Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов реализации некоферментных функций тиамина в тканях животных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов реализации некоферментных функций тиамина в тканях животных"



1СТИТУТ

АКАДЕМИИ НАУК УКРАИНЫ

о 'V-

л\, ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМЕНИ А.В.ПАЛЛАДШ1А

На правах рукописи

ПАРХОМЕНКО кшш ^(ХАЙЛОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕАЛИЗАЦИИ НЕКОКРШГПШХ ФУНКЦИЙ ТИАМИНА В ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Киев

1993

Работа выполнена в отделе биохимии коферментов Института биохимии им. А.В.Палладина ' АН Украины

Официальные оппоненты: Академик АН Украины,

доктор медицинских наук, профессор ШУБА М.Ф.

в 14 часов на заседании специализированного совета Д 016.07.01 по защите диссертаций при Институте биохимии им. А.В.Палладина АН Украины по адресу: 252030, г.Киев, ул. Леонтовича 9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им. А.В.Палладина АН Украины.

Доктор биологических наук, профессор ВЕЛИКИЙ Н.Н.

Доктор биологических наук, профессор ХОЛОДОВА Ю.Д.

Ведушдя организация: Украинский государственный.

медицинский университет им.' А.А. Богомольца

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В результате.многолетних-исследований биохимической роли тиамина (витамина B-i) во внутриклеточном метаболизме сложилось представление, что она не может быть сведена лишь к участию дйфосфорного эфира тиамина (ТДФ) в качестве кофермента в функционировании нескольких ферментов углеводного обмена. Основанием для такого предположения послужили следующие факты: 1. Наличие во всех тканях и клетках в качестве обязательных компонентов помимо ТДФ ряда некофер-ментных производных тиамина, в том числе, двух других его фосфорных зфиров - монофосфзта и трифосфата и ферментов их обмена. Наличие у тиамина Нейротропной функции, которую

невозможно объяснить, основываясь только на каталитической роли ТДФ в метаболизме углеводов. 3. Выявление патологий, в частности генетической этиологии, обусловленных нарушением обмена -тиамина, не сопровождающимся изменением активности ТДФ-зависимых ферментов. Анализ перечисленных выше фактов указывал на наличие каких-то специфических функций тиамина в физиологических процессах, отличных от коферментных фушсций ТДФ, которые условно назвали некоферментными [Ostrowsky, 1968; Berman & Fishman, 1975; Iwata Н.,1982; Haas, 19883.

Считается, что механизм каталитического (коферментного) действия тиамина изучен достаточно хорошо, хотя по мере совершенствования методов, применяемых в биохимических исследованиях, выявляются новые детали этого сложного процесса. В частности, в клетках микроорганизмов [Rondo & Ishimoto, 19753 обнаружен новый необычный ТДФ-зависимый фермент, принимающий участие в обмене серусодержащих соединений.

Более сложная ситуация складывается при изучении неко-ферментных механизмов участия тиамина в метаболизме. Исследователи, занимающиеся биохимией тиамина, в поисках его неко-ферментных функций выбирают различные подходы. Одни изучают свойства распространенных во всех живых тканях некоферментных форм тиамина и пути их взаимодействия с другими биологически активными молекулами [Островский и др.. 1971, 19751. Другие, исходя из предположения, что некоферментные биохимические функции тиамина должны быть связаны исключительно с его пейротропной Физиологической функцией, ищут молекулярные меха-

I

низмы участия тиамина и его производных в функционировании возбудимых мембран или в регуляции обмена нейромедиаторов CMatsuda, Cooper, 1983, 1985; Schoffeníels, Marginetu, 1984]. И хотя в этих исследованиях получено немало новых сведений об обмене тиамина и функционировании ТДФ-зависимых ферментов, до . сих пор представления о некоферментных механизмах участия тиамина в обмене веществ очень расплывчаты, и существуют лишь отдельные отрывочные сведения, не дающие однозначных ответов. Было показано, что помимо каталитической роли кофермент оказывает на ферменты "стабилизирующее" действие, молекулярные механизмы которого не расшифрованы [Рыбина и др., 1974]. Появились сообщения о возможности индукции или репрессии ТДФ-зависимых • ферментных белков тиамином или ■ его производным [Reunauer et all, 1971]. Было отмечено [Pandit & Chakrabarti, 1972], что уже на первых этапах развития Bi-авитаминоза наблюдается прогрессирующее снижение содержания в тканях восстановленного глутатиона, что само по себе могло способствовать снижению активности ТДФ-зависимых дегидрогеназ, в активных и регуляторных центрах которых содержатся SH-группы [Бунин и др., 1991] и чувствительность которых к уровню, восстановленного глутатиона в тканях была показана Штутман и др., 1975]. Более поздние работы показали возможность участия тиаминфос-фатов в регуляции активности ТДФ-зависимых ферментов, в частности, пируватдегидрогеназного комплекса (ПЦК) tAlkonyi et all., 1976; Roche & Cate, 1977] и кетоглутаратдегидрогеназно-го комплекса (КГДК) [Yusa, 1966] по механизмам, не связанным с коферментной функцией ТДФ. На основании экспериментальных данных высказываются предположения об участии тиаминфосфатов в реакциях трансфосфорилирования [Bettendorff & Schoffeníels, 1990] и окислительного фосфорилирования [Раэумович, Карпуть, 1969].

Идентификация некоферментных функций тиамина в физиологических условиях - довольно сложная задача, так как многие его эффекты на те или иные участки клеточного обмена опосредованы цепочкой метаболических превращений, берущих начало от субстратов или продуктов .ТДФ-зависимых ферментных реакций, занимающих в большинстве случаев ключевое положение в обмене. Среди нескольких ферментов этой группы в организме животных наиболее важными в метаболическом аспекте являются транскето-

лаза и уже упоминавшиеся ПДК и КГДК. Кетокислоты, являясь субстрат'ами для окислительного декарбоксилирования, могут подвергаться различным превращениям в организме.-Они способны декарбоксилироваться икарбоксйлироваться, • что в случае лиру-вата обеспечивает взаимосвязь гликолиза и глюконеогенеза. Благодаря способности к аминированию с образованием соответствующих аминокислот а-кетокислоты играют роль связующего звена между обменом углеводов и белков. Конечный продукт аэробного окисления глюкозы - ацетил-КоА, образующийся в результате пируватдегидрогеназной реакции, окисляется далее в ЦТК или идет на построение кетоновых тел, липидов и, что особенно ваяно в аспекте выяснения нейротропнсй функции тиамина,- нейро-медиатара аиетилхолина. В связи с вышесказанным, первоочередной задачей при расшифровке- путей регуляторного воздействия тиамина на клеточный метаболизм мы считаем изучение молекулярных механизмов участия его биологически активных производных в регуляции функционирования ТДФ-зависимых ферментов.

Актуальность исследований, направленных на выяснение новых аспектов участия тиамина в клеточном метаболизме, подтверждается растущим перечнем патологий, связанных с нарушением обмена тиамина, которые невозможно объяснить только кофер-ментной функцией ТДФ. Результаты таких исследований будут способствовать научно обоснованному применению производных тиамина в медицине, в частности, созданию принципиально новых форм нейроактивных лекарственных препаратов.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в выяснении биологической роли и механизмов участия тиамина и его производных в регуляции функционирования ТДФ-зависимых ферментных систем, и внутриклеточного обмена.

Решались следующие задачи:

- в условиях различной обеспеченности организма животных Тиамином и различной интенсивности его обмена проследить за-вис1!мость между уровнем тиамина и его фосфатов в тканях и активностью ТДФ-зависимых ферментов, в первую очередь - пирува-тдегидрогеназного комплекса (ПДК), занимающего ключевое положение в клеточном метаболизме;

- провести исследование механизмов некоферментного действия тиаминфосфатов на функционирование ПДК на изолированных системах:

- выяснить возможность регуляторного действия тиамина и тиаминфосфатов на функционирование ГШК и, соответственно, синтез ацетилхолина в нервных клетках;

- исследовать особенности обмена тиамина и его связь с обменом ацетилхолина в нервных окончаниях;

- на основании полученных данных сформулировать представления о механизмах действия тиамина на функционирование ТДФ-зависимых ферментов (на примере ПДЮ в клетках тканей животных и провести экспериментальную проверку возможности функционирования этих механизмов in vivo;

- на основании анализа совокупности всех полученных данных и данных литературы'провести обсуждение возможных механизмов нейротропного действия тиамина.

Научная значимость и новизна. В работе использованы принципиально новые подходы для выяснения некоферментных механизмов действия тиамина на ТДФ-зависимые дегидрогеназы а-кетокислот: исследована корреляционная зависимость между уровнем индивидуальных тиаминфосфатов и активностью этих ферментов в печени экспериментальных животных, отличающихся по уровню обеспеченности тиамином и по интенсивности его использования, обусловленной различной направленностью метаболических процессов. Установлено, что в нормальных условиях в печени животных отсутствует регуляция активности ТДФ-зависимых дегидрогеназ по механизму ассоциации-диссоциации кофермента и алофермента. В то же .время в условиях недостаточности тиамина важным компонентом регуляции активности этих ферментов становится тиол-дисульфидная система тканей; выявлено прямое, не зависящее от его коферментной функции, участие тиамина в поддержании равновесия этой системы. Прямая корреляция между уровнем кофермента и активностью ТДФ-зависимого фермента - КГДГ отмечена только при 10-кратном снижении концентрации кофермента по сравнению с контролем (кажущаяся Km определена равной 3,83±1,62 мкМ). Показано,что при физиологических, условиях ТДФ и ТТФ принимают участие в регуляции активности ПДК фосфорили-рованием-дефосфорилированием по механизму, не зависящему от коферментной функции ТДФ. ТДФ и ТТФ, связываясь с ПДК.оба ин-гибируют активность ПДР-киназы,но действуют различным образом на активность ЩГ-фосфатаэы: ТДФ активирует ее при всех испытанных концентрациях, ТТФ оказываем нелинейное ингибирование.

