Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интенсификация процесса очистки нефтезагрязненных почв с использованием препарата "мелафен"

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Интенсификация процесса очистки нефтезагрязненных почв с использованием препарата "мелафен""

На правах рукописи

ЗАХАРОВА КОРНЕЛИЯ АНАТОЛЬЕВНА

ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОЦЕССА ОЧИСТКИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРЕПАРАТА «МЕ ЛАФЕН»

03.00.23 - Биотехнология 03 00.16- Экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

0031731ГЬ

Казань - 2007

003173176

Работа выполнена на кафедре химической кибернетики Казанского государственного технологического университета и в ОАО «Сибнефть-Ноябрьскнефтегаз» (г Ноябрьск)

Научные руководители доктор технических наук, профессор

Емельянов Виктор Михайлович

кандидат технических наук, доцент Шулаев Максим Вячеславович

Официальные оппоненты доктор технических наук, профессор

Ибатуллин Равиль Рустамович, Татарский научно-исследовательский и проектный институт нефти ОАО «Татнефть»

кандидат биологических наук Петров Андрей Михайлович, Центральная специализированная инспекция аналитического контроля Министерства экологии и природных ресурсов Республики Татарстан

Ведущая организация Казанский государственный университет

Защита состоится « 14 » ноября 2007 г в 14 00 часов на заседании диссертационного совета Д 212 080 02 в Казанском государственном технологическом университете по адресу 420015, г Казань, ул К Маркса, 68, зал заседании Ученого совета (А-330)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета

Электронный вариант автореферата размещен на сайте Казанского государственного технологического университета (www kstu ru)

Автореферат разослан 2007

года

Ученый секретарь диссертационного совета /— АС Сирогкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Предприятия добычи и транспортировки нефти являются основными источниками загрязнения почвы и водоемов нефтью и нефтепродуктами (НП) Влияние нефтяных загрязнений на почву проявляется в изменении ее физических, физико-химических и химических свойств, в торможении интенсивности биологических процессов

Суть восстановления загрязненных экосистем - максимальная мобилизация внутренних ресурсов экосистемы на восстановление своих первоначальных функций Рекультивация нефтезагрязненных земель - это ускорение процесса самоочищения, при котором используются все природные резервы экосистемы

Проблема очистки почв от загрязнений нефтью и НП приобретает все большую остроту в связи с ограниченностью возможностей, а иногда и экологической небезопасностью применения для этих целей ме<анических, физических и химических способов очистки В связи с этим актуальной является возможность использования микроорганизмов (МО), способных расти и проявлять активную биохимическую деятельность в среде с высоким содержанием нефтезагрязнений (НЗ), способных к биодеструкции этих веществ

Естественные процессы восстановления природных систем после нефтяного загрязнения весьма продолжительны по времени, а главными агентами их самоочищения являются аборигенные углеводородокисляющие микроорганизмы (УОМ) Стимулирование почвенной углеводородокисляющей микрофлоры биологически активными препаратами является одним из перспективных способов рекультивации

В зарубежных странах принято считать безопасным уровень содержания НП в почве 1 - 3 г/кг, начало серьезного экологического ущерба - при содержании 20 г/кг и выше В России предельно допустимая концентрация (ПДК) НП в почве составляет 1,5 г/кг, началом серьезного экологического ущерба является загрязнение почвы нефтью в концентрациях, превышающих 13 г/кг, т к при этих концентрациях начинается миграция НП в подпочвенные воды существенно нарушается экологическое равновесие в почвенном биоценозе

В данной диссертации исследована возможность препарата «Мелафен» стимулировать биологические процессы очистки нефтезагрязненных почв

Диссертационная работа выполнена в соответствии со следующими комплексными программами и исследовательскими проектами Грант РФФИ №!20460ФИ «Мелафен Новые области применения и механизм действия» (2007 - 2008), Договор Академии Наук Республики Татарстан №07-7 3 1/2005-2007 «Создание высокоэффективных препаратов для сельского хозяйства и ветеринарии» (2005 - 2007)

Цель н задачи исследований Целью настоящей работы являлось исследование процессов биодеструкции НЗ в различных типах почв и разработка биотехнологии рекультивации нефтезагрязненных почв, основанной на применении препарата «Мелафен», обеспечивающей минимизацию нагрузки на окружающую среду на территории нефтедобывающих предприятий

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи

3

- исследование стимулирующего действия препарата «Мелафен» на ин генси-фикацию процесса очистки различных типов нефтезагрязненных почв,

- определение оптимальных концентраций препарата «Мелафен», при которых наиболее эффективно проходит процесс очистки почв,

- определение концентраций НЗ, при которых наиболее эффективно происходят процессы их деструкции аборигенными почвенными МО в присутствии препарата «Мелафен»,

- исследование влияния препарата «Мелафен» на состав аборигенных углево-дородокисляющих культур МО,

- разработка технологии рекультивации нефтезагрязненных почв, основанной на применении препарата «Мелафен»

Научная новизна. Впервые исследован и апробирован препарат «Мелафен» для стимуляции микробной деятельности аборигенных УОМ при деструкции НЗ в почвах в лабораторном масштабе, а также в условиях промышленных испытаний Разработана и рекомендована к внедрению технология рекультивации нефтезагрязненных почв с использованием указанного препарата В настоящей работе впервые экспериментально показано стимулирующее действие препарата «Мелафен» на почвенную микрофлору с увеличением численности и повышением активности УОМ

Практическая значимость работы. Проведены промышленные испытания препарата «Мелафен» на территории Вынгапуровского месторождения ТПДН «За-полярнефть» ОАО «Сибнефть-Ноябрьскнефтегаз» (г Ноябрьск) Предложена биотехнология рекультивации нефтезагрязненных почв, метод рекомендован для внедрения на данном предприятии Применение разработанной биотехнологии позволит улучшить эффективность рекультивационных мероприятий на 20% При внедрении разработанной технологии экономический эффект составит 1245435 руб /год, по сравнению с применяемой в настоящее время технологией очистки почв с использованием препарата «Fyre-Zyme» («FZ»)

