Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Информационные связи в стеблевых апексах растений при переходе к цветению

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Информационные связи в стеблевых апексах растений при переходе к цветению"

РГ6 -8

ОД ОНТ 1398

На правах рукописи

Никифорова Виктория Юлиановна

I

ИНФОРМАЦИОННЫЕ СВЯЗИ В СТЕБЛЕВЫХ АПЕКСАХ РАСТЕНИЙ ПРИ ПЕРЕХОДЕ К ЦВЕТЕНИЮ

03.00.12 - Физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1996

Работа выполнена в Лаборатории роста и развития Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Э.Л. МИЛЯЕВА

Официальные оппоненты: кандидат биологических наук

Э.И. ВЫСКРЕБЕНЦЕВА

доктор биологических наук, профессор А.П. МЕЛИКЯН

Ведущее учреждение: Главный ботанический сад РАН

(Москва)

Защита состоится 15 октября 1996 г. в 13 часов 30 минут на заседании Диссертационного совета К 002.45.01 при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирягева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан 13 сентября 1996 г.

Ученый секретарь А Л^ кандидатбиологичесКихн

Диссертационного совета <Т\ ч У М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы понимание сигнальных механизмов, определяющих рост и развитие растений, становится важнейшей целью современных исследований в физиологии растений [Ryan et al., 1991]. Ярким примером функционирования системы сигналов в развитии растений является фотопериодическая регуляция гзетения.

Согласно современным представлениям, в основе которых лежит теория зацветания М.Х.Чайлахяна [Чайлахян, 1988], переход фотопериодически чувствительных растений -к цветению происходит под влиянием образования в листьях в ответ на фотопериодический сигнал гормональных веществ, которые затем транспортируются из листьев в стеблевые апикальные меристемы, что приводит в конце концов к смене программы морфогенеза с вегетативной на репродуктивную. После поступления в гпекс опосредованного фотопериодического сигнала в фирме соответствующего гормонального стимула должна существовать надежная передаточная цепь между изменением содержания и активности гормонального вещества в клетках апекса, экспрессией флоральных генов в апикальных клетках и формированием новых генеративных тканей и органов.

Вероятные биохимические пути преобразования гормональных сигналов, приводящих к включению новых или к изменению экспрессии уже работающих генов, в настоящее время широко исследуются. Однако для успешного начала органогенеза место, или позиция, инициальных событий органогенеза с участием продуктов экспрессии этих генов должны быть строго определены. Клеточные же взаимодействия путем обмена позиционными инфоцмационными сигналами, происходящие после экспрессии генов, результатом которых является начало органогенеза в строго определенном месте стеблевой апикальной меристемы, остаются не установленными, так же, как остается неясной природа этих сигналов. Кандидатами на эту роль может быть целый ряд веществ, участвующих в росте и развитии растений. Олигосахариды выделяются из этого ряда веществ тем, что для них

показано участие в передающих сигналы системах, регулирующих не только развитие растений, но также формирование ответных реакций на воздействия внешней среды.

Основной целью настоящей работы было изучение клеточных взаимодействий, происходящих путем обмена информационными сигналами возможной олигосахаридной природы в стеблевом апексе растения после поступления туда гормонального стимула цветения при переходе к генеративному органогенезу.

Для достижения этой цели мы поставили следующие задачи исследования:

1. Выявить локализацию и последовательность органогенеза з стеблевых апексах рудбекии двуцветной и периллы красной с использованием методов сканирующей электронной микроскопии и поляризационной световой микроскопии .

2. Изучить симпластические пути передачи информационных сигналов в вегетативных и репродуктивных стеблевых апексах растений с использованием методов трансмиссионной электронной микроскопии.

3. Выявить возможное участие пектиновых олигосахаридных фрагментов клеточных стенок в качестве позиционные информационных сигналов в регуляции морфогенеза в стеблевом апексе.

4. Исследовать комплементарный компонент предполагаемой системы "сигнал - рецептор", а именно сравнить гликопротеиновые компоненты мембран клеток вегетативных и генеративных стеблевых апексов растений. ч

Научная новизна. С помощью сканирующей электронной микроскопии впервые была выявлена последовательность и локализация заложения репродуктивных органов в стеблевых апексах растений двух противоположных по фотопериодической реакции групп - длиннодневной Rudbeckia bicolor Nutt. и короткодневной Perilla nankinensis (Lour.) Dence.

Впервые показано, что развитие репродуктивного апекса рудбекии складывается из последовательного заложения и дифференцировки "простых" и "объединённых" меристем, обладающих разными типами симметрии. На определенном этапе развития меристема апекса рудбекии продуцировала общий примордий, из которого развивались примордии прицветника и цветка.

Впервые показаны изменения распределения плазмодесм з различных зонах стеблевого апекса при переходе к цветению;

показано формирование симпластических доменов зон стеблевого апекса, значение перераспределения симпластических доменов в стеблевом апексе при переходе к цветению.

На модельной системе стеблевых апексов интактных растений впервые проведено экзогенное воздействие пента- и октаолигогалактуронидами, и обнаружена морфогенетическая активность экзогенных олигогалактуронидов на интактных растениях in vivo.

