Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов действия митохондриально-направленных антиоксидантов при острой почечной недостаточности

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов действия митохондриально-направленных антиоксидантов при острой почечной недостаточности"

На правах рукописи

Янкаускас Станисловас Стасисович

Исследование механизмов действия митохондриально-направленных антиоксидантов при острой почечной недостаточности

03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 СЕН 2014

МОСКВА

2014

005552255

Работа выполнена на Факультете биоинженерии и биоинформатики и в НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», заведующий лабораторией структуры и функции митохондрий доктор биологических наук, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», ведущий научный сотрудник Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ФГБУ науки «Институт биохимии им. А.Н.Баха» РАН, лаборатория биомедицинских исследований, ведущий научный сотрудник

доктор биологических наук, ФГБУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН, ведущий научный сотрудник Ведущая организация:

НИИ молекулярной медицины ГБОУ ВПО Первого МГМУ им.И.М.Сеченова

Защита состоится «¿» О-^М 2014 г. в часов мин на заседании Диссертационного совета Д 501.001.93 при Биологическом факультете МГУ имени М.В. Ломоносована по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ломоносовский пр-т, 27

Автореферат разослан «>> С2-М-И 2014 г.

Зоров Дмитрий Борисович

Плотников Егор Юрьевич

Ковалев Леонид Иванович

Сурин Александр Михайлович

Ученый секретарь диссертационного совета,доктор биологических наук

■и оЧ Г I

Б.А. Умарова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Острая почечная недостаточность (ОПН) - это синдром, характеризующийся быстрым (в течение часов или недель) снижением скорости клубочковой фильтрации, которое сопровождается накоплением продуктов азотного метаболизма, водно-электролитными и кислотно-щелочными нарушениями (Devarajan P. et al, 2005). ОПН представляет собой социально значимую патологию в силу ее широкой распространённости и провоцируемой ею высокой смертности. Данная патология развивается у 5% всех госпитализированных больных и у 30% пациентов отделений интенсивной терапии, а летальность составляет 40-60% (Schrier R.W et al, 2004).

Такая высокая смертность частично объясняется преобладанием больных пожилого и старческого возраста в популяции больных ОПН, а также тем фактом, что в подавляющем большинстве случаев данная патология встречается как осложнение различных тяжёлых состояний (в пост-операционном периоде, при тяжёлых травмах, системных нарушениях гемодинамики, сепсисе, сердечной недостаточности). Однако, главная причина высокого уровня смертности заключается прежде всего в отсутствии эффективной фармакологической терапии ишемической ОПН. Большинство современных подходов направлено на коррекцию осложнений, возникающих в результате нарушения работы почки, и носят симптоматический характер (Мухин Н.А., 2009).

Структура смертности ОПН определяется ренальной формой этой патологии, когда причиной почечной недостаточности становится повреждение ткани органа. В 55-75% случаев повреждающим агентом является ишемия органа, в 30-40% нефротоксическое действие различных препаратов (аминогликозидные антибиотики, радиоконтрастные вещества, противораковые и иммуносупрессивные препараты) (Thadhani R. et al, 1996; Lameire N., 2005; Ярмагомедов A.A, 2005). Работы последних лет демонстрируют ключевую роль окислительного стресса в патогенезе ишемической и нефротоксической ОПН (Plotnikov E.Y. et al., 2007; Rodriguez F. et al, 2014). В условиях окислительного стресса митохондрия является главным источником образования активных форм кислорода (АФК) и одновременно мишенью их повреждающего действия (Broekemeier К.М. et al, 1992; Zorov D.B. et al, 2000; Rasola A. et al, 2010). Следствием митохондриальной дисфункции становится глубокий энергетический дефицит переживаемый клетками нефрона, не позволяющий им эффективно выполнять свои функции, и даже приводящий к их некрозу. Одновременно активируются сигнальные пути апоптотической программы. Таким образом, можно предполагать, что нормализация функционирования митохондрии в условиях окислительного стресса может предотвратить повреждение органа.

Существует две стратегии нефропротекции, рассматривающие как главную мишень митохондриальный ретикулум. Первая основана на использовании антиоксидантов и направлена на уменьшение количества АФК. Несмотря на множество экспериментальных доказательств, эффективность

подхода оспаривается данными клинических испытаний (Kromhout D., 2001). Причиной этого, по всей видимости, является недостаточная концентрация «классических» антиоксидантов в клеточных компартментах, ответственных за образование и реализацию ключевых эффектов АФК. Различные группы исследователей в настоящее время разрабатывают подходы, позволяющие антиоксидантным молекулам преимущественно накапливаться и осуществлять своё антиоксидантное действие внутри митохондрии (Sheu S.S. et al, 2006; Zabbarova I., Kanai A., 2008; Антоненко Ю.Н. и др., 2009).

Вторая стратегия, получившая название ишемического прекондиционирования (ИПК), использует активацию сигнальных путей, приводящих к увеличению толерантности клетки к уже образовавшимся АФК. Запуск сигнальных каскадов может осуществляться при помощи как физиологических, так и фармакологических манипуляций. Ряд исследований показали ключевую роль митохондрии и АФК в реализации защитных механизмов ИПК (Park К.М. et al, 2001; Juhaszova М. et al, 2009).

Целью данной работы было исследование действия митохондриально-направленных соединений семейства SkQ при ОПН через влияние на продукцию АФК и сигнальные пути прекондиционирования органа.

Задачи работы:

1. Исследовать влияние различных митохондриально-направленных соединений семейства SkQ на почечную недостаточность, возникающую при ишемии/реперфузии почки.

2. Изучить роль сигнальных путей ишемического/фармакологического прекондиционирования в реализации эффектов митохондриально-направленных соединений семейства SkQ.

3. Исследовать изменения почечного кровообращения, вызываемые ишемией/реперфузией почки, и возможность влияния на эти изменения при помощи митохондриально-направленных соединений семейства SkQ.

4. Исследовать влияние митохондриально-направленных соединений семейства SkQ и фармакологического прекондиционирования на острую почечную недостаточность, вызываемую аминогликозидным антибиотиком гентамицином.

Научная новизна работы:

Показано нефропротекторное действие митохондриально-направленного антиоксиданта Ю-(б'-пластолхинонил) децил-родамина (SkQRl) при ишемии/реперфузии почки, включающее в себя увеличение выживания животных, уменьшение почечной недостаточности, улучшение гистологической картины ткани почки, снижение выраженности окислительного стресса и нормализацию содержания эритропоэтина в почке.

