Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование физико-химических параметров органического вещества почв

ВАК РФ 03.00.27, Почвоведение

Автореферат диссертации по теме "Исследование физико-химических параметров органического вещества почв"

1 *

о&

На правах рукописи

ЧУКОВ Серафим Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА ПОЧВ (поданным ЭПР.и 13С-ЯМР)

03.00.27 — почвоведение

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете.

Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Б.Ф.Апарин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г.В.Мотузова доктор сельскохозяйственных наук Б.М.Когут доктор биологических наук, профессор В.Н.Кудеяров Ведущая организация:

Московская сельскохозяйственная академия им. К. А.Тимирязева

Защита состоится 18 декабря 1998 г. в 15 часов 30 минут в аудитории М-2 на заседании диссертационного совета Д 053.05.31 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова

Адрес: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, факультет Почвоведения

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета Почвоведения МГУ

Автореферат разослан "_"_1998 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

Л.А.Лебедева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Цель работы.

Изучение состояния и трансформации структуршлх и функциональных физико-химических параметров органического вещества почв Русской равнины под влиянием антропогенного воздействия (на примере черноземов, серых лесных и дерново-подзолистых почв) на разных уровнях организации - от органического вещества в ненарушенном состоянии па уровне почвенного горизонта до молекулярного уровня в препаратах гумусовых веществ и оценка ряда их экологических функций.

Задачи исследований.

1. Разработать новые методологические подходы к изучению физико-химических параметров органического вещества почв с помощью современных радиофизических методов резонансной спектроскопии (ЭПР, ,3С-ЯМР).

2. Изучить трансформацию углеродного скелета и других структурных параметров гумусовых веществ в условиях антропогенного воздействия.

3. Установить взаимосвязь свободных радикалов с важнейшими функциональными параметрами гумусовых веществ, состоянием и процессам! трансформации органического вещества почв в целом.

4. Исследовать физиологическую и биопротекторную активность гуминовых кислот и оценить их изменение при антропогенном воздействии на почвы.

5. Предложить показатели ряда экологических функций гуминовых кислот и органического вещества для системы комплексной параметрической оценки экологического потенциала органического вещества почв.

Защищаемые положения.

1. Свободные радикалы и их концентрация являются важнейшим параметром гуминовых кислот, тесно связанным с общим уровнем их биохимической активности и проявлением важных экологических функций - физиологической и биопротекторной активности.

2. В условиях антропогенного воздействия при недостаточном поступлении органических остатков в гумусовый горизонт в углеродном скелете гуминовых кислот относительно возрастает доля ароматических и поликонденсированных структур, снижается уровень ряда функциональных параметров.

3. Биопротекторная активность гуминовых кислот в условиях загрязнения среды тяжелыми металлами частично связано с прямой инактивацией последних, однако наиболее сильное влияние оказывает прямая физиологическая стимуляция защитных реакций растений и их устойчивости к токсическому воздействию.

4. В систему параметрической оценки экологического потенциала гуминовых кислот целесообразно включить ряд связанных с их экологическими функциями физико-химических параметров.

Научная новизна.

На основе теоретического обобщения разработана схема, отражающая основные методологические подходы к изучению органического вещества почв.

С использованием современных радиофизических методов резонансной спектроскопии разработаны новые методологические подходы к изучению структурных и функциональных параметров органического вещества почв.

По результатам анализа литературных и собственных экспериментальных данных показано, что парамагнитная активность гумусовых кислот (концентрация свободных радикалов с g-фaктopoм 2,003) является величиной обратной их биотермодинамической устойчивости и глубине гумификации.

Впервые непосредственно в растворе изучено влияние различных катионов на парамагнитную активность гуминовых кислот и обнаружена гетерогенность их свободных радикалов (СР) с §-фактором 2,003. Разработан метод количественной оценки двух типов СР принадлежащих периферической и ядерной части макромолекул гуминовых кислот (Авторское свидетельство № 1392472).

Предложен принципиально новый метод оценки качественного состава органического вещества почвы по спектру ЭПР образца почвы, основанный на впервые обнаруженном факте присутствия в почве не одного, как было известно ранее, а двух различных типов СР, один из которых, с g-фaктopoм 2,003, хорошо известен и локализован в молекулах гумусовых кислот, а второй, с g-фaктopoм 2,002, находится в структуре инертных, прочно связанных с минеральной частью фракций органического вещества. Разработанный метод позволяет изучать органическое вещество в его нативном состоянии непосредственно в почвенных образцах, не прибегая к предварительным экстрактивным процедурам (Авторское свидетельство № 1193549 и патент РФ № 1791776).

Впервые в спектрах 13С-ЯМР гуминовых кислот чернозема и темно-серой лесной почвы при компьютерной Фурье-трансформации в области сигнала ароматического углерода разделены и количественно определены два сигнала: широкий сигнал высококонденсированных полисопряженных структур и более узкий сигнал менее конденсированных, "рассеянных" ароматических ядер.

Показано, что при распашке черноземов в гуминовых кислотах относительное накопление ароматических структур идет за счет высококонденсированных структур, а при распашке темно-серых лесных почв в большей степени накапливаются "рассеянные" ароматические фрагменты. Погребение сильнее влияет на молекулярную структуру гуминовых кислот, чем распашка.

По результатам исследования физиологической активности гуминовых кислот различных почв как на уровне растительных тканей, так и на уровне целого растительного организма показано, что она тесно связана со свободными радикалами и установлены количественные параметры этой взаимосвязи. Показано также, что механизм проявления физиологической активности в гуминовых кислотах дерново-подзолистых почв несколько иной, чем в гуминовых кислотах черноземов и серых лесных почв.

Установлено, что проявление биопротекторной активности гуминовых кислот в условиях загрязнения среды тяжелыми металлами частично связано с прямой инактивацией последних, однако наиболее сильное влияние оказывает прямая физиологическая стимуляция защитных реакций растений и повышения их устойчивости к токсическому воздействию.

Предложено использовать в числе показателей системы комплексной параметрической оценки экологического потенциата гуминовых кислот и органического вещества почв в целом ряд тесно связанных с их экологическими функциями физико-химических параметров, определяемых методами ЭПР и 13С-ЯМР (концентрация СР и ароматичность гуминовых кислот, а также концентрация активных фракций органического вещества почв).

Практическая значимость и реализация результатов работы.

Полученные результаты доведены до широкого круга специалистов путем публикаций и докладов на конференциях, а также широко используются в учебном процессе на Почвенном отделении СПбГУ в бакалаврских и магистерских курсах лекций "Химия почв", "Биохимия органического вещества", "Физико-химические методы исследования почв", "Структурно-функциональные параметры гумусовых веществ", "Экологические функции органического вещества почв", "Нормирование техногенной нагрузки на почвы" и др. На основе материалов диссертации была выпущена часть 1 Методических указаний по курсу "Физико-химические методы исследования почв. (Спектроскопические методы.)".

Предложен новый способ оценки качественного состава органического вещества почв, простота и надежность которого позволяют рекомендовать его к внедрению как в практике научных наследований, так и производственных условиях, при агрохимическом обследовании почв.

Использование в системе экологических оценок гумусовых веществ и органического вещества почв в целом предлагаемых физико-химических параметров может бьггь полезным при оценке состояния и трансформации органического вещества почв, как в естественных, так и в антропогенных экосистемах и применяться не только в фундаментальных исследованиях, но и при мониторинге

антропогенно нарушенных почв, нормировании техногенных нагрузок и экологической экспертизе.

Апробация полученных материалов.

Основные материалы работы доложены на Всероссийских (Всесоюзных) и международных научных конференциях «Нечерноземные почвы и пути их рационального использования» (Ленинград, 1979, 1980, 1982, 1983, 1985 г.г.); «Докучаевское почвоведение 100 лет на службе сельского хозяйства» (Ленинград, 1983); «Современные методы физико-химических исследований и химико-аналитического контроля в сельском хозяйстве» (Тюмень, 1984); "Агропочвоведе-ние и плодородие почв", (Ленинград, 1986); "Плодородие почвы в интенсивном земледелии" (Волгоград, 1988); Делегатские съезда общества почвоведов (Минск, 1977; Ташкеет, 1985; С. Петербург, 1996); "Humus et Planta", (Prague, 1991); Регуляторы роста и развития растений, (Москва, 1995); 7-th European Ecological Congress (Budapest, 1995) Ш М-нар. конф. "Освоение Севера и проблемы рекультивации" (С.-Петербург, 1996); "Резервы повышения плодородия почв и эффективности удобрений" (Горки, Белоруссия, 1996); 8-th Meeting of the International Humic Substances Society (Wroclav, Poland, 1996); "Проблемы антропогенного почвообразования" (Москва, 1997); "Антропогенная деградация почвенного покрова и меры ее предупреждения", (Москва, 1998); 9-th International Meeting of the International Humic Substances Society (Adelaide, Australia, 1998).

Публикации: Результаты исследований отражены в 64 публикациях. Список основных из них приводится в конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 309 страницах, содержит 45 таблиц и 40 рисунков. Она состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, приложений и списка литературы, состоящего из 511 названий, в том числе 145 на иностранных языках.

В диссертационной работе использованы результаты личных исследований автора и совместных работ с сотрудниками кафедры почвоведения и географии почв СПбГУ и Биологического НИИ СПбГУ проф. В.П.Цыпленковым, В.К.Пестряковым, И.А.Терешенковой, H.H.Федоровой, Н.В.Ковш, М.А.Надпо-рожской, А.И.Поповым, В.Д.Талашкиной, И.Н.Лапшиной, Т.А.Рычковой, которым автор выражает искреннюю благодарность.

Автор благодарен за помощь в работе и ценные замечания научному консультанту работы, заведующему кафедрой почвоведения и географии почв Санкт-Петербургского государственного университета, профессору Б.Ф.Апарину, а также доценту О.Г.Растворовой, профессору О.Г.Чертову, и сотрудникам кафедры почвоведения и экологии почв СПбГУ за неоценимую помощь в работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 Принципы и методологические подходы к изучению орга1шческо-го вещества целинных и антропогенно нарушенных почв.

1.1. Трансформация органического вещества и плодородие пахотных почв.

В разделе кратко изложено современное состояние исследовании по органическому веществу в целинных и пахотных почвах, и связи его с плодородием почв. Рассматриваются работы И.В.Тюрина, (1937); Д.С.Орлова (1974, 1990, 1996 и др.);

A.Д.Фокина (1974, 1978, 1993 и др.); Л.Н.Александровой (1980 и др.);

B.В.Пономаревой и Т.А.Плотниковой (1980 и др.); В.А.Семенова, (1988, 1992); А.А.Короткова, (1970 и др.); Б.П.Ахтырцева, (1974 и др.); В.И.Кирюшина и др., (1993); А.П.Щербакова, (1979 и др.); Б.МКогута (1996 и др); и других авторов. Плодородие и устойчивость почв к шггропогенному воздействию зависит не столько от количественного содержания органического вещества, сколько от его качественных характеристик, в связи с чем вопрос изучения физико-химических структурных и функциональных параметров гумусовых веществ и органического вещества почв в целом имеет большое значите.

Отмечено, что, несмотря на единство взглядов в вопросе общей направленности трансформации органического вещества почвы при ее распашке, в литературе встречаются большие расхождения в трактовке молекулярных механизмов этого процесса. Отчасти это вызвано несовершенством методической базы исследований. Многие широко используемые в настоящее время методы, начиная от экстракции препаратов гумусовых веществ и кончая методами исследования их состава и свойств, носят во многом условный или косвенный характер, что иногда приводит к несоответствиям как в получаемых данных, так и в их интерпретации. По этой же причине в настоящее время практически отсутствует надежный, универс&тьный и достаточно информативный количественный показатель качествешюго состава органического вещества антропогенно преобразованных почв. Это в свою очередь затрудняет адекватный учет роли органического вещества в проявлении важнейших функциональных параметров самой почвы, таких, как плодородие, устойчивость почвенной среды к неблагоприятным воздействиям и т.п.

1.2. Основные представления о трансформации качествешюго состава органического вещества погребенных гумусовых горизонтов палеопочв.

В этом разделе при сравнении представлений И.В.Тюрина (1940), И.П.Герасимова (1969 и др.), О.Н.Бирюковой и Д.С.Орлова (1980), МА.Дергачевой (1995, 1997 и др.), O.A.Чичаговой (1961, 1985 и др.) Т.Д.Морозовой (1971, 1979),

C.В.Губина (1984) и других авторов о трансформации органического вещества в погребенных почвах отмечается определенная противоречивость во взглядах Одни

авторы считают, что гумусовые вещества в погребенных почвах как бы консервируются и не претерпевают существенных качественных изменений, другие наоборот указывают на существенную трансформацию их фракционного состава и структурных особенностей. По нашему мнению это отчасти может быть связано как с разновозрастностью и особенностями погребения почв (глубина, гидротермический режим и др.), так и с упоминавшимся выше несовершенством методической базы исследований структурных параметров органического вещества почв.

1.3. Методологические подходы к изучению качественного состава органического вещества целинных и антропогенно нарушенных почв.

В биохимии почв в последние годы достаточно остро стоит проблема совершенствования методологических подходов к изучению органического вещества и в особенности почвенного гумуса. Многие традиционные методы исследования (такие как, например, фракционно-групповой анализ гумуса и др.) во многом исчерпали свои возможности, а целый ряд широко используемых методов структурных исследований гумусовых веществ, оказались либо трудно применимыми, либо косвенными и трудно интерпретируемым. Причина этого отчасти заключается в сложном и нерегулярном строении, а также в гегерополидисперсном характере почвенного гумуса. В результате этого, при изучении влияния антропогенного воздействия на процессы трансформации органического вещества исследователи часто сталкиваются с трудно сопоставимыми, а часто и противоречивыми данными.