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались на I Всероссийской конференции «Актуальные проблемы защиты окружающей среды» г Улан-Удэ, 2004 г , IV творческой научной конференции молодых специалистов ОАО «Сибнефть-Ноябрьскнефтегаз», г Ноябрьск, 2004 г, Научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», г Казань, 2004 г , V Республиканской научной конференции «Акгуаль-ные экологические проблемы Республики Татарстан», г Казань, 2004 г, III Московском международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития», г Москва, 2005 г, Международной конференции «Проблемы биодеструкции загрязнителей окружающей среды», г Саратов, 2005 г, Девятой Международной конференции «Consoil 2005» г Бордо, Франция, 2005 г Материалы работы отмечены на Всероссийском конкурсе «Инженер года - 2006» медалью Лауреата I степени, г Москва, 2006 г

Публикации Основные положения диссертационной работы опубликованы в печати в 7 статьях, 5 тезисах докладов и 1 приоритетной заявке на патент

Структура и объем работы Диссертация изложена на 147 страницах ма-

4

шинописного текста, состоит из введения, 7 глав, заключения и библиографического списка, включающего 103 наименования Работа проиллюстрирована 42 рисунками и 30 таблицами Приложение занимает 6 страниц

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1(о введении обоснована актуальность работы, сформулированы цель и задачи и опредглены основные направления исследований, показаны научная новизна и практическая ценность работы

Первая глава содержит обзор литературы, в котором освещены способы борьбы с нефтяным загрязнением окружающей среды, рассмотрены методы очистки почв от НЗ, механизмы деструкции НЗ, приведен обзор биопрепаратов и ферментных препаратов, применяемых для ликвидации НЗ

Во второй главе представлены материалы и методы исследований На этапе лабораторных экспериментов в качестве объектов исследований выступали модельные почвенные образцы - подзолистые и торфяные почвы Западной Сибири и серые лесные почвы Республики Татарстан, в качестве НЗ - нефти Западной Сибири (Западно-Ноябрьское месторождение) и Татарстана (Ромашкинское месторождение)

На этапе опытно-промышленных испытаний биодеструкции НЗ в реальных условиях, в качестве объекта исследований выступала подзолистая почва Вынгапуровского месторождения, загрязненная в результате эксплуатации данного месторождения

Для возможности оценки влияния препарата «Мелафен» на процессы биодеструкции НЗ в почвах, в качестве препарата для сравнения, нами был выбран «рг», который в настоящее время широко применяется при рекультивации неф-тезагрязненных территорий на нефтяных месторождениях ОАО «Сибнефть-Ноябрьскнефтегаз»

«.YZ» - это продукт, образованный на основе сбраживания Сахаров, аминокислот, внеклеточных ферментов и биоэмульгаторов Основу препарата составляют ферменты - амилаза, каталаза, протеаза, лиаза В состав препарата «FZ» кроме ферментов входят простые и сложные сахара, протеин, аминокислоты, а также незначительное количество биоразложимых ПАВ

Синтетический препарат «Мелафен» - представляет собой меламиновую соль бис(оксиметил) фосфиновой кислоты (рис 1), не обладает ДНК-повреждающим, мутагенным, токсическим, гено-токсическим действием в диапазоне концентраций от 0,46 10"' М до 0,46 10"3 М Применяется в качестве регулятора роста и развития растений Концентрацию НЗ в почвенных образцах определяли в соответствии с ПНД Ф 16 I 2 2 22-98 «Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в почвах и донных отложениях методом ИК-спектрометрии»

Видовой состав почвенной микрофлоры определяли методом посева на соответствующие элективные среды

N42

гАм я

\ НОР(СН2ОН)2

Рис 1 - Структурная химическая формула активного вещества препарата (Мелафен»

В третьей главе представлены результаты лабораторных исследований процессов деструкции НЗ в подзолистых и торфяных почвах Западной Сибири в условиях низких концентраций НЗ (Снкч от 3 до 20 г/кг). Помимо исследований кинетики деструкции НЗ, определялась эффективность препарата «Р2».

Кривые кинетики деструкции НЗ в условиях самоочищения и в присутствии препарата «Р2», представленные на рис. 2, имеют схожий характер.

6

2. я г

время, суг. —деструкция ИЗ в условиях сам аоч истки - деструкция НЗ в присутствии

= £ 50СО

=г е-

ес ¡р

1

-деструкция ИЗ и усяовияхсамоочисзки ■деструкция НЗв присутствии г!

5 к

=Г £■ АООС -о

* ь 2000 --Й-

№ 20 30 40

Вргия. с/тг -деструхи^я Н3# условиях сэмеочиегки -деструкция ИЗ * присутствии Р2

Время, сут. — деструкция НЭ 8 условиях евмоа-ч истки ■Ш—деструкция НЗ 8 присутствии Р2

—деструкция НЭ в успоаиях самоочистки —Я—• деструкция НЗ в присутствии №

Рис. 2 — Кинетика деструкции нефтезагрязнений в подзолистых образцах почв: А — Снач- 20 г/кг; Ь-Снач= 15 г/кг; В-Снач=10 г/кг; Г-Снач=7 г/кг; Д-Снач-5 г/кг; Е-Снач=3 г/кг.

