Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование молекулярно-генетических маркеров у яровой мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом для идентификации хромосомных перестроек и генов устойчивости к болезням
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Использование молекулярно-генетических маркеров у яровой мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом для идентификации хромосомных перестроек и генов устойчивости к болезням"
На правах рукописи
С1
ГАИНУЛЛИН Наиль Рифкатович
/
МО*' и
" , Г
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ У ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С ЧУЖЕРОДНЫМ ГЕНЕТИЧЕСКИМ МАТЕРИАЛОМ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ХРОМОСОМНЫХ ПЕРЕСТРОЕК И ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К БОЛЕЗНЯМ
Специальность 03 00 15 -генетика
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2008
003171129
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте сельского хозяйства Центральных районов Нечерноземной зоны
Научный руководитель:
доктор биологических наук, Дапочкина Инна Федоровна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Хрусталева Людмила Ивановна кандидат сельскохозяйственных наук Молканова Ольга Ивановна
Ведущая организация:
ГНЦ РФ «Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства имени Н.И. Вавилова» РДСХН (г Санкт-Петербург)
Защита диссертации состоится " (алоНЯ_2008 г в ¡¡'СО часов на
заседании диссертационного совета Д 220 043 10 в РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева Адрес 127550, Москва, Тимирязевская ул, 49 Ученый совет РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева
С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева
Автореферат разослан "tO " Ji^S 2008 г и размещен на сайте университета www timacad ru
Ученый секретарь диссертационного совета
4?
Е. А. Калашникова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Генетическое разнообразие современных сортов мягкой пшеницы (ТгШсит аеапшт Ь) по генам устойчивости к бурой ржавчине (Рисстш тпы ЕпкзБ) невелико В лучшем случае у них идентифицируется 1-2, реже 3 гена устойчивости (Кокиле Т М е1 а1, 2004) Стратегия защиты мягкой пшеницы от бурой ржавчины, наиболее распространенного и вредоносного заболевания, включает в себя несколько направлений.
• применение химических средств защиты и иммуностимуляторов,
• поиск новых генетических источников устойчивости, в том числе среди дикорастущих форм и передача их генов в мягкую пшеницу,
• использование эффективных для данной зоны генов Ьг,
• создание многолинейных сортов,
• мозаичное расположение сортов в регионах возделывания пшеницы,
• сочетание новых комбинаций генов, обеспечивающих полевую устойчивость и иммунитет
Каждый из подходов имеет свои плюсы и минусы. С генетической точки зрения, поиск новых генов устойчивости Ьг, а также создание сортов, сочетающих расоспецифическую и неспецифическую устойчивость, обеспечивают эффективную и длительную устойчивость к бурой ржавчине
Поэтому поиск источников и доноров мягкой пшеницы к этому заболеванию, а также выявление комбинаторики генов Ьг, обеспечивающих сопротивляемость к бурой ржавчине, остается актуальной проблемой в селекции мягкой пшеницы Использование современных молекулярно-генетических методов может значительно ускорить процесс выделения генотипов устойчивых к болезням и создание сортов устойчивых к болезням
Молекулярные маркеры широко используются при изучении структуры генома мягкой пшеницы, идентификации и картирование генов, ответственных за проявление полезных свойств, а также для выделения и клонирования генов с целью изучения контролируемых ими свойств и передачи их другим сортам (т е для генетической трансформации) Использование молекулярных маркеров в селекции позволяет получать информацию о признаке уже на ранних стадиях развития, не дожидаясь фенотипического проявления признака, упрощает тестирование устойчивости к различным заболеваниям, требующих кропотливой оценки традиционными методами исследования
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состоит в идентификации хромосомных перестроек и генов устойчивости к болезням с использованием молекулярно-генетических маркеров у
яровой мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом коллекции «Арсенал»
Были поставлены следующие задачи
1 Изучить полиморфизм микросателлитных праймеров, разработанных на Я-геном мягкой пшеницы у образца Ае ¡рекокЗез (к-389), Ае ШипсшЬя,
Т Ыгагае,
2 Установить и идентифицировать с помощью Б БЫ технологии наличие и вид хромосомных перестроек в геноме интрогрессивных линий яровой мягкой пшеницы (2п=42) с чужеродным генетическим материалом
Ае speltoid.es, Ае ШипааШ, Т Ыгагае и у дисомно-дополненных линий (ДЦЛ) 2п=44 с хромосомами Ае йреНонЗез-,
3 Изучить возможность применения БТБ праймеров, сцепленных с 1г генами устойчивости к бурой ржавчине, для идентификации генов устойчивости у Ае зре1(01<^ея и выявить наличие полиморфизма в изучаемых образцах яровой пшеницы,
4 Определить число генов устойчивости к бурой ржавчине на основе гибридологического анализа растений Р2 (образец х тестер восприимчивости),
5. Охарактеризовать образцы коллекции по другим хозяйственно-ценным признакам и выделить доноры устойчивости к бурой ржавчине для селекционного использования Научная новизна
- Впервые у образцов яровой пшеницы коллекции «Арсенал» установлены множественные интрогрессии чужеродного генетического материала Ае яреио^еь по В геному С наибольшей частотой в хромосомные перестройки включались короткие плечи хромосом 1В, 7В и длинное плечо 4В хромосомы мягкой пшеницы
- У образца Ае speltoldes к-389 идентифицировано наличие гомеологичных генов устойчивости к бурой ржавчине Ьг9, Ьг19, Ьг37, Ьг50 и генов устойчивости к мучнистой росе Рт2 и Рт13, ранее идентифицированных у других видов трибы.
- Впервые у 23 образцов яровой мягкой пшеницы коллекции «Арсенал» с использованием БТЗ маркеров идентифицирован генотип устойчивости к бурой ржавчине и у 11 образцов к мучнистой росе
Практическая значимость.
• Выделенные доноры с идентифицированным генотипом устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе могут быть вовлечены в селекцию на повышение иммунитета у мягкой пшеницы
• Праймеры, проявившие полиморфизм, могут быть использованы для идентификации локусов, переданных от дикорастущих сородичей
• Данные о наличии гомеологичных генов устойчивости у Ае speltoides могут быть использованы в филогении сородичей пшеницы Апробация работы Результаты исследования доложены на III
международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2004 г; в школе молодых ученых «Экологическая генетика культурных растений», Краснодар, 2005 г; Втором Всероссийском съезде по защите растений, С -Петербург, 2005 г, Международном совещании Европейского общества по изучению генетики злаков (EWAC) в Стамбуле, 2007 г, II Вавиловской международной конференции "Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке состояние, проблемы, перспективы", Санк-Петербург, 2007 г, Международной конференции «Научное наследие Н И Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства», Москва, 2007
Публикации По материалам диссертации опубликованы 9 научных статей, вт ч. 1 в журнале «Генетика»
Объем и структура работы Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, раздела экспериментальной части, заключения, выводов, рекомендаций В тексте приведены ' j таблицы и < '/ рисунков. Список литературы включает/^"1 наименования, в том числе ~~ - на иностранных языках
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
Экспериментальная работа выполнена в 2004-2008 гг в лаборатории генетики и цитологии ГНУ НИИСХ ЦРНЗ
Материалом служили образцы яровой пшеницы коллекции «Арсенал», устойчивые к бурой ржавчине, с различным числом хромосом Четыре дисомно-дополненные линии (2п=44) с хромосомами Ае speltoides, 29 гексаплоидных линий яровой пшеницы с чужеродным генетическим материалом Ае speltoides, Т kiharae, Ае triuncialis и тестерные линии с известными генами устойчивости к бурой ржавчине, восприимчивая к бурой ржавчине и мучнистой росе линия Хакасская, а также исходные родительские формы, участвовавшие в создании линий коллекции «Арсенал»
Выделение ДНК проводили по СТАВ методу из 5 дневных безхлорофильных проростков, выращенных в чашках Петри на увлажненной фильтровальной бумаге при температуре 25°С (Edwards К, 1991)
Концентрацию выделенной ДНК определяли методом разведений полученных препаратов с последующим их электрофорезом в 1% агарозном геле, содержащем 1мкг/мл бромистого этидия и визуализацией в ультрафиолете Порог чувствительности бромистого этидия в агарозных гелях составляет 10 нг ДНК (Остерман Л А, 1981). У линий с пониженной прорастаемостью выделение ДНК проводили из семян наборами SILICA M фирмы ООО «Биоком» согласно протоколу компании.
Для идентификации хромосомных перестроек использовали SSR технологию, позволяющую получить молекулярные маркеры специфичные к определенным хромосомам Случайным образом отобрали 54 пары праймеров, разработанные для маркирования В генома мягкой пшеницы (Roder M S, 1998) Для идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе использовали STS и SSR-маркеры сцепленные с генами Lrl, Lr9, LrlO, Lrl9, Lr21, Lr24, Lr28, Lr34, Lr35, Lr37, Lr39, Lr46, Lr50 и генами Pml, Pm2, Pm3, Pm4b, Pml3, Pml6 Синтез праймеров осуществляли в фирме «Синтол», г Москва
Амплификацию проведили в ампификаторах Bio-Rad - MJ Reseach РТС-150 и РТС-200 (<х- блок 96x0,2) Параметры ПЦР анализа осуществляли согласно протоколу праймеров
Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в 2% агарозном геле в трис-боратном буфере Визуализацию осуществляли окрашиванием бромистым этидием в УФ свете на трансиллюминаторе
Подбор праймеров осуществляли через онлайн программу РптегЗ -http //frodo wi mit edu/cgi-bin/primer3/ В случае наличия сиквенсов на два аллельных состояния локуса подбор кодоминантного праймера производили через онлайн программу ClustalW -http //www ebi ас uk/Tools/clustalw/index html с последующем использованием программы РптегЗ
Параллельно гены устойчивости в линиях яровой пшеницы определялись методом фитопатологического тестирования сотрудниками ВНИИФ
Техника скрещивания общепринятая Гибриды Fi высевали в поле для получения семян F2 Гибриды Fi высевали в поле для получения семян F^. Определение числа генов устойчивости к бурой ржавчине и наличие/отсутствие аллельности проводили на инфекционном фоне бурой ржавчине в популяциях растений F2 Учитывали два класса растений, устойчивые (R) и восприимчивые (S) Для обработки полученных данных использовали пакет программ «Agros 2 09» (Мартынов С П., 1997)
Качество зерна (уровень седиментации, процент белка и клейковины в зерне, число падения) определяли в лаборатории технологии зерна НИИСХ ЦРНЗ по общепринятым методикам
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Использование SSR маркеров по В геному мягкой пшеницы для идентификации перестроек у образцов коллекции «Арсенал»
Дивергенция и становление видов часто сопровождаются образованием новых семейств видоспецифичных повторов (Flavell R В, 1982) В изменчивости тандемных повторов, к которым относятся как микросателлиты (simple sequence repeats - SSR) с длиной мономера не более 6 пар нуклеотидов, так и макросателлиты, длина мономера которых чаще всего колеблется в пределах от 100 до 400 пн (Zhao and Ganal, 1996, Sharma and Raina, 2005), важную роль играет варьирование числа мономеров в кластере Амплификация маркеров серии Xgwm, разработанных на геном мягкой пшеницы, у образцов яровой пшеницы коллекции «Арсенал» и родительских форм (приведена в табл 1 и 2, продемонстрирована на рис 1-3)
1В хромосома мягкой пшеницы На короткое плечо IBS этой хромосомы использовали три праймера Xgwml8, Xgwmll, Xgwm550 С помощью праймера Xgwml8 амплифицируется маркер размером 182-188 пн на мягкой пшенице и дает маркер на Ае speltoides (к-389) размером 225-230 п н Данный маркер отжигается у линий 82/001, 76/00', 79/00', ДЦЛ I и II кластеров У этих линий обнаружен только эгилопсный маркер и отсутствует пшеничный, что говорит о замещении пшеничного плеча хромосомы IBS или его участка на плечо или участок хромосомы Ае speltoides Линии 100/00', 118/00', 199/00', 120/00', 127/00', 129/00', 136/00', 145/00', к-62903 и к-62905 имеют только пшеничный фрагмент ДНК этого праймера
С помощью праймера Xgwmll по Редер (Roder M S et al, 1998) на тестерных линиях пшеницы амплифицируется фрагмент ДНК 202-213 п.н На сорте Родина выявлены ампликоны массой около 200 п н, на Ае speltoides праймер дал фрагмент ДНК массой 170 п н., а у Ае triunciahs 150 п.н. Фрагмент ДНК Ае speltoides, обнаружен только у линии 82/00', что указывает на перестройку прицентромерной части IBS плеча
С помощью праймера Xgwm550 по Редер амплифицируется фрагмент ДНК длиной 156-158 п.н на мягкой пшенице У сорта Родина длина ампликона составила 120 п н , а у Ае speltoides 100 п н Эгилопсный локус обнаружен у ДЦЛ IV кластера и гексаплоидных линий 76/00', 102/00', 118/00', 120/00'.