Следует признать, что общепринятая методическая процедура щелочной экстракции и препаративного выделения гумусовых веществ носит в известной степени условный характер и несколько влияет на периферическую часть их макромолекул. В 70-80-е годы предпринимались активные поиски альтернативных щелочи экстрагенгов различной природы, однако сравнительные исследования их эффективности и степени воздействия на гумусовые вещества показали, что щелочному гидролизу пока нет реальной альтернативы (Александрова, 1980; и др.). Анализ современной отечественной и зарубежной научной литературы показал, что этот метод по-прежнему широко используется исследователями во всем мире для препаративного выделения гумусовых кислот. Нагивность и неизменность основных структурных элементов гуминовых кислот в почве и выделенных из нее препаратов на сегодняшний день практически доказана целым рядом прямых приборных методов (Preston, Ripmeester 1982; Орлов, 1990; Krosshavn е.а., 1992; Wershaw, е.а., 1996; Gehring е.а., 1997).

Одной из наиболее сложных проблем в изучении органического вещества почв и в особенности гумусовых веществ является изучение их молекулярной структу-

ры. К концу 80-х годов дня оценки молекулярной структуры гумусовых веществ в основном использовались методы, позволяющие оценить соотношение ароматических и алифатических фрагментов молекул, такие как определение экстинкции растворов гумусовых веществ при различных длинах волн (коэффициент цветности Е4/Еб), гидролизуемость, элементный состав (определение степени бензоидности и графико-статистический анализ по Ван-Кревелену) и другие. К сожалению, большинство из этих методов является косвенными и дают весьма условную информацию о молекулярной структуре гумусовых веществ.

Некоторый прогресс был получен с использованием таких прямых методов как пиролизная масс-спектрометрия (Хмельницкий и др. 1982; и др.) и ступенчатая деструкция гумусовых веществ с оценкой выхода бензолполикарбоновых кислот (Орлов, 1990). Однако трудности методического характера и неоднозначность интерпретации полученных данных пока затрудняют их широкое применение.

Таким образом, необходим выход на новый уровень методического обеспечения, связанный, во-первых, с использованием современных прямых методов детального изучения молекулярной структуры и функциональных свойств гумусовых веществ, а во-вторых, с изучением органического вещества в нативном состоянии непосредственно в почвенном образце.

В результате теоретического обобщения и многолетних исследований почв естественных и антропогенных экосистем была разработана схема, в которой мы сделали попытку отразить основные методологические подходы к изучению органического вещества почв (рис. 1.). Она состоит из двух крупных блоков, представляющих основные методологические подходы к изучению органического вещества. Внутри каждой группы пунктирной линией отделены физико-химические структурные и функциональные параметры органического вещества почв или их гумусовых веществ, определяемые с помощью достаточно хорошо известных химических методов.

Подход, представленный в первом, самом большом экстракгивно-гидролизном блоке данной схемы связан, в основном, с выделением и изучением различных фракций органического вещества. Большинство представленных в нем методов (выше пунктирной линии) являются традиционными и достаточно широко используются. Необходимо отметить и еще один немаловажный аспект - многие из этих методов являются разрушающими, то есть в ходе их применения изучаемый образец безвозвратно утрачивается. В то же время в биохимии постепенно расширяется использование так называемых неразрушающих методов, позволяющих с одной стороны сохранить исследуемый образец, а с другой - избежать возможной рекомбинации между структурными элементами макромолекул гумусовых веществ в процессе их деструкции. С целью снижения негативного воздействия щелочного

гидролиза нами была проведена специальная методическая работа по подбору и компоновке мягкой и эффективной методики экстракции и очистки препаратов гуминовых кислот.

Во втором блоке сгруппированы методы, позволяющие изучать физико-химические параметры органического вещества как единого целого в его нативном состоянии. Этот методологический подход начал развиваться сравнительно недавно с разработкой достаточно чувствительных методов, позволяющих изучать органическое вещество непосредственно в почвенном образце. Несомненное преимущество такого подхода заключается в большей надежности и достоверности получаемых данных, поскольку они не связаны с какими-либо предварительными экстрактивными процедурами, неизбежно воздействующими на молекулярную структуру (особенно на периферическую часть макромолекул) экстрагируемых препаратов гумусовых веществ.

Рисунок 1. Схема изучения структурных и функциональных параметров органического вещества почвы

и

Значительная часть приведенных в схеме методов достаточно хорошо известна и апробирована, некоторые разработаны сравнительно недавно, а ряд из них находятся еще в стадии разработки. Предложенная схема отражает современные представления и носит, прежде всего, систематический характер. Ее осуществление в полном объеме представляет значительные трудности, да и вряд ли необходимо. В связи с этим основное внимание нами было уделено разработке и совершенствованию наиболее перспективных прямых методов изучения структурно-функциональных параметров оргшшческого вещества почв.

Вполне очевидно, что на современном уровне развития биохимии оргшшческого вещества почв для дальнейшего познания процессов трансформации органического вещества, как в естественных, так и в антропогенно измененных условиях требуется переход от изучения индивидуальных механизмов к исследованию более сложных комбинаций процессов (Таргульян и др., 1989) на молекулярно-фрагментарном уровне (Фокин и др., 1993). Необходимо получение объективной информации о физико-химических параметрах и экологических функциях на различных уровнях организации органического вещества почвы - от почвенного горизонта до уровня макромолекул гумусовых веществ.

В данной работе предпринята попытка такого исследования структурных и функциональных параметров органического вещества почв с использованием современных спектроскопических методов, позволяющих получать прямую информацию о важнейших физико-химических параметрах гумусовых соединений на разных уровнях организации. Поэтому основной упор в структурных исследованиях органического вещества и препаратов гумусовых веществ был сделан на методы электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и ядерного магнитного резонанса (13С ЯМР с твердофазной СРМАБ-техникой и Фурье преобразованием спектров), с помощью которых можно исследовать не только препараты гумусовых соединений, но и органическое вещество непосредственно в почве без его предварительной экстракции. Это дает возможность изучать почву, как цельную гетеро-полидисперсную систему, и давать более объективную оценку состава, свойств ее органического вещества и процессов его трансформации.

Глава 2. Характеристика объектов исследования.

Для изучения антропогенного воздействия на органическое вещество почв был взят зональный ряд (чернозем типичный, серые и темно-серые лесные, а также дерново-подзолисше почвы), отражающий особенности большей части целинных и антропогенно измененных почв на территории Русской равнины. Полевые исследования и отбор образцов почв проводили с помощью сравнительно-географического метода путем закладки парных разрезов, различающихся по

антропогенному воздействию, в пределах одного почвенно-географического контура (одной почвенной разности).

Образцы черноземов и темно-серых лесных почв были отобраны в районе заповедника "Лес на Ворскле" в Белгородской области, серые лесные почвы - в Веневском районе Тульской области, дерново-подзолистые почвы - на территории Ломоносовского и Гатчинского районов Ленинградской области. При изучении погребенных почв подбирались объекты с относительно точной датировкой срока погребения. Только в двух вариантах (чернозема и серой лесной почвы) были использованы объекты с не имеющим точной датировки эрозионным погребением почвенных профилей.

Суммируя изложенные в главе результаты, полученные на основании изучения морфологических и некоторых физико-химических характеристик на уровне почвенного горизонта, можно отметить, что морфологически пахотные горизошы, по сравнению с целинными, имеют более светлую окраску, менее благоприятную структуру, подпахотные горизонты уплотнены. При погребении наблюдается значительное уплотнение гумусовых горизонтов. Окультуривание пахотной дерново-подзолистой почвы ведет к формированию мощного темно окрашенного и хорошо оструктуренного гумусового горизонта. Содержание органического углерода и азота в пахотных вариантах изученных почв на 30-50% ниже по сравнению с целинными (за исключением окультуренной дерново-подзолистой почвы). При погребении почв в гумусовых горизонтах наблюдаются аналогичные и более сильные изменения.

Методы работы. Физико-химическая характеристика почвенных образцов и препаратов гумусовых кислот проводилась общепринятыми методами. В ходе исследований были использованы современные радиофизические методы резонансной спектроскопии: электронный парамагнитный резонанс (радиоспектрометр РЭ-1306) и метод ЯМР на ядрах 13С (импульсный ЯМР спектрометр Вгискег СХР-100 с частотой 25,18 МГц с использованием твердофазной СРМАЭ - техники с вращением образца под магическим углом). Методика оценки физиологической активности и другие использованные в работе методики упоминаются в тексте.

Глава 3 Методические аспекты применения электронного парамагнитного резонанса к изучению органического вещества почвы.

3.1. Получение спектров электронного парамагнитного резонанса и их математическая обработка.

В последнее время метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) все чаще используется в исследованиях гумусовых веществ. Основным его достоинством является возможность обнаруживать неспаренные электроны,

принадлежащие свободным радикалам (СР) даже при очень низкой их концентрации в любом веществе без видоизменения его состава и структуры.

Важная роль неспаренных (свободных) электронов в любой химической или биологической системе обусловливается большим запасом энергии и, соответ-ствешю, высокой химической активностью, которой они обладают. Известно, что большинство химических реакций идет через стадию образования свободных радикалов, обладающих неспаренным электроном. СР может быть коротхоживу-щим (например, в ходе реакции неорганических молекул) и стабильным (обычно в сложных органических системах).

В литературе, посвященной применению метода ЭПР к изучению природных высокомолекулярных органических соединений, для обозначения группировок атомов или участков молекул, обладающих неспаренным свободным электроном, наряду с термином "свободный радикал" принят термин "парамагнитные центры" (их обычно обозначают сокращенно ПМЦ). Этот термин с физической точки зрения более корректен, так как обозначает собой, по сути, свободный неспарен-ный электрон, который может и не принадлежать какой-либо конкретной группе атомов, а быть локализован на достаточно большом пространстве конденсированных ароматических структур, как это имеет место в утлях. Однако, поскольку с биохимической точки зрения эти термины, по сути, являются синонимами, то нам кажется, более привычен все же термин "свободные радикалы", (используемый также и в иностранной литературе), поэтому его мы и будем придерживаться в дальнейшем.

В разделе экспериментально обоснованы оптимальные параметры регистрации спектров ЭПР твердых образцов гумусовых кислот (степень измельчения препарата, величина навески, мощность излучения СВЧ и амплитуда модуляции). Для изучения парамагнитной активности ПС и взаимодействия с катионами в растворе был изготовлен плоский капилляр из органического стекла и экспериментально отработаны оптимальные параметры регистрации спектров ЭПР растворов ГК.

3.2 Влияние различных методов очистки препаратов гуминовых кислот на их парамагнитную активность

Изучение влияния различных методов очистки на парамагнитные свойства, элементный состав и оптические свойства (коэффициент цветности) препаратов ГК позволило предложить мягкую, но достаточно эффективную методику их очистки, состоящую из последовательной обработки щелочного экстракта (0,1 н №ОН) коагулятором (нас. р-р Ка2804), высокоскоростного центрифугирования при 25 тыс. об/мин. и диализа, после которого препарат сушили в вакууме над Р205 при

t=40°C. Эта стандартная методика, применявшаяся нами для очистки препаратов ГК различных почв, позволяла получать образцы с зольностью до 4%.

Глава 4. Изучение органического вещества почв методом электронного парамагнитного резонанса.

4.1 Свободные радикалы и их роль в органическом веществе почв.

В разделе освещаются современные взгляды на природу парамагнетизма гумусовых веществ и роль СР (ПМЦ) в органическом веществе почвы. Рассматриваются работы М.М.Кононовой (1965), И.Д.Комиссарова и Л. Ф. Логинова с соавторами (1971, 1981 и др.), Н.Н.Бамбалова с соавторами (1976 и др), С.А.Алиева с соавторами (1977 и др.), В.Ф.Бабанина с соавторами (1977, 1983), иностранных авторов (Schnitzer, 1969, 1970, 1971, 1982 и др.; Senesi, 1981, 1983, 1996 и др.) и других исследователей, указывающих, что парамагнитная активность (концентрация СР) является важнейшей характеристикой гумусовых веществ почвы. Отмечено, что СР (ПМЦ) принимают непосредственное участие в окислительной полимеризации гумусовых веществ, их взаимодействиях с минералами, обменном поглощении катионов, инактивации органических токсикантов и др.

Большинство авторов считают возможным существование в высокомолекулярных природных органических соединениях, к которым можно отнести и гумусовые вещества, по меньшей мере, 4-х типов СР (ПМЦ), дающих сигнал в области g-факгора 2,003: свободные радикалы семихиноидного типа, дефекты сопряженных я-связей, комплексы с переносом заряда и ПМЦ развитой системы сопряженных связей. Однако в спектре ЭПР все эти СР (ПМЦ) дают сигнал в одной области спектра с g-факгором 2,003, и дифференцировать их по этим типам, несмотря на ряд попыток (исследования релаксационных характеристик СР с помощью эффектов быстрого прохождения (Стригуцкий и др. 1989) и др), пока не удается.

4.2. Исследование процесса взаимодействия гушшовыж кислот с катионами.

Анализ литературы о влиянии органо-минеральных взаимодействий на парамагнитную активность гумусовых соединений показал, что подавляющее большинство работ выполнено на единичных препаратах без исследования концентрационных зависимостей, а соотношение гумусовых кислот с катионами часто во много раз превышает пропорции, возможные в естественных условиях.

