Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Интегрины бета 2 и бета 6 - новые маркеры альвеолярных клеток типа II

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Интегрины бета 2 и бета 6 - новые маркеры альвеолярных клеток типа II"

На правах рукописи

Мухаметшина Регина Талгатовна

ИНТЕГРИНЫ БЕТА 2 И БЕТА 6 НОВЫЕ МАРКЕРЫ АЛЬВЕОЛЯРНЫХ КЛЕТОК ТИПА

Н

03.01.04 -биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

¿8 АВГ

2014

005552043

Казань-2014

005552043

Работа выполнялась в Казанском (Приволжском) федеральном университете (г. Казань, Россия) и в Институте исследований сердца и легких им. Макса Планка (г.Бад-Наухем,

Германия).

Научные руководители:

д.б.н., проф.

Багаева Татьяна Вадимовна д.б.н., РЬБ., Гильермо Баррето

Официальные оппоненты: д.б.н., проф., ведущий научный сотрудник лаборатории Окислительно-восстановительного метаболизма КазНЦ РТ- Каримова Фатима Габдуллазяновна

к.б.н., заведующий отделом культивирования и идентификации вирусов Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИД

иинфекционными заболеваниями - Уразов Наиль Гумерович Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр токсикологической радиационной и биологической безопасности»

Защита диссертации состоится «25» сентября 2014 в 13.00 часов на заседании диссертационного совета при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный Университет» по адресу: г. Казань, ул. К.Маркса, 74. В зале заседания ученого совета.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им.Н.И.Лобачевского ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: г.Казань, ул. Кремлевская, 35.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» \v\vw.kpfu.ru

2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

д.б.н., профессор

З.И.Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важную роль в нормальном функционировании и восстановлении поврежденных легких выполняют эпителиальные клетки, в том числе, альвеолоциты II.

Повреждения альвеолоцитов II типа нарушает транспорт ионов, что препятствует оттоку жидкости из альвеолярного пространства (Modelska et al.//American Journal of Physiology. 1999.-P.844-857). Поскольку клетки АТП способны к дифференцировке в альвеолоциты I типа, их повреждение препятствует процессу восстановления целостности альвеолярной стенки. Нарушение структуры альвеолярного эпителия приводит к обнажению базальной мембраны, и на ней образуются волокна фибрина, что приводит к образованию «гиалиновых мембран» (Nishioka et al.//The Journal of Medical Investigation. 2013,- V. 60,- P.175-183). Тяжелое повреждение альвеолярного эпителия и нарушение его репарации приводит к легочному фиброзу (Войтковская и др.// Вестник клиничкской медицины,- 2012,- Т.5.- С.60-62). Кроме того, альвеолоциты II синтезируют сурфактант. Это комплекс веществ, состоящий из фосфолипидов и специфических сурфактант-ассоциированных белков. Он выполняет многие функции: стимулирует фагоцитоз альвеолярных макрофагов, стабилизирует альвеолоциты, агрегирует бактерии и вирусы, снижает темпы развития системной воспалительной реакции. Однако главной функцией сурфактанта является предотвращение полного коллапса альвеол в период выдоха, что обусловлено его способностью создавать поверхностное натяжение в легких (Puligandla, The Journal of Applied Physiology, 2000,- V.88.- P.1061-1071). Нарушение синтеза сурфактанта приводит к тяжелым формам заболеваний легких, в том числе, синдрому острого повреждения легких, острому респираторному дистресс-синдрому, включающим тяжелый острый респираторный синдром, муковисцидоз и идиопатический фиброз легких.

В 1977 году Мейсон и Уильяме разработали концепцию альвеолярных клеток типа II (ATII), как клеток защитников альвеол (Mason et al.// Federation proceedings. 1977,- V. 36. - P. 2697-2702.). Их способность к синтезу сурфактанта, участие в регуляции баланса альвеолярной жидкости, коагуляции/фибринолиза, дифференцировка в клетки ATI и способность к удалению апоптотических ATII клеток путем фагоцитоза, способствуя тем самым восстановлению эпителия, полностью соответствует данной концепции. Кроме того, клетки ATII могут функционировать в легких в качестве иммунорегуляторных клеток (Fehrenbach et al//Respiratory Research, 2001,- V. 2. - P. 33-46).

Интерес, проявляемый исследователями разных стран к альвеолярным клеткам, связан также с их возможной ролью в качестве стволовых клеток. Роль стволовых клеток многообразна. Они являются основой для формирования различных тканей и органов, способны к активному росту и размножению. В работе Кима с соавторами (Kim et al.// Cell. 2005. V.121. - P. 823-835) было отмечено, что базальные клетки, «клетки Клара» вместе с альвеолярными клетками типа II могут быть первичными стволовыми клетками эпителия легких.

В литературе имеются данные о процентном соотношении некоторых из изученных типов клеток легких, так - эпителиальные клетки типа I составляют 8% клеток от общего количества; 16% приходится на долю ATII и ATI клеток; эндотелиальные клетки капилляров, составляют 30% клеток легких; на клетки интерстициального пространства приходится 37%, а количество альвеолярных макрофагов варьирует. Сравнение межвидовой характеристики клеток в альвеолярной области легких людей и крыс в норме показало, что процентное содержание клеток, их средняя толщина, размер и площадь занимаемой поверхности, было

относительно постоянным у исследованных организмов (Сгаро et al.//The American review of respiratory disease. 1982,- V. 126. - P. 332-337).

Для характеристики различных типов клеток необходимы специфические молекулярные маркеры, которые позволяют контролировать и идентифицировать происходящие в структуре легких процессы, выяснять механизмы взаимоотношений между различными типами клеток, идентифицировать присутствие стволовых клеток или возможность возникновения тяжелых заболеваний.

Поиск специфических маркеров, которые могут быть использованы для сортировки и обогащения, определенных субпопуляций клеток, в том числе, альвеолярного типа П (ATII), является актуальной задачей, решение которой позволит получить новые данные о функционировании данных клеток в легких, выяснить структурные и функциональные особенности их белков, участвующих в различных физиологических процессах.

В настоящее время определены уникальные молекулярные маркеры для некоторых типов клеток легких, например, альвеолярные клетки типа I - имеют маркер Tla (Williams// The Annual Review of Physiology. 2003. V. 65. - P. 669-695), для альвеолярных клеток II типа используется сурфактантный белок-С (Fehrenbach, Respiratory Research. 2001.- V. 2. - P. 33-46), белок CCSP - маркер клеток Клара (Kim et. al.// Cell.- 2005,- V. 121.-P.823-835), однако, для большинства клеток специфические маркеры еще не найдены.

Цель работы - поиск новых поверхностных маркеров альвеолярных клеток типа II и выяснение их участия в отдельных физиологических процессах, протекающих в клетках. Основные задачи исследования:

1. Выделить суммарную фракцию специфических белков, характерных для клеток ATII, и определить в их составе наиболее активно экспрессирующиеся интегрины;

2. Установить принадлежность и внутреннюю локализацию наиболее активно экспрессирующихся интегринов;

3. Исследовать популяцию клеток АТИ цитометрическим методом, с использованием специфических антител для выбранных интегринов

4. Доказать возможность использования специфических антител в качестве маркеров клеток ATII;

5. Выявить физиологическую значимость выбранных интегринов в газообмене, в дифференцировке клеток и других процессах.

Положения, выносимые на защиту:

• Интегрины бета- 2 и бета- 6 являются специфическими маркерами альвеолярных клеток типа И;

• Интегрин бета- 2 функционально значим для нормального функционирования легких, влияя на процесс газообмена легких и принимая участие в опосредованной негативной регуляции Wnt сигнализации.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что в составе клеток альвеолярного типа П, имеются мембранные белки, которые специфичны для клеток данного типа. Установлено, что два белка, а именно интегрины бета-2 и бета-6, могут быть использованы в работах с клетками легких, в качестве маркеров.

Впервые доказано наличие в легких мыши двух различных субпопуляций клеток АТП, содержащих в своем составе интегрины бета-2 и бета-6.

