медиан сывороточных маркеров у беременных Ростовской области при сроке гестации 15-18 недель от представленных производителями тест-систем.

Исследование гормонов плода и плаценты как прогностических маркеров эмбриогенеза

Известно, что адаптационные механизмы, которые обеспечивают оптимальные условия для роста и развития плода, реализуются в условиях адекватной интеграции всех систем, участвующих в этом процессе. Одно из главенствующих мест в интегральной схеме занимает эндокринная система. В соответствии с изменяющимися потребностями плода в течение беременности происходят изменения гормонального гомеостаза (Савельева Г.М., 2000; Лысенков С.П. и др., 2002).

В таблице 2 представлены уровни содержания в сыворотке крови беременных женщин - гормонов и эмбрионспецифических белков: кортизола, прогестерона, тестостерона, свободного эстриола, дигидроэпиадростерона сульфат (ДГЭА-С), 17 гидроксипрогестерона (17-ОН-прогестерон), хорионического го-надотропина (ХГЧ), альфа-фетопротеина (АФП), трофобластического бета-гликопротеина (ТБГ) в случаях рождения детей с нормальной массой тела (группа 1) и с низкой массой тела (группа 2).

Во время беременности плацента, снабжаемая предшественниками гормонов, за счет работы системы мать-плацента-плод синтезирует в больших количествах стероидные гормоны, а также различные белковые и пептидные гормоны, и в свою очередь секретирует эти продукты в кровоток матери и плода. Кроме того, белковые и пептидные гормоны, продуцируемые плацентой, действуют посредством паракринного механизма, регулируя секрецию стероидных гормонов плаценты (Гриффин Дж., Охеды С., 2008). При анализе концентрации прогестерона в сыворотке крови контрольной группы и группы женщин, родивших детей с низкой массой тела были получены достоверные различия (рис. 4). Уро-

вень прогестерона в группе женщин, родивших детей с низкой массой тела был увеличен в среднем на 22%, по сравнению с контрольной группой. Так, среднее значения прогестерона в группе 4 составило 232,31 нмоль/л, максимальное значение составило 358,0 нмоль/л. В контрольной группе средняя концентрация гормона составила 190,41 нмоль/л. Синтезу прогестерона принадлежит одно из важных мест в эндокринной функции плаценты (Gellersen, Fernandes, Brosens, 2009; Hil et al., 2010; Feinshtein, 2010). Прогестерон синтезируется с ранних сроков беременности. В первые три месяца основная роль в продукции этого гормона принадлежит желтому телу беременности, а затем плаценте (Савельева, 2000; Гриффин Дж., Охеды С., 2008). Увеличение концентрации прогестерона в сыворотке крови женщин с низкой массой тела может быть связано с нарушением функционирования фето-плацентарного комплекса, а также с патологическими изменениями, происходящими в плаценте.

Таблица 2 - Содержание уровня гормонов и эмбрионспецифичных белков в сыворотке крови беременных женщин, в случаях рождения ими детей с нормальной (группа 3) и низкой массой тела (группа 4)__

Наименование гормонов и эмбрионспецифичных белков Единицы измерения Содержание аналитов в группах беременных Р (t-крите-рий)

Группа 3 (п= 57) М±т Группа 4 (п-29) М±т

ХГЧ МЕ/л 27502±1947 40369±6885 0,025

АФП МЕ/мл 51,27±3,94 54,15±3,86 0,643

Эстриол свободный нг/мл 3,47±0,18 2,18±0,18 0,000

ТБГ нг/мл 36602±2411 36999±3310 0,923

Прогестерон нмоль/л 190,41±8,52 232,31,26 0,005

Тестостерон нмоль/л 2,95±0,14 3,81±0,22 0,001

Кортизол нмоль/л 570,21±20,24 677,21±42,71 0,011

ДГЭА-С мкг/мл 1,45±0,09 1,56±0,18 0,54

17-ОН-прогестерон нг/мл 3,32±0,18 3,27±0,13 0,84

Анализ содержания кортизола в сыворотке крови выявил достоверные отличия между контрольной группой и группой женщин, родивших детей с низкой массой тела. По результатам наших исследований в группе с нормально протекающей беременностью уровень гормона колебался в пределах от 210,74 нмоль/л до 969,73 нмоль/л во втором триместре беременности. Однако уровень кортизола в сыворотке крови женщин, родивших детей с низкой массой тела, достоверно выше по отношению к контрольной группе (группа 3). В группе женщин, родивших детей с низкой массой тела уровень кортизола в крови колебался от 407,54 нмоль/л и до 1383,2 нмоль/л. Как известно глюкокортикости-роиды оказывают как анаболические, так и катаболические эффекты, причем катаболические преобладают. Кортизол снижает утилизацию аминокислот для белкового синтеза везде, кроме печени, т.о. избыток кортизола связан с прогрессирующей потерей белка, атрофией и слабостью мышц, утончением кожи и потерей костного матрикса и массы (Гриффин Дж., Охеды С., 2008).

Несмотря на отсутствие достоверных отличий в уровнях ДГЭА-С и 17 ОН-прогестерона уровень тестостерона в сыворотке крови женщин, родивших де-

тей с низкой массой тела достоверно отличался от контроля и превышал его концентрацию в 1,3 раза. Среднее значение в группе 4 составило 3,81 нмоль/л, в группе 3 - 2,95 нмоль/л. Уровень тестостерона у беременных повышается при заболеваниях трофобласта (Кишкун A.A., 2007), что может быть и имело место в наших исследованиях.

Известно, что во время беременности скорость продукции эстрогенов в плаценте заметно возрастает. Эстриол - представитель эстрогенов - является главным стероидным гормоном, синтезируемым плацентой. По данным литературы показано, что снижение уровня свободного эстриола может приводить к задержке роста и развития плода (Кишкун A.A., 2007). Известно также, что эстрогены повышают кровоток в матке и могут играть роль в созревании и развитии фетальных органов (Гриффин Дж., Охеды С., 2008).В наших исследованиях уровень свободного эстриола в сыворотке крови женщин, родивших детей с низкой массой тела был достоверно снижен по отношению к уровню гормона в контрольной группе. Средняя концентрация свободного эстриола во второй группе составила 2,18 нг/мл, в первой группе 3,47 нг/мл.

46,78*

Рисунок 4 - Относительное содержание (%) уровня гормонов и эмбрионспеци-фичных белков в сыворотке крови женщин, родивших детей с низкой массой тела по отношению к группе женщин с нормально протекающей беременности Примечание (здесь и далее по тексту): *** - достоверное отличие по сравнению с II триместром при р < 0,001; ** - достоверное отличие по сравнению с II триместром при р < 0,01; * -достоверное отличие по сравнению со 11 триместром при р < 0,05.

В наших исследованиях не было получено достоверных различий в уровне ТБГ в сыворотке крови женщин с нормально протекающей беременностью и женщин, родивших детей с низкой массой тела. Средняя концентрация ТБГ составила 36998 нг/мл в 4 группе и 36602 нг/мл - в третьей группе. Средняя концентрация АФП в сыворотке крови женщин, родивших детей с низкой массой

тела составила 54,14 МЕ/л, в группе женщин при нормально протекающей беременности - 51,27 МЕ/л.

Исследование уровня хорионического гонадотропина выявило достоверные отличия между двумя группами. В ходе изучения динамики уровня ХГЧ средняя концентрация гормона в сыворотке крови при нормально протекающей беременности составила 27501 МЕ/л. Средняя концентрация ХГЧ в сыворотке крови женщин, родивших детей с низкой массой тела, превышала уровень контроля почти в полтора раза и составила 40369 МЕ/л. Повышение уровня ХГЧ в сыворотке крови беременных свидетельствует о нарушении гемодинамики в функциональной системе мать - плацента - плод (Николаева Ю.А., 2007).

Таким образом, в результате наших исследований были получены достоверные изменения уровня стероидных гормонов - прогестерона, кортизола, св. эст-риола, тестостерона, а также хорионического гонадотропина, что может указывать на влияние данных маркеров на рост и развитие плода.

Показатели окислительного статуса беременных, родивших детей с низкой массой тела

Результаты исследования показателей системы окислительного стресса при физиологическом течении беременности приведены в таблице 3. Как видно из данных таблицы при физиологически протекающей беременности интенсивность свободно-радикальных процессов во втором триместре достаточно высокая, что отражается в высоте быстрой вспышки хемилюминесценции. Однако активность антиоксидантной системы находится на высоком уровне, что обеспечивает контролируемый уровень интенсивности свободно-радикальных реакций и не допускает развития неконтролируемых реакций перекисного окисления липидов, приводящих к деструкции клеточных мембран. Это подтверждается низким уровнем внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ). В третьем триместре при физиологически протекающей беременности происходит статистически значимое снижение интенсивности свободно-радикальных реакций, что зафиксировано по снижению показателей хемилюминесценции. В то же время зафиксировано снижение уровня супероксиддисмутазы при одновременном повышении активности каталазы. В третьем триместре повышается и уровень мочевины. Однако, несмотря на это уровень ВЭГ в третьем триместре в 10 раз превышает этот показатель для второго триместра. Увеличение его концентрации говорит об увеличении деструкции и проницаемости мембран эритроцитов (Внуков В.В., 1989; Слюсарева И.В., 2007).