1BL. На длинное плечо 1В хромосомы использовали четыре праймера Праймеры Xgwml40, Xgwm403 и Xgwm259 не дали полиморфных фрагментов у родительских форм.
С помощью праймера Xgwml53 амплифицируется фрагмент ДНК длиной 183 пн на 1BL. У Ае speltoides обнаружен маркер 195 пн., у Ае triuncialis фрагмент 205 п н Фрагменты ДНК, гомологичные эгилопсным, у изученных линий не амплифицировались
2В хромосома мягкой пшеницы- короткое плечо 2BS На это плечо использовали праймеры Xgwm210, Xgwm410, Xgwml48, Xgwm257 и Xgwm374. Установили, что праймер Xgwm210 отжигается на коротких плечах хромосомы 2В и 2D Хромосома 2BS дает 280 п н, а на 2DS амплифицируется фрагмент массой 180 п н Этот праймер дает маркеры у Ае speltoides размером 165 и 300 п н, а у Ае ¿гшисга/мамплифицируется фрагмент 190 и н Линия 118/00', имевшая в родословной Ае triuncialis, несет фрагмент, аналогичный данному виду - 190 п.н
С помощью праймера Xgwm410 образуется фрагмент массой 335-367 п н У Ае speltoides данный маркер дал апликон массой 300 п н Протестированные линии, не обнаружили фрагментов, идентичных эгилопсному, что говорит о сохранности этого участка 2В хромосомы
С помощью праймера Xgwml48 амплифицируется фрагмент ДНК длиной 165-167 п н, локализованный на 2BS. Этот маркер хорошо проявляется у сорта Родина. На Ае speltoides праймер полиморфного фрагментаа не дал Изученные линии обнаружили полиморфизм по пшеничному локусу Так линии 102/00' и 119/00' амплифицировали фрагмент массой 110 пн, 79/00' - 130 пн., 72/00' -150 п н, 90/00' и к-62903 - 175 п н и 82/00' - 180 п н
Праймеры Xgwm257 и Xgwm374 на 2% агарозном геле межвидового полиморфизма не дали
2BL. На данное плечо отобраны 3 праймера- Xgwm526, Xgwm382, Xgwml6. С помощью праймер Xgwm526 апмлифицируется фрагмент массой 138-148 п н. У Ае speltoides амплифицируется фрагмент размером 225 п н Оба локуса, специфичных генетическому материалу, как пшеницы, так и эгилопсу, обнаружены у ДЦЛ I кластера, что подразумевает транслокацию либо добавление в геном мягкой пшеницы генетического материала хромосомы 2SL Ае speltoides
Праймер Xgwm382, разработанный на 2BL, 2AL и 2DL плечи мягкой пшеницы, дает фрагменты у сорта Родина 180 пн, 97 пн и 110 пн соответственно. У Ае speltoides данный маркер синтезировал ампликоны массой 100 и 150 п н Линии 118/00' и 119/00' обнаружили фрагмент длиной 100 пн, идентичный эгилопсному Данный праймер сцеплен с геном Рт4Ь и у тестерной линии с геном Pm4b дает фрагмент массой 94 п.н. Ампликон обнаружен у линии 145/00'
Хромосома ЗВ. С помощью праймера Xgwm389 амплифицируется фрагмент, локализованный на 3BS длиной 117-128 пн У Ае speltoides он амплифицировал фрагмент размером 140 пн. У линий 119/00', 120/00',118/00', 90/00' и к-62905 амплифицируются фрагменты эгилопсного типа, свидетельствуя об интрогрессии его генетического материала Для уточнения размера интрогрессии использовали праймеры Xgwm285, Xgwm496 и Xgwm72, но они не прояснили ситуацию Xgwm285 и Xgwm496 не дали полиморфных фрагментов ДНК, a Xgwm72 не отжигался у родительских форм
Для изучения длинного плеча хромосомы 3BL мягкой пшеницы использовали праймеры Xgwm547, Xgwm340, Xgwm299 и Xgwml08. Праймер Xgwm574 дал маркер 171 п.н. У Ае speltoides он амплифицировал два фрагментаа 120 и 170 п.н. Эгилопсные фрагментыы обнаружены у линий 118/00' и 79/00' Полиморфные ампликоны массой 150 п.н пшеничного типа синтезировались у линий 102/00', 145/00' ДДЛII кластера и ДДЛ III кластера.
Праймер Xgwm340 отжигался у сорта Родина, и все исследованные линии обнаружили только пшеничные фрагменты
Амплификация маркеров Xgwm299 для 3BL мягкой пшеницы оказалась неинформативной, так как фрагменты пшеницы и Ае speltoides, и Ае triuncialis имели одинаковую массу - 206 п н На линия к-62903 проявились фрагменты массой 210 и 230 пн, у линии 122/00-1 также амплифицировалась два фрагмента - 190 пни 250 п.н. Линия 141/00-1 обнаружила полиморфизм и фрагмент с массой 190 пн. Маркер Xgwml08 на агарозном геле не дал полиморфных фрагментов.
Хромосома 4В. По 4BS использовали праймеры Xgwm368 и Xgwm495. Праймер Xgwm368 дал маркер 259-271 п н, а у Ае speltoides 290 п.н У линии 76/00' и 82/0О1 проявился, как пшеничный, так и эгилопсный фрагменты Это свидетельствует о транслокации участка 4S хромосомы эгилопса на неизвестную хромосому пшеницы ДДЛ I кластера и гексаплоидные линии! 02/00', 119/00', 120/00', 129/00', 136/00' и к-62905 имели только пшеничные фрагменты
Праймер Xgwm495 у пшеницы амплифицировал фрагмент 160-178 п н, а у Ае speltoides 120 пн У исследованных линий амплификация фрагментов эгилопсного типа не обнаружена
4BL. Праймер Xgwm6, разработанный на это плечо дает маркер 150 п н, а у Ае speltoides 190 п н Линия 76/00', 79/00', 82/00', ДДЛ II кластера и к-62903 имели и пшеничный и эгилопсный маркер Это указывает на интрогрессию генетического материала 4S хромосомы эгилопса, однако его локализация не установлена Гомологичная замена пшеничного плеча или участка хромосомы на эгилопсную обнаружена только у ДДЛ I кластера
Линии 102/00', 119/00', 120/00', 141/00-1 и сорт Родина имели только пшеничные фрагменты (примеры электрофореграммы приведена на рнс.1).
Рис.1. Наличие локусов ДНК Т. aestivum (150 п.н,)/Ае. speltoides (190 п.н.) в линиях коллекции «Арсенал» при использовании SSR праймера Xgwm6 на плечо 4BL мягкой пшеницы
12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1. Т. aestivum (2п=42) к-62903; 2. Т. aestivum (2п=42) к-62904; 3. Т. aestivum (2п=42) 106/00'; 4. Т. aestivum (2n=42) 81/00¡ ;5. Т. aestivum (2п=42) 81/00'; 6. Т. aestivum (2п=42) 15/00'- 7. Т. aestivum (2n=44) X кл; 8. Т. aestivum (2n=44) XI кл; 9. Т. aestivum (2n=44) XV кл; 10. Т. aestivum (2n=44) I кл; П. Т. aestivum (2n=44) VII кл; 12. Т. aestivum (2п=44) VIII кл; 13. Т. aestivum (2n=44) XII кл; 14. Ае. speltoides (k-1316);15. Ае. speltoides (k-389); 16. Т. aestivum (сорт Родина); 17. Маркер молекулярного веса
Хромосома 5В, 5BS. На короткое плечо хромосомы 5В были отобраны праймеры Xgwm234, Xg\vm443 и Xgwml59.
С помощью праймера Xgwm234 амплифицируется маркер длиной 229 п.н., который четко проявляется у сорта Родина, а у Ае. speltoides два маркера размерами 114 и 163 п.н. Пшеничные и эгилопсные фрагменты присутствуют у линии 90/00', 118/00', 119/00', 120/00', 127/00', 141/00'-1, 145/00' и 149/00'. Место интрогрессии генетического материала 5SS хормосомы Ае. speltoides неизвестно (пример электрофореграммы приведен на рис. 2).
Праймер Xgwm443 на Ае. speltoides фрагментов не дал, а у Ае. triuncialis фрагмент данного локуса составил 110 п.н., а у пшеницы фрагмент массой 150 п.н. Линии 119/00', 120/00' дали полиморфные фрагменты: 170 п.н. и 140 п.н. соответственно, а линия 118/00' с генетическим материалом Ае. triuncialis амплифицировала два фрагмента - 100 и 155 п.н.
Праймер Xgwml59 у Ае. speltoides не дает фрагментов.
5BL. На это плечо разработаны праймеры: Xgwm499, Xgwm67, Xgwm604 и Xgwm554. Праймер Xgwm499 дал фрагмент 131-177 п.н., у Ае. speltoides 100 п.н., а у Ае. triuncialis 110 п.н. Фрагментов эгилопсов у образцов коллекции не обнаружено. Линия 79/00' дала фрагмент массой 140 п.н.
Рис. 2. Наличие локусов ДНК Т. аеэНуит (229 п.н,)/Ае. 5реко1с1ез (114 и 163 п.н.) в линиях коллекции «Арсенал» при использовании 85Л праймера Xgwm234 на плечо 555 мягкой пшеницы
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 1314151617
1. Т. aestivum (2п=42) 90/004 2. Т. aestivum (2п=42) 102/004 3. Т. aestivum (2п=42) 149/004 4. Т. aestivum (2п=42) 142/004 5. Т. aestivum (2n=42) 141/0<У-1; 6. Т. aestivum (2п=42) 145/004 7. Т. aestivum (2п=42) 130/004 8. Т. aestivum (2п=42) 136/004 9. Т. aestivum (2п=42) 129/004 Ю. NIL Lr 37; 11. NIL Lr 34; 12. NIL Lr 24; 13. NIL Lr 13; 14. NIL Lr 12; 15.T. aestivum (2n=42) сорт Родина; 16. Ae. speltoides (k-389); 17. маркер молекулярного веса
Праймер Xgwm67 для 5BL пшеницы амплифицируех фрагмент 92-94 п.н. Отжиг на Ae. speltoides не дал полиморфизма, у Ae. triuncialis идет специфическая амплификация с фрагментом 80 п.н. Аналогичный фрагмент обнаружен у линии 79/00', что по-видимому связано с частичным переопылением. У линии к-62903 амплифицировался фрагмент длиной 100 п.н.
Праймер Xgwm604 на эгилопсе не отжигается, а у линий обнаружен полиморфизм по данному.
Тестирование маркером Xgwm554 ке обнаружило различие по массе фрагментов у родительских форм.
Хромосома 6В, 6BS. На короткое плечо хромосомы 6BS отобрали праймеры Xgwml32, Xgwml33, Xgwm613 и Xgwm518.