Анализ кривых кинетики деструкции НЗ показывает, что резкое уменьшение содержания ИЗ наблЕодается в первые 14 суток после загрязнения. Это объясняется мобилизацией естественной нефтеокисляющей почвенной микрофлоры. Внесение в почву нефти рассматривается как поступление субстрата для У ОМ,

20 40

Вр[:МЯ, С/Т

—леструш^я НЗ в условичк самосчис~л+ —Лвстру"1-^11 НЗ н прй^уктвии

ъ еооо

II

II ^ I

Далее кривые деструкции выходят на линейный участок (в течение 20 сут), что объясняется уменьшением субстрата и гибелью части МО С 34 по 50 сут наблюдается незначительное увеличение концентрации НЗ - вероятно это связано с отмиранием части МО из-за нехватки питательной среды По-видимому, в первые 20 сут эксперимента происходит утилизация легкоокисляемых фракций, т е предельных и непредельных линейных углеводородных структур Циклические соединения, входящие в состав нефти, относятся к микробиологически трудноокис-ляемым продуктам Поэтому остаточные концентрации трудноокисляемых фракций отрицательно влияют на жизнедеятельность МО Для более глубокой очистки необходима адаптация МО к ним и требуется более длительный период времени, что подтверждают результаты анализов на пятидесятые сутки эксперимента

Максимальное удаление НЗ в условиях самоочищения наблюдается в образцах с концентрацией НЗ 15 и 20 г/кг Кривая деструкции образца с концентрацией НЗ 10 г/кг наиболее стабильна и в конце исследуемого периода не происходит увеличения содержания НЗ Это дает основание сделать вывод, что концентрации НЗ 10 - 20 г/кг являются приемлемыми для самоочищения почв

Максимальный эффект от применения препарата «.¥7.» наблюдается при очистке почв с концентрацией НЗ 10-20 мг/кг

Анализ кривых кинетики деструкции НЗ в торфяных почвах представляется достаточно сложным Исследование показало, что на 28 сут эксперимента во всех торфяных образцах наблюдается большая деструкция НЗ, чем на 44 сут Это объясняется тем, что почвы с высоким содержанием органического вещества обладают сорбционным сродством к органике, кроме того, продуктами жизнедеятельности и лизиса клеток могут быть тоже органические соединения, которые могут давать вклад в общее количество НЗ

Также можно предположить, что увеличение содержания концентрации НЗ связано с увеличением содержания легких фракций органики, поскольку торф содержит сложные нативные органические соединения, которые разлагаются на более простые (линейные), а метод ИК-спектроскопии основан на регистрации спектров поглощения именно алифатических соединений

Для сравнения процессов биодеструкции НЗ в почвах различных климатических зон, в четвертой главе представлены результаты лабораторных экспериментов, которые проводились в два этапа На первом этапе исследовалось действие препарата «Мелафен» при очистке подзолистых почв Западной Сибири, загрязненных нефтью Западно-Ноябрьского месторождения, на втором этапе исследовалось действие препарата «Мелафен» при очистке серых лесных почв Республики Татарстан, загрязненных нефтью Ромашкинского месторождения

На каждом этапе исследовались почвенные образцы с концентрацией НЗ 20 и 40 г/кг Для определения зависимости действия исследуемого препарата от его концентрации, «Мелафен» применялся н виде раствора в различных концентрациях 10"4, 10"6, 10 8 г/кг почвы

В образцах подзолистых почв Западной Сибири (Снач = 20 г/кг) в течение 10 суток после внесения нефти во всех образцах наблюдалось резкое уменьшение

содержания НЗ (рис. 3), Это объясняется мобилизацией аборигенной нефте о кисля га щей почвенной микрофлоры из неактивного состояния при хранении почвы.

Под воздействием препарата «Мелафен», в течение 10 суток после загрязнения, содержание НЗ в почве снижалось в три раза быстрее, чем в необработанной препаратом почве. Это свидетельствует о том, что препарат «Мелафен» оказывает стимулирующее действие на естественную микрофлору в указанных концентрациях и ускоряет процесс бжшеградация нефти в почве.

-!? 20

—^ ■ >ч . .т;ч: >>., ... ! ц?; ппчш

■ЧК<*РУШ1П * Пр^тч-ьни ГТрсГИЙ^Т» ГЮ-1 Г.'и !

-Д11ЛП,ШИ 135 » Рр^утсщнм проори а: '1 11Г^ г.'^г) 1 ^ЗДЗУ^ШО ИЗ » г^нкут^ьми гтсчГгК*! л М^^ии Л г.'кг)

- деструкция КЗ н коьпрольном образце почвы

- Ю > присутствии препар&та Мь^^с н (I и-41/кг)

- деструкция НЗ в присутствии препарата : м { . : ; ¡V ;

- деструкция Ш & присутствии п;>'':-11 '

Рис. 3 - Кинетика биодеструкции нефтез агрязнсний и подзолистых образцах почв (СН1Ч = 20 г/кг)

Рис. 4 - Кинетика биодеструкции пефтезагрячнений в образцах серых лесных почв (С1гач= 20 г/кг)

При повторной обработке опытных образцов почв новыми порциями препарата «Мелафен», было отмечено дальнейшее снижение концентрации НЗ а контрольных и опытных образцах. При этом снижение концентрации НЗ в опытных пробах оказалось более чем в 2 раза эффективнее, чем в контроле. Препарат «Мелафен» подтвердил свое стимулирующее действие на МО почвы, хотя стимулирующий эффект оказался менее выраженным, чем & первые 10 суток,

Установлено, что в подзолистых почвах при Снач = 20 г/кг через 10 суток количество НЗ в почве без внесения препарата снизилось ¡1а 53% от первоначального, в результате биоремедиации - на 82%. причем разница в образцах с различными концентрациями препарата «Мелафен» незначительна. Через 20 суток снижение содержания НЗ я контроле составляло 82,5%, а в вариантах с концентрациями препарата 10"к г/кг, 10 й г/кг, 10"* г/кг составило 81,5%. 79,5%, и 80,0% соответственно. Через 30 суток содержание НЗ в модельных образцах снизилось до 93,8% в контроле, в варианте с концентрацией препарата 10'8 г/кг на 97,3%, а в вариантах с концентрациями препарата «Мелафен» 10'6 г/кг и 10^ г/кг составило по 96,9%.

Затем было проведено исследование действия препарата «Мелафен» на серые лесные почвы Республики Татарстан.