Продемонстрирована ключевая роль активации сигнальных каскадов ишемического прекондиционирования в защите почки от ишемического повреждения. Показано, что нефропротекторный эффект SkQRl сопряжён с ингибированием киназы гликогенсинтазы (GSK-Зр) в ткани почки и увеличением образования эритропоэтина в эпителиоцитах почечных канальцев.

Показано нефропротекторное действие прекондиционирования почки сверхкороткими периодами (15 сек) ишемии и реперфузии, которое наблюдалось у молодых животных и отсутствовало у старых.

Показана возможность защиты почки при ишемии/реперфузии с помощью частичного разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования. Продемонстрировано защитное действие классического (2,4-динитрофенол) и митохондриально-направленного (додецил-родамин, С12Я1) разобщителей на функцию почки при ишемии/реперфузии.

При помощи ультразвуковой допплеровской техники впервые описано снижение общего почечного кровотока и увеличение почечного сосудистого сопротивления на ранних стадиях реперфузии (до 30 мин) после ишемии почки. Митохондриально-направленный антиоксидант БкС^Ш обращал эти изменения, увеличивая общий почечный кровоток и снижая почечное сосудистое сопротивление.

Обнаружено защитное действие митохондриально-направленного антиоксиданта БкСЗШ при развитии гентамициновой нефротоксичности, включающее в себя увеличение выживания животных, уменьшение ОПН и нормализацию содержания эритропоэтина в почке.

Показано, что индукция сигнальных каскадов ишемического прекондиционирования агонистом 5-опиодных рецепторов даларгином или хлоридом лития приводит к уменьшению почечной недостаточности, нормализации гистологической картины ткани, снижению выраженности окислительного стресса при нефротоксическом действии гентамицина.

Научно-практическое значение работы:

Проведённые исследования расширяют представления о механизмах защиты почки при ОПН ишемического и нефротоксического (при использовании аминогликозидных антибиотиков) генеза. Были изучены сигнальные каскады, активация которых увеличивает толерантность почки к ишемическому и токсическому повреждению. Эти данные дают возможность разработки новых нефропротекторных лекарств.

В данной работе показан терапевтический потенциал ряда соединений: митохондриально-направленного антиоксиданта БкрИЛ, ингибиторов вБК-ЗР даларгина и хлорида лития, разобщителей дыхания и фосфорилирования 2,4-динитрофенола и С12Я1. Проведенные исследования открывают перспективы для проведения доклинических исследований применения данных веществ в терапии ОПН.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Митохондриально-направленный антиоксидант БкОШ предотвращает развитие почечной недостаточности после ишемии/реперфузии почки, улучшая функцию органа, уменьшая повреждение ткани и снижая выраженность окислительного стресса.

2. Нефропротекторное действие 8к(ЗЯ1 сопряжено с увеличением фосфорилированной (цитопротекторной) формы СБК-Зр и содержания эритропоэтина в ткани почки, что указывает на сходство механизмов защитного действия БкСЗШ с ишемическим прекондиционированием.

3. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQRl снижает выраженность нарушений почечного кровообращения, возникающих после ишемии/реперфузии почки и проявляющихся в уменьшении почечного кровотока и увеличении почечного сосудистого сопротивления.

4. Выраженность нефропатии, вызываемой аминогликозидным антибиотиком гентамицином и сопряженной с развитием окислительного стресса, повреждением ткани почки и снижением её функции, уменьшается при действии SkQRl или агонистов фармакологического прекондициоинрования.

Апробация работы и публикации

Основное содержание работы изложено в 24 работах. Апробация работы была проведена на открытом семинаре отдела биоэнергетики Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ (председатель - академик РАН В.П.Скулачев). Результаты исследований докладывались на международных и российских конференциях: EuroNanoMedicine (Словения, Блед 2009 г.), Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2010» (Москва 2010 г.), 16th European Bioenergetics Conference (Польша, Варшава 2010 г.), 21-й съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга 2010 г.), 5-я Всероссийская с международным участием школа-конференция «Физиология кровообращения» (Москва 2012 г.), 37th FEBS Congress (Испания, Севилья 2012 г), Международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино 2013 г.), 50th ERA-EDTA Congress (Турция, Стамбул 2013 г.).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела «материалы и методы», результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Материал диссертации изложен на 171 странице, содержит 35 рисунков и 3 таблицы, в списке цитируемой литературы 367 наименований.

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 24 научных работы, в том числе 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК, и 17 тезисов конференций. Материалы и методы исследования

Эксперименты были выполнены на беспородных самцах белых крыс (250450 г), содержавшихся в условиях вивария и получавших стандартный рацион питания ad libitum. На проведение экспериментального исследования было получено разрешение Комиссии по биоэтике НИИ Физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского (протокол №1 от 8 апреля 2013 г.).

/.Моделирование ишемической ОПН

Для наркоза использовали хлоралгидрат (в/б 300 мг/кг). Сосудистый пучок левой почки освобождали от прилежащей жировой ткани и пережимали на 40 минут микрососудистым нетравматическим зажимом. Правую почку удаляли. С ложнооперированными животными производили те же манипуляции, исключая наложение зажима на сосудистый пучок почки. В течение всего времени действия наркоза температуру животного поддерживали на уровне 37°С. Через 48 ч реперфузии у животных забирали кровь из хвостовой

вены. Концентрацию мочевины в сыворотке крови определяли с помощью автоматического анализатора CellTac («Nihon Kohben», Италия). Часть крыс декапитировали после глубокого наркоза этиловым эфиром и извлекали почку для дальнейших исследований.

В опытах по исследованию ИПК микрососудистый зажим накладывали на сосудистый пучок почки на 15 сек, после чего восстанавливали кровоток на 15 сек. Такой цикл повторяли 4 раза. После последнего 15 сек периода реперфузии сосудистый пучок пережимали на 40 мин.