Увеличение уровня свободных радикалов в кровотоке матери в середине беременности регистрируется при любых вариантах течения беременности. При различных осложнениях и патологиях беременности повышение уровня свободных радикалов в крови матери - более значительное, чем при физиологическом течении беременности (Lash G.E. et al., 2008).

Нами были исследованы следующие показатели окислительного статуса матерей, родивших детей с низкой массой тела: общий уровень перекисей; уровень супероксиддисмутазы (СОД); уровень малонового диальдегида (МДА). У женщин, родивших детей с нормальной массой тела, уровень СОД в сыворотке

крови на 16-18 неделях беременности соответствует показателям для физиологически протекающей беременности. Суммарное содержание перекисей в 2 раза выше по сравнению с нормой для небеременных, что согласуется с данными о повышении интенсивности свободно-радикальных реакций во втором триместре нормально протекающей беременности. Уровень промежуточного продукта ПОЛ малонового диальдегида не превышает показатели для небеременных (табл. 3, табл. 4).

Таблица 3 - Показатели окислительного статуса при физиологическом течении беременности__

Показатель Физиологически протекающая беременность

11 триместр III триместр

Быстрая вспышка ХЛ, o.e.' 434,1±72,2 167,1±14,61***

Светосумма XJI, o.e.1 128,1±15,53 65,0±7,Ю***

Каталаза, у.е.1 53,1±3,99 68,3±3,17**

СОД, нг/мл 91,4±7,59 66,4±5,65*

Мочевина, мг/100 мл 17,4±1,25 21,0±0,95*

Церулоплазмин, у.е.2 13,6±1,19 15,3±0,53

ВЭГ, г/л 0,2±0,07 2,2±0,58***

Таблица 4 - Показатели окислительного статуса крови матерей (16-18 недели беременности), родивших детей с низкой (группа 3) и нормальной массой тела (группа 4)____

Показатель окислительного статуса Группа 3 Х±ш (п=57) Группа 4 Х±т (п=29) Р (t-критерий)

СОД (нг/мл) 89,35±9,19 54,8±3,87 0,007**

Суммарные перекиси (мкмоль/л) 1142±33,0 1235±48,0 0,10

МДА (нмоль/л) 6,1±0,14 6,63±0,18 0,02*

У женщин, родивших детей с низкой массой тела, в сыворотке крови во втором триместре беременности суммарное содержание перекисей не отличается от третьей группы (табл. 4) В то же время уровень МДА несколько выше по сравнению с группой контроля, а уровень СОД практически на 40% ниже. Таким образом, при изучении показателей окислительного статуса матери во втором триместре беременности выявлен дисбаланс в системе оксиданты - анти-оксиданты у женщин, родивших детей с низкой массой тела.

Исследование частот полиморфных аллелей генов свертывающей системы крови ассоциированных с эмбриональными потерями

Одной из ведущих причин невынашивания беременности, особенно на ранних сроках, являются генетические факторы. В настоящее время установлено, что синдром потери плода обуславливается не только хромосомными аномалиями, но и генными мутациями, а также наличием полиморфных аллелей генов, активно функционирующих в период гестации.

Нами был проведен анализ частот полиморфных аллелей некоторых генов факторов свертывающей системы крови (Р3-субъединицы тромбоцитарного рецептора фибриногена - 1ТОВЗ ЬеиЗЗРго, а2-субъединицы тромбоцитарного рецептора фибриногена - 1ТвА2 С807Т, ингибитора тканевого активатора плаз-

миногена тип 1 - РА1 1-675 50/40, фактора VII - Б VII-323 имЮЬр, фибриногена - РОВ-455Сг-Л) у женщин из двух групп: контрольной и группы женщин с синдромом потери плода. Носительство полиморфных аллелей генов фибрино-литической системы может сопровождаться гиперкоагуляцией, тромбообразо-ванием в ранних сосудах плаценты, приводить к нарушению жизнедеятельности имплантировавшегося плодного яйца.

Проведенный анализ частот полиморфных аллелей по каждому отдельному гену показал, что распределение частот аллелей у эмбрионов сходно с таковым у матерей. Количество полиморфных аллелей в группе женщин с синдромом потери плода выше по сравнению с контрольной, однако выявленные различия не являются статистически достоверными.

При сочетанном анализе носительства полиморфных аллелей установлено, что как среди матерей, так и среди эмбрионов в контрольной группе преобладают носители 1-3 полиморфных аллелей пяти исследуемых генов (рис. 5). При невынашивании беременности как среди женщин, так и среди эмбрионов снижается доля носителей одного полиморфного аллеля. Среди женщин 28,6% составляют носители 4 полиморфных аллелей. Среди погибших эмбрионов 21,4% были носителями 4 полиморфных аллелей генов свертывающей системы крови.

зо

25 20 15 Ю 5

мать эмбрион

контроль

эмбрион

НБ

I О 1 ■ 2 ■ 3

Рисунок 5 - Частота распределения (%) по количеству исследуемых полиморфных аллелей в генотипе женщин и эмбрионов

Можно предположить, что в данном случае происходит чрезмерное тромбо-образование, нарушение имплантации и кровоснабжения формирующейся плаценты.

Исследование частот полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков ассоциированных с эмбриональными потерями

Нами были исследованы частоты полиморфных аллелей ряда генов первой фазы (цитохрома Р-450 СУР1А1. цитохрома СУР2Е1, алкогольдегидрогеназы АЭНШ, альдегиддегидрогеназы АЬБН2) и второй фазы системы детоксикации ксенобиотиков (ацетилтрансферазы 2 ЫАТ2 и глутатион-Б-трансферазы вБТР!) у женщин с невынашиванием беременности в анамнезе и в контрольной группе.

Анализ сочетанного носительства полиморфных аллелей генов системы де-токсикации ксенобиотиков матери и эмбриона выявил, что достоверно чаще по сравнению с контролем при невынашивании беременности выявляется сочетание материнского и эмбрионального гетерозиготного носительства полиморфного аллеля А114У гена глутатион-Б-трансферазы.

Полиморфные аллели исследуемых генов в гомозиготном состоянии не выявлены в обеих группах женщин. Большая часть женщин, как в контрольной группе, так и с невынашиванием беременности являются гомозиготами по нормальному аллелю генов первой фазы системы детоксикации ксенобиотиков.

Степень увеличения риска зависит от количества полиморфных аллелей в генотипе. В контрольной группе, как женщин, так и эмбрионов более чем в 83% случаев в генотипе присутствует не более двух полиморфных аллелей из 9 исследуемых мутаций. Среди женщин с невынашиванием беременности в единичных случаях выявлено по одному полиморфному аллелю генов 14-ацетилтрансферазы 2 и глутатион-Б-трансферазы. Значительно снижается по сравнению с контрольной группой доля лиц с двумя полиморфными аллелями; в то же время количество носительниц трех полиморфных аллелей увеличивается более чем в 2 раза; 17,9% приходится на женщин, имеющих сразу 4 одно-нуклеотидных полиморфизма в исследуемых генах. Среди погибших эмбрионов 86% являются носителями трёх и более полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков, тогда как среди эмбрионов, развивавшихся при физиологически протекающей беременности, доля носителей трёх и более полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков составляет 25% (табл. 5).

Таблица 5 - Частота распределения (%) по количеству исследуемых полиморфных аллелей генов первой и второй фазы биотрансформации ксенобиотиков в генотипе женщин и эмбрионов_

Кол-во поли- Мать Эмбрион

морфных аллелей контроль НБ контроль НБ

0 0 0 0 0

1 0 0 12,5 ±11,69 3,4 ±3,36

2 33,6 ± 19,2 25,0 ±5,68 62,5 ± 17,1 10,3 ±5,64**

3 33,4 ± 19,2 35,7 ±9,0 12,5 ± 11,69 34,5 ± 8,8

4 33,0 ± 19,2 17,9 ±7,2 12,5 ±11,69 37,9 ± 9,0 *

5 0 14,3 ± 6,6 0 6,9 ±4,71

6 0 7,1 ±4,85 0 6,9 ±4,71

Снижение активности ферментов второй фазы системы детоксикации ксенобиотиков нарушает метаболизм эндогенных и экзогенных химических соединений, способствует длительному сохранению в клетках промежуточных токсических веществ, в том числе и продуктов перекисного окисления липидов, что может провоцировать активацию свободно-радикальных реакций и развитие патологического процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время ранняя оценка отдаленных эмбриональных нарушений проводится с помощью биохимического скрининга беременных в первом и втором триместре, и включает выявление лишь узкого круга патологий, таких как синдром Дауна, синдром Эдвардса, дефекты заращения нервной трубки (ДЗНТ), на долю которых приходится менее 1% от всех врожденных пороков развития, регистрируемых в популяции. При этом эффективность выявления данных патологий составляет около 70% (от общего числа детей с синдромом Дауна и ВПР), а ложноположительные результаты (когда риск рассчитан, как высокий- а ребенок рождается здоровым) встречаются в 5% случаев от общего числа обследованных (Золотухина Т.В., 2003; Кащеева Т.К., 2009). При введении, рассчитанных нами, региональных медиан для сывороточных белков крови женщин Ростовской области во втором триместре беременности, снизилось количество ложноположительных результатов по риску рождения ребенка с синдромом Эдвардса и ДЗНТ, при этом не было выявлено ложноотрицательных результатов для этих патологий. Можно сказать, что эффективность скрининга на синдром Эдвардса и ДЗНТ при переходе на региональные медианы повысилась, однако, что касается скрининга на синдром Дауна - это не так: с одной стороны повысилась чувствительность скрининга на синдром Дауна, с другой -увеличилось количество ложноположительных результатов, относящих беременных в группу риска по данной патологии плода. Все это лишний раз демонстрирует низкую специфичность маркеров, используемых в современной пре-натальной диагностике, и необходимость поиска новых, более специфичных маркеров. Кроме того, пока идет поиск новых, возможно более высокотехнологичных, маркеров ВПР и ХА, необходимо анализировать вклад других факторов, приводящих к изменению уровней сывороточных маркеров, с целью исключать из группы риска по ВПР и ХА женщин, у которых данные факторы привели к изменению уровня сывороточных маркеров.