В образцах с концентрацией НЗ 20 г/кг, в течение 6 суток после внесения нефти наблюдалось резкое з'меньшение содержания НЗ (рис. 4). Наиболее существенное снижение концентрации НЗ наблюдалось для опытных образцов с нре-

паратом «Мелафен», внесенных в почву в количествах 10" и 10"6 г/кг

С 6 по 13 сутки продолжилось снижение содержания НЗ в почве, причем эффективность деятельности УОМ в контрольных и опытных образцах практически одинакова и составила 84 - 87%

Далее, на 17 сутки в опытные образцы почв повторно был внесен препарат «Мелафен», что инициировало дальнейшее активное снижение концентрации НЗ в них Таким образом, препарат «Мелафен» также подтвердил свое стимулирующее действие на МО почвы При этом следует отметить, что НЗ являлись доступным субстратом, стимулирующим почвенную микрофлору Установлено, что на 6 сутки эксперимента количество НЗ в почве без внесения препарата снизилось на 78 /о от первоначального, а в результате биодеструкции - на 87% Значительной разницы для опытных почвенных образцов с разными концентрациями препарата «Мелафен» отмечено не было Через 17 суток снижение содержания НЗ в контроле составило 92%, а в вариантах с концентрациями препарата 10'8 г/кг, 10 6 г/кг, 10"4г/кг составило 85%, 85,8%, и 89,1% соответственно Через 28 суток содержание НЗ в контрольном образце снизилось до 99,2%, в варианте с концентрацией препарата «Мелафен» 10"6 г/кг на 98,8%, а в вариантах с концентрациями препарата 10'8 г/кг и 10"4 г/кг составило по 99,39%

Как было отмечено выше, началом серьезного экологического ущерба является загрязнение почвы нефтью в концентрациях, превышающих 13 г/кг

На практике, при эксплуатации нефтяных месторождений, концентрация НЗ превышает этот показатель в десятки и сотни раз Основной разлив устраняется, как правило, механическими методами, но концентрация остаточного уровня загрязнения составляет 100 г/кг и выше

Считывая вышесказанное, были поставлены задачи по исследованию процессов деструкции высоких концентраций НЗ (20 - 100 г/кг) в подзолистых почвах Западной Сибири, определению и сравнению эффективности препаратов «Мелафен» и «Иг» в условиях данного эксперимента Результаты исследований преде гавлены в пятой главе С учетом проведенных ранее экспериментов, в настоящей серии исследований препарат «Мелафен» применялся в концентрациях 10"6 г/кг и 108 г/кг

На рис 5 представлены графики кинетики деструкции НЗ в исследуемых образцах

Сравнение кривых деструкции НЗ в концентрации 100 г/кг, представленных на рис 5а показывает, что максимальное снижение содержания УВ происходит в условиях самоочищения в первые 12 суток Затем происходит 2 резких скачкообразных увеличения содержания НЗ - с 12 по 22 сутки - на 27%, и с 40 по 54 сутки на 26% Это связано с отмиранием МО в результате токсического действия НЗ

Кривые, характеризующие действие препарата «Мелафен» в концентрациях 10"6 г/кг и 10"8 г/кг схожи В период с 18 по 77 сут для образца с «Мелафеном» (10 8 г/кг) происходит увеличение содержания НЗ, и дополнительное внесение препарата не приносит положительного результата Можно предположить, что такая концентрация препарата «Мелафен» слишком мала для успешной деструк-

ции НЗ в условиях данного эксперимента

С 42 по 54 сут в образце с препаратом «Мелафен» (10"6 г/кг) содержание У В незначительно увеличивается, однако дополнительное внесение препарата позволяет снизить уровень загрязнении до 20 г/кг Эффективность препарата «Мелафен» в концентрациях 10"6 г/кг и 10"8 г/кг составляет 69% и 58 % соответственно

Эффективность препарата «¥Ъу> составляет 56%, характер кривой ровный, без пиков, максимальная степень очистки достигается на 104 сутки эксперимента и составляет 69% Необходимо отметить, что в образцах с применением «¥7у>, после внесения препарата и увлажнения почвы происходит «остекление» - затвердевание и засыхание комочков почвы Аэрация таких почв затрудняется, дыхание почвы снижается и требуется дополнительное рыхление почвенных образцов

Анализ кривых, представленных на рис 56 показывает, что максимальное снижение содержания загрязнений происходит на 15 сутки эксперимента в контрольном образце и в образце с «Мелафеном» (10"8 г/кг) Степени очистки достигают 80 и 70% соответственно Затем в обоих образцах происходит резкое увеличение содержания НЗ до концентрации 55 г/кг Степени очистки в условиях самоочищения и с применением препарата «Мелафен» (10"8г/кг) одинаковы и составляют 63%

Кривые образцов с применением препаратов «FZ» и «Мелафен» (10"6 г/кг) одинаковы с 1 по 14 сут, далее в образцах с препаратом «Мелафен» (10"6 г/кг) происходит снижение концентрации НЗ, а в образцах с «FZ■» характер кривой становится волнообразным, возможно э го связано с «остеклением» образцов под воздействием препарата «¥2» Степень очистки в образцах с «¥Ху> - 59%, с «Мелафеном» (10"6 г/кг) - 62%

Анализ кривых на рис 5в указывает на схожий характер происходящих процессов в образцах с препаратом «Мелафен» в обеих концентрациях - наблюдается незначительное увеличение содержания НЗ в период с 25 по 40 сут, а затем дальнейшее уменьшение содержания НЗ до 18 г/кг в образцах с препаратом «Мелафен» (10'6 г/кг) Эффективность препарата «Мелафен» в данном эксперименте составляет 60% для обеих концентраций

Кривая деструкции НЗ для контрольного образца аналогична контрольным образцам при С„ач = 100 и 80 г/кг Степень эффективности - 64%

Кривая деструкции НЗ для образцов с «Б2» аналогична соответствующему образцу при Снач = 80 г/кг, эффективность - 44%

Максимальные степени очистки дня образцов с применением препаратов и «Мелафен» (в концентрациях 10 6 и 10"8 г/кг), представленных на рис 5 г, составляют 57, 61 и 54 % соответственно

Кривая деструкции НЗ в условиях самоочищения аналогична контрольным образцам при Скач = 100, 80 и 60 г/кг Степень эффективности составляет 67%

В период с 1 по 13 сут во всех образцах с Снач= 20 г/кг (рис 5д) происходит уменьшение содержания НЗ Максимум наблюдается в образце с препаратом «Мелафен» 108 г/кг на 35 сут и составляет 74% Степени эффективности для препаратов составляют - 54%, «Мелафен» 10'6г/кг - 57%, «Мелафен» 10"8 г/кг - 60%, в контроле - 56%