2. Изучение кровотока при помощи высокочастотной допплеровской техники

В опытах по исследованию гемодинамики использовали высокочастотную ультразвуковую допплеровскую технику, работающая на частоте 27 МГц, разработанную в биоинженерной лаборатории НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН. Измерение кровотока выполняли датчиками бандажного типа с внутренним диаметром 1,5-2 мм, прокалиброванными в единицах объёмной скорости кровотока. Датчики накладывали на почечную артерию и брюшную аорту. Регистрацию скорости кровотока начинали через 10-15 мин после фиксации датчиков, ожидая стабилизации кровотока.

В течение эксперимента осуществляли регистрацию линейной (V) и объёмной (Q) скорости кровотока. Оцифровку данных, поступающих от ультразвукового прибора, проводили при помощи компьютерной программы «Graph2Digit». Анализ состояния кровотока осуществляли на основании следующих параметров:

• частота сердечных сокращений (ЧСС, уд/мин)

• объёмная скорость кровотока (Q, мл/мин)

• пиковая систолическая скорость кровотока (Vmax, см/с)

• конечная диастолическая скорость кровотока (Vmin, см/с)

• индекс резистивности: (Vmax - Vmin)/ Vmax

3. Моделирование аминогликоизидной ОПН

В течение 6 сут крысам в/б вводили гентамицин (KRKA, Словения) в дозе 160мг/кг.сут. Через 24 ч после последней инъекции гентамицина у животных забирали кровь из хвостовой вены для определения концентрации мочевины. В течение 14 дней наблюдали за выживанием животных.

4. Определение продукции АФК

Продукцию АФК оценивали по интенсивности флуоресценции 2,7-дихлорфлуоресцеина диацетата (2,7-DCF DA; Calbiochem, San Diego, США), при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM510 (Carl Zeiss, Германия). После 40 мин ишемии и 10 реперфузии, или через 3 ч после инъекции гентамицина (в/б 160 мг/кг/сут), или аналогичного периода без ишемии/реперфузии, или после введения физраствора без гентамицина, почку выделяли и помещали в среду инкубации (стандартный раствор Хенкса для клеточных культур с добавлением 10 мМ Hepes-NaOH pH 7,4). Затем при помощи вибрационного микротома Vibratom NLS (WPI, США) получали срезы коркового вещества почки толщиной 150-200 мкм. Срезы инкубировали в

течение 10 мин в среде инкубации, содержащей 10 мкМ 2,7-DCF DA и отмывали чистой средой инкубации в течение 5 мин. После этого срезы анализировали на конфокальном микроскопе.

В ряде опытов исследовали продукцию АФК в изолированном сегменте брюшной аорты. Вырезанный сегмент разрезали в продольном направлении и помещали в среду инкубации (как и в предыдущих опытах) с добавлением или без добавления ангиотензина (АНГ) II (100 нг/мл). Через 1 ч инкубации среду с АНГ II заменяли на чистую среду инкубации, после чего расправляли и фиксировали сегмент сосуда. Далее сосуд окрашивали 2,7-DCF DA, как описано выше, и при помощи конфокальной микроскопии оценивали продукцию АФК в интиме сосуда.

5. Определение малонового диалъдегида (МДА) в ткани почки

Концентрацию МДА определения с помощью тиобарбитуровой кислоты

(ТБК) в гомогенатах почечной ткани. Почку извлекали, почечную капсулу удаляли, ткань размельчали ножницами и гомогенизировали в 3 мл буфера (1,15% КС1 , 0,38% EDTA) при 4°С. К гомогенату добавляли 0,8% ТБК и 1% Н3Р04 в соотношении 1 : 1,1 : 3,3, соответственно. Смесь инкубировали 40 минут при 100°С, после чего центрифугировали 5 мин при 11 000 g. Супернатант отбирали и измеряли его оптическую плотность при длине волны 532 нм на спектрофотометре Hitachi 557. Результаты нормировали на концентрацию белка.

6. Определение концентрации белка

Определение концентрации белка в гомогенатах почечной ткани определяли по методу, описанному Смитом и соавт. (Smith et al., 1985), основанному на колориметрической реакции бицинхониновой кислоты с белками, в микромодификации метода для 96-луночного планшета.

7. Илшуноблоттинг

Электрофорез белков для последующего иммуноблоттинга проводили в псевдоградиентном (10-20% полиакриламидном) геле в денатурирующих условиях по Laemmli (Laemmli, 1970). По окончании электрофореза переносили белки на PVDF мембрану. Мембрану блокировали обезжиренным молоком, промывали и инкубировали в течение ночи при 4°С с первичными антителами (к P-GSK-3p, GSK-3P, эритропоэтин, АНГ II, (3-тубулин). Мембраны промывали и инкубировали 1,5 ч при 25°С с вторичными антикроличьими антителами. Мембраны промывали, специфические полосы детектировали с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL Advance Western blotting detection kit. Хемилюминесценцию регистрировали с помощью фотопленки (Kodak, США). Изображение оцифровывали на сканере VI00 Photo (Epson, Япония) и анализировали с помощью программного обеспечения WCIF ImageJ (NIH, Bethesda, MD, США).

8. Иммуногистохамия

Срезы коркового вещества почек, получали как описано в п.4 и фиксировали в течение 12 ч в 4% формалине при 4°С, пермеабилизовали 0,1% Тритоном Х-100 в течение 10 мин при 4°С и отмывали фосфатным буфером (5 мин каждая промывка). После 1-ч блокирования 1% бычьим сывороточным

альбумином срезы инкубировали 2 ч при комнатной температуре с первичными кроличьими антителами к эритропоэтину (1:50), отмывали и инкубировали 1 ч с вторичными антителами (1:50) (анти-кроличьи антитела козы, конъюгированные с Alexa-594 (Sigma, США). После отмывки срезы фиксировали на предметном стекле.

Анализировали образцы при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM510 (Carl Zeiss, Германия). Для возбуждения флуоресценции использовались аргоновый лазер (полоса излучения 488 нм) и HeNe лазер (568 нм). Конфокальные снимки получали с помощью 40х 1,3 N.A. иммерсионного объектива и впоследствии анализировали в программе «Corel Photo Paint 12» (США).