ки прогностических маркеров в ранней оценке эмбриональных потерь и гипотрофии новорожденных.

Таблица 6 - Динамика прогностических маркеров в ранней оценке долгосрочных состояний эмбриона___

Динамика прогностических маркеров, ассоциированных с состояниями эмбриона Срок обследования Состояние эмбриона

АФП (Т), ХГЧ (<->), св. Эз (<-►) 15-18 недель беременности ДЗНТ

АФП (4), ХГЧ (Т), св. Эз(|) 15-18 недель беременности с. Дауна

АФП (<-►), ХГЧ (1), св. Эз (|) 15-18 недель беременности с. Эдвардса

ХГЧ прогестерон (|), кортизол (|), тестостерон (Т), св. Эз (|), АФП (<-), ТБГ (<-»), ДГЭА-С («-♦), 17-ОН-прогестерон («->) 15-18 недель беременности Гипотрофия плода

СОД (4), МДА (}), суммарные перекиси(<->) 15-18 недель беременности Гипотрофия плода

Наличие полиморфных аллелей в генах системы свертывания крови: ГГСВЗ(-), 1ТСА2(-), Р УН(-), РА1 1(-), РОВ(-) 8-12 недель беременности Гибель эмбриона

Наличие полиморфных аллелей в генах системы детоксикации ксенобиотиков первой фазы: СУР2Е1(-), СУР1А1(-), АОНШ(-), АЬОШ(-) 8-12 недель беременности Гибель эмбриона

Наличие полиморфных аллелей в генах системы детоксикации ксенобиотиков второй фазы: ЯАТ2(-), С8ТР1(++) 8-12 недель беременности Гибель эмбриона

Количество полиморфных аллелей в генах системы детоксикации ксенобиотиков: 3(+), 4(++), 5(+++), 6(+++) 8-12 недель беременности Гибель эмбриона

Примечание: (-), («->) - отсутствует ассоциация данного маркера с исследуемым состоянием эмбриона; (+), (++), (+++) - данный маркер ассоциирован с исследуемым состоянием эмбриона; (|), или (],) - уровень данного маркера повышен, или понижен, при исследуемом состоянии эмбриона.

Большое значение в понимании механизмов, нарушающих нормальное течение беременности, имеет изучение не только материнского генотипа, но и генотипа эмбриона. Наши исследования показали, что носительство как матерью, так и эмбрионом отдельного полиморфного аллеля генов системы свертывания крови и генов системы детоксикации ксенобиотиков слабо ассоциировано с ранними эмбриональными потерями. Однако анализ сочетанного носительства полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков матери и эмбриона выявил, что достоверно чаще по сравнению с контролем при невынашивании беременности выявляется сочетание материнского и эмбрионального гетерозиготного носительства полиморфного аллеля А114У гена глутатион-8-трансферазы. Большая часть женщин с невынашиванием беременности является носителем 3-4 исследуемых полиморфных аллелей, что фенотипически может приводить к повышению степени агрегации тромбоцитов при одновременном снижении активности процессов фибринолиза. В нашем исследовании

выявлены статистически значимые отличия по количеству полиморфных аллелей генов второй фазы детоксикации ксенобиотиков для эмбриональных тканей. Таким образом, можно заключить, что риск развития мультифакторной патологии повышается не столько при наличии полиморфного варианта отдельного гена системы биотрансформации, сколько при сочетании нескольких полиморфных маркеров, относящихся как к первой, так и ко второй фазе детоксикации ксенобиотиков как в материнском генотипе, так и генотипе эмбриона. Таким образом, с целью профилактики ранних эмбриональных потерь, необходимо проводить как можно раньше (лучше до зачатия) анализ уровня полиморфизма генов системы детоксикации одновременно и у матери и отца будущего ребенка.

ВЫВОДЫ

1. Введение в Ростовской области региональных норм для АФП, ХГЧ и св. эстриола повышает на 8% чувствительность пренатального скрининга по сывороточным маркерам крови матери во втором триместре независимо от метода их определения (иммуноферментый или иммунофлуоресцентый).

2. Сочетанное определение хорионического гонадотропина, прогестерона, кортизола, тестостерона и св. эстриола позволяет прогнозировать рождение ребенка с низким весом.

3. У женщин, родивших детей с низкой массой тела на 38-40 неделях, в сыворотке крови во втором триместре беременности регистрируется активность супероксиддисмутазы на 38,6% ниже по сравнению с референсными значениями.

4. Частоты генотипов полиморфных аллелей генов системы гемостаза (ITGB3, ITGA2, F VII, FGB, PAI 1) среди женщин с эмбриональными потерями и женщин с физиологической протекающей беременностью практически одинаковы.

5. При невынашивании беременности выявляется сочетание материнского и эмбрионального гетерозиготного носительства полиморфного аллеля A114V гена глутатион-Б-трансферазы Р1.

6. Среди погибших эмбрионов 86% являются носителями трёх и более полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков, тогда как среди эмбрионов, развивавшихся при физиологически протекающей беременности, доля носителей трёх и более полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков составляет 25%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гутникова, JI.B. Региональные нормы сывороточных маркеров крови, используемых в пренатальной диагностике плода / Л.В. Гутникова// Труды аспирантов и соискателей Ростовского государственного университета: сб. науч. тр. - Ростов-на-Дону: Изд-во Рост, ун-та, 2005. - Т. XI - С. 63-64.

2. Гутникова, Л.В. Маркеры окислительного стресса в мониторинге беременности/ Л.В. Гутникова// От экспериментальной биологии к превентивной и

интегральной медицине: мат-лы междунар. междисциплинарного симпозиума (г. Судак-, 17-27 сентября 2006 г.). - Судак, 2006. - С. 23-24.

3. Гутникова, JT.B. Динамика содержания альфа-фетопротеина и хориомиче-скгого гонадотропина в крови беременных женщин в зависимости от времени года / J1.B. Гутникова // Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине: мат-лы I междунар. науч.-практ. конф. (г. Ростов-на-Дону, 10-12 октября 2007 г.). - Ростов-на-Дону: Йзд-во «ЦВВР», 2007. - С. 15-16.

4. Данько, Е.А. Пренаталышй скрининг врожденных пороков развития плода / Е.А. Данько, JI.B. Гутникова, Е.В. Машкина, A.A. Александрова, Т.П. Шку-рат /У Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: мат-лы II междунар. науч.-практ. конф. (г. Ростов-на-Дону, 8-10 октября 2008 г.). - Рое-тов-на-Дону, 2008. - С. 94-95.

5. Ломгева, C.B. Аллантоин и нормальная беременность / C.B. Ломтева. Л.В. Гутникова, В.Н. Прокофьев, Е.П. Гуськов // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (г. Новосибирск, 11-15 мая 2008 г.). — Новосибирск: Изд-во Арта, 2008. - С. 402. - ISBN 5-9027-001Î -6.

6. Гутникова, Л.В. Анализ результатов пренаталыюго биохимического скрининга у беременных женщин Ростовской области / Л.В. Гутникова // Главный врач юга России. - 2009. - № 2 - С. 25-26.

7. Гутникова, Л.В. Исследование эффективности пренаталыюго скрининга в первом триместре беременности / Л.В. Гутникова, A.A. Александрова, C.B. Ломтева, Е.А. Данько, Е.В. Машкина, Т.П. Шкурат // Валеология. - 2009. - № 3. - С. 28-34.

8. Гутникова, Л. В. Динамика отклонений биохимических маркеров в первом триместре беременности у жительниц Ростовской области в зависимости возраста / Л.В. Гутникова // Ранние сроки беременности. Профилактика репродуктивных потерь: маг-лы науч.-практ. конф. (г. Ростов-на-Дону, 20 ноября 2009 г.). - Ростов-на-Дону: Изд-во ГОУ ВПО РостГМУ, 2009. - С. 28-29.

9. Александрова, A.A., Исследование референсных региональных норм биохимических маркеров пренаталыюго скрининга второго триместра у жительниц г. Ростова-на-Дону / A.A. Александрова, Л.В. Гутникова, С.С. Амелина // Медицинская генетика: мат-лы VI съезда Российского общества медицинских генетиков (г. Ростов-на-Дону, 16-17 мая 2010 г.). - М.: Изд-во Гениус Медиа, 2010.-С. 6.