Мы проводили исследования концентрационных зависимостей взаимодействия гуминовых кислот (ГК) различных почв с катионами железа, марганца, меди, кальция, цинка, свинца и алюминия. Исследование твердых препаратов комплексов показало (см.рис.2), что при взаимодействии с катионами железа в ГК резко падает

содержание СР (они дают сигнал с д-фактором 2,003). То, что в сухой смеси ГК с хлоридом железа этот факт не обнаруживается, подтверждает непосредственное участие СР ГК в реакции с катионами железа. Анализ формы линии сигнала ЭПР полученных препаратов методом линейных анаморфоз показал, что СР ПС можно условно разделить на две группы: СР, находящиеся на близком расстоянии друг от друга, локализоБашше, по-видимому, в "ядерной" части ГК (для них характерен обмен энергией друг с другом - так называемое "спин-спиновое" обменное взаимодействие) и СР, рассеянные по молекулам ГК, возможно локализованные в их "периферической" части (для них характерно "спин-решеточное" обменное взаимодействие, в случае которого обмен энергией происходит между СР и остальной частью молекулы). При возрастании концентрации железа в ГК начинают относительно преобладать СР «ядерной» части - они реагируют с катионами железа медленнее, чем СР «периферической» части. Это может свидетельствовать о труднодоступности СР «ядерной» части ГК для катионов железа.

Рисунок 2. Полные спектры ЭПР чистых ГК чернозема (а), комплекса ГК с катионами железа (б), сухой смеси ГК с хлоридом железа (в) и чистого хлорида железа (г).

Изучение динамики интенсивности наблюдаемых в спектре ЭПР ГК сигналов с g-фaктopaми 4,3 и 2,11 (см. рис. 2) показало, что при малых концентрациях катиона железа (до 0,5 мг-экв. на 1 г ГК) происходит резкое увеличение первого сигнала, а второй начинает увеличиваться только при дальнейшем повышении концентрации железа. Следует отметить, что в препарате сухой смеси ГК.с хлоридом железа наблюдается заметное увеличение только сигнала с g-фaктopoм 2,11. Это позволяет предположить, что сигнал с g-фaктopoм 4,3 вызван атомами железа, химически

связанными с ГК, а сигнал с g-фaктopoм 2,11 может быть обусловлен железом, или поверхностно адсорбированным молекулами ГК, или его минеральными частицами, присутствующими в ГК уже как механическая примесь (такой же сигнал даегг чистый хлорид железа).

При изучении парамагнитных свойств ГК в растворе возникла необходимость подробного исследования влияния рН раствора та концентрацию СР в ГК. Полученная зависимость, приведенная на рис. 3, свидетельствует, что в области значений рН от 2,5 до 10,6 концентрация СР увеличивается в среднем на 10-15% на единицу рН. Это явление можно объяснить стабилизацией семихиноидных радикалов при подщелачивании среды. В области значений рН 2,0 и ниже концентрация СР вновь начинает повышаться, что может быть связано с сильной коагуляцией и частичным кислотным гидролизом молекул ГК.

140-1

120-

100'

О."

о

ГС

=Г (0 а. н х й>

X

о

80-

60-

40

20-

4 6 8

Реакция среды, рН

—г-10

I

12

Рисунок 3. Зависимость парамагнитной активности (%) ГК целинной темно-серой лесной почвы от реакции среды в растворе. За 100% принята КСР при рН=7,0.

Гетерогенность СР в ГК, обнаруженная при изучении твердых препаратов комплексов ГК с железом, была подтверждена исследованиями железо-гуминовых комплексов в растворе, результаты которых представлены на рис. 4. Во всех ГК

наблюдается зона насыщения, которая возникает, очевидно, после истощения СР «периферийных» структур ГК и далее сменяется новым падением концентрации СР, обусловленным вступлением в реакцию с катионами СР «ядерной» части ГК. Таким образом, по положению зоны насыщения можно оценить количественное соотношение двух типов СР.

На рис. 4 видно, что в ГК чернозема и пахотной серой лесной почвы можно отметить несколько меньшее содержание СР периферической части, чем в ГК целинной темно-серой лесной почвы. Опыты по комплексообразованию ПС с другими катионами также подтверждают этот вывод и позволяют разделить использованные катионы на три группы. Железо, медь и марганец активно взаимодействуют с СР ГК до почти полного исчезновения СР. Катионы свинца и алюминия реагируют лишь с частью СР ГК, а взаимодействие катионов кальция и цинка с СР осложняется образованием комплексов с переносом заряда (Блюменфельд и др., 1962; Григорьева и др., 1967; и др.).

Концентрация Ре3* (мг-экв/1г ГК)

Рисунок 4. Зависимость концентрации СР в растворе ГК различных почв от содержания катионов железа.

4.3. Изучение взаимосвязи концентрации СР и степени гумификации органического вещества в почвах.

Сопоставление литературных (Блюменфельд и др., 1962; Касаточкин и др., 1969; Орлов, 1979, 1990, и др.) и собственных данных позволило выдвинуть

гипотезу, что парамагнитная активность гумусовых кислот обратно пропорциональна их биотермодинамической устойчивости и глубине гумификации. К сожалению, в научной литературе мало данных по использованию метода ЭПР (несмотря на принципиальную возможность) для изучения органического вещества в его нативном состоянии непосредственно в почвенных образцах.

С целью проверки этой гипотезы из исследованных лесостепных почв по специальной мягкой методике нами были выделены препараты 1-й фракции ГК, обладающие благодаря минимальным деструктивным воздействиям уровнем парамагнитной активности близким к естественному. Можно отметить (см. табл. 1), что препараты из горизонта А1 целинной темно-серой лесной почвы имеют самую высокую концентрацию СР (КСР) и низкую оптическую плотность, что свидетельствует об их слабой биотермодинамической устойчивости и сравнительно небольшой глубине гумификации. В то же время гуминовые кислоты чернозема имеют весьма низкую парамагнитную активность и высокую оптическую плотность, что, в согласии с литературными данными, свидетельствует об их большой глубине гумификации и высокой биотермодинамической устойчивости. Следует отметить, что распашка темно-серой лесной почвы снижает концентрацию СР в ПС почта на 50%, а чернозема - более чем на 30%. В погребенных горизонтах изменения более значительны: 75% и 53% соответственно и парамагнитная активность ГК 1-й фракции погребенной темно-серой лесной почвы снижается до уровня ГК чернозема. Эту же закономерность можно отметить и при определении концентрации СР (ПМЦ) непосредственно в почвенных образцах (см. табл. 2).

Изучение оптических свойств растворов ГК целинных, пахотных и погребенных почв показало, что в данном случае коэффициент цветности не показывает существенных изменений и можно говорить лишь о тенденции к его увеличению в ГК ашропогенно нарушенных почв. Это может свидетельствовать о достаточно низкой чувствительности и невысокой надежности этого условного показателя.

Таблица 1

Парамагнитная активность (концентрация СР) и оптические свойства ГК.

Почва, горизонт ССР, спин/г Ю16 Р*0,00\%ГК 1см,465 нм. Е4/Е6

Темно-серая лесная (целинная) А! 50,7 0,064 4,9

Темно-серая лесная пахотная Апах. 27,0 0,067 5,1

Гемно-серая лесная погребенная А1 погр. 12,4 0,073 5,0

Чернозем типичный (целинный) А 17,0 0,092 7,2

Чернозем типичный пахотный Апах. 11,4 - 7,8

Чернозем типичный погребенный Апогр. 8,0 - 7,6

Таким образом, сопоставляя данные по КСР и оптической плотности, можно заключить, что при распашке, погребении и связанных с ними изменениях биогид-ротермического режима гумусообразования в гумусовых горизонте происходит относительное накопление биотермодинамически высокоустойчивых глубоко гумифшщрованных соединений с высокой оптической плотностью и низкой парамагнитной активностью. Существенные изменения парамагнитной активности в препаратах гумусовых кислот при дополнительных экстрактивных процедурах, обусловили необходимость изучения парамагнитной активности в самих почвенных образцах.

4.4. Изучение парамагнитной активности органического вещества непосредственно в почвенном образце.

Метод ЭПР благодаря своей высокой чувствительности дает редкую пока возможность изучать почву как цельную гетерополидисперагую систему, а ее органическое вещество в наивном состоянии непосредственно в почвенных образцах, не прибегая к предварительному экстрагированию препаратов каких-либо условных групп и фракций. Анализ немногочисленных литературных источников по спектрам ЭПР образцов почв показал, что в области g-фaктopa 2,0 обнаруживали только один узкий сигнал с g-фaктopoм 2,003.

Рисунок 5. Спектры ЭПР гумусовых горизонтов темно-серой лесной целинной "а" и серой лесной пахотной "б" почв.

В полученном нами спектре ЭПР горизонта А[ целинной серой лесной почвы в указанной области наблюдается такой же единичный узкий синглетный пик с g-фактором 2,003, принадлежащий СР, наблюдавшимся нами в препаратах гумусовых кислот, выделенных из этого образца почвы. Однако в спектре ЭПР образца гумусового горизонта пахотной темно-серой лесной почвы, представленном на рисунке 5, наряду с известным сигналом с §-фактором 2,003, впервые был обнаружен еще один с g-фaктopoм 2,002 ранее никем не наблюдавшийся ни в почвенных образцах, нив выделенных из них препаратах гумусовых соединений. Такой спектр ЭПР может свидетельствовать о наличии в этом образце почвы не одного, как было известно ранее по литературным данным, а двух различных типов СР. Проявление в гумусовом горизонте пахотной серой лесной почвы новых типов СР можно объяснить влиянием распашки, при которой в этом горизонте произошла частичная деструкция и минерализация органического вещества, о чем можно судить по уменьшению содержания общего углерода. Данные по исследованию образцов гумусовых горизонтов чернозема типичного и дерново-подзолистой почвы, представленные в табл. 2, подтверждают вывод, сделанный нами на образцах темно-серых лесных почв.

Таблица 2

Содержа! ие органического углерода и парамагнитная активность органического вещества в целинных и пахотных почвах и почвообразующих породах по данным спектроскопии ЭПР

Почва, разрез Горизонт С,% КСР, спин/г 1016

g=2.003 (КАФ) g=2.002 (КПФ)

Чернозем цел. р. 820 А 2-15 3,07 8,04 -

Чернозем пахотный, р. 820а Апах 0-25 2,28 5,98 0,10

Темно-серая лесн. цел. р. 821 Ai 2-15 4,71 9,78 -

(1 п Ai облуч УФ 4,70 20,92 -

(Г И Ai экстр NaOH 1,20 0,29 0,69

Темно-серая лесн. пах. р. 822 Апах 0-22 1,68 0,63 0,51

Дерново-подзолистая цел р.1 А,А2 2-10 4,37 5,48 0,41

Дерново-подзолистая пах р.б Апах 0-22 1,56 1,30 0,92

Дерново-подз. окультур. pli Апах 0-25 5,69 3,46 0,34

Лесс - - 0,23 0,45

Красно-бурая карб. морена - - 0,06 0,37

Лент, глина - - 0,01 0,67

Концепция ведущей роли деструктивных процессов в проявлении нового типа СР была подтверждена в ряде экспериментов по гидролизу и окислительной деструкции органического вещества целинных почв. Результаты, представленные в

табл. 2 и на рис. 6, показывают, что как гидролиз и удаление гумусовых кислот раствором щелочи, так и окислительная деструкция органического вещества раствором перекиси водорода вызывают сильное уменьшение сигнала СР 2,003 от гумусовых кислот и появление значительного количества СР 2,002. Но использованные методы не в состоянии удалить из почвы все органическое вещество.

Для окончательного вывода о природе нового типа СР была использована термодеструкция в аргоне. Данные, представленные на рис. 7, показывают, что соединения с СР 2,002 оказались значительно менее устойчивыми к воздействию температуры, чем СР гумусовых соединений. Этот результат позволяет выдвинуть гипотезу об органическом происхождении нового типа СР, которая подтверждается данными по сравнительно быстрому насыщению сигнала 2,002 от увеличения мощности СВЧ при регистрации спектра ЭПР, что также указывает на органическую природу этих СР (Л. А. Блюменфельд и др., 1962).

I I 1 | I | г | I | 1 |—

0 10 20 30 40 50 60

Концентрация Н202, %

Рисунок 6. Зависимость парамагнитной активности образца гумусового горизонта темно-серой лесной почвы от обработки его раствором перекиси водорода.

Рисунок 7. Влияние термодеструкции в атмосфере аргона на парамагнитные свойства пахотной темно-серой лесной почвы.

После лабораторных экспериментов по искусственной деструкции органического вещества были предприняты исследования роли естественных природных факторов в появлении СР 2,002 в почве. Пахотные почвы, например, больше чем целинные, подвергаются облучению солнечным ультрафиолетом, однако искусственное облучение горизонта А1 целинной серой лесной почвы вызвало лишь значительное увеличение числа уже имевшихся в ней СР 2,003, как это видно из табл. 2, и не привело к появлению каких-либо дополнительных сигналов в этой области спектра.

Для выяснения роли микробной деструкции в появлении нового типа СР был заложен опыт по длительному инкубированию образца горизонта А1 целинной темно-серой лесной почвы. Результаты, представленные на рис. 8, показывают, что инициирование микробной деятельности слабым раствором глюкозы приводило к резкому усилению деструкции, о чем можно судить по увеличению числа СР 2,003. С течением времени, однако, установилась тенденция к снижению их концентрации. В образце с 250-дневным сроком инкубации, наряду с уменьшением содержания общего углерода, происходит изменение качественного состава органического вещества. Возрастает его биотермодинамическая устойчивость и глубина гумифи-

кации. Этот срок оказался, одаако, недостаточным для коренных изменений в качественном и количественном составе органического вещества, необходимых для проявления СР 2,002.

о

X ь-

■г 5

а." о

30 п

25-

20-

15-

10

—I— 50

100

—1— 150

200

250

Дни

Рисунок 8. Зависимость парамагнитной активности образца темно-серой лесной почвы от времени инкубации (добавки глюкозы производили перед началом опыта и после 40 дней инкубации).