С помощью праймера Xgwml32 амплифицируется фрагмент длиной 116118 п н у пшеницы, а у Ае speltoides - 150 п.н. У линий коллекции фрагменты не обнаружены. Xgwml33 у пшеницы амплифицирует ампликон массой 124128 п н, а у Ае speltoides и Ае triuncialis фрагменты массой 100 п н У линии 127/00' с генетическим материалом Ае triuncialis амплифицировалось два фрагмента - 100 и 150 п н
С помощью праймера Xgwm613 амплифицируется фрагмент длиной 114118 п н, а у Ае speltoides 94-110 п н Эгилопсный маркер обнаружен у линий 129/00', 136/00'и 145/00'
У линии 129/00' амплифицируется также и пшеничный фрагмент, что свидетельствует о наличии транслокации участка 6S хромосомы эгилопса на хромосому пшеницы У линии 136/00' и 145/00' постулируются замещения части 6BS хромосомы участком или плечом 6S хромосомы эгилопса
Маркер Xgwm518 на агарозных гелях полиморфных фрагментов не дал 6BL. На это плечо использовали праймеры Xgwm626, Xgwm88, Xgwm219 С помощью праймера Xgwm626 у пшеницы амплифицировался фрагмент длиной 101-128 п.н., а у Ае speltoides и Ае triuncialis - 95-98 п н Маркер Ае triuncialis обнаружен лишь у линии 122/00'-1, у которой отсутствовал пшеничный Это может свидетельствовать о замещении 6BL плеча или его участка на плечо хромосомы Ае triuncialis
С помощью праймера Xgwm88 у пшеницы амплифицировался фрагмент длиной 162 п н, у Ае speltoides амплификации нет, а у Ае triuncialis отжиг дал ампликоны размером 120 и 180 пн. Линия 118/00' имела фрагмента ДНК типа Ае triuncialis. Линия 90/001 и к-62903 синтезировали ампликон массой 110 п н, а линии 119/00' и 120/00' - 140 п н, образец к-62905 дал бенд длиной 150 п н, что указывает на полиморфность локуса у линий
Маркер Xgwm219 амплифицировался только у сорта Родина (170 п.н). Хромосома 7В, 7BS. На 7BS разработаны праймеры Xgwm46 и Xgwm569. Праймер Xgwm46 у пшеницы дает фрагменты 179-186 п н , а у Ае speltoides 8595 п н Установили, что линии 79/00', 79/00' и ДДЛII кластера амплифицируют фрагменты обоих типов. Это может свидетельствовать о транслокации участка или плеча 7SS хромосомы на хромосому пшеницы
С помощью праймера Xgwm569 у мягкой пшеницы амплифицируется фрагмент длиной 126-130 п н , а у Ае speltoides и Т hharae маркер размером 140 пн. Линии 122/00-1, 142/00', к-62903 и к-62905 амплифицировали фрагменты эгилопса, а линия 119/00' дала специфичный фрагмент массой 100 п н.
7BL. На длинное плечо хромосомы 7В отобрали праймеры Xgwml46, Xgwm577 и Xgwm302. Праймер Xgwml46 у пшеницы дал фрагмент массой
174 п.н., у Ае. speltoides - 210 п.н., ay T. kiharae - 150 п.н. У линий 102/00*, 119/00' и ДДЛ IV кластера синтезировались бенды эгилопса массой 210 п.н. По данному локусу обнаружен полиморфизм. У образцов 79/00', 142/00', к-62903 выявлен бенд массой 180 п.н., а у линии 76/00' - 185 п.н., у 100/00* и 145/00* -190 п.н.
Праймер Xgwm302 у пшеницы дал фрагмент длиной 277 п.н., а у Ае. speltoides и Ае. triuncialis - 300 п.н. Бендов эгилопсов у образцов коллекции не обнаружено.
Праймер Xgwm577 дает у пшеницы фрагмент длиной 155-164 п.н., а у Ае. speltoides не отжигается, что может свидетельствовать об изменении данного локуса пшеницы в процессе эволюции. Данный праймер у линий дает полиморфизм фрагментов по ДНК пшеницы (электрофореграммы приведены на рис.3, а; Ь; с - аллельные различия микросателлитного локуса).
Рис. 3. Наличие локусов ДНК Т. aestivum/Ae. speltoides в линиях коллекции «Арсенал» при использовании SSR праймера Xgwm577 на плечо 7BL мягкой пшеницы (а; Ь; с - аллельные различия микросателитного локуса).
с acb cabcbaa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1. Т. aestivum (2n=44) IV кластера; 2. Т. aestivum (2n=44) III кластера; 3. Т. aestivum (2n=44) II кластера; 4. Т. aestivum (2n=44) I кластера; 5. Т. aestivum (2п=42) 79/00'; 6. Т. aestivum (2п=42) 76/00'; 7. Т. aestivum (2n=42) 82/00*; 8. Т. aestivum (2n=42) 72/00*; 9. Т. aestivum (2п=42) 100/00'; 10. Т. aestivum (2n=42) NIL Lr37; 11. Т. aestivum (2n=42) NIL Lr34; 12. Т. aestivum (2n=42) NIL Lr24; 13. T. aestivum (2n=42) NIL Lrl3; 14. T. aestivum (2n=42) NIL Lrl2; 15. Ae. speltoides (k-389); 16. T. aestivum (2n=42) сорт Родина; 17. маркер молекулярного веса.
Хромосома 1А. 1AS. По данным Рёдер (Röder М. S. et. al., 1998), праймер Xgwml36, разработанный на 1AS пшеницы, дает фрагмент массой 278-321 п.н., у сорта Родина ампликон имел длину 210 п.н., у Ае. speltoides ампликон 290 п.н., а у Ае. triuncialis - 205 п.н. У линий 90/00*, 118/00* и 119/00* амплифицировались фрагменты Ае. triuncialis. Линия к-62903 обнаружила полиморфизм по данному локусу и амплифицировала бенд массой 220 п.н.
13
2AS и 2DS. Праймер Xgwm296 отжигался на коротких плечах хромосом 2А и 2D, давая бенды 158 пн и 182 пн. соответственно У Ае speltoides меркер был длиной 200 п н, а у Ае triuncialis и T. hharae синтезировались фрагменты только пшеничного типа Данный маркер на гомолог локуса В-генома обнаружил полиморфизм у линий 90/00' и к-62903 (170 п н ), 122/00'-1 (160 п н ) и к-62905 (140 п н ) Ампликонов, гомологичных эгилопсу, у образцов не обнаружено.
6А хромосома С помощью праймера Xgwm334 амплифицируется фрагмент ДНК длиной 110-114 пн, локализованный на 6AS, па. а у Ае speltoides и Ае triuncialis 150 пн У исследованных линий амплификация бендов эгилопсного типа не обнаружена
1D хромосома. Праймер Xgdm33 амплифицирует фрагмент, локализованный на коротком плече 1D хромосомы, и амплифицирует фрагменты 165-167 п.н. Он хорошо проявляется у сорта Родина, а на Ае speltoides дает неполиморфный фрагмент, идентичный пшеничному
Изучение микросателлитных маркеров пшеницы при изучении линий коллекции «Арсенал» позволило обнаружить интрогрессию чужеродного генетического материала Ае speltoides у тринадцати образцов, Ае triuncialis у трех и Т hharae у двух образцов Полученные результаты согласуются с данными Адониной И.Г. (2004) по линии 76/00', имеющей замещение короткого плеча хромосомы 7D на короткое плечо хромосомы 7S Ае speltoides. Кроме того, нами была подтверждена стабильность транслокаций у линии 76/00' в процессе размножения с 1998 по 2003 год. С использованием SSR-маркеров подтверждены транслокации идентифицированные методом цитологического анализа (Т) у линий 79/00', 90/00', 127/00', 129/001, 141/00-1, 145/00', 149/00' (табл.1,2)
Результаты по интрогрессии генетического материала видов Т hharae (.2п=42, AGD) и Ае triuncialis (2п=28, CU) приведены в табл 2 У линии 120/00' при использовании маркеров на В геном тремя маркерами идентифицировано место локализации чужеродного материала у двух хромосом (IBS и 3BS); а у линии 119/00' перестроены, по крайней мере, три хромосомы (2BL, 3BS, 7BL)
Таблица 1. Цитологический и молекулярно-генетический анализ образцов коллекции «Арсенал» с генетическим материалом Ае зреНо^ез
Линии Чужеродный генетический материал в геноме у исследуемых образцов Цитологический анализ*
по типу транслокации (Т) по типу замещения (DS)
ДЦЛI кластер Т ? 2SL, Т ? 4SS 1BS/1SS, 4BL/4SL 2п=44(ДДЛ)
ДЦЛII кластер T^SS 1BS/1SS, 4BL/4SL 2п=44 (ДЦЛ)
ДДЛIII кластер 2п=44ЦЦЩ
ДЦЛ IV кластер 1BS/1SS, 7BL/7SL 2п=44 (ДЦЛ)
юо/оо' 2п=42
72ДЮ Т?
129/00* T7 6SS DS+T
82/00 Т ? 4SS, Т ? 7SS 1BS/1SS, 4BL/4SL DS
76/00 Т ? 4SS, Т ? 7SS 1BS/1SS, 4BL/4SL DS
136/00' 6BS/6SS, гес + гетер хр
130/001 DS
145/00' Т •> 4SS, 6BS/6SS Т +гетер хр
79/001 T7 7SS 1BS/1SS, 4BL/4SL, 5BL/5SL DS+T
141/00 -1 T7 5SS DS+2T
102/00 1BS/1SS, 7BL/7SL гес
101/00 гес
142/00 7BS/7SS rec + повыш гетер хр
149/00 T?5SS малая Т+гетер хр
90/00' Т ? 5SS Т +гетер хр
к-62905 T7 5SS.7AS 7SS 3BS/3SS, 7BS/7SS 7AS 7SS (Adomna I G et al, 2004)
к-62903 T7 4SL 7BS/7SS 2BL/2SL
*здесь и далее результаты получены сотрудниками лаб генетики и цитологии НИИСХ ЦРНЗ на основании изучения М1 мейоза у гибридов Б) (линия х исходный сорт Родина) гетер хр -гетерологичность хромосом, проявляющаяся в повышенной частоте открытых бивалентов, гес - интрогрессия чужеродного материала за счет рекомбинационных процессов в мейозе (крупные хромосомные перестройки отсутствуют)
Таблица 2 Цитологический и молекулярно-генетический анализ образцов яровой пшеницы с генетическим материалом Т Ыгагае и Ае ¡пипсгаЬз
Линии Чужеродный генетический материал в геноме у исследуемых образцов Цитологический анализ*
по типу транслокации (Т) по типу замещения (DS)
120/00 Т? AGD 1BS/AGD, 3BS/AGD, гетер хр
119/00 2BL/AGD, 3BS/AGD, 7BL/AGD гес +гетер хр
122/00-2 гес + гетер хр
122/00-1 6BL/CU, 7BS/CU гес +гетер хр
118/00 2Т? CU IBS/CU, 2BL/CU, 3BS/CU, 6BL/CU, 2DS/CU гес + гетер хр
127/00 т? си БЭ+Т
Самый перестроенный В геном обнаружен у образца 118/00' интрогрессия чужеродного материала Ае triuncialis по типу замещения идентифицирована на IBS, 2BL, 3BS, 6BL хромосомах. Кроме того, этот образец имеет перестройку по 2DS хромосоме и несколько транслокаций, Учитывая тот факт, что при цитологическом анализе в Ml у растений Fj (образец х Родина) у всех образцов (кроме 127/00') наблюдали формирование 21 бивалента (число открытых бивалентов повышено), а мультиваленты и униваленты отсутствовали, можно предположить, что зафиксированные с использованием SSR - маркеров перестройки имеют точечный характер
У образца 127/00' с использованием SSR маркеров подтверждено наличие транслокации
Использование STS и SSR маркеров, сцепленных с генами устойчивости к болезням, для их идентификации у Ае. speltoides и образцов коллекции «Арсенал» Идентификация гомеологичных генов устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе Ае. speltoides. У образца Ае speltoides к-389 было идентифицицировано наличие нескольких генов устойчивости к болезням, которые ранее были обнаружены у других сородичей пшеницы (Рис 4-5) Было показано наличие у образца к-389 генов устойчивости к бурой ржавчине Lr9 (Ае umbellulata), Lrl9 (Ag elongatum), Lr37 (T ventricosum) и Lr50 (T timopheevu),
1 .NIL Lrl9; 2. Ae. speltoides (k-389);
3. T. aestivum (2n=42) сорт Родина;
4. маркер молекулярного веса
NIL - почти
1, 7. маркер молекулярного веса; 2, 3, 6. Т. aestivum; 4. Ae. longissima\ 5. Ae. speltoides (k-389)
:нная линия
Рис. 4. Электрофореграмма праймера Lrl9gbF/Lrl9gbR на ген Lrl9 (130 н.п.).