10. Гутникова, Л.В. Полиморфизм генов интегринов и невынашивание беременности / Л.В. Гутникова, К.А. Коваленко, И.О. Покудина, И.О. Бушты-рева, Е.В. Машкина // Медицинская генетика: мат-лы VI съезда Российского общества медицинских генетиков (г. Ростов-на-Дону, 16-17 мая 2010 г.). - М.: Изд-во Гениус Медиа, 2010. - С. 50.

11. Коваленко, К.А. Гены системы детоксикации и невынашивание беременности / К.А. Коваленко, Л.В. Гутникова, A.A. Родионов, A.A. Александрова, Т.П. Шкурат // Медицинская генетика: мат-лы VI съезда Российского общества медицинских генетиков (г. Ростов-на-Дону, 16-17 мая 2010 г.). - М.: Изд-во Гениус Медиа, 2010. - С. 86.

Подписано в печать 30.09.2010 г. Формат 60x84 1/)6. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. лист 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 1316.

Типография Южного федерального университета 344090, г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 200/1, тел (863) 247-80-51.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гутникова, Людмила Валерьевна

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы. Биохимические и молекулярно-генетические маркеры эмбриогенеза человека

1.1 Биохимические методы оценки прогноза развития плода

1.1.1 Биохимический пренатальный скрининг. Ретроспектива и перспектива

1.1.2 Эндокринная регуляция роста и развития плода

1.1.3 Биохимические маркеры окислительного стресса в оценке роста и развития плода

1.2 Молекулярно-генетические маркеры в прогнозе развития плода

1.2.1 Генетические маркеры системы гемостаза и патология беременности

1.2.2 Гены системы детоксикации ксенобиотиков

2 Материал и методы исследования

2.1 Материал исследования

2.1.1 Отбор пациентов для проведения ретроспективного пренатально-го скрининга

2.1.2 Материал для исследования биохимических маркеров при низкой массе плода

2.1.3 Материал для исследования молекулярно-генетических маркеров прогноза развития плода

2.2 Методы исследований

2.2.1 Иммуноферментный и иммунофлуоресцентный методы определения альфа-фетопротеина, хорионического гонадотропина и свободного эстриола

2.2.2 Методы исследования содержания плацентарных гормонов

2.2.3 Методы оценки окислительного статуса маточно-плацентарных отношений

2.2.4 Молекулярно-генетические методы исследования полиморфизма генов

2.2.5 Статистические методы

2.2.6 Контроль качества проводимых исследований

3 Результаты и их обсуждение

3.1 Исследование региональных медиан биохимических маркеров развития плода, с целью совершенствования существующего пренаталь-ного скрининга

3.2 Исследование гормонов плода и плаценты как прогностических маркеров эмбриогенеза

3.3 Показатели окислительного статуса беременных, родивших детей с низкой массой тела

3.4 Исследование частот полиморфных аллелей генов свертывающей системы крови при невынашивании беременности

3.5 Исследование частот полиморфных аллелей генов системы деток-сикации ксенобиотиков при невынашивании беременности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование прогностических биохимических и молекулярно-генетических маркеров эмбриогенеза человека"

Актуальность проблемы. Важ ной проблемой понимания процессов эмбрионального развития человека являются вопросы прогностического значения. Высокая пластичность организма в раннем периоде делает эмбрион более чувствительным к различным факторам среды, с другой стороны, существует возможность воздействия на него в целях коррекции. Существующие биохимические маркеры развития плода, такие как альфа-фетопротеин, хорионический гонадотропин и свободный эстриол, достоверны в прогнозе синдрома Дауна и пороков развития нервной трубки, и малоэффективны в прогнозе врожденных пороков развития других соматических органов и наследственных заболеваний, а также в прогнозе развития гипоксии и гипотрофии плода. История разработки биохимических маркеров развития плода насчитывает более 40 лет, тем не менее, большинство современных исследований направлено на изучение узкого круга патологий - хромосомных анеуп-' лоидий, грубых врожденных пороков развития. В то же время существует необходимость дальнейшего углубленного изучения механизмов развития ранних этапов эмбриогенеза и разработки методов прогноза течения беременности на основе индивидуальных особенностей генотипов родителей.

Актуальность проблемы, стремление теоретически и практически обосновать применение новых маркеров для оценки состояния плода с позиций современной эмбриологии, используя новые биохимические и молеку-лярно — генетические подходы, обусловило выполнение настоящей работы.

Задачи исследования.

1. Провести ретроспективный и проспективный анализ биохимиче-' ского пренатального скрининга у беременных Ростовской области в период с 2006 по 2009 гг. Исследовать региональные медианы понедельного развития плода по сывороточным маркерам, определяемым иммуноферментным и им-мунофлуоресцентным методами, с целью оптимизации существующего пренатального скрининга.

Научная новизна работы. Впервые, опираясь на большой статистический материал (более 30000 беременностей и их исходов), доказана целесообразность внедрения в существующий пренатальный скрининг региональных медиан для сывороточных маркеров крови независимо от их метода исследования. Введение региональных медиан сывороточных маркеров для беременных Ростовской области увеличивает чувствительность пренатального скрининга в среднем на 10%. Впервые показано, что увеличение уровня прогестерона, тестостерона, кортизола, хорионического гонадотропина человека и снижение концентрации свободного эстриола в крови матери во втором триместре достоверно ассоциировано с рождением детей с низким весом. Впервые показано, что снижение уровня антиоксидантных ферментов во втором триместре беременности может служить прогностическим маркером рождения ребенка с низкой массой тела. Впервые показано, что сочетание материнского и эмбрионального гетерозиготного носительства полиморфное го аллеля А114У гена глутатион-Б-трансферазы Р1 ассоциировано с увеличением риска эмбриональной гибели плода. Впервые показано, что суммарное носительство в супружеской паре более трех полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков приводит к достоверному увеличению риска эмбриональных потерь.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Введение региональных норм для медиан альфа-фетопротеина, свободного эстриола и хорионического гормона человека повышает эффективность пренатального скрининга независимо от метода определения — имму-ноферментного или иммунофлуоресцентного анализа.

4. Риск ранних эмбриональных потерь увеличивается при гетерозиготном носительстве как матерью, так и эмбрионом полиморфного аллеля Al 14V гена глутатион-Б-трансферазы Р1.

Теоретическое и практическое значение работы. В общетеоретическом плане, полученные результаты расширяют представления о патобиохи-мических процессах эмбрионального развития человека и открывают новые перспективы их практического применения в пренатальной диагностике плода. Выполненная работа расширяет существующие представления о прогностических биохимических и молекулярно-генетических маркерах эмбриогенеза человека.

В результате проведения комплексных исследований по поиску биохимических и молекулярно-генетических прогностических маркеров эмбриогенеза человека получены новые данные, позволяющие существенно оптимизировать существующий пренатальный скрининг, расширить спектр выявляемых нарушений развития плода и прогнозировать раннюю летальность эмбриона по генотипам родителей. Разработан алгоритм прогноза рождения детей с низким весом по уровню гормонов (хорионический гонадотропин, кортизол, прогестерон, тестостерон, свободный эстриол) и уровню антиокси-дантов в крови матери во втором триместре беременности. Доказана целесообразность определения носительства аллеля глутатионтрасферазы GSTP1 Alai 14Val у обоих супругов с целью прогноза эмбриональной гибели плода. Предложен и внедрен способ оптимизации существующего биохимического пренатального скрининга в Ростовской области на основе расчета региональных медиан. Полученные в работе новые экспериментальные данные используются при чтении лекций в спецкурсах «Эмбриология человека», «Медико9 генетическое консультирование», «Свободные радикалы в живых системах», «Предиктивная медицина».

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научных сессиях биолого-почвенного факультета ЮФУ (2 005, 2008, 2009); на междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегральной медицине» (Судак-2006); на II международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотех-нологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008); на заседании Ростовского отделения общества ВОГиС (2009); на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, ма

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Гутникова, Людмила Валерьевна

выводы

4. Частоты генотипов полиморфных аллелей генов системы гемостаза (ГГСВЗ, 1ТОА2, Б VII, БОВ, РА1 1) среди женщин с эмбриональными потерями и женщин с физиологической протекающей беременностью практически одинаковы.

5. При невынашивании беременности выявляется сочетание материнского и эмбрионального гетерозиготного носительства полиморфного ал-леля А114У гена глутатион-8-трансферазы Р1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время ранняя оценка отдаленных эмбриональных нарушений проводится с помощью биохимического скрининга беременных в первом и втором триместре, и включает выявление лишь узкого круга патологий, таких как синдром Дауна, синдром Эдвардса, дефекты заращения нервной трубки (ДЗНТ), на долю которых приходится менее 1 % от всех врожденных пороков развития, регистрируемых в популяции. При этом эффективность выявления данных патологий составляет около 70% (от общего числа детей с синдромом Дауна и ВПР), а ложноположительные результаты (когда риск рассчитан, как высокий - а ребенок рождается здоровым) встречаются в 5% случаев от общего числа обследованных (Золотухина Т.В., 2003; Кащеева Т.К., 2009). При введении, рассчитанных нами, региональных медиан для сывороточных белков крови женщин Ростовской области во втором триместре беременности, снизилось количество ложноположительных результатов по риску рождения ребенка с синдромом Эдвардса и ДЗНТ, при этом не было выявлено ложноотрицательных результатов для этих патологий. Можно сказать, что эффективность скрининга на синдром Эдвардса и ДЗНТ при переходе на региональные медианы повысилась, однако, что касается скрининга на синдром Дауна - это не так: с одной стороны повысилась чувствительность скрининга на синдром Дауна, с другой - увеличилось количество ложноположительных результатов, относящих беременных в группу риска по данной патологии плода. Все это лишний раз демонстрирует низкую специфичность маркеров, используемых в современной пренатальной диагностике, и необходимость поиска новых, более специфичных маркеров. Кроме того, пока идет поиск новых, возможно более высокотехнологичных, маркеров ВПР и ХА, необходимо анализировать вклад других факторов, приводящих к изменению уровней сывороточных маркеров, с целью исключать из группы риска по ВПР и ХА женщин, у которых данные факторы привели к изменению уровня сывороточных маркеров.