Впервые установлено, что интегрин бета-2 физиологически значим в организме животного. Так, его отсутствие приводит к нарушениям нормального газообмена легких.

Кроме того, получены приоритетные данные о функциональной связи клеток ATII с Wnt-сигнализацией. Доказано, что интегрин бета-2 принимает участие в опосредованной негативной регуляции Wnt сигнализации клеток, т.е. он влияет на процесс эмбриогенеза, дифференцировки клеток и другие процессы.

Практическая значимость работы. Выявленные нами новые, специфичные, поверхностные маркеры (интегрины бета-2 и бета-6) позволят увеличить возможности получения обогащенной однородной популяции клеток АТП типа, изучение которых расширит наши знания в области функционирования данных клеток в организме.

Интегрины бета-2 и бета-6 могут быть использованы в качестве диагностических белков, характеризующих присутствие клеток АТИ в легких, нарушение функционирования которых приводит к различным тяжелым заболеваниям.

Результаты исследований о физиологической значимости интегрина бета-2 в процессах газообмена и дифференцировке клеток легких будут полезны для практического применения при разработке новых лекарственных препаратов регуляторного действия.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась в соответствии с планом НИР Казанского (Приволжского) федерального университета «Молекулярно-генетические, клеточные и популяционные основы функционирования живых систем» (№ регистрационной заявки 1. 14.066.11.9.06Д), а также при поддержке программ „LOEWE-Initiative der Landesförderung" (III L 4 - 518/15.004, 2009 года) и Немецкого Фонда научных исследований (ВА 4036/1-1).

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на 1 Международной научной интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2012), на Отчетном годовом семинаре Института Исследований легких и сердца им. Макса-Планкта (Бад Наухем, Германия, 2012), на 2 Международной научной интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2013), на конференции по исследованию легких «Deutsches Zentrum fur Lungenforschung Conference» (Бад Наухем, Германия, 2013), Международной научно-технической конференции «Прикладная электродинамика, фотоника и живые системы (Казань, 2013), на 1 Научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Современные проблемы фундаментальной медицины и биологии» (Казань, 2013), на Итоговых научных конференциях КФУ.

Личный вклад автора. Благодаря исследованиям, проведенным диссертантом были выявлены новые специфические маркеры альвеолярных клеток типа II, что позволит решить проблему получения обогащенной однородной популяции клеток типа ATII и расширит наши знания о функционирования данных клеток в организме.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы. Общий объем диссертации 108 страниц. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Работа содержит 4 таблицы и 27 рисунков. Список литературы включает 131 источник, в том числе 120 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали мышей двух видов: мыши дикого типа (WT, C57BL/6) были получены из лаборатории Чарльза Ривера (г. Уилмингтон США); мыши, с нокаутом гена интегрина бета-2 (ß2 Integrin-deficient) - из лаборатории кафедры Дерматологии и

аллергических заболеваний Медицинского факультета Университета Ульма (г.Баден-Вюртемберг, Германия).

Эпителиальные клетки легких мышей (MLE-12, АТСС CRL-2110), нормальные клетки легких мышей (MLG, АТСС CCL-206), фибробласты мышей (NIH/3T3, АТСС CRL-1658) и мезенхимные клетки плода легких мышей (MFLM-4) были получены из Американской коллекции типовых культур.

Выделение клеток ATII легких мыши проводили по методу, предложенному в работе Корти с сотрудниками (Corti et al.//Am J Respir Cell Mol Biol. 1996.- V.14.-P.309-315). Культивирование клеточной культуры ATII осуществляли в чашках Петри, покрытых фибронекгином. Культивацию вели в течение трех дней в медиуме-DMEM (D-MEM/F-12 (1:1) Life Technologies), содержащим 10% эмбриональной бычьей сыворотки, с добавлением 1% пенициллина / стрептомицина. Клетки выращивали в атмосфере 5% С02 при температуре 37° С (Corti et al.// Am J Respir Cell Mol Biol. 1996,- V. 14.-P.309-315).

Изучение экспрессии генов альвеолярных клеток, проводили с помощью иммунного окрашивания, используя специфические антитела и красители.

Получение суммарной РНК и полнмеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией

осуществляли с использованием набора Rneasy Kit (Invitrogen).

Вестерн-блоттинг белка проводили по методу Майера (Maier et al.// Proc Natl Acad Sei USA. -2012.-V. 109.-P. 11794-11799).

Анализ проточной цитометрии осуществляли по методу Волкаерта (Volckaert et al.// J clin Invest.- 2011.-V.121.-P.4409-4419) и использовали, как для оценки экспрессии маркеров клеточной поверхности со специфическими антителами, так и для определения этапа активации интегринов бета-2 и бета-6.

FASP метод и изоляцию мембранных белков осуществляли по методу Вишневского (Wisniewski et al.// Methods Mol Biol. - 2009. - V. 528. - P. 127-134).

Масс-спектрометрический анализ проводили с использованием ряда систем и приборов системы нанофлоу (nanoflow) Agilent 1200 LC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) по методу Коха (Cox et. al.// Nat Protoc. -2009,- V. 4. - P. 698-705).

Статистический анализ проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel-2007. Все данные в работе представлены в виде средней ± стандартной ошибки (среднее ± SEM). Для анализа дисперсии (ANOVA) были использованы значения уровней между группами и значений Р. Значения Р вычисляли после однофакторного дисперсионного анализа, * Р < 0,05; ** Р <0,01 и ***Р <0,001.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для поиска специфических маркеров, которые могли быть использованы для сортировки и обогащения клеток АТИ был применен протеомный анализ. Этот анализ позволяет проводить одновременное изучение многих индивидуальных белков, совокупность которых составляет определенную систему, которая характеризует исследуемый объект, как целостную систему, функционирующую в данных условиях. Кроме того, протеомный анализ позволяет исследовать синтез определенных специфических белков, возможную их модификацию и другие изменения, происходящие в исследуемом объекте.

С этой целью первоначально необходимо было получить культуру альвеолярных клеток типа II и выделить из них суммарную фракцию белков.

1. Получение и культивирование клеток ATII и MLE-12

С этой целью из легких мыши по протоколу, предложенному ранее Корти с сотрудниками (Corti et al., 1996) была изолирована первичная культура клеток АТИ, которая культивировалась в специфических для данных клеток условиях с целью получения необходимой биомассы. Параллельно культивировались клетки легочного эпителия (MLE-12). Данные клетки были необходимы для сравнительного анализа белков различных клеток, с целью доказательства их специфичности.

Используемые клетки предварительно смешивались с клетками «целого легкого» SILAC-мышей, имеющими в своем составе стабильные изотопы, связанные с определенными аминокислотами, в соотношении 1:1. Этот метод является метаболической стратегией маркировки белков для их количественного протеомного анализа. Вес клеток, использованных для получения белка с мечеными клетками, соответствовал весу клеток контроля. 2. Масс-спектрометрический анализ белков ATII и MLE-12 клеток

2.1. Определение принадлежности изолированных белков к клеточным органеллам

Исследования принадлежности белков, выделенных из альвеолярных клеток типа II, к определенным клеточным органеллам, показали, что в наибольшее их количество (90%), приходится на долю мембранных органелл клеток. Из них примерно 48% были отнесены к мембранной части клеток, 33% - к интегральной мембране, 10% белков связано с Аппаратом Гольджи, 6% отнесены внеклеточной области, а оставшиеся 3% белков не были определены (рис.1).

Таким образом, результаты исследований показали, что основная часть изолированных белков из альвеолярных клеток типа II относятся к мембранными протеинами.

аппарат Гольджи Щ интегральная мембрана ■ внеклеточная Я мембранная часть область неизвестные

Рис.1. Принадлежность изолированных белков к клеточным органеллам при применении масс-спектрометрического анализа, с использованием программы Gorilla.

2.2. Экспрессия генов, ответственных за синтез мембранных белков клеток альвеолярного типа II

Следующим этапом изучения белков альвеолярного типа II был анализ экспрессии их генов и определение месторасположения изучаемых белков в клетках.