Показана принципиальная возможность участия тиаминфосфа-тов по вышеописанному механизму в регуляции активности ГЩК в нервных окончаниях мозга и, опосредованно через функционирование" ЦЦК,~ - в регуляции синтеза АХ. Проведено комплексное изучение обмена тиамина и его связи с обменом АХ в нервных окончаниях.

Впервые выделен и охарактеризован по биологической активности тиаминсвязывающий белок синаптосом, показана его причастность к обмену тиаминфосфатов и АХ.

На основании анализа собственник экспериментальных данных и данных литературы сформулирована оригинальная гипотеза относительно мохаяизысв реализации нейротропной функции тиамина, согласно которой тиамин квалифицирован как спутник ней-ромедиатора АХ.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные о некоферментной регуляции тиамином активности ТДФ-зависимых ферментов в тканях животных и вытекающая из результатов этих исследований гипотеза о природе нейротроп-ности тиамина имеют, прежде всего, приоритетное научно-теоретическое значение. Они позволяют с новых позиций оценить роль тиамина в клеточном метаболизме и являются основой для развития новых направлений в биохимии тиамина.

Разработано несколько новых биохимических методов и модификаций известных методов исследования обмена тиамина,в том числе новый метод разделения тиаминфосфатов на катионообмен-ном сефадексе, который "послужил основой для нескольких аналогичных разработок в мире.

Результаты данного исследования служат научно-теоретическим обоснованием создания новых препаратов тиамина и его производных в комбинации о другими биологически активными соединениями для медицины и ветеринарии. В частности, автором разработан препарат "Биометок", предназначенный для повышения жизнестойкости животных.который показал высокую эффективность при испытании.

Апробация. Основные положения диссертации доложены на

III (107? г.), IV (1982 г.), V (1987 г.) и VI (1992 г.) Украинских биохимических съездах и III (1974 г.), IV ¡1379 г.) и V (1986 г.) Всесоюзных биохимических'съездах; на III (1975 г.),

IV (1977 г.) и V (1983 г.) Гродненских симпозиумах¡Всесоюзных

2-4-33 5

конференциях "Актуальные проблемы витаминологии"(Москва,1978), "Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов и других предшественников коферментов" (Иркутск, 1983), "Научные основы витаминного питания с/х животных" (Рига, 1987), "Клиническая витаминология" (Москва, .1991) и др. (всего 10), на нескольких республиканских конференциях; на шести Всесоюзных биохимических симпозиумах (1982-1990 гг); на Проблемной комиссии по витаминологии (Гродно, 1986), а также на международных конференциях: "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989) и "Биохимия й физиология ТДФ-зависимых.ферментов" (Влаубейрон, 1990).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), экспериментальной части (собственные исследования - 5 глав), обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы (473 источника,, в том числе 88 отечественных и 385 иностранных авторов). Работа изложена на 260 . страницах машинописного текста, включая 58 страниц списка литературы. Текст диссертации иллюстрирован 18 таблицами и 35 рисунками.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эксперименты с алиментарным Bi-авитаминозом, ' вызываемым скармливанием животным тиаминдефицитной диеты [Takafiashl et all., 19711, проведены на беспородных белых крысах с массой тела 60-70 г. с использованием парнокормленного контроля. В соответствующих постановках на 100 г живой массы крысы вводили внутримышечно тиамина - 250 мкг, метионина - 40 мг, витамина Е в виде ацетата а-токоферола - 2 мг. В экспериментах с острым окситиаминовым авитаминозом использовали . самцов крыс линии Вистар с массой тела 80-120 г. Окситиамин вводили внутримышечно в дозе 400 мг на 1 кг живой массы. Опыты с адаптивным гиперлипогенезом (кормление углеводами после голодания) проводили на.крысах самцах линии Вистар массой 250-320 г. Си-наптосомы и субсинаптосомальные фрагменты для проведения экс-1ерцментов In vitro изолировали из мозга крыс самцов массой. 150-200*г.

При изучении взаимодействия тиамина.и других соединений

[тиаминфосфатов, нейромедиаторов и т.д.] с синаптосомами и субсинаптосомальными фракциями инкубацию проводили в бикарбо-натном Кребс-Рингеровском буфере (pH 7,4). В экспериментах-по -изучению взаимодействия тиамина с синаптосомами и их фрагментами использован"" [35S]тиамин или [14СЗтиамин (Amersham). Для фиксации изменений в мембранном потенциале синаптосом использовали флуоресцентный зонд 3,3'-дипропилтиодикарбоцианин (dis-Cn(3)) в концентрации 1,22 мкМ [Sins Alon et all, 19743.

Митохондрии печени крыс, субклеточные и субсинаптосо-мальные фракции мозга крыс получали известным " методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы [Schnider et all., 1950; Herrn et all., 19821 без существенных изменений; фракцию синапхических везикул дополнительно очищали от фрагментов плазматических мембран синаптосом СЛишко и др., 19861. Очистку ГЩК из митохондриальных экстраютов проводили по методу Roche с соавт. [Roche S¡ Cate, 1977]. Последняя стадия очистки состояла в ультрацентрифугировании через слой 1,5 М сахарозы в 0,05 М HEPES-буфере, содержащем 0,1 мМ EGTA, что способствовало полному отделению фосфатазы от комплекса. Средняя удельная активность препарата комплекса - 3 ед. на 1 мг белка. ЦЦГ-фосфатазу изолировали из объединенных суперна-тантов,' полученных после осаждения ИДИ ПЭГ с последующим центрифугированием, дополнительно введен этап концентрирования раствора фермента с помощью ультрафильтрации. ТС® из синаптосом мозга крыс выделяли по разработанному наш методу (Постоенко и др., 1987], включающему хроматографию на аффинном сорбенте и гельфильтрацию на колонке с сефадексом G-150 (2,2x50 см). Аффинный сорбент - тиамин-Н-4-азобенэоил-е-ами-нокапроил-гидразидс.офароза 4В - синтезировали по методу Кля-шицкого с соавт. [Кляшицкий и др.,19803 с небольшой модификацией. Большинство исследований с ТТФ проведено с синтезированным нами ТТФ, очистка которого проводилась с помощью разработанного метода [Пархоменко, Климчук, "19823.

Активность ОДК в гомогенатах тканей определяли в сопряженной системе с р-нитроанилином и ариламинацетилтрансферазой [Wieland et all., 1972]. В отдельных исследованиях пируватде-• гидрогеназнуго и et-кетоглутаратдегидрогеназную активности определяли с феррицианидом как искусственным.акцептором электронов, взяв за основу метод, описанный Gubler [Gubler, 19623

2* . . 7

или модифицированный метод Kresza CKresze, 1979], в котором в качестве субстрата берется 11-14Ипируват. Для определения способности гомогенатов печени синтезировать ацетоин из пиру-вата пользовались разработанным нами методом определения аце-тоина без извлечения его из реакционной среды [Вовк, Пархоменко, 1982]. ВДГ-киназную активность ЭДК оценивали по скорости инактивации комплекса при инкубации в специальной среде и по скорости включения в комплекс меченого фосфата из [г-э2РШР. Активность ПДГ-фосфатазы измеряли по начальной скорости реактивации инактивированного фосфорилированием комплекса или по начальной скорости высвобождения d2P из препаратов комплекса, который был инактивирован в присутствии [т-32РШР. Активность транскетолазы определяли по образованию седогептулезо-7-фосфата известным методом. При'определении активности тиаминдифосфаткиназы инкубацию препаратов проводили в среде, описанной ранее [Воскобоев, Лучко, 1980] с использованием Сг-32РШР. Синтезированный [т-32РПТФ идентифицировали на полосках ацетата целлюлозы после электрофорети-ческого разделения продуктов реакции по разработанному нами методу. ТМФазную, ТДФазную и ТТФазную активности определяли по образованию неорганического фосфора с малахитовым зеленым [Kwok-Ming et all.,1986]. В отдельных экспериментах, в том числе во всех экспериментах с ТСБ, анализ ТТФазной активности проводили, измеряя ферментативным методом [Островский, 1979] скорость образования ТДФ. Ацетилхолинзстеразную активность определяли с реактивом Элдмана, используя в качестве субстрата ацетилтиохолин [Trotter & Burton, 1969].

Включение меченого углерода из [1-14С]пирувата так же как и меченого [14С]холина в ацетилхолин (АХ) определяли после осаждения АХ в виде периодата или рейнеката с помощью описанного метода [Fonnum, 1975]. Тиаминсвязывающую активность ТСВ определяли по описанной методике [Nishimure, 1984] с использованием [тиазол-2-14С]тиамина или [тиазол-^ЗЗтиамина в 0,05 M Рингер-бикарбонатном буфере, рН 7,4, время инкубации -20 мин. Несвязавшийся лиганд отделяли фильтрацией на мембранных фильтрах Millipor или Watman GF/C с диаметром пор 0,45.мк после добавления к инкубационной среде г-глобулина и полиэти-ленгликоля для осаждения белка [Cuatrecasas, 1972].

. Содержание индивидуальных тиаминфосфатов анализировали с

помощью разработанного нами метода CParkhomenko et al1., 1979], пирувата - ферментативным методом [Асатиани, 1969], свободных жирных кислот - известным колориметрическим методом — "CNovak, ""1565]. Содержание свободных восстановленных SH-rpynn определяли с помощью реактива Эллмана CSedlak & Lindsay, 19683 в гомогенатах немедленно после их приготовления и осаждения белков этанолом. В зависимости от объекта исследования содержание белка определяли по методу Бредфорда, Лоури или спектрофотометрически при 280 нм. Кинетический анализ данных по связыванию и ферментативной активности, а также статистическую обработку данных проводили с помощью специальных компьютерных программ.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.Исследование влияния тиаминового статуса организма крыс на функционирование ТДФ-зависимых ферментов.