Впервые гистохимическая методика определения специфичности гликопротеинов с помощью меченых пектинов применена к стеблевым апексам растений; показано различие а гпикопротеиновых компонентах мембран примордиев прицветников у рудбекии и периллы .

Теоретическое и практическое значение. В работе выдвинуты новые представления о возможных механизмах обмена морфогёнетич^скимя информационными сигналами в стебпевых апексах растений при переходе их от вегетативного состояния в репродуктивное.

Разработан усовершенствованный метод подготовки материала для исследования в сканирующем электронном микроскопе.

Разработана методика гистохимического определёния гпикопротеиновых компонентов мембран с помощью меченных пектинов в растительных тканях.

Полученные результаты вносят вклад в современные представления об информационном обмене в развитии растений, в частности, в морфогенезе стеблевых апексов при переходе от вегетативного состояния в репродуктивное.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на XI Международном симпозиуме "Эмбриология и семенное размножение" (Ленинград, 1990); на IX Всероссийском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых теп (Черноголовка, 1995); на II ежегодном симпозиуме ОФР РАН "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996); на Международной конференции Общества экспериментальной биологии "Регуляция развития растений: Гены и сигналы" (Дублин, Ирландия, 1996); на семинарах Лаборатории роста и развития Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Объем и структура 'диссертации. Диссертационна:! работа (М2. страниц, 2.4 рисунков, 3 таблиц) состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание применявшихся методик, изложение результатов опытов и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованной литературы ({2С наименований, из них 36 -зарубежных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Методики исследований.

1.1. Постановка физиологических опытов.

Растения рудбекии двуцветной (Rudbeckia bicolor Nutt., сем. Compositae) выращивали из се ,ян в условиях неблагоприятного для цветения короткого дня (8 часов света + 16 часов темноты). После достижения растениями возраста 3 месяцев вегетирующие растения подвергали воздействию увеличивающимся числом длинных дней (16 часов света + 8 часов темноты)-Продолжительность индукции длиннодневным фотопериодом составляла 6, 9, 12, 16 и 20 дней.

Растения периллы (Perilla nankinensis (Lour.) Dence, сем. Labiatae) выращивали в том же вегетационном домике и такой же почвенной культуре в течение 3 месяцев в условиях длинного дня, после чего подвергали воздействию возрастающим количеством коротких дней. Продолжительность короткодневной индукции составляла 5, 8, 14 и 20 дней.

1.2. Сканирующая электронная микроскопия.

Общепринятая методика подготовки материала для исследования в сканирующем электронном микроскопе позволила нам получить представление о расположении примордиев развивающихся органов, но не о взаимном расположении клеток стеблевой апикальной меристемы, так как поверхности клеток получались сморщенными, что искажало картину. Для устранения этого искажения мы испытали различные реагенты, которые могли бы повысить проницаемость клеточной стенки для фиксатора и ацетонов восходящей концентрации, применяемых в традиционной проводке. Лучшие результаты были получены после фиксации материала в течение 2 суток на холоде и последующей обработки 1% водным раствором танина, 10-15-минутной окраски 3% раствором хлорного железа FeCI3 Затем материал выдерживался в 0,5% водном растворе щавелевокислого аммония (МН4)2С204 • Н20 1 5 часов в термостате при температуре 87°С, в 17,5% растворе NaOH 20 часов при комнатной температуре и в 7,5% растворе Triton в течение суток на холоде. Далее обезвоживание и ьысушивание материала проводилось по методике, приведенной выше.

1.3. Поляризационная световая микроскопия.

Нами была разработана методика фиксации и контрастной окраски срезов in situ на основе красителя, предложенного Nelson [Nelson, 1990]. Краситель был приготовлен из мерных фабричных чернил, разведенных бутаног.ом в объемном соотношении 2:1. Добавление в краситель детергента Tween-20 в концентрации '\1/о давало лучшие результаты при микроскопическом наблюдении. Окрашенные срезы отмывались от детергента в дистиллированной воде, заливались глицерином, накрывались покровными стеклами и герметизировались расплавленным парафином. Наблюдение проводилось.с помощью поляризационной приставки на микроскопе фирмы "Carl Zeiss" марки NU 2 (Германия). Для фотографирования - использовалась пленка Микрат-200, увеличение на фотографиях 50-KpaTHOte.

1.4. Трансмиссионная электронная микроскопия.

Для трансмиссионной электронной микроскопии вырезали стебг.евые апексы высотой 1-1,5 мм. В качестве фиксатора использовали 3% раствор глютаральдегида в фосфатном буфере pH 7,4 с добавлением сахарозы из расчета 25 мг на каждый мл фиксатора. Фиксацию материала проводили в течение 18 часов на холоде. После пятикратной промывки в фосфатном буфере проводили дофиксацию материала 1%-ным раствором 0s04 в фосфатном буфере в течение 3 ч на холоде. Затем материал обезвоживали в серии спиртов и в ацетоне и заключали в заливочную смесь на основе эпона.