Используя метод параллельного анализа экспрессии множества генов с помощью микрочипов, удалось сгруппировать гены близкие по профилям экспрессии и сравнить их присутствие в различных типах клеток.

Результаты проведенных исследований представлены на диаграмме, где можно наблюдать распределение белков клеток ATII в сравнение с клетками MLE-12 типа (рис. 2).

Как показали полученные результаты и проведенные расчеты профилей, в выделенных фракциях белков имеются белки специфичные только для клеток ATII. Это белки удаленные от центра (с минусовыми значениями, начиная от -2,5 до -5), поскольку центральные белки характерны и для других клеток.

MLE 12 к AT II

16 14

Рис.2. Соотношения Фракций белков (вертикальная ось в процентах) с кратными Изменениями (Горизонтальная ось Log2) клеток MLE-12 и клеток АТ II.

Контролем, полученных результатов служили данные, где было проведено сравнительного исследование содержания белков ATII относительно клеток «целого легкого» (стандарт) (рис. 3).

Результаты исследований показали, что в клетках «целого легкого» наблюдается экспрессия генов белков характерных для клеток ATII. Однако количество синтезируемого ими белка, принадлежащего клеткам ATII, было в 1,5-1,7 раз меньше, по сравнению с количеством белка, полученного из самих клеток АТП.

Вторым контролем данного эксперимента были результаты сравнительного анализа экспрессии генов клеток MLE12 по сравнению с экспрессией генов «целого легкого» (рис.4).

Стандарт к АТ И 14 -

S 10 í

á 8

Log 2 Краткое Изменение

Рис.3. Соотношения Фракций белков (вертикальная ось в процентах) с Кратными Изменениями (Горизонтальная ось Log2) в целом легком и альвеолярных клетках типа II.

Стандарт к MLE 12

16 -

_ 14

I 10

Log 2 Кратное Изменение

Рис.4. Соотношения Фракций белков (вертикальная ось в процентах) с Кратными Изменениями (Горизонтальная ось Log2) в целом легком и в клетках MLE-12.

Эксперименты показали, что экспрессия генов клеток MLE-12, по сравнению с клетками «целого легкого», отличается незначительно. Это говорит о том, что суммарный белок клеток

МЬЕ-12 типа более близок по своему составу, к белкам клеток целого легкого и возможно не имеет специфических белков.

Выявленные спектры специфических белков клеток АТП были изучены в сравнении со спектрами белков других клеток (более 4 тыс. наименований), у которых определено их месторасположение в клетках, принадлежность к определенной линии клеток и их специфичность (рис.5).

Результаты исследований показали, что основная масса анализируемых белков клеток АТП, также как и белков клеток МЬЕ-12 типа, характерна для «целого легкого». Однако немало белков удалено от центра и расположено в установленной области (- 2,5)-(-5,0) характерной для альвеолярных клеток типа II.

Дальнейшее изучение и сравнение базы данных транскриптом и протеомной базы изучаемых клеток, путем расчета соотношения экспрессии генов в клетках МЬЕ-12, в сравнении с клетками АТИ, и в сравнение с соответствующим количеством общего белка, характерного для клеток легких мышей, показало, что в клетках АТП, идентифицируются 26 генов, которые экспрессируются в клетках АТП на высоком уровне.

Название генов, их идентификационный номер в базе ЫшРго^ клеточная локализация, месторасположение по отрицательным и положительным значениям, а также расположение генов по цвету и фигуре, представлены в таблице 1.

Анализируя полученные данные по экспрессии представленных генов и расположению соответствующих им белков, можно было предположить, что среди представленных высоко экпрессируемых белков клеток АТП, есть белки, которые могут быть их потенциальными поверхностными маркерами.

5

а

а

z

0 X

01

i

I

Рис.5. Определение специфических мембранных белков, потенциальных маркеров для клеток ATII, путем расчета соотношения экспрессии генов в клетках MLE-12 в сравнении с клетками ATII.

3. Выявление белков, способных выполнить роль маркеров клеток АТП

Дальнейший скрининг белков 26 специфических генов, характерных для клеток АТП по критериям, характеризующим состав их пептидов, уникальность структурных элементов, по оценке эффективности обменов при упорядоченности п элементов (Log 2 кратное Изменение),

Белок против Экспрессии Генов

6

*

А • > * ЛИР эшд'-

\ -6 / •-< а vtUB в (

О ■ й * ■» X ^V! т i

• \ -if

О

п -б'

Соотношение изобилия белков NILE-12/АТП

выявил только два белка - интегрин бета-2 (^Ь2) и интегрин бета-6 (Itgb6), которые по своим характеристикам могли быть маркерами для альвеолярных клеток типа II (табл.1).

Таблица 1.

Экспрессия генов белков различных клеток, соответствующих белкам клеток АТН

Gene name Single Uniprot Location log ML12/AT2 1/CHIP ML12/AT2 Figure

ITGA2 Q62469 membrane part -5,62 0,85 О

ITGB2 P11835 membrane fraction -5,92 -4,96 Л

ITGB6 Q9Z0T9 membrane part -4,40 -2,50 О

С LU Q06890 extracellular region -3,06 -0,70 д

ЕРНА2 Q03145 integral to membrane 0,75 -0,73 □

CD9 P40240 integral to membrane 0,73 -0,44 О

COL1A2 Q01149 extracellular space -7,57 -2,32 О

BASP1 Q91XV3 plasma membrane -6,56 -2,41 д

IGFBP7 Q61581 extracellular region -6,08 -4,67 о

PTPRC P06800 integral to membrane -4,84 -5,74 □

ANPEP P97449 integral to membrane -4,83 -4,87 о

MGLL 035678 membrane part -4,81 -3,12 -2,88 д

OSMR 070458 integral to membrane -4,75 о

FILIP1L Q6P6LO membrane -4,69 -3,59 □

CTSS Q3U5K1 membrane -4,45 -6,31 О

FABP5 Q05816 cytoplasm -4,09 -7,11 д

AGPAT4 Q8K4X7 integral to membrane -4,05 -3,50 О

SFTPC P21841 intracellular part -0,15 -5,57 О

PTGIS Q8BXC0 endoplasmic reticulum meml -6,72 -1,93 □

THBS1 P35441 extracellular space -6,40 -1,54 А

FBN1 088840 extracellular matrix part -5,99 -1,38

DES P31001 cell fraction;insoluble fraction -5,68 -0,99 ©

ASS1 P16460 mitochondrion;orqanelle;merr -4,83 -1,43 □

PDLIM4 Q5SWV3 PDZ domain (Also known as -6,15 0,37 А

CDH11 P55288 cytoplasmiplasma mem bran' -4,78 0,18

CSPG4 Q8VHY0 integral to membrane -4,35 -0,38 ©

Особый интерес к интегринам не случаен, поскольку именно они принимают активное участие в различных процессах сигнализации клеток, которые важны для нормального функционирования легкого. Однако не все представленные в таблице 2 интегрины могли быть выбраны в качестве маркеров. Например, интергин Itga2, который также активно экспрессировался в клетках ATII , не мог быть выбран маркером, поскольку его экспрессия была значительно ниже, чем экспрессия генов интегринов бета-2 и бета-6 (табл.1).

4. Определение присутствия Itgb2 и Itgb6 в различных клеточных линиях мышей

Для подтверждения специфичности интегринов бета-2 и бета-6 для альвеолярных клеток типа II была проведена реакция обратной транскрипции (QRT-PCR) с количественным определением продуктов ПДР на различных клеточных линиях.

Присутствие Itgb2 и Itgb6 определяли на клеточных линиях Mlg (нормальные клетки легких мыши), MFLM-4 (фетальные мезенхимные клетки легких мыши),АТП (альвеолярные клетки II типа), NIH/3T3 (мышиные фибробласты), клетках MLE-12 (клетки легочного эпителия), а также в Lung («целые легкие» мыши) (рис.6).

Результаты исследований показали, что интегрины бета-2 и бета-6, относящиеся к мембранным белкам, наиболее активно экспрессируются, в альвеолярных клетках типа II. В меньшем количестве (в среднем в 2 раза) данные белки определяются в целом легком.