9. Гистологическое исследование

Почку фиксировали 1 сут в модифицированном фиксаторе Телесницкого (70% изопропанол, 10% формалин и вода в соотношении 7:2:1), обезвоживали 1 сут в 90% изопропаноле и 1 сут в изопропаноле-99, заливали парафином. На микротоме делали срезы толщиной 6 мкм и фиксировали их на предметные стёкла. Срезы депарафинизировали в ксилоле (2-3 мин), обезвоживали в 96% спирте (два раза по 1-2 мин), окрашивали гематоксилином (4 мин) и эозином (1 мин), отмывали водой и 96% спиртом (20 сек). Перед заключением срезы обрабатывались ксилолом (0,5-1 мин). Срезы заключались в синтетическую смолу «полимаунт». Срезы изучали, используя световой микроскоп. Производили полуколичественную оценку выраженности патоморфологических изменений коркового вещества.

10. Статистика

Выборка в опытах на животных составляла не менее 5 животных для каждой группы; при конфокальной микроскопии и гистологическом исследовании оценивалось не менее 10 полей зрения для каждого образца. Все данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего. Сравнение между группами проводилось с помощью теста Стьюдента для параметрических данных и U-критерий Манна-Уитни для непараметрических данных.

Результаты исследования

Нефропротекторное действие митохопдриалыю-паправленпого антиоксидапта SkQRlnpu И/Р почки

Модель транзитной ишемии и последующей реперфузии (И/Р) почки крысы in vivo наиболее часто используется для экспериментального изучения ОПН. В нашей работе мы подвергали почку 40-мин ишемии и оценивали её функцию через 48 ч после операции. Такая ишемия приводила к резкому нарушению функции органа: на 2-е сут мы наблюдали увеличение концентрации мочевины (основной маркёр выделительной функции почки) в крови животных примерно в 8 раз и падение содержания эритропоэтина в ткани почки примерно на треть. И/Р также приводила к гибели 50% животных к 4-м сут эксперимента (рис. 1).

При в/б введении животным митохондриально-направленного антиоксиданта SkQRl за 3 ч до начала ишемии, через 1 ч после начала

реперфузии и три раза через каждые 12 ч мы наблюдали выраженный терапевтический эффект, если доза каждой инъекции составляла 20 или 100 нмоль/кг. БкСЗНЛ снижал концентрацию мочевины примерно в 2 раза и увеличивал выживание до 80-83%. Иммуноблотинг почечной ткани показал, что лечение животных 5кС?К1 также позволяло сохранить нормальную продукцию эритропоэтина (рис. 1).

эпо—

И/Р + вкОШ 100 нмоль/кг

Рис. 1. вкОЯ! предотвращает развитие почечной

недостаточности (А,Б) и увеличивает выживание (В) после 40-мин ишемии (И/Р). Концентрация мочевины в крови (А) и иммуноблотинг гомогенатов почечной ткани (Б) через 48 ч после И/Р. 8кСЖ1 вводили в/б за 3 ч до начала ишемии, через 1.18. 30. 42 ч после начала реперфузии. Доза каждой инъекции составляла 20. 100 или 500 нмоль/кг. «ЛО» п=5; «И/Р» п=18; «И/Р + 5кОЯ1 20 нмоль/кг» п=9; «И/Р + 8кОЯ1 100 нмоль/кг» п=31; «И/Р + 8кСЖ1 500 нмоль/кг» п=7. ЛО — ложнооперированные животные; ЭПО - эритропоэтин; * - р<0.001; ** - р<0.05; н/д - нет достоверных отличий.

время, сутки

Гистологическое исследование ткани почки через 48 ч после И/Р выявило значительное нарушение нормальной структуры ткани (рис. 2). Наиболее выраженные изменения наблюдали в корковом слое почки и во внутренней полоске наружного мозгового вещества. В то время как у ложнооперированных животных не наблюдалось патологических изменений, у крыс перенесших И/Р были видны многочисленные очаги некроза (рис. 2Б,белая стрелка), часто встречались дилатированные канальцы (рис. 2Б, чёрная стрелка), их обструкция гиалиновыми цилиндрами, потеря щёточной каёмки. Полуколичественный анализ выраженности патоморфологических изменений показал, что при

лечении животных БкОЮ в дозе 100 нмоль/кг частота встречаемости погибших канальцев резко уменьшалась и достоверно реже наблюдалась дилатация (рис. 2Г). При этом митохондриально-направленный антиоксидант не влиял на обструкцию дистальных отделов нефрона.

Ш

»за*

Б Т- Г*"

I Ai

S '.5

rr

[il

■ ЛО

□ И/Р

□ И/Р + SkQR1

Рис. 2. Патоморфологические изменения ткани почки через 48 часов после 40-мин ишемии (И/Р).

Микрофотографии коркового вещества почки ложнооперированных животных (ЛО) (А), перенесших И/Р (Б) и перенесших И/Р на фоне лечения SkQRl (в/б 100 нмоль/кг за 3 ч до начала ишемии, через 1.18. 30. 42 ч после начала реперфузии) (В). Полу количественная оценка выраженности

патоморфологических изменений (Г). * - р<0,001; # - р<0.05: н/д - нет достоверных отличий.

Считается, что в начале каскада патологических событий, ведущих к ОПН, лежит гиперпродукция АФК (Palier M.S. et al, 1984; Plotnikov E.Y. et al., 2007). Мы исследовали образование кислородных радикалов при помощи флуоресцентного зонда на АФК - 2',7-дихлорфлуоресцина (DCF). 40-мин ишемия приводила к многократному увеличению интенсивности флуоресценции DCF уже через 10 мин реперфузии, что говорит об увеличении образования кислородных радикалов. Предварительное введение SkQRl за 3 ч до начала ишемии приводило к падению сигнала DCF до контрольных значений (рис. 3). Измерение концентрации МДА - маркёра перекисного окисления

липидов - через 48 ч после И/Р в ткани почки также показало увеличение выраженности окислительного стресса после И/Р и уменьшение его выраженности при использовании БкСЖ! (данные не представлены).

Контроль

— с?4*-

и/р + экат

Рис. 3. Продукция АФК через 40 мин ишемии и 10 мин реперфузии. 8к<ЗЯ1 (в/б 100 нмоль/кг) вводили за 3 ч до начала ишемии.

ЭСР — 2',7'-дихлофлуоресцина диацетат; * - р<0.005.

и/р +

ЭКСЗР!

Таким образом, мы обнаружили, что митохондриально-направленный антиоксидант БкОЯ! предотвращал вызываемое И/Р повреждение почки. Сохранение функции почки, скорее всего, объясняется тем, что 8кС?Р1 уменьшает продукцию АФК во время реперфузии, что в свою очередь предотвращает гибель канальцевого эпителия.