в естественных уедоиадч

® Присутствии прсппрата Í* и отсутствии npcttajMia Мсла^сн (ÍO-6r''icr:i п гршугствм» lyctapftT« Мс.-афси { 10-Srfor)

лктуукчкж 2 С és собственных увловик

двструюуи в присутствия нрегарата íi

ясструкцл 3Í3 л пр^утетвни прегярвч Мелофеч (1 o»fiir."«ti,

депруюс» 1U ■ Iiprtey нотами MenniJíH (lO-SrVtr),

2 2СХЗСО

3 I SOCO 3

í-

5 1<ХХО

£ soto

50 Bf*M*. «yr.

ISO

' JldCTJlVltl04l КЭ я (СТССГКШЧХ услоыоЧ " десШЮИ» НЗ * присутствии Гф-сгтарат* &

113 К rpvKVTtTKSlk ГфПНрат* Mí*H*HtltMjr.'W) —"— ,itci£JKii«JJ 3 вцриеу rt i ы|И i j^riptTí Ме.ифеи О Q-ftv'm I

Рис, 5 Кинетика деструкции лефтс-загрязнений в подзолистых образцах кочв;

А-С1Ж= 100 г/кг; b- C^=SD г/кг; В - Сшч = 60 г/кг; г - Сшч= 40 г/кг; Д-С,в„=20г/кг

Проведенные исследования позволили определить концентрации НЗ, при которых наиболее эффективно происходят процессы их деструкции аборигенными МО ;io4ü а присутствии исследуемых Препаратов: для препарата «l:Z» диапазон НЗ составляет 20 - 40 г/кг, при этом эффективность очистки достигает 62%; для препарата «Мелафен» (10 ■ г/кг) максимальный показатель эффективности -78% достигается в условиях сильного загрязнения почв при С„ач = 100 г/к г.; для препарата «Мелафен» (10's г/кг) максимальный показатель эффективности - 68% набл юдается и образце с Снач = 20 г/кг.

Также результаты исследований показывают, что применение препарата «Мелафен» (в концентрации 10'6 г/кг почвы), в сравнении с условиями самоочищения, позволит увеличить эффективность деструкции НЗ в среднем на 29%;

применение препарата «FZ» - на 19%

На каждом этапе лабораторных экспериментов проводили исследование состава почвенных УОМ В третьей главе анализ общей численности УОМ в контрольных и опытных образцах почв осуществляли посевом на агаризованную питательную среду, по минеральному составу соответствующую среде Чапека

Выросшие колонии рассматривали невооруженным глазом, при этом были отмечены основные морфологические и культур,шьныв признаки

Выявлено, что в различных почвенных образцах присутствуют как специфичные только для данного типа почв УОМ, так и типичные для подзолистых и торфяных почв МО

В дальнейшем в качестве посевного материала для выделения чистых культур УОМ, из всех почвенных образцов были отобраны наиболее ярко выраженные культуры МО На 4 сут пос не посева выросли исследуемые образцы

Идентификацию родов УОМ осуществляли по морфологическим признакам при микроскопировании (использовался иммерсионный объектив) Были идентифицированы следующие рр Bacillus, Pénicillium, Micrococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodobacter, Mycobacterium, Nocardia и Thermomono-spora Нужно отметить, что торфяные почвы оказались гораздо богаче по родовому составу Все перечисленные рода были обнаружены в образцах с торфяной почвой, а в подзолистых почвах обнаружены лишь рр Bacillus и Pseudomonas

Результаты этих исследований были подтверждены и при испытании «Ме-лафена» на подзолистых почвах Западной Сибири Были идентифицированы рр Bacillus и Pseudomonas Однако также были обнаружены рр Micrococcus, Fusarium и Pénicillium, что, как можно предположить, связано со стимулирующим действием препарата «Мелафен»

При исследовании процессов биодеструкции НЗ в серых лесных почвах Республики Татарстан, определение колониеобразующих единиц (КОЕ) показало, что при концентрации НЗ 20 г/кг, стимуляция микробной деятельности наиболее выражена для углеводородокисляющих бактерий и аэробных гетеротрофов Стимулирование микробной активности актиномицетов и микромицетов не выявлено, что связано с их подавлением почвенной микрофлорой в условиях конкуренции за субстрат

В случае недоступности субстрата для бактерий, при внесении нефти в почву в количестве 40 г/кг, мицелиальные МО получают преимущество, что связано с их развитым ферментативным аппаратом, способностью использовать труднодоступный для биодеградации субстрат и обеспечивать собственное развитие

При проведении исследований очисгки почв Западной Сибири от НЗ в диапазоне концентраций 20 - 100 г/кг были идентифицированы различные физиологические группы нефтеокисляющих МО при концентрациях НЗ 20 и 100 г/кг Данные представлены в таблицах 1 и 2 соответственно

Таблица 1 - Физиологические группы микроорганизмов подзолистых почв при концентрации нефтезагрязнений 20 г/кг____

Варианты Опыта Аэробные гетеротрофные бактерии млн*КОЕ/г Углеводород-окисляющие бактерии, млн*КОЕ/г Спорообразуюшие бактерии тыс'КОЕ/г Микроскопические грибы, тыс* КОЕ/г Актиномицеты, тыс*КОЕ/г

Подзолистые почвы (фон) 0 390 0 178 0 500 Bat illus mycoidi's Bacillus polvmyca 0 '|00 1 000 р Mycobacterium

Подзолистые почвы + Нефть 0 490 0 030 48 000 Bacillus mycoidts 0 500 р РетсШпип 1 000 р Mycobacterium

Подзолистые почвы + «FZ» 0310 0 038 17 000 Bacillus mycotdiS 1 000 р РетаИшт

Подзолистые почвы + «Мелафен» Ш^г/кг 1 030 0 152 8 500 Вас illus mycoides 12 000 р РетаИнип -

Подзолистые почвы + «Мелафен» 10 !г/кг 0 520 0 229 43 600 Bacillus polymyxa Bacillus megaterium -