Изменение содержания и направленности обмена тиамина в тканях обеспечивалось несколькими методическими приемами:

истощение эндогенного пула витамина за счет содержания животных на тиаминдефицитном рационе; введение на этом фоне тиамина; введение антагониста тиамина - окситиамина нормальным животным с целью вызвать В}- авитаминоз: интенсификация использования тиамина в тканях за счет скармливания животным высокоуглеводного рациона (адаптивный гиперлипогенез) и дополнительное введение на этом фоне тиамина.

В первой серии экспериментов исследовалась взаимосвязь между активностью ТДФ-зависимых ферментов и уровнем тиамина й печени крыс в условиях дефицита тиамина и при дополнительной его введении. Проверялось влияние на активность ферментов следующих факторов: насыщение ТДФ-ом алоферментных белков,индукция алоферментов тиамином или синтезирующимся из . него ТДФ-ом, состояние белковых SH-групп. Как свидетельствуют данные, приведенные в табл.1, внутримышечное введение авитаминозный животным тиамина, приводящее уже через 2 часа к максимальному увеличению его содержания в ткани печени, сопровождается повышением уровня всех анализируемых показателей, в том числе -• существенным повышением активности дегидрогеназ а-кетокислоЧ

З-Ч-ЪЗ . 9

Табл.1. Содержание тиамина (нмоль на 1 г ткани), небелковых SH-rpynn (мкмоль на 1 г ткани) и активность ферментов (мкмоль за 1 мин на 1 г ткани) в печени крыс при различной обеспеченности тиамином и введении на этом фоне ЦГИ и метио-нина (М±т, л - 5-12). Обозначения: I - контроль, II - Bi-ави-таминоз, III - Bi-авитаминоз + тиамин, IV - Bi- авитаминоз + ЦГИ + тиамин; "а" и "6" - достоверное отличие показателя от такового для I и II группы животных, соответственно.

1 |Условия |опыта Содержание тиамина Содержа^ ние SH-rpynn I .............- Активность ферментов!

свободного фосфори-лирован-ного ct-кетоглу-таратдегид-рргеназы . 1 1 пируват-| дегидро-| геназы |

| I 1,42 15,13 12,77 0,67 0,46 |

+0,18 +0,95 ±1,56 ±0,04 ±0,05 |

1 П 0,92 1,25а 6,24а 0,41а 0,19а |

±0,12 ±0,21 ±1,32 ±0,04 ±0,02 |

| III:

| через 1,57 16,85б 13,36 0,77 0,47б |

|2 часа ±0,44 ±0,56 ±2,65 ±0,15 ±0,06 |

|6 часов 1,66 16,50б 9,92 0,57 0,58 |

±0,33 ±4,45 ±2,62 ±0,10 ±0,18 |

|12 часов 1,31 12,08® 7,30 0,33а 0,40 |

±0,22 ±1,51 ±1,59 ±0,03 ±0,16 |

1 IV:

|через 3,99а' 6 23,17а'6 15,1 0,86® 0,836 |

|2 часа ±0,41 ±1,05 ±2,2 ±0,12 ±0,18 I

|б часов 5,69а' 6 22,19а' 6 11,9 0,69б 0,85б I

±0,52 ±1,20 ±2,3 ±0,04 ±0,20 |

|12 часов 2,59®'6 17,836 8,1 0.56 0,486 |

±0,08 ±1,51 ±2,8 ±0,05 ±0,09 |

| I + ме-

|тионин .1,04 2,58б 10,68® 0,69б 0,25б |

¡через ±0,30 ±0,38 ±1,43 ±0,08 ±0,04 |

|2 часа | „ |

и восстановленного глутатиона.

Ни в одной экспериментальной точке ЦГИ, ингибитор синтеза белков в цитоплазме , практически не -снижал-определяемую активность -ПДГ И""КГДГ~~в расчете на 1 мг митохондриального белка, а также величину ТДФ-эффекта для обеих дегидрогеназ.по которой условно можно судить о наличии свободного апофермен-та. Следовательно можно сделать вывод,что при В\- авитаминозе и последующем введении крысам тиамина количество апофермент-ных белков ТДФ-зависимых дегидрогеназ существенно не изменялось. В то же время в этих условиях наблюдалось выраженное изменение в уровне восстановленного глутатиона, и, соответс-• твенно, в соотношении оютслешшх-ьосстановленных SH- групп белков. Вопрос о роли окисления белковых SH-групп в нарушении функционирования ТДФ-зависимых ферментов при В}-авитаминозе и выяснении его причинной связи с уровнем тиамина еще не поднимался в литературе, поэтому представлялось целесообразным его исследойать. Данные, приведенные в табл.1, свидетельствуют о. том, что роль дефицита кофермента в снижении активности ферментов при авитаминозе не столь значительна.На последних стадиях авитаминоза достаточно восстановления внутриклеточного окисленного тиамина и ТДФ (их дисульфидов) за счет стимуляции метшнином синтеза глутатиона Штутман и др. ,19753 и восстановления уровня белковых SH-групп для того, чтобы повысить активность ферментов почти до уровня нормы.

Чтобы ответить на вопрос, что первично при развитии Bi -авитаминоза - снижение активности ТДФ-зависимых ферментов в результате дефицита кофермента или независимое от него нарушение синтеза глутатиона, являющееся причиной снижения уровня свободных и белковых SH-групп в тканях, был проведен корреляционный анализ, взаимосвязи между интересующими нас' показателями по всей совокупности экспериментальных точек, полученных в данной серии экспериментов. Результаты показали, что корреляция наблюдается только между активностью КГДГ и уровнем SH-групп и, в меньшей выборке - между активностью КГДГ и уровнем ТДФ (рис.1). Полученная совокупность экспериментальных точек была проанализирована с помощью компьютерной программы. В результате такого анализа концентрация SH-групп (или глутатиона),, при которой -активность фермента составляет 50Х от максимальной, определена равной 4,07±0,9 мкмоль на 1 г ткани.

SH-группы, ТДФ.нмоль на I г тк.

мкмоль на I г ткана

Рис.1. Зависимость активности а-кетоглутаратдегидро-генааы от уровня SH-групп (А) и содержания ТДф (Б) в печени крыс с различной обеспеченностью тиамином. Кривые построены согласно известной методике CDuggle-Ъу, 1981J.

что соответствует среднему физиологическому уровню глутатиона СКулинский, Колесниченко, 19901. Иной характер связи между КГДГ-активностью и содержанием ТДФ. Зависимость между этими параметрами выявлена нами только в группе животных с дефицитом тиамина при почти десятикратном, по сравнению с контролем, снижении уровня кофермента (рис.1,В). При анализе этих данных принято допущение, что определяемый фосфорилиро-ванный тиамин весь представлен ТДФ-ом и последний равномерно распределен в ткани печени.Несмотря на формальность 'и относительность предпринятого анализа, величина условной Кщ для ТДФ по отношению к активности КГДГ (3,83±1,62 мкМ) оказалась близкой к Km, определяемой для ТДФ в изолированных системах с соответствующим апоферментом [Butler et all., 1977; Roche & Reed, 19323. Эта величина в 5-6 раз ниже,, чем концентрация ТДФ в печени нормальных животных (табл. 1), следовательно, при физиологических условиях ТДФ как кофермент не является лимитирующим в функционировании зависящих о него дегидроге-наз. Форма кривой, представленной _ на рис. 1,2? свидетельст-

12

вует о том, что в качестве независимой переменной в данном случае выступает содержание ЗН-групп, следовательно изменение активности фермента есть следствие изменения_содержания восс-тановлённого глутатиона"." Дополнительным подтверждением такого вывода могут служить результаты экспериментов с введением ме-тионина тиаминдефицитным животным'(табл.1): в этих условиях повышения уровня ЗН-групп за счет стимуляции синтеза глутатиона введенным метионином достаточно для восстановления активности ТДФ-зависимых ферментов почти до уровня контроля. Результаты проведенного анализа свидетельствуют о том, что скорее нарушение обмена глутатиона, чем дефицит кофермента, может быть первичной причиной отменил активности ТДФ-ззвисиьшх дегидрогеказ при развитии В1-авитаминоза.

Ответ на вопрос, является ли падение уровня тиамина и его производных прямой причиной снижения уровня восстановленного глутатиона в тканях тиаминдефицитных животных или этот эффект опосредован снижением активности транскетолазы в результате дефицита ТДФ и угнетением вследствие этого пентозо-фосфатного пути окисления углеводов, получен в экспериментах с острым окситиаминовым авитаминозом. В первые 12 часов после ВЁедеНия крысам окситиамина не наблюдалось заметного изменения в активности транскетолазы, следовательно, в этом случае действие тиамина на обмен глутатиона через пентозофосфатный путь с большой вероятностью можно исключить. В то же время в этих экспериментач четко прослеживалась однонаправленность в изменении уровня ЗН-групп и свободного (не фосфсрнлированно-го) тиамина в первые часы после инъекции окситиамина (рис. 2). Компьютерный анализ совокупности экспериментальных точек, соответствующих содержанию ЗН-групп при конкретных значениях содержания тМаМина, показал, что они располагаются в определенной-последовательности, отличающейся для контрольных и подопытных (с введением окситиамина) животных. Полученные кривые формально свидетельствуют о зависимости содержания ЗН-групп от концентрации свободного тиамина, однако молекулярные механизмы такой связи неясны.

Судя по данным, приведенным в табл. 1, активность ПДГ так же как и КГДГ зависит от состояния ЗН-групп, однако выраженной прямой корреляции между активность этого фермента и уровнем ЗН-групп или тканеьой концентрацией ТДФ не удалось 4 - У- 3 3 13

Рис. 2. Содержание тиамина (ось абсцисс, в нмолях на 1 г ткани) и SH-■ групп (в мкмолях на 1 г ткани) в печени крыс в норме (1) и после введения ОТ(2). Кривые построены согласно известной методике CDuggleby, 1981}; Mim, П'3-5.