Нефропротекторное действие ИПК при И/Р Известно, что ключевую роль в увеличении толерантности ткани к ишемическому повреждению играют сигнальные пути ИПК. Конечной точкой данных сигнальных путей является 3(3-изоформа киназы гликогенсинтазы (СЭК-3(3). Ингибирование фермента, происходящее при фосфорилировании серина-9, приводит к предотвращению открытия поры неспецифической проницаемости митохондрии. Открытие поры становится причиной запуска апоптотической

Д Рис. 4. увеличивает п сему т ^ фосфорилирование С8К-ЗР (А) и г содержание эритропоэтина (ЭПО) в ткани __почки (Б). Иммуноблоттинг гомогенатов

БКмпршь ЯЬО<?1 Эч ЗМУМ 24ч ^

почечной ткани через 3 и 24 ч после

ЗГ|0_ ШШш инъекции БкСЖ! (в/б I мкмоль/кг). Р-08К-3(3

И^^^ЧР - фосфорилированная форма 3|3 изоформы ■Ьнпшль зиумзч змж124ч киназы гликоген сиитазы

о.

- н¿Д

ЛО И/Р (3-4 И/Р (3-4 И/Р И/Р мес) мес) + (20мес) (20мес) ИПК +ИПК

Рис. 5. Ишемическое

прекондиционирование (ИПК)

предотвращает развитие почечной недостаточности после 40-мин ишемии (И/Р). Концентрация мочевины в крови через 48 ч после И/Р. ИПК - 4 цикла по 15 сек ишемии и 15 сек реперфузии непосредственно перед И/Р. Крысы возрастом 3-4 мес («И/Р» п=13; «И/Р+ИПК» п=4) и 20 мес («И/Р» п=2; «И/Р+ИПК» п=3). ЛО - ложнооперированные животные (п=5); * -р<0.001.

программы. Одним из триггеров открытия митохондриальной поры является окислительный стресс Э.В. е1 а1., 2009; Juhaszova М. а1., 2009).

В нашей работе мы обнаружили, что в/б введение 8кС?1и интактным животным приводит к увеличению содержания Р-вЗК-Зр в почке (рис. 4А). Также нами было показано, что митохондриально-направленный антиоксидант увеличивает синтез эритропоэтина в почке (рис. 4Б). Известно, что сигнальные каскады активации рецептора данного гормона приводят в том числе и к фосфорилированию 08К-3(3 (Ма1е5е К. ег а1., 2004).

Физиологичным способом активации

сигнальных каскадов ИПК является ишемическая

тренировка органа. Мы пережимали сосудистый пучок почки на 15 сек с

S 20

15 сек и повторяли раза. Потом

И/Р + C12R1 100 нмоль/кг

И/Р + 2,4-ДНФ 275 нмоль/кг

Рис. 6 Разобщение дыхания и фосфорилирования предотвращает развитие почечной недостаточности после 40-мин ишемии (И/Р). Концентрация мочевины в крови через 48 ч после И/Р. C12R1 (в/б 100 нмоль/кг) и 2.4-ДНФ (в/б 275 нмоль/кг) за 3 ч до начала ишемии, через 1.18. 30. 42 ч после начала реперфузии. «ЛО» п=5; «И/Р» п=29; «И/Р+С12R1» п=5; «И/Р+2.4-ДНФ» п=5. ЛО — ложнооперированные животные; *-р<0.05; **-р<0.1

последующей реперфузией, этот цикл 4 почку подвергали 40-мин И/Р. Такая манипуляция оказывала ярко выраженное защитное действие на функцию почки (рис. 5). Дальнейшие исследования показали, что ИПК предотвращает почечную недостаточность только у молодых крыс (3-4 мес), а у старых крыс (20 мес) данный эффект исчезает (рис. 5).

Нефропротекторное действие разобщения дыхания и фосфорилирования при И/Р

Ещё одной стратегией нефропротекции, направленной на предотвращение окислительного стресса и его последствий, является разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий. Известно, что данный подход увеличивает толерантность ткани к ишемическому повреждению (Sack M.N., 2006). Мы исследовали влияние митохондриально-направленного соединения C12R1, лишённого антиоксидантной части в составе своей молекулы, но обладающей разобщающим действием на митохондрии (Severin F.F. et al., 2010). Мы обнаружили, что C12R1 был не способен активировать сигнальные пути ИПК (данные не приведены), но при этом его введение крысам при И/Р почки в той же схеме, что и SkQRl, предотвращало нарушение почечной функции (рис. 6). Введение животным классического разобщителя 2,4-динитрофенола в той же схеме и в дозах того же порядка также имело выраженный терапевтический эффект при И/Р почки (рис. 6).

Изменения почечного кровообращения при И/Р

Важную роль в патогенезе ишемической ОПН играет нарушение почечного кровотока. Мы исследовали почечную и центральную гемодинамику при помощи высокочастотной ультразвуковой допплеровской техники (рис. 7). Мы обнаружили, что после 40-мин ишемии почечный кровоток восстанавливается не более чем до 40% от предишемических значений, а почечное сосудистое сопротивление возрастает более, чем на 20% (рис. 8). Регистрация линейной и средней скорости кровотока по брюшной аорте, а также измерение ЧСС показало, что И/Р почки не приводит к значительным

ишемия реперфузия А I -40 мин- t

40 см/с || im т | Б

10 мл/мин

5 10 15 20 25 30 мин мин мин мин мин мин

\ р I I I I

Щ ft) I« II II Ц I

I II Шш Ii II 11 Hill

г

6 мл мин J

Н—I I-1

1с 25 с

Рис. 7. Изменения центрального и почечного кровотока, вызванные 40-мин ишемией почки. Измерение линейной (А.В) и объёмной (Б,Г) скорости кровотока по ао.abdominalis (А.Б) и a.renalis (В.Г) при помощи высокочастотной ультразвуковой техники.