12 3 4
Рис. 5. Электрофореграмма праймера UTV14 на ген Рт13 (570 н.п.).
1 2 3 4 5 6 7
а также генов устойчивости к мучнистой росе Рт2(Ае. щиаггоза) и Рт13(Ае. 1о^15$1та).
Наличие данных генов у Ае. speltoid.es к-389 может свидетельствовать о филогенетическом родстве сородичей пшеницы, древности данных генов устойчивости и стабильности их локусов во времени, и говорит о значимости этих генов для развития иммунитета у видов трибы ТгШсеае Ь.
Идентификация генов устойчивости Ьг и Рт у образцов яровой пшеницы
коллекции «Арсенал».
На первоначальном этапе исследований нами было определено наиболее вероятное число генов, контролирующих устойчивость, было установлено 1-4 генов устойчивости на основе гибридологического анализа.
Для идентификации генов устойчивости использовали молекулярные маркеры, сцепленные с генами устойчивости к бурой ржавчине Ьг1, Ьг9, ЬгЮ, Ьг19, Ьг21, Ьг24, Ьг28, Ьг34, Ьг35, Ьг37, Ьг39 Ьг46, Ьг50 и генами устойчивости к мучнистой росе Рт2, РтЗс, Рт4Ь, Рт13 и Рт16 Наличие/отсутствие некоторых эффективных генов Ьг выявлялось гибридологическим анализом растений Бг, полученных от скрещивания образец х почти изогенная линия с известными генами Ьг.
Фитопатологическое тестирование предполагаемых доноров устойчивости к бурой ржавчине и молекулярно-генетический метод (использование молекулярных-маркеров), а также использование тестов на аллелизм взаимно дополнили друг друга(табл 3)
Амплификацию маркера, сцепленного с геном Ьг39, наблюдали только у моногенной линии с геном Ьг39 и у линии мягкой пшеницы дисомно-дополненной хромосомами Ае ареЛогс/ел. ДДЛ I кластера (2п~44) У образцов, взятых в исследование, амплификации маркера не обнаружено,
Праймер к гену Ьг28 не проявил специфичность на данный ген (те ампликон нарабатывается на всех линиях с пшеничным геномом вне связи с наличием/отсутствием гена Ьг28)
Использование молекулярных маркеров к высоко эффективным генам Ьг9 и Ьг24 позволило выделить четыре образца с геном Ьг9 (76/001, 79/00', 119/00', 120/00'), два образца с геном Ьг24 (120/00', 122/00-1) Однако при проведении теста на аллелизм с образцами 76/00' и 79/00' на ген Ьг9 в гибридных популяциях наблюдали расщепление на устойчивые и восприимчивые растения То есть, само наличие гена Ьг9 не означало его экспрессию в генотипе линий с чужеродным генетическим материалом Образец с чужеродным генетическим материалом ТИкагае 120/00' обладает уникальной комбинацией из 6 генов устойчивости, сочетая ювенильные гены устойчивости Ьг1, Ьг9, ЬгЮ, Ьг21, Ьг24 с геном устойчивости взрослого растения Ьг37. У образца 119/00* того же происхождения дополнительно идентифицированы гены Ьг1 и Ьг12, но отсутствует высоко эффективный ген Ьг24
Использование ПЦР метода позволило также установить присутствие гена Ьг10 еще у шести образцов коллекции Наличие только одного гена Ьг10 не определяет устойчивость к бурой ржавчине в регионах РФ, но в сочетании с другими генами устойчивости может повышать сопротивляемость к бурой ржавчине У образцов коллекции достаточно часто встречается комбинация генов Ьг10+Ьг21 и Ьг1+Ьг10+Ьг21, которые идентифицированы у сорта Родина, принимавшего участие в происхождении образцов Однако у сорта Родина такие сочетания не обеспечивают устойчивости Степень поражения
сорта болезнью достигает 80% В то же время такое сочетание генов в генетической среде образцов 130/00' и 118/00' обеспечивает иммунитет к бурой ржавчине Особую ценность некоторым генотипам пшеницы придает редкое сочетание генов, например, сочетание генов Ьг1, 10, 21, 19 и 34 (к-62905) Эта комбинация генов, а также сочетание генов устойчивости взрослого растения Ьг12+Ьг34 с геном Ьг21 и Ьг19 (79/00') обеспечивают в условиях Нечерноземной зоны полевую устойчивость Степень поражения не превышает 10-20%
Сочетание ювенильных генов устойчивости Ьг27+31 с теми же генами устойчивости взрослого растения Ьг12 и Ьг34 и геном Ьг35 (102/00') обеспечивают иммунитет растению и длительную устойчивость, поскольку для поражения патогену требуется преодолеть устойчивость нескольких генов.
В тех случаях, когда идентифицированы один или несколько генов устойчивости, не являющихся эффективными Ьг1в+ (141/00'-1), ЬгЮ, Ьг2б, Ьг44++ (149/00'), Ьг1+, Ьг25+, Ьг44 (122/00-2), устойчивость генотипов определяется, скорее всего, дополнительными неидентифицированными генами У линий 90/00' и к-62903 с рецессивным характером наследования устойчивости не удалось идентифицировать Ьг гены методом фитопотологического тестирования, но удалось выявить наличие гена Ьг46 при использовании БТБ маркера Ген Ьг46 также был обнаружен у образца 119/00' и ДЦЛIII кластера (2п=44)
Таким образом, с использованием БТБ маркеров, метода фитопатологического тестирования впервые идентифицирован генотип устойчивости к бурой ржавчине у 23 гексаплоидных образцов яровой мягкой пшеницы и двух ДЦЛ (2п=44) I и III кластеров. Выявлены закономерности, определяющие устойчивость образцов к бурой ржавчине
- полигенный характер детерминации устойчивости к этому опасному заболеванию, подтвержденный гибридологическим анализом растений Бг (линия х тестер восприимчивости),
- наличие эффективных генов устойчивости к бурой ржавчине Ьг9, Ьг24, Ьг35,1г27+31, Ьг28, Ьг4б, 1г50,
- сочетание ювенильных генов устойчивости с генами устойчивости взрослого растения- редко встречающиеся комбинации генов Ьг. (Ьг19, 1г21, Ьг12, Ьг34,
Ьг27+31, Ьг34, Ьг35, Ьг12, Ьг26, Шх, 1г26, Ьг44, Ьг19, Ьг35)
Насыщенность доноров генами устойчивости к бурой ржавчине, в том числе эффективными, и редкая комбинаторика генов определяет возможность их универсального использования в селекционных программах на иммунитет к бурой ржавчине для всех регионов Российской Федерации
Яровые образцы пшеницы коллекции «Арсенал» также проверяли на наличие некоторых генов устойчивости к мучнистой росе с использованием БТв и ЗБЯ маркеров. Эффективными генами в условиях Нечерноземной зоны РФ в 2004-2007 годах, по данным оценки коллекции с известным генотипом устойчивости, оказались Рт2, Рт7, Рт12, Рт13, Рт17, Рт16, Рт32. Праймер на ген Рт2 амплифицировался у линий 76/00\ 79/00\ 102/00', 145/00', к-62903 и ДЦЛ II кластера. Ампликоны праймера к гену Рт13 идентифицированы у линии 141/00'-1. Бенды ББИ маркера, сцепленного с геном Рт16, выявлены у линий 79/00', 101/00', 102/00', 119/00', 127/00' и 136/00'.
Амплификацию праймера Рт4Ъ наблюдали только у линий 145/00' и 101/00'. Высокий иммунитет образца 145/00' (0% поражения), скорее всего, связан с неидентифицированным геном Рт, поскольку линия геном Рт4Ь имеет поражение до 40%. Для уточнения соответствия праймера Х§с1тЗЗ, сцепленного с геном РтЗ провели ПЦР анализ у следующих линий РтЗа, РтЗЬ, РтЗс, РтЗс1, РтЗ/, бенды специфичные к данному локусу амплифицировались только у линии РтЗс (130 п.н.), ампликоны на другие аллели гена были не информативны (Рис. 6).
Ген РтЗс не обнаружен ни у одного из протестированных образцов коллекции «Арсенал».
Рис. 6. Электрофореграмма амплификации 5 изогенных линий с аллелями гена РтЗ.
РтЗ/ РшЗй РтЗс РтЗЬ РтЗа
Амплификация маркеров к эффективным генам устойчивости Рт13 (141/00'-1), Рт1б (79/00®, 101/00', 102/00', 119/00', 127/00', 129/00' и 136/00' ) позволят использовать перечисленные образцы коллекции в селекции на устойчивость к мучнистой росе.
Характеристика протестированных образцов коллекции по другим хозяйственно-ценным признакам.
Высокоустойчивыми за годы наблюдения были ДЦЛ I кластера, ДЦЛ II кластера, ДЦЛ III кластера, ДЦЛ IV кластера и гексаплоидные лини 82/00', 136/00', 120/00', 130/00', 145/00', 118/00', 102/00% 90/00' и к-62903.
Отдельные образцы имели поражение в пределах 10-20/i.2 - 40%, что может свидетельствовать о наличии устойчивости по типу «slow rusting» т.е. медленное нарастание инфекции бурой ржавчины (122/00-2, 76/00', 79/00', 141/00-1 и к-62905).