Таблица 2- Физиологические группы микроорганизмов подзолистых почв при концентрации нефтезагрязнений 100 г/к!__

Варианты опыта Аэробные гетеротрофные бактерии, млн*КОЕ/г Углеводорол-окисляющие бактерии, млн*КОЕ/г Спорообразующие бактерии, тыс*КОЕ/г Микроскопические грибы, тыс*КОЕ/г

Подзолистые почвы + Нефть 0 560 0 046 0 200 Bacillus mycotdes Bacillus megalerium 0 500 p Pénicillium

Подзолистые почвы +■ 0 140 0 023 0 750 Bacillus mycotdes 1 000 p Pénicillium

Подзолистые почвы + «Мелафен» Ю^г/кг 0 630 0 240 0 450 Bacillus mycotdes 1 000 p Pénicillium

Подзолистые почвы + «Мелафен» 10 "г/кг 0 340 0 067 48 000 Bacillus polymyxa 0 500 p Aspergillus

В сравнении с образцами с С„ач= 20 г/кг, в образцах с Снач= 100 г/кг отмечено значительное уменьшение численности различных физиологических групп МО, за исключением спорообразующих бактерий и микомицетов, которые устойчивы к высоким концентрациям НЗ Их количество уменьшилось незначительно При концентрации НЗ 100 мг/г актином и центы обнаружить не удалось

Увеличение бактерий и микромииегов, в условиях высокой степени загрязнения почв, объясняется наличием большого количества органики для гетеротрофного питания и отсутствием ароматических УВ, определяющих токсичность нефти по отношению к МО

Выделенная микобиота характеризуется преобладанием пенициллов По-видимому, микромицеты Aspergillus и Pénicillium являются устойчивыми к антропогенным воздействиям и надежным биоиндикационным показателем неблагополучного экологического состояния почв

Среди аэробных гетеротрофных и углеводородокисляющих бактерий идентифицированы Ps fluorescens на среде Кинга Известно, что бактерии р Pseudomonas играют особую роль в процессах биодеструкции НЗ в почвах в естественных условиях

Таким образом, показано, что нефтяное загрязнение почв изменяет численность отдельных групп МО за счет угнетения одних и стимулирования других, что отражается на равновесии в почвенном биоценозе

Из литературы известно, что «Мелафен» в сверхнизких концентрациях не оказывает влияния на каталазную активность почвы Другой важной характеристикой трансформации органического вещества и вовлечения труднодоступных форм углерода в биологический круговорот является проявление целлюлозоли-тической активности в почве Установлено, что «Мелафен» не проявляет ни положительного, ни отрицательного влияния на активность почвенной целлюлазы Этим можно объяснить большую численность УОМ и аэробных гетеротрофных бактерий в почвенных образцах с использованием препарата «Мелафен» в концентрациях 10"8 - 10"*3 г/кг

Из исследований других авторов известно, что с агрономической точки зрения одним из наиболее значимых процессов, осуществляемых почвенными МО, является процесс биологической фиксации азота, интерес к которому обусловлен его важной ролью в азотном балансе природных экосистем Препарат «Мелафен» в интервале концентраций 10"6 -10"7 % (масс ) не оказывает отрицательного воздействия на ферментативную активность почвы, а в некоторых случаях способствует незначительному повышению активности ферментов (уреазы, протеазы и нитрогеназы), участвующих в круговороте азота По-видимому, с эти фактом связано увеличение численности микромицетов в почвенных образцах с применением препарата «Мелафен» в концентрациях 10"8 - 10"6 г/кг

В настоящее время нет точных данных о механизме влияния препарата «Мелафен» на живую клетку. Известно, что АТФ выполняет субстратную функцию в живой клетке, поставляя энергию для активного транспорта молекул и ионов, биосинтеза макромолекул и др В настоящее время убедительно показано, что АТФ играет не только субстратную роль, но и в очень малых концентрациях выполняет сигнальную функцию, усиливая передачу сигналов через рецепторы АТФ на внешней мембране клеток, в частности, сигналов к росту и делению

Запуск генетических программ, как показано в литературе, может осуществляться специфическими химическими и физико-химическими факторами

Вполне возможно, что «Мелафен» относится к тем специфическим химическим факторам, способным в сверхнизких концентрациях регулировать рост клетки Можно предположить, что «Мелафен» действует подобно АТФ при контакте с внешней мембраной клеток и вызывает усиление роста и деления

Убедительным доказательством такого предположения являются данные о

влиянии различных концентраций «Мелафена» на величину удельного тирозино-вого фосфорилирования белков растений Авторы приходят к заключению, что «изменение удельного тирозинового фосфорилирования белков препаратом «Ме-лафен» свидетельствует о его высокой эффективности в регуляции метаболизма клеток растений тирозинкиназной сигнальной системой» Так же тирозиновое фосфорилирование белков участвует в процессах роста и дифференцировки клеток животных Результаты исследований этих авторов дают весомое основание предполагать инициирующую роль фосфиновой группы молекулы «Мелафена», подобно фосфорным группам молекулы АТФ, для «запуска» каскадного механизма усиления биологического сигнала

В связи с вышеизложенным, можно предположить, что в настоящей работе эффев ты низких концентраций препарата «Мелафен» могли быть вызваны активацией сигнальных систем клеток почвенных МО

Итак, полученные нами результаты позволяют предположить, что «Мелафен» оказывает влияние на увеличение скорости энергетических процессов клеток почвенных МО Дополнительная энергия, образованная при триггерном действии «Мелафена» на клетку, является основой ускорения метаболических процессов

Предварительные серии лабораторных экспериментов послужили основой для проведения опытно-промышленных испытаний, результаты которых пред-ставле-ны в шестой главе В качестве объекта исследования выступали подзолистые почвы 3-х исследуемых участков.

1 участок — контрольный, незагрязненный нефтью участок, площадь участка

1 м2,

2 участок — загрязненный нефтью участок для исследования деструкции НЗ в естественных условиях, площадь участка 1 м2,

3 участок - загрязненный нефтью участок для исследования деструкции НЗ с применением препарата «Мелафен» в концентрации 10"6 г/кг почвы, площадь участка 1 м2

Продолжительность эксперимента составила 85 дней На протяжении всего эксперимента контролировалась среднесуточная температура окружающей среды, среднее значение составило +15°С Полученные результаты, представлены на рис 6 Начальное содержание НЗ на 2 и 3 участках составило 94,64 г/кг На участках 2 и 3 уменьшение содержания НЗ в период с 1 по 20 сутки эксперимента связано с физико-химическими явлениями и мобилизацией естественной нефтео-кисляюще почвенной микрофлоры - аэрация снижает дефицит кислорода и разрушает гидрофобную пленку поверхностных нефтяных компонентов, тем самым ускоряя физико-химическую и микробиологическую деструкцию НЗ, улучшается дыхание почвы, происходит интенсификация процессов микробиологического окисления НЗ На участке 3 под действием препарата «Мелафен» деструкция НЗ происходит более интенсивно

Среднее значение степени эффективности очистки в естественных условиях за весь период эксперимента составило 56,66%, применение препарата «Мела-

фен» увеличивает этот показа тел I. до 76.37%. На 85 сутки эксперимента разница в степенях очистки составила 28,15%.

Таким образом, полученные данные подтверждают биостимулирующее действие препарата «Мелафен» на процесс биодеструкции НЗ в почвах.

На основании проведенных полномасштабных лабораторных исследований и опытно-промышленных испытаний бы па разработана биотехнология рекультивации нефтезагрязненных почв с применением препарата «Мелафен» (рис. 7).

При разработке технологической схемы придерживались следующих принципов:

- экологическая безопасность - чрезвычайно низкие концентрации препарат «Мелафен» полност ью утилизируются в природной среде;

- эффективная очистки почв в широком диапазоне концентраций НЗ;

- стимулирующее: действие препарата на высшие растения способствует проведению фитомеяиорацин нарушенных земель, как заключительного этапа рекультивации нефтезагрязненных почв;

- простота ведения технологического процесса и обслуживания оборудования;

На предварительной стадии механической очистки нефтезагрязненных почв удаляется основная часть НЗ путем сбора НЗ и сгребания Неф-тезагрязненного грунта на предусмотренные площадки-поли-гоиы. Затем производится раскорчевывание загрязненных площадей и первичное дискование. Целью технической рекультивации является приведение земель в состояние, пригодное для последующего проведения биологического этапа рекультивации.

После технического эта.па рекультивации осуществляется биологический этап. Целью биологического этапа является восстановление плодородия нарушенных земель и растительного покрова. Учитывая специфику нефтедобывающих предприятий и удаленность месторождений нефти от населенных пунктов, в данной схеме предусмотрено приготовление раствора препарата «Мелафен» производить на территориях технологических баз в бетономешалках, а затем готовый раствор с помощью насоса перекачивать в цистерны КАМАЗа (КРАЗа) и транспортировать к месту ликвидации последствий нефтсрозливов.

Внесение раствора препарата осуществляется поливом соответствующих территорий при помощи водополивйчной машины ВМ 12. Далее, для аэрирования и обеспечения доступа кислорода в низ л ежащие почвенные слои, производят

- минимизация эксплуатационных за трат.

Врет суг.

-М - фо.1

—*—двег£(укц№1 НЗ д —в—досгсчщия НЗ в ","стлрелаоэггз'

Рис. б Кинетика биодеструкции нефтезагрк^-неннй в подзолистых почвенных образцам

боронование (рыхление) почвы в один ¡-лед, с использованием бороны дисковой тяжёлой БДТ-3, которая агрегатяруется с ДТ-75 + ШТН4-3'>,

Через 10 суток необходимо проводить повторную обработку нефтезагрязненных территорий раствором препарата, каждыг 14 суток - бороновать.

Для контроля и прогнозирования процесса деструкции НЗ рекомендуется проводить аналитический контроль нефтеза грязненных почп.

Приготовлений расгчюра Ирг«эзтя ^-—РлЛлин (дек^рата

щ

^ , -си-1 —,-

^(ЙащйЧу^кдС у.Ш:-кли; нифгсрры 1га ОГ>рзбогна |Ячпы рисгиером Ньг^тен!^ гючны

РиС. 7 - Схема технологии рекультивации Всфтезагрязненных почв с применением препарата «Мелафен».

Выводы:

1. Установлено, что исследуемые подзолистые почвы способны к самоочищению благодаря деятельности нативных почвенных МО -деструкторов нефти. Также показднй, ч-то МО саосс&иы к «реабилитации» после разового загрязнения почв нефтью.

2. Изучена кинетика био деструкции НЗ в подзолисты« почвах Западной Сибири и серых лесных почвах Республики Татарстан, обработанных препаратом «Мелафен». Выявлено, что препарат «Мелафен» обладает стимулирующим действием на аборигенную микробиоту, при этой НЗ подвергались успешной биоле-стрУКЦИИ практически без предварительной адаптации МО.

3. В коде пабораторнык исследований прошгеоэ. бкорси.еукатай почвы проанализирована зависимость утилизации НЗ почвенной микрофлорой от концентрации препарата «Мелафен». Показана, что применение данного препарата в концентрации 10"6 г/кг наиболее эффективно.

4. Результаты лабораторных экспериментов свидетельствуют о достаточно быстрой утилизации препарата «Мелафен» почвенными МО и процессе биодест-рукпии НЗ в почвенных образцах в течение 10 суток. В ходе экспериментов не отмечено способности данного препарата, модулировать повышенную биологическую активность, поэтому требуется его постоянное внесение в почву каждые 10 суток для поддержания высокой микробной активности почв-

5. Определены концентрации НЗ, при которых процессы их биодеструкции в почвах происходят наиболее интенсивно. Преимуществом «Мелафена» перед «К» является возможность его использования для рекультивации почв в условиях больших концентраций НЗ. Экспериментально установлено, что эффективное применение препарата «РХ» возможно ери концентрациях НЗ в почвах до 40 г/кг,

при этом степень очистки достигает 62%, эффективность препарата «Мелафен» показана в более широком диапазоне концентраций НЗ, вплоть до 100 г/кг (78%)

6 Применение препарата «Мелафен» для биодеструкции НЗ в сравнении с естественными условиями очистки почв, увеличивает эффективность очистки в среднем на 30% и позволяет сократить сроки рекультивации на 5 суток

7 Исследован состав нефтеутилизирующих МО почвенных образцов Выявлено, что в процессах утилизации НЗ участвуют различные УОМ В качест ве доминирующих определены следующие рр . Bacillus, Penicillium, Micrococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Acmetobacter, Rhodobacter, Mycobacterium, Nocardia и Thermomonospora

8 Впервые экспериментально показано стимулирующее действие препарата «Мелафен» на процессы биодеструкции НЗ в почвах, что подтверждается увеличением численности почвенных УОМ в образцах с использованием «Мелафена», по сравнению с другими исследуемыми образцами

9 Предложена технологическая схема биорекультивации нефтезагрязнен-ных почв с применением препарата «Мелафен», позволяющая увеличить эффективность деструкции НЗ на 25 - 30%

10 При внедрении предложенной технологии годовой эколого-экономический эффект составит 292636,95 тыс руб Экономический эффект с учетом капитальных и эксплуатационных затрат составит 1245435 руб /год, по сравнению с применяемой в настоящее время технологией очистки почв

Основное содержание диссертации изложено в публикациях:

1 Захарова К А Исследование очистки почв Западной Сибири с помощью ферментных препаратов/Захарова К А , Шулаев М В , Емельянов В М // Актуальные проблемы защиты окр среды Матер I Всероссийской конфер - Улан-Удэ Изд-во ВСГТУ, 2004 - с 130-134

2 Захарова К А Исследование биорегенерации почв Западной Сибири с помощью ферментных препаратов/ Захарова К А , Шулаев М В , Емельянов В М // Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии 2004 Матер научн конфер. Казань 17-18 июня 2004 г / Под ред Р ГВасилова - М МАКС Пресс, 2004 с 100-101

3 Захарова К А Исследование родового состава аборигенных нефтеутилизирующих микроорганизмов в песчаных и торфяных почвах/ Захарова К А , Шулаев М В , Емельянов В М //Актуальн экол пробл РТ Матер V Республ научн конф Казань, 7-9 дек 2004 г - Казань Отечество, 2004 -с 157-158

4 Захарова К А Исследование очистки почв Западной Сибири с помощью ферментных препаратов/ Захарова К.А., Шулаев М В , Емельянов В М // V спехи в химии и химической технологии Сб науч тр Том XVIII, №6(46) У'?8 М РХТУ им Д И Менделеева, 2004, с 33-35

5 Захарова К А Исследование биологической очистки почв от нефтеэагряз-нений с применением препарата "Fyre-Zyme'V/MaTep IV творческой конф молодых специалистов ОАО «Сибнефть-Ноябрьскнефтегаз» Ноябрьск, 23 - 24 апр

2004/Под общ ред С Ю Русакова, В Л Кузнецова -Ноябрьск ЗАО ИД «Благовест», 2004 с 124-128

6 Захарова К А Исследование биотехнологии очистки почв аборигенными культурами в присутствии ферментных препаратов/ Захарова К А , ШулаевМВ , Шагинурова ГИ , Емельянов В M//Биотехнология состояние и перспективы развития Матер Ш Московского междунар конгр (Москва 14 - 18 марта 2005 г)-М ЗАО «Экспобиохимтехнологии», РХТУ им Д ИМенделеева, 2005 — ч 2 -с 25-26

7 Захарова К А Стимулирование микробной деятельности почвенных микроорганизмов в процессах биоремедиации/ К А Захарова, МВЛ1улаев, С Г Фаттахов, А С Сироткин, Г И Шагинурова, M M Шулаева// Проблемы биодеструкции загрязнителей окружающей среды Матер конф / Междунар конф Саратов Изд-во Научная книга, 2005 - с 102-103

8 Zakhrova К A Research of native oil utilizing microoiganisms genus structure m sandy and peat soils/ К A Zakhrova, M V Shulaev, VM Emelianov// Consoil 2005 Proceeding of the 9th International FZK/TNO Conference on Contaminated Soil Abstract Bordeaux, Fiance, 3-7 Oct2005 p 1772- 1774

9 Захарова К А Способ биологической очистки почв от пефтезагрязнений/ МВШулаев, С Г Фаттахов, К А Захарова, В С Резник, M M Шулаева, А ИКоновалов, О Г Синяшин//Приоритетная заявка № 2007130925 от 13 08 07 г

10 Захарова К А Деструкция неф гезагрязнений в торфяных почвах Западной Сибири/ К А Захарова, И И Бикчурин, ВМ Емельянов, M ВШулаев// Вестник Архангельского гос техн ун-та Серия «Прикладная геоэкология» Вып70 Архангельск Из д-во АГТУ, 2007 - с 51 -60

11 Захарова К А Исследование биодеструкции нeфтeîaгpязнeний в подзолистых почвах Западно-Сибирского региона в естественных условиях и с применением препарата «Fyre-Zyme»/ К А Захарова, И И Бикчурин, В M Емельянов, M ВШулаев//H ТЖ Нефтепромысловое дело -М ВНИИОЭНГ, 2007 -№10 -С 64-70

12 Захарова К А Исследование биотехнологии очистки почв от нефтезаг-рязненийс использованием препарата «Fyie-Zyme»/Захарова К А ,МоисеевВВ , ШулаевМВ , Емельянов В M Л Вестник Казанского технологического университета, 2007 -№3-4 -С 185-190

13 Захарова КА Исследование биодеструкции нефтезагрязнений в подзолистых почвах Западной Сибири под воздействием препаратов «Мелафен» и «Fyre-Zyme»/ Захарова К А , Моисеев ВВ , Шулаев M В , Емельянов ВМ // Научный журнал Вестник Казанского ГАУ, 2007 -№1 -С 60-65

Соискатель

Заказ № _Тираж/Й^кз

Офсетная лаборатория Казанского государственного технологического университета 420015, г Казань, улК Маркса, 68