Наличие Itgb2 и Itgb6 в целом легком объясняется тем, что альвеолярные клетки являются составной частью целого легкого и данные показатели являются результатом их синтеза.

к а ». = s

g ® О о.

О 2 " а S а

£ s-m

Рис 6. Определение специфичной экспрессии протеинов Itgb2 и Itgb6 на клеточных линиях мышей: Mlg - нормальные клетки легких мыши, MFLM-4 фетальные мезенхимальные клетки легких мыши, NIH/3T3- мышиные фибробласты, MLE-12-клетки легочного эпителия, ATII- альвеолярные клетки типа II, Lung -клетки легких взрослой мыши.

Установлено, что интегрин бета-2 проявляет большую специфичность к клеткам ATII по сравнению с интегрином бета-6, поскольку небольшое его количество обнаруживается в фетальных мезенхимных клетках легких мышей. Однако специфичность его остается на достаточно высоком уровне, поскольку экспрессия интегрина бета-6 полностью отсутствовала в легочном эпителии. В других линиях клеток мышей экспрессии данных белков не наблюдалось (рис.6).

Подтверждением достоверности специфичности интегринов Itgb2 и Itgb6 клеткам ATII, служило определение наличия внутриклеточного белка Sftpc (proSP-C), как в клетках АТП, так и в клетках MLE-12. На сегодняшний день этот белок является лучшим маркером для клеток ATII, несмотря на то, что он активно синтезируется и в клетках MLE-12, что отражено в диаграмме (рис.6). Однако, данный белок при проведении иммунного окрашивания в первично изолированных клетках ATII, обнаруживается в гораздо большем количестве, чем в клетках MLE12, что позволяет его использовать в качестве маркера этих клеток.

Специфичность Itgb2 и Itgb6 была также доказана при изучении содержания белка на различных клеточных линиях легких и селезенке мыши (рис.7).

ITGB2

CD14 —

CD45

LMNB1--------

Л ^ ^

J; о Л? ^ «? ^

Рис.7. Анализ экспрессии Itgb2 и Itgb6 методом Вестерн-блоттинга на клетках легких и селезенке мыши: ATII- альвеолярные клетки типа II, MLE-12 клетки легочного эпителия, LLC1- раковые клетки легких «Льюиса», NIH/3T3- эмбриональные фибробласты мышей, MFLM-4 фетальные мезенхимальные клетки легких мыши, Mlg - нормальные клетки легких мыши, и Lung -клетки легких взрослой мыши.

Как показали результаты, представленные на электрофораграмме, экспрессия генов интегринов (ITGB2 и ITGB6) полностью отсутствовала на других клеточных линиях, кроме клеток АТП и в малых количествах в целом легком.

J

Однако, по результатам анализа Вестерн-блоттинга, экспрессия интегрина бета-2 наблюдалась также в клетках селезенки. Обнаружение в ней данного интегрина, по-видимому, связано с присутствием крови в данном органе. Известно, что интегрины относятся к лейкоцитам и их присутствие в селезенке, по-видимому, дает соответствующую реакцию.

Доказательством того, что интегрины бета-2 и бета-6 в изолированных клетках АТП, не являются результатом загрязнения альвеолярных клеток, клетками крови, являются пятна белков, которые характерны для крови и которые отсутствуют в клетках АТН.

Клеточная специфичность интегринов и ^Ь6 была также доказана с помощью

тестирования белковых экстрактов со специфическими моноклональными антителами - СБ 14 и С045. которые являются маркерами для красных кровяных клеток - моноцитов, макрофагов.

Результаты иммунного окрашивания данного эксперимента не представлены, так как на фотографиях отсутствовала флюоресценция.

Отсутствие флюоресценции еще раз подтвердило, что наличие протеинов \tgb2 и в клетках АТП типа не является результатом их загрязнения клетками крови, поскольку реакция с антителами СО 14 и С045 наблюдалась, только в экстракте белка селезенки, содержащей кровь, но отсутствовала в других белковых экстрактах.

Таким образом, результаты вестерн-блоттинга белковых экстрактов и их иммунного окрашивания подтвердили клеточную специфичность интегринов бета-2 и бета-6 относительно альвеолярных клеток типа II.

5. Определение содержания субпопуляций клеток АТН в легких взрослой мыши и присутствие в них интегринов бета-2 и бета-6

Дальнейшая детальная характеристика суммарных белков, подтверждающая специфичность интегринов для клеток АТП, была проведена с помощью проточной цитометрии с использованием специфических антител (БДрс и/или к»Ь2 или ^Ь6), с одним (рис.8 ) или двойным (рис.9 ) действием.

Результаты исследований показали, что в составе суспензии клеток легких взрослой мыши, 13% клеток проявляют положительную реакцию на белок Бйрс, 7% - на интегрин бета-6 и 25% клеток - на интегрин бета-2 (рисунок 8).

Поскольку клеток, с положительной реакцией на интегрин бета-2 было в 2 раза больше, чем клеток с положительной реакцией на Бйрс, можно было предположить, что интегрин бета-2 имеет количественное преимущество перед белком 5Йрс.

1)

ш * 25%

2)

7%

Itgb2 - APC Itgb6 - FITC

Рис.8. Анализ суспензии клеток взрослых легких с помощью проточной цитометрии после одного иммунного использования Sftpc и/или Itgb2 или ^Ь6-специфических антител: 1 -Itgb2 окрашивание, 2 - Itgb6 окрашивание, 3 - Sftpc окрашивание.

Однако, анализ результатов эксперимента с двойным окрашиванием суспензии клеток легких взрослой мыши (рис.9) показал, что только 5% анализируемых клеток давали положительную реакцию на присутствие белка Sftpc и интегрина бета-2, а 6% клеток давали положительную реакцию на присутствие белка Sftpc и интегрина бета-6.

1)

8% 5%

• 16%

2)

<1 «Г

СО

11% 6%

1.5%

ИдЬ2-АРС ЦдЬб - Р1ТС

Рис.9. Анализ суспензии клеток взрослых легких с помощью проточной цитометрии после двойного иммунного использования вКрс и/или На 1)2 или ^Ь6-специфических антител: 1- двойное окрашивание рго8РС/Р1ТС-^Ь2/АРС, 2 - двойное окрашивание рговРС/АРС-1^Ьб/№ТГС.

Кроме того, в результате используемого метода с двойным иммунным окрашиванием белка был установлен ранее неизвестный факт, о возможности существования клеток АТП в легких врослой мыши, в виде двойной субпопуляции. На рисунке 9 отчетливо видно разделение фракций белка на два фрагмента, что является доказательством этого факта.

Таким образом, анализ окрашенных клеток, взаимодействующих со специфическими антителами доказал, что клетки АТИ в легких взрослой мыши существуют в виде двух субпопуляций, каждая из которых содержит специфические интегрины бета-2 и бета-6. Популяция клеток АТИ, содержит равное количество клеток, синтезирующих белок Эйре и интегрины бета-2 и бета-6, что позволят рассматривать данные интегрины как маркерные белки.

6. Определение локализации ^Ь2 и в изолированных альвеолярных клетках типа II

Для определения локализации интегринов бета-2 и бета-6 в изолированных альвеолярных клетках типа II был использован метод двойного иммуноокрашивания срезов взрослого легкого, при использовании специфических антител, коньюгированных различными флюрохромами (рис.10-11).

Расположение окрашенных специфических антител в клетках АТП показало, что белки 5Йрс и 1щЪ2 расположены в них относительно близко друг к другу, т.е. интегрин бета-2, возможно, находится во внутренней структуре клеток.

Рис.10. Двойное окрашивание протеинов 8РТР-С и 1ТСВ2 на поверхности изолированных альвеолярных клеток типа II и срезе легких. Рисунки воспроизведены с помощью конфокального микроскопа: 1), 2) при использовании специфических антител рговРС (БЙрс) - и Нф2 на срезе легких при разных увеличениях, 3) те же протеины , но на клетках АТП. Окраска: ОКА05- синего цвета окрашенные ядра, красного цвета-зеленого цвета- рго8РС.