Таблица 3. Идентифицируемые гены устойчивости к бурой ржавчине с использованием ПЦР метода и тест-патотипов бурой ржавчины
образец 1 ены, постулированные с использованием
N1К -маркеров тест-патотипов Ьурой ржавчины*
Ьп ЬгУ шо ы\9 Ьг21 Ьг24 Ьг34 Ьг35 ЪтЗТ ЬгЗУ Ьг4о
72/001 + тип реакции 1), 1, гены не постулируются
76/001 + + наличие генов устойчивости взрослого растения
79/001 7+ + + и 12, им
82/001 + ЬгЮ, Ы26+
УО/ОШ + 0-и, для тест-патотипов с генами вирулентности взрослого растения, гены не
100/001 Ьг43++
101/001 + + напичие генов устойчивости взрослого растения
102/001 + + + Ьг27+31+, Ьг34, и 12
118/001 + + + ЬгЮ, ЬП4Ь+
119/001 + + + + + + Ьг1+, Ы12
120/001 + + + + + + ЬгШ+++, ЬгЗУ
122/001- +
122/001- •'Ьг1+,Ьг:й+,и44
"127/001 + + + Ьг28+
129/001 "' + + + Ы1и+++, Ьг37+
130/001 + + + ыю
136/001 + ч. + •'Ьг10,Ьг14Ь++, 1ЛЗ++
141/001- ЬП6+
142/001 Ы26,ЬгП
145/001 + + + + и, 0,
149/001 •> и 10, Ьг26, Ьг44++
к-62903 + 0,0, к 6 тест-патотипам с генами вирулентности взрослого растения
к-62905 + + + + + Ьг1, ЬгЮ
1 Кл +
111 Кл +
Родина + + + ЬгШ,и-14а,Ьг14Ь,Ьг23
*генотипирование проведено сотрудниками ВНИИФ в лаборатории иммунитета растений (зав лаб к б н Е Д Коваленко) ю
При изучении количественных признаков у выделенных доноров установлены следующие закономерности Выявлено достоверное увеличение длины колоса по сравнению с сортом Родина у большинства линий Большее число колосков в колосе формировали линии 100/00', 129/00', 136/00', 130/00', 79/00', 102/00', 127/00' и 149/00' Самыми продуктивными (масса зерна с колоса) оказались образцы 145/00', 102/00' и 149/00' (от 1,31 до 2,33 г) Крупнозерностью отличались образцы 119/00', 122/00'-2, 122/004, 145/00', 141/00-1, 102/00', 141/00-1, 101/00', 142/00', 149/00', Л-500 и Л-592 (масса 1000 зерен 41-50 г.).По качеству зерна все исследованные линии превышали материнскую форму По уровню седиментации, только линия 122/00'-1 показала меньший объем 3,1мл (у сорта Родина - 3,8 мл) Содержание сырого белка в зерне у всех образцов оказалась выше, чем у сорта Родина. Содержание клейковины в зерне у образцов был также выше, чем у материнской формы, Более низкий результат показала только линия 145/00' 21,5% (у Родины 23,2)
ВЫВОДЫ
1 При использовании 32 полиморфных из 54 случайно отобранных микросателитных маркеров В генома мягкой пшеницы, установлено наличие множественных транслокаций у образцов яровой пшеницы с генетическим материалом Ае йреЫо^ез С наибольшей частотой в хромосомные перестройки включались короткие плечи хромосом 1В - у 9 линий, 7В - у 4 линий и длинное плечо 4В хромосомы - 5 линий
2 Подтверждена возможность использования микросателитных праймеров, разработанных на В геном мягкой пшеницы, на ее сородичах (Ае ¡реко^ез, Т Шагае, Ае ¡пипсга!^) и гибридах, полученных с их участием
3 Впервые у образца Ае speltoid.es к-389, принимавшем участие в происхождении некоторых образцов яровой пшеницы коллекции «Арсенал», выявлена амплификация БТБ маркеров, сцепленных с генами устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе, которые ранее были идентифицированы у других сородичей пшеницы Ьг9 (Ае итЬеНиЫа), Ьг19 (А% е1о^аШт), Ьг37 Т ( уепМсазит) и Ьг50 (Т ПторИееуи), а также генов устойчивости к мучнистой росе Рт2(Ае зциаггоза) и Рт13(Ае 1о^шгта)
4 Впервые с использованием БТЗ маркеров, сцепленных с 2> генами, установлен генотип и закономерности, определяющие высокую устойчивость 23 образцов яровой пшеницы с чужеродным генетическим материалом к бурой ржавчине-
полигенный характер наследования, подтвержденный также гибридологическим анализом растений Б2 (линия х тестер воспримчивости),
наличие эффективных генов устойчивости к бурой ржавчине Lr9, Lr24, Lr27+31, Lr28, Lr35, Lr46, Lr50,
сочетание ювеншьных генов устойчивости с генами устойчивости взрослого растения,
- редко встречающиеся комбинации генов Lr Lrl9+Lr21+Lrl2+Lr34, Lr27+Lr31+Lr34+Lr35+Lrl2, Lr26+Lr44, Lrl9+Lr35
5. Впервые с использованием STS и SSR маркеров, сцепленных с Рт генами, идентифицирован генотип устойчивости к мучнистой росе у 11 яровых образцов пшеницы коллекции «Арсенал» Выявлено, что устойчивость может определяться геном Рт13 (141/00-1), геном Рт2 (76/001, к-62903, ДЦЛ II кластера), геном Рт16 (119/001, 127/00', 136/001) или сочетанием двух эффективных генов устойчивости Рт2+Рт16 (79/00', 102/00', 129/00', 145/00') 6 Установлено, что выделенные из коллекции «Арсенал» доноры устойчивости, характеризуются продуктивностью главного колоса от 1,31 до 2,33 г, массой 1000 зерен от 30 до 50 г, а по качеству зерна (% сырого протеина и клейковины в зерне) превышают исходный сорт Родина.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Насыщенность доноров генами устойчивости к бурой ржавчине, в том числе эффективными, и редкая комбинаторика генов определяют возможность их универсального использования в селекционных программах на иммунитет, расширяя генетический фонд культурных пшениц Передачу генов Lr в другие генотипы мягкой пшеницы следует вести с использованием молекулярных маркеров
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1 Серова А С Гайнуллин H Р Лапочкина И Ф Идентификация генетического материала вида Aegilops speltoides Tausch у пшенично-эгилопсных линий с использованием SSR и STS маркеров.//Тезисы докладов III международная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» Москва, 2004 г С 10-14
2 Lapochkina IF , Yatchevskaya G L , Iordanskaya, Kyzlasov V G, Rudenko MI., Makarova I.Yu, Serova A S , Gamullin N R, Kovalenko E D, Zemchuzhma AI, Kolomiets T M, Solomatin D A, Kiseleva MI, Pshenichnikova T A Collection common wheat "Arsenal" with alien genetic material of species (Ae speltoides, Ae triuncialis, Tkiharae). //Abstracts of 5th Intern Tnticeae Symposium, Prague, Czech Republic June 6-10,2005., p 85
3 Гайнуллин HP , Чичерин А А, Лапочкина И Ф Использование SSR-маркеров для идентификации чужеродного материала в геноме мягкой пшеницы //Материалы школы молодых ученых «Экологическая генетика культурных растений», Краснодар, 2005, с 285-287
4 Лапочкина И Ф, Ячевская Г Л, Иорданская И В , Кызласов В Г, Руденко М И, Макарова И.Ю , Серова А С., Гайнуллин Н Р, Коваленко Е Д, Жемчужина А.И, Коломиец Т.М, Соломатин Д А, Киселева М И Линии яровой мягкой пшеницы с идентифицированным генотипом устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе из коллекции "Арсенал" //Второй Всерос. съезд по защите растений. Фитосанитарное оздоровление экосистем - С -П.-2005 -Т1 -С493-495.
5. Лапочкина И Ф, Кызласов В Г, Ячевская Г.Л, Руденко М И, Макарова И.Ю .Иорданская И В, Гайнуллин Н Р Развитие хозяйственно-ценных признаков у отдаленных гибридов мягкой пшеницы //Современные достижения и проблемы АПК в Центральном районе Нечерноземной зоны//Материалы научно-практической конференции. Немчиновка, НИИСХ ЦРНЗ, 2006. С 7982
6. Гайнуллин Н.Р, Лапочкина И Ф, Жемчужина А И, Киселева М И, Коломиец Т М, Коваленко Е Д Использование фитопатологического и молекулярно-генетического методов для идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине у образцов мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом коллекции «Арсенал» // Генетика, 2007 т. 43 №8 С 1-7
7. IF. Lapochkina, NR. Gajnullin, Е D Kovalenko, AI Zemchuzhina, T M Kolomiets, MI Kiseleva The diversity of bread wheat samples with alien genetic material from wild relatives for the genes of resistance to leaf rust //Abstracts & list of Participants, The 14th International EWAC Workshop, 40th Anniversary EWAC, 6-10 May 2007 Hotel Villa Suite, Istanbul, Turkey Session 3
8 Н.Р Гайнуллин, И Ф Лапочкина Идентификация хромосомных перестроек у образцов коллекции «Арсенал» с использованием SSR маркеров по Б геному мягкой пшеницы// Тезисы доклада II Вавиловской международной конференции "Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке-состояние, проблемы, перспективы" - С.-П - 2007, - С, 253-254
9 И Ф. Лапочкина, HP Гайнуллин. Е Д. Коваленко, А И Жемчужина, Н Н Куркова, И.Ю Макарова, МИ. Руденко, ИВ. Иорданская Генетический потенциал мягкой пшеницы коллекции «Арсенал» по генам устойчивости к бурой ржавчине// Тезисы доклада II Вавиловской международной конференции "Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке состояние, проблемы, перспективы" - С.-П. - 2007 - С. 92-94
1,5 печ л
Зак 270
Тир 100 экз
Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА имени К А. Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гайнуллин, Наиль Рифкатович
Введение.
Глава I. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).
1.1 .Таксономия родов ТгШсит Ь. и Aegilops Ь. и их филогенетические отношения.
1.2.Генетика устойчивости мягкой пшеницы к бурой ржавчине.
1.2.1. Генетические концепции взаимоотношений растений-хозяев и паразитов.
1.3. Методы идентификации хромосомных перестроек.
1.4. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), его модификации и области использования для ДНК маркирования и генотипирования.
1.4.1. Преимущества метода ПЦР.
1.4.2. Подбор праймеров.
1.4.3. Основные варианты ПЦР.
1.5. Использование ПЦР в селекционно-генетических исследованиях.
1.5.1. Использование ДНК маркеров на мягкой пшенице.
1.5.2. Использование ДНК маркеров мягкой пшеницы у межродовых гибридов и дикорастущих видах.
Глава II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.
2.1. Материал.
2.2. Метод экстракции ДНК.
2.3. Маркеры, использованные в работе, и условия проведения ПЦР.
2.4. Визуализация и анализ электрофореграмм.
2.5. Подбор праймеров по сиквенсам.
2.6. Фитопатологическое тестирование.
2.7. Гибридологический анализ.
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Использование SSR маркеров по В геному мягкой пшеницы для идентификации хромосомных перестроек у образцов яровой пшеницы коллекции «Арсенал».
3.2. Использование STS и SSR маркеров, сцепленных с генами устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе, для их идентификации.
3.2.1. Идентификация гомеологичных генов устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе у образца Ae.speltoides (к-389).
3.2.2. Идентификация генов устойчивости Lr и Рт у образцов коллекции «Арсенал».
3.3. Характеристика протестированных образцов коллекции по другим хозяйственно-ценным признакам.
Выводы.
Рекомендации по использованию результатов.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование молекулярно-генетических маркеров у яровой мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом для идентификации хромосомных перестроек и генов устойчивости к болезням"
Актуальность темы. Генетическое разнообразие современных сортов мягкой пшеницы {ТгШсит аезНуит Ь.) по генам устойчивости к бурой ржавчине (Риссша ЪгШЫ ЕпквБ.) невелико. В лучшем случае у них идентифицируется 1-2, реже 3 гена устойчивости (Ко1огте1з е1 а1., 2004). Стратегия защиты мягкой пшеницы от бурой ржавчины, наиболее распространенного и вредоносного заболевания, включает в себя несколько направлений:
• применение химических средств защиты и иммуностимуляторов;
• поиск новых генетических источников устойчивости, в том числе среди дикорастущих форм и передача их генов в мягкую пшеницу;
• использование эффективных для данной зоны генов Ьг\
• создание многолинейных сортов;
• мозаичное расположение сортов в регионах возделывания пшеницы;
• сочетание новых комбинаций генов, обеспечивающих полевую устойчивость и иммунитет.
Каждый из подходов имеет свои плюсы и минусы. С генетической точки зрения, поиск новых генов устойчивости Ьг, а также создание сортов, сочетающих расоспецифическую и неспецифическую устойчивость, обеспечивают эффективную и длительную устойчивость к бурой ржавчине.
Поэтому поиск источников и доноров мягкой пшеницы к этому заболеванию, а также выявление комбинаторики генов Ьг, обеспечивающих сопротивляемость к бурой ржавчине, остается актуальной проблемой в селекции мягкой пшеницы.' Использование современных молекулярно-генетических методов может значительно ускорить процесс выделения генотипов устойчивых к болезням и создание сортов устойчивых к болезням.