установить.Объясняется это тем, что регуляция ГЩК в физиологических условиях намного сложнее и сопряжена с ковалентной модификацией одной из субъединиц 1ЩГ CReed et all., 1975]. Поскольку в литературе имеются отрывочные сведения об участии ТДФ в регуляции ПДК фосфорилированием-дефосфорилированием [Roche, Cate, 1977; Alkony et all., 19761, мы попытались детальнее исследовать этот вопрос. Согласно имеющимся данным литературы [Пархоменко, Рыбина, 1978], многофакторная регуляция ПДК происходит,, в основном, на уровне его ТДФ-зависимого первого компонента, ГЩГ, который в большинстве случаев является лимитирующим в функционировании всего комплекса в целом. Проведенное нами сравнительное исследование изменения активности целого комплекса и его .первого компонента в печени крыс с моделью адаптивного гиперлипогенеза и введении на'этом фоне тиамина подтверждает лимитирующую роль пируватдегидрогеназно-го компонента в комплексе (табл.2). Однако, судя по данным, приведенным в табл. 2, изменение содержания ТДФ в физиологических пределах, даже повышение его уровня в печени животных IV группы в 1,5 раза по сравнению с I и III группами, не оказывает прямого активирующего, коферментного, влияния на активность зависящего от него фермента - ПДГ' и ПДК в целом. Напротив, при введении тиамина животным с адаптивным гиперли-погенезом наблюдаются обратнонаправленные изменения ~ ~в содержаний" ТДФ и активности фермента, что подтверждается со-

Т4

Й

а 5

с

ä 4 (i

I 2

4 6 6 7

Тмгиши

ответствующими изменениями в тканевой концентрации его субстрата - пирувата и жирны^ кислот. Последние в данном случае можно рассматривать Kai; конечный продукт-метаболического пути превращения"пирувата через ПДК, так как есть данные, что в этих условиях синтез жирных кислот прямо зависит от синтеза ацетил-КоА в полной реакции ПДК [Denton, 1975; Denton,Hugnes, 1987]. Результаты опытов по измерению всех показателей в динамике после однократной инъекции тиамина крысам с моделью

Табл. 2. Содержание производных тиамина (нмоль на 1 г свежей ткани), пируватдегидрогеназная активность (нмоль прореагировавшего пирувата аа 1 мин на 1 г ткани), уровень пирувата (нмоль на 1 г влажной ткани) и свободных жирных кислот (мкмоль на 1 г влажной ткани) в печени крыс с различной метаболической направленностью и после введения тиамина на фоне активации липогенеза; М±ш, n-5-Ю. Условные обозначения: I .- контроль, II - голод, III - высокоуглеводный рацион, IV - введение тиамина на фоне высокоуглеводного ра-• циона; "а" и "6и- достоверное отличие показателя от такового для I и III группы, соответственно.

1 1 I Покааа-| тель г р у п п а живо .....1 т Н Ы X |

I II III IV 1

1 Свободный 1,27+0,15 1,48±0,30 2,05±0,333 3,05±0,б3а |

I тиамин

IТМФ 2,85±0,80 3,58±0,47 2,99±0,33 3,85+0,50 |

1ТДФ 10,97±1,54 11,80±1,10 10,61±0,83 16,96±l,27ö |

|ТТФ 2,88±0,50 3,62±0,38а 2,61±0,27 4,33±0,68б |

|Актив- 243,90 60,49а' 6 349,27 220,49б |

ность ПДК ±62,40 ±13,66 ±42,93 ±37,07 |

|Актив- 49,72 24,62 55,67 23,76а'б|

1ПДГ ±10,18 ±7,62 ±12,51' ±2,02 |

|Пируват 57,50 35,43а-6 64,30 92,92а-61

±3,10 ±6,15 ±5,15 +9,32 |

I Св.жирные 5.90 6,96 6,36 5,47 I

|кислоты 1 +0,33 ±0,37 ±0,35 +0,40 I | I

4 * 15

адаптивного гиперлипогенееа (рис.3 и 4) подтверждают наличие в данных физиологических условиях обратной корреляции между изменениями в активности ПДК и концентрацией тиаминфосфатов.

«з и

а

я

сз а

га к го

а.1 о сз ж

30

12

18 чао

Рис. 3. Содержание свободного,общего тиамина и ТТФ .(соответственно,!, 2 и 3, в нмолях на 1 г ткани) в печени крыс с адаптивным гиперлипо-генезом в динамике после однократной инъекции тиамина; М±т, п-3-5.

Щ 60

Й аз

I 20

glOO & 80 3 60

з -

о 6

е

18 чао

Рис. 4. Пируват-дегидрогеназная активность(1,нмоль окисленного пиру-вата за 1 мин на 1 г ткани), содержа-, ние пирувата (2, нмоль на 1 г ткани) и свободных жирных кислот (3, мкмоль на 1 г ткани) в печени крыс с адаптивным гипе-рлипогенезом в динамике после однократной инъекции тиамина; М±т, п=3-5.

Первое предположение,которое возникает относительно механизма влияния тиамина на активность ПДК, исходя из Имеющихся сведений о сложности строения и регуляции этого ферментного комплекса в физиологических условиях,- прямое или опосредова-

16

иное влияние тиаминфосфатов на регуляцию ПДК фосфорилировани-ем-дефосфорилированием.Такое предположение подтверждается ре— вультатами экспериментов,-в которых в динамике после однокра- — тного введения тиамина крысам с адаптивным гиперлипогенезом активность ЛДГ измерялась до и после активации in vitro эндогенной ПДГ-фосфатазой. Активация фермента в присутствии 10 мМ Mg2+ почти полностью снимала отрицательный эффект тиамина.

Обобщая данные, приведенные в настоящей главе, можно заключить, что в норме в физиологических условиях отсутствует регуляция активности дегидрогеназных компонентов ПДК и КГДГ по принципу ассоциации-диссоциации апофермента и кофермента -ТДФ. Лишь при xsctkom Вг-авиташшозо, когда общее содержание тиамина снижается на порядок по сравнению с нормой, можно наблюдать зависимое от потери кофермента снижение активности КГДГ (рис. 1, Б). Тем не менее, изменение концентрации тиаминфосфатов в тканях in vivo, так же как и в изолированных митохондриях, в зависимости от условий может оказывать разнонаправленное влияние на функционирование ГЩК. Имеющиеся в литературе сведения о возможности ферментативного взаимопревращения в паре ТДФ-ТТФ и о строгой структурированности этих реакций на белглх [Reunwonga <5- Cooper, 1977] дают основания предполагать,что взаимопревращение тиаминфосфатов in vivo может быть сопряжено с регуляцией активности 11ДК, на первом ферментном белке которого показано наличие аффинного к ТДФ ре-гуляторного участка [Roche & Cate, 1977], отличного от такового, входящего в активный центр этого белка.

2. Исследование молекулярных механизмов действия ТДФ и ТТФ на функционирование ПДК

Анализируя возможные молекулярные механизмы участия тиаминфосфатов (ТДФ и ТТФ) в регуляции активности ПДК, мы остановились на следующих: 1). тиаминфосфаты, участвуя в реакциях перефосфорилирования с адениловыми нуклеотидами, увеличивают содоржлние внутримитохондриадыгаго АТР, актигируя таким сбра-с<ом ВДГ-кишшую реакцию; 2). ТТФ - служит донором г-фосфата в ПДГ-киназной реакции; 3). ТТФ по какому-то иному механизму активирует ВД'-кипазную реакцию или ингибирует ПДГ -фосфлтаз-ную реакцию.

5--Í/-3 3

Функционирование в условиях in vivo первого механизма практически невозможно: физиологическая концентрация тиамин-фосфатов, по крайней мере, на три порядка ниже таковой адени-ловых нуклеотидов. Предположение об участии ТТФ в ПДГ-киназ-ной реакции в качестве донора фосфата не подтвердилось при экспериментальной проверке на препаратах ВДК различной степени очистки. "г

Возможность участия ТДФ и ТТФ в регуляции активности ГЩГ-фосфатазы проверялась на грубоочищенных препаратах комплекса с уд.акт. 0,6 ед. при активации их экзогенной фосфата-зой. Как свидетельствуют полученные результаты (рис. 5), ТДФ способствует активации комплекса, в то время как ТТФ, не снижая активности комплекса ниже контрольной, предотвращает его активацию.

Рис. 5. Кинетика ацети-лирования р-нитроанилина в сопряженной реакции с арил-аминацилтрансферазой грубо-очищенными препаратами ЩК, предварительно проинкубированными в среде для активации эндогенной ПДГ-фосфата-зы без эффекторов (1) и с добавлением ТДФ (2),ТТФ (3) и АТР (4). К - активность в контрольной пробе.

Дальнейшее исследование тиаминфосфатов на функционирование регуляторных ферментов ПДК проводилось на очищенных препаратах ПДК (с которыми жестко ассоциирована ДДГ-киназа) и ПДГ-фосфатазы. Согласно полученным данным, ТДФ при всех исследованных концентрациях является эффективным активатором фосфатазы [рис. 6]. Анализ кинетики активации был проведен графическим методом в координатах Эди-Хофсти (в нашем случае - зависимость V/A от V, где А -концентрация активатора; V - скорость реактивации в присутствии активатора) [Уэбб, 1966]. Константу активации (Ка) определяли как величину, обратную тангенсу угла наклона прямой к

0 5 10 15 20 Мин

молекулярных механшмоБ действия

оси V (рис. 6, Б). Анализ показал, что при изменении концентрации субстрата сродство активатора к ферменту не изменя-

ло §

? 6 !Г б 50"

-Lg СТДФЗ

Рис. 6. Зависимость активности ПДГ-фосфатазы от концентрации ТДФ (А) •при различных концентрациях субстрата: 1, 2 и 3, соответственно, 30, 60 и 120 мкг белка ПДК, инактивированного с tr-32P3АТР; Б - то же в координатах Эди-Хофсти. Активность ПДГ-фосфатазы IV] определена по высвобождению згР из ПЛИ и выраяеяа в толях фосфора на 1 мг белка в мин.