• I

%

1.5. Измерение частоты встречаемости плазмодесм.

Число плазмодесм на единицу длины клеточной стенки измеряли на электронных микрографиях с помощью MOP Videoplan (Reichert-Jung, Австрия). Расчет частоты встречаемости плазмодесм проводили, определяя длину клеточных стенок между соседними клетками (длину межклеточной границы) и число плазмодесм на 1 мкм этой границы (частота встречаемости плазмодесм).

1.6. Обработки апексов олигогалактуроновыми кислотами.

Стеблевые апексы трехмесячных растений рудбекии и периллы обрабатывали олигогалактуроновыми кислотами, полученными' из

гидролизата а-В-галактуронан'а [НетпсИоУэ е1 а1., 1980] и любезно предоставленными нам доктором К. Хенриковой (НетпсИоуэ К.) из Братиславского института химии (Словакия): растворами пентагалактуроновой кислоты (ПГК) в концентрациях

- б -7

5x10 М и 5*10" М и октагалактуроновой кислоты (ОГК) в концентрациях 106М и 10~7М для растений рудбекии и 5*10 6М ПГК и 10 6М ОГК для растенкй париллы. Закапывание проводили ежедневно в утренние часы. Объем раствора для одного закапывания составлял 0,5 мл. Таким образом, за 5 дней обработок каждое растение рудбекии получило суммарно 2,5 мл раствора, зл 10 дней обработок - 5 мл; каждое растение периллы за 10 дкз£. обработок получило 5 мл ргствора, за 20 дней обработок - 10 мл. Впитывание растворов происходило в среднем за 12 часов.

1.7. Исследование гликопротепнсвых компонентов мембран

вегетативного и генеративного апексов с помощью меченых пектинов.

Гликопротеиновые компоненты мембран вегетативного и генеративного апексов рудбекии и периллы исследовали с помощью конканавалина А, меченого пероксидазой. Для угнетения неспецифической активности эндогенной пероксидазы срезы выдерживали 20 минут в метаноле с добавлением 0,3% Н202-

Инкубирование срезов в растворе меченного пероксидазой конканавалина А концентрации 30 мкг/мл проводили на предметных стеклах, помещенных в чашки Петри. Оптимальное время составило 45 минут. Из двух испытанных нами хромогенов - ТМБ и ДАБ -предпочтение было отдано ДАБ, так как продукты его реакции с перекисью водорода имеют голубую окраску и при изучении окрашенных срезов в световом микроскопе легко выявляются.

Глава 2. Локализация и последовательность органогенеза в стеблевых апексах рудбекии и периллы .при переходе к

цветению.

Изучение локализации и последовательности процессов заложения примордиев вегетативных и генеративных органов меристемой стеблевого апекса необходимо для характеристики

путей регуляции морфогенеза в стеблевом . апексе высшего растения.

У рудбекии сначала возникают бугорки листьев наружной части обертки, затем - листьев внутренней части обертки. Через некоторое время появляются бугорки, которые мы вслед за Тукером называем "общими примордиямм" (термин Тукера [Tucker, 1975]). Особенность их состоит в том, что каждый такой общий примордий продуцирует адоксиальную флоральную меристему и абаксиальный примордий прицветника. Адоксиальная меристема цветка и абаксиальная меристема прицветника формируются из меристемы общего примордия синхронно, однако они сразу же становятся непохожими: меристема цветка - это вновь образованная меристема, нарастающая округлым холмиком и обладающая центральной симметрией, а меристема прицветника' организована дорзивентрально и обладает билатеральной симметрией. Таким образом, уникальность общего примордия, на наш взгляд, состоит в том, что он обладает сложной симметрией и дает начало как обладающей центральной симметрией меристеме цветка, так и билатерально-симметричной меристеме примордия прицветника.

Соцветие у периллы кистевидное. Перилла является типичным представителем растений с пазушным типом инициации меристемы цветков: после фотопериодической индукции коротким днем в апексе вегетировавшего растения в пазухах билатерально-симметричных примордиев прицветников совершенно обособленно закладывались овальные бугорки - примордии цветков, которые также обладали билатеральной симметрией. - -

Это позволяет сделать вывод о различном физиологическом статусе прицветных листьев у рудбекии и периллы, что подтверждается результатами наших опытов, выявивших качественные различия гликопротеиновых компонентов мембран, в том числе плазмалеммы прицветных листьев в репродуктивных апексах этих растений [Milyaeva et al., 1992].

Глава 3. Переориентация целлюлозных микрофибрилл в стеблевых апексах при переходе к цветению.

Основой исследования в поляризованном свете послужило присущее целлюлозе двойное лучепреломление, которое позволяло

судить о преимущественной ориентации микрофибрилл в даньом районе поверхности стебкевого апекса по большей или меньшей освещенности этого района в сравнении с фоном.

Исследование показаю, что как вегетативному, -так и репродуктивному органогенезу непосредственно предшествует изменение ориентации целлюлозных микрофибрилл в месте заложения примордия будущее органа. Полученные результаты показывают,- что произошедшие изменение в направлении целлюлозных микрофибрпл/! в клеточных стенках поверхности стеблевого апекса сформиоовали неоднородность разных участков апекса, и :>та неоднородность саязана с цальнейшей судьбс Г; выделенной изменением ориентации микрофибрилл группы клеток.

Глава А. Симплэстические связи в вегетативных и генерапвньк стеблевых апексах растений.

Пназмоде мы в стебжвых апоксах рудбекии д^уцвет, ой пргдетазляг.и ссбой темные тяжи, проходившие перпендикупярнс клеточной стенке. Как правило, они были расположены поодиночке или в аггрегатах по две. Часто на ультратонких срезах было видно, что к плазмодесмам со стороны цитоплазмы клетки подходят мембраны эндоплазматического ретикулюма. Иногда встречались разветвленные плазмодесмы.

Мы сравнивали частоту встречаемости плазмодесм в клетках контрольных и индуцированных апексов, центральной и медуллярной зон стеблевого апекса, а также в клетках первого, второго и последующих слоев (рис. 1 ).

Наибольшая частота встречаемости плазмодесм обнаружена между клетками первого и второго слоя в центральной зоне контрольного (не индуцированного к цветению) апекса. Слабее всего симплэстические связи были между клетками во втором слое центральной зоны контрольного апе:;са (Таблица 1, стат. обработка - в Таблице 2).

Для удобства сравнения частоты встречаемости плазмодесм в различных клеточных стенках мы использовали графики, предложенные Van Bei и названные им плазмодесмограммами [Van Bel et al., 1980]. На плазмодесмограммах частота встречаемости плазмодесм между различными стенками клеток пропорциональна числу линий между изображенными клетками (Таблица 3). '

Рис. 1. Схема продольного среза стеблевого апекса рудбекии двуцветной. 1 -центральная зона, 2 - 1«цуппярная зона, 3 - боковая зона. Стрелками обозначены стенки и слои клеток, в которых проводили подсчеты плазмодесм.

Сравнение контрольных и индуцировгнных апексов показало, что в центральной зоне неиндуцированных апексов частота встречаемости плазмодесм была распределена крайне неравномерно относительно слоев клеток (плазмодесмограмма рис. 2).

Частота встречаемости плазмодесм была особенно велика между клетками первого и второго слоев, примерно в два раза ниже между соседними клетками первого слоя. Во внутренних слоях клеток частота встречаемости плазмодесм между соседними клетками, напротив, дала самые йизкие значения из всех проведенных измерений (плазмодесмограмма рис. 2 а).-

В центральной зоне индуцированных апексов частота встречаемости плазмодесм была распределена гораздо более равномерно, что хорошо видно на плазмодесмограмме (плазмодесмограмма рис. 2 б). После индукции число связей между клетками первого слоя центральной зоны возрастало, а между клетками первого и второго слоя центральной зоны. напротив, уменьшалось (плазмодесмограмма рис. 2 а и рис. 2 б). Во втором слое частота встречаемости плазмодесм резко увеличивалась после фотопериодической индукции (плазмодесмограмма рис. 2 б). В целом число связей между клетками при

Таблица 1

Частота встречаемости плазмодесм в клеточных стенках разных зон стеблевого апекса рудбекии

Варианты опытов Расположение клеточных стенок Зоны стеблевых апексов

Централ1 на? Медулля эная

Частота встречаемости плазмодесм* Частота встречаемое Л1 (в %) Число линий на члазмодес-могрзмме Частота встреча-смости плазмодесм* Частота встречаемости (в %) Число линий на плазмодсс-мограмме

х С С с = * ч 2 § ь • 15 II ё 3 0,73 /0,02* 54 3 0,81 /0,01 ' 60 ! 1 ! ! ! 4

н X с 3 а != • 5 Т. • 1 5 и - 2 1 36 /1\02 100 6

а \и г х 5 5 = 2 5 с = а « 0,33 /0,01 24 1

"Р 1 - * ■А 2 - Я у 1 5 ' 5 о 1 5 я 0,80 /0,02 59 4 0,53 /0,01 39 2

о со . 3 а 3 -: ^ и 3 - г 0,77 /0,01 57 4

¡¡1 | ¡3 3 я о — о, в г о я 0,91 /0.02 67 4

* - число плазмодесм на 1 мкм клеточной стенки / ** - стандартная омтбка

Таблица 2.

Сравнение частоты встречаемости ппазмодесм в клеточных стенках разных зон ст"блевого апекса рудбекии.

N па ры Сравниваемые г.г.ры значений частот встречаемост и ппазмодесм Чис- . ло из-мере нйй Среднее арифметическое Среднее квадратичное отклоне -ние Стандартная ошибка Число степеней свободы рите-рий '.:тью-дента Досто- 1 верны 1 ли различия

1 0 ДД ц.з. 1 сл. 100 0,738 0,203 0,020

8 ДД а.з. 1 сл. 100 0,796 0,176 0,018 198 2,15 да ■

2 0 ДА ц.з. 1-2 сл 100 1,358 0,204 0,021

8 ДД ц.з. 1 -2 сп 100 0,769 0,144 0,01 4 198 23,56 да

3 0 ДА ц.з. 2 сг,. 100 0,327 0,040 0,0С4

8 ДД ц.з. 2 сл. 100 0,910 0,153 0,015 198 37,13 да

4 0 ДД м.з. 200 0,814 0,174 0,012

8 ДД м.з. 200 0,530 0,093 0,007 398 ¿0,29 да

5 0 ДД ц.з. 1 сл. 100 0,738 0,203 0,020

0 ДД ц.з. 2 сл. 100 0,327 0,040 0,004 198 20,55 да

6 8 ДД ц.з. 1 сл. 100 0,796 0,176 0,018

8 ДД ц.з. 2 сл. 100 0,910 0,153 0,01 5 198 4,96 да I

>7 8 ДД ц.з. 300 0,825 0,190 0,011 1

8 ДД м.з. 200 0,530 0,093 0,007 498 22.69 ! да !

8 0 ДД ц.з. 300 0,808 0,267- 0,016 1 1

0 ДД м.з. 200 0,814 0,174 0,012 498 0,31 нет 1

9 0 ДД ц.з. 1 сл. 100 0,738 0,203 0,020 1

0_ДД ц.з. 1 -2 сп 100 1,358 0,204 0,021. 198 21,38 да !

Сокращения, использованные в таблице: ц.з. - центральная зона, м з. - медуллярная зона, 1 сл. - антиклинальное стенки между кл-зтками первого слоя, 2 сп. - перикпинаг.&ние и антиклинальные стенхи между клетками второго и более глубоких слоев, 1 -2 сл. - периклкчальные стенки между клетками первого и второго споее.

Таблица 3.

Определение числа пиний на плазмодесмограмме.

Комбинация смежных клеток Частота встречаемости ппазмодесм % от наибольшей частоты встречаемости Число линий на ппазмодесмограмме

0 ДД, Ц.З., 1-2 слои 1,358 100 6

8 ДД, Ц.З., 2 слой 0,91 67 4

0 ДД, М.З., слои 0,814 60 ~ 4

8 ДД, Ц.З., 1 слой 0,796 59 4 •

18 ДД, Ц.З., 1-2 слои 0,769 57 4

0 ДД, U.3., 1 слой 0,738 54 3

8 ДД, М.З., 2-3 спои 0,728 54 3

8 ДД, М.З., 1 слой 0,465 34 2

0 ДД, Ц.З., 2 слой 0,327 24 1

переходе от вегетативного состояния к репродуктивному возрастало.

Сравнение частоты встречаемости ппазмодесм между клетками медуллярной зоны до и после фотопериодической индукции пскезапо статистически достоверное уменьшение числа связей после индукции (пяазмодесмограмма рис. 2 в, г).

В ряде р-абот, посвященных исследованию плаз.модесменного аппарата [Erwee et л!., 1985; Beebe et ai., 19S1], было показано, что существует некоторая симпластическая компзртментация. Таким образом, з приведенных выше работах показано разделение симппаста на симпластические домены, 'определяемые частотой встречаемости ппазмодесм а кпзточных стенках соседних клеток. -Симпластические домены характеризуются симпластическим током между клетками внутри домена, отличным по своей интенсивности от такового вне данного симпластического домена.

Центральная зона

О ДД (контроль)

8 ДД (опыт)

Г

слои

К

г >

II слои

ч

1 !

I слой

II слои!

III слой

Г

!11 слой \_У

а

б

Медуллярная зоне О ДД (контроль) 8 ДД (опыт)

В

Г

Рис. 2

Распределение частот встречаемости плазмодесм, представленное в форме п.тазмозосмограмм

Наши измерения показали возрастание частоты встречаемости пгазмодесм в первом и втором слоях клеток центральной зоны и уменьшение частоты встречаемости плазмодесм в медуллярной зоне индуцированных апексов. Это позволило нам прийти к заключению о том, что после фотопериодической индукции в 8 ДД формируется симплааичесхий домен центральной зоны, ограничивающий симпластический ток межяу центральной и медуллярной зонами индуцированного апекса. Существование доменов было обнаружено также во флорапьных апексах Iris Bergmans et al. [Bergmans et al., 1993] при изучении проницаемости симпласта в экспериментах с микроиньекциями флюоресцентных красок. Однако использованная Бергмансом методика позволила выявить симпластические домены лишь на поверхности стеблевого апекса," поэтому сопоставить эти данные с нашими данными о доменах во внутренних слоях апекса не представляется возможным.

С точки зрения информационного обмена, при переходе к цветению основной функцией симпластического" домена центральной зоны, вероятно, является обеспечение проведения информационных сигналов для координации дифференциации клеток и тканей при развертывании новой генеративной программы морфогенеза. Таким образом, симпластический домен центральной зоны можно считать информационным доменом.

Можно полагать, что формирование симпластических доменов центральной и медуллярной зон стеблевых Апексов необходимо для проведения информационных сигналов внутри апекса и, вероятно, является одним из необходимых звеньев в цепи процессов от экспрессии репродуктивных генов до начала репродуктивного органогенеза.

Глава 5. Влияние олигогалактуроновых кислот на переход к цветению.

Для проверки участия пектиновых олигосахаридных фрагментов клеточных стенок в качестве информационных сигналов в регуляции морфогенеза мы изучали'влияния экзогенных олигогалактуроновых кислот на переход растений рудбекии и перилл:^ « цветению. ^

Рудбекия. В опытах с рудбекией пента- и октагалактуроновая кислоты влияли на морфогенез: у большей части растении, происходило стеблевание в условиях неблагоприятного фотопериод ; (рис. 3). В результате 5-днеЕной обработки пентагалактуроноЕой

75. _

50._

25. _

5 х 1

I стеблевания

/—51

Пентагалактуро- Октзгглэктуро-новая кислота новая кислота

5 х 10"7М

% стебле-

75--

Пентагапактуро- Октагалактуро-новая кислота новая кислота

К - контроль без обработок

| | - 5 дней обработок

- 10 дней обработок

Рис. 3. Влияние экзогенных опигогялактуроноьых кислот на морфогенез растений рудбекии

-6

кислотой в концентрации 5x10 М'у 27% растений наблюдали стеблевание, при уменьшении концентрации до 5x10 ''м стеблевание наблюдали уже у 51% растений в результате 5-дневнпй обработки, и у 26% растений - в результате 10-дневной

обработки. 5-дневная обработка апексов рудбекии

-6 -7

октагалактуроновой кислотой в концентрациях 5x10 М и 5x10 М вызвала образование стеблей у 7£% растений, 10-дневная

обработка

лишь у 50% растений. Таким образом,

октагалактуроновая кислота (ОГК) показала бо' 'ьшую

физиологическую активность по сравнению с пентагалактуроновой кислотой (ПГК). Если концентрация ОГК не влияла на ее физиологическую активность, то уменьшение в 10 раз концентрации раствора ПГК дало более высокий % стеблевания. Интересно отметить, что 5-дневная продолжительность обработок оказалась гораздо более эффективной во всех вариантах опытов с рудбекией по сравнению с 10 днями обработки (рис. 3).

Перилла. У периллы максимальный эффект был получен у растений, обработанных ПГК и ОГК в сочетании с недостаточными для зацветания 5 днями короткодневной фотопериодической индукции - соответственно 63% и 100% растений сформировало бутоны к сороковому дню после начала обработок (рис. 4).

Пентагалактуро-новая кислота

j I % бутонизации

100-

80-

60-

40-

20-

Октагалактуро-новая кислота

100 -

80 -

60

40-

20

% бутонизации

К

дд

5КД

18 КД

ДД

5 КД 18 КД

К - контроль без обработок

1-' - 10 дней

обработок

- 20 дней обработок

Рис,.. 4,

Влияние экзогенных олигогалаюуроновых кислот на морфогенез растений периллы

ПГК оказалась также физиологически активной при обработках растений периллы, находившихся в неиндуктивных условиях на длинном дне: 35% растеуий перешли к бутонизации; и при обработках растений в сочетании с 18 короткими днями фотопериодической индукции - переход к цветению оказался заторможенным по сравнению с необработанным контролем: к сороковому дню после начала обработок ни одно обработанное ПГК растение не сформировало бутонов, в то время как все контрольные (не обработанные ПГК) растения зацвели.

Обработанные ОГК растения в неиндуктивных условиях оставались в вегетативном состоянии, как н контрольные растения, не подвергавшиеся обработкам. В сочетании с 18 короткими днями фотопериодической индукции обработки ОГ]С полностью затормозили переход растений к.цветению: ни одно обработанное ОГК растение не зацвело, в то время как все контрольные -необработанные ОГК - растения зацвели (рис.

Таким образом, впервые опыты по обработкам стеблевых апексов интактных растений in vivo олигогалактуроновыми кислотами показали их несомненную морфогенетическую активность при переходе растений от вегетативного состояния к цветению.

По-видимому, олигога лактуроновые кислоты могут участвовать в системе передачи информационных сигналов, возникающих в растениях после запуска соответствующей генетической программы под влиянием фотопериодической индукции цветения.

Глава 6. Различия в гликопротеиновых компонентах мембран вегетативных и генеративных стеблевых апексоз.

Несмотря на то, что в настоящее время существует обширная литература, касающаяся молекулярных основ узнавания и передачи сигналов, в том числе и углеводных детерминант гликопротеиновых компонентов мембран в животных клетках и тканях, у растений изучение гликопротеинов проводилось в основном в связи с процессами узнавания при взаимодействиях :

. поверхности

рыльца и пыльцевого зерна [Dowghty et al., 1993].

Исследование углеводной специфичности гпикопротеиновых компонентов мембран вегетативных и репродуктивных органов рудбекии и периллы с помощью меченого конканавалина А, специфически связывающегося с остатками a-D-маннозы и a-D-глюкозы, показало, что листовые примордии в вегетативных почках рудбекии не окрашивались, в то время как в репродуктивных почках положительную реакцию давали примордии прицветников. Положительная реакция была получена в плазмалемме, тонопласте, ядерной оболочке.

Все контрольные варианты не обнаружили окраски, что свидетельствует о специфичности реакций.

Таким образом, данное исследование показало, что состав углеводных остатков гликопротеинов плазмалеммы клеток вегетативных и генеративных стеблевых апексов у рудбекий неодинаков. Это позволяет сделать вывод о различном физиологическом статусе прицветных листьев у рудбекии и периллы, что подтверждается результатами наших опытов, выявивших принципиальные различия в заложении и развитии прицветных листьев и цветков у рудбекии и у периллы [глава 2 данной работы].

\

Ряд современных исследований рецепторов сигналов в клетках животных и растительных организмов описывает поверхностно-расположенные глико-содержащие рецепторы сигналов [Faye et al., 1988; Ryan et al., 1991]. л

Сопоставление этих данных с результатами наших исследований углеводной специфичности гпикопротеиновых компонентов мембран клеток вегетативных и репродуктивных стеблевых апексов может указывать на то, что позитивное пектиновое окрашивание участков генеративных апексов, вероятно, выявляет места возможного взаимодействия поверхностных гликоконьюгатов - гликопротеинов клеточных мембран - с морфогенетйчески активными олигосахаридами.

О природе таких взаимодействий судить сложно, однако сопоставление полученных нами данных о несомненной морфогенетической активности олигогалактуронидов с выявленными нами различиями в физиологическом статусе примордиев вегетативных листьев и прицветников рудбекии и

периллы, а также в гликопротеиновых компонентах мембран клеток этих органов указывают на возможное функционирование системы передачи сигналов <олигогалактуронид-гликопротеин>. В этой системе специфические последовательности олигогалактуронидсв могут являться позиционными сигналами или одним из звеньев в цепи передачи информационных морфогенетических сигналов, углеводные компоненты гликопротеинов - рецепторами сигналов при вегетативйом и генеративном морфогенезе. Предшествующим звеном цепи может являться активация либо генная экспрессия фермента, отщепляющего от пектина клеточной стенки специфический олигогалактуроновый фрагмент (рис. 5). В пользу такого предположения говорит исследование МакДугалла с соавт. [McDougall et at., 1991]. Ими было показано, что биологически активные олигосахариды генерируются при частичном постсинтетическом гидролизе внеклеточных полисахаридов более, чем путем синтеза олигомера de novo .

г

Экспрессия

генов,

некоторые

Один из возможных путей информационных потоков в .. стеблевом апексе - гапаюуроновый сигнал -гликопротеиновый рецептор - при переходе к цветению (гипотетическая схама)

Появление

морфогене-

тически

активных блигогапак-

Захват олигогалактуронового морфогена гликопрсгтеиноеыл рецептором в строго

огределеннсм положением

рецептора месте стеблевого апекса

Рецепция фото-

периодьмеской индукции

Вегетативный апекс Генеративный апекс

ГйС. 5

Современная физиология и биология развития растений не дает нам достаточно данных для проверки нашего предположения. У представителей животного мира показана роль нативных углеводов в качестве маркеров клеток развивающихся органов и тканей, компетентных к определенным сигналам. Так, Стрейтом с соавт. [Streit et al., 1995] было показано, что углевод L5 может считаться маркером клеток, способных к ответу на индукцию невральього сигнала в эмбрионе цыпленка.

Современные исследования в области медицины также дают некоторую информацию о возможных взаимодействиях элементов системы углеводный остаток - гликопротеид. Так, углеводная часть одного из гормонов (FSH, Follicle-Stimulating-Hormone -стимулирующий фолликул гормон) гликопротеиновой природы, участвующего в развитии и созревании фолликула яичника и в' сперматогенезе, собирается на 52-м и 78-м остатках аспарагина на а-субьединице и на 7-м и . 24-м остатках на ß-субьединице. Кроме того, в системе in vitro наличие углеводного остатка в положении «-52 является необходимым условием эффективной передачи сигналов [Bishop et al., 1995].

При передаче нервных сигналов в тканях человека также показано участие передающей сигналы системы гликопротеид -олигосахарид. Нервный сигнал распознают углевод-несущие • молекулы: гликопротеины, гликолипиды или протеоглюканы. Такие молекулы найдены на поверхности клеток или во внеклеточном матриксе, их функции - это регуляция клеточных взаимодействий в процессе paзвитияj в процессе изменения активности синапса, а также в процессе регенерации нервных связей после повреждения у взрослых. Экспрессия углеводов, вероятно, тонко настроена для этих функций. Среди идентифицированных углеводов -полйсиаловая кислота, глюкуроновая кислота с сульфатом в положении 3' (З'-sulfated glucuronic acid) и олигоманнозные остатки. Они действуют не только между соседними поверхностями клеток-партнеров (транс-взаимодействие), но также между молекулами, участвующими в узнавании в поверхностной мембране одной клетки (цис-взаимодействие), тем самым формируя комплексы, влияющие на передачу сигналов внутрь клетки [Schachner et al.,' 1995].

Для выяснения тонких механизмов функционирования передаточной цепи информационных сигналов в стеблевых апексах

гг

растений при переходе к цветению необходимы дальнейшие исследования.

Выводы.

1. Выявлена последовательность органогенеза в стеблевых апексах дпиннодневной рудбекии и короткодневной периллы.

Обнаружено различие в морфогении прицветных листьев у рудбекии и периллы:.

2. Изменение направления целлюлозных микрофибрилл предшествует как вегетативному, так и репродуктивному органогенезу; место закладки листового примордия и цветочного' бугорка соответствует положению группы клеток, характеризующейся изменением ориентации целлюлозных микрофибрилл.

3. После экспрессии репродуктивных генов до начала репродуктивного органогенеза происходит формирование симпластических доменов центральной и медуллярной зон стеблевых апексов. Вероятно, формирование симпластических доменов необходимо для проведения информационных сигналов внутри апекса.

4. Окта- и пента-галактуроновые кислоты в определенных концентрациях проявляют морфогенетическую активность в переходе растений от вегетативного состояния к цветению. По-видимому, олигогалакгуроновые кислоты могут участвовать в системе передачи информационных сигналов, возникающих в растениях после запуска соответствующей генетической программы под влиянием фотопериодической индукции цветения.

5. Гликопротеиновые компоненты мембран клеток вегетативных и репродуктивных апексов различны. Это указывает, вероятно, на неодинаковую компетентность гликопротеиновых рецепторов к узнаванию возможных опигосахаридных компонентов информационной морфогенетической сигнальной системы.

6. Обеспечение информационного обмена в стеблевых апексах растений при переключении морфогенетической программы развития с вегетативной на репродуктивную может осуществляться, по-видимому, при участии информационных сигналов в стеблевых апексах растений посредством специфического связывания углеводного компонента

гликопрпотеинового рецептора с олигосахаридным компонентом

информационной сигнальной системы.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Миляева Э.Л., Никифорова В.Ю., Комарова Э.Н. Использование меченых пектинов для изучения углеводной специфичности гликопротеиновых компонентов мембран вегетативных и репродуктивных органов растений. // Цитология. - 1991 - Т. 33. - W9. - Сс. 86-87.

2. Миляева Э.Л., Комарова Э.Н., Ковалева J1.B., Никифорова В.Ю. Использование меченых пектинов для выявления различий между вегетативными и репродуктивными тканями растений. // Тезисы докладов И Сьезда ВОФР, Минск, 1990. - Москва. ' - 1992. - С. 137.

3. Никифорова В.Ю. Электронномикроскопическое изучение особенностей формирования репродуктивных элементов рудбекии и периллы. // Тезисы докл. II Сьезда ВОФР, Минск, 1990. - Москва. - 1992. - С. 148.

4. Milyaeva E.L, Nikiforova V.J., Komarova E.N. Sugar specificity of glycoprotein membrane components in plant reproductive organs. // XI Intern. Symp. "Embryology and Seed Reproduction", Proceedings. St.-Petersburg, Nauka. - 1992. -Pp. 365-366.

5. V. Nikiforova, E. Milyaeva, N. Rodionova. Possible participation of cell wall carbohydrates in plant morphogenesis. // 4th International Congress of Plant molecular Biology, The Netherlands. Abstracts. - Amsterdam RAI. -1994. - N939.

6. Никифорова В.Ю., Миляева Э.Л. Особенности органогенеза в стеблевых апексах рудбекии и периллы при переходе к цветению. //Физиология растений. - 1995. - Т. 42. - N2. - Сс. 187-194.

7. V.J. Nikiforova, E.L. Milyaeva. Effect of oligogalacturonic acids on transition of plants from vegetative to reproductive morphogenesis. // 1 5th Conference on Plant Growth Substances, Abstracts. Minneapolis, Minnesota, USA. - 1995. -N278.

8. Миляева Э.Л., Никифоврва В.Ю. Симппастические связи в стеблевом апексе рудбекии при переходе к цветению.

//Физиология растений. - 1995. - Т. 42. - W5. - Сс. 720-7267,

9. . V.J. Nikiforova, E.L. Milyaeva. Application of REM for studying

of organogenesis in stem apice%,of plants. // .IX Russian Symposium pn Scanning Electron Microscopy and Analytical Methods of solids investigations, Abstracts. Chernogolovka, Russia. - 1995. - Pp. 170-171.

10. Никифорова В.Ю., Миляева Э.Л., Родионова H.A. Влияние олигогалактуроновых кислот на переход растений от вегетативного морфогенеза к репродуктивному. // Доклады Академии Наук. - 1995. - Т. 343. - N6. - Сс. 831-833.

11. В.Ю. Никифорова, Э.Л. Миляева. Регуляция морфогенеза растений с помощью олигогалактуроновых кислот. // Тезисы докладов II Ежегодного симпозиума ОФР РАН "Физико-химические основы физиологии растений". Пенза. - 1996.

12. V.J. Nikiforova, E.L. Milyaeva. informational signaling in stem apices during transition to flowering. // Control of Plant Development: Genes and Signals, Abstracts. Dublin, Ireland. -

1996,- S Ы.