Молекулярные маркеры широко используются при изучении структуры генома мягкой пшеницы, идентификации и картирование генов, ответственных за проявление полезных свойств, а также для выделения и клонирования генов с целью изучения контролируемых ими свойств и передачи их другим сортам (т.е. для генетической трансформации). Использование молекулярных маркеров в селекции позволяет получать информацию о признаке уже на ранних стадиях развития, не дожидаясь фенотипического проявления признака, упрощает тестирование устойчивости к различным заболеваниям, требующих кропотливой оценки традиционными методами исследования.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состоит в идентификации хромосомных перестроек и генов устойчивости к болезням с использовании молекулярно-генетических маркеров у яровой мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом коллекции «Арсенал». Были поставлены следующие задачи:
1. Изучить полиморфизм локусов с помощью микросателлитных праймеров, разработанных на ^-геном мягкой пшеницы у образца Ае. speltoid.es (к-389), Ае. МипЫаШ, Т. кгИагае;
2. Установить и идентифицировать с помощью БЗЫ технологии наличие и вид хромосомных перестроек в геноме интрогрессивных линий яровой мягкой пшеницы (2п=42) с чужеродным генетическим материалом;
Ае. зре1Шс1е8, Ае. МипЫаНя, Т. кШагае и у дисомно-дополненных линий (ДДЛ) 2п=44 с хромосомами Ае.яреиогс/ея;
3. Изучить возможность применения БТБ маркеров, сцепленных с Ьг генами устойчивости к бурой ржавчине, для идентификации генов устойчивости у Аелре11о1<Зея и выявить наличие полиморфизма в изучаемых образцах яровой пшеницы;
4. Определить число генов устойчивости к бурой ржавчине на основе гибридологического анализа растений Р2 (образец х тестер восприимчивости);
5. Охарактеризовать образцы коллекции по другим хозяйственно-ценным признакам и выделить доноры устойчивости к бурой ржавчине для селекционного использования.
Научная новизна.
-Впервые у образцов яровой пшеницы коллекции «Арсенал» установлены множественные интрогрессии чужеродного генетического материала Ае.эреиогсЯея по В геному. С наибольшей частотой в хромосомные перестройки включались короткие плечи хромосом 1В, 7В и длинное плечо 4В хромосомы мягкой пшеницы. -У образца Ае.8ре1Шс1е8 к-389 идентифицировано наличие гомеологичных генов устойчивости к бурой ржавчине Ьг9, Ьг19, Ьг37, Ьг50 и генов устойчивости к мучнистой росе Рт2 и Рт13, ранее идентифицированных у других видов трибы. -Впервые у 23 образцов яровой мягкой пшеницы коллекции «Арсенал» с использованием БТБ маркеров идентифицирован генотип устойчивости к бурой ржавчине и у 11 образцов к мучнистой росе. Практическая значимость.
• Выделенные доноры с идентифицированным генотипом устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе могут быть вовлечены в селекцию на повышение иммунитета у мягкой пшеницы.
• Маркеры, проявившие полиморфизм, могут использоваться для идентификации локусов, переданных от дикорастущих сородичей.
• Данные о наличии гомеологичных генов устойчивости у Ае.зре1Шйе8 могут быть использованы в филогении сородичей пшеницы.
Апробация работы. Результаты исследования доложены на III международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2004 г; в школе молодых ученых «Экологическая генетика культурных растений», Краснодар, 2005 г; Втором
Всероссийском съезде по защите растений, С.-Петербург, 2005 г; Международном совещании Европейского общества по изучению генетики злаков (EWAC) в Стамбуле, 2007 г; II Вавиловской международной конференции "Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы", Санк-Петербург, 2007 г; Международной конференции «Научное наследие Н. И. Вавилова -фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства», Москва, 2007.
Список публикаций по теме диссертации:
1. Серова А. С. Гайнуллин Н. Р. Лапочкина И. Ф. Идентификация генетического материала вида Aegilops speltoides Tausch.y пшенично-эгилопсных линий с использованием SSR и STS маркеров // Тезисы докладов III международная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» Москва. 2004 г. - С. 10-14.
2. Lapochkina I.F., Yatchevskaya G.L., Iordanskaya, Kyzlasov V.G., Rudenko M.I., Makarova I.Yu., Serova A.S., Gainullin N.R., Kovalenko E.D., Zemchuzhina A.I., Kolomiets T.M., Solomatin D.A., Kiseleva M.I., Pshenichnikova T.A. Collection common wheat "Arsenal" with alien genetic material of species (Ae.speltoides, Ae.triuncialis, T.kiharae) II Abstracts of 5th Intern. Triticeae Symposium, Prague, Czech Republic June 6-10, 2005. -P. 85.
3. Гайнуллин H.P., Чичерин A.A., Лапочкина И.Ф. Использование SSR-маркеров для идентификации чужеродного материала в геноме мягкой пшеницы // Материалы школы молодых ученых «Экологическая генетика культурных растений», Краснодар, 2005. - С. 285-287.
4. Лапочкина И.Ф., Ячевская Г.Л., Иорданская И.В., Кызласов В.Г., Руденко М.И., Макарова И.Ю., Серова A.C., Гайнуллин Н.Р., Коваленко Е.Д., Жемчужина А.И., Коломиец Т.М., Соломатин Д.А.,
Киселева М.И. Линии яровой мягкой пшеницы с идентифицированным генотипом устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе из коллекции "Арсенал" // Второй Всерос. съезд по защите растений. Фитосанитарное оздоровление экосистем.- С.-П.-2005 .- Т.1.-С.493-495.
5. Лапочкина И.Ф., Кызласов В .Г., Ячевская Г.Л., Руденко М.И., Макарова И.Ю., Иорданская И.В., Гайнуллин Н.Р. Развитие хозяйственно-ценных признаков у отдаленных гибридов мягкой пшеницы.//Современные достижения и проблемы АПК в Центральном районе Нечерноземной зоны // Материалы научно-практической конференции. Немчиновка, НИИСХ ЦРНЗ, 2006. - С. 79-82.
6. Гайнуллин Н.Р., Лапочкина И.Ф., Жемчужина А.И., Киселева М.И., Коломиец Т.М., Коваленко Е.Д. Использование фитопатологического и молекулярно-генетического методов для идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине у образцов мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом коллекции «Арсенал».// Генетика, 2007. т. 43. №8. - С. 1-7.
7. I.F. Lapochkina, N.R. Gajnullin, E.D. Kovalenko, A.I. Zemchuzhina, T.M. Kolomiets, M.I. Kiseleva. The diversity of bread wheat samples with alien genetic material from wild relatives for the genes of resistance to leaf rust // Abstracts & list of Participants, The 14th International EWAC Workshop, 40th Anniversary EWAC, 6-10 May 2007 Hotel Villa Suite, Istanbul, Turkey. Session 3.
8. Н.Р. Гайнуллин, И.Ф. Лапочкина. Идентификация хромосомных перестроек у образцов коллекции «Арсенал» с использованием SSR маркеров по В геному мягкой пшеницы // Тезисы доклада II Вавиловской международной конференции "Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы" -С.-П. -2007. - С. 253-254.
9. И.Ф. Лапочкина, Н.Р. Гайнуллин, Е.Д. Коваленко, А.И. Жемчужина, Н.Н Куркова, И.Ю. Макарова, М.И. Руденко, И.В. Иорданская. Генетический потенциал мягкой пшеницы коллекции «Арсенал» по генам устойчивости к бурой ржавчине // Тезисы доклада II Вавиловской международной конференции "Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы".-С.-П. - 2007. - С. 92-94.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Гайнуллин, Наиль Рифкатович
Выводы
1. При использовании 32 полиморфных из 54 случайно отобранных микросателитных маркеров В генома мягкой пшеницы, установлено наличие множественных транслокаций у образцов яровой пшеницы с генетическим материалом Ае.8реИогс1е8. С наибольшей частотой в хромосомные перестройки включались: короткие плечи хромосом 1В — у 9 линий, 7В — у 4 линий и длинное плечо 4В хромосомы — 5 линий.
2. Подтверждена возможность использования микросателитных праймеров, разработанных на В геном мягкой пшеницы, на ее сородичах {Ае.зре1Шс1е8, Т. Шкагае, Ае. МипыаИъ) и гибридах, полученных с их участием.
3. Впервые у образца Ae.speltoid.es к-389, принимавшем участие в происхождении некоторых образцов яровой пшеницы коллекции «Арсенал», выявлена амплификация БТ8 маркеров, сцепленных с генами устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе, которые ранее были идентифицированы у других сородичей пшеницы: Ьг9 (Ае. итЬеПиШа), Ьг19 (А§. elongatum)! Ьг37 Т.(уеШпсозит) и Ьг50 (Т. иторкееуп), а также генов устойчивости к мучнистой росе Рт2(Ае. щиаггоза) и Рт13(Ае. longissima).
4. Впервые с использованием БТБ маркеров, сцепленных с Ьг генами, установлен генотип и закономерности, определяющие высокую устойчивость 23 образцов яровой пшеницы с чужеродным генетическим материалом к бурой ржавчине: полигенный характер наследования, подтвержденный такэ/се гибридологическим анализом растений (линия х тестер воспримчивости); наличие эффективных генов устойчивости к бурой ржавчине: Ьг9, Ьг24, Ьг27+31, Ьг28, Ьг35, Ьг46, Ьг50;
- сочетание ювенилъных генов устойчивости с генами устойчивости взрослого растения;
- редко встречающиеся комбинации генов Ьг: Ьг19+Ьг21+Ьг12+Ьг34; Ьг27+ЬгЗ 1 +Ьг34+Ьг35+Ьг12; Ьг26+Ьг44, Ьг19+Ьг35.
5. Впервые с использованием 8Т8 и 881*. маркеров, сцепленных с Рт генами, идентифицирован генотип устойчивости к мучнистой росе у 11 яровых образцов пшеницы коллекции «Арсенал». Выявлено, что устойчивость может определяться геном Рт13 (141/00'-1), геном Рт2 (76/00', к-62903, ДДЛII кластера), геном Рт16 (119/00!, 127/001, 136/00;) или сочетанием двух эффективных генов устойчивости Рт2+Рт16 (79/00', 102/00', 129/00', 145/00*).
6. Установлено, что выделенные из коллекции «Арсенал» доноры устойчивости, характеризуются продуктивностью главного колоса от 1,31 до 2,33 г., массой 1000 зерен от 30 до 50 г., а по качеству зерна (% сырого протеина и клейковины в зерне) превышают исходный сорт Родина.
Рекомендации по использованию результатов
Насыщенность доноров генами устойчивости к бурой ржавчине, в том числе эффективными, и редкая комбинаторика генов определяют возможность их универсального использования в селекционных программах на иммунитет. Передачу эффективных генов Ьг от доноров в другие генотипы мягкой пшеницы следует вести с использованием молекулярных маркеров.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гайнуллин, Наиль Рифкатович, Москва
1. Adhikari Т. В., Wallwork H., Goodwin S. B. Microsatellite markers linked to the Stb2 and Stb3 genes for resistance to septoria tritici blotch in wheat // Crop Science.- 2004,- V.44.- №.4,- P. 1403-1411.
2. Adonina I. G., Salina E. A., Efremova Т. T. and Pshenichnikova T. A. The study of introgressive lines of Triticum aestivum x Aegilops speltoides by in situ and SSR analysis // Plant Breeding.- 2004.- V.123.- P. 220-224.
3. Adonina I.G., Salina E.A., Pestsova E.G., and Roder M.S. Transferability of wheat microsatellites to diploid Aegilops species and determination of chromosomal localizations of microsatellites in the S genome // Genome.-2005.- V.48.- P. 959-970.
4. Allaby R. G., Brown T. A. Identification of a 5S rDNA spacer type specific to Triticum urartu and wheats containing the T. urartu genome // Genome.-2000.-V.43.-P. 250-254.