ется, Ка остается равной в среднем 65 нМ. ТТФ, в отличие от ТДФ, при всех исследованных концентрациях снижает активность фосфатазы (рис. 7). В ингибировании прослеживается две зоны: первая - в диапазоне концентраций ТТФ 10-100 нМ, вторая - при концентрации выше 1 мкМ. Двухфазность в ингибировании сохраняется при использовании обоих методов анализа фосфатазной активности, однако ингибирование низкими концентрациями ТТФ гораздо более выражено при измерении активности фосфатазы по скорости реактивации комплекса. Наблюдаемую картину можно объяснить, допуская, что ТТФ при низких концентрациях, соизмеримых с концентрацией самого комплекса, связываясь с последним, более специфично ингибирует отщепление фосфатазой именно того фосфатного остатка из трех возможных ГКегЬеу et all., 1981], с которым связана реактивация комплекса.По-видимому, при высоких концентрациях. ТТФ тачая специфичность утра-

5*

19-

%

100

60

5 4 Lg СТТФ]

Рис. 7, Активность 1ЩГ-фосфатазы (в 7. от контроля), измеренная в присутствии различных концентраций ТТФ М±т, п-4). Активность измерена по скорости реактивации комплекса (1) и по скорости высвобождения Э2Р (2).

чивается. Можно предположить, что временное снятие ингибиро-вания ТТФ-ом активности фосфатазы - в диапазоне концентраций 0,Ь-5,0 мкМ связано с появлением в среде ТДФ, вызванным частичным разрушением ТТФ при инкубации в вышеуказанных условиях. Однако более вероятным представляется предположение, что ТТФ взаимодействует не с ПДГ-фосфатазой, а с белками самого комплекса, и это взаимодействие вызывает изменение конформа-ции последнего. Частичное подтверждение вышесказанному получено при анализе графическим методом в координатах Диксона кинетики ингибированил ЦЦГ-фосфатазы ТТФ-ом при более высоких его концентрациях. Полученные данные свидетельствуют, что ин-гибирование на этом участке конкурентно по отношению с субстрату - фосфоршшрованному комплексу; соответственно, Ki -25,0±3,0 мкМ. На основании этих результатов можно сделать вывод, что ТТФ ингибирует активность ПДГ-фосфатазы, препятствуя ее связыванию с комплексом.

Результаты исследования влияния обоих тиаминфосфатов на активность ПДГ-киназы показали (рис. 8), что ТДФ и ТТФ оба зыраженно ингйбируют активность ПДГ-киназы при концентрациях, превышающих 10 мкМоль. Угнетение ЦЦГкиназы ТДФ-ом уже описано ранее в литературе [Roche & Reed, 1972],тогда как сведения относительно ТТФ получены впервые.

Анализ представленных выше экспериментальных данных сви-

20

6

Рис. 8. Влияние тиаминфосфатов

70

(ТФ) на активность ЩГ-кина-зы (X от контроля): 1 - ТДФ,

50

г - ттф.

вГ 7 б 5 4 - 1ТФ1

детельствует.что при концентрациях, превышающих 10 мкМ, ТТФ сходным образом угнетает активность обоих регуляторных ферментов, один из которых прочно связан с комплексом, а другой - нет. Это может указывать на то, что, во-первых, ТТФ взаимодействует не с регуляторными ферментами,а с самим комплексом, а, во-вторых, что это взаимодействие приводит к уменьшению доступности регуляторного центра, подвергающегося фосфорили-рованию-дефосфорилированию. Последнее может быть следствием конформационного изменения комплекса, в пользу чего свидетельствует также приближенное значение коэффициента Хилла (0,48) для ингибирования ТТФ-ом ПДГ-фосфатазной реакции на линейном участке ингибирования,рассчитанное с помощью разностного метода [Курганов,1978) . В то же время коэффициент Хилла для активации фосфатазы ТДФ-ом близок к 1,0, что можно расценивать как факт, указывающий на наличие в комплексе одного регуляторного участка, связывающего ТДФ.

Приведенные выше данные свидетельствуют, что ТДФ как регулятор оказывает на ПДК только активирующее влияние, в то время как ТТФ при всех испытанных концентрациях тормозит активацию комплекса фосфатазой. В целом то обстоятельство, что два таких близких по строению и способных к взаимопревращению соединения, как ТДФ и ТТФ, оказывают на ГЩГ-фосфатазу противоположное действие, может иметь определенное физиологическое значение, обеспечивая дополнительный высокоспецифичный меха-

низм регуляции активности комплекса. Едва ли этот механизм может играть важную роль в ткани печени, где активность ПДК определяется, прежде всего, состоянием метаболизма, и только комбинация таких факторов, как активация липогенеза после голодания и введение на этом фоне тиамина,позволили нам выявить угнетающее действие тиамина на активность ПДК. В этом плане больший интерес представляют ткани,обогащенные клетками с возбудимыми мембранами, так как показано, ■ что регуляция функционирования в них ПДК четко сопряжена с изменением мембранного потенциала [Schaffer & Olson, 1980; Browing et all., 1981; Thashlhiro A. et all., 1984]. Именно поэтому исследования были продолжены на ткани мозга и синаптосомах.

3. Исследование некоферментной роли тиамина в функционировании нервной клетки

Одна из первых гипотез, касающихся нейротропной функции тиамина (Peters, 1964), объясняет патологические изменения в нервной ткани при недостаточности тиамина нарушениями в синтезе ацетил-КоА, предшественника нейромедиатора АХ, обусловленные снижением активности ЦДК из-за дефицита его кофермента - ТДФ. Дальнейшие исследования показали, что далеко не всегда нарушения функции нервной ткани, связанные с дефицитом тиами-.на, сопровождаются нарушением 1ЩГ-активности в мозгу (Haas, 1990), и гипотеза Peters- на некоторое время была забыта. Однако целый ряд экспериментальных данных, полученных исследователями за последнее время,-побуждают вернуться к рассмотрению вопроса о возможности реализации специфической нейротропной функции тиамина на уровне регуляции синтеза (или обмена) АХ. В аспекте рассматриваемой проблемы из этих данных наибольшее значение имеют следующие: 1) открытие механизма регуляции ПДК фосфорилированием-дефосфорилированием (Reed, 1969), 2) экспериментальные доказательства предпочтительности использования пирувата для синтеза АХ CLefresne et all., 1978; Perry et all., 1980], 3) доказательства четкой сопряженности регуляции ПДК по механизму фосфорилирования с функционированием возбудимой мембраны [Browing et all.,1981; Schaffer &-Olson, 19803. Выявление участия тиаминфосфатов в регуляции ПДК с учетом вышеперечисленных фактов позволяет вернуться - к гипотезе,

22

высказанной Peters, но с позиции иного, некоферментного, механизма действия тиамина.

Поскольку, по нашим наблюдениям, JM-и ГТФ оказывают ' противоположно направленное"действие на активность ПДГ-фосфа-тазы и в целом на активность ПДК, мы предположили, что легко протекающая m vivo трансформация этих двух фосфорных эфиров тиамина, сопряженная с изменением мембранного потенциала, может играть определенную роль в регуляции активности ПДК и, соответственно, синтеза АХ.

Однако, чтобы проверить это предположение, нужно было, прежде всего, убедиться, что, действительно, изменение концентрации тиаминфосфатов в нервной клетке будет приводить к изменении синтеза ЛХ из Шфувата и, соответственно, к изменению активности ПДК, и что концентрация фосфатов тиамина в клетке изменяется синхронно с изменением потенциала возбудимой мембраны.

Исследование влияния тиамина на синтез АХ из [2-14С] пи-рувата синаптосомами, проведенное в экспериментах in vitro, показало, что возрастание концентрации тиамина в среде инкубации от 1 до 50 мкМ приводит к нелинейному ингибировашяо включения меченого углеродз из Г2-1,3С] пирувата в АХ (Рис. 9). В тех же условиях полная активность ПДК, так же как и активность первого ферментного белка комплекса, изменяются синхронно с изменением включения метки из пирувата в АХ (рис. 9, 1 и 9, Z). Определение активности ПДГ синаптосом после активации in vitro эндогенной ПДГ-фосфатазой (рис.9, 4) показало, что действие тиамина направлено на регуляцию ПДК фосфорилиро-ванием-дефосфорилированием. Изменение включения радиоактивного углерода из пирувата в C0¿ (рис. 9, £>) также коррелирует с изменением активности ПДК и ПДГ.Полученные результаты свидетельствуют в.Пользу предположения о влияния тиамина на синтез АХ именно на уровне синтеза его предшественника - аце~-тил-КоА. Однако, чтобы с уверенностью утверждать, что этот путь воздействия тиамина на внутрисиналтосомальный метаболизм АХ единственный и не является результатом неспецифического влияния тиамина на все функции нервной клетки,опосредованного взаимодействием его с определенными рецепторами на возбудимой мембране, было проведено исследование влияния тиамина на другие процессы,связанные с синтезом и обменом АХ. а именно: на

Рис. 9. Активность ВДК Ш, ПДГ (2 и 3, соответственно, до и после активации эндогенной ПДГ-фосфатазой) и включение меченого углерода из С2-14С]пирувата в АХ (4) и СОг (5) в синаптосомах, инкубированных с тиамином. Все величины выражены в X от значения соответствующего показателя в контроле (инкубация без тиамина).

захват нервными окончаниями второго субстрата в реакции синтеза АХ - холина,на ферменты синтеза АХ - холинацетилтрансфе-разу (КФ 2.3.1.6) и гидролиза АХ - ацетилхолинэстеразу (АХЭ, КФ 3.1,1.7).- Оказалось, что как при субстратной (100 мкМ), так и при физиологической (1 мкМ) концентрациях холина, тиамин в диапазоне концентраций 0,1 мкМ-1 мМ не ингибирует захват холина. Напротив,® последнем случае при концентрации тиамина 0,1-10 миЧ наблюдается некоторая достоверная стимуляция

захвата холина. Исследование действия тиамина на активность холинацетилтрансферазы и АХЭ показали,что и на эти реакции тиамин_не_ влияет., при физиологических концентрациях^! АХЭ-ой активности тиамином определена равной 0,2 мМ.Таким образом, проведенные исследования подтверждают наае предположение об ивбирателЬном действии тиамина на синтез АХ на уровне регуляции ПДК.

При оценке полученных результатов неизбежно возникает вопрос: насколько физиологично это действие тиамина? Согласно имеющимся в литературе сведениям, тиамин высвобождается из нервно-мышечных препаратов при возбуждении [Minx,1938; Itoka-wa S Cooper, 19703, следовательно, можно ожидать, что в пре-синаптическсй щели in vivo периодически создаются определенные концентрации экзогенного по отношению к нервным окончаниям тиамина. В связи с этим был исследован характер взаимодействия тиамина с нервными окончаниями в диапазоне его физиологических концентраций (рис. 10). Оказалось,что Кд для спе-

[Тиамин], мкМ

Рис. 10. Взаимодействие тиамина с синаптосомами мозга крыс при инкубации в Кребс-Рингеровском бикарбонатном буфере при температуре °0 С (1 - превалирует связывание) и 37 °С (2 - связывание + транспорт).' Количество прореагировавшего тиамина рассчитано по удельной радиоактивности использованного меченого тиамина. С помощью компьютерной программы Ши^1еЬу, 19811 определены Кд*Л,34± 0,55 мкМ и К^-З.ЭЗИ.З мкМ.

цифического связывания тиамина с мембраной нервных окончаний и К,,) для его транспорта через мембрану имеют один и тот же порядок и равны,соответственно, 2,34±0,55 мкМ и 3,92±1,3 мкМ, что соответствует внутриклеточным.концентрациям тиамина. Результаты, полученные при исследовании концентрационной зависимости специфического связывания тиамина изолированными плазматическими мембранами синаптосом (ПМС) (рис. 11) и фактически отражающие характер взаимодействия тиамина с мембранами нервных окончаний, принципиально ничем не отличаются от данных, полученных при изучении взаимодействия тиамина с мембранами других клеток, например, слизистой желудка CRlndi & Ventura, 19723, гепатоцитов [Lumeng et all., 19793, клеток микроорганизов [Takashi, 19833 и др., согласно которым при низких концентрациях тиамина (от 0,01 до 10 мкМ) его взаимодействие с биологическими мембранами является активным процессом, При более высоких - преобладает пассивный транспорт.

. ,__4 3 [тиамин3

Рис. 11. Концентрационная зависимость связывания меченого тиамина препаратами ПМС (инкубация в Кребс-Рин-геровском бикарбонатком буфере в течение 2,5 мин, 37 °С, 0,5 мг белка ПМС на 1 мл среды): каждая точка - среднее из трех опытов; Вр - равновесная концентрация связанного тиамина [Варфоломеев и др., 1985].

Кд для специфического связывания тиамина с препаратами ПМС определена равной 3,1 мкМ. Захваченный синаптосомами меченый тиамин обнаруживается во всех субсинаптосомальных фракциях;' причем при" физиологических концентрациях его большая часть оказывается связанной с фракцией мембран и синаптических везикул (табл. 3). Уже через 2.5 мин инкубации синаптосом с меченым тиамином подавляющая часть захваченного ими тиамина фосфорилирована: тиамин, ТМФ, ТДФ и ТТФ составляют, соответственно, 16,8; 21,5; 41,5 и 20,Ж от общего содержания меченого тиамина (42,5 пмоль на 1 мг белка, среднее из трех независимых определений). Следует отметить, что при более длитель-

Табл,- 3. Распределение по субсинаптосомальным фракциям [З53]тиамина, поглощенного синаптосомами в опытах in vitro и in vivo (пмоль тиамина на 1 мг белка), М±ш, п-3.

i-1

In vivo

Препарат

In vitro

-,-!-

[тиамин)-2мкМ |[тиамин]-20мкМ

[тиамин]-1,5мкМ

Синаптосомы после шока Миелин + Гл.ретикулум Пл.мембраны синаптосом Синаптичес-кие везикулы Синаптосом. митохондрии

45,60110,17

4,1811,20 10,53+2,00

47,38413,05

3,27±1,00

245,80+74,07

28,80±5,бЗ 73,89+15.07

116,00+33,40

231,46±52,83

1,80±0,40

1,74±0,38 1,51+0,36

13,43±3,45

б,16±1,67

L

ной инкубации синаптосом в среде с тиамином, доля ТТФ снижается до 5,9%, что приближается к среднестатистическому содержанию этого фосфата в ткани мозга fBettendorff et all.,

1985). Полученные данные подтверждают имеющиеся в литературе сведения о том, что при поступлении тиамина в клетки животных значительная часть его проходит через стадию образования ТТФ, который является наиболее быстро обменивающимся

• - И7

фосфоршшрованным производным тиамина [Рыбина, 1959; Вегшап & Fishman, 1975]-. В то же время относительное содержание в синаптосомах других тиаминфосфатов, синтезирующихся из захваченного ими меченого тиамина, и через 15 мин инкубации значительно отличается от среднестатистических ■ показателей для ткани мозга: ТДФ составляет всего 41,2%, а доля ТМФ и свободного тиамина намного возрастает. Эти результаты свидетельствуют о том,что захваченный тиамин не смешивается о общим пулом тиамина в синаптосомах, основную часть которого в мозгу, как и во всех* других тканях, составляет ТДФ [Matsuda & Cooper, 1981]. На основании этих данных было выдвинуто предположение о существовании в нервных окончаниях подвижного пула тиамина, отличного от метаболического пула, представленного, в основном ТДФ, связанным с белками зависимых от него ферментов. Детальное изучение локализации ферментов синтеза и деградации ТДФ и ТТФ в изолированных синаптосомах показало, что,так же как и в других клетках, синтез этих тиаминфосфатов в нервных окончаниях происходит преимущественно в цитозоле, ТТФазная активность наиболее высока во фракции плазматических мембран и синаптических везикул, . ТДФазная - в митохондриях. Предположение о наличие лабильного пула тиамина в нервных окончаниях подтверждается результатами экспериментов по изучению влияния факторов,деполяризующих мембрану синаптосом, на связывание синаптосомами меченого, тиамина. Деполяризация мембраны не только препятствует связыванию'тиамина синаптосомами, но и приводит к выбросу в окружающую среду уже захваченного ранее тиамина (рис. 12).

Исследования с использованием флуоресцентного.зонда показали, что тиамин и его фосфаты, добавленные в инкубационную среду, в свою очередь вызывают деполяриз'ацию синаптических мембран: в Кребс-Рингеровской среде тиамин, ТМФ, ТДФ вызывают заметную деполяризанию мембраны, начиная от 1-10 мкМ и выше, ТТФ - при более низких концентрациях - 0,1 мкМ. Поскольку присутствие ТТФ в пресинаптической щели практически исключено (в мембране содержится ТТФаза), а концентрации тиамина и других его фосфатов, вызывающие деполяризацию, довольно высоки в сравнении с возможной концентрацией их in vivo в пресинаптической щели, мы считаем, что деполяризующее действие этих соединений'на синаптическую мембрану извне не

t-

м

к

"3

I 2

I

2

мин

мин

Рис. 12. Связывание (А) и высвобождение (В) тиамина синаптосомами при деполяризации их добавлением KCL в концентрации 4,5 мМ (1), 30 мМ (2), 60 мМ (3) и KCL (30 мМ) с валиномицином (4).

физиологично. Однако, не исключено, что тиаминфосфаты могут оказывать определенное влияние на мембранный потенциал изнутри клетки. Действительно, данные, полученные при изучении взаимодействия тиамина и его фосфатов с препаратами синапто-сом и ПМС, подтверждают высказанное выше предположение. Оказалось, что тиаминфосфаты не конкурируют с [г4С]тиамином за связывание с препаратами синаптосом, но являются эффективными конкурентами этому лиганду при взаимодействии его с препаратами ПМС. Наиболее показательные результаты в этом плане получены в экспериментах с 1ТФ-ом (Рис. 13).

Детальное исследование, проведенное методом конкурентного анализа [Варфоломеев, Зайцев, 1982], показало, что сродство ТТФ к препаратам ПМС даже несколько выше,чем самого тиамина; рассчитанная для него Кд равна 1,0±0,3 мкМ.Различие в результатах, полученных с препаратами синаптосом и ПМС можно объяснить тем обстоятельством, что в случае синаптосом ТДФ и ТТФ неспособны связаться с внешней поверхностью мембраны, в препаратах же ПМС ориентация мембранных везикул смешанная (примерно наполовину) и для взаимодействия становится доступной внутренняя поверхность ПМС.к которой сродство тиаминфо-

сфатов выше. Таким образом, можно предположить наличие определенной детерминированности потока тиамина и его фосфатов между нервным окончанием и пресинаптической щелью, сопряженного с функциональным состоянием возбудимой мембраны: захват тиамина при реполяризации мембраны, 'фосфорилирование его до ТДФ и ТТФ в цитоплазме и дефосфоршшрование всех фосфатов до тиамина и выброс в пресинаптическую щель при деполяризации (возбуждении). Мы предполагаем,что в этом челночном движении тиамина через мембрану нервных окончаний определенное участие принимает изолированный нами из синаптосом тиамийсвязы-вающий белок.(ТСБ).На такое предположение наводит одинаковое сродство тиамина к ТСБ и препаратам ПМС, что нашло отражение в довольно близких значениях Кд,составляющих .соответственно, 3,1 и Э,0 мкМ. Сравнительное исследование взаимодействия фосфорных эфиров тиамина с ТСБ и ПМС,Проведенное с использованием [14С]тиамина с помощью метода конкурентного анализа также показало сходство этих характеристик для обоих препаратов (рис. 14): и в той и в другом случае наиболее активно конкурируют с тиамином за связывание ТТФ' и ТМФ.

В дополнение ко всему выявлена способность ТСВ в присутствии ионов двухвалентных металлов избирательно гидролизовать фосфорные эфиры тиамина, наиболее активно - ТТФ (табл. 4) и аффинитет его к АХ, характеризующийся Кд-13,0±2,0 мкМ. Константа Михаэлиса для реакции гидролиза ТТФ .ТСБ определена равной 17,7 мкМ . Эта величина несколько выше, чем возможная усредненная концентрация ТТФ в нервных окончаниях. Следователь-'

го-

ТСА, %

50

Л

[+1

гЬ

•ь

¡4т

Б

Л

1294 123 4

Рис. 14. Тиаминсвязывающая активность (в % от контроля) ТСБ (А) и ПМС (Б) при инкубации их с 10-кратным избытком немеченого тиамина (1),ТШ> (2), ТДФ (3) и ТТФ (4).

Табл. 4. Способность субсинаптосомальных фракций и ТСБ гидролизовать фосфорные эфиры тиамина (в нмоль ?1 на 1 мг белка за 15 мин, п - 3 - 5).

1 | препарат 1 I ТТФ + мг2+ ) ТДФ, рН 9,0 1 1 | ТМФ + | I М(Т2+ 1

IрН - 9.0 I 1 |рН - 7,61 1 | + | + Са2+ 1 1 1 |рн - 9,0|

| синаптосомы | 35,0 1 1 1 41,5 | 31,9 1 1 48,6 1 38,5 |

1 ±9,5 1 ±Ю,б | ±10,5 1 ±6,0 1 ±4,3 |

I ПМС | 99,3 1 61,5 | 88,2 1 71,0 1 53,0 |

| ±28,0 1 ±13,5 | ±25,6 | ±13,6 1 ±13,5 |

| митохондрии 1 8,1 1 27,8 | 72,4 I 317,0 1 27,9 |

|синаптосом 1 ±4,6 1 ±2,0 1 ±19,5 1 ±15,4 1 ±3,0 |

)синаптич. I 92,0 I 156,5 | 70,1 1 91,9 1 151,1 1

I везикулы 1 ±16,7 1 ±46,0 | ±19,1 1 ±4,0 1 ±11,5 |

I миелин + 1 ю.о 1 19,1 I 54,3 1 ?8,4 1 24,0 |

|мембраны гл. 1 ±3,5 1 ±9,0.1 ±13,4 | +29,0 ! ±5,7 |

Iретикулума 1 1 1

I ТСБ 1 48,9 I 363,4 | 206,8 | 134,7 1 65,0 |

| 1 ±9,4 1 I ±38,5 | 1 1 ±61,4 I ±33,8 I 1 ±21,4 | 1 1

но, можно предположить, что если белок и функционирует как ТТФаза in vivo, то только в строго определенных условиях. Такой вывод подтверждается и результатами исследования кинетики угнетения ТТФазной активности тиамином: оказалось, что тиамин угнетает ТТФазную активность'ТСБ при его физиологических концентрациях <Ki-4,5 мкМ). Это угнетение, по нашим данным, имеет неконкурентный характерно отношению к ТТФ, что может свидетельствовать о связывании тиамина и ТТФ различными участками белка. Установленные факты привлекают интерес к ТСБ как возможному звену в цепочке реакций, вовлекающих тиамин в осуществление специфических функций нервной клетки. ,

На основании анализа всей совокупности полученных нами данных и данных литературы была сформулирована новая гипотеза о механизмах нейротропного действия тиамина, краеугольными точками которой являются представления о наличии в нервных окончания подвижного пула тиамина, потенциалзависимая циркуляция его между пресинаптической щелью и внутриклеточным пространством синаптосом, сопряжение обмена тиамина (его подвижного пула) с обменом АХ. По нашим предположениям, может быть несколько участков такого сопряжения: на уровне регуляции синтеза ацетильного компонента АХ (регуляция активности ЦЦК), перенос ацетильного компонента через митохондриальные мембраны, захват и (или) высвобождение АХ или продуктов его гидролиза нервными окончаниями. Мы также не исключаем возможности участия тиамина в регуляции функционирования ацетилхолинового рецептора, о чем уже имеются сведения в литературе ÍDoerffe et all., 1979], а также возможности участия тиаминфосфатов, особенно ТТФ, в регуляции фосфорилирования функционально важных белков нервных окончаний. Обнаружение в мембранных структурах нервного окончания функционально активного ТСБ, проявляющего сродство как к тиамину, так и к АХ, подтверждает справедливость высказанных выше-предположений. В целом же вся совокупность полученных данных свидетельствует о том,что нейроактив-ность тиамина объясняется не наличием уникальной некофермент-ной функции тиамина в нервных клетках, а особенностями структурно-функциональной организации последних; обусловливающих исключительную важность для них отдельных биохимических реакций, протекающих с участием тиамина по некоферментному механизму и имеющих универсальное распространение во всех тканях.

выводы

1. В тканях животных регуляция активности первого_.компо-- -_ нентадегидрогеназных комплексов «-кетокислот по принципу ассоциация-диссоциация кофермента (ТДФ) и апофермента реализуется только в условиях глубокого авитаминоза. Подтверждением этого является определенная нами величина кажущейся Km КГДГ для ТДФ в ткани печени, равная 3,8±1,6 мкМ, что в 5-6 раз ниже физиологической концентрации ТДФ.

2. Выявлена прямая корреляционная связь, не зависящая от коферментной функции ТДФ, между уровнем тиамина в свободной форме и уровнем восстановленного глутатиона в ткани печени. Изменение уровня восстановленного глутатиона под воздействием тиамина может быть одним из факторов его регуляторного действия на активность ТДФ-зависимых дегидрогеназ.

3. ТДФ и ТТФ в физиологических концентрациях принимают у лстие в регуляции активности ПДК по механизму фосфорилиро-вания-дефосфорилирования. Оба тиаминфосфата ингибируют активность ПДГ-киназы (что приводит к активации ПДК) и действуют противоположнонаправленно на активность ПДГ-фосфатазы. ТДФ активирует ее (Кд-0,02 мкМ), ТТФ оказывает' нелинейное ингиби-рование (и, таким образом, ингибирует активность ПДК).

4. В нервных окончаниях тиамин опосредованно через регуляцию тиаминфосфатами активности ПДК по механизму фосфорили-рования-дефосфорилирования принимает участие в регуляции синтеза ацетилхолина из пирувата.

5. На плазматических мембранах синаптосом (ПМС) обнаружены участки, специфически связывающие тиамин (Кд- 3,0 мкМ). Тиаминфосфаты конкурируют с тиамином за связывание с препаратами ПМС (ТТФ>ТМФ> ТДФ) и неспособны конкурировать с ним при взаимодействии с ■ нативкыми синаптосомами, что свидетельствует о лгасализации тиаминсвязывающих участков на внутренней поверхности IIMC.

6. Из синаптосом впервые изолирован тиаминсвязываюший белок (ТСВ), сродство которого к тиамину идентично к таковому ШС (Кд-3,1 мкМ). Изолированный ТСБ проявляет способность избирательно гидролизовать фосфорные эфиры тиамина, наиболее активно -. ТТФ, и связывает ацетилхолин с КД-13,СИ2,0 мкМ. Сходство изученных характеристик изолированного ТСБ и ПМС в отношении связывания тиамнна свидетельствует о вероятной ло-

33

кализации белка в возбудимых мембранах и об участии его в реализации нейротропной функции тиамина.

7. Исследовано распределение ферментов синтеза и деградации тиаминфосфатов в .нервных окончаниях.В нервных окончаниях, так же как и в клетках других тканей, синтез ТДФ и ТТФ локализован преимущественно в цитоплазме, гидролиз ТДФ наиболее активно осуществляется митохондриями, а ТТФ - плазматическими мембранами синалтосом и синалтическими везикулами.

8. Захв4ченный синаптосомами экзогенный тиамин фосфорили-руется до ТМФДДФ и ТТФ и включается во все субсинаптосомаль-ные фракции. Распределение по фракциям меченого тиамина, попавшего в синаптосомы в опытах in vivo и in vitro неодинаково: в первом случ4е большая часть метки локализована в митохондриях, во втором - во фракции плазматических мембран и синаптических везикул. При деполяризации захваченный in vitro меченый тиамин высвобождается из синалтосом в окружающее пространство. Постулируется существование в нервных окончаниях двух пулов тиамина: медленно обменивающегося (связанного с ферментными белками) и быстро обменивающегося, циркуляция которого между вне- и внутриклеточным пространством нервного окончания сопряжена с функциональным состоянием плазматических мембран. -

9. На основании анализа собственных экспериментальных и литературных данных предложена новая гипотеза механизма реализации нейротропной функции тиамина, в основе которой лежит представление о взаимосвязи обмена тиамина и ацетилхолина.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Риб1на А.О., Пархоменко Ю.М., Полыцак Р.Б. Препаративне розд!лення т1ам1нди- i трифосфат!в методом hohoo6míhhhoí хроматограф!i // Укр. 6íoxím. журн. - 1975. - 47, N 3. -С. 385 - 388.

2. Пархоменко Ю.М., Риб1наА.А., Полыцак Р.Б. Розд^дення фосфорних эф1р!в TiaMiHy на ионообм1нному сефадекс1// Укр. 6ÍOXÍM. журн. - 1976. - 48, N 3.- С. 384'- 387.

3. Риб1наА.О., Пархоменко Ю.М., Полыцак Р.Б., Чаусовський Т. I. РегуляЩя т1ам1ндифосфатом активност! i синтезу апо-ферментхБ дег1дрогеназ и-кетокислот// 3-й Украпюький 6i-

34

oxiM.3"isfl. тез.симп.доп., Донецьк, 1977. - С. 180 - 181.

4. Рыбина A.A., Пархоменко Ю.М., Польщак Р.Б.,___Чаусовский -------

----------Т.И. О коферментной" регуляции активности ТДФ-содержащих

ферментов // Витамины. - Киев: Наукова думка. - 1976, N 9. - С. 47 - 58.

5. Пархоменко Ю.М., Рыбина A.A. Регуляция активности дегид-рогеназ а-кетокислот в организме животных // Биохимия животных и челсвсга, вып. 2. Киев': Наукова думка. - 1978. -С. 58 - 71.