Нами впервые была показана высокая прогностическая ценность определения на ранних сроках гестации панели эмбрионспецифических белков и гормонов, а также показателей окислительного статуса в сыворотке беременных для оценки низкой массы плода при рождении. Сочетанное определение хорионического гонадотропина, прогестерона, кортизола, тестостерона и св. эстриола, а также супероксиддисмутазы и малонового диальдегида позволяет прогнозировать рождение ребенка с низким весом уже во втором триместре беременности. Средняя концентрация ХГЧ в сыворотке крови женщин, родивших детей с низкой массой тела превышала уровень в группе с физиологически протекающей беременностью почти в полтора раза (46,78%). Повышение содержания ХГЧ в сыворотке крови беременных свидетельствует о нарушении гемодинамики в функциональной системе мать — плацента — плод (Николаева Ю.А., 2007). Уровень прогестерона в> группе-женщин, родивших детей с низкой массой тела был увеличен в среднем на 22%, по сравнению с контрольной группой. По данным разных авторов, увеличение концентрации прогестерона в крови беременных возникает при плацентарной недостаточ- * ности, осложненной плацентитом. Известно, что при плацинтите нарушается плацентарный кровоток, и как следствие возникает недостаточность трофи- ' ческой функции плаценты. Повышение уровней прогестерона и ХГЧ скорее всего является компенсаторной реакцией плаценты на возможные в ней нарушения (Николаева Ю.А., 2007). Уровень кортизола в сыворотке крови женщин, родивших детей с низкой массой тела, выше по отношению к контрольной группе на18,76 %. Кортизол является стрессовым гормоном и на его уровень может повлиять общее психосоматическое состояние (стресс, депрессия, тяжелые сопутствующие заболевания, интоксикация). Как известно глюкокортикостироиды оказывают как анаболические, так и катаболиче-ские эффекты, причем катаболические преобладают. Кортизол снижает утилизацию аминокислот для белкового синтеза везде, кроме печени, т.о. избыток кортизола связан с прогрессирующей потерей белка, атрофией и слабостью мышц, утончением кожи и потерей костного матрикса и массы (Гриф

113 фин Дж., Охеды С., 2008). Уровень тестостерона в сыворотке крови женщин, родивших детей с низкой массой тела отличался от контроля и превышал его концентрацию в 1,3 раза. Уровень тестостерона у беременных повышается при заболеваниях трофобласта (Кишкун, 2007), что может быть и имело место в наших исследованиях. Уровень свободного эстриола в сыворотке крови женщин, родивших детей с низкой массой тела был ниже по отношению к уровню гормона в контрольной группе на 37,18%. Известно, что эстрогены повышают кровоток в матке и могут играть роль в созревании и развитии фе-тальных органов (Гриффин Дж., Охеды С., 2008).

В результате исследования уровня ДГЭА-С и 17-ОН- прогестерона в обследуемых группах не было выявлено достоверных отличий. Средняя концентрация ДГЭА-С составила 1,45 мкг/мл и 1,56 мкг/мл в контрольной группе и в группе женщин, родивших детей с низкой массой'тела соответственно. Средняя концентрация Л 7-ОН-прогестеронахоставила-3,32 нг/мл в контрольной группе и 3,27 нг/мл в группе женщин, родивших детей с низкой массой тела. Одинаковые показатели в обеих исследуемых группах были получены для АФП (белок, вырабатываемый фетальной печенью) и ТБГ (белок, вырабатываемый трофобластом).

Мы полагаем, что полученная динамика биохимических показателей у беременных женщин, родивших детей с низкой массой тела, обусловлена патологическими изменениями непосредственно в плаценте, и скорее всего эти изменения связаны с нарушением гемодинамики плаценты.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гутникова, Людмила Валерьевна, Ростов-на-Дону

1. Айламазян, Э.К. Антиоксиданты в комплексной терапии поздних токсикозов беременных и связанной с ними хронической гипоксии плода / Э. К. Айламазян // Акушерство и гинекология. 1991. - № 3 - С. 31-34.

2. Айламазян, Э.К. Акушерство: учебник для мед. вузов. 4-е изд., испр. / Э.К. Айламазян, Б.Н. Новиков, Л.П. Павлова и др. — СПб.: СпецЛит, 2003.-528 с.

3. Айламазян, Э.К. Акушерство. Национальное руководство / Под ред. Э.К. Айламазяна, В.И. Кулакова, В.Е. Радзинского, Г.М. Савельевой -M.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. 1218 с. - ISBN 978-5-9704-1050-9.

4. Алексеева, М.Л. АФП: Использование в онкологии и перинатоло-гии Электронный ресурс. / М.Л. Алексеева // Проблемы репродукции. — 2000. № 4. URL http://www.rusmedserv.eom/problreprod/2000/4/article3 53 .html (дата обращения 16.11.2009).

5. Баймурадова, C.B. Клинико-диагностическое значение тромбо- -филии при бесплодии неясного генеза и неудачах ЭКО / C.B. Баймурадова, В. Бицадзе, Ф. Гахрамалы, А. Макацария // Материалы IV съезда акушеров-7 гинекологов России. 2008. - С. 16-17.

6. Балуда, В.П. Физиология системы гемостаза / В.П. Балуда, М.В. Балуда, И.И. Деянов, И.К. Тлепушков. М., 1995. - 243 с.

7. Балуда, В.П. Претромботическое состояние. Тромбоз и его профилактика / В.П. Балуда, М.В. Балуда, А.П. Гольдберг., ПЛ. Салманов. М.: «Зеркало-М», 1999. - 297 с.

8. Баранов, B.C. Цитогенетика эмбрионального развития человека / B.C. Баранов, Т.В. Кузнецова. СПб.: Изд-во Н-Л, 2007. - 640с.

9. Баркаган, З.С. Клинико-патогенетические варианты, номенклатура и основы диагностики гематогенных тромбофилий / З.С. Баркаган // Проблемы гематологии. 1996. - № 3. - С. 5-15.

10. И. Бескоровайная, Т.С. Влияние некоторых генетических факторов на нарушение репродукции у человека: дис. . канд. мед. наук.: 03.00.15 / Т. С. Бескоровайная. М., 2005. - 89 с.

11. Беспалова, О.Н. Генетика невынашивания беременности / О.Н. Беспалова // Журнал акушерства и женских болезней. — 2007. T. LVI, № 1. — С. 81-95.

12. Биохимический скрининг в пренатальной диагностике заболеваний плода: пособие для акушеров-гинекологов / под. ред. С.И. Куцева, Е.П. Гуськова. Ростов н/Д.: Изд. РГМУ., 2004. - 32 с.

13. Бокарев, И.Н. Тромбозы и противотромботическая терапия в клинической практике / И.Н. Бокарев, JI.B. Попова, Т.В. Козлова М.: Медицинское информационное агентство, 2009. - 512 с.

14. Бычков, И.В. Оптимизация методов лечения гипоксических состояний плода / И.В. Бычков, И.И. Логвинова, C.B. Шамарин // Прикладные информационные аспекты медицины. — 2009. — №122. — С. 168-172.

15. Владимирский, Б.М. Математика. Общий курс: учебник, 4-е изд. / Б.М. Владимирский, А.Б. Горстко, Я.М. Ерусалимский СПб.: Лань, 2008 -С. 727-730. - ISBN 978-5-8114-0445-2.

16. Гинтер, Е.К. Медицинская генетика: учебник / Е.К. Гинтер. М.: Медицина, 2003. - 448 с.

17. Гриффин, Дж. Физиология эндокринной системы / Под ред. Дж. Гриффин и С. Охеды; пер. с англ. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2008. -496 с. - ISBN 978-5-94774-493-4.

18. Данилов, Р.К. Общая и медицинская эмбриология / Р.К. Данилов, Т.Г. Боровая. СПб.: СпецЛит, 2003. - 231с. - ISBN 5-299-00208-4.

19. Евсюкова, И.И. Патогенез перинатальной патологии у новорожденных детей, развивавшихся в условиях хронической гипоксии при плацентарной недостаточности / И.И. Евсюкова // Журнал акушерства и женских болезней. 2004. - T. LUI, №2. - С. 26-29.

20. Золотухина, Т.В. Клетки плода в крови матери: новый неинва-зивный метод в пренатальной диагностике наследственных болезней / Т.В. Золотухина, Н.В. Шилова // Вестник РАМН. 1999. - №12. - С. 45-48.

21. Зяблицев, C.B. Практическая гормонодиагностика в акушерстве и гинекологии: руководство для врачей / C.B. Зяблицев, Э.Б. Яковлева, С.Б. Арбузова, М.И. Николенко. Донецк: Кассиопея, 1998. - 74 с.