Можно отметить, что в гумусовом горизонте погребенной темно-серой лесной почвы (табл. 4) слабый сигнал от СР 2,003 сочетается с достаточно интенсивным сигналом от СР 2,002. Ранее по исследованию препаратов гумусовых кислот уже был сделан вывод о высокой биотермодинамической устойчивости и глубокой гумификации относительно прочно связанных с минеральной частью гуминовых кислот погребенного горизонта. Таким образом, можно предположить, что микробная деструкция органического вещества является, по-видимому, основным фактором, приводящим к появлению СР 2,002. Весьма интересен также обнаруженный нами факт присутствия небольшого количества СР 2,002 в ряде образцов почвообразующих пород, (табл. 2), что свидетельствует об участии соединений с этими СР в самых ранних этапах оргало-минеральных взаимодействий.

7-

6-

(О 5-

ь

X 1— 4-

"С

г:

о 3-

О.

2-

1 -

0-

д=2.002 - д=2.003

Концентрация РеС1з, (%)

Рисунок 9. Зависимость концентрации двух типов СР органического вещества дерново-подзолистой почвы от содержания катионов железа.

После выяснения природы и происхождения нового типа СР для определения их реакционноспособносш был поставлен опыт по взаимодействию СР с катионами железа. Результаты, представленные на рисунке 9, свидетельствуют об относительно высокой реакционноспособносш СР 2,003 и практически полной инертности СР 2,002. Это дало повод первые отнести первые к активным, а последние - к пассивным фракциям органического вещества почвы. Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод, что сигнал 2,002 обусловлен СР, находящимися в структуре инертных органических веществ, прочно связанных с минеральной частью. Эти, по-видимому, не очень высокомолекулярные вещества, являясь пионерами органо-минеральных взаимодействий, занимают самые прочные комплексообразующие позиции на поверхности кристаллических решеток минералов, формируя своеобразную матрицу, СР которой в дальнейшем, если происходит гумусово-аккумулятивный процесс, участвуют в закреплении и достройке более высокомолекулярных гумусовых соединений. При распашке и других воздействиях, изменяющих биогидротермические условия гумусообразовання, деструктивные

процессы вновь приводят к относительному увеличению доли прочносвязшшых с минеральной частью соединений, несущих в своей структуре СР 2,002.

Для экспериментальной проверки этой гипотезы нами были использованы образцы из достаточно продолжительного (2 года) многофакторного лабораторного модельного опыта по компостированию дерново-подзолистых почв разной степени окультуренности с добавлением высоких доз (1:10) органических материалов (навоз, торф и смесь наземной массы клевера и тимофеевки) при оптимальной влажности (60% от ПВ) и температуре +28°С (Пестряков, Чуков Ковш и др. 1990).

Таблица 3.

Содержание СР (1015 спин/г) активных (КАФ) и пассивных (КПФ) фракций органического вещества в компостированных образцах дерново-подзолистых почв

Образец Исходные 3 месяца 6 месяцев 12 месяцев 24 месяца

Добавка КАФ КПФ КАФ КПФ КАФ КПФ КАФ КПФ КАФ КПФ

ДПцел. 5,48 3,41 1,62 0,23 2,02 1,01 3,70 0,39 0,67 0,80

" +навоз 9,47 3,41 1,76 0,42 2,15 0,86 2,58 0,79 1,62 0,58

" +торф 11,30 3,41 2,86 0,83 2,20 0,65 2,50 0,72 2,08 0,60

"+кл,тим. 6,34 3,41 0,93 0,93 0,88 0,90 1,91 0,68 1,08 0,62

ДПпах. 1,30 3,92 0,85 0,40 1,52 0,94 1,74 0,91 0,52 0,93

" +навоз 5,29 3,92 2,65 0,29 1,97 0,85 2,57 0,77 1,04 0,85

" +торф 7,15 3,92 5,65 0,50 5,26 0,53 4,07 0,48 2,00 0,91

"+кл,тим. 2,16 3,92 1,54 0,93 1,83 0,96 0,75 0,86 0,64 0,98

ЦП окульт 3,46 3,34 1,95 0,42 2,47 0,56 1,82 0,58 2,26 0,70

" +навоз 7,45 3,34 2,11 0,56 1,58 0,62 1,93 0,76 1,29 0,55

" +торф 9,31 3,34 6,82 0,69 5,53 0,37 5,10 0,41 2,44 0,51

'+кл,тим. 4,32 3,34 1,36 0,77 2,81 0,58 1,33 0,57 1,13 0,61

Концентрацию активных фракций (КАФ) в исходных смесях (до компостирования) определяли расчетным путем после раздельного определения в почвенном образце и в органических добавках, ряд которых (навоз и торф) содержал гумусовые и гуминоподобные вещества в исходном состоянии. Пассивные, прочно связанные с минеральной частью фракции, присутствуют только в почве, и потому их количество в исходных смесях от внесения органических добавок не изменяется.

Результаты (табл. 3) показывают, что в процессе компостирования наряду с общей минерализацией органического вещества идут процессы существенной трансформации его структурных параметров. В контрольных вариантах исходных почв эта трансформация заключается в постепенном уменьшении содержания активных фракций, которое сопровождается заметным ростом количества пассивных. Добавление в исследованные почвы органических материалов не вызвало

качественных изменений в характер трансформации органического вещества, но заметно изменило количественные показатели. Так, резкое увеличение содержания активных фракций в комиостах, отмеченное в образцах до начала компостирования, сказывается во всех сроках. При сравнении образцов разных сроков компостирования можно отметить, что 6 и 12-месячные образцы в целом заметно меньше различаются между собой по качественному составу, чем образцы 3 и 24-месячного сроков. Влияние типа органических материалов выражается в том, что в вариантах с торфом повышенное содержание активных фракций ярче выражено в последнем сроке компостирования, в то время как варианты с навозом имеют лучший качественный состав в первых сроках компостирования. Вполне очевидно, что по данным ЭПР благоприятное влияние органических удобрений на качественный состав органического вещества исследуемых почв сохраняется в большинстве случаев почти до конца опыта.

Таким образом, по результатам изучения образцов почв модельного опыта можно сделать вывод, что пассивные фракции, содержание которых оценивается по концентрации СР с §-факгором 2,002, достаточно чувствительно реагируют на изменение гидротермических условий и поступление органических остатков. Однако, для того, чтобы показать возникновение сигнала от этих фракций в почвах с высоким содержанием достаточно зрелых гумусовых веществ (целинные разности чернозема типичного и темно-серой лесной почвы), где он в исходном состоянии почв отсутствует, использованных сроков инкубации, видимо, не хватает.

Поэтому представляется целесообразным рассматривать в качестве модельных объектов с достаточно продолжительным сроком инкубации в условиях дефицита поступления свежих органических остатков погребенные варианты этих почв. Их органическое вещество, практически лишенное поступления свежих органических остатков (если не считать корневого опада и то только в случае размещения погребенного горизонта в пределах корнеобитаемой толщи почвы), подвергалось постепенной микробиологической деструкции, что приводит в ряде случаев к более значительному снижению содержания органического углерода, чем в пахотной почве.

Результаты представленные в табл. 4 показывают, что в погребенных гумусовых горизонтах значительно снижается сигнал от гумусовых соединений с g-фактором 2,003 и во всех вариантах этих почв отмечается образование СР пассивных фракций - проявляется достаточно интенсивный сигнал с g-фaктopoм 2,002. В то же время в разделе 4.3 было показано, что гумусовые кислоты погребенной почвы характеризуются высокой степенью биотермодинамической устойчивости и

зрелости, причем замегао возрастает прочность связи присутствующих в нем гумусовых соединений с минеральной частью.

В погребенном горизонте чернозема наблюдается заметное падение (на 30%) содержания активных фракций, которое сопровождается некоторым увеличением содержания пассивных, прочно связанных с минеральной частью. В результате отношение активных фракций к пассивным падает почти в два раза.

В темно-серых лесных почвах наблюдаются несколько более характерные изменения, которые могут быть связаны с биогидротермическими условиями гумусообразовшшя в поверхностных горизонтах. Распашка и интенсивное сельскохозяйственное использование верхних горизонтов этих почв обусловливают более инертный характер их органического вещества и тем самым ослабляют различия между пахотным и погребенным горизонтами.

Таблица 4.

Содержание органического углерода и парамагнитная активность органического вещества в образцах целинных, пахотных и погребенных почв по данным спектроскопии ЭПР.

Почва Горизонт С,% КАФ КПФ

Чернозем с погреб, горизонтом Агах., 0-25 4,36 5,22 0,65

н А 30-40 4,08 4,77 0,52

н Апогр., 40-50 6,86 3,66 0,74

Темно-серая лесная целинная А,, 2-10 5,61 3,91 0,87

Темно-серая лесная погребенная Апогр., 51-57 3,40 1,53 0,97

Дерново-подзолистая целинная А1А2, 2-10 4,68 0,80 1,27

Дерново-подзолистая погребенная Апогр., 42-48 3,38 0,51 1,14

В дерново-подзолистых почвах характер трансформации качественного состава органического вещества при погребении в основном сохраняется. По данным ЭПР наблюдается снижение активных фракций почти на 40%. и повышение удельной (на 1%С) концентрации пассивных фракций в погребенном горизонте.

Таким образом, можно сделать вывод, что если при распашке содержание СР активных фракций, связанных с гумусовыми веществам падает на 30 - 50%, то последующее погребение почв вызывает дальнейшее их снижение еще на 30 - 40%. Зависимость конце1гграция СР пассивных фракций от антропогенного воздействия имеет обратную закономерность. Невысокое общее содержание этих фракций обусловлено тем, что верхний предел концентрации пассивных фракций определяется количеством прочных комплексообразующих позиций на поверхности кристаллических решеток почвенных минералов, где эти фракции могут быть защищены от микробиологической деструкции.

Проведенные исследования позволили предложить принципиально новый показатель качественного состава органического вещества (соотношения активных и пассивных, прочно связанных с минеральной частью, инертных фракций органического вещества), при определении которого после регистрации спектра ЭПР образца почвы выбирают сигналы с g-факторами 2,002 и 2,003 и определяют их количественное соотношение.

Принципиальная новизна предлагаемого показателя и способа его определения состоит в том, что метод ЭПР используется в данном случае для изучения всего органического вещества в его нативном состоянии и определяются непосредственные реакционные центры молекул, а не отдельные условные фракции. В результате этого значительно повышается надежность, информативность и скорость определения, что позволяет рекомендовать указанный способ для контроля за качественным составом органического вещества почвы при антропогенном воздействии.

Глава 5 Применение метода ядерного магнитного резонанса к изучешно органического вещества почв

С целью подробного изучения молекулярной структуры гумусовых кислот был использован уникальный неразрушакяций прямой твердофазный метод исследования углеродного скелета сложных органических макромолекул - спектроскопия 13С-ЯМР. В главе освещаются важнейшие работы в этой области (Wilson, 1987; Preston, Rusk, 1990; Frund, e.a.,1994a; WershawR.L. 1996; Gehring e.a.,1997; и др.).

_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i

ppm 180 reo 140 120 loo а о во 40 го о

Рисунок 10. Спектр 13С-ЯМР ПС целинного чернозема с прорисовкой сигналов, выделенных при Фурье-трансформации в области углерода ароматических структур.

В наших исследованиях для расшифровки и количественной обработки полученных спектров 13С-ЯМР ГК был использован метод компьютерной Фурье-

трансформации спектров, позволяющий производить не только расчет интегральной интенсивности сигналов, но и разделение сигналов при их наложении. Эшм методом в спектрах 13С-ЯМР ГК целинных и пахотных вариантов чернозема и темно-серой лесной почвы в области сигналов ароматического углерода был выявлен не отмеченный ранее в литературе широкий сигнал от полисопряжешп.хх конденсированных структур ГК. В качестве примера (рис. 10) на спектре 13С-ЯМР ГК цепшшого чернозема, показано, что мощный синптетный на первый взгляд пик в области углерода ароматических структур (129 ррт) на самом деле состоит из двух сигналов, схематично показанных на рис. 10 ручной прорисовкой под спектром.

Этот широкий пик ранее не отмечался исследователями в спектрах 13С-ЯМР ГК, и, как показал анализ данных по спектрам ВС-ЯМР высокомолекулярных соединений, принадлежит высококонденсированным полисопряженным гетероа-роматическим структурам. В результате близкого расположения и ограниченной подвижности составляющих их ароматических ядер и вследствие связанной с этим анизотропии химического сдвига этот достаточно сильный сигнал значительно уширяется и выполаживается. Следует отметить, что в ГК целинного чернозема типичного этот связанный со структурами высококонденсированной ядерной части сигнал имеет самую большую интегральную интенсивность в спектре 13С-ЯМР.

На рисунке 11 в качестве примера представлены совмещенные спектры ЯМР ГК целинной, пахотной и погребенной почвы, которые наглядно показывают трансформацию молекулярной структуры ГК при распашке и погребении почв.

180 160 140 120 100 80 60 40 20 О

ррт

Рис. 11 Спектры !3С-ЯМР препаратов ГК целинной (а), пахотной (б) и погребенной (в) темно-серой лесной почвы.

Данные по результатам Фурье-трансформации спектров13С-ЯМР препаратов ПС исследовашгых почв (табл. 5) указывают на существенную трансформацию

углеродного скелета макромолекул при распашке и погребении. Снижение количества алифатических цепей сопровождается относительным увеличением на 20 - 40% содержания ароматических структур. Это приводит к возрастанию отношения АЯ/АЬ в пахотных почвах почш в два раза, а показателя ароматичности - на 30%. Причем в ГК пахотного чернозема увеличение ароматичности происходит в основном за счет относительно накопления высококонденсированных ароматических структур ядра ГК (широкий сигнал). В то же время в ГК пахотного варианта темно-серой лесной почвы почти 60% от общей прибавки ароматических структур приходится на более подвижные и менее конденсированные ароматические фрагменты, дающие узкий сигнал |3С-ЯМР. Это указывает на некоторые различия в трансформации органического вещества этих почв.