-60 -50 -45 -41 -40 0 1 5 10 15 20 25 30 + !-.-МА окклюзия реперфузия врем:

И/Р +

Бкат И/Р +

экот +

-60 -50 -45 -41 -40 + 1_-ЫА ОККЛЮЗИЯ

Т

реперфузия

Рис. 8. SkQRl увеличивает скорость восстановления почечного кровотока (А) и снижает почечное сосудистое сопротивление (Б) после 40-мин ишемии (И/Р). Измерение кровотока по а.гепаПэ при помощи высокочастотной ультразвуковой техники. Ь-ЫА (N0) Ь-нитроаргинин. в/в. 1 мг/кг) вводили за 10 мин до начала И/Р. 8к<ЗЯ1 (в/б 100 нмоль/кг) вводили за 3 ч до начала И/Р. «И/Р» п=5; «И/Р+8кдЯ1» п=4; «И/Р+8к(ЗЯ1+Ь-ЫА» п=4. * - р<0.05 ** - р<0.1 по сравнению с «И/Р».

митохондриально-направленного антиоксиданта на почечную гемодинамику может быть связан с уменьшением продукции АФК в стенке сосуда и, как следствие, увеличением биодоступности N0, который с высоким сродством реагирует с супероксидным радикалом (Ргуог \V.A-, Бяиаёгко в-Ь., 1995). При совместном введении крысам вместе с Зкрш неселективного

ингибитора 1ЧО-синтаз ТМш-Ь-нитроаргинина мы отметили

уменьшение положительного влияния митохондриально-направленного антиоксиданта на почечный кровоток и сосудистое сопротивление (рис. 8). Через 48 ч после И/Р мы видели так же отмену и нефропротекторного действия ЗкС^Ю (рис. 9).

-•-И/Р + Эксат + 1_-ЫА

изменениям центральной -•-и/р гемодинамики (данные не приведены).

Введение ЗкС^ЖЛ за 3 ч до начала ишемии приводило к увеличению почечного кровотока до 67% от предишемических значений и нормализации сосудистого сопротивления почки на ранних сроках реперфузии (рис. 8). Таким образом, защитное действие

митохондриально-направленного антиоксидант может быть связано с уменьшением выраженности гипоксии, связанной с нарушением почечного

кровотока после И/Р.

Механизм

положительного влияния

2 40 2

$ 30 X

ю

0)

5 20 S

10

Л о

И/Р

И/Р + И/Р + SkQR1 SkQR1 +L-NA

Рис. 9. Совместное применение N«>-1^-нитроаргинина (L-NA) и БкОШ отменяет защитное действие БкОШ на функцию почки после 40-мин ишемии

(И/Р). Концентрация мочевины в крови через 48 ч после И/Р. Ь-ЫА (в/в I мг/кг) вводили за 10 мин до начала И/Р. вкОШ (в/б 100 нмоль/кг) вводили за 3 ч до начала ишемии, через 1, 18, 30, 42 ч после начала реперфузии. «ЛО» п=5; «И/Р» п=56; «И/Р+ЗкОЮ» п=31; «И/Р+8кОЯ1+Ыч1А» п=8. ЛО — ложнооперированные животные; * - р<0.001; н/д — нет достоверных отличий.

Источником окислительного стресса в стенке артериальных сосудов может быть не только сама И/Р, но и некоторые вещества, чья продукция увеличивается в результате И/Р почки. Иммуноблоттинг гомогенатов почечной ткани показал, что И/Р приводит к значительному увеличению содержания АНГ II в почке (рис. 10А). Мы исследовали последствия инкубации АНГ II с изолированным сегментом брюшной аорты и обнаружили, что пептид увеличивает продукцию АФК в интиме сосуда (рис. 10Б,В).

Нефропротекторное действие митохондриалыю-направленного антиоксиданта при амии о г л икозидно й ОПН

Длительное введение крысам высоких доз гентамицина является наиболее широко используемой моделью ОПН, возникающей при применении аминогликозидных антибиотиков. В нашей работе мы наблюдали выраженную нефротоксичность гентамицина после 6 сут в/б введения препарата в дозе 160

о

J3 Q

О С

¿Г

контроль АНГ II

Рис. 10. Увеличение содержания ангиотензина II (АНГ II) в ткани почки после И/Р (А) и увеличение продукции АФК интимой сосуда под действием АНГ II (Б,В) ex vivo. Иммуноблоттинг гомогенатов почечной ткани через 24 ч после И/Р (А). Продукция активных форм кислорода в интиме брюшной аорты через 1 ч инкубации изолированного сегмента сосуда с АНГ II (100 нг/мл) (Б,В). DCF - 2',7'-дихлофлуоресцина диацетат; * - р<0,05 | ^

^ 40 £

га" зо х

I 20

контроль

Б

эпо—*

Контроль Гент

гент + SkQR1

Гейт + SkQR1

• контроль

-гент + SkQR1

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

время, сутки

Рис. 11. 8к(}Я1 предотвращает развитие почечной недостаточности (А,Б) и увеличивает выживание (В) после 6 сут введения гентамицина (160 мг/кг/сут).

Концентрация мочевины в крови (А) и иммуноблотинг гомогенатов почечной ткани (Б) через 24 ч после последней инъекции гентамицина. 5кСЖ1 (в/б 100 нмоль/кг/сут) вводили в течение 6 сут. за 3 ч до инъекции гентамицина. «Контроль» п=5; «гент» п=23; «гент+8кСЖ1» п=17. ЭПО - эритропоэтин; * - р<0.05; ** - р<0.1.

радикалов может быть объяснено введении аминогликозидного антибиотика.

мг/кг/сут. Через 24 ч после последней инъекции

гентамицина концентрация мочевины в крови животных возрастала более чем в 4 раза, а содержание эритропоэтина в почке уменьшалось почти наполовину. К 20-му дню эксперимента погибало около 40% животных. Введение SkQRI (100 нмоль/кг/сут) за 3 ч до каждой инъекции гентамицина приводило к смягчению токсичного

действия антибиотика - мы наблюдали уменьшение

концентрации мочевины в полтора раза и нормализацию уровня эритропоэтина.

Использование митохондриально-направленного антиоксиданта также увеличивало выживание животных с 61% до 83% (рис. 11).