22. Иващенко, Т.Э. Генотипический и биохимический анализ плацент у женщин с самопроизвольным досрочным прерыванием беременности / Т.Э. Иващенко, Г.К. Парцалис, В.М. Прокопенко // Журнал акушерства и женских болезней. 2006. - T. LV, № 2. - С. 58-63.

23. Илюхин, Е.А. Тромбофилия и венозные тромбозы / Е.А. Илюхин, Г.Г. Прохоров, В.М. Жирновой // Амбулаторная хирургия. 2006. - №3. - С. 3-7.

24. Кащеева, Т.К. Перспективы использования дополнительных сывороточных маркеров в биохимическом скрининге беременных / Т.К. Кащеева // Журнал акушерства и женских болезней. 2007. - T. LVI, №1. - С. 104108.

25. Кащеева, Т.К. Пренатальный биохимический скрининг — система, принципы, клинико-диагностические критерии, алгоритмы: автореф. дис. док. биол. наук: 14.00.46. / Т.К. Кащеева. СПб., 2009. - 51 с.

26. Кишкун, A.A. Гормональные и генетические исследования в клинической практике / A.A. Кишкун. М.: Лабора, 2007. - 400 с. - ISBN 978-59900478-6-0.

27. Лебеденко, B.C. Перекисное окисление липидов при плацентарной недостаточности и гипотрофии плода: дис. . канд. мед. наук. / B.C. Лебеденко.-М., 1987- 134 с.

28. Лысенков, С.П. Неотложные состояния и анестезия в акушерстве. Клиническая патофизиология и фармакотерапия / С.П. Лысенков, В.В. Мяс-никова, В.В. Пономарорев. — Майкоп: «Качество», 2002. — 604 с.

29. Макацария, А.Д. Антифосфолипидный синдром, генетические тромбофилии в патогенезе основных форм акушерской патологии / А.Д. Макацария, В.О Бицадзе // Российский медицинский журнал. 2006. - Спец. вып.-С. 2-10.

30. Марри, Р. Биохимия человека: в 2 т. / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В.М. Родуэл. М.:Мир; БИНОМ, 2009. - Т.2. - 414 с. - ISBN 978-503-003855-1.

31. Николаева, М.Г. Роль тромбогенных генетических мутаций и полиморфизмов у женщин с крайне отягощенным акушерским анамнезом / М.Г. Николаева, Е.Е. Григорьева, А.П. Момот, Г.В. Сердюк // Материалы IV съезда акушеров-гинекологов России. М., 2008. — С. 182.

32. Оловников, A.M. Молекулярный механизм морфогенеза: теория локационной ДНК / A.M. Оловников // Биохимия. 1996. - Т. 61. — Вып. 11.— С. 1948-1970.

33. Павлова, Н.Г. Интраамниальная инфекция в патогенезе плацентарной недостаточности и задержки развития плода / Н.Г. Павлова // Журнал акушерства и женских болезней. 2007. — № S1. - С. 55-58.

34. Петренко, В.М. Основы эмбриологии. Вопросы развития в анатомии человека: изд. второе исп. и доп. / В.М. Петренко. — СПб: СПбГМА, Изд-во ДЕАН, 2004. 400 с.

35. Плужникова, Т.А. Применение препарата «фолацин» у женщин с привычным невынашиванием при гипергомоцистеинемии / Т.А. Плужникова, Е.А. Алябьева // Материалы IX всероссийского научного форума «Мать и дитя». М., 2007. - С. 486.

36. Пономарева, O.A. Сорбционная емкость эритроцитов пуповинной крови новорожденных, перенесших перинатальную гипоксию / O.A. Пономарева, С.М. Кабиева, Л.Е. Муравлева, А.Ж. Тулешева // Фундаментальные исследования. 2009. - №S1. - С. 57-57.

37. Прокопенко, В.М. Роль окислительного стресса в патогенезе гес-тоза / В.М. Прокопенко // Журнал акушерства и женских болезней. — 2007. — Т. LVI-№4.-C. 31-36.

38. Радзинский, В.Е. Ранние сроки беременности / В.Е. Радзинский,

39. A.A. Оразмурадов. М.: Изд-во МИА, 2005. - 448 с. - ISBN 5-89481-309-3.

40. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. С помощью пакета программ «Статистика» / О.Ю. Реброва. М.: МедиаСфера, 2002. - 312 с.

41. Розен, В.Б. Основы эндокринологии/ В.Б. Розен. — М.: МГУ, 1994.-89 с.

42. Савельева, Г.М. Акушерство / Г.М. Савельева, В.И. Кулаков, А.Н. Стрижанов и др. М.: Медицина, 2000. - 816 с.

43. Серов, В.Н. Практическое акушерство: Руководство для врачей /

44. B.Н. Серов, А.Н. Стрижаков, С.А. Маркин. -М.: Медицина, 1989. 512 с.

45. Сидорова, И.С. Течение и ведение беременности по триместрам / И.С. Сидорова, И.О. Макаров. — М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2007. 304с.

46. Слюсарева, И.В. Особенности изменения метаболических процессов в эритроцитах и слюне при ишемическом инсульте до и после коррекции: автореф. дис. . канд. мед. наук 03.00.04/ И.В. Слюсарева. Ростов н/Д, 2007.- 18 с.

47. Ходжаева, З.С. Наследственные тромбофилии и привычные репродуктивные потери / З.С. Ходжаева, Г.Т. Сухих, C.JI. Блинецкая и др. // Материалы IX всероссийского научного форума «Мать и дитя». — 2007. — С. 287.

48. Шабалова, Н.П. Основы перинатологии / Н.П. Шабалова, Ю.В. Цвелева. -М.: МЕДпресс-информ, 2004. 640 с.

49. Шестопалов, A.B. Биологические функции аллантоина /A.B. Шестопалов, Т.П. Шкурат, З.И. Микашинович и др. // Известия РАН. Серия биологическая. 2006. - №5. - С. 541-545.

50. Шестопалов, A.B. Метаболическая активность плацентарных макрофагов и молекулярные механизмы формирования плаценты при различных вариантах течения беременности: автореф. дис. докт. мед. наук 03.00.04/ A.B. Шестопалов. Ростов-н/Д, 2007. - С. 3.

51. Aitken, D.A. Prenetal screening for neural tube defects and aneuploi-dy / D.A. Aitken, J.A. Crossley, K. Spencer // Principles and practice of medcal genetics. 2002. - V. 1. - P. 763-801.

52. Anthony, R.V. Placental-fetal hormonal interactions: impact on fetal growth / R.V. Anthony, S.L. Pratt, R. Liang, M.D. Holland // J Anim Sei. 1995. -Vol. 73,-№6.-P. 1861-1871.

53. Bachelot, A. Reproductive role of prolactin / A. Bachelot, N. Binart // Reproduction. 2007. - Vol. 133, - №2. - P. 361-369.

54. Beaudin, A.E. Folate-mediated one-carbon metabolism and neural tube defects: balancing genome synthesis and gene expression / A.E. Beaudin, P.J. Stover // Birth. Defects Res. C. Embryo Today. 2007. - Vol. 81. - P. 183-203.

55. Beer, J.H. Genetics of platelet receptor single-nucleotide polymorf-isms: clinical implications in thrombosis / J.H. Beer, S. Pederiva, L. Pontiggia // J Neural Transm. 2000. - Vol. 107. - P. 266-272.

56. Ben-Jonathan, N. What can we learn from rodents about prolactin in humans? / N. Ben-Jonathan, C.R. LaPensee, E.W. LaPensee // Endocr Rev. 2008. -Vol. 29 -№1. - P. 1-41.

57. Berry, E. Peroxosome proliferator-activated receptor isoform expression changes in human gestational tissues with labor at term / E. Berry, R. Eykholt, R. Helliwell et al. // Mol Pharmacol. 2003. - Vol. 64. - P. 1586-1590.

58. Bertina, R.M. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C / R.M. Bertina, B.P. Koeleman, T. Koster et al. // Nature. 1994. - Vol. 369. - P. 64-67.

59. Bick, R.L. Recurrent miscarriage: causes, evaluation, and treatment / R.L. Bick, J. Madden, K.B. Heller, A. Toofanian // Medscape Womens Health. -1998.-Vol.3.-P. 2-13.

60. Boorstein, W.R. Human chorionic gonadotropin p-subunit is encoded by at least eight genes arranged in tandem, inverted pairs / W.R. Boorstein, N.C. Vamvakopoulos, J.C. Fiddes // Nature. 1982. - Vol. 300. - P. 419-422.

61. Boothby, M. Imbalanced of human choriogonadotropin alpha, beta subunits reflects the steady state levels of the corresponding mRNAs / M. Boothby, J. Kukowska, I. Boime // JBC. 1983. - Vol. 258. - P. 9250-9253.

62. Brenner, B. Thrombophilia and fetal loss / B. Brenner // Seminars in Thromb Haemost. 2003. - Vol. 29. - P. 165-170.

63. Chang, K. Review article: steroid hormones and uterine vascular adaptation to pregnancy / K. Chang, L. Zhang // Reprod Sci. 2008. - Vol. 15. №4. -P. 336-348.

64. Chen, C.P. Prenatal diagnosis of a deletion of 18q in a fetus associated with multiple-marker screen positive results / C.P. Chen, S.R. Chern, F.F. Liu // Prenat Diagn. 1997. - Vol. 17. - № 6. - P. 571-576.