5. Badaeva E. D., Friebe В., Gill B. S. Genome diffirenciation Aegilops. 2. Physical mapping of 5S and 18S-26S ribo-somal RNA gene families in diploid species // Genome.- 1996.- V.39.- P. 1150-1158.
6. Breiman A. Mitochondrial DNA diversity in the genera of Triticum and Aegilops revealed by Southern blot hybridization // Theor. Appl. Genet.-1987.- V.73.- P. 563-570.
7. Camara A. Chromosomes dos trigos hexaploides // Agronomia, Lusitana, Columbia.- 1944.- V.6.- № 3.- P. 221-251.
8. Cenci A., D'ovidio R., Tanzarella O.A., Ceoloni C., Porceddu E. Identification of molecular markers linked to Pml3, an Aegilops longissima gene conferring resistance to powdery mildew in wheat. // Theor. Appl. Genet.- 1999.- V.98.- P. 448-454.
9. Dvorak J., Zhang H.-B. Variation in repeated nucleotide sequences sheds light on phytogeny of the wheat В and G genomes // PNAS USA.- 1990.-V.87.- P. 9640-9644.
10. Edwards K., Jonstone C., Thompson C. A Simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis// Nucl. Acids Res.-1991.- V.19.-№.6.-P. 1349.
11. Feldman M. Identification of unpaired chromosomes in F, hybrids involving Triticum aestivum and T. timopheevii //Canad. J. Genet. Cytol.- 1966.- V.8.-№. l.-P. 144-151.
12. Feuillet C., Messmer M., Schachermayr G., Keller B. Genetic and physical characterization of the Lrl leaf rust resistance locus in wheat (Triticum aestivum L.) // Molecular and General Genetics.- 1995.- V.248.- V.5.- P. 553-562.
13. Flavell R.B. Sequence amplification, deletion and rearrangement: Major sources of variation during species divergence // Genome Evolution / Eds Dover G.A., Flavell R.B. London: Acad. Press.- 1982.- P. 301-323.
14. Flor H. H. The complementary genie systems in flax and flax rust // Adv. Genet.- 1956.- V.8.- P. 29- 54.
15. Gill B. S., Appels R. Relationships between jYw-loci from different Triticeae species // PL Syst. EvoL- 1988.- V.160.- P. 77-89.
16. Giorgi B., Bozzini A. Kyriotype analysis in Triticum. IV. Analysis of (Ae. speltoides x T. boeoticum) amphiploid and a hypothesis on the evolution of tetraploid wheats // Caryologia.- 1969.- V.22.- P. 289-306.
17. Greganova Z., Kraic J., and Galova Z. Diagnostic of Wheat Leaf Rust Resistance Genes by DNA Markers and their Application in MAS // Czech J. Genet. Plant Breed.- 2003.- V.39.- №4.- P. 127-129.
18. Gupta M., Chyi Y-S, Romero-Severson J. and Owen J.L. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats // Theoretical and Applied Genetics.- 1994.- V.89.-P. 998-1006.
19. Halina Wioeniewska, Jukasz stkpiec, Krzysztof Kowalczyk. Resistance of spring wheat cultivars and lines to leaf rust // J. Appl. Genet.- 2003.- V.44.-№3.-P. 361-368.
20. Heid C.A. Real-time quantitative PCR // Genome Res.- 1996.- №6.- P. 986994.
21. Heiterfuss R. Tagungsberichtung / 1965.- №74.- 254 p.
22. Helguera M., Khan I.A., Kolmer J., Lijavetzky D., Zhong-Qi L., Dubcovsky J. PCR assays for the Lr37-Yrl7-Sr38 cluster of rust resistance genes and their use to develop isogenic hard red spring wheat lines // Crop Sci.- 2003.- V.43.- №5.- P.1839-1847.
23. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions //Biotechnology.- 1993.- №11.- P. 1026-1030.
24. Jaaska V. Electrophoretic survey of seedling esterases in wheats in relation to their phylogeny // Theor. Appl. Genet.- 1980.- V.56.- P. 273-284.
25. Jaaska V. Isoenzyme differences between the wild diploid and tetraploid wheats // Genet. Res. Crop Evol.- 1997.- V.44.- P. 137-146.
26. Jenkins J. A. Chromosome homologous in wheat and Aegilops // Amer. J. Bot.- 1929.- V.16.- №4.- P. 238-245.
27. Johnson B. L. Protein electrophoretic profiles and the origin of the B genome of wheat // Proceed. Natl. Acad. Sei.- 1972b.- V.69.- P. 1398-1402.
28. Johnson B. L. Seed protein profiles and the origin of the hexaploid wheats // Amer. J. Bot.- 1972a.- V.59.- №9.- P. 952-960.
29. Kerby K., Kuspira J., Jones B. L. Biochemical data bearing on the relationship between the genome of Triticum urartu and U and B genome of the polyploid wheats // Genome.- 1988.- V.30.- №4.- P. 576-581.
30. Khlestkina E.K., Roder M.S., Börner A., Salina E.A. Application of microsatellite (SSR) markers for gene mapping and genetic diversity assessment in cultivated wheat and its relatives // XXXVII ESNA Annual Meeting.- 10-14 September, 2007.- Dubna.
31. Khlestkina E.K., Than M. H. M., Pestsova E.G., Röder M. S., Malyshev S. V., Korzun V., and Börner A. Mapping of 99 new microsatellite loci in rye
32. Secale cereale L.) including 39 expressed sequence tags // Theor. Appl. Genet.- 2004.- V.109.- P. 725-732.
33. Kihara H. Cytologishe und genetische Studien bei wichtigen Getreidearten mit besonderer Rucksicht auf das verhalten der Chromosomem und die Sterilität in der Bastarden // Mem. Coll. Sei. Kyoto Imper. Univ. Ser. B.-1924.-V.l.-№1.-P. 1-200.
34. Kihara H. Die Entdeckung der DD-Analyzatoren beim Weizen // Agric. and Hortic. Japan. Tokyo.- 1944.- V.19. P. 889-890.
35. Kirby J., Vinh H. T., Reader S. M. and Dudnikov A. Ju. Short Communication Genetic mapping of the Acphl locus in Aegilops tauschii // Plant Breeding.- 2005.- V.124.- P. 523—524.
36. Kolomiets T.M., Kovalenko E.D., Zhemchuzhina A.I.et al. Postulated resistance gene in cultivars and lines with alien genes to leaf rust wheat // Cereal Rusts and Powdery Mildews Bulletin www.crpmb.org/.2004/1029kolomiets.
37. Krishnan, B.R., Blakesley, R.W. and Berg, D.E. Linear amplification DNA sequencing directly from single phage plaques and bacterial colonies // Nucleic AcidsRes.- 1991.-V.19.-P. 1153.
38. Lilienfeld F., Kihara H. Genomanalyse bei Triticum und Aegilops. V. Triticum timopheevi Zhuk // Cytologia.- 1934.- V.6.- №1.- P.87-122.
39. Liu X.M., Smith C.M., Gill B.S., Tolmay V. Microsatellite markers linked to six Russian wheat aphid resistance genes in wheat // Theor Appl Genet.-2001,- V.102.-P. 504-510.
40. Maestra B., Naranjo T. Structural chromosome differentiation between Triticum timopheevii and T. turgidum and T. aestivum II Theor. Appl. Genet.- 1999.- V.98. P. 744-750.
41. Mains E.B., Jackson H.S. Physiologic specialization on the leaf rust of wheat Puccinia triticina Erikss II Phytopathology.- 1926.- V.16.- №1.- P. 89-120.
42. Manifesto M. M., Schlatter A. R., Hopp H. E., Sua'rez, E. Y. and Dubcovsky J. Quantitative Evaluation of Genetic Diversity in Wheat Germplasm Using Molecular Markers // Crop Sei.- 2001.- V41.- P. 682-690.
43. Mark Chee, Robert Yang, Earl Hubbell, Anthony Bemo, Xiaohua C. Huang, David Stern, Jim Winkler, David J. Lockhart, Macdonald S. Morris, Stephen P. A. Fodor. Accessing genetic information with high-density DNA arrays//Science.- 1996.-V.274.- P. 610-614.
44. McFadden E. S., Sears E. R. The origin of Triticum spelta and its free threshing hexaploid relatives // J. Hered.- 1946.- V.37.- P. 107-116.
45. Mcintosh R.A., Devos K.M., Dubcovsky J. et al. Catalogue of gene symbols for wheat: 2006 supplement // Ann. Wheat Newslet.- 2006.- V.52.-P. 208-230.
46. Mcintosh R.A., Hart G.E., Devos K.M. et al. Catalogue of gene symbols for wheat // University of Saskatchewan.- 1998.- 235 p.
47. Mcintosh R.A., Wellings C.R., Park R.F. Wheat Rusts. An Atlas of Resistance Genes // Melbourne: CSIRO.- 1995.- 200 p.
48. Messmer M.M., Seyfarth R., Keller M., Schachermayr G., Winzeler M., Zanetti S., Feuillet C., Keller B. Genetic analysis of durable leaf rust resistance in winter wheat // Theoretical and Applied Genetics.- 2000.-V.100.- P. 419-431.
49. Miller T. E. Systematics and evolution // Wheat breeding: Its scientific basis / Ed. F. G. H. Lupton. L.; N. Y.: Chapman and Hall.- 1987.- P. 1-30.
50. Miyashita N., Mori N., Tsunewaki K. Molecular variation in chloroplast DNA regions in ancestral species of wheat // Genetics.- 1994.- V.137.- P. 883-889.
51. Mohler V., Jahoor A. Allele-specific amplification of polymorphic sites for the detection of powdery mildew resistance loci in cereals // Theor. Appl. Genet.- 1996.- V.93.-P. 1078-1082.
52. Mullis K. The unusual origin of the polymerase chain reaction // Scientific American.- 1990,- April.- P. 56-65.
53. Neu C., Stein N., Keller B. Genetic mapping of the Lr20-Pml resistance locus reveals suppressed recombination on chromosome arm 7AL in hexaploid wheat // Genome.- 2002.- V.45. №4.- P. 737-44.
54. Nishikawa K. Species relationship of wheat and its putative ancestors as viewed from isozyme variation // Proceed. 61h Intern. Wheat Genet. Symp. Kyoto.- 1983.- P. 53-63.
55. O'Connell J, and J O'Connell. RT-PCR Protocols / Totowa, New Jersey: Humana Press.- 2002.- 606 p.
56. Pathak N. Studies in the cytology of cereals // J. Genet.- 1940.- V.39.- P. 437-467.
57. Peterson R.F., Campbell A.B., and Hannah A.E. A diagrammatic scale for estimating rust intensity of leaves and stem of cereals // Can. J. Res. Sect.-1948,- V.26.-P. 496-500.
58. Prins R. , Groenewald J. Z., Marais G. F., Snape J. W. and Koebner R. M. D. AFLP and STS tagging of Lrl9, a gene conferring resistance to leaf rust in wheat // Theoretical and Applied Genetics.- 2001.- V.103. №4.- P. 618624.
59. Ralph D., McClelland M. Arbitrary Primed PCR Methods for Studying Bacterial Diseases // Molecular Bacteriology. Protocols and Clinical Applications. Totowa: Humana Press.- 1998.- P. 83 — 102.
60. Rees H. Deoxyribonucleic acid and the ancestry of wheat // Nature.- 1963.-V.198. P. 108-109.
61. Ridley A.M. Genomic Fingerprinting by Application of rep-PCR // Molecular Bacteriology. Protocols and Clinical Applications. Totowa: Humana Press.- 1998,- P. 103 170.
62. Riley R., Chapman V. The D genome of hexaploid wheat // Wheat Inf. Serv.- I960.- V.2. P. 18-19.
63. Riley R., Unrau J., Chapman V. Evidence on the. origin of the B genome of wheat // J. I-lered.- 1958.- V.49.- №2. P. 91-98.