Таким образом,

предварительное введение митохондриально-направленного антиоксиданта уменьшало токсическое

действием гентамицина на почку. Анализ литературы показывает, что важную роль в механизме токсического

действия гентамицина играет гиперпродукция АФК. При этом источником этих форм является митохондрия (Walker P.D., Shah S.V., 1987). В первую очередь именно нейтрализацией образовавшихся кислородных терапевтическое действие SkQRI при

■ Р-вБК-Зр

контроль даларган даларгин 25 мкгУкг 50 мггУкг

ис1

30 М|Укг

Нефропротекторное действие агентов фармакологического прекондиционирования при аминогликозидной ОПН

Также как и при И/Р, защита почки от аминогликозидной токсичности может осуществляться через увеличение толерантности ткани к окислительному стрессу через активацию механизмов ИПК.

Поэтому мы провели серию опытов с агонистом 5-опиоидных рецепторов даларгином и хлоридом лития. Данные литературы позволили предположить, что оба эти вещества, воздействуя на разные сигнальные каскады в конечном итоге ингибируют вБК-Зр, предотвращая открытие митохондриальной поры. Наши опыты подтвердили это предположение - уже через 1 ч после в/б инъекции даларгина (50 мкг/кг) и хлорида лития (30 мг/кг) мы наблюдали увеличение уровня фосфорилированности вБК-ЗР в ткани почки (рис. 12А).

Далее мы исследовали нефропротекторный Д

потенциал активации

сигнальных путей ИПК. Мы вводили даларгин (50 мкг/кг/сут) или хлорид лития (30 мг/кг/сут) за 3 ч до каждой инъекции

гентамицина (160 мг/кг/сут). Через сутки после последней инъекции гентамицина мы наблюдали уменьшение концентрации мочевины в крови животных получавших вместе с гентамицином агонисты ИПК по сравнению с животным, получавшими только аминогликозидный антибиотик (рис. 12Б).

Одновременно мы провели гистологическое исследование, показавшее, что почечная

недостаточность, развивающаяся на фоне приёма гентамицина является следствием повреждения ткани почки (рис. 13А,Б,В). Через сутки после 6 дней введения препарата

нормальная структура органа была нарушена. В корковом веществе почки наблюдали

контроль

гент + иС1

ент гент + даларгин

Рис. 12. Даларгин и 1лС1 увеличивают фосфорилирование С8К-ЗР (А) и предотвращают развитие почечной

недостаточности после 6 сут введения гентамицина (160 мг/кг/сут) (Б). Иммуноблоттинг гомогенатов почечной ткани через 1 ч после инъекций даларгина (в/б 25 или 50 мкг/кг) или I лС) (в/б 30 мг/кг) (А). Концентрация мочевины в крови через 24 ч после последней инъекции гентамицина (Б). Даларгин (в/б 50 мкг/кг /сут) или ЫС1 (в/б 30 мг/кг/сут) вводился в течение 6 сут, за 3 ч до инъекции гентамицина. «Контроль» п=5; «гент» п=8; «гент +даларгин» п=7; «гент + 1лС1» п=8. * - р<0.05 ; ** - р<0,1 18

некроз инфильтрация

контроль - -

гентамицин 3,5 2

гентамицин + даларгин 2,5 1

гент + 1лС1 2 0.5

Рис. 13. Патоморфологнческие изменения ткани почки через 24 ч 6 сут введения гентамицина (160 мг/кг/сут). Микрофотографии коркового вещества почки животных, получавших гентамицин (А), и животных, получавших за 3 ч до каждой инъекции гентамицина даларгин (в/б 50 мкг/кг/сут) (Б) или 1лС1 (30 мг/кг/сут) (В). Полуколичественная оценка выраженности патоморфологических изменений (Г).

некроз канальцев (белые стрелки), их дилатация, обструкция гиалиновыми цилиндрами, инфильтрация лейкоцитами (чёрные стрелки). Используя полуколичественный метод оценки выраженности патоморфологических изменений, мы оценили изменения частоты встречаемости некроза и лейкоцитарной инфильтрации - двух признаков, играющих наибольшую роль в патофизиологии аминогликозидной ОПН (рис 13Г). Лечение животных и даларгином, и хлоридом лития сопровождалось уменьшением и частоты встречаемости погибших канальцев и выраженности инфильтрации. При этом защитный эффект хлорида лития был более выраженным, чем у даларгина.

Далее мы исследовали процессы образования АФК под действием гентамицина. Через I ч после в/б гентамицина (160 мг/кг) мы не наблюдали увеличения интенсивности флуоресценции ОСИ в коре почки (данные не приведены). При этом через 3 ч после инъекции антибиотика продукция АФК возрастала примерно в 8 раз по сравнению с контрольными животными. Введение хлорида лития и даларгина за 3 ч до гентамицина приводило к уменьшению интенсивности ОСИ, а следовательно и продукции кислородных радикалов (рис. 14). Также мы оценили выраженность окислительного стресса после 5 дней введения животным гентамицина по суммарному уровню

карбонилирования белков почки. Введение животным гентамицина приводило к увеличению данного показателя по сравнению с контрольными животными, а лечение животных агонистами ИПК снижало данный показатель (данные не приведены).

контроль

гент + ЫС1

Ч 25

£ ■ Р и_ 20

гент + даларгин

ш

даларгин

Рис. 14. Продукция активных форм кислорода в коре почки через 3 ч после инъекции гентамицина (в/б 160 мг/кг). Даларгин (в/б 50 мкг/кг) или УС1 (в/б 30 мг/кг) вводили за 3 ч до инъекции гентамицина. ЭСР - 2',7'-дихлорфлуоресцин диацетат; * - р<0,01 ; ** - р<0,05

Таким образом, вещества, активирующие сигнальные пути ИПК, не только уменьшали нефротоксичность гентамицина, но и уменьшали уровень окислительного стресса, вызываемого антибиотиком. Известно, что индукция неспецифической проницаемости митохондрии приводит к увеличению образования АФК митохондриями. Поэтому антиоксидантное действие даларгина и хлорида лития, не способных напрямую нейтрализовать кислородные радикалы, может быть объяснено их ингибирующим действием на митохондриальную пору, которое в свою очередь реализуется, через ингибирование активности вЗК-Зр.

Выводы:

1. Митохондриально-направленный антиоксидант 10-(б'-пластолхинонил) децил-родамин (SkQRl) предотвращает развитие почечной недостаточности после ишемии/реперфузии почки, уменьшает повреждение ткани почки и снижает выраженность окислительного стресса.

2. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQRl активирует в почке сигнальные пути ишемического прекондициоинрования, в частности, увеличивает содержание в почке фосфорилированной формы фермента GSK-3ß и эритрпоэтина.