Таблица 5.

Влияние распашки и погребения почв на содержание структурных фрагментов (%) в препаратах ГК (по данным 13С-ЯМР).

Почва 190- 170-106 105- 30-41 10-20 80-20 AR Арома-

171 узк/шир 81 AL тично-

ррт сть, %

Распашка

Черн. цел., р. 820 11,6 19,1/26,1 - 20,2 23,0 43,6 1,05 51,2

Черн. пах., р.820а 15,6 20,2/36,4 - 16,1 11,7 27,8 2,04 67,1

Т-с.лесн.цел, р. 821 27,8 8,8/27,8 - 17,4 18,2 35,6 1,02 50,7

Т-с.лесн.пах, р.822 17,6 14,2/38,7 - 18,1 11,4 29,5 1,79 64,2

Д.-подз. цел., р 1 16,7 22,4 3,7 23,7 33,6 57,3 0,37 27,7

Д.-подз пах., р 6 16,9 29,2, 2,0 25,8 26,1 51,9 0,56 35,1

Погребение

Чернозем, р.13а 16,3 36,6 22,5 10,7 13,9 24,6 1,49 43,7

"р.13(погр.) 14,3 59,5 - 14,9 11,3 26,2 2,62 69,4

Т.-с. лесная, р. 12 13,1 25,8 6,5 28,4 26,2 54,6 0,47 37,2

" (погр.) 23,9 35,0 6,8 18,0 16,3 35,1 1,02 54,4

Серая лесн, р.11 24,2 34,8 6,3 19,8 14,9 34,7 1,00 55,5

" (погр.) 27,6 57,4 2Д 7,4 5,4 12,8 4,48 83,6

Дерн.-подз., р.10а 10,8 17,0 6,3 24,9 41,0 65,9 0,26 19,0

" р. 10 (погр.) 10,4 18,9 11,3 25,9 33,5 59,4 0,32 21,1

Примечание: Величине химического сдвига (ррт) соответствуют следующие типы структур органического углерода: 171 - 190 - С-карбонилов в С ОС®; 170 — 106 - ароматический С и СН; 105 - 81 - С эфиров и полисахаридов; 80-41 - С углеводов, аминокислот, 40 - 20 - С алифатических цепей, алканов, жирных кислот.

Таким образом, получены прямые данные о трансформации углеродного скелета макромолекул ГК, наглядно свидетельствующие о накоплении конденсирован-

пых ароматических и биохимически инертных структур в пахотных почвах, что подтверждается и результатами изучения парамагнитной активности ПС. Аналогичные, но более сильно выраженные изменения можно отметить и в ПС погребенных почв.

Снижение содержания углерода карбоксильных структур (область 171 - 190 ррш) также свидетельствует о снижении уровня биохимической активности ПС в этих почвах. Эти данные подтверждаются результатами определе1П1Я карбоксильных групп в препаратах ГК изученных почв традиционными методами. Анализ изменения содержания углерода алифатических боковых цепей показывает, что при распашке они убывают более значительно, чем при последующем погребении. По-видимому, если при распашке трансформация углеродного скелета ГК в большей степени затрагивает боковые цепочки, то в погребенных почвах она идет уже одновременно по всем типам алифатических структур.

Йсх. 3 мес, 6 мес, 12 мес, 24 мес

ЕЗАлкильные цепи.

Ш Углеводы, аминокислоты.

Эфиры, полисахариды

■ Ароматические структуры

ПО Карбонилы

Рисунок 12. Влияние инкубирования на молекулярную структуру ГК целинной дерново-подзолистой почвы по данным 13С ЯМР.

Следует отметить, что в данных по препаратам ГК дерново-подзолистых почв наблюдаются аналогичные, но не столь контрастные изменения молекулярной структуры, как в лесостепных почвах и характер их, по-видимому, несколько более сложный. В связи с этим было проведено исследование ГК и фульвокислот (ФК), полученных из образцов описанного выше в главе 4 лабораторного модельного опыта. Данные по гуминовым и фульвокислотам целинной почвы в течение 2-х

летней инкубации без органических добавок, представленные на рис. 12 и 13, указывают на сложный характер трансформации молекулярной структуры гумусовых кислот. Это связано, прежде всего, с зональными особенностями режима гумусообразования, которые обусловливают относительно слабое и, возможно, фрагментарное развитие ароматических структур в ГК дерново-подзолистых почв, о чем можно судить по значительно более низкому (в 2-3 раза ниже, чем в лесостепных почвах) показателю ароматичности ГК (табл. 5).

Анализ молекулярной структуры ГК и ФК показывает, что основные различия между этими важнейшими группами гумусовых веществ заключаются в отчетливом преобладании в составе ФК дерново-подзолистой почвы структур типа углеводов, аминокислот, спиртов, а также других фрагментов, в основном, непредельной алифатической природы. ГК этих почв в свою очередь характеризуются более развитой (о чем свидетельствует более высокие значения отношения ЛК/ЛЬ по сравнению с ФК), но, видимо, фрагментарной ароматической частью.

Исх

3 мес, 6 мес, 12 мес, 24 мес,

Рисунок 13. Влияние инкубирования на молекулярную структуру ФК целинной дерново-подзолистой почвы (обозначения см. рис 12).

При оценке влияния инкубирования на гумусовые кислоты дерново-подзолистой почвы можно отметить, что в данном случае имеет место определенная цикличность процесса гумусообразования. В течение первых трех месяцев

инкубации, очевидно, идет интенсивная трансформация "внутренних резервов" (слаборазложившихея органических остатков), что приводит к повышению содержания алифатических структур (особенно углерода непредельных алифатических цепей).

К шестимесячному сроку этот затихающий процесс трансформации сменяет частичная минерализация и дальнейшая трансформация этих новообразовагшых гумусовых кислот, что приводит с одной стороны к резкому (особенно для ГК) увеличегало углерода карбонильных структур, что, возможно, является результатом кислотообразовашм (по ДН.Александровой, 1980), а с другой - к относительной минерализации алифатических структур. В связи с этим в препарате ГК этого срока наблюдается максимальное значение показателя ароматичности.

Процесс переработки слаборазложившихея органических остатков вызывает, очевидно, некоторый рост микробной массы, которая после завершение трансформационного цикла также начинает разлагаться, что, по-видимому, и обусловливает появление в препаратах как ГК, так и ФК годичного срока всплеска алифатических структур в области 40-80 ррт и новую фазу их перегруппировки в дальнейшем (образец двухлетнего срока), которая, впрочем, не затрагивает ароматической части макромолекул ГК. Процесс "дальнейшей гумификации" ФК также протекает в направлешш относительного повышения доли ароматических структур на уровне характерного для ФК высокого содержшшя непредельных алифатических структур.

Рисунок 14. Влияние органических добавок на молекулярную структуру ГК окультуренной дерново-подзолистой почвы (обозначения см. рис. 12).

Некоторую дополнительную информацию о процессах трансформации органического вещества могут дать результаты, по препаратам ГК, полученным из образцов окультуренной дерново-подзолистой почвы компостированной с различными органическими добавками, представленные на рис. 14. Данные по ГК двух сроков компостирования показывают, что в препаратах трехмесячного срока компостирования также наблюдается заметное увеличение содержания алифатических структур, что может быть вызвано как переработкой детрита самой почвы, так процессом трансформации внесенных органических остатков. Не следует забывать и о поступлении части "готовых" ГК, особенно в вариантах с навозом и торфом. Можно отметить, что именно в этих вариантах, по сравнению с добавкой травяной смеси (наземная масса клевера и тимофеевки) наблюдается максимальное снижение показателя ароматичности ГК.

В ГК годичного срока компостирования различия, как по ароматичности, так и по группам молекулярных структур сглаживаются, что может свидетельствовать о снижении влияния различий в качественном составе внесенных в почву органических остатков и постепенной стабилизации примерно однотипной во всех образцах молекулярной структуры ГК окультуренной дерново-подзолистой почвы.

Глава б Физиологическая и биопротекторная активность гумныовых кислот

Как физиологическая, так и биопротекторная активность являются важнейшими функциональными параметрами гумусовых веществ. Благодаря этим свойствам гумусовые вещества играют важную роль как в обеспечении высокой биологической продуктивности системы почва - растение, так и в повышении устойчивости этой системы к неблагоприятным воздействиям (загрязнению и т.п.).

Различные аспекты физиологической активности (ФА) гумусовых веществ исследовались многими авторами (Нефедов, 1887; Тюрин, 1937; Ваксман, 1937; Христева, 1947, 1951, 1953, 1967, 1973 и др.; Климова, Комиссаров, 1971; Горовая, 1985, 1988 и др.; Наумова и др., 1995; Kozjubinskaya е. а., 1996 и др.), которые показали, что гумусовые, кислоты влияют на общий ход обмена веществ в растениях и, в особенности, на процессы дыхания и роста.

Что же касается природы ФА гумусовых кислот и ее связи со структурными параметров их молекул, то по этому вопросу в литературе встречаются достаточно противоречивые данные (Flaig, 1958,1970; Пивоваров 1962; Malcolm, Vaughan, 1978; Mishra, Srivastava, 1988; Albusio, e. a., 1989; Piccolo, e.a. 1992; Muscolo, Nardi, 1996; и др.).

Прояснить взаимосвязь ФА как функционального параметра со структурными особенностями гумусовых веществ мы попытачись на основе гипотезы (Комисса-

ров, 1971; Алиев, 1983) о том, что СР (ГГМЦ), как основные реакционные центры молекул ГВ, могут быть непосредственно связаны с проявлением их ФА.

В наших опытах ФА ГК определяли с помощью метода проростков (Сергеева, 1963) и модифицированного нами для ГК метода (Бояркин, 1948) определения ауксиноподобной ФА на колеоптилях кукурузы.

При сравнении физиологического действия ГК и стимуляторов роста из торфа на всхожесть семян и длину корней салата установлено, что стимуляторы "БСТ" и "Тюльпан" обладают более высокой ФА, чем ГК почв (рис. 15.). Но эти стимуляторы весьма неоднозначно влияют на всхожесть семян и длину корней, и их положительная ФА наблюдается в узком диапазоне концентраций, превышение которого дает резко выраженный отрицательный эффект. Стимулирующее действие ГК на прорастание и длину корней салата наблюдается (рис. 15.) в значительно более широком диапазоне концентраций, хотя и на более низком уровне.

130 - *

120 - / 110

100 Н Г"

—и— ГК Чернозема - - ГК Т-сер. лесной •а ГК Дерн.-подэ.

90 -80 -7060 -50 -4030 -

—т-

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

Концентрация гумусовых препаратов, %

Рисунок 15. Зависимость произведения всхожести (п) и длины (1) корней (% от контроля) салата сорта "Каменная головка" от концентрации гумусовых препаратов.

Таблица б.

Концентрация СР и ФА различных фракций ГК целинных, пахотных и погребенных почв.

Образец КСР, 10° спин/г ФА,усл.ед

Чернозем

Ацел ГК 1+2 355,13 0,80

Апах ГК 1 15,09 0,18

Атах ГК 1+2 114,19 0,42

АпогрГК1 30,18 0,30

Апогр ГК 1+2 79,67 0,60

Темно-серая лесная

Ацел ГК 1+2 212,50 0,63

Апах ГК 1+2 232,15 0,61

Апогр ГК 1+2 19,94 0,39

Серая лесная

Ацел ГК 1+2 107,78 0,56

Апах ГК 1+2 93,86 0,35

Апогр ГК 1+2 52,18 0,28

На основании результатов полученных на колеопгилях кукурузы установлено, что ФА ГК обусловлена не столько их молекулярной структурой (по данным 13С-ЯМР), сколько уровнем биохимической активности. Наиболее тесно связанной с ней физико-химической характеристикой ГК, является содержание СР.

На концентрацию СР и ФА ГК значительное влияние оказывают биогидротер-мические условия гумусообразования. Распашка и погребение гумусового горизонта приводит к смещению равновесия в сторону преобладания деструктивных процессов и минерализации активных фракций почвенного гумуса. Как уже было показано выше, эти процессы обусловливают с одной стороны снижение КСР ГК, а с другой, как показано в главе 5, - относительное накопление биохимически инертных конденсированных ароматических структур, что и находит свое отражение в снижении ФА ГК.

Следует отметить, что указанная закономерность наиболее ярко проявляется на препаратах ГК чернозема и серых лесных почв, как это видно в табл. 6 и на рис. 16. Дополнительное исследование препаратов 1-й фракции ГК пахотного и погребенного чернозема показало их низкую (по сравнению с суммой 1-й и 2-й фракций ГК) физиологическую активность, что может бьггь отчасти обусловлено более низкой концентрацией СР и более высоким содержанием алифатических фрагментов в их молекулах, что подтверждается данными 13С ЯМР.

КСР (СПИН/Г X 1015)

Рисунок 16. Зависимость ФА (прирост колеоптилей кукурузы) от концентрации СР в гуминовых кислотах лесостепных почв.

С использованием корреляционного анализа, установлена относительно высокая величина коэффициента корреляции по взаимосвязи ФА ГК чернозема и серых лесных почв с их парамагнитной активностью: +0,86 при Р=0,03. Применение регрессионного анализа позволило описать полученную закономерность уравнением параболической регрессии второго порядка, которое при Р=0,003 имеет вид:

ФА= 0,247 + 0,00227КСР +2,15х10"6х(КСР)2

В дерново-подзолистых почвах картина изменения ФА и концентрации СР при распашке и погребении несколько более сложная. Анализ полученных результатов (см рис. 17.) показывает, прежде всего, что у ПС чернозема и серой лесной почвы имеется достаточно четко выраженный максимум на концетрационных зависимостях в области 0,001%. У ПС дерново-подзолистой гточвы в этой области наблюдается плато как видно на рис. 17, а максимум проявления ФА обнаружен в области более высоких концентраций ПС. Видимо из-за низкого уровня концентрации СР и фрагментарного строения ядерной части ПС этих почв наблюдается' накопление пороговой концентрации СР, при которой происходит всплеск ФА, уровень которой превышает ФА ПС серой лесной почвы. Все это может свидетельствовать о

том, что в случае дерново-подзолистой почвы мы, по-видимому, имеем дело с более сложным механизмом проявления ФА, чем в ГК лесостепных почв.

10'

8-

2-

0 -

■— Чернозем - Серая лесн. Дерн.-подз.

1Е-5

1Е-4 1Е-3

Концентрация ГК, %

0,01

4-

Рисунок 17. Зависимость физиологической активности (величина прироста колеоптилей в %.) от концентрации ГК (%) целинных вариантов изученных почв.

Дополнительную информацию о ФА ГК дерново-подзолистых почв дает сравнение представленных на рисунке 18, концентрационных зависимостей ФА ГК целинной, пахотной и окультуренной разностей. У ГК выпаханной почвы ФА достоверно ниже, чем ГК целинной почвы, а в ГК окультуренной почвы обладающей наиболее высоким уровнем ФА доминирует "низкоконцентрациошгый" механизм, отмеченный выше у ГК чернозема и темно-серой лесной почвы.

Результаты сравнительного изучения ФА ГК дерново-подзолистых почв, в том числе выделенных из инкубированных в оптимальных гидротермических условиях образцов целинного горизонта, представленные на рис. 18 и 19, показывают, что, прежде всего, при распашке и погребении происходит резкое снижение ФА ГК, тогда как окультуривание дерново-подзолистых почв приводит к заметному повышению ФА их ПС, даже по сравнению с целинной почвой. Погребенную же разность этой почвы (ФА ее ГК 2-3 раза ниже ГК всех других вариантов) здесь можно рассматривать как близкий к равновесному состоянию этап трансформации гумусовых веществ дерново-подзолистой почвы в условиях резкого дефицита органических остатков и преобладания минерализациишых процессов.

12 11 10 9

0,000

0,004

0,005

Концентрация ГК, (%)

Рисунок 18. Зависимость физиологической активности (прирост колеоптилей, %) от концентрации ГК целинной, пахотной и окультуренной дерново-подзолистой почвы.

11 -ю -

7 -6

5 -4 -3 -2 -1 -0 -0,0005

—■— Исх

• 6 м ее.

• - А- 12 мее.

---▼--- 24 мес.

-О- Погреб.

0,0010

0,0015 0,0020

Концентрация ГК, %

0,0025

Рисунок 19. Зависимость физиологической активности от концентрации ГК дерново-подзолистой почвы: целинной разных сроков инкубации и погребенной.

В условиях современных антропогенных экосистем одним из важнейших функциональных параметров органического вещества почв является биопротекторная активность, заключающаяся в защите и повышении устойчивости растений при действии неблагоприятных внешних факторов. Однако немногочисленные работы (СЬапш1ас1е, 1968; Горовая, 1983, 1988; КогрЬтэкауа, е. а., 1996; Регттоуа, е.а., 1996; и др.) не до конца проясняют вопрос взаимосвязи этого функционального параметра ГВ с их структурными особенностями.

Нами проводились исследования по биопротекторному влиянию гумшювых кислот на растительные организмы в условиях загрязнения тяжелыми металлами (ТМ), в частности медью и никелем. На рисунке 20. представлены данные одного из опытов по изучению влияния ГК на рост колеоптилей кукурузы, которые показывают, что в присутствии даже небольших количеств ТМ происходит сильное угнетение ростовых процессов у колеоптилей кукурузы. Добавление ГК (0,0032%) из гумусового горизонта целинной дерново-подзолистой почвы даже при максимальной концентрации ТМ полностью ингибирует их токсическое действие, а при более низких концентрациях даег стимулирующий эффект - все варианты с добавлением ГК имеют достоверный положительный прирост.

Рисунок 20. Биопротекторная активность препарата ГК целинной дерново-подзолистой почвы на колеоптилях кукурузы в условиях токсического влияния катионов меди и никеля.

В числе механизмов обусловливающих биопротекторную активность ГК следует отметить, прежде всего, прямую инактивацию катионов путем их обменного поглощения из раствора с участием функциональных групп макромолекул ГК. Однако масштабы этой инактивации невелики: суммарная ЕКО ГК оказывается в шесть раз ниже концентрации (0,0032%) катионов ТМ в первом варианте опыта. Оставшиеся в растворе этого варианта 0,0027% ТМ в отсутствии ГК вызвали бы отрицательный прирост иа уровне -6%, а в присутствии ГК мы наблюдаем достоверный положительный прирост колеоптилей. Это показывает, что в данном случае проявляется еще один и гораздо более мощный биопротекторный механизм, связанный с прямой физиологической стимуляцией макромолекулами ГК адаптивных реакций устойчивости и роста растительных тканей и клеток, позволяющих им преодолевать токсическое воздействие ТМ.

мм

Конц Си2+ 8

А

Б 5 4 3 2 1

I II III IV и VI VII VIII IX

СЛ О

о

0.000В 0.0012 0.0625 0.005 ГК,%

Рисунок 21. Биопротекторная активность ГК дерново-подзолистой почвы на культуре хлореллы в присутствии катионов меди

Исследование биопротекторной активности ГК на уровне растительных организмов проводили на штамме хлореллы САШ-75. На изображении планшета (рис. 21) интенсивность черного цвета отражает уровень зеленой окраски ячеек, пропорциональную числу выживших в присутствии токсиканта особей хлореллы. Концентрация катионов меди менялась от З,25х10"3% в ячейках №1 нечетных рядов до 0,005% в ячейках №8 тех же рядов. В четных рядах концентрация катиона на

порядок выше. На рис. 21 видно, что, начиная с концентрации ПС 0,0025%, число выживших особей хлореллы увеличивается, а при концентрации ПС 0,005% хлорелла способна выдерживать в 4-6 раз большие количества катионов меди.

Соотношение отмеченных выше двух механизмов биопротекторной активности ГК (инактивации катионов меди путем прямого их поглощения макромолекулами ПС и прямой стимуляции ПС адаптивных механизмов растительного организма) столь же контрастное, как и в опыте с колеоггтилями. Так, например, ЕКО присутствующей в растворе ПС на уровне соотношения концентраций в ячейке №5 ряда IX почти в 5 раз ниже находящихся там катионов меди, а число выживших в ней особей хлореллы намного больше, чем в близких ей по концентрации меди ячейках без добавления ПС.

Таблица 7.

Уровень биопротекторной активности различных ПС по тестированию на культуре хлореллы.

Вариант № ячейки Летальная конц. меди, %

БезГК 2 0,00016

ГК Дерново-подзолистой цел. 4 0,00062

ГК Дерново-подзолистой пах. 3 0,00031

ПС Дерново-подзолистой окульт. 4 0,00062

ГК Темно-серой лесной цел. 4 0,00062

ГК Чернозема 5 0,00125

Этот метод был использован нами также для сравнения биопротекторной активности ПС исследованных почв. Данные по летальным концентрациям меди, представленные в табл. 7 показывают, что ПС дерново-подзолистой почвы (целинной и окультуренной) и целинной темно-серой лесной почвы обладают биопротекторной активностью примерно на одном уровне. ПС пахотной дерново-подзолистой почвы имеегг относительно более низкий, а ПС чернозема - более высокий уровень биопротекторной активности. Эти результаты хорошо согласуются с показанным выше уровнем физиологической и парамагнитной активности этих ПС.

Заключение.

Проведенные исследования некоторых физико-химических структурных и функциональных параметров органического вещества почв как в нативном состоянии на уровне почвенного горизонта, так и на молекулярном уровне препаратов гумусовых веществ позволяют разработать подход к оценке ряда важных экологических функций, что является одним из ключевых вопросов оценки роли

органического вещества почв в экосистемах и биосфере в целом. Параметризация этих функций дает возможность количественной оценки комплексного показателя -экологического потенциала.

Сложность разработки такого интегрального показателя состоит в том, что он должен учитывать определишую диалектическую противоречивость некоторых экологических функций как на уровне гумусовых веществ почвы, так и на уровне органического вещества почвы в целом. Все это позволяет нам предложить только несколько важных параметров в сложную систему оценки экологических функций гумусовых веществ на основе установленных взаимосвязей между их структурными характеристиками и важнейшими функциональными свойствами.

Одним из первых таких параметров является парамагнитная активность или концентрация СР (ПМЦ) - важнейшая физико-химическая и структурная характеристика гумусовых веществ. СР определяют общий уровень биохимической активности органических макромолекул и непосредственно связаны с целым рядом важных функциональных параметров последних. Так, в частности, при изучении методом ЭПР процессов взаимодействия гуминовых кислот с катионами непосредственно в растворе нами было показано прямое участие СР во взаимодействии ГК с такими катионами, как медь, свинец, цинк и другие.

В наших исследованиях при изучении природы физиологической активности гумусовых веществ, которая является одним из важных экологических факторов, установлено, что она связана не столько с закономерностями строения углеродного скелета макромолекул гумусовых веществ, сколько с общим уровнем их биохимической активности, показателем которой является содержание СР или ПМЦ в гумусовых веществах.

Исследования биопротекторной активности - другого важного экологического параметра гумусовых веществ - в отношении, как растительных тканей, так и целых растительных организмов в условиях загрязнения среды тяжелыми металлами, в частности медью и никелем, показали высокий уровень биопротекторной активности препаратов гуминовых кислот, который также связан с величиной физиологической и парамагнитной активности.

Другим важным параметром гумусовых веществ является биотермодинамическая устойчивость, которая характеризует, прежде всего, зрелость и глубину гумификации макромолекул гумусовых веществ, устойчивость их к деструкции и минерализации под воздействием биотических и абиотических факторов. Чем биотермодинамическая устойчивость ниже, тем выше активность и реакционно-способность гумусовых веществ. С этим параметром связана также оценка возможности мобилизации азота и микроэлементов гумусовых веществ для питания и роста растений. Выше в главе 4 было показано, что надежным обратным

показателем уровня биотермодинамической устойчивости гумусовых веществ является парамагнитная активность.

Несомненно также, что биотермодинамическая устойчивость и глубина гумификации тесно связаны и со структурой углеродного скелета макромолекул гумусовых веществ, оцениваемой по данным спектроскопии 13С-ЯМР с твердофазной CPMAS-техникой (см. главу 5). При анализе обширной информации, получаемой при анализе спектров 13С-ЯМР, в качестве формального показателя наиболее удобно использовать соотношение углерода ароматических структур к углероду алифатических цепей (AR/AL) (Preston, 1992) или показатель ароматичности: соотношение ароматических структур к сумме ароматических и алифатических (AR/(AR+AL)).

Таким образом, установив взаимосвязи важнейших функциональных и экологически значимых параметров гумусовых веществ с их структурными характеристиками, можно предложить использовать при количественной оценке экологического потенциала гумусовых веществ во-первых парамагнитную активность (концентрация CP или ПМЦ), как показатель общего уровня биохимической активности, непосредственно связанный с такими важнейшими функциональными свойствами гумусовых веществ, как взаимодействие с катионами, физиологическая и биопротекторная активность. Во-вторых, большое значение для экологических функций гумусовых веществ имеет также структура углеродного скелета их молекул, которую в данном является случае можно учитывать с помощью показателя ароматичности, определяемого на основе данных 13С-ЯМР.

При переходе с молекулярного уровня гуминовых кислот на уровень почвенного горизонта (органического вещества почв в целом) в параметрической оценке его экологического потенциала должны быть учтены не только количественные, но и качественные параметры органического вещества. Причем следует особо отметить, что в этом случае целесообразно использовать методы, позволяющие исследовать органическое вещество в целом как единую гетерополидисперсную систему непосредственно в почвенном образце.

Безусловно, первым показателем в экологический потенциал должна входить величина валового содержания органического углерода, как важная количественная характеристика органического вещества почвы. Этот показатель лучше определять наиболее надежными методами, к числу которых можно отнести определение по С02, либо широко используемый по настоящее время метод Тюрина, который имеет, однако, ряд известных методических недостатков, обсуждавшихся выше (см. главу 1).

Вторым параметром в показатель экологического потенциала целесообразно вкшочизъ содержание активных фракций органического вещества почв. С помощью этого важного показателя непосредствешго оценивается степень активности и качественный состав органического вещества. Метод ЭПР позволяет определять эту важную характеристику непосредствешго в почвенном образце, что позволяет оценивать органическое вещество почвы, как цельную гетерополидисперсную систему без каких-либо условных экстрактивных процедур. Разработанная нами методика определения методом ЭПР содержания активных и пассивных фракций в органическом веществе почвы описана выше в главе 4.

Таким образом, включение в систему экологических оценок предлагаемых нами физико-химических параметров повышает уровень интеграции важнейшее структурных и функциональных параметров как гумусовых веществ, так и органического вещества почв в целом и в дальнейшем может послужить основой для развития концепции экологического потенциала органического вещества почв с разработкой методики его количественной оценки. Это в свою очередь может иметь большое значение как для фундаментальной оценки роли гумусовых веществ и органического вещества в целом в функциошфовании и устойчивости почв и экосистем, так и для экологического прогнозирования и разработки нормирования предельно допустимых уровней техногенной нагрузки в конкретных экосистемах

ВЫВОДЫ

1. С использованием резонансных спектроскопических методов электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) на ядрах "С с твердофазной СРМАБ-техникой разработаны новые методологические подхода к изучению физико-химических структурно-функциональных параметров гумусовых веществ и органического вещества почв в целом,

2. В спектрах ЭПР образцов пахотных и погребенных горизонтов исследованных почв, а также в гумусовом горизонте целинной дерново-подзолистой почвы, наряду с наблюдавшимся ранее сигналом с §-фактором 2,003 от СР (ПМЦ) гумусовых кислот, впервые был обнаружен еще о,тин сигнал с g-фaктopoм 2,002. Он принадлежит СР (ПМЦ) локализованным на инертных органических структурах, прочно связанных с минеральной частью. На основе проведенных исследований предложен принципиально новый способ оценки качественного состава органического вещества почв путем определения соотношения фракций активного и пассивного органического вещества непосредствешго в почвенном образце по спектру ЭПР.

3. Концентрация свободных радикалов (СР) или парамагнитных це1ггров (ПМЦ) в гуминовых кислотах, определяемая методом ЭПР, является величиной

обратной их биотермодинамической устойчивости и глубине гумификации. Установлено, что при распашке и погребении почв парамагнитная активность снижается, а биотермодинамическая устойчивость гумусовых веществ увеличивается.

4. Эксперименты по исследованию в растворе методом ЭПР комплексообра-зования гуминовых кислот с различными катионами показали, что СР непосредственно участвуют в процессах взаимодействия гумусовых веществ с катионами металлов, в том числе таких как медь, свинец, цинк и другие.

5. При исследовании формы линии сигнала ЭПР от СР твердых препаратов комплексов гуминовых кислот с катионами железа была показана гетерогенность СР гуминовых кислот. Наличие двух типов СР подтверждено в опытах по изучению методом ЭПР комппексообразования различных гуминовых кислот в растворе. Обнаружена зона насыщения СР периферических алифатических структур, по положению которой можно оценить количественное соотношение двух типов СР в гуминовых кислотах различных почв. Установлено, что у гуминовых кислот чернозема доля периферических СР ниже, чем в гуминовых кислотах темно-серой лесной почвы.

6. По данным 13С-ЯМР в углеродном скелете фульвокислот преобладают структуры типа углеводов, аминокислот, полисахаридов, а также других фрагментов алифатической природы (в основном непредельных). Гуминовые кислоты обладают более развитой и конденсированной ароматической частью.

7. При Фурье-трансформации спектров 13С-ЯМР гуминовых кислот чернозема и темно-серой лесной почвы в области сигнала ароматического углерода были дифференцированы и количественно определены два сигнала: широкий сигнал высококонденсированных полисопряженных структур и более узкий сигнал менее конденсированных, "рассеянных" ароматических ядер.

8. По данным спектроскопии 13С-ЯМР установлено, что в результате антропогенного воздействия в пахотных и погребенных почвах происходит существенная трансформация углеродного скелета макромолекул гуминовых кислот, выражающаяся в относительном увеличении общего содержания ароматических структур и в особенности их высококонденсированных разновидностей. Погребение почв сильнее влияет на молекулярную структуру гуминовых кислот, чем распашка и сельскохозяйственное использование почв.

9. Показано наличие у гуминовых кислот изученных почв не только физиологической, но и биопротекторной активности как по отношению к растительным тканям, так и по отношению к растительным организмам в целом. Природа физиологической и биопротекторной активности наиболее тесно связана с содержанием свободных радикалов, однако, механизм ее проявления в гуминовых

кислотах дерново-подзолистых почв несколько иной, чем у гуминовых кислот черноземов и серых лесных почв. При распашке и погребении почв физиологическая и биопротекторная активность гуминовых кислот слабеет.

10. Установлено, что проявление биопротекторной активности гуминовых кислот в условиях загрязнения среды тяжелыми металлами лишь частично связано с прямой инактивацией этих ксенобиотиков. Наиболее сильное влияние оказывает прямая физиологическая стимуляция адаптационных механизмов как на уровне растительных тканей, так и на уровне растительных организмов.

11. В числе показателей системы комплексной параметрической оценки экологического потенциала гуминовых кислот и органического вещества почв в целом целесообразно использовать ряд тесно связанных с их важными экологическими функциями физико-химических параметров, определяемых методами ЭПР и 13С-ЯМР (концентрация СР и ароматичность гуминовых кислот, а также концентрация активных фракций органического вещества почв).

Основные работы, опубликованные по материалам диссертации.

1. Чуков С.Н., Никонова С.Н. Применение спектроскопии ЭПР к изучению органического вещества гумусово-железисто-шшювиальных подзолистых почв // Вестник ЛГУ. 1980. Сер. биол. Вып. 2. С. 115.

2.Чуков С.Н. К вопросу о парамагнитной активности органического вещества почв И Тез.докл. науч. конф. "Докучаевское почвоведение 100 лет на службе сельского хозяйства" Л. 1983. С. 30-31.

3. Чуков С.Н., Никонова СЛ. Применение метода ЭПР к изучению модельных железо-гумусовых соединений И Моделирование почвообразовательных процессов гумидной зоны / Тр.Биол. НИИ ЛГУ №35. Л1984. С. 115-128.

4.Чуков С.Н., Гуров А.Ф. Парамагнитные свойства органо-минеральных соединений гумусово-иллювиального песчаного подзола // Моделирование почвообразовательных процессов гумидной зоны / Тр.Биол. НИИ ЛГУ №35. Л.1984. С. 138-149.

5.Цыпленков В.П., Чуков С.Н. О парамагнитной активности некоторых почв // Вестник ЛГУ. 1984. Сер. биол. Вып. 3. С. 89-94.

6.Цыпленков В.П., Чуков С.Н. Использование метода ЭПР при изучении трансформации органического вещества в окультуренных почвах // Совр. методы физ,-хим. иссл. ихим.-аналиг. контроля в с.-х. Тюмень. 1984. С. 122-123.

1.Цыпленков В.П., Чуков С.Н. Способ определения качественного состава органического вещества почв // Авторское свидетельство. № 1193549 приоритет от 18.05.84.

8.Цыпленков В.Л., Чуков С.Н. Парамагнитная активность органического вещества некоторых почв // Почвоведение. 1984. № 11. С. 123-129.

9.Цыпленков В.П., Чуков С.Н. Использование метода ЭПР в изучении органического вещества почвы // Гумус и почвообразование в Н-ч. зоне РСФСР / Сборник научных трудов ЛГУ. 1985. С. 32-43.

10. Цыпленков В.П., Чуков С.Н. Исследование степени гумификации органического вещества в почвах // Вестник ЛГУ. 1985. Сер. биол. вып 3. С. 90-97.

11. Цыпленков В.П., Чуков С.Н. и др. Физико-химические методы изучения и контроля органического вещества почв // Бюл. Почв, ин-та им. В.В.Докучаева. Вып. XI. М. 1986. С. 8-11.

12. Чуков С.Н., Цыпленков В.П., Пестряков В.К Способ определения качественного состава органического вещества почв // Авторское свидетельство № 1392472. приоритет от 02.10.86.

13. Пестряков В.К, Цыпленков В.П., Чуков С.Н. и др. О трансформации органических веществ при компостировании в дерново-подзолистых почвах // Почвоведение. 1987. №4. С. 54-63.

14. Пестряков В.К, Цыпленков В.П., Чуков С.Н. и др. О качественном составе органического вещества при компостировании растительных остатков с дерново-подзолистой почвой разной степени окультуренности // Доклады ВАСХНИЛ. 1987. №6. С. 12-15

15. Чуков С.Н., Редченко Е.Б., Терешенкова И.А. Использование метода ЭПР для изучения изменения органического вещества почв при их сельскохозяйственном использовании // Вестник ЛГУ. рукопись деп. в ВИНИТИ 14.07.88. №5664-В88.

16. Пестряков В.К, Чуков С.Н., Ковш H.B. и др. О трансформации органических веществ в модельном лабораторном опыте II Вестник ЛГУ. 1988. Сер. биол. Вып. 4. С. 82-88.

17. Пестряков В.К, Цыпленков В.П., Чуков С.Н. и др. Комплексное изучение динамики органического вещества почв // Вестник ЛГУ. 1989. Сер. биол. Вып. 3. С. 89-95.

18. Чуков С.Н., Федорова H.H. Исследование взаимодействия гумусовых кислот с моноионными формами монтмориллонита методом ЭПР // Вестник ЛГУ. 1989. Сер. биол. Вып. 4. С. 77-81.

19. Чуков С.Н. "Способ оценки состояния почвы" // Патент РФ №1791776, от 06.12.90.

20. Пестряков В.К, Чуков С.Н., Ковш Н.В. и др. Моделирование трансформации органических веществ в лабораторном эксперименте // Почвоведение. 1990. № 3. С. 30-40.

21. Чуков С.Н., Надпорожская М.А. О качественном составе органического вещества фракции туминов//Вестник ЛГУ. 1991. Сер. биол. Вып. 1. С. 28-34.

22. Chukov S.N. NMR-C13 characterisation of humic acids of various soils // "Humus et Planta". Prague. 1991. p 25-27.

23. Чуков С.Н. Методические указания по курсу "Физико-химические методы исследования почв" Часть 1 Спектроскопические методы / СПб. Изд-во СПбГУ. 1992.40 с.

24. Чертов О.Г., Владимирова С.К, Чуков С.Н. и др. Об оценке экологического потенциала почв // Вестник С-Петербург. ун-та. 1992. Сер. биол. Вып. 4. С. 9197.

25. Чуков С.Н. Парамагнитная активность и функциональные свойства органического вещества некоторых почв // Вестник С-Петербург. ун-та. 1992. Сер. биол. вып 2. С. 106-108.

26. Чертов О.Г., Чуков С.Н., Надпорожская М.А. и др. О методике изучеиия функционально-динамических характеристик трансформации органического вещества почв // Веепшк С-Петербург. ун-та. 1994. Сер. биол. Вып. 3. С. 106-110.

27. Чертов О.Г., Чуков С.Н. К вопросу интегральной оценки антропогенного нарушения почв // Почвоведение. 1994. № 5. С. 102-104.

28. Чуков С.Н., TaiaiuKima В.Д., Надпорожская М.А. Физиологическая активность ростовых стимуляторов и гуминовых кислот почв // Почвоведешю. 1995. №2. С. 55-61.

29. Чуков СЛ., Талашкгта В.Д. Физиологическая и биопротекторная активность гуминовых кислот почв // Регуляторы роста и развития растений. М. 1995 С. 193-194

30. Пестряков В.К, Чуков С.Н., Ковш Н.В. и др. О биологической продуктивности дерново-подзолистых почв разной степени окультурешюсти в вегетациошгом опыте // Вестник С-Петербург. ун-та. 1995. Сер.биол. Вып. 4. С. 115-119.

31. Чертов О.Г., Чуков С.Н., Надпорожская М.А. и др. Об оценке экологического состояния почв в районах крупных промышленных агломераций (на примере Санкт-Петербурга) II Тр. Биол. НИИ СПбГУ. Вып. 45. 1996. С. 19-34.

32. Чуков СЛ., Талашкипа В.Д., Надпорожская М.А. О природе физиологической активности гуминовых кислот некоторых почв // Тр. Биол. НИИ СПбГУ. Вып. 45. 1996. С. 170-182.

33. Чуков С.Н. Структурно-функциональные параметры и экологический потенциал органического вещества почвы в условиях современных наземных экосистем // Вести. С.-Петербург, ун-та. 1996. Сер. биол. Вып 1. С. 48 - 55.

34. Chukov S.N., Talashkina V.D. Interrelation of physiological activity of humic acids and their structurally-functional parameters // Abstracts and papers of 8th Meeting of the Int. Humic Substances Soc. 9-14 September 1996 Wroclav. Poland. p274.

35. Чуков С.Н. Применение метода ядерного магнитного резонанса к изучению органического вещества почв // Вести. С.-Петербург, ун-та. 1997. Сер. биол. Вып. 4. С. 50-59.

36. Aparin B.F., Matinian N.N., Chukov S.N. Natural and anthropogenic factors of soil evolution in the North-Western part of the Russian plain // Proc. of Int. Conf. "Problems of anthropogenic soil formation". M. 1997. P. 22-25.

37. Чуков С.Н. Изучение гумусовых кислот антропогенно нарушенных почв методом 13С-ЯМР// Почвоведение. 1998. №9. С. 1085 - 1093.

38. Chukov S.N. The ecological potential of organic matter in soils of anthropogenic ecosystems // "Summaries of 16 World Congress of Soil Science, 20-26.08.1998". Le Corum. 1998. Vol. 1 Symp. 7. P. 140.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Чуков, Серафим Николаевич, Санкт-Петербург

Министерство общего и профессионального образования Российской федерации Санкт-Петербургский государственный университет

С? "у . "........V -- ' •- .'■■• •

Присудил у-:.-. .. ст-зпен '"ч

г;___________ЙШогаУел^

I, мечальнигч ^-ттравленчя Рл *г

; ЧУКОВ Серафим Николаевич / г ,

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА ПОЧВ (по данным ЭПР и 13С-ЯМР)

03.00.27 - почвоведение

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург -1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 4

Глава 1 Принципы и методологические подходы к изучению органического вещества целинных и антропогенно нарушенных почв. 12

1.1. Трансформация органического вещества и плодородие пахотных почв. 17

1.2. Основные представления о трансформации качественного состава органического вещества погребенных гумусовых горизонтов палеопочв 32

1.3. Методологические подходы к изучению качественного состава органического вещества целинных и антропогенно нарушенных почв. 37

Глава 2. Характеристика объектов исследования. 44

2.1. Целинные и пахотные почвы. 46

2.2. Погребенные почвы. 52

Глава 3 Методические аспекты применения электронного парамагнитного резонанса к изучению органического вещества почвы. 3.1. Получение спектров электронного парамагнитного резонанса и их математическая отработка. 58

3.2 Влияние различных методов очистки препаратов гумино-вых кислот на их парамагнитную активность. 70

Глава 4. Изучение органического вещества почв методом электронного парамагнитного резонанса. 4.1 Свободные радикалы и их роль в органическом веществе почв. 80

4.2. Исследование процесса взаимодействия гуминовых кислот с катионами. 98

4.3. Изучение взаимосвязи концентрации СР и степени гумификации органического вещества в почвах. 125

4.4. Изучение парамагнитной активности органического вещества непосредственно в почвенном образце 141

Глава 5 Применение метода ядерного магнитного резонанса к изучению органического вещества почв 177

Глава 6 Физиологическая и биопротекторная активность гуминовых кислот 195

Заключение 222

Выводы 227

Список литературы 231

Приложения 284

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Плодородие и устойчивость почв к антропогенному воздействию тесно связаны не только с количественным содержанием органического вещества, но и с его качественными характеристиками. Это диктует необходимость пристального изучения этих параметров не только в целинных, но и в почвах подверженных антропогенному воздействию, поскольку в них роль органического вещества особенно велика. В первую очередь это касается наиболее распространенных видов воздействия человека на почвы -распашки земель и связанного с ней эрозионного погребения материала из гумусовых горизонтов.

Несмотря на единство взглядов в вопросе общей направленности трансформации органического вещества почвы при ее распашке и погребении, в литературе встречаются большие расхождения в трактовке молекулярных механизмов этого процесса. Отчасти это вызвано несовершенством методической базы исследований. Многие широко используемые в настоящее время методы, начиная от экстракции препаратов гумусовых веществ и кончая методами исследования их состава и свойств, носят во многом условный или косвенный характер, что иногда приводит к несоответствиям как в получаемых данных, так и в их интерпретации. По этой же причине в настоящее время практически отсутствует надежный, универсальный и достаточно информативный количественный показатель качественного состава органического вещества целинных и антропогенно преобразованных почв.

Это в свою очередь затрудняет адекватный учет роли органического вещества в проявлении важнейших функциональных параметров самой почвы, таких, как плодородие, устойчивость почвенной среды к неблагоприятным воздействиям и т.п. В результате качественный состав органического

вещества почвы практически не учитывается в современных моделях функционирования почв и экосистем.

Таким образом в биохимии почв в последние годы достаточно остро стоит проблема совершенствования методологических подходов к изучению органического вещества и в особенности гумусовых веществ. Традиционные методы исследования (такие как, например, фракционно-групповой анализ гумуса и др.) во многом исчерпали свои возможности, а целый ряд широко используемых в биохимии методов структурных исследований, оказались либо трудно применимыми, либо косвенными и трудно интерпретируемыми. Причина этого отчасти заключается в сложном и нерегулярном строении, а также в гетерополидисперсном характере почвенного гумуса. В результате этого, при изучении антропогенного влияния на процессы трансформации органического вещества исследователи часто сталкиваются с трудно сопоставимыми, а часто и противоречивыми данными.

Так, в частности, следует признать, что общепринятая методическая процедура щелочной экстракции и препаративного выделения гуминовых кислот носит в известной степени условный характер и несколько влияет на периферическую часть их макромолекул. Однако сравнительные исследования эффективности и степени воздействия на гумусовые вещества альтернативных щелочи экстрагентов различной природы показали, что щелочному гидролизу пока нет реальной альтернативы. Анализ современной отечественной и зарубежной научной литературы показывает, что этот метод по-прежнему широко используется исследователями во всем мире для препаративного выделения гумусовых кислот.

Одной из наиболее сложных проблем в изучении органического вещества почв и гумусовых веществ является изучение молекулярной структуры. До конца 80-х годов для ее оценки использовались в основном достаточно косвенные и условные методы. Некоторый прогресс был получен с использованием ряда прямых деструктивных методов (пиролизная масс-

спектрометрия, ступенчатая деструкция гумусовых веществ с оценкой выхода бензолполикарбоновых кислот и т.п.). Однако трудности методического характера и неоднозначность интерпретации полученных данных пока сдерживают их широкое применение.

Таким образом, для дальнейшего развитии биохимии органического вещества почв необходим выход на новый уровень методического обеспечения, связанный, во-первых, с использованием современных прямых методов детального изучения молекулярной структуры и функциональных свойств гумусовых веществ, а во-вторых, с изучением органического вещества в нативном состоянии непосредственно в почвенном образце.

Повышение надежности и объективности информации о важнейших структурных и функциональных параметрах органического вещества почв настоятельно необходимо для адекватной оценки его наиболее экологически значимых параметров и их взаимосвязи с важнейшими структурными особенностями гумусовых веществ. Это позволит обосновать экологическую значимость ряда структурных параметров органического вещества почв и необходимость их учета в системе оценок экологических функций и экологического потенциала как гумусовых веществ, так и органического вещества почв в целом.

Цель исследования.

Изучение состояния и трансформации структурных и функциональных физико-химических параметров органического вещества почв Русской равнины под влиянием антропогенного воздействия (на примере черноземов, серых лесных и дерново-подзолистых почв) на разных уровнях организации -от органического вещества в ненарушенном состоянии на уровне почвенного горизонта до молекулярного уровня в препаратах гумусовых веществ и параметрическая оценка их наиболее экологически значимых параметров.

у

Задачи исследований.

1. Разработать новые методологические подходы к изучению физико-химических параметров органического вещества почв с помощью современных радиофизических методов резонансной спектроскопии (ЭПР, 13С-ЯМР).

2. Изучить трансформацию углеродного скелета и других структурных параметров гумусовых веществ в условиях антропогенного воздействия.

3. Установить взаимосвязь свободных радикалов с важнейшими функциональными параметрами гумусовых веществ и состоянием и процессами трансформации органического вещества почв в целом.

4. Исследовать физиологическую и биопротекторную активность гу-миновых кислот и оценить их изменение при антропогенном воздействии на почвы.

5. Предложить показатели ряда экологических функций гуминовых кислот и органического вещества для системы комплексной параметрической оценки экологического потенциала органического вещества почв.

Научная новизна.

На основе теоретического обобщения разработана схема, отражающая основные методологические подходы к изучению органического вещества почв.

На основании использования современных радиофизических методов резонансной спектроскопии разработаны новые методологические подходы к изучению структурно-функциональных параметров органического вещества почв.

По результатам анализа литературных и собственных экспериментальных данных показано, что парамагнитная активность гумусовых кислот (концентрация свободных радикалов с g-фaктopoм 2,003) является величиной обратной их биотермодинамической устойчивости и глубине гумификации.

Впервые непосредственно в растворе изучено влияние различных катионов на парамагнитную активность гуминовых кислот и обнаружена гетерогенность их свободных радикалов (СР) с g-фaктopoм 2,003. Разработан метод количественной оценки двух типов СР принадлежащих периферической и ядерной части молекул гуминовых кислот (Авторское свидетельство № 1392472).

Предложен принципиально новый метод оценки качественного состава органического вещества почвы по спектру ЭПР, основанный на впервые обнаруженном факте присутствия в почве не одного, как было известно ранее, а двух различных типов СР, один из которых, с g-фaктopoм 2,003, хорошо известен и локализован в молекулах гумусовых кислот, а второй, с g-фактором 2,002, находится в структуре инертных, прочно связанных с минеральной частью фракций органического вещества. Разработанный метод позволяет изучать органическое вещество в его нативном состоянии непосредственно в почвенных образцах, не прибегая к предварительным экстрактивным процедурам (Авторское свидетельство № 1791776 и патент РФ №1193549).

13

Впервые при Фурье-трансформации спектров С-ЯМР гуминовых кислот чернозема и темно-серой лесной почвы в области сигнала ароматического углерода разделены и количественно определены два сигнала: широкий сигнал высококонденсированных полисопряженных структур и более узкий сигнал менее конденсированных, "рассеянных" ароматических ядер.

По результатам исследования физиологической активности гуминовых кислот различных почв как на уровне растительных тканей, так и на уровне целого растительного организма показано, что она наиболее тесно связана со свободными радикалами и установлены количественные параметры взаимосвязи этого важного функционального параметра гуминовых кислот с содержанием в них СР. Показано также, что механизм проявления

физиологической активности в гуминовых кислотах дерново-подзолистых почв несколько иной, чем в гуминовых кислотах черноземов и серых лесных почв.

Установлено, что проявление биопротекторной активности гуминовых кислот в условиях загрязнения среды тяжелыми металлами частично связано с их прямой инактивацией, однако наиболее сильное влияние оказывает прямая физиологическая стимуляция защитных реакций растений и повышение их устойчивости к токсическому воздействию.

Предложено использовать в числе показателей системы комплексной параметрической оценки экологического потенциала гуминовых кислот и органического вещества почв в целом ряд тесно связанных с их важными экологическими функциями физико-химических параметров, определяемых методами ЭПР и 13С-ЯМР (концентрация СР и ароматичность ГК, а также концентрация активных фракций органического вещества почв).

Практическая значимость и реализация результатов работы.

Полученные результаты доведены до широкого круга специалистов путем публикаций и докладов на конференциях, а также широко используются в учебном процессе на Почвенном отделении СПбГУ в бакалаврских и магистерских курсах лекций "Химия почв", "Биохимия органического вещества "Физико-химические методы исследования почв", "Структурно-функциональные параметры гумусовых веществ", "Экологические функции органического вещества почв", "Нормирование техногенной нагрузки на почвы" и др. На основе материалов диссертации была выпущена часть 1 Методических указаний по курсу "Физико-химические методы исследования почв. (Спектроскопические методы.)".

Предложен новый способ оценки качественного состава органического вещества почв, простота и надежность которого позволяют рекомендовать

его к внедрению как в практике научных наследовании, так и производственных условиях, при агрохимическом обследовании почв.

Использование в системе экологических оценок гумусовых веществ и органического вещества почв в целом предлагаемых физико-химических параметров может быть полезным при оценке состояния и трансформации органического вещества почв, как в естественных, так и в антропогенных экосистемах и применяться не только в фундаментальных исследованиях, но и при мониторинге антропогенно нарушенных почв, нормировании техногенных нагрузок и экологической экспертизе.

Апробация работы

Основные материалы работы доложены на Всероссийских и Всесоюзных научных конференциях «Нечерноземные почвы и пути их рационального использования» (Ленинград, 1979, 1980, 1982, 1983, 1985 гг.); «Докучаевское почвоведение 100 лет на службе сельского хозяйства» (Ленинград, 1983); «Современные методы физико-химических исследований и химико-аналитического контроля в сельском хозяйстве» (Тюмень, 1984); "Агропочвоведение и плодородие почв", (Ленинград, 1986); "Плодородие почвы в интенсивном земледелии" (Волгоград, 1988); Делегатские съезды общества почвоведов (Минск, 1977; Ташкент, 1985; С. Петербург, 1996); международных конференциях: "Humus et Planta", (Prague, 1991); Регуляторы роста и развития растений, (Москва, 1995); 7-th European Ecological Congress (Budapest, 1995) III М-нар. конф. "Освоение Севера и проблемы рекультивации" (С.-Петербург, 1996); "Резервы повышения плодородия почв и эффективности удобрений" (Горки, Белоруссия, 1996); 8th Meeting of the International Humic Substances Society (Wroclav, Poland, 1996); "Проблемы антропогенного почвообразования" (Москва, 1997); "Антропогенная деградация почвенного покрова и меры ее предупреждения",

(Москва, 1998); 9-th International Meeting of the International Humic Substances Society (Adelaide, Australia, 1998).

В диссертационной работе использованы результаты личных исследований автора и совместных работ с сотрудниками кафедры почвоведения и географии почв СПбГУ и Биологического НИИ СПбГУ проф. В.П.Цыпленковым, В.К.Пестряковым, И.А.Терешенковой, Н.Н.Федоровой, Н.В.Ковш, М.А.Надпорожской, А.И.Поповым, В.Д.Талашкиной и И.Н.Лапшиной, Т.А.Рычковой, которым автор выражает искреннюю благодарность. -

Автор благодарен за помощь в работе и ценные замечания научному консультанту работы, заведующему кафедрой почвоведения и географии почв Санкт-Петербургского государственного университета, профессору Б.Ф.Апарину, а также доценту О.Г.Растворовой, профессору О.Г.Чертову, и сотрудникам кафедры почвоведения и географии почв СПбГУ за неоценимую помощь в работе.

Автор благодарит также Российский фонд фундаментальных исследований (грант 96-04-49013), при поддержке которого была выполнена часть данной работы.

ГЛАВА 1. ПРИНЦИПЫ И МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА ЦЕЛИННЫХ И АНТРОПОГЕННО НАРУШЕННЫХ ПОЧВ

Почва, как центральное звено биологического круговорота, играет ключевую роль в функционировании и устойчивости любой наземной экосистемы и биосферы в целом (Добровольский, Никитин, 1990; Розанов, Розанов, 1990, Карпачевский, 1993; Почвенно-экологический мониторинг..., 1994; Апарин, 1996; и др.), выполняя (Розанов, 1988, Карпачевский, 1993) функцию селективной геомембраны. Наиболее важными для устойчивости экосистем параметрами почвы является ее плодородие, буферность по отношению к неблагоприятным воздействиям, а также способность к иммобилизации и инактивации поллютантов, поступающих в почвенный профиль из атмосферы, с удобрениями и из других источников. Известно, что в наибольшей степени эти параметры регулируются органическим веществом почв и в особенности гумусовыми веществами как наиболее динамичной и химически активной субстанцией почвы (Орлов, 1993; Карпачевский, 1993; и др.). Органическое вещество почвы, например, в значительной степени компенсирует отрицательный эффект антропогенного воздействия (Соколова и др., 1991), снижает содержание подвижных форм многих тяжелых металлов (Жигарев, Лутович, 1996 и др.), а также регулирует влияние кислых атмо