65. Chiesa, C. Lep tin, IGF-1, IGFBP-3, and Insulin Concentrations at Birth: Is There a Relationship with Fetal Growth and Neonatal Anthropometry? / C. Chiesa, J.F. Osborn, C. Haass // Clin. Chem. 2008. - Vol. 54. - P. 550-558.

66. Cole, L.A.The heterogeneity of hCG: III. The occurence, biological and immunological activities of nicked hCG / L.A. Cole, A. Kardana, P. Andrade-Gordon//Endocrinology. 1991.-Vol. 129.-P. 1559-1567.

67. Cole, L.A. The deactivation of hCG by nicking and dissociation / L.A. Cole, A. Kardana, S-Y. Park, G.D. Braustein // J. of clin. End. and Metab. 1993. -Vol. 76. - №3. — P. 704-710.

68. Cole, L.A. Immunoassay of human chorionic gonadotropin, its free subunits, and metabolites / L.A. Cole // Clin Chem. 1997. - Vol. 43. - № 12. - P. 2233-2243.

69. Cole, L.A. Human chorionic gonadotropin tests / L.A. Cole // Expert reviews in molecular diagnostic. 2009. - Vol. 9. - №7. - P. 721-747.

70. Cuckle, H.S. Urinary p-core human chorionic gonadotropin: a new approach to Downs syndrome screening / H.S. Cuckle, R.K. lies, T. Chard // Pre-nat. Diagn. 1994. - Vol. 14. - P. 953-958.

71. Cumming, A.M. Development of resistance to activated protein C during pregnancy / A.M. Cumming, R.C. Tait, S. Fildes et al. // Br J Haematol. -1995. Vol. 90. - P. 725-727.

72. Daly, S. Homocysteine and folic acid: implications for pregnancy / S. Daly, A. Cotter, A.E. Molloy, J. Scott // Semin. Vase. Med. 2005. - Vol. 5. - P. 190-200.

73. Davis, C.D. DNA methylation, cancer susceptibility, and nutrient interactions / C.D. Davis, E.O. Uthus // Exp. Biol. Med. (Maywood). 2004. - Vol. 10.-P. 95-98.

74. DeAngelo, A. Hyperhomocysteinemia and venous thromboembolic diseases / A. DeAngelo, G. Mazzola, L. Crippa // Haematologica. 1997. - Vol. 82.-P. 211-219.

75. Delias, C. Historical analysis of PAI-1 from its discovery to its potential role in cell motility and disease / C. Delias, D. Loskutoff // Tromb Haemost. -2005. Vol. 93. - P. 631-640.

76. Dick, P.T. Prenatal screening for and diagnosis of Down syndrome. Canadian Task Force on the Periodic Health Examination / P.T. Dick // Can Med Ass J. 1996.-Vol. 154. — № 4. - P. 465-479.

77. Engelmann, B. Intravascular tissue factor pathway — a model for rapid initiation of coagulation within the blood vessel / B. Engelmann, T. Luther, I. Müller // Thromb Haemost. 2003. - Vol. 89. - P. 3-8.

78. Evain-Brion, D. Hormonal regulation of fetal growth / D. Evain-Brion // Horm Res. 1994. - Vol. 42. - №4-5. - P. 207-214.

79. Feinshtein, V. Progesterone levels in cesarean and normal delivered term placentas / V. Feinshtein, Z. Ben-Zvi, E. Sheiner et al. // Arch Gynecol Obstet. 2010. - Vol. 281 -№3. - P. 387-392.

80. Fell, D. Disruption of thymidylate synthesis and glycine-serine interconversion by L-methionine and L-homocystine in Raji cells / D. Fell, J. Selhub // Biochim. Biophys. Acta. 1990. - Vol. 1. - P. 80-84.

81. Fialova, L. Fetoplacental antigens in pregnancies with fetal chromosomal aberrations / L. Fialova, I. Malbochan, L. Mikulikova, Z. Hajek // Sb Lek. -1993.-Vol. 94,-№2.-P. 179-183.

82. Gellersen, B. Non-genomic progesterone actions in female reproduction / B. Gellersen, M.S. Femandes, J.J. Brosens // Hum Reprod Update. 2009. -Vol. 15. — №1. - P. 119-38.

83. Giguere, Y. Combining biochemical and ultrasonographic markers in predicting reeclampsia: a systematic review / Y. Giguere, M. Charland, E. Bujold et al. // Clinical Chemistry. 2010. - Vol. 56. -№3. - P. 361-375.

84. Girling, J. Inherited thrombophilia and pregnancy / J. Girling, M. de Swiet// Curr Opin Obstet Gynecol. 1998. - Vol. 10. - P. 135-144.

85. Glueck, C. Genetic hypofibrinolysis in complicated pregnancies / C. Glueck, M. Kupfermine, R. Fontaine // Obstet Gynecol. 2001. - Vol. 97. - P. 4448.

86. Grandone, E. Inherited thrombophilia and gestational vascular complications / E. Grandone, M. Margaglione // Best Practice & Research Clin. Haematol. 2003. - Vol. 16. - P. 321-332.

87. Guibourdenche, J. Placental hormones and fetal growth / J. Guibour-denche, D. Porquet, D. Evain-Brion // Gynecol Obstet Fertil. 2001. - Vol. 29. -№7-8. - P. 532-533.

88. Handwerger, S. The roles of placental growth hormone and placental lactogen in the regulation of human fetal growth and development / S. Handwerger, M. J. Freemark // J Pediatr Endocrinol Metab. 2000 - №13(4) - P. 343-356.

89. Hassold, T.J. Maternal folate polymorphisms and the etiology of human nondisjunction / T. J. Hassold, L. C. Burrage, E. R. Chan // Am J Hum Genet. 2001. - Vol. 69. - P. 434-439.

90. Hewitt, D. Placental expression of peroxisome proliferator-activated receptors in rat pregnancy and the effect of increased glucocorticoid exposure / D. Hewitt, P. Mark, B. Waddell // Biol Reprod. 2006. - Vol. 74. - P. 23-28.

91. Hill, M. Is maternal progesterone actually independent of the fetal steroids? / M. Hill, A. Parizek, J.E. Jirasek et al. // Physiol Res. 2010 - №59(2) -P.211-224.

92. Hung, T.H. In vitro ischemia-reperfusion injury in term human placenta as a model for oxidative stress in pathological pregnancies / T.H. Hung, J.N. Skepper, G.J. Burton // American Journal of Pathology. 2001. - Vol. 159. - №. 3.-P. 1031-1043.

93. Hung, T.H. A longitudinal study of oxidative stress and antioxidant status in women with uncomplicated pregnancies throughout gestation / T.H. Hung, L.M. Lo, T.H. Chiu et al. // Reprod Sci. 2010. - Vol. 4. - P. 401-409.

94. Jauniaux, E. Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress; a possible factor in human early pregnancy failure / E. Jauniaux,

95. A.L. Watson, J. Hempstock et al. // American Journal of Pathology. 2000. - № 157.-P. 2111-2122.

96. Jauniaux, E. Placental-related diseases of pregnancy: involvement of oxidative stress and implications in human evolution / E. Jauniaux, L. Poston, G.J. Burton //Human Reproduction Update. 2006. - Vol.12. - №6. - P. 747-755.

97. Kamudhamas, A. Homocysteine thiolactone induces apoptosis in cultured human trophoblasts: a mechanism for homocysteine-mediated placental dysfunction? / A. Kamudhamas, L. Pang, S. Smith et al. // Am J Obstet Gynecol. -2004.-Vol. 191.-P. 563-571.

98. Karmakar, S. Regulation of trophoblast invasion by OL-lbeta and TGF-betal / S. Karmakar, C. Das // Am J Reprod Immunol. 2002. - Vol. 48. -№4.-P. 210-219.

99. Knutsen-Larson, S. The first trimester screen in clinical practice / S. Knutsen-Larson, J.D. Flanagan, P. Van Eerden, Q.P. Stein // S D Medicine. -2009. Vol. 62. - №10. - P. 392-393.

100. Kodaman, P. Endocrine-regulated and protein kinase C-dependent generation of superoxide by rat preovulatory follicles / P. Kodaman, H.R. Behrman // Endocrinology. 2001. - Vol. 142. - P. 687-693.

101. Kolialexi, A. Application of proteomics for diagnosis of fetal aneup-loidies and pregnancy complication / A. Kolialexi, A.K. Anagnostopolus, A. Ma-vrou, G.Th. Tsangaris // Journal of proteomics. 2009. - Vol.72. - P. 731-739.

102. Krantz, D.A. First-trimester Down syndrome screening: Free (3-human chorionic gonadotropin and pregnancy-associated plasma protein A / D.A. Krantz, J.W. Larsen, P.D. Buchanan, J.N. Macri // Am. J. Obstet. Gynecol. 1996. - Vol. 174.-612-616.

103. Kraus, J.P. Biochemistry and molecular genetics of cystathionine be-ta-synthase deficiency / J.P. Kraus // Eur. J. Pediatr. 1998. - Vol. 157. - P. 5053.

104. Kucik, D.F. Activation-enhanced aIIb|33-Integrin-Cytoskeleton Interactions Outside of Focal Contacts Require the a-Subunit / D.F. Kucik, T.E. O'Toole, A. Zheleznyak et al. //Mol Biol Cell. 2001. - Vol.12. - P. 1509-1518.