3. Ишемическое прекондицинирование короткими периодами ишемии и реперфузии предотвращает развитие почечной недостаточности при ишемии/реперфузии почки у молодых животных, но не оказывает влияния на старых животных.

4. Разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования при помощи классического разобщителя 2,4-динитрофенола и митохондриально-направленного разобщителя додецилродамина защищает от развития почечной недостаточности после ишемии/реперфузии.

5. Митохондриально-направленный антиоксидант SkQRl снижает выраженность нарушений почечного кровообращения, возникающих после ишемии/реперфузии почки, предотвращает уменьшение почечного кровотока и снижает почечное сосудистое сопротивление на ранних сроках реперфузии. Защитный эффект SkQRl на почечный кровоток исчезает при ингибировании синтеза оксида азота.

6. Активация сигнальных каскадов ишемического прекондиционирования при помощи митохондриально-направленного антиоксиданта SkQRl или ингибиторов фермента GSK-3ß (агонист 5-опиодных рецепторов даларгин и хлорид лития) защищает почку от токсического действия аминогликозидного антибиотика гентамицина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Янкаускас С.С., Мациевский Д.Д., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Использование высокочастотной ультразвуковой допплеровской техники для исследования почечного кровотока при ишемии/реперфузии почки. Нефрология и диализ, 2014, 16, 1, с. 169-173.

2. Зоров Д.Б., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю., Силачёв Д.Н., Зорова Л.Д., Певзнер И.Б., Моросанова М.А., Янкаускас С.С., Зоров С.Д., Бабенко В.А. Перспективы митохондриальной медицины. Биохимия, 2013, 78, 9, с. 1251-1264.

3. Плотников Е.Ю., Силачев Д.Н., Янкаускас С.С., Рокицкая Т.И., Чупыркина A.A., Певзнер И.Б., Зорова Л.Д., Исаев Н.К., Антоненко Ю.Н., Скулачев В.П., Зоров Д.Б. Частичное разобщение дыхания и фосфорилирования как один из путей реализации нефро- и нейропротекторного действия проникающих катионов семейства SkQ. Биохимия, 2012, с. 1240-1250.

4. Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю., Янкаускас С.С., Исаев Н.К., Силачев Д.Н., Зорова Л.Д., Певзнер И.Б., Пулькова Н.В., Зоров С.Д., Моросанова М.А. Феноптозная

проблема: от чего гибнет организм? Уроки по почечной недостаточности. Биохимия, 2012, 77, 7, с. 893-906.

5. Янкаускас С.С., Плотников Е.Ю., Моросанова М.А., Певзнер И.Б., Зорова Л.Д., Скулачёв В.П., Зоров Д.Б. Митохондриально-адресованный антиоксидант SkQRl предотвращает вызванную гентамицином почечную недостаточность и потерю слуха. Биохимия, 2012, 77, 6, с. 818-823.

6. Plotnikov E.Y., Chupyrkina А.А., Jankauskas S.S., Pevzner I.B., Silachev D.N., Skulachev V.P., Zorov D.B. Mechanisms of nephroprotective effect of mitochondria-targeted antioxidants under rhabdomyolysis and ischemia/reperfusion. Biochimica et Biophysica Acta, 2011, 1812, 77-86.

7. Плотников Е.Ю., Силачев Д.Н., Чупыркина A.A., Даньшина М.И., Янкаускас С.С., Моросанова М.А., Стельмашук Е.В., Васильева А.К., Горячева Е.С., Пирогов Ю.А., Исаев Н.К., Зоров Д.Б. Новое поколение Скулачев-ионов обладающих выраженным нефро- и нейропротекторным действием. Биохимия, 2010, 75, 2, с. 177 — 184.

Избранные тезисы конференций:

1. Янкаускас С.С., Певзнер И.Б., Бабенко В.А., Зорова Л.Д., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б.Митохондриально-направленные подходы к предотвращению гентамициновой токсичности. Международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», 2013, Пущино, с.631-635.

2. Jankauskas S.S., Pevzner I.B., Zorova L.D., Babenko V.A., Morosanova M.A., Plotnikov E.Y., Zorov D.B.. Mitochondria-targeted approaches to prevent gentamycin toxicity. 50th ERA-EDTA Congress, 2013, Turkey, Istanbul, Nephrology Dialysis Transplantation, 28 (SI), SP068.

3. Jankauskas S.S., Plotnikov E.Y., Pevzner I.B., Chupyrkina A.A., Kirpatovsky V.I., Zorov D.B. Mitochondria-targeted antioxidant SkQRl prevents acute kidney injuiy after ischemia/reperfusion, rhabdomyolysis and gentamicin toxicity. 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress, 2012, Spain, Sevilla, FEBS Journal Volume 279 (Suppl 1), 205

4. Янкаускас C.C., Мациевский Д.Д., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Использование высокочастотной ультразвуковой доплеровской техники для исследования почечного кровотока при ишемии/реперфузии почки. 5-я Всероссийская с международным участием школа-конференция «Физиология кровообращения», 2012, Москва, с. 197-198.

5. Янкаускас С.С., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Эффекты митохондриально-адресованного антиоксиданта SkQRl на почечную недостаточность после ишемии/реперфузии. 21-й съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова,2010, Калуга, с.720-721.

6. Jankauskas S.S., Plotnikov E.Y., I.B. Pevzner, V.P. Skulachev, D.B. Zorov. Mitochondria-targeted antioxidants prevented ischemic injuiy of kidney. 16th European Bioenergetics Conference, 2010, Poland, Warsaw, Biochimica et Biophysica Acta, 2010, 1797 (Suppl.), p. 59-60.

7. Янкаускас C.C. Окислительный стресс и повреждение почечной ткани предотвращаются митохондриально-адресованным антиоксидантом SkQR 1. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2010», 2010, Москва, с. 1-2.

8. Jankauskas S.S., А.А. Chupyrkina E.Y. Plotnikov, A.V. Kazachenko, I.V. Kirpatovsky, D.B. Zorov. Effects of mitochondria-targeted antioxidants on acute renal failure. EuroNanoMedicine 2009, 2009, Slovenia, Bled, p. 96.

Заказ № 52-а/07/2014 Подписано в печать 05.08.2014 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:zak@cfr.ru