Рис. 11. Двойное окрашивание протеинов рго8РС и на поверхности изолированных альвеолярных клеток типа II и срезе легких. Рисунки воспроизведены с помощью конфокального микроскопа: а), б) при использовании специфических антител рговРС и на срезе легких при разных увеличениях, в) те же протеины , но на клетках АТП.

Однако при иммунном окрашивании целого легкого мы наблюдали ярко выраженное поверхностное расположение интегринов, как интегрина бета-2, так и интегрина бета-6 (рис. 10). В данном эксперименте также было установлено, что содержание в клетках интегрина бета-6 было значительно меньше, чем содержание интегрина бета-2.

Таким образом, данный метод позволил определить локализацию белков в изолированных альвеолярных клетках типа II, а также на срезах легких. Используя иммунофлюоресцентное окрашивание срезов взрослого легкого, было установлено, что специфические белки ^Ь2 и П§Ь6 локализованы на поверхности клеток АТП.

Установленный, преимущественный синтез интегрина бета-2 на изолированных клетках II типа согласуется с данными экспрессии гена, ответственного за синтез данного белка, как в клетках типа АТП, так и в клетках «целого легкого», и полном отсутствии экспрессии синтеза интегрина бета-2 в клетках МЬЕ-12 (рис.12).

На масс-спектрах экспрессии генов белков, наиболее высокий пик расположен в районе длины волны - 681.82, именно он характерен для интегрина бета-2 в клетках АТП. Второй пик с длиной волны 684.82 на первом рисунке отражает менее выраженную экспрессию данного белка на целом легком.

На втором рисунке показано соотношение экспрессии генов белков клеток МЬЕ-12 к целому легкому, где практически экспрессия интегрина бета-2 отсутствовала.

Таким образом, полученные результаты подтвердили преимущественную экспрессию гена интегрина бета-2 в клетках АТП и возможность его использования в качестве основного маркера для данных клеток.

Heavy Lung vs. AT1I Heavy Lung vs. MLE-12

MH^+.SOWNNDNPLFK MH'*\ LTEIIPK

53i $33 ем ess 6« 407403409 410 411 412

mi nvs

Рис.12. Масс-спектр экспрессии гена Itgb2: а) в клетках ATII по отношению к целому легкому, б) в клетках MLE-12 по отношению к целому легкому.

7. Роль экспрессии гена интегрина бета-2 (Itgb2) в газообмене клеток легких мышей

Установлено, что нормальное функционирование клеток животных и человека зависит от определенного набора интегринов. Однако роль отдельных интегринов в процессах

14

функционирования клеток изучена недостаточно. Поэтому следующим этапом наших исследований было определение роли экспрессии гена интегрина бета-2 в процессе газообмена легких мышей.

С этой целью в работе использовались мыши дикого типа (WT, C57BL/6) и мыши, у которых методом нокаута был ингибирован ген, ответственный за синтез интегрина бета-2 (Itgb2-/-).

Из литературы известно, что нокаут генов отдельных интегринов приводит к серьезным морфологическим и физиологическим изменениям в организме человека и животного (Kim et.al.,2005). Однако результаты наших исследований показали, что как мыши дикого типа, так и мыши с нокаутом гена интегрина бета-2 (Itgb2-/-) нормально развивались, были подвижны и набирали вес (табл. 2). Кроме того, в поведении мышей разных групп также не было отмечено значительных изменений.

Интегрин бета-2 синтезируется в различных органах и тканях человека и животных. Синтезируется он и в легких.

Исследование структуры легких и легочной ткани мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена интегрина бета-2 показало, что, как визуально, так и гистологически они мало отличались друг от друга. При отсутствии экспрессии интегрина бета-2 структура легких не была нарушена, она имела идеально белый цвет, что характерно для легких мышей нормального дикого типа.

На гистологических срезах легочной ткани мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена интегрина бета-2 были видны бронхиолы, газовые пузырьки, на поверхности которых расположены альвеолярные клетки, но значительных различий в структуре срезов отмечено не было.

Таким образом, по морфологическим показателям мыши, подвергнутые нокауту, не отличались от мышей дикого типа.

Таблица 2.

Характеристика весового прироста мышей дикого типа и нокаут мышей

Время эксперимента Средний вес мышей различного типа, г

Дикий тип (WT, C57BL/6) Нокаут Itgb2-/-

5 недель 17,6 ±1,2 19,0 ±1,0

6 недель 18,3 ±1,2 19,5 ±1,3

7 недель 19,0 ±1,4 20,4 ±1,5

8 недель 22,8 ±1.5 23,0 ±1,6

Тем не менее, при сравнительном изучении концентрации вдыхаемого кислорода клетками мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена интегрина бета-2 было установлено, что для мышей дикого типа данный показатель по среднеарифметическому значению был достоверно выше, чем у мышей с нокаутом гена интегрина бета-2 (рис.13). Если у мышей дикого типа давление на мембрану клеток составляло 120 ед., то для мышей с нокаутом гена интегрина бета-2 этот показатель был не более 70 ед.

НЕЙ

WT ¡Ígb2 -/Рис.13. Измерения потребления кислорода клетками легких у мышей: 1 - мыши дикого

типа (WT, C57BL/6); 2 - нокаут мыши (Itgb2-/-).

Однако по количеству выдыхаемого углекислого газа достоверного различия между мышами дикого типа и мышами с нокаутом гена интегрина бета-2 не наблюдалось (рис.14). Данные показатели по давлению газа на мембрану у мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена интегрина бета-2 составляли 40-45 ед.

ш

WT Itgb2 -/Рис. 14. Измерения выделения углекислого газа клетками мышей легких: 1 - мыши дикого типа (WT, C57BL/6); 2 - нокаут мыши (Itgb2-/-).

Таким образом, результаты экспериментов показали, что у мышей с нокаутом гена интегрина бета-2 наблюдается нарушение процесса газообмена легких, когда количество вдыхаемого кислорода не соответствует количеству выдыхаемого углекислого газа. Следовательно, изучаемый нами интегрин бета-2 принимает участие в процессе газообмена легких.

8. Участие интегрина бета-2 в Wnt сигнализации клеток

Wnt сигнализация клеток - это один из сигнальных путей клеток животных, регулирующий эмбриогенез, дифференцировку тканей и развитие раковых опухолей. Тщательный анализ имеющейся базы данных о белках мембранной фракции клеток ATII показал, что они обогащены белками, вовлеченными в Wnt сигнализацию.

Для изучения участия интегрина бета-2 в Wnt сигнализации клеток легких мышей, эксперименты проводились на животных с выключенным геном, ответственным за синтез интегрина бета-2 (Itgb2-/-) и нормальным набором функционирующих генов (дикий тип). Анализ участия интегрина бета-2 в процессах Wnt сигнализации проводили с помощью определения концентрации клеток, содержащих бета-катенин (ABC), как основного медиатора и индикатора данного процесса (рис. 15-16).

Сравнение тканей мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена интегрина бета-2 показало достоверное увеличение интенсивности флюоресценции бета-катенина в клетках Itgb2-/- мышей, что свидетельствовало об активации процесса транскрипции белков Wnt сигнализации в данных клетках.

Рис. 15. Иммуноокрашивание ткани легких : 1) дикого типа, 2) с выключенным и%Ь2 -/геном. Окрашивание ядер- 1)КЛ05- синего цвета, активация белков Wnt сигнализации -зеленого цвета.

Известно, что концентрация бета-катенина в клетках коррелирует в них с интенсивностью канонической \Vrit сигнализации. Таким образом, полученные результаты по интенсивности флюоресценции бета-катенина в клетках И§Ь2-/- мышей, свидетельствует также о повышении канонический \Vrit сигнализации после нокаута гена интегрина бета-2.

Повышение канонической \V14T сигнализации было дополнительно подтверждено путем количественной оценки экспрессии генов легких взрослой мыши дикого типа (\¥Т) и 1\$)2-1-мышами (рис.16).

■ ? 12 ¡I *

ta

WT Itgb2 -/-

Рис.16. Количественная оценка ЛВС положительных клеток в легких дикого типа и Itgb2 -/- мышей после иммуноокрашивания. На оси ординат показано количество ЛВС позитивных клеток в процентах по отношению к общему числу клеток. Данные представлены в виде средних значений ± S.E.M. (N = 3). Звездочки, Р значения после одностороннего ANOVA, *** Р <0,001; ** Р <0,01; * Р <0,05.

Как видно из полученных результатов, количество клеток, содержащих бета-катенин для мышей дикого типа, составляет 5-6%, а для мышей Itgb2 -/- типа этот показатель равен 11-13%.

Таким образом, количество ABC позитивных клеток, для которых отмечается повышение канонической Wnt сигнализации, возрастает в среднем в 2,2 раза у мышей Itgb2 -/типа, по сравнению с мышами дикого типа.

Влияние интегрина бета-2 на каноническую Wnt сигнализацию можно проследить с помощью анализа экспрессии маркеров WNT канонического пути. Результаты данного эксперимента представлены на рисунке 17.

о л

в х es £ = =

sg s

i- о а

u Я с

о 5 « = ' а

°х

Axin2

WT

Itgb2 -/-

WT

Itgb2 -/-

WT

Itgb2 -/-

Рис.17. Анализ экспрессии указанных маркеров WNT сигнализации - Axin2, Bmp4, Mycn -представлены в количественном соотношении с помощью PCR реакции реального времени в легких взрослых мышей WT и Itgb2-/ - типа. Данные представлены в виде средних значений ± S.E.M. (в 4-х повторностях).

£ =

5 «

к

.. 5

м с-»

н

s-f*

Itgb2 ш

1 ****

S контроль Itgb2 -/Рис.18. Анализ экспрессии Itgb2 с помощью PCR реакции реального времени в легких взрослых мышей WT и Itgb2-/ - типа. Данные представлены в виде средних значений ± S.E.M. (в 4-х повторностях).

Как видно из полученных результатов, нокаут Itgb2 мыши повышает экспрессию всех маркеров Wnt канонического пути в 2-3 раза.

Контролем данного эксперимента являются данные представленные на рисунке 18, где отмечена высокая экспрессия интегрина бета-2 в клетках мышей дикого типа и ее отсутствие в клетках мышей с нокаутом гена интегрина бета-2.

Данные экспрессии маркеров Wnt канонического пути подтверждаются также результатами Вестерн-блотинга(рис. 19).

WT Itgb2 -/- WT Itgb2 -/-

AXIN2---MYCNJ

BMP4 — LMNB1

Рис.19. Результаты Вестерн-блоттинга экспрессии маркеров \VINT канонического пути.

Как видно из полученной электрофореграммы, количество белков маркеров \Vrit канонического пути выше в легких взрослых мышей \\ф2-1 - типа, чем в легких мышей дикого типа.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ^Ь2 участвует в опосредованной негативной регуляции \Vrit сигнализации клеток.

Чтобы подтвердить роль И§Ь2 в опосредованной негативной регуляции \Vrit сигнализации, мы трансфицировали плазмиду несущую гены белка ^Ь2 в клетки МЬЕ-12 (рис. 20). Для активации процесса \Vrit сигнализации клетки МЬЕ-12 были предварительно обработаны 1ЛС1. Контролем служили необработанные клетки МЬЕ 12.

¿ь ф ь L/Ы - - i I LJ\_,i — I ■ L.II^.1 — — т ■

° ¡С '№2 - + - + пдьг + - + пдьг + - +

Рис.20. Анализ экспрессии генов - Ахш2, Вшр4, Мусп. (|К1-РС К на клетках МЬЕ-12, которые не обрабатывали (иТИ) или обработаны (Тг) ЫС1 и трансфицированные либо в контроль (-) или в мышь ^Ь2 с экспрессионной плазмидой. Данные представлены в виде средних значений ± 8.Е.М. (в 4-х повторностях).

Результаты исследований показали, что присутствие в клетках МЬЕ-12, снизило

уровень экспрессии специфических белков сигнального пути - Ахт2, Втр4 и Мусп. Особенно четко это снижение наблюдается на клетках, обработанных раствором хлорида

лития, где снижение экспрессии генов для белка Втр4 наблюдалось в среднем в 2 раза, а остальных маркеров в 1,3-1,5 раз.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что Itgb2 участвует в опосредованной негативной регуляции Wnt сигнализации в легких взрослой мыши и, следовательно, в процессах эмбриогенеза, дифференцировки клеток и других, связанных с Wnt сигнализацией клеток.

ВЫВОДЫ

1. Получена суммарная фракция белков, специфичных для альвеолярных клеток ATII, состоящая из 26 протеинов, 90% из которых являются мембранными белками. Среди них выявлены наиболее активно экспрессирующиеся интегрины - это интегрины бета-2 и бета-6 (Itgb2 и Itgbó).

2. Методами иммунного окрашивания, проточной цитометрии, а также путем количественной оценки экспрессии генов легких мышей, доказана специфичность интегринов бета-2 и бета-6 для альвеолярных клеток типа II, выявлена их поверхностная локализация.

3. Установлено существование клеток ATII в легких взрослых мышей в виде двух субпопуляций, каждая из которых экспрессирует интегрины бета-2 и бета-6.

4. Доказано участие Itgb2 в газообмене легких, а также в процессе дифференцировки клеток, эмбриогенезе и других, связанных с Wnt сигнализацией. В первом случае, отсутствие Itgb2 в клетках вызывает нарушение нормального газообмена легких, во втором - наблюдается усиление процессов, связанных с Wnt сигнализацией.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Mukhametshina, R.T. Quantitative Proteome Analysis of Alveolar Type-II Cells Reveáis a Connection of Integrin Receptor Subunits Beta 2/6 and WNT Signaling / R.T. Mukhametshina, A. Ruhs, I. Singh, D. Hasan, A. Contreras, A.Mehta, V.S. Nikam, K. Ahlbrecht, G. Carraro, H.A. Cabrera-Fuentes, D. Jiang, R. Voswinckel, W. Seeger, S. Bellusci, K. Scharffetter-Kochanek, T.V. Bagaeva, K.T. Preissner, T. Boettger, T. Braun, M. Kriiger, G. Barreto // J. Proteome Res. -2013.-V.12.-Nol2.-P.5598-5608.

2. Мухаметшина, P.T. Роль экспрессии гена интегрина бета 2 в газообмене клеток легких мыши / Р.Т.Мухаметшина, А. Мехта, К.Т. Прайснер, Г. Баррето, Т.В. Багаева // Ученые записки Казанского университета, Серия Естественные науки.-2013.-Т.155.-Кн,3.- С.183-186.

3. Мухаметшина, Р.Т. Альвеолярные клетки и их специфические маркеры / Р.Т.Мухаметшина, Г. Баррето, Т.В. Багаева // Материалы II Международной научной Интернет-конференции Биотехнология. Взгляд в будущее, 26-27 марта 2013.- С.226-229

4. Мухаметшина, Р.Т. Некоторые субпопуляции альвеолярных клеток типа II экспрессируют белки - интегрины бета 2 и бета 6, которые можно рассматривать как маркерные / Р.Т.Мухаметшина, Т.В. Багаева /1 Научно-практическая конференция студентов и молодых ученых «Современные проблемы фундаментальной медицины и биологии».-Казань: ООО «Парк-медиа», 2013.- 97с.

5. Кабрера Фуентес, Э.А. Проникновение биназы в клетки альвеолярного эпителия легких не индуцируют их гибель /Э.А. Кабрера Фуентес, Н.В. Калачева, Р.Т. Мухаметшина, П.В. Зеленихин, А.И. Колпаков, Г. Баррето, К.Т. Прайсснер, О.Н. Ильинская // Журнал Биомедицинская химия - 2012,- Т. 58.- Вып. 3.- С. 272-280.

Автор выражает глубокую признательность научным руководителям диссертационной работы д.б.н., проф. Багаевой Т.В. за внимательное отношение и помощь в работе над

диссертацией, д.б.н., проф. Баррето Г. за неоценимую помощь при проведении экспериментальных исследований и советы в процессе выполнения диссертационной

работы, д.б.н., проф. Прайснеру за предоставленную возможность проведения экспериментов в Институте имени Макса Планка (Германии), PhD студенту Адити Мехта, PhD Алехандро Кабрера, PhD Свену Беккер за ценные советы по выполнению

данного исследования.

Просьба высылать отзывы на автореферат по адресу: 420008,г.Казань,ул.Кремлевская,д.18,главное здание КФУ, к.105, отдел аттестации научно-педагогических кадров, e-mail: RGDzjubenko'iT'kpfu.ru. факс 8(843)233-78-67. Диссертационный совет Д212.081.08. Ученый секретарь Абрамова Зинаида Ивановна.

Факс 8(843)238-76-01.

E-mail автора: regina.mukhametshina@gmail.com

Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага офсетная №1 Печать RISO. Уч.-изд.л.1,2. Тираж 100 экз.

ЦЕНТР ПЕЧАТИ "Линк". Казань, ул. Карла Маркса, 51

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мухаметшина, Регина Талгатовна, Казань

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи 04201460909 ^

МУХАМЕТШИНА РЕГИНА ТАЛГАТОВНА

ИНТЕГРИНЫ БЕТА-2 И БЕТА-б - НОВЫЕ МАРКЕРЫ АЛЬВЕОЛЯРНЫХ

КЛЕТОК ТИПА II

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н., проф. Багаева Т.В. Научный руководитель PhD., Баррето Г.

КАЗАНЬ-2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................10

1. Альвеолярные клетки легких взрослой мыши...........................10

1.1. Расположение Альвеолярных клеток типа II в структуре легких... 10

1.2. Характеристика ATII клеток.................................................11

1.3. Функции альвеолоцитов II типа.............................................15

1.4. Изменения структуры альвеолоцитов П-го типа при заболеваниях ...........................................................................................19

1.5. Формирование группы клеток альвеолярного газообмена в процессе развития легких (Клетки ATI и ATII)...........................................20

1.6. Взаимосвязь альвеолярных клеток ATII и ATI...................................24

1.7. Сурфактантные протеины и интегрины эпителиальных (альвеолярных) клеток легких.....................................................................25

2. Интегрины...................................................................................................27

2.1. Общая характеристика интегринов......................................................27

2.1.1. Характеристика интегрина бета 2..................................................30

2.1.2. Характеристика интегрина бета-6.................................................33

2.2. Интегрины и альвеолярные клетки типа II, их взаимосвязь.............35

3. Wnt-сигнальный путь............................................................................37

3.1. Влияние Wnt-сигнализации на клеточный цикл и пролиферацию клеток.............................................................................................................40

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..............................................................................................44

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...........................................................45

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................45

1.1. Материалы и объекты исследований...................................................45

1.2 Методы исследования............................................................................46

1.2.1. Выделение клеток ATII легких мыши..........................................46

1.2.2. Культивирование клеточной культуры ATII...............................47

1.2.3. Иммунное окрашивание клеточной культуры AHI....................47

1.2.4. Получение суммарной РНК и RT-PCR (Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией)........................................................48

1.2.5. Вестерн-блоттинг............................................................................49

1.2.6. Изоляция клеток легких для экспериментально проточной цитометрии.................................................................................................50

1.2.7. Метод проточной цитометрии......................................................51

1.2.8. FASP метод (ФАСП -фильтр автоматизированная подготовка проб) - Изоляция мембранных белков....................................................53

1.2.9. Масс-спектрометрия: методы и данные анализа.........................54

1.3. Трансфекция...........................................................................................55

1.4. Математическая обработка результатов..............................................55

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ............................................................56

4.1. Масс-спектрометрический анализ мембранных белков

ATII и MLE-12 клеток..................................................................................56

4.2. Экспрессия генов, ответственных за синтез мембранных

белков клеток альвеолярного типа II..........................................................59

4.3 Выявление белков, способных выполнить роль маркеров

клеток ATII типа...........................................................................................65

4.4. Определение присутствия Itgb2 и Itgbó в различных

клеточных линиях мыши..............................................................................65

4.5. Определение наличия двух различных субпопуляций клеток АТП во взрослых легких и доказательство

специфичности протеинов ITGB2 и ITGB6 для данных видов...............68

4.6. Определение локализации Itgb2 и Itgb6 в изолированных альвеолярных клеток типа II........................................................................70

4.7. Участие специфического белка ITGB2 Wnt сигнализации

клеток.............................................................................................................73

4.8. Участие специфического белка ГГСВ2 в газообмене

легких.............................................................................................................80

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................................85

ВЫВОДЫ.........................................................................................................93

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..........................................................................94

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................96

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Важную роль в нормальном функционировании и восстановлении поврежденных легких выполняют эпителиальные клетки, в том числе, альвеолоциты II.

Повреждения альвеолоцитов II типа нарушает транспорт ионов, что препятствует оттоку жидкости из альвеолярного пространства (Modelska et al., 1999). Поскольку клетки ATII способны к дифференцировке в альвеолоциты I типа, их повреждение препятствует процессу восстановления целостности альвеолярной стенки. Нарушение структуры альвеолярного эпителия приводит к обнажению базальной мембраны, и на ней образуются волокна фибрина, что приводит к образованию «гиалиновых мембран» (Nishioka et al., 2013). Тяжелое повреждение альвеолярного эпителия и нарушение его репарации приводит к легочному фиброзу (Войтковская и др., 2012), патологическим заболеваниям (McElroy et al., 2004). Кроме того, альвеолоциты II синтезируют сурфактант. Это комплекс веществ, состоящий из фосфолипидов и специфических сурфактант-ассоциированных белков. Он выполняет многие функции: стимулирует фагоцитоз альвеолярных макрофагов, стабилизирует альвеолоциты, агрегирует бактерии и вирусы, снижает темпы развития системной воспалительной реакции. Однако главной функцией сурфактанта является предотвращение полного коллапса альвеол в период выдоха, что обусловлено его способностью создавать поверхностное натяжение в легких (Puligandla, 2000). Нарушение синтеза сурфактанта приводит к тяжелым формам заболеваний легких, в том числе, синдрому острого повреждения легких, острому респираторному дистресс-синдрому, включающим тяжелый острый респираторный синдром, муковисцидоз и идиопатический фиброз легких.

В 1977 году Мейсон и Уильяме разработали концепцию альвеолярных клеток типа II (АТП), как клеток защитников альвеол (Mason et al., 1977). Их способность к синтезу сурфактанта, участие в регуляции баланса альвеолярной жидкости, коагуляции/фибринолиза, дифференцировка в клетки ATI и способность к удалению апоптотических АТП клеток путем фагоцитоза, способствуя тем самым восстановлению эпителия, полностью соответствует данной концепции. Кроме того,

5

клетки ATII могут функционировать в легких в качестве иммунорегуляторных клеток (Fehrenbach et al., 2001).

Интерес, проявляемый исследователями разных стран к альвеолярным клеткам, связан также с их возможной ролью в качестве стволовых клеток. Роль стволовых клеток многообразна. Они являются основой для формирования различных тканей и органов, способны к активному росту и размножению. В работе Кима с соавторами (Kim et al., 2005) было отмечено, что базальные клетки, «клетки Клара» вместе с альвеолярными клетками типа II могут быть первичными стволовыми клетками эпителия легких.

В литературе имеются данные о процентном соотношении некоторых из изученных типов клеток легких, так - эпителиальные клетки типа I составляют 8% клеток от общего количества; 16% приходится на долю ATII и ATI клеток; эндотелиальные клетки капилляров, составляют 30% клеток легких; на клетки интерстициального пространства приходится 37%, а количество альвеолярных макрофагов варьирует. Сравнение межвидовой характеристики клеток в альвеолярной области легких людей и крыс в норме показало, что процентное содержание клеток, их средняя толщина, размер и площадь занимаемой поверхности, было относительно постоянным у исследованных организмов (Crapo et al., 1982).

Для характеристики различных типов клеток необходимы специфические молекулярные маркеры, которые позволяют контролировать и идентифицировать происходящие в структуре легких процессы, выяснять механизмы взаимоотношений между различными типами клеток, идентифицировать присутствие стволовых клеток или возможность возникновения тяжелых заболеваний.

Поиск специфических маркеров, которые могут быть использованы для сортировки и обогащения, определенных субпопуляций клеток, в том числе, альвеолярного типа II (ATII), является актуальной задачей, решение которой позволит получить новые данные о функционировании данных клеток в легких, выяснить структурные и функциональные особенности их белков, участвующих в различных физиологических процессах.

В настоящее время определены уникальные молекулярные маркеры для некоторых типов клеток легких, например, альвеолярные клетки типа I - имеют маркер Tla (Williams., 2003), для альвеолярных клеток II типа используется сурфактантный белок-С (Fehrenbach, 2001), белок CCSP - маркер клеток Клара (Kim et. al., 2005), однако, для большинства клеток специфические маркеры еще не найдены.

Цель работы - поиск новых поверхностных маркеров альвеолярных клеток типа II и выяснение их участия в отдельных физиологических процессах, протекающих в клетках.

Основные задачи исследования:

1. Выделить суммарную фракцию специфических белков, характерных для клеток ATII, и определить в их составе наиболее активно экспрессирующиеся интегрины;

2. Установить принадлежность и внутреннюю локализацию наиболее активно экспрессирующихся интегринов;

3. Исследовать популяцию клеток ATII цитометрическим методом, с использованием специфических антител для выбранных интегринов;

4. Доказать возможность использования специфических антител в качестве маркеров клеток ATII;

5. Выявить физиологическую значимость выбранных интегринов в газообмене, в дифференцировке клеток и других процессах.

Положения, выносимые на защиту:

• Интегрины бета- 2 и бета- 6 являются специфическими маркерами альвеолярных клеток типа II;

• Интегрин бета- 2 функционально значим для нормального функционирования легких, влияя на процесс газообмена легких и принимая участие в опосредованной негативной регуляции Wnt сигнализации.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что в составе клеток альвеолярного типа II, имеются мембранные белки, которые специфичны для клеток

данного типа. Установлено, что два белка, а именно интегрины бета-2 и бета-6, могут быть использованы в работах с клетками легких, в качестве маркеров.

Впервые доказано наличие в легких мыши двух различных субпопуляций клеток ATII, содержащих в своем составе интегрины бета-2 и бета-6.

Впервые установлено, что интегрин бета-2 физиологически значим в организме животного. Так, его отсутствие приводит к нарушениям нормального газообмена легких. Кроме того, получены приоритетные данные о функциональной связи клеток ATII с Wnt-сигнализацией. Доказано, что интегрин бета-2 принимает участие в опосредованной негативной регуляции Wnt сигнализации клеток, т.е. он влияет на процесс эмбриогенеза, дифференцировки клеток и другие процессы.

Практическая значимость работы. Выявленные нами новые, специфичные, поверхностные маркеры (интегрины бета-2 и бета-6) позволят увеличить возможности получения обогащенной однородной популяции клеток ATII типа, изучение которых расширит наши знания в области функционирования данных клеток в организме.

Интегрины бета-2 и бета-6 могут быть использованы в качестве диагностических белков, характеризующих присутствие клеток ATII в легких, нарушение функционирования которых приводит к различным тяжелым заболеваниям.

Результаты исследований о физиологической значимости интегрина бета-2 в процессах газообмена и дифференцировке клеток легких будут полезны для практического применения при разработке новых лекарственных препаратов регуляторного действия.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась в соответствии с планом НИР. Казанского (Приволжского) федерального университета «Молекулярно-генетические, клеточные и популяционные основы функционирования живых систем» (№ регистрационной заявки 1. 14.066.11.9.06Д), а также при поддержке программ „LOEWE-Initiative der Landesförderung" (Ш L 4 - 518/15.004, 2009 года) и Немецкого Фонда научных исследований (ВА 4036/1-1).

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на 1 Международной научной интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2012), на Отчетном годовом семинаре Института Исследований легких и сердца им. Макса-Планкта (Бад Наухем, Германия, 2012), на 2 Международной научной интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2013), на конференции по исследованию легких «Deutsches Zentrum fur Lungenforschung Conference» (Бад Наухем, Германия, 2013), Международной научно-технической конференции «Прикладная электродинамика, фотоника и живые системы (Казань, 2013), на 1 Научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Современные проблемы фундаментальной медицины и биологии» (Казань, 2013), на Итоговых научных конференциях КФУ.

Личный вклад автора. Благодаря исследованиям, проведенным диссертантом были выявлены новые специфические маркеры альвеолярных клеток типа II, что позволит решить проблему получения обогащенной однородной популяции клеток типа ATII и расширит наши знания о функционирования данных клеток в организме.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы. Общий объем диссертации 108 страниц. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Работа содержит 4 таблицы и 27 рисунков. Список литературы включает 131 источников, в том числе 120 работ зарубежных авторов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Альвеолярные клетки легких взрослой мыши

1.1. Расположение Альвеолярных клеток типа II в структуре легких

Клетки Альвеолярного типа II (ATII клетки) представляют собой одну из популяций клеток-предшественников, расположенных в альвеолах легких, благодаря которым происходит постоянное обновление тканей легких. АТИ клетки вместе с бронхеальвеолярными стволовыми клетками (BASCs) отвечают за регенерацию альвеолярного эпителия в гомеостатическом обороте, в ответ на повреждение легкого, т.е. по-видимому, могут выступать в качестве стволовых клеток или клеток-предшественников.

Клетки-предшественники во взрослых легких мыши, расположены в различных участках легкого. В работах Лию (Liu et al., 2008) было показано, что при каждом новом разветвлении легких, наблюдается формирование новой популяции клеток, которые выступают в роли стволовых клеток. При рассмотрении структуры легких, начиная с поверхностной трахеи можно наблюдать их расположение (рис.1). Так, первая группа (1) представляет собой неизвестный тип клеток, обнаруженных в протоках подслизистой железы (SMG), расположенных на поверхности трахеи. Вторая группа (2) - базальные клетки межхрящевых зон внутренней трахеи и бронхов. Они формируют нейроэндокринные тельца. Третья группа (3), один из вариантов Клара клеток (Clarav), может быть связана с нейроэндокринными тельцами (НЭТ) и расположена в бронхиолах. Четвертая группа (4) - клетки Клара В типа, связаны с альвеолярным каналом с помощью специфического бронхиолярного соединения (Бадж). Пятая группа (5) - альвеолярные клетки типа II или пневмоциты, расположены в альвеолах легких. Альвеолярные клетки типа I располагаются на поверхности альвеол, а альвеолярные клетки типа II - в центральной ее части (рис.2).

Рис. 1 - Расположение клеток-предшественников во взрослых легких мыши. Стрелки указывают на месторасположение определенных групп клеток в различных участках легкого (Liu et al., 2008).

1.2. Характеристика ATII клеток

Клетки Альвеолярного типа II (ATII) представляют собой одну из популяций клеток, расположенных в альвеолах легких. Сами альвеолы имеют пузырькообразную форму и отделяются друг от друга межальвеолярными перегородками, которые имеют толщину 2-8 мкм. Перегородки одновременно

являются стенками двух или нескольких соседних альвеол. Альвеолы имеют вид открытого пузырька диаметром около 120-140 мкм.

Рис. 2 - Структура альвеол. 1- макрофаг, 2-альвеолярная полость клетки, 3-пневмоциты (альвеолярные клетки) типа I, 4 - кардиолипин, 5- ламеллярные гранулы, 6-пневмоциты (альвеолярные клетки) типа II.

Наружная сторона стенок альвеол густо оплетена сетью капилляров, все они начинаются в легочной артерии и в результате, объединяясь, формируют легочную вену.

Внутреннюю поверхность стенок альвеол выстилает однослойный плоский эпителий. Он неоднороден и представлен 2-мя основными видами альвеолоцитов: I типа — плоскими, или респираторными клетками и Н-го типа — большими, или гранулярными клетками. В некоторой литературе вместо термина «альвеолоциты» используется термин «пн