6. Пархоменко Ю.М., Рыбина A.A., Польщак Р.Б., Чаусовский • Т.И. Пируват- и й-кетоглутаратдегвдрогенаэная активность

и их регуляция при различной обеспеченности крыс тиамином // Материалы Всесоюзн. симпоз."Актуальные проблемы витаминологии". - Москва.- 1978. С. 153.

7. Хмелевский Ю.В., Рыбина A.A., Пархоменко Ю.М. и др. Влияние совместного введения, метионина и витаминов В* и Е белым крысам с экспериментальным инфарктом миокарда на некоторые показатели углеводного обмена в мозге, сердце и печени // Депо ВИНИТИ N 158-77 от 25.04.1977, 12 стр., РЖ "Биология". - 1977, N 8. - Реф. 8Н249.

8. Польщак Р.Б., Рыбина A.A., Пархоменко Ю.М., Халмурадов А. Г. Исследования содержания тиамина, его коферментной формы и активности тиаминзависимых ферментов в онтогенезе крыс // Укр.бШш.хурн.- 1378. - 50, N 2.- С. 226 - 229.

9. Пархоменко Ю.М., Халмурадов А. Г., Рыбина A.A., Полыцак Р.Б. Влияние метионина и витаминов Bj и Е на активность тиаминдифосфатзависимых ферментов в сердечной мышце крыс с экспериментальным инфарктом миокарда //. Материалы Всесоюзной конференции по биохимии мышц. Ленинград: Наука. -1978. - С. 135 - Í37.

10. Чаговец Р.В., Рыбина A.A., Пархоменко Ю.М. и др. Об обмене тиамина и его биологически активных производных // Тиамин. - Москва, Наука. - 1978.С. 5 - 26.

11. Рыбина A.A., Пархоменко Ю.М., Польщак Р.Б. Пируват- и «-кетоглутаратдегидрогеназная активность и их регуляция при различной обеспеченности крыс тиамином/ В кн.: Актуальные • проблемы витаминологии': мат. Всесоюзного симп., 1978. - Москва. - С. 153.

12. Parkhomenko Yu.M., Rybina A.A., Khalmuradov A.G. Separa-.

tion of thiamine phosphoric esters on sephadex-cation exchanger// In book: Methods in Enzymology, v.' 62: Vitamins and coenzymes, p. D/ ed. D.B.Mc Cormic & L.D.Wright. - N. Y. -London: Academic Press. - 1979. - P. 69 - 63.

13. Рыбина А.А., Халмурадов А.Г., Пархоменко Ю.M. Белки, специфически связывающие тиамин и их биологическая роль // Укр. бИОХИМ. журн. - 1980. - 52, N 5. - С. 652 - 667.

14. Пархоменко Ю.М., РибшаА.А., Халмурадов А.Г. Вивчення рол1 т1ам1нтрифосфату в шптинному метабол1зм1 // Матер. Укр. SioxiM. -з'1зду. - Ктв: Наукова думка. - 1982. С. 113 - 114.

15. Пархоменко Ю.М., Климчук С.А. Препаративное получение ти-аминтрифосфата с помощью катионообменных смол // Укр.био-хим. журн. - 1982. - 54,. N 5.- 0. 551 - 553.

16. ВовкА.И., Пархоменко Ю- М., Бабичева Г.Ф., Черныш И. ¡0. Простой 'метод определения ацетоина в биологических средах // Укр.биохим.журн.- 1982. - 54, N 6. - С. 685 - 689.

17. Пархоменко Ю.М., Вовк А.И., Протасова З.С. и др. Влияние тиамина на активность пируватдегидрогеназного комплекса печени крыс при интенсификации липогенеза // Укр. биохим. журн. - 1983. - 55, N 4. - С. 408 - 414.

18. Пархоменко Ю.М., Рыбина А.А., Климчук С.А., Халмурадов А.Г. Исследование взаимосвязи между содержанием тиамин-фосфатов и пируватдегидрогеназной активностью в печени крыс с интенсифицированным липогенезом// Укр.биохим.журн. - 1983. - 55, N Б. - С. 617 - 522'.

19. Пархоменко Ю.М., Халмурадов А.Г. Авт.св-во СССР N 1053811, А 01К 61/62 от 25.08.1983, Билл. ИР M 42, 1983.

20. Пархоменко Ю.М., Протасова З.С., Халмурадов А.Г. Тиамин-фосфаты и регуляция активности пируватдегидрогеназного комплекса в митохондриях печени крыс // Укр. биохим. журн. - 1986. - 58, N 6. - С. 35 - 41.

21. Пархоменко Ю.М., Халмурадов А.Г., Черныш И.Ю., Чурилова Т.Я. Исследование специфического связывания [14С]тиамина и тиаминфосфатов с синаптическими мембранами/ В кн.: мат. Всес. конф. по нейронаукам, Киев, 1986. - С. 102.

22. Халмурадов А.Г., Пархоменко Ю.М., Черныш И.¡0., Чурилова Т.Я. Особенности связывания тиамина синаптическими-мембранами мозга крыс// 5-й Всес. биохим. съезд: тез. докл. -

36

Москва, 1986. - С. 460 - 461.

23. Розанов В.А., Пархоменко Ю.М.__Пируваг-_и оксоглутаратде------

гидрогеназнгш активность различных отделов головного мозга // Укр. биохим. журн. - 1987. - 59, N 1. - С. 29 - 33.

24. Пархоменко Ю.М., Черныш И.Ю., Чурилова Т.Я., Халмурадов

A.Г. Влияние тиаминфосфатов на активность регуляторных ферментов пируватдегидрогенаэного комплекса // Укр. биохим. журн. - 1987. - 59, N 6. -С. 49 - 54.

25. Пархоменко Ю.М., Черныш И.Ю., Протасова 3.С., Постоенко

B.А. Вивчення б1ох1м1чних механизм!в нейротропност! т1а-Miny/' В кн.: Доп. V-rо Укр.бшххм. зЧзда, 1987. - С. 120 -121.

26. Постоенко В.И., Пархоменко Ю.М., ВовкА.И., Халмурадов А.Г., Донченко Г.В. Выделение и некоторые свойства тиа-минсвязывающего белка синалтосом головного мозга крыс // Биохимия. - 1987. - 52, N 11. - С. 1792 - 1797,

27. Постоенко В.А., Пархоменко Ю.М., Донченко Г.В. Характеристика тиаминсвязывающего белка синалтосом мозга крыс // Укр.биохим. журн. - 1987. - 59, N б. - С. 9 - 14.

28. Пархоменко Ю.М., Протасова 3.С., Постоенко В.А., Донченко Г.В. Локализация ферментов синтеза и деградации тиамин-трифосфата в синаптосомах мозга крыс // Докл. АН УССР, сер. Б. - 1988. - N 8. - С. 73 - 76.

29. Пархоменко Ю.М., Черныш И.Ю., Донченко Г.В., Халмурадов А.Г. Введение витаминного премикса в рацион животных с интенсифицированным липогенезом // Вестник с/х науки. 1988. - 308, H 2. - С. 63 - 67.

30. Давиденко Н.К., Вукивская Г.Л., Пархоменко Ю.М. Устойчивость комплексов тиаминмонофосфата и тиаминдифосфата с ионами металлов// Координационная химия. 1989. - 15, N 6. - С. 1059 - 1062.

31. Parkhomenko Yu.M. The noncoenzyme mechanism of thiamine phosphates participation in régulation of the pyruvate dehydrogenase complex//Molecular organization of biologi--cal structures: abstr.book. ,v.1.- Moscow.- 1989. - P.143.

32. Протасова 3.С., Пархоменко Ю.М., Донченко Г,В, Транспорт тиамина через плазматические мембраны синалтосом мозга крыс // Механизмы регуляции клеточной активности: тез. докл. - Ташкент. - 1989. - С. 62 - 63.

.37 •

33. Постоенко В.А., Пархоменко Ю.М., Донченко Г.В. Особенности физико-химического строения тиаминсвязывающего белка синаптосом мозга крыс// Нейрохимия. - 1990. - 9, N 1. -С. 29 - 34.

34. Пархоменко Ю.М., Черныш И.Ю., Протасова 3.С., Донченко Г.В/ Исследование взаимосвязи между обеспеченностью тканей тиамином, активностью тиаминдифосфатзависимых ферментов и уровнем восстановленного глутатиона // Укр. биохим. журн.- 1990.- 62, N 6. - С. 63 - 69.

35. Пархоменко Ю.М., Донченко Г.В. Взаимосвязь обмена тиамина и ацетилхолина в нервных окончаниях мозга крыс/ В кн.: Клиническая витаминология: тез. Всес. конф., 1991.- С. 9 - 10. .

36. Протасова 3.С., Пхакадзе Е.Г., Черныш И.Ю., Пархоменко Ю.М. Исследование хиаминтрифосфатазной .активности тиаминсвязывающего белка/ там же, С. 36.

37. Parkhomenko Yu.M., Protasova 2.S., Chernysh I.Yu., Phka-• kadze E.G., Donchenko G.V. Modification of acetylcholine

synthesis in the rat brain synaptosomes by thiamine and its relation to the regulation of the pyruvate dehydrogenase complex activity / In book: Biochemistry and Physiology of ThDP-Dependent Enzymes.Proc.Int.meet., 1990/ed.H. Bisswanger & J.Ullrich. - Weinhelm-New York-Basel-Cambridge: VCH. - 1991. - P. 376 - 380.

38. Пархоменко Ю.М., Яковенко Е.Я., Донченко Г.В. и др. Кормовая добавка. Авт. св-во СССР N1669099, 1991.

39. Пархоменко Ю.М., Черныш И.Ю., Донченко Г.В. Повышение эффективности использования тиамина при введении его в организм совместно с метионином и витамином Е // Вопросы питания. - 1992. - N 1. - С. 45 - 48.

40. Пархоменко Ю.М., Протасова 3.С., Черниш 1.Ю., Донченко Г.В. Особливост! обм!ну т1ам1ну в нервових зак1нченнях мозку щурхв// VI Укр. б1ох1м. з'13д: тез. доп., ч.1. -

. Кшв: Видавництво УСТА, 1992. - С, 134.