64. Róder M. S., Korzun V., Wendehake K., Plaschke J., Tixier M-H., Leroy P., Ganal M. W. A microsatellite map of wheat // Genetics.- 1998.- V.149. P. 2007-2023.
65. Saiki R., Scharf S., Faloona F., Mullis K., Horn G., and Erlich H. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia// Science.- 1985.- V.230.- P. 1350-1354.
66. Sarkar P., Stebbins G. L. Morphological evidence Concerning the origin of the B genome in wheat // Amer. J. Bot.- 1956.- V.43.- P. 297-304.
67. Sasanuma T., Miyashita N. T., Tsunewaki K. Wheat phylogeny detennined by RFLP analysis of nuclear DNA. 3. Intra- and interspecific variation of five Aegilops Sitopsis species // Theor. Appl. Genet.- 1996.- V.92.- P. 928934.
68. Savelkoul P.H., Aarts H.J., De Haas J., Dijkshoorn L., Duim B., Otsen M., et al. Amplified-Fragment Length Polymorphism Analysis // the State of an Art. J Clin Microbiol.- 1999.- V.37.- P. 3083 3091.
69. Schachermayr G., Feuillet C., Keller B. Molecular markers for the detection of the wheat leaf rust resistance gene LrlO in diverse genetic backgrounds // Mol. Breed.- 1997.- V.3.- №1.- P. 65-74.
70. Schachermayr G., Messmer M., Feuillet C., Winzeler H., Keller B. Identification of molecular markers linked to the Agropyron elongatum— derived leaf rust resistance gene Lr24 in wheat // Theor. Appl. Genet.-1995.- V.90.- №7-8.- P. 982-990.
71. Schachermayr G., Siedler H., Gale M.D., Winzeler H., Winzeler R.M. and Keller B. Identification and localization of molecular markers linked to the Lr9 leaf rust resistance gene of wheat // Theor. Appl. Genet.- 1994.- V.88.-№1,- P. 110-115.
72. Somers DJ, Isaac P, Edwards K. A hing-density wheat microsatellite consensus map for bread wheat (Triticum aestivum L.) // Theoretical and Applied Genetics.- 2004.- V.109.- P. 1105-1114.
73. Suman Sud, Navtej Singh Bains, Govinder Singh Nanda Genetic relationships among wheat genotypes, as revealed by microsatellite markers and pedigree analysis // J. Appl. Genet.- 2005.- V.46.- №4.- P. 375-379.
74. Swaminathan B., Matar G.M. Molecular Typing Methods. Diagnostic Molecular Microbiology // Principles and Applications. Washington: ASM Press.- 1993.-P. 26-50.
75. Syed Shahinshah Gilani, Tomohiro Ban and Zabta Khan Shinwari. Reconstruction of chromosomal inheritance in pedigree of Japanese wheat cultivars // Journal of Agricultural and Biological Science.- 2006. July.-V. 1.- №. 1. www.arpnjournals.com
76. Takumi S., Nasuda S., Liu Y.-G., Tsunewaki K. Wheat phylogeny determined by RFLP analysis of nuclear DNA. 1. Einkorn wheat // Japan. J. Genet.- 1993.- V.68.- P. 73-79.
77. Terachi T., Tsunewaki K. The molecular basis of genetic diversity among cytoplasms of Triticum and Aegilops. VIII. Mitochondrial RFLP analysis using cloned gene as probes // Mol. Biol. Evol.- 1992.- Vol. 9. P. 917-931.
78. Tsunewaki K. Cytoplasmic variation in Triticum and Aegilops // Proceed. 7th Intern. Wheat Genet. Symp. Kyoto.- 1988.- P. 53-62.
79. Wagenaar E. B. Studies of the constitution of Triticum timopheevi Zhuk. I. Evidence for genetic control of meiotic irregularities in tetraploid hybrids // Canad. J. Genet. Cytol.- 1961.- V.3.- №1.- P. 36-47.
80. Witcombe J. R. A guide to the species of Aegilops L // Rome: International Board for Plant Genetic Resources.- 1983.- 74 p.
81. Wolf G., Lerch B. Genome analysis in the Triticinae using isoenzymes of phosphodiesterase // Proceed. 4th Intern. Wheat Genet. Symp. Missouri.-1973.- P. 885-889.
82. Xu X.-Y., Bai G.-H., Carver B. F., Shaner G.E., Hunger R.M. Mapping of QTLs prolonging the latent period of Puccinia triticina infection in wheat // Theoretical and Applied Genetics.- 2005.- V.l 10.- №2.- P. 244-251.
83. Yogesh Vilcal, Parveen Chhuneja, Rippy Singh and H S Dhaliwal Tagging of an Aegilops speltoides Derived Leaf Rust Resistance Gene Lr 28 with a Microsatellite Marker in Wheat // J. Plant Biochemistry & Biotechnology.-2004.-V.l3.- P. 47-49.
84. Zietkiewicz E., Rafalski A. and Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification//Genomics.- 1994.- V.20.- P. 176-183.
85. Адонина И. Г., Салина Е. А. Механизмы изменчивости субтеломерных повтороы Spelt 1 в потомстве интрогрессивной линии Triticum aestivum L. х Aegilops speltoides Tausch // Генетика.- 2007.-Т.43,- № 4.- С. 567-569.
86. Бильданова Л.Л., Салина Е.А., Першина Л.А. Изучение беккросных потомков ячменно-пшеничных гибридов с использованием методов RAPD и RAMPO // Генетика.- 2002.- Т.38.- №3.- С. 332-339.
87. Вам дер Планк. Генетические и молекулярные основы патогенеза у растений. М.: Мир, 1981.- 236 с.
88. Гайнуллин Н.Р., Чичерин A.A., Лапочкина И.Ф. Использование SSR-маркеров для идентификации чужеродного материала в геноме мягкой пшеницы // Материалы школы молодых ученых «Экологическая генетика культурных растений». Краснодар.- 2005.- С. 285-287.
89. Галаев А. В., Бабаянц Л. Т., Сиволап Ю. М. Детекция интрогрессии элементов генома Aegilops cylindrica Host, в геном Triticum aestivum L. с помощью 1SSR- и SSR-анализа // Генетика.- 2004.- Т.40.- №12.- С. 1654-1661.
90. Гешеле Э.Э. Основы фитопатологической оценки в селекции растений. М.: Колос, 1978.- 53 с.
91. Губарева Н. К., Гаврилюк И. П., Чернобурова А. Д. Определение подлинности и чистоты семян пшеницы по электрофоретическому спектру глиадина (Методич. указания и каталог сортовых формул) //Л.: ВНИИР, 1975.-36 с.
92. Каминская Л.Н., Корень Л.В., Леонова И.Н., Адонина И.Г., Хотылева Л.В., Салина Е.А. Создание линий тритикале, маркированных Vrn-генамп, и их молекулярно-генетический анализ // Информационный вестник ВОГиС.- 2005.- Т.9.- №4.- С. 481-489.
93. Ш.Конарев А. В., Мигушова Э. Ф., Гаврилюк И. П., Конарев В. Г. О природе генома пшениц группы Т. timopheevii по данным электрофореза и иммунохимического анализа // Докл. ВАСХНИЛ.-1971,-№4,-С. 13-16.
94. Конарев В. Г. Белки растений как генетические маркеры. М.: Колос, 1983.-320 с.
95. Конарев В. Г., Гаврилюк И. П., Пенева Т. И. и др. О природе и происхождении геномов пшеницы по данным биохимии и иммунохимии белков зерна // С.-х. Биология,- 1976.- Т.П.- №5.- С. 656665.
96. Кудрявцев А. М., Внутрисортовая гетерогенность твердой пшеницы -важный компонент биоразнообразия вида // Генетика.- 2006.- Т.42.-№10.-С. 1437-1440.
97. Лапочкина И.Ф. Генетическое разнообразие коллекции «Арсенал» и ее использование в селекции пшеницы // Генетические ресурсы культурных растений: Тез. докладов. СПб.- 2001.- С. 133-135.
98. Лапочкина И.Ф., Волкова Г.А. Создание коллекции замещенных и дополненных хромосомами Aegilops speltoides Taush. линий яровой мягкой пшеницы // Гентика.- 1994.- Т.30.- С. 86-87.
99. Лебедев В. Б. Ржавчина пшеницы в Нижнем Поволжье // 1998.-Capa i овский государственный аграрный университет.- 295 с.
100. Мак Кей Дж. Род Triticum и его систематика // Вавиловское наследие в современной биологии. М.: Наука, 1989.- С. 170-185.
101. Малышев C.B., Войлоков A.B., Корзун В.Н., Бёрнер А., Картель H.A. Картирование генома ржи (Seeale cereale L.) с помощью молекулярных маркеров // Вестник ВОГиС.- 2005.- Т.9.- №4.- С. 473-480.
102. Мартынов С. П. Статистический и биометрико-генетический анализ в растениеводстве и селекции // Пакет программ AGROS 2.10.- 2000.-Тверь.
103. Метлпцкий JT.B., Дьяков Ю.Т., Озерецковская O.JI. Доклады АН УССР,- 1973.-№1,- 209 с.
104. Метлицкий JI.B., Озерецковская O.JI. Доклады АН УССР.- №1.-1976.-227 с.
105. Мпгушова Э. Ф. К вопросу о происхождении геномов пшеницы // Тр. по прикл. бот., ген. и сел.- 1975.- Т.55.- Вып. 3.- С. 3-26.
106. Михайлова JI. А. Генетика взаимоотношений возбудителя бурой ржавчины и пшеницы // С-Пб.: RIZO-печать ООО «Инновационный центр защиты растений».- 2006.- 80 с.
107. Михайлова JI. А. Структура популяций возбудителя бурой ржавчины пшеницы па территории СНГ V. Ареалы популяций и направления миграции спор // Микология и фитопатология.- 1996.- Т.ЗО.- вып.4.- С. 84-90.
108. Остерман Л.А. Методы исследования нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1981.-288 с.
109. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Генная и белковал инженерия. М.: Наука, 2004.- Т.1.- 525 с.
110. Салина Е. А., Шумный В. К. Молекулярно генетическое картирозание генома пшеницы: использование в селекциию // Генетика в XXi веке: современное состояние и перспективы развития. III съезд ВОГмС. Москва.- 6-12 июня 2004.- Т.1.- С. 80.
111. Урбапович О. IO., Малышев С. В., Долматович Т. В., Картель Н. А. Определение генов устойчивости к бурой ржавчине в сортах пшеницы (Tri Ii cum aestivum L.) с использованием молекулярных маркеров // Генетика.- 2006.- Т.42.- №5.- С. 675-683.
112. Хакимова А. Г., Гаврилкж И. П. Компонентный и антигенный состав глиаднна разных представителей Ае. squarrosa L // Тр. по прикл. бот., ген. и сел.- 1973.- Т.52,-Вып.1.- С. 193-205.
113. Щербаков В.1С. Использование индуцированного иммунитета в селекции растений. М. 1973.- 112 с.
114. Яаска В. Происхождение тетраплоидных пшениц по данным электроборетического изучения ферментов // Изв. АН ЭССР, Сер. Биол.- 1974.- Т.23.- №3.- С. 201-220.
-
Гайнуллин, Наиль Рифкатович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.15
- Генетический контроль устойчивости к грибным болезням у мягкой пшеницы с интрогрессиями от Triticum timopheevii Zhuk
- Изучение интрогрессивных линий Triticum aestivum L. для использования в селекции мягкой пшеницы
- Создание замещенных линий пшеницы с помощью чужеродного гена-маркера Нр ржи
- Сравнительное филогенетическое исследование полиплоидных пшениц Triticum dicoccum (Schrank) Schuebl., T.spelta L. и T.aestivum L. с использованием цитогенетических маркеров
- Потенциал гексаплоидных синтетических пшениц как источников устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе
