Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование соевого шрота для получения биологически активных веществ и оценка их функциональной активности

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Использование соевого шрота для получения биологически активных веществ и оценка их функциональной активности"

На правах рукописи

Хабибулина Наталья Викторовна

Использование соевого шрота для получения биологически активных веществ и оценка их функциональной активности

Специальность: 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

2 6 А П Р 2012

Москва-2012

005019453

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета имени Д.И. Менделеева

Научный руководитель: Доктор химических наук, доцент

Красноштанова Алла Альбертовна

Официальные оппоненты: Доктор технических наук, доцент

кафедры «Аналитическая химия» Московского государственного университета пищевых производств Милорадова Елена Васильевна

Ведущая организация:

Кандидат технических наук, доцент отдела биосинтетических и биокаталитических нанотехнологий ферментов, дрожжей, органических кислот и БАД Всероссийского научно-исследовательского института пищевой биотехнологии РАСХН Курбатова Елена Ивановна

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР)

Защита состоится «22» мая 2012 г. в " на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-тсхнологическом университете им. Д. И. Менделеева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская пл., д. 9, в аудитории 433 (конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан « апреля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Уу

ДМ 212.204.13 /¿/./¿¿Г¿¿¿¿¿у^

Шакир И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Одним из наиболее перспективных видов растительного сырья, характеризующегося высоким содержанием биологически активных веществ, является соя. Площади посевов сои в мире постоянно растут, в 2010 году они составили 70 млн. га, а объем продукции, произведенной из соевых бобов, превысил 200 млн. т [Толоконников В.В., 2010].

Технологии переработки соевых бобов основаны на извлечении из них различных компонентов: масел, белков, различных биологически активных соединений. Традиционно, соя представлена на рынке такими продуктами, как соевое масло, соевые молоко и молочные продукты, концентраты, изоляты и гидролизаты белка, при этом ассортимент продуктов на основе сои постоянно расширяется. В последние годы сою стали использовать не только в пищевой промышленности (при производстве мясных и кондитерских продуктов, в хлебопечении), но и в лечебно-профилактическом питании; при создании БАД; медицине и фармацевтике для производства препаратов, подавляющих активность протеаз, антиканцерогенных препаратов, при осуществлении гормонозаместительной терапии и др. [Храмцов А.Г., 2003]. Расширение спектра отраслей, в которых используются соевые продукты, обуславливает актуальность исследовательских работ, направленных на ее глубокую переработку.

Особое внимание уделяют таким продуктам, как изолят белка, изофлавоноиды и ингибиторы протеаз. Общим недостатком существующих технологий их выделения из сои является узкая направленность на получение одного целевого продукта с образованием большого количества трудноутилизируемых отходов, характеризующихся наличием ценных соединений.

Разработка технологии переработки соевого шрота, предусматривающей получение в рамках одной технологической схемы ряда биологически активных веществ, обладающих высокой функциональной активностью (изолята белка, изофлавоноидов и ингибиторов протеаз) является актуальной с позиции снижения себестоимости отдельных продуктов (полупродуктов) и повышения рентабельности и экологичности производства.

Цель н задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка основ технологии переработки соевого шрота с получением изолята белка сои, изофлавоноидов, ингибиторов протеаз и оценка их функциональной активности.

Дня достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

— подобрать последовательность стадий переработки соевого шрота, позволяющую получить отдельные фракции, содержащие высокомолекулярную фракцию белковых веществ, изофлавоноиды и ингибиторы протеаз, в рамках технологии получения изолята белка сои;

— провести исследование и сравнительный анализ различных методов очистки фракции изофлавоноидов;

— подобрать условия фракционирования, выделения и очистки препаратов соевых ингибиторов протеаз из обогащенной ими фракции;

— разработать основы технологии получения ингибиторов протеаз и изофлавоноидов на основе полупродуктов, образующихся при выделении изолята белка, и провести технико-экономические расчеты эффективности разработанной технологии;

— оценить функциональную активность ингибиторов протеаз и изофлавоноидов с позиции повышения выживаемости микробных клеток при воздействии на них

жестким ультрафиолетом и пероксидом водорода на примере дрожжей Sac-charomyces cerevisiae; - оценить функциональную активность изофлавоноидов с точки зрения их влияния на каталитическую активность ферментов. Научная новизна.

Разработан способ получения биологически активных веществ сои (изофлавоноидов и ингибиторов протеаз) на основе полупродуктов, образующихся в технологии производства изолята белка. Подтверждена экономическая целесообразность применения жидкость-жидкостной экстракции для достижения требуемой степени очистки концентрата изофлавоноидов.

Показано, что введение соевых ингибиторов протеаз и изофлавоноидов в культуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae повышает выживаемость клеток при воздействии на них жестким ультрафиолетом и пероксидом водорода.

Установлено влияние соевых изофлавоноидов на каталитическую активность промышленных ферментных препаратов за счет образования водородных связей и гидрофобных взаимодействий.

Практическая значимость.

Разработан способ выделения биологически активных веществ сои (ингибиторов протеаз, изофлавоноидов), предусматривающий введение в технологию переработки соевого шрота в изолят белка дополнительных технологических стадий, позволяющих получить фракцию изофлавоноидов с содержанием основного вещества не менее 70 %, ингибиторов Кунитца и Баумана-Бирк с содержанием сырого протеина 95 и 89 %, соответственно.

На основании полученных экспериментальных данных разработан лабораторный регламент и исходные данные для проектирования опытной установки переработки соевого шрота в рамках комплексной технологии. Проведена ориентировочная технико-экономическая оценка эффективности реализации предлагаемой технологии при расчетной мощности производства 5 ООО тонн/год по соевому шроту.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены на Международной конференции молодых ученых «Успехи в химии и химической технологии» (Москва, 2008, 2010); б-ой Международной конференции «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Харьков, 2009); V и VI Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011); 3-ей конференции молодых ученых и специалистов «Обеспечение качества и безопасности продукции агропромышленного комплекса в современных социально-экономических условиях (Москва, 2009); конкурсе проектов молодых ученых в Рамках 15-ой Международной выставки химической промышленности и науки «Химия-2009» (Москва, 2009); 1-ой Международной конференции Российского Химического Общества им. Д.И.Менделеева «Ресурсо- и энергосберегающие технологии в химической и нефтехимической промышленности» (Москва, 2009); Международной конференции молодых ученых, студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений - V Кирпичниковские чтения» (Казань, 2009); VIII Международной конференции «Биоангиоксидант» (Москва, 2009); Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 11 тезисов докладов, подана заявка па патент.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание объектов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 221 наименование, в том числе 133 иностранных авторов, 4 приложения. Основной текст работы изложен на 152 страницах машинописного текста, включает 27 таблиц, 53 рисунка.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы охарактеризована практическая значимость сои для народного хозяйства; рассмотрена общая характеристика и биохимический состав соевых бобов; описаны технологии переработки соевого сырья и получения основных соевых белковых продуктов. Описаны свойства и роль биологически активных компонентов сои - ингибиторов протеаз и изофлавоноидов, рассмотрены современные способы их выделения и области применения. На основе проведенного анализа научно-технической и патентной литературы сделан вывод о целесообразности проведения исследований по разработке способа получения биологически активных соевых компонентов - изофлавоноидов и ингибиторов протеаз - совместно с изолятом белка.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Основным объектом исследования являлся соевый шрот с содержанием сырого протеина 52 %, индексом растворимости азота 43,2 % (от сухих веществ) и содержанием общих углеводов 29,7 %. Микробные объекты исследования: дрожжи Candida tropicalis и Endomycopsis fibuligera из коллекции кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Содержание белковых веществ в растворах определяли методом Лоури, общее содержание углеводов - методом Дюбуа, общее содержание азотсодержащих веществ - методом Къельдаля, содержание нуклеиновых кислот - методом Спирина, определение индекса растворимости азота - методом водной экстракции [Шакир И.В. и др., 2008]. Качественное и количественное определение изофлавоноидов проводили методами, основанными на образовании комплексов изофлавоноидов с хлоридами железа (III) и алюминия [Лобанова A.A. и др., 2004]. Активность протеолитических ферментов и рибонуклеазы определяли в соответствии с [Worthington Enzyme Manual, 1965]. Липолитическую активность оценивали титриметрическим методом [Tietz N.W., 1989]. Ферментативный гидролиз субстратов осуществляли в аппарате с мешалкой и рубашкой при рН-статировании и заданной температуре. Эффективность гидролиза казеината натрия и дрожжевой РНК оценивали по увеличению содержания низкомолекулярной фракции (молекулярная масса <2 кДа), не осаждаемой 50 %-ной трихло-руксусной кислотой. Молокосвертывающую активность определяли согласно ГОСТ Р 52688-2006, антиоксидантную активность - пат. РФ 2144674 С1.

Молекулярно-массовое распределение белковых веществ определяли методом гель-хроматографии с использованием колонки диаметром 1 см и высотой 20 см, заполненной полимерным гелем марки Сефадекс. Электрофоретическое определение белков проводили по методу Лэммли [Остерман Л.А., 1985].

Фракционирование белоксодержащих растворов проводили в лабораторной ячейке при рабочем давлении 0,2 МПа с использованием плоских (УПМ-100, УПМ-20) и половолоконных мембранных элементов (ВПУ-100ПА, ВПУ-20ПА).

Ионообменную хроматографию проводили в статических и динамических условиях, в качестве элюента использовали водные растворы хлорида натрия, соляной

кислоты, гидроксида натрия и этилового спирта.

Культивирование микроорганизмов проводили в глубинных условиях в колбах Эрленмейера объемом 250 мл (объем питательной среды 100 мл) при постоянном встряхивании и температуре 28-30 °С. Накопление микробной биомассы определяли прямым подсчетом клеток в камере Горяева и гравиметрическим методом. Определение острой токсичности препаратов проводили с тест-культурой Telrahymertapyriformis.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием методов математической статистики, включенных в пакет программ «Excel» и «Statistics 6.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ L Разработка основ технологии совместного получения изолята белка, ингибиторов протеаз и изофлавоноидов сои Выбор последовательности стадий извлечения белковой фракции и фракции изофлавоноидов из соевого шрота

Распространенной и успешно внедренной технологией глубокой переработки сои является получение изолята из соевых бобов, поэтому именно она была взята за основу разрабатываемой технологии совместного получения биологически активных веществ сои (изолята белка, изофлавоноидов и ингибиторов протеаз). Принципиальная схема получения изолята белка сои включает стадии обезжиривания соевых бобов органическими растворителями с получением соевого шрота, экстракции белковых веществ, ультрафильтрацию экстракта, осаждение высокомолекулярной фракции белка из концентрата и последующую очистку целевого продукта.

При разработке технологии получения ингибиторов протеаз и изофлавоноидов совместно с изолятом белка следует принимать во внимание специфические свойства ингибиторов протеаз (невысокую молекулярную массу) и изофлавоноидов (хорошую растворимость в этиловом спирте). В связи с этим, были предложены два варианта принципиальных схем совместного получения биологически активных веществ сои (рис.1), отличающиеся последовательностью стадий извлечения изофлавоноидов и белковых веществ. Согласно первой схеме, на первом этапе предусматривается экстракция белковых веществ из соевого шрота, затем этиловым спиртом из твердого остатка экстрагируются изофлавоноиды, согласно второй последовательность стадий обратная. Далее белковые экстракты, полученные по обеим схемам, обрабатываются согласно принципиальной схеме получения изолята белка.

Полученные результаты (табл. 1) свидетельствуют о том, что содержание белковых веществ в белковых экстрактах сопоставимо, при этом в случае второй схемы содержание сырого протеина в осадке белка, получаемом осаждением из концентрата, выше (62 и 72 % для схем 1 и 2, соответственно), что упрощает его очистку при получении изолята белка. Кроме того, при обработке согласно второй схеме содержание изофлавоноидов в спиртовом экстракте в 2,4 раза выше. Это позволяет рассматривать последовательность стадий получения фракций, обогащенных биологически активными веществами, согласно блок-схеме 2 более перспективной.

Поскольку ингибиторы типа Баумана-Бирк является спирторастворимыми, при осуществлении технологических стадий согласно блок-схеме 2 они частично переходят в экстракт изофлавоноидов, что подтверждается результатами гель-хроматографии. При этом основная масса ингибиторов протеаз содержится в пермеате, образующемся после ультраконцентрирования белкового экстракта.

Блок-схема 1 Блок-схема 2

На получение На получение

изолята белка изолята белка

Рис.1. Подбор последовательности стадий переработки соевого шрота, позволяющих получить фракции высокомолекулярных белковых веществ, изофлавоноидов и ингибиторов протеаз

Таблица 1.

Состав полупродуктов, получаемых при подборе последовательности стадий переработки соевого шрота ______

Белковые Снижение Снижение Изофла- Общие

Показатели вещества. активности зкгивности воиоиды, углеводы,

Анализируемые ^^ г/л трипсина, % химотрипсина, % г/л г/л

полупродукты

Блок- белковый экстракт 16,3±0,74 51,3 36,1 0,13±0,01 18,0±0,86

схема концентрат 35,4±0,81 43,8 25.7 0,09±0,01 22,1±0,81

1 пермеат 3,5±0,09 64,8 43,8 0,15±0,01 15,3±0,58

экстракт изофлавоноидов 1,2±0,07 7,1 6,9 0,11±0,02 6,8±0,32

Блок- белковый экстракт 13,4±0,63 38,3 21,9 0,02±0,01 10,9±0,65

схема концентрат 29,7±0,76 38,5 20,8 0,02±0.01 13,0±0,61

г пермеат 2,9£0,10 56,4 37,2 0,01±0,01 9Д±0,38

экстракт изофлавоноидов 1,8±0,08 20,5 14,8 0,26±0,02 13,410,41

Получение очищенной фракции изофлавоноидов

Спиртовой экстракт изофлавоноидов, полученный в соответствии с выбранной последовательностью стадий, помимо целевого продукта содержит примеси ингибиторов Баумана-Бирк, низкомолекулярных пептидов и углеводов, для очистки от которых была предложена последовательность стадий (рис.3), предусматривающая регенерацию экстрагента (методом вакуум-выпаривания во избежание инактивации биологически активных веществ), отделение примеси ингибиторов Баумана-Бирк осаждением в изоэлектрической точке, последующую очистку осветленного концентрата изофлавоноидов от балластных веществ.

Проведение стадии вакуум-выпаривания и осаждения позволяет получить осадок ингибито-ров Баумана-Бирк с содержанием сырого протеина 35 %, который далее направляют на стадию выделения ингибиторов.

7

Рис-2. Блок-схема получения очищенного концентрата изофлавоноидов из эксграюз изофлавоноидов

Таблица 2.

Состав полупродуктов, образующихся при получении очищенной фракции изофлавоноидов

Фракция Содержание, г/л

Белковые вещества (из них низкомолекулярной фракции, % от общего) Углеводы Изофлавоноиды

Спиртовой экстракт изофлавоноидов 1,8*0,06 (38,9) 13,5±0,35 0,3±0,01

Концентрат изофлавоноидов 9,1 ±0,43 (38,9) 67,4*1,84 1,3*0,04

Осветленный концентрат изофлавоноидов 2,7±0,09 (78,8) 49,4± 1,48 1,2±0,0,3

Полученный осветленный концентрат изофлавоноидов содержит 1,2 г/л основного вещества, что в 4 раза выше, чем в исходном спиртовом экстракте, однако характеризуется значительным количеством сопутствующих углеводов и белковых веществ (табл. 2), поэтому требуется его очистка от указанных соединений. Для получения очищеп-ного концентрата изофлавоноидов в настоящей работе были опробованы методы ионного обмена и жидкость-жидкостной экстракции.

Очистка осветленного кониентуата изофлавоноидов методом ионного обмена Для очистки осветленного концентрата изофлавоноидов методом ионного обмена были выбраны сорбенты полистирольной природы (катиониты: С-106, С-145, С-150, КУ-2х8; анионигы: А847С, А1005, АВ-17х8) и карбоксиметилцеляюлоза (волокнистая, Н+-форма, «РЕАХИМ»). При подборе оптимальных условий проведения ионного обмена для каждого сорбента варьировали такие параметры, как: режим (статический, динамический), соотношение сорбента и сорбируемой фракции, содержание компонентов в исходной фракции, рН исходного раствора, продолжительность процесса, природу элюентов и последовательность обработки ими.

Проведенные исследования показали, что для всех сорбентов степень сорбции изофлавоноидов в подобранных условиях составляет не менее 70 %. Десорбцию следует проводить ступенчато: на первом этапе десорбируют белковые вещества и углеводы (элюенты 1М НС1 для катионитов и 1М ЫаС1 для анионитов и карбоксиметилцеллюлозы), на втором - изофлавоноидов (элюент - 80 %-ый этиловый спирт). Наилучшие результаты были достигнуты в случае катионитов при использовании ионообменной смолы С-150, анионитов - А847С, однако наиболее перспективным является использование карбоксиметилцеллюлозы, с помощью которой удается достичь практически полной очистки концентрата изофлавоноидов от примесных веществ.

Таблица 3.

Очистка осветленного концентрата нзофлавоноидов от белковых веществ и углеводов в динамических условиях методом ионного обмена

Фракция Сорбент

С-150 | А847С | Карбоксиметилцеллюлоза

Содержание, % от исходного

Белковые вещества Углеводы Изофла- I Бе-гк°- вые воновды вещества Углеводы Изофла-воновды Белковые вещества Углеводы Изофла-воноиды

Несорб крова иная фракция 38,6 63,4 4,6 22,3 64,8 9,1 76,2 91,2 28,7

Промывная вода 18,0 15,0 10,0 4,1 14,3 8,2 6,8 2,4 3,7

1ый элюат 36,2 16,6 1,2 36,2 20,9 7,5 17,0 6,4 6,7

2 ой элюат 7,2 - 84,2 I 37,4 - 75,2 - - 60,9

Очистка осветленного концентрата нзофлавоноидов методом жидкость-жидкостной экстракции

Альтернативным способом очистки осветленного концентрата изофлавоноидов является жидкость-жидкостная экстракция, основанная на различной растворимости белков, углеводов и изофлавоноидов в воде и органических растворителях. При исследовании очистки осветленного концентрата изофлавоноидов варьировали такие параметры, как: соотношение органическая фаза (этилацетат) - водная фаза (осветленный концентрат изофлавоноидов), температура, продолжительность процесса, рН исходного концентрата и введение модифицирующих добавок к этилацетату (ко-растворители - н-бутанол и изоамиловый спирт).

Таблица 4.

Очистка концентрата изофлавоноидов методом жидкость-жидкостной экстракции

Объемное соотношение этилацетат/ н-бутанол Содержание в органической фазе, % от исходного Объемное соотношение этилацетат/ изоамиловый спирт Содержание в органической фазе, % от исходного

Белковые вещества Углеводы Изофла-воноиды Белковые вещества Углеводы Изофла-воноиды

10/0 39,9 17,8 89,4 10/0 39,9 17,8 89,4

8/2 25,7 3,4 95,8 9/1 22,7 7,4 89,7

6/4 17,2 0 97,9 7/3 19,1 0 96,2

5/5 21,2 0 96,8 5/5 23,9 0 91,4

4/6 20,4 1.3 97,1 3/7 28,8 2,5 91.5

2/8 27,4 2.5 97,5 1/9 42,5 3,7 88,6

0/10 49,8 1,4 93,0 0/10 45,3 1,6 90,7

Показано, что при проведении процесса в наилучших условиях (соотношение органической и водной фаз 3:1, экстракция смесью этилацетат/н-бутанол в соотношении 6:4 при комнатной температуре и рН исходного раствора 2,0) можно получить очищенный концентрат изофлавоноидов с содержанием основного вещества не менее 70 % (табл. 4).

Сравнение методов очистки осветленного концентрата изофлавоноидов Сравнение методов очистки осветленного концентрата изофлавоноидов показал, что оба метода позволяют получить фракцию изофлавоноидов с содержанием основного вещества не менее 70 %, однако более высокой степени очистки можно достичь методом ионного обмена при использовании в качестве

сорбента карбокскметитце.тлюзозы. Тем не менее, с экономической точки зрения (затраты на сырье при проведении ионного обмена в 15 раз выше, а потери целевого продукта достигают 39 %) для промышленной реализации в данном случае более целесообразным является метод жидкость-жидкостной экстракции.

Таблица 5.

Очистка осветленного концентрата изофлавоноидов методами ионного обмена и жидкость-жидкостной экстракции____

Способ очистки Подобранные условия Содержание основного вещества в очищенном концентрате, % Выход, % от исходного Затраты на сырье, руб./г изофлавонодов

Ионный обмен Разбавление исходного концентрата в 5 раз, динамический режим, 40 % карбоксиметидцеллюлозы по массе, рН 2,0, продолжительность сорбции - 1 час, первый элюент 1М КаС1 (2 объема колонки), второй элюенг 80 % этиловый спирт (2 объема колонки) 98 61 2840

Жидкость- жидкостная экстракция Органическая фаза: водная фаза=3:1, комнатная температура, рН 2,0, продолжительность экстракции 30 мин, состав органической фазы - этилацетат/н-б\танол 6:4. 73 98 195

Выделение и очистка соевых ингибиторов протеаз

В соответствии с выбранной схемой обработки соевого шрота, ингибиторы протеаз вследствие невысоких молекулярных масс накапливаются главным образом в пермеате, образующемся на стадии ультрафильтрации белкового экстракта. Поскольку содержание ингибиторов в этом полупродукте невелико, что усложняет процедуру их выделения и очистки, необходимым этапом является повышение их содержания, что может бьпь достигнуто проведением рецикла по пермеату. Однако при осуществлении рециклов возможно накопление токсичных веществ в белковых экстрактах, и, как следствие, в изоляте, поэтому необходим подбор числа стадий возврата пермеата на стадию экстракции белковых веществ. В результате экспериментов было установлено, что максимально возможное количество рециклов без образования токсичных продуктов равно трем, при этом увеличение содержания нгибиторов в пермеатах подтверждается результатами гель-хроматографии (табл. 5^.

Фракиионирование ингибиторов протеаз ультрафилътратей

Фракция, обогащенная ингибиторами протеаз, после стадии ультрафильтрации белкового экстракта, содержит смесь ингибиторов Кунитца и Баумана-Бирк (табл. 5$. Основываясь на различии в молекулярных массах (для ингибиторов Кунитца 20-23 кДа, для ингибиторов Баумана-Бирк - 8-13 кДа) и различной растворимости ингибиторов в органических растворителях, для их фракционирования и очистки была предложена схема, предусматривающая: разделение ингибиторов ультрафильтрацией, очистку получаемых фракций диафильтрацией, осаждение ингибиторов органическими растворителями с их последующим переосаждением (рис. 3).

Ультрафильтрация при использовании мембраны с отсекаемой молекулярной массой 20 кДа не позволяет разделить ингибиторы полностью. Для достижения необходимой полноты разделения необходимо проведение двукратной диафильтрации, при этом содержание ингибитора Баумана-Бирк в концентрате снижается до незначительного количества (табл. б).

ю

Таблица 5а.

Состав полупродуктов, получаемых при рециркуляции пермеата__

Анализируемые полупродукты Белковые вещества, т/л Низкомолекулярная фракция, % от общего содержания белковых веществ Общие углеводы, т/л Снижение активности трипсина, % Снижение активности химотрип-С1ша. % Острая токсичность изолята

Исходная экстракция

Экстракт 14,0±0,43 8,91 10,6±0,36 27,0 | 34,9 не токсичен

Концентрат 30,1±0.91 8,63 13.0±0,42 17,3 24,4

Пермеат 2,91=0,09 12.27 9.2±0.31 41.8 49,6

Первый рецикл

Экстракт 17,2±0,52 14,90 18,5±0,49 32,6 43,2 не токсичен

Концентрат 33.8±0.98 8,73 20,5±0,64 21,9 30,7

Пермеат 4,ИДЮ 16.09 15,5±0,46 52.8 59,5

Вто рой рецикл

Экстракт 21Д±0,62 19,56 29,8±0,78 39,8 52,3 не токсичен

Концентрат 37,3±1.20 9,07 28,4±0,77 25.5 36,2

Пермеат 5,9±0,15 18,21 22,7±0,71 70,3 67,1

Третий рецикл

Экстракт 24,6±0,71 26,24 38,5±1,31 46,0 61,0 не токсичен

Концентрат 40.6±1,42 11,01 36,4±1,28 30,4 42,2

Пермеат 7,0±0,19 20,70 28,2±0,81 78,6 74,8

Четвертый рецикл

Экстракт 28,2±0,82 34.62 48,7±1,42 1 52,4 69,8 токсичен

Концентрат 44,3±1,53 13,11 45,1*1,21 36,0 48,6

Пермеат 8,4±0,23 23,04 35,7±1,11 1 85,1 81,3

Рис.3. Блок-схема получения ингибиторов протеаз из обогащенной ими фракции

Получение очищенных препаратов ингибиторов протеаз

Выделепие ингибиторов протеаз из соответствующих фракций может бьггь осуществлено осаждением органическими растворителями, причем в случае ингибитора Кунитца исследует использовать этиловый спирт, а ингибитора Баумана-Бирк - ацетон. Поскольку при очистке концентрата изофлавоноидов также получается фракция ингибиторов Баумана-Бирк, перед осаждением соответствующие фракции следует объединить.

При подборе оптимальных условий осаждения ингибиторов протеаз варьировали гидромодуль этанола и ацетона, а также изучали динамику осаждения. Удовлетворительная степень осаждения (85 %) достигается при продолжительности процесса 5 часов.

Полученные субстанции содержали примеси (доля сырого протеина не превышала 80 и 35 % в случае ингибиторов Кунитца и Баумана-Бирк, соответственно), для удаления которых были предложены дополнительные стадии диафильтрации и переосаждения.

Таблица 6.

Состав полупродуктов, получаемых при улътрафильтрации и диафнльтрации (УПМ-20)

Анализируемые Общий белок по Низкомоле куляр ная Общие Снижение Снижение

полупродукты Лоури, г/л фракция, % от углевода активности активности

общего содержания г/л трипсина, химотрипспна.

белковых веществ % %

Исходный пермеат 7,04 20.70 28,23 75,6 88,8

Ультрафильтрация

Концентрат 17,4±0,51 13,8±0,41 36,1±0,71 42,5 57,5

Пермеат 3,4±0,12 50,2*0,43 25,4±0,46 30.0 70,3

Диафильтрация -1

Концентрат 14,6±0,46 9,3±0,23 23,1±0,62 37.1 22,6

Диафильтрат 2,8±0,11 83,9±0,45 12,8±0,72 2,0 33,2

Диафильтрация - 2

Концентрат 12,8±0,32 7,9±0,21 11,б±0,53 32,9 13,7

Диафильтрат 2,0±0,07 86,2±0,52 11,7±0,61 4,7 11,5

Диафильтрация - 3

Концентрат 11,1±0,29 5,5±0,17 б,4±0,41 29,0 9,0

Диафильтрат 1,2±0,06 89,9±0,57 5,1±0,32 2,5 3,1

В результате проведенных исследований установлено, что для очистки ингибиторов Кунитца достаточно переосаждения, в то время как для ингибиторов Баумана-Бирк необходимы предварительная диафильтрация объединенной фракции ингибиторов и последующее переосаждение (табл. 7). Полученные очищенные фракции с содержанием сырого протеина не менее 89 % для ингибиторов Баумана-Бирк и 95 % для ингибиторов Кунитца, не обладают острой токсичностью, а их ингибирующая активность соответствует известным аналогам. Технико-экономическая оценка разработанной технологии получения биологически активных веществ из соевого шрота

На основании проведенных исследований разработана принципиальная схема комплексной переработки соевого шрота, включающая следующие основные стадии:

• экстракцию изофлавоноидов из соевого шрота этиловым спиртом;

• регенерацию этанола и последующую очистку концентрата изофлавоноидов жидкость-жидкостной экстракцией;

• экстракцию белковых веществ из твердого остатка, образовавшегося на стадии

Таблица 7.

Осаждение и очистка ингибиторов прогеаз

Условия Фракция Содержание, % от

стадии исходного

Ингибиторы Кунитца Ингибиторы Баумана-Бирк

Осаждение ингибиторов Кунитца

Этанол Осадок 88 15

2:1,5 Надосадочная 12 85

часов жидкость

Переосаждение ингибиторов Кунитца

Этанол Осадок 76 2

2:1,5 Надосадочная 12 13

часов жидкость

Диафильтрация объединенной фракщ ш кягиоиторов Баумана-Бирк

Вода 1:1, Очищенная фракция - 100

мембрана УПМ-5 Диафильтрат - 0

Осаждение ингибиторов Баумана-Бврк

Ацетон Осадок - 90

1:1,5 Надосадочная - 10

часов жидкость

Переосаждение ингибиторов Баумана-Бирк

Ацетон Осадок - 81

1:1,5 Надосадочная - 9

часов жидкость

спиртовой экстракции;

• получение очищешгых фракций высокомолекулярных соевых белков, ингибиторов Кунитца и Баумана-Бирк ультрафильтрацией и диафильтрацией;

• выделение изолята белка и ингибиторов протеаз осаждением из соответствующих фракций (рис. 4).

Рис. 4. Принципиальная блок-схема переработки соевого шрота с получением изолята белка, соевых изофлавоноидов и ингибиторов протеаз

Таблица 8. в рамках разра-

Технико-экономические показатели комплексной переработки батываемой техноло-

соевого шрота (5 ООО тонн/год) с получением биологически активных „ __

, v , а - гии образуются жидкие

веществ (изолята белка, концентрата изофлавоноидов и ингиоиторов r J ^

поотеаз^ отходы, представляю-

щие собой диафильтра-ты со стадий очистки целевых продуктов, а также кубовые остатки после отгонки этанола и ацетона. Для снижения нагрузки на очистные сооружения была исследована принципиальная возможность биодеградации данных стоков культурами микроорганизмов на примере Candida tropicalis и Endomycopsis ßbuligera. Полученные результаты (степень усвоения субстрата не менее 50 %, содержание сырого протеипа в биомассе до 32 %) свидетельствуют о возможности переработки стоков микробиологическим путем, в том числе и в биомассу кормового назначения.

Технико-экономическая оценка разработанной технологии комплексной переработки соевого шрота мощностью 5 ООО тонн/год по сырью (табл. 8) показала, что

№ Единица Значение по-

ц/п Наименование показателя измерения казателей

1 Капитальные затраты тыс руб 150 137

Полная себестоимость тыс руб 851 905

годового выпуска

3 Себестоимость единицы продукции - концентрат изофлавоноидов - изоляг белка - ингибиторы Кунлта - ингибиторы Баумана-Бирк тыс. руб/м3 тыс. руб/т тыс. руб/т тыс. руб/т 538,7 43,8 318,9 574,0

4 Стоимость годового выпуска продукции тыс. руб/т 1 335 117

5 Прибыль годовая тысруб 483 912

Рентабельность

6 а) производственных фондов б) продукции % % 49,0 36,2

7 Срок окупаемости капитальных вложений год 1,86

внедрение разработанной технологии позволит получить до 480 млн. руб./год прибыли при сроке окупаемости, не превышающем 2 года.

II. Исследование функциональной активности соевых изофлавоноидов и ингибиторов протеаз

Анализ литературы показывает, что соевые изофлавоноиды и ингибиторы протеаз обладают антиканцерогенным, антиоксидантным, противовоспалительным, радиопротекторным и др. действием [Dittmann, К.Н., 1998; Messina, М., 2002]. Также анализ их строения позволяет предположить, что их функциональная активность может проявляться в повышении выживаемости клеток при действии на них жестким ультрафиолетом или пероксидом водорода, кроме того, изофлавоноиды могут выступать в роли модификаторов ферментов.

Влияние ингибиторов протеаз и изофлавоноидов на выживаемость клеток микроорганизмов

Исследование влияния соевых ингибиторов протеаз и изофлавоноидов на выживаемость дрожжей осуществляли на примере культуры Saccharomyces cerevisiae при воздействии на нее жестким ультрафиолетовым излучением (X = 250 нм) и пероксидом водорода.

Таблица 9.

Влияние соевых изофлавоноидов и ингибиторов протеаз на выживаемость клеток дрожжей

Условия эксперимента Выживаемость, Условия эксперимента Выживаемость,

Концентрация Продолжительность % Концентрация Концентрация %

защитного облучения, с защитного пероксида

агента, мг/л агента, мг/л водорода, %

Контроль

0 0 100 0 0 100

0 1,0 6Э,7±2.11 0 0,5 43,5±1,56

0 2,5 27,0±1,08 0 1,5 12,0±1,14

Изофлавоноиды

10 15 57,1±1,86 10 0,5 76,5±2,31

10 30 20,6±1,45 10 1,5 54,3±2,11

50 15 73.6±1.84 50 0.5 85,9±2,14

50 30 30,4±1,41 50 1,5 65,3±1,86

Ингибиторы Бунктца

100 15 71.5±2,04 100 0,5 77,6±1,63

100 30 22.3±1,03 100 1,5 55,0±1,47

1000 15 80,1±1,63 1000 0,5 89,5±1,9б

1000 30 34,6±1,14 1000 1,5 79,1±1,23

Ингнбвторы Баумана-Бирк

100 15 78,1±2,87 100 0,5 79,4±1,78

100 30 42,1±2,13 100 1,5 51,8±1,65

1000 15 85.6±1,б9 1000 0,5 87,1±1.45

1000 30 57,2±1,74 1000 1,5 66,2± 1,34

Эксперимент выполняли следующим образом: проводили предынкубацию ингибиторов протеаз или изофлавоноидов (в концентрациях 0,01-1 г/л и 5-50 мг/л, соответственно) с суточной культурой дрожжей (плотность популяции 10-108 млн.кл./мл), затем воздействовали или ультрафиолетовым излучением в течение 0-30 с, или пероксидом водорода в концентрации 0,1-2,5 %.

Результаты исследования (табл. 9) показали, что введение в культуру ингибиторов протеаз и изофлавоноидов во всем диапазоне параметров (концентрация ингибиторов протеаз 0,01-1,00 г/л, изофлавоноидов - 5-50 мг/л, пероксида водорода -

0,1-2,5 %, время облучения 0-30 с) повышает выживаемость дрохжей в 1,2-4,7 раз. Полученные результаты могут быть обусловлены антиоксидантным действием изофлавоноидов и ингибиторов протеаз (полученные соединения замедляют скорость аутоокисления адреналина на 10-25 %).

Влияние изофлавоноидов на каталитическую активность промышленных гидролитических ферментных препаратов

Таблица ю. Анализ литературы и

Влияние концентрации изофлавоноидов и продолжительности химической структуры изофлавоноидов показывает, что они могут выступать в роли модификаторов ферментов. Влияние изофлавоноидов на каталитическую активность ферментов оценивали на примере таких промышленное гидролитических ферментных препаратов, как: трипсин, рибонуклеаза, пепсин, сычужный фермент, панкреатин (рассматривался в качестве источника липазы). Критерием эффективности процесса для трипсина, РНКазы и панкреатина являя-лась степень гидролиза субстратов (казеината натия, дрожжевой РНК, оливкового масла), для пепсина и сычуж-

Фермент/ Концентра- Прсдынкубация Предынкубации

субстрат ция с ферментным с субстратом

изофлаво- препаратом

ноидов, мин Степень мин. Степень

моль/л* 105 гидролиза, гидролиза,

% %

Трипсин/ 0 0 24,811,14 0 24,&±1,14

казеинат 2,4 0 19,8± 1,23 0 19,8±1,23

натрия 23.6 0 15,7±1,04 0 15,7±1,04

23,6 10 8,1±0,45 10 16,4±0,74

23.6 20 4,5±0,23 20 23 .(>±0,98

23,6 30 2,6±0,25 30 23,9±1,11

РНК-аза/ 0 0 28,9±1,35 0 28,9±1,35

дрожжевая 2,4 0 38,8± 1,47 0 38,8±1,47

РНК 23,6 0 51,7±1,63 0 51,7±1,63

23,6 10 24,0±1,23 10 32,&±1,78

23,6 20 11,4±1,01 20 60,0±1,63

23,6 30 8,3±0,69 30 61,0±1,б5

Панкреатин/ 0 0 10,6±0,86 0 10,6±0,45

оливковое 2,4 0 14,1±0,78 0 14,1±0,5б

масло 23,6 0 25,9±0,74 0 25 ,№±0,74

23,6 10 23,5±1,51 10 28,4±1,98

23,6 20 24,7±1,78 20 42,4±2,И

23,6 30 23,5±1,64 30 42,4±2,03

ного фермента — скорость створаживания молока.

В ходе эксперимента варьировали такие параметры, как: концентрация изофлавоноидов, продолжительность предынкубации изофлавоноидов с ферментным препаратом или субстратом, а также оценивали влияние изофлавоноидов на температурный и рН-оптимумы каталитической активности ферментных препаратов. Влияние хаофлавоноидов на каталитическую активность ферментных препаратов В ходе проведенных экспериментов установлено, при добавлении в реакционную среду изофлавоноидов каталитическая активность РНК-азы, панкретина, сычужного фермента и пепсина повышается, в то время как трипсина - снижается (табл. 10, 11).

Также показано, что нредынкубация оказывает заметный эффект на степень гидролиза (скорость створаживания) соответствующих субстратов, причем максимальный эффект достигается для одних систем в случае предынкубации изофлавоноидов с субстратом (дрожжевая РНК, оливковое масло), для других - изофлавоноидов с ферментом (трипсин, пепсин, сычужный фермент).

Влияние изофлавоноидов на температурные и рН-зависимости каталитической активности ферментных препаратов

Помимо влияния на каталитическую активность, изофлавоноиды также оказывают действие на температурные и рН-зависимости каталитической активности

Фермент/ субстрат Концентрация изофлавоноидов, моль/л* 10* Предынкубация с ферментным препаратом Предынкубация с субстратом

мин. Аюишюсгь, % от контроля МВД. Акшвнооъ, % сг контроля

Пепсин/ молоко 0 0 100 0 100

11,8 в 121,9±2,45 0 121,9±2,45

23,6 0 1И±3,02 0 111±3,02

11,8 5 127,7±2,78 5 102,0±1,96

11,8 15 95,5±2,11 15 95,8±2,74

11,8 30 95,9±2,43 30 94,8±2,31

Сычужный фермент/ молоко 0 0 100 0 100

11,8 0 1 МДМ ,78 0 И0,2±1,78

23,6 0 101,8±1,45 0 101,8±1,45

11,8 10 114,б±1,63 10 100,6±2Д1

11,8 20 102,1±1,79 20 103,8±1,59

11,8 30 98,0±2,04 30 98,2±1,74

промышленных ферментных препаратов. При этом установлено, что для РНК-азы и трипсина-происходит смещение температурного оптимума в сторону более высоких температур, для РНК-азы также наблюдается смещение значения оптимума pH в нейтральную область. При этом для РНК-азы и панкреатина область оптимальных значений расширяется, для трипсина - сужается (табл. 12).

Таблица 11. Полученные результа-

Влияиие концентрации изофлавоноидов и продолжительности ТЫ могут быть обусловлены

образованием водородных связей и гидрофобными взаимодействиями в системах изофлавоноиды/фермент или изофлавоноиды/субстрат, что подтверждено результатами УФ- и ИК-спектрометрии. Сходство строения изофлавоноидов с другими модификаторами ферментов - алки-локсибензолами, также способными образовывать водородные связи и гидрофобные взаимодействия с ферментами и субстратами, позволяет предположить схожесть механизмов действия обеих групп соединений. Эта гипотеза подтверждается результатами апробации кинетической модели взаимодействия [Красноштанова A.A., 2009], разработанной для алкилоксибензолов, применительно к изофлавоноидам. Показано, что модель, разработанная для алки- Таблица 12

локсибезолов, адекватно описывает влияние изофлавоноидов на температурный и рН-поведение системы в присутствии зависимости каталитической активности ферментных изофлавоноидов.

Таким образом, показано, что соевые изофлавоноиды и ингибиторы протеаз являются соединениями, обладающими высокой биологической активностью: повышают выживаемость клеток микроорганизмов при действии на них жесткого ультрафиолетового излучения и пероксида водорода (на примере культуры Saccharomyces cerevisiae). Кроме того, изофлавоноиды оказывают влияние на каталитическую активность промышленных ферментов (на примере РНКазы, трипсина, панкреатина, пепсина и сычужного фермента).

Ферментативный процесс Условия Оптимальные условия

Т,"С рн

Гидролиз дрожжевой РНК без изофлавоноидов 65 7,5

с изофлавоноидами 70* 7,0

Гидролиз казеината натрия без изофлавоноидов 40 8

с изофлавоноидами 45»* 8**

Гидролиз оливкового масла без изофлавоноидов 37 7

с нзофлавоноцдамн 37* 7*

Створаживание молока пепсином без изофлавоноидов 35 5,5

с изофлавоноидами 35 5,5

Створаживание молока сычужным ферментом без изофлавоноидов 35 5,5

с изофлавоноидами 35 5,5

* - расширение, ** - сужение

1. Разработаны основы технологии переработки соевого шрота с получением изолята белка сои, изофлавоноидов и ингибиторов протеаз, включающей стадии экстракции, ультрафгаьтрации, диафильтрации, осаждения и переосаждения.

2. Проведен сравнительный анализ очистки фракции изофлавоноидов ионным обменом и жидкость-жидкостной экстракцией по технологическим и экономическим показателям. Показана предпочтительность жидкость-жидкостной экстракции (соотношение органической (этилацетат/н-бутанол 6:4) и водной фаз 3:1, pH 2,0, продолжительность 30 минут, температура 25 °С), позволяющей получить фракцию изофлавоноидов с содержанием основного вещества 73 % при затратах на сырье не более 195 руб./г изофлавоноидов.

3. Подобраны условия выделения ингибиторов протеаз из отходов производства изолята белка сои, включающего стадии мембранного разделения, диафильтрации, осаждения и переосаждения из подпо-егтиртокых и водно-ацетоновых растворов. Получены фракция ингибиторов Кунитца, содержащая 95 % сырого протеина (1 мг ингибирует 1,5 мг трипсина с активностью 300 ед. ТАМЕ/мг фермента); фракция ингибиторов Баумана-Бирк, содержащая 89 % сырого протеина (1 мг ингибирует 0,35 мг трипсина с активностью 300 ед. ТАМЕ/мг фермента и 0,7 мг химотрипсина с активностью 40 ед. ВТЕЕ/мг фермента).

4. Показано, что ингибиторы протеаз и изофлавоноиды повышают выживаемость клеток микроорганизмов (на примере дрожжей Saccharomyces cerevisiae) при воздействии на них жестким ультрафиолетом (к = 250 нм, 0-30 с) и пероксидом водорода (0,1-1,5 %) в 1,2-4,7 раза.

5. Исследовано влияние изофлавоноидов на каталитическую активность промышленных ферментных препаратов (па примере трипсина, РНКазы, панкреатина, пепсина и сычужного фермента). Подтверждено, что изофлавоноиды являются модификаторами ферментов, при этом степень гидролиза субстратов в случае РНКазы и панкреатина возрастает в 1,5-4 раза, в случае трипсина снижается в 2 раза, активность молокосвертывающих ферментов повышается на 15-30 %. Установлено, что влияние изофлавоноидов на каталитическую активность ферментов обусловлено образованием водородных связей и гидрофобными взаимодействиями.

6. Проведена ориентировочная технико-экономическая оценка реализации разработанной технологии. При расчетной мощности производства 5 000 тонн/год по соевому шроту прибыль составляет не менее 480 млн. руб./год при сроке окупаемости, не превышающем 2 года.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Хабибулина, Н.В. Зависимость биологических эффектов от химической структуры флавоноидов / Насибов P.C., Хабибулина Н.В., Козлов К.Г. // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2010. №2/1. С. 260.

2. Хабибулина Н.В., Красноштанова A.A. Заявка на патент «Способ защиты дрожжей Saccharomyces cerevisiae от стрессорных воздействий различной природы» №2012106867, приоритет от 27.02.12

3. Хабибулина, Н.В. Изучение кинетики накопления и инактивации ингибиторов трипсина и химотрипсина из белого лепестка. Разработка технологии получения соевых ингибиторов трипсина и химотрипсина / Н.В. Хабибулина // IV Международный конгресс молодых ученых по химии и химической технологии. Москва 2008. Том ХХП, №13. С. 76-80.

4. Хабибулина, H.B. Получение ингибиторов трипсина и химотрипсина из отходов производства соевого изолята / Н.В. Хабибулина, A.A. Красноштанова // 6-я Международная конференция «Сотрудничество для решения проблемы отходов». Харьков. 2009. С. 149-151.

5. Хабибулина, Н.В. Разработка научных основ технологии получения соевых ингибиторов трипсина и химотрипсина / Н.В. Хабибулина, A.A. Красноштанова // V Московский Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 2009 г. ч.1. С. 411-412.

6. Хабибулина, Н.В. Исследование процесса получения ингибиторов пищеварительных ферментов на основе отходов производства изолята белка сои / Н.В. Хабибулина, A.A. Красноштанова // 3-я Конференция молодых ученых и специалистов «Обеспечение качества и безопасности продукции агропромышленного комплекса в современных социально-экономических условиях». Москва. 2009 г. С.236-238.

7. Хабибулина, Н.В. Разработка научных основ технологии получения соевых ингибиторов трипсина и химотрипсина из отходов производства изолята белка сои / Н.В. Хабибулина, A.A. Красноштанова // 15-я международная выставка химической промышленности и науки «ХИМИЯ-2009», Конкурс проектов молодых ученых. Москва. 2009 г. С. 40-41,

8. Хабибулина, Н.В. Разработка научных основ технологии получения соевых ингибиторов трипсина и химотрипсина из отходов производства изолята белка сои / HB. Хабибулина, A.A. Красноштанова// 1-я Международная конференция Российского Химического Общества им. ДИ.Менделеева «Ресурсо- и энергосберегающие технологии в химической и нефтехимической промышленности». Москва. 2009 г. С. 71-72.

9. Хабибулина, Н.В. Исследование процесса очистки экстракта изофлавоноидов от белковых веществ / Н.В. Хабибулина, A.A. Красноштанова, В.И. Панфилов // Химическая промышленность сегодня. - 2012. -№ 5. - с. 34-38.

10. Хабибулина, Н.В. Изучение процесса получения и очистки фракции соевых изофлавоноидов совместно с изолятом белка сои / Н.В. Хабибулина // VI Международный конгресс молодых ученых по химии и химической технологии. Москва. 2010. Том XXIV, №11(116). С. 46-50.

11. Хабибулина, Н.В. Изучение эффективности применения соевых ингибиторов трипсина и химотрипсина в качестве антистрессовых агентов / Н.В. Хабибулина, A.A. Красноштанова // XIII Международная конференция молодых ученых, студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений - V Кирпичниковские чтения». Казань. 2009. С. 365.

12. Хабибулина Н.В. Исследование процесса получения соевых изофлавоноидов из отходов производства изолята белка сои / Н.В. Хабибулина, О.Ю. Костина, К.С. Закиева, A.A. Красноштанова // Московская Международная научно-практическая конференция «Биотехнология: экология крупных городов». Москва. 2010. С. 241-242.

13. Хабибулина, Н.В. Исследование эффективности применения соевых изофлавоноидов в качестве антистрессорных агентов / Н.В. Хабибулина, A.A. Красноштанова // VIII Международная конференция «Биоантиоксидант». Москва. 2010. С. 486-487.

14. Хабибулина, Н.В. Разработка научных основ технологии совместного получения изофлавоноидов, изолята белка и ингибиторов протеолитических ферментов из белого лепестка / HB. Хабибулина, A.A. Красноштанова // VI Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2011. ч.1. С. 329-330.

Подписано в печать:

18.04.2012

Заказ № 7200 Тираж -110 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата технических наук, Хабибулина, Наталья Викторовна, Москва

Российский химико-технологический университет им. Д. И. Менделеева

6112-5/2461 На правах рукописи

Хабибулина Наталья Викторовна

Использование соевого шрота для получения биологически активных веществ и оценка их функциональной активности

03.01.06 - Биотехнология (в т. ч. бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент Красноштанова Алла Альбертовна

Москва - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................6

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР...........................................................................9

1.1. Общая характеристика сои.....................................................................9

1.1.1.Применение сои в народном хозяйстве...................................................9

1.1.2. Биохимический состав сои..................................................................11

1.1.3. Технологии переработки сои...............................................................14

1.2. Соевые ингибиторы протеаз..................................................................19

1.2.1. Общая характеристика.......................................................................19

1.2.2. Физико-химические свойства и структура...............................................21

1.2.3. Биологическая роль ингибиторов протеаз...............................................23

1.2.4. Методы выделения и очистки ингибиторов протеаз..................................28

1.3. Изофлавоноиды.................................................................................31

1.3.1. Общая характеристика.......................................................................31

1.3.2. Биологическая роль изофлавоноидов.....................................................33

1.3.3. Биосинтез и метаболизм изофлавоноидов................................................39

1.3.4. Методы выделения, очистки и анализа изофлавоноидов.............................41

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................45

2.1. Объекты исследования.........................................................................45

2.2. Реагенты...........................................................................................45

2.3. Методы анализа.................................................................................47

2.3.1. Определение влажности образца............................................................................47

2.3.2. Количественное определение азотсодержащих веществ в белковых растворах.. ..47

2.3.3. Определение активности ферментов......................................................48

2.3.4. Количественное определение углеводов.....................................................49

2.3.5. Определение содержания нуклеиновых кислот.......................................50

2.3.6. Определение индекса растворимости азота.............................................50

2.3.7. Определение содержания изофлавоноидов.............................................51

2.3.8. Определение общей молокосвертывающей активности препаратов...............51

2.3.9. Определение жироудерживающей способности (ЖУС)..............................52

2.3.10. Определение жироэмульгирующей способности (ЖЭС)............................52

2.3.11. Определение антиоксидантной активности соединений............................52

2.4. Методы исследования..........................................................................53

2.4.1. Методика проведения экстракции растворимых веществ из соевого шрота......53

2.4.2. Методика проведения концентрирования вакуум - выпариванием..................53

2.4.3. Методика проведения осаждения белковых веществ из водных, водно-спиртовых и водно-ацетоновых растворов......................................................54

2.4.4. Методика проведения процесса ультрафильтрации ...................................54

2.4.5. Методика проведения процесса молекулярно-ситовой хроматографии..............56

2.4.6. Методика проведения ионного обмена...................................................57

2.4.7. Методика проведения жидкость-жидкостной экстракции...........................59

2.4.8. Методика проведения ферментативного гидролиза....................................59

2.4.9. Методика проведения гель-электрофореза в полиакриловом геле..................59

2.4.10. Методика проведения культивирования микроорганизмов........................60

2.4.11. Выявление живых и мертвых клеток грибов и дрожжей..............................61

2.4.12. Методика определения токсичности с применением тест-культуры инфузорий

ТеКакутепа руп/огт1з...............................................................................62

ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ .....................................................................................................63

3.1. Подбор последовательности стадий переработки соевого шрота с получением фракций, содержащих изофлавоноиды, высокомолекулярную фракцию белковых веществ и ингибиторов протеаз.....................................................................63

3.2. Исследование процесса очистки экстракта изофлавоноидов...........................71

3.2.1. Исследование очистки концентрата изофлавоноидов методом ионного обмена.. .72

3.2.2. Исследование процесса очистки концентрата изофлавоноидов методом жидкость-жидкостной экстракции.....................................................................79

3.3. Разработка стадий выделения и очистки соевых ингибиторов протеаз...............86

3.3.1. Исследование разделения ингибиторов мембранными методами..................90

3.3.2. Выбор технологического оформления стадии ультрафильтрации..................91

3.3.3. Исследование процесса осаждения ингибиторов.......................................95

3.3.4. Исследование процесса очистки фракций ингибиторов..............................96

3.3.5. Биоконверсия отходов, образующихся при получении изофлавоноидов, изолята белка и ингибиторов протеаз из соевого шрота................................................98

3.4. Оценка функциональной активности полученных препаратов изофлавоноидов и

ингибиторов протеаз...............................................................................103

3.4.1. Исследование функциональной активности изофлавоноидов в отношении каталитической активности ферментных препаратов............................................103

3.4.2. Изучение функциональной активности соевых ИФ и ингибиторов протеаз в качестве защитных соединений от ультрафиолетового излучения и пероксида водорода... 124

ВЫВОДЫ............................................................................................129

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................130

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1. Материальный баланс комплексной переработки соевого шрота с получением биологически активных веществ (изолята белка, изофлавоноидов, ингибиторов протеаз)........................................................................................153

Приложение 2. Расчёт технико-экономических показателей цеха по переработке соевого шрота с получением биологически активных веществ (изолята белка, изофлавоноидов,

ингибиторов протеаз) мощностью 5 ООО тонн/год по исходному сырью....................165

Приложение 3. ИК-спектры интермедиатов ферментных препаратов и субстратов с

изофлавоноидами....................................................................................177

Приложение 4. Лабораторный регламент на комплексную переработку соевого шрота с получением соевых изофлавоноидов, ингибиторов протеаз и изолята белка.........181

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИФ - изофлавоноиды

ББИ - ингибиторы типа Баумана-Бирк

СКТИ - соевые ингибиторы типа Кунитца

ЖУС - жироудерживающая способность

ЖЭС - жироэмульгирующая способность

ИБС - изолят белка сои

КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза

НФ - несорбированная фракция

ПВ - промывная вода

БВ - белковые вещества

УВ - углеводы

АОБ - алкилоксибензолы

НМФ - низкомолекулярная фракция

ВМФ - высокомолекулярная фракция

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Одним из наиболее перспективных видов растительного сырья, характеризующегося высоким содержанием биологически активных веществ, является соя. Площади посевов сои в мире постоянно растут, в 2010 году они составили 70 млн. га, а объем продукции, произведенной из соевых бобов, превысил 200 млн. т.

Технологии переработки соевых бобов основаны на извлечении из них различных компонентов: масел, белков, различных биологически активных соединений. Традиционно, соя представлена на рынке такими продуктами, как соевое масло, соевые молоко и молочные продукты, концентраты, изоляты и гидролизаты белка, при этом ассортимент продуктов на основе сои постоянно расширяется. В последние годы сою стали использовать не только в пищевой промышленности (при производстве мясных и кондитерских продуктов, в хлебопечении), но и в лечебно-профилактическом питании; при создании БАД; медицине и фармацевтике для производства препаратов, подавляющих активность протеаз, антиканцерогенных препаратов, при осуществлении гормонозаместительной терапии и др. Расширение спектра отраслей, в которых используются соевые продукты, обуславливает актуальность исследовательских работ, направленных на ее глубокую переработку.

Особое внимание уделяют таким продуктам, как изолят белка, изофлавоноиды и ингибиторы протеаз. Общим недостатком существующих технологий их выделения из сои является узкая направленность на получение одного целевого продукта с образованием большого количества трудноутилизируемых отходов, характеризующихся наличием ценных соединений.

Разработка технологии переработки соевого шрота, предусматривающей получение в рамках одной технологической схемы ряда биологически активных веществ, обладающих высокой функциональной активностью (изолята белка, изофлавоноидов и ингибиторов протеаз) является актуальной с позиции снижения себестоимости отдельных продуктов (полупродуктов) и повышения рентабельности и экологичности производства.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка основ технологии переработки соевого шрота с получением изолята белка сои, изофлавоноидов, ингибиторов протеаз и оценка их функциональной активности.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

подобрать последовательность стадий переработки соевого шрота, позволяющую получить отдельные фракции, содержащие высокомолекулярную фракцию белковых веществ, изофлавоноиды и ингибиторы протеаз, в рамках технологии получения изо-лята белка сои;

провести исследование и сравнительный анализ различных методов очистки фракции изофлавоноидов;

подобрать условия фракционирования, выделения и очистки препаратов соевых ингибиторов протеаз из обогащенной ими фракции;

разработать основы технологии получения ингибиторов протеаз и изофлавоноидов на основе полупродуктов, образующихся при выделении изолята белка, и провести технико-экономические расчеты эффективности разработанной технологии; оценить функциональную активность ингибиторов протеаз и изофлавоноидов с позиции повышения выживаемости микробных клеток при воздействии на них жестким ультрафиолетом и пероксидом водорода на примере дрожжей Басскаготусез сегеугягае;

оценить функциональную активность изофлавоноидов с точки зрения их влияния на каталитическую активность ферментов. Научная новизна.

Разработан способ получения биологически активных веществ сои (изофлавоноидов и ингибиторов протеаз) на основе полупродуктов, образующихся в технологии производства изолята белка. Подтверждена экономическая целесообразность применения жидкость-жидкостной экстракции для достижения требуемой степени очистки концентрата изофлавоноидов.

Показано, что введение соевых ингибиторов протеаз и изофлавоноидов в культуру дрожжей Басскаготусез сегеугягае повышает выживаемость клеток при воздействии на них жестким ультрафиолетом и пероксидом водорода.

Установлено влияние соевых изофлавоноидов на каталитическую активность промышленных ферментных препаратов за счет образования водородных связей и гидрофобных взаимодействий.

Практическая значимость.

Разработан способ выделения биологически активных веществ сои (ингибиторов протеаз, изофлавоноидов), предусматривающий введение в технологию переработки соевого шрота в изолят белка дополнительных технологических стадий, позволяющих получить фракцию изофлавоноидов с содержанием основного вещества не менее 70 %, ингибиторов Кунитца и Баумана-Бирк с содержанием сырого протеина 95 и 89 %, соответственно.

На основании полученных экспериментальных данных разработан лабораторный регламент и исходные данные для проектирования опытной установки переработки соевого шрота в рамках комплексной технологии. Проведена ориентировочная технико-экономическая оценка эффективности реализации предлагаемой технологии при расчетной мощности производства 5 ООО тонн/год по соевому шроту.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены на Международной конференции молодых ученых «Успехи в химии и химической технологии» (Москва, 2008, 2010); 6-ой Международной конференции «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Харьков, 2009); V и VI Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011); 3-ей конференции молодых ученых и специалистов «Обеспечение качества и безопасности продукции агропромышленного комплекса в современных социально-экономических условиях (Москва, 2009); конкурсе проектов молодых ученых в Рамках 15-ой Международной выставки химической промышленности и науки «Химия-2009» (Москва, 2009); 1-ой Международной конференции Российского Химического Общества им. Д.И.Менделеева «Ресурсо- и энергосберегающие технологии в химической и нефтехимической промышленности» (Москва, 2009); Международной конференции молодых ученых, студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений - V Кирпичниковские чтения» (Казань, 2009); VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2009); Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 11 тезисов докладов, подана заявка на патент.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОИ

1.1.1. Применение сои в народном хозяйстве

Соя - важнейшая белково-масличная культура мирового земледелия. Это одно из древнейших культурных растений, известных в Азии с 6-го тысячелетия до нашей эры. В Европе соя стала известна в 1873 году, когда она была представлена на международной выставке в Вене. В России о сое узнали во время русско-японской войны 1904-1905 гг. [1]. В настоящее время по площади посевов соя занимает 1-ое место среди всех культивируемых бобовых. В России сою начали культивировать в конце XIX в., однако отсутствие сортов, приспособленных к климатическим условиям, сдерживало ее распространение. В настоящее время ее посевы сосредоточены на Дальнем Востоке и в Ставропольском крае [2].

Мировые площади посевов сои и мирового урожая сои для США составляют 40 % и 50 %, соответственно, далее идут Бразилия (19 % и 19 %), Китай (13 % и 8,5 %), Аргентина (10 % и 11 %), Индия (9 % и 3,4 %), страны Европейского Союза (1,5 % и 1 %). На долю России приходится 1 % мировых площадей и около 0,2 % мирового урожая соевых бобов [3, 4, 5].

Соя - одна из наиболее изученных в генетическом отношении сельскохозяйственных культур, у которой в настоящее время известно 469 генов. Одно из основных направлений современной селекции сои - улучшение качества бобов: достижение максимально высокого содержания белка, оптимизация его качественного состава, снижение содержания антипитательных веществ, улучшенный вкус, хорошие технологические качества [6].

Высока экономическая эффективность возделывания сои: каждый гектар ее посева при урожае 20 - 25 ц/га дает 500 - 700 руб. чистой прибыли. Соя - наиболее дешевый и доступный источник высококачественного белка: стоимость белка сои в 7-10 раз ниже стоимости белка мясо-костной или рыбной муки [7, 8].

Соя как бобовая культура обогащает почву азотом. После ее уборки на 1 га накапливается 70-80 кг усвояемого азота. Как пропашная культура при хорошем уходе за ней соя оставляет поле чистым от сорняков и является ценным предшественником многих полевых культур. Соя может успешно использоваться и в качестве зеленого удобрения [9,10].

Соя является важным масличным растением. Доля соевого масла в мировом производстве в течение последнего десятилетия составляет 25-30 % (8,5-9,2 млн. т), которое широко используют для приготовления маргарина, майонеза и других высококалорийных продуктов питания [11, 12].

Соевые белки, используемые в качестве добавок в пищевых продуктах, помогают улучшить их функциональные свойства. Высокая влагосвязывающая способность соевых белков (1 г белка связывает до 6 г воды) обеспечивает стабильную эмульсию или гелеобразную форму пищевым продуктам, изготовленным на их основе, что ценно в лечебном питании больных желудочно-кишечными заболеваниями [13,14].

Соя полезна для человека вследствие отсутствия в ней холестерина, также она считается «профилактиком» онкологических заболеваний и благотворно влияет на пищеварительную систему. Соя эффективно снижает уровень холестерина в крови, оптимизирует содержание глюкозы в ней при диабете, укрепляет костную ткань, предотвращает развитие болезней сердца и кровеносных сосудов, уменьшает риск образования камней в почках и печени [15].

Соя содержит оптимальное соотношение омега-3 и омега-6 полиненасыщенных жирных кислот. Именно поэтому питание на основе сои является оптимальным с точки зрения профилактики сердечно-сосудистых заболеваний. Соя содержит антиканцерогенные вещества, препятствующие образованию и останавлив