105. Laigaard, J. ADAM 12 as a first-trimester maternal serum marker in screening Down syndrome / J. Laigaard, K. Spencer, M. Christiansen et al. // Pre-nantal diagnosis. 2006. - Vol.26 - №10. - P. 973-979.

106. Lentz, SR. Homocysteine: Is it a clinically important cardiovascular risk factor? / S.R. Lentz, W.G. Haynes // Clev. Clin. J. Med. 2004. - Vol. 71. -P. 729-734.

107. Lo, Y. M. Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma / Y.M. Lo, N.M. Hjelm, C. Fidler // N. Engl. J. Med. 1998. -Vol. 339, N24.-P. 1734-1748.

108. Lo, Y.M. Fetal DNA in maternal plasma: biology and diagnostic applications / Y.M. Lo // Clin Chem, 2000 - Vol.46. - P. 1903-1906.

109. Lockwood, C. Tne deciduas regulates hrmostasis in human endometrium / C. Lockwood, G. Krikun, F. Schatz // Semin Reprod Endocrinol. 1999. -Vol. 17. -N 1. -P. 45-54.

110. Madsen, H.N. Screening for fetal trisomy 21 in gestational weeks 6 and 7 / H.N. Madsen, O.B. Petersen, N. Torring // Acta Obstet Gynecol Scand. -2010.-Vol. 89(9).-P. 1218-1221.

111. Martin, C.B. Normal fetal physiology and behavior, and adaptive responses with hypoxemia / C.B. Martin // Seminars in Perinatilogy. 2008. - Vol. 32 (4).-P. 239-242.

112. Martucci, C. P450 enzymes of estrogen metabolism / C. Martucci, J. Fishman // Pharmacol. Ther. 1993. - Vol. 57. - № 2. - P. 237-257.

113. McDonald, N.Q. New protein fold revealed by 2.3 A resolution crystal structure of nerve growth factor / N.Q. McDonald, R. Lapatto, J. Murray-Rust // Nature. 1991.-Vol. 354.-P. 411 -414.

114. Merkartz, J. An association between low maternal serum a-fetoprotein and fetal chromosomal abnormalities / J. Merkartz, H. Nitowsky, J. Macri, W. Johnson // Am. 1. Obstet. Gynecol. 1984. - Vol 148. - P. 886-894.

115. Michael, A.E. Potential significance of physiological and pharmacological glucocorticoids in early pregnancy / A.E. Michael, A.T. Papageorghiou // Human reproduction update. 2008. - Vol. 14. - №5. - P. 497-517.

116. Mikkelsson, J. The GPIIIa (beta3 integrin) PLA polymorfism in the early development of coronary atherosclerosis / J. Mikkelsson, M. Perola, P. Laip-pala et al. //J Am Coll Cardiol. 2000. - Vol. 36. - P. 1317-1323.

117. Mozgovaia, E. Genetic predisposition to pre-eclampsia: polymorphism of genes involved in regulation of endothelial functions / E. Mozgovaia, O. Malysheva, T. Ivashchenko, V. Baranov // BJMG. 2002. - Vol. 5. - № 3-4. - P. 19-26.

118. Mullis, P.E. Regulation of fetal growth: consequences and impact of being born small / P.E. Mullis, P. Tonella // Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2008. - Vol. 22(1) - P. 173-190.

119. Murphy, V.E. Endocrine Regulation of Human Fetal Growth: The

120. Role of the Mother, Placenta, and Fetus / V.E Murphy, R. Smith., W.B. Giles, V.L.

121. Clifton // Endocr. Rev. 2006. - Vol. 27 - P. 141 - 169.135

122. Myatt, L. Reactive oxygen and nitrogen species and functional adaptation of the placenta / L. Myatt // Placenta. 2010. - P. 66-69.

123. Nadir, Y. Association of homocysteine, vitamin B12, folic acid, and MTHFR C677T in patients with a thrombotic event or recurrent fetal loss / Y. Nadir, R. Hoffman, B. Brenner // Ann Hematol. 2007. - Vol. 86. - P. 35-40.

124. Ndumbe, F.M. Prenatal diagnosis on the first trimester of pregnancy / F.M. Ndumbe, Q. Navti, V.N. Chilaka, J.C. Konje // Obstetrics and gynecology survey. 2008. - Vol. 63 - №5- P. 317-328.

125. Nebert, D. Ecogenetics: from biology to health / D. Nebert, M. Carvan // Toxicol Indust Hlth. 1997. - Vol. 13. - P. 163-192.

126. O'Shaughnessy, K. Thrombophilic polymorphisms in pre-eclampsia: altered frequency of the functional 98C>T polymorphism of glycoprotein Ilia / K. O'Shaughnessy, B. Fu, S. Downing, N. Morris // J Med Genet. 2001. - Vol. 38. -P. 775-777.

127. Pinzani, P. Circulating nucleic acids in cancer and pregnancy / P. Pin-zani, F. Salvianti, M. Pazzagli, C. Orlando // Methods. 2010. - Vol. 50. - P. 302307.

128. Policastro, P. The |3-subunit of human chorionic gonadotropin is encoded by multiple genes / P. Policastro, C.E. Ovitt, M. Hoshina // JBC. 1983. -Vol. 258.-P. 11492- 11499.

129. Rey, E. Thrombophilic disorders and fetal loss: a meta-analysis / E. Rey, S.R. Kahn, M. Daviv, J. Shrier // The Lancet. 2003. - Vol. 361. - P.901-908.

130. Salas, S.P. Time course of maternal plasma volume and hormonal changes in women with preeclampsia or fetal growth restriction / S.P. Salas; G.

131. Marshall; B.L. Gutiérrez; P. Rosso // Hypertension. 2006. - Vol. 47(2). - P.203-208.

132. Scifres, C.M. Intrauterine growth restriction, human placental development and trophoblast cell death / C.M. Scifres, D.M. Nelson // J Physiol 2009.- Vol. 587 (14) P.3453-3458.

133. Schwippert-Houtermans, B. Evaluation of an antibody-based genotype classification of the platelet fibrinogen receptor (GPIIb/IIIa)/ B. Schwippert-Houtermans, S. Strapatsakis, P. Roesen et al. // Cytometry. 2001. - Vol. 46. - P. 238-242.

134. Sood, R. Thrombophilia and fetal loss: Lessons from gene targeting in mice / R. Sood // Thromb Res. 2009. - Vol. 123 - №2. - P. S79- S84.

135. Spencer, K. Stability of intact chorionic gonaotropin in serum. Liquid whole blood and dried whole-blood' filter-paper / K. Spencer, J.N. Macri, P. Carpenter // Clin. Chem. 1993. - Vol. 39. - № 6. - P. 1064 -1068.

136. Spencer, K. Aneploidy screening in the first trimester / K. Spencer // American journal of medical genetics part C. 2007. - Vol. 145 (C) - P. 18-32.

137. Spencer, T. Genes involved in conceptus-endometrial interactions / T. Spencer, O. Sandra, E. Wolf// Reproduction. 2008. - Vol. 135. - P. 165-179.

138. Takami, M. Antioxidants reversibly inhibit the spontaneous resumption of meiosis / M. Takami, S. Preston, V. Toyloy, H. Behrman // Am. J. Physiol.- 1999. Vol. 276. - P. 684-688.

139. Trabetti, E. Homocysteine, MTHFR gene polymorphisms, and cardio-cerebrovascular risk. / E. Trabetti // J. Appl. Genet. 2008. - Vol. 49. - P. 267-282.

140. Van Lieshout, E. Localization of glutathione S-transferase a and n in human embryonic tissues at 8 weeks gestational age / E. Van Lieshout, M. Knapen ,W. Lange // Hum Reprod. 1998. -Vol. 13.-P. 1380-1386.

141. Waston, A.L. Human chorionic gonadotropin and viability in placental organ culture / A.L. Waston, M.E. Palmer, V.G. Burton // Hum. Reprod. 1995- Vol. 10. № 8. - P. 2159-216.

142. Watson, A.L. Variations in expression of copper/zinc superoxide dis-mutase in villous trophoblast of the human placenta with gestational age / A. L. Watson, M.E. Palmer, E. Jauniaux, G.J. Burton // Placenta. 1997. - Vol. 18. - P. 295-299.

143. Yamada, N. The 4G/5G polymorphism of the plasminogen activator inhibitor-1 gene is associated with severe preeclampsia / N. Yamada, T. Arinami, K. Yamakawa-Kobayashiet. et. al. // J Hum Genet. 2000. - Vol. 45. - P. 138141.

144. Young, S.L. Progesterone function in human endometrium: clinical perspectives / S.L. Young, B.A. Lessey // Semin Reprod Med. 2010 - Vol.28 -№ 1 - P.5-16.

145. Younis, J.S. Gestational vascular complications / J.S. Younis, A. Sa-mueloff// Best Practice & Research Clin. Haematol. 2003. - Vol. 16. - P. 332338.

Информация о работе

Гутникова, Людмила Валерьевна
кандидата биологических наук
Ростов-на-Дону, 2010
ВАК 03.03.05

Диссертация

Исследование прогностических биохимических и молекулярно-генетических маркеров эмбриогенеза человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы