Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование методов культивирования и консервации меристем в селекции картофеля

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Манжулин, Анатолий Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II

1. Сохранение сортов и видов картофеля клубнями и семенами. II

2. Сохранение сортов и видов картофеля при использовании методов культуры тканей

3. Сохранение сортов и видов картофеля при сверхнизких температурах 21 З.а. Особенности сохранения биологических объектов при сверхнизких температурах

З.б. Глубокое замораживание объектов растительного происхождения

3.в. Влияние процесса замораживание - хранение -оттаивание на выживаемость апексов и сохранение генетической стабильности

4. Использование методов криоконсервации пыльцы картофеля в селекционной практике

Глава П. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава Ш. ВЛИЯНИЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ АПЕКСОВ

И ИХ М0РЮИЗИ0Л0ГИЧЕСК0Г0 СОСТОЯНИЯ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ ПОСЛЕ ЦИКЛА ЗАМОРАЖИВАНИЕ-ОТТАИВАНИЕ

Глава 1У. ИЗУЧЕНИЕ МАТЕРИАЛА, ПОДВЕРГНУТОГО ОБРАБОТКЕ ХОЛОДОМ

I. Характер и интенсивность роста стеблевых апексов картофеля после цикла замораживание-оттаивание

2. Морфологическая оценка и биохимический анализ растений-регенерантов, полученных из апексов после глубокого замораживания

Глава У. ОСОБЕННОСТИ КРИОСОХРАНЕНИЯ ДРУГИХ СОРТОВ И ВИДОВ КАРТОФЕЛЯ

Глава У1. КРИОСОХРАНЕНИЕ ПЫЛЬЦЫ КАРТОФЕЛЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КРИОБАНКА ПЫЛЬЦЫ В ВЫПОЛНЕНИИ СЕЛЕКЦИОННЫХ ПРОГРАММ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование методов культивирования и консервации меристем в селекции картофеля"

Проблема сохранения генофонда растительного мира является одной из первостепенных в связи с тем, что в настоящее время значительное количество ценных и редких видов растений находится на грани полного исчезновения. По последним данным число: этих видов составляет около 444 наименований (Красная книга, 1978). Если исходить из общегосударственного значения того или иного вида растений, то на территории СССР в охране нуждается около 4000 видов (Красная книга, 1975). Безотлагательное решение проблемы сохранения генофонда мировой флоры необходимо в первую очередь потому, что спасение отдельных видов растений уже невозможно без осуществления специальных мер сохранения (Fisher et.ai.,1969). Заинтересованность в сохранении всего многообразия мировой флоры связана с рядом причин, однако, исходя из чисто практического использования, можно выделить две основные. Во-первых, еще мало изучены свойства подавляющего большинства видов растений. В хозяйственной деятельности человечество использует только ничтожную часть богатств растительной природы, поэтому потеря даже незначительного числа видов, которые могут обладать ценными, еще неизвестными нам свойствами, является недопустимой. Во-вторых, сохранение генофонда растительной флоры является важным для проведения селекционной работы с целью получения новых и улучшения существующих хозяйственно-ценных видов и сортов растений (Красная книга,1975).

Картофель не относится к числу редких видов растений, однако, учитывая его сельскохозяйственную и промышленную ценность, а также тревожные сигналы о том, что некоторые его виды находятся на грани исчезновения или уже перестали существовать (Huamas, 1980), можно с уверенностью говорить о том, что и для картофеля решение проблемы сохранения всего его сортового и видового разнообразия имеет немаловажное значение.

В практическом отношении сохранение генофонда картофеля имеет большое значение для успешного проведения селекционной работы, Для выведения новых перспективных сортов картофеля селекционеры имеют в своем распоряжении большое разнообразие исходного материала - лучшие отечественные и зарубежные сорта, гибридные формы, дикие и примитивные культурные виды. Уже сам факт существования коллекции ставит перед селекционерами задачу полного ее сохранения. Кроме того, повышенные требования, предъявляемые к новым сортам, которые должны превосходить по урожайности, крахмалистости и другим хозяйственно-биологическим признакам лучшие сорта-стандарты, районированные на значительных посадочных площадях, вынуждают селекционеров расширять генетическую базу, т.е. укрупнять коллекции исходного материала. Поддерживание больших коллекций, которые обычно размещают в поле, не только трудоемкий процесс, но и не очень надежный, так как не исключаются потери образцов коллекции вследствие неблагоприятных условий среды, болезней, вредителей, нарушения агротехники и других факторов. Такие потери не только обедняют коллекцию исходного материала, но и сводят на нет многолетний труд селекционеров, вложенный в каждый входящий в нее сорт или перспективный гибрид.

Введение картофеля в культуру (Р.Г.Бутенко, 1964, Morel,Muller, 1964,Murashige, 1974,Ме11ог,Stace-Snith,1977) позволило частично решить проблему сохранения коллекций сортов и видов, по крайней мере исключить влияние тех неблагоприятных факторов, которые имеют место при выращивании картофеля в полевых условиях. Однако нельзя с уверенностью говорить о достаточной надежности этого способа сохранения коллекции не только потому, что при-его использовании не исключена возможность инфицирования материала во время пересадок, но и потому, что не исключается вероятность потери исходных образцов в результате непредвиденных изменений на генном, хромосомном и клеточном уровнях (мутации, хромосомные абберации, изменение плоидности). (Ф.Л.Калинин и др., 1980).

В последнее время исследователи ряда стран изучают возможность использования для сохранения генофонда различных видов растений принципиально нового способа, основанного на глубоком замораживании и последующем хранении при сверхнизких температурах клеточных культур и меристематических верхушек побегов. Наибольший интерес в этой области исследований представляет криосохранение апексов, как генетически стабильного объекта, из которого можно легко получить растения-регенеранты, тем более, что на примере ряда видов растений уже показана возможность глубокого замораживания и последующего возобновления роста апексов (А.С.Попов, 1982). К тому времени, когда были получены первые положительные результаты по криоконсервации растительных клеток и тканей, о преимуществах этого способа, в частности его надежности и обеспечении продолжительного хранения материала, уже было известно из экспериментальных данных по глубокому замораживанию и длительному хранению при сверхнизких температурах клеток животных и микроорганизмов (Мегутап, 1966,Магиг, 1970). Поэтому первостепенным вопросом, который предстояло изучить, был вопрос не о пригодности условий сверхнизких температур для хранения клеток и тканей растений в смысле надежности и длительности хранения, а о том, какие условия предварительной подготовки материала и проведения глубокого замораживания и оттаивания требуются для того, чтобы клетки и ткани были способны сохранять жизнеспособность и способность к морфогенезу, оставаясь при этом генетически стабильными. Такой подход к решению проблемы является наиболее правильным, особенно в отношении предварительной подготовки материала, причина необходимости и продолжительности которой еще плохо изучена.

Изучение возможности сохранения генофонда картофеля путем криоконсервации апексов было начато сравнительно недавно, тем не менее, оно было довольно успешным. Исследуемые виды картофеля сохраняли способность к регенерации целого растения после криоконсервации апексов (Bajao, ,1977,Grout, Henshaw, 1978, Towill, 1979). Однако ни один из авторов не взял на себя смелости заявить о том, что разработанный им способ может быть универсальным и позволит сохранить по крайней мере сортовое разнообразие картофеля. Таким образом, для картофеля вопрос о возможности использования методов криоконсервации апексов остается открытым и для его решения необходимы дальнейшие исследования.

Наряду с криоконсервацией сортов и видов картофеля, криогенную технику используют и для других практических целей, в частности, для сохранения пыльцы картофеля. Целью последнего является расширение программы скрещиваний в направлении создания новых раннеспелых высокоурожайных сортов картофеля за счет вовлечения в скрещивание позднеспелых сортов-опылителей, которые обычно не включают в селекционную программу в качестве отцов из-за того, что в большинстве случаев фаза цветения протекает у них намного позднее, чем у раннеспелых и среднеспелых сортов. В настоящее время уже имеются данные о сохранении фер-тильности пыльцы картофеля после длительного хранения в жидком азоте, однако вопрос о том, может ли пыльца после длительного хранения в глубокозамороженном состоянии заменить свежесобранную пыльцу, т.е. насколько она сохранила свои функции, еще недостаточно изучен.

Целью нашей работы было:

I. Изучение влияния предварительной подготовки, морфо-физиологического состояния апексов,, условий предкультивирования и рекультивирования на их выживаемость и сохранение способности к регенерации целого растения после цикла замораживание-хранение-оттаивание, для выявления общих закономерностей, которые позволят создать универсальный способ криоконсервации сортов и видов картофеля.

2. Определение пригодности использования в селекционной работе пыльцы картофеля после длительного (не менее года) хранения ее в жидком азоте.

В связи с тем, что проблема криоконсервации апексов картофеля уже изучалась некоторыми зарубежными исследователями, нашей основной целью было выявление позитивных и негативных сторон существующих методов криоконсервации апексов и разработка, с учетом этих наблюдений, способа криоконсервации с более широкими возможностями, т.е. пригодного для сохранения большинства видов и сортов, составляющих генофонд картофеля.

В задачи наших исследований входило:

- подбор оптимальной концентрации криопротекторов и определение допустимого времени инкубирования апексов в их присутствии;

- определение влияния размера, морфофизиологического состояния апексов и их местонахождения на материнском растении на последующую выживаемость апексов после цикла замораживание-хранение-оттаивание;

- подбор оптимального режима замораживания апексов;

- определение влияния "затравки" кристаллизации раствора криопроектора, окружающего апексы, на выживаеость последних после медленного замораживания, хранения, оттаивания;

- выявление наличия или отсутствия изменений у апексов после глубокого замораживания по сравнению с исходным сортотипом;

- проведение наблюдений за изменением характера и интенсивности роста растений-регенерантов, полученных из обработанных холодом апексов в сравнении с апексами, находившимися в обычных условиях выращивания;

- определение степени пригодности разработанного способа криоконсервации для разных сортов и видов картофеля;

- определение надежности сохранения регенерационной способности апексами, находившимися в глубокозамороженном состоянии длительное время.

В случае криосохранения пыльцы наши задачи заключались в:

- определении жизнеспособности пыльцы картофеля после глубокого замораживания и разных сроков хранения в жидком азоте;

- определении уровня фертильности пыльцы по истечении одного года хранения в условиях сверхнизкой температуры по скрещиваниям с несколькими произвольно выбранными партнерами в сравнении со свежесобранной пыльцой.

Научная новизна. Изучено влияние различных вариантов предварительной подготовки апексов на их выживаемость после проведения цикла замораживание-оттаивание. Установлено, в каком мор-фофизиологическом состоянии апексы стойко сохраняют способность к регенерации целого растения. Выявлены некоторые закономерности в изменении характера роста апексов, находившихся в глубокозамороженном состоянии. Выявлены общие закономерности, связанные с морфофизиологическим состоянием апексов, обусловливающие их выживаемость в цикле замораживание-оттаивание. Определено влияние продолжительности нахождения апексов в жидком азоте на их выживаемость и сохранение морфогенетических потенций.

Практическая ценность и реализация. Впервые в СССР разработан универсальный и надежный способ криоконсервации апексов картофеля, позволяющий сохранять образцы в жидком азоте в неизменном состоянии длительное время, который может быть использован для создания банка генов коллекции исходного материала, включающей разнообразные сорта, гибридные формы и виды картофеля. Показана пригодность метода криоконсервации пыльцы картофеля, обусловливающего использование ее в программе скрещиваний по истечении 12 месяцев хранения в жидком азоте.

Внедрение в практику. На базе ИФР АН СССР создан банк пыльцы картофеля лучших сортов-опылителей, которая будет использоваться в программе скрещиваний в ближайшем году, а также и в последующие годы.

Основная часть работы выполнена в лаборатории культуры тканей и морфогенеза ШР АН СССР. Полевые опыты и биохимические анализы проведены в НИИ картофельного хозяйства МСХ РСФСР.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Манжулин, Анатолий Владимирович

!• Для глубокого замораживания наиболее пригодным объек том являются апексы клубневых проростков , вычлененные из пазу хи листьев 3-4 яруса, находящиеся в стадии формирования нового листового примордия.2. Для успешного замораживания стеблевых апексов необходи ма их предварительная подготовка, которая заключается в культи вировании апексов в течение 5 часов на среде без ДМСО с после дующей экспозицией их на среде с Ъ% ДМСО в течение 20 часов, непосредственно перед замораживанием,

3, Наиболее оптимальный режим замораживани№Ч>хлаядение "затравку" (инициацию кристаллизации) путем погружения дна ампул в жидкий азот на 1,0 сек, при температуре -5 С с последующей

4. После цикла замораживание-оттаивание у апексов изменяет ся характер роста, что ведет к более быстрому развитию побегов из отдельных апексов, однако в среднем по интенсивности роста и развития апексов не было существенных различий между опытными и контрольным вариантами.5, По наступлению и прохождению фенологических фаз развития, морфологическим признакам и биохимическим показателям не было существенных различий мевду опытными и контрольными образцами.6, Стеблевые апексы могут длительное время (не менее 21 ме сяца) находиться в жидком азоте без потери жизнеспособности и способности к регенерации целого растения.7. Разработанный нами способ криоконсервации апексов вполне пригоден для сохранения сортов вида Solanxim tubeirasum . Ддя установления его пригодности для криосохранения других видов картофеля необходимы дальнейшие исследования.8. Для успешного криосохранения пыльцы картофеля необходи ма ее предварительная подготовка - подсушивание при комнатной температуре в течение суток непосредственно перед замораживанием,

9. Наиболее простым и надежным способом глубокого заморажи вания пыльцы является погружение ее в сухих ампулах прямо в жидкий азот,

10. Пыльца картофеля сохраняет фертильность после хранения в жидком азоте в течение года на том же уровне, что и свежесоб ранная и может при необходимости с гарантией заменить последнюю.11. Способ криоконсервации апексов можно успешно использо вать в селекционных центрах для сохранения коллекций исходного материала картофеля; способ криосохранения пыльцы можно рекомен- .довать с целью длительного хранения пыльцы картофеля для надежной и целенаправленной работы селекционеров,

12. Применение криоконсервации апексов для сохранения коллек ционного материала и пыльцы для подбора в скрещивании родитель ских пар, различающихся по времени цветения, увеличит возможно сть и рентабельность селекционного процесса в картофелеводстве,

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Манжулин, Анатолий Владимирович, Москва

2. Букасов С М Камераз А.Я. Селекция и семеноводство картофеля. Л.гКолос, I972.-359 с.

3. Будин К.З., Шинкарев В.И., Оглуздин H.G. Биохимический анализ клубней картофеля, полученных в пробирочной культуре.Доклады ВАСХНИЛ, I98I, 7. с.8.

4. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.:Наука, I964.-270 с.

5. Винклер Г.Н., Бутенко Р.Г. Применение черенкования при выращивании безвирусных растений картофеля методом культуры меристемы. Физиология растений, 1970, т.17, вып.4.с,851-853.

6. Винокурова З.И. Влияние среды и размеров апикальной меристемы на процесс дифференциации и регенерации растений картофеля в культуре тканей. В сб.: Генетика, селекция и семеноводство полевых культур. Л., 1977, т.298, с.69-73.

7. Гусев А., Капустин М»Н. Особенности хранения картофеля.Картофель и овощи, 1980, II.с.14.

8. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М.: Колос, 1965.-424 с.

9. Загорска Н.А., Шамина 3,Б.,БутенкоР.Г.Закономерности:морфогенеза в культуре тканей диплоидного и полиплоидного табака.Доклады АН СССР, I97I, т.196, Ш 5,c.I209-I2I2.

10. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полшцук В.Е, Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наукова думка, 1980.-488с.

11. Князева В.П., Кирюхин В.П. Методические указания по колориметрическому определению азотистых веществ в картофеле. М.. I978.-32C.

12. Красная книга. Дикорастущие виды флоры СССР, нуждающиеся в охране (Отв.ред.Тахтаджян). Л.:Наука, 1975.-204 с.

13. Малыхин В.Г., Иванченко Г.З. Ранний сорт картофеля Домодедовский. В сб.: Селекция и семеноводство картофеля. Научные труды НИИКХ, М., 1980, вып.36.с.8-13.

14. Морозова Е., Мелик-Саркисов О.С. Размножение безвирусного картофеля клубнями, полученными in vitro. Физиология растений, 1978, Т.25, вып.2, с.373-378.

15. Морозова Е., Мелик-Саркисов О.С. Влияние физиологического состояния проростков картофеля на регенерацию растений из изолированных апексов. Доклады ВАСХНИЛ, I98I, вып.9, с.8-10.

16. Оглуздин H.G. Значение культуры тканей и органов в селекции и семеноводстве картофеля. Бюллетень ВНИИ растениеводства, 1980, вып.98, с.69-71

17. Оглуздин H.G. Способ хранения безвирусной коллекции картофеля. Бюллетень ВНИИ растениеводства, I98I, вып.114,с.56-58.

18. Остапенко Д.П. Способ сохранения оздоровленных от инфекции коллекционных образцов картофеля, используемых для селекционно-генетических исследований и семеноводства. В кн.:Тезисы докладов 1У съезда генетиков и селекционеров Украины, Киев: Наукова думка, I98I, часть 4, с.44-46.

19. Петербургский А.В. Практикум по агрономической химии.М.:С.-х.литература, журналы, плакаты, 1963т 591 с.

20. Попов А.С. Сохранение семян и меристем высших растений с помощью глубокого замораживания. В сб.: Консервация генетических ресурсов. Пущине, 1982, с.3-14.

21. Сабурова И.В., Балаба Т.Я., Линденберг Л.К., Сапелкина И.М. Сравнительная оценка методов криоконсервации кожи при различных температурных режимах. В кн.:Вопросы пересадки органов и тканей. М., 1966, с.64-67.

22. Самыгин Г.А. Причины вымерзания растений. М.:Наука, 1974. 192 с.

23. Самыгин Г.А., Матвеева Н.М. О защитном действии глицерина и других легко проникающих в протопласты веществ при замораживании клеток растений. Физиология растений, 1967, т.14, вып.6, C.I048-I056.

24. Трофимец Л.Н., Князев В.А., Хромова Л.М., Егорова Л.И. Оздоровление картофеля от вирусных болезней методом верхушечной меристемы. -х.биология, 1975, т.10, 5, с.760-765.

25. Трофимец Л.Н., Волкова Т.В., Миренкова Н.Н. Методы культуры тканей в картофелеводстве. В кн.: Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. Научные труды ВАСХНИЛ, М.:Колос, 1979, с.123-128.

26. Трускинов Э,В. Опыт оздоровления от вирусов коллекционных образцов картофеля путем культуры меристемной ткани. В кн.: Тезисы докладов Всесоюзного семинара-совещания "Современные методы получения безвирусного картофеля. М., 1975,с.17-18.

27. Трускинов Э.В. Клубнеобразование в культуре тканей картофеля как фактор его размножения и длительного хранения в коллекции. Бюллетень ВНИИ растениеводства, 1980, вып.105,с.77-79.

29. Урбах В.Ю. Математическая статистика для биологов и медиков. М.:Изд-во АН СССР, 1963. 324 с.

30. Федосенко В.А. Консервация семян культурных и диких видов картофеля при сверхнизких температурах. Бюллетень ВНИИ растениеводства, 1980, вып.105, с.80-83.

31. Федосенко В.А., Колесник И.А. Хранение ягод картофеля в жидком азоте. Бюллетень ВНИИ растениеводства, 1980, вып.105, с.83-84.

32. Фенина Н.А. Коллекция картофеля в искусственных условиях. В кн.: Тезисы докладов Всесоюзного семинара-совещания "Современные методы получения безвирусного картофеля". М., 1975, с.33-34.

33. Хромова Л.М. Исходная характеристика вычленяемых меристем Защита картофеля от вирусных болезней в семеноводстве. Научные труды НИИКХ, М., 1977,вып.ЗО, с.26-28.

34. Хромова Л.М. Культивирование верхушечных меристем картофеля для оздоровления сортов от вирусных болезней. В кн..Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. Научные труды ВАСХНИЛ, М.: Колос, 1979, с.128-137.

35. Цилосани Г.М. Морфогенез в культуре каллусной ткани картофеля. Бюллетень ВНИИ растениеводства, 1980, вып.98, с.64-65.

36. Чавдаров Ч.Б., Дмитрова Д., Русева Р. Влияние на ретарданта CCG върху растежа и развитието на меристемни растения от картофи. Растениевъдни науки, София: Сельскостопанска академия, 1982, т.19. 7, с.30-35.

37. Шамина З.Б. Генетическая изменчивость растительных клеток, В кн.:Труды П Всесоюзной конференции по культуре тканей, Киев,1975, с.80-93.

38. Altman Р.Ь., Dittmer D.S. Life spans: pollen. Biology data book. I. Federation of American Societies for experimental biology. Maryland, Bethesda, 1972, v.I; p.242-246.

41. Bajaj Y.P.S. Tuberization in potato plants regenerated from freeze preserved meristems. Crop improvement, 1978, V.5, N. 2, p;I57-I4I.

42. Bajaj Y.P.S». Freeze preservation of meristems of Arachis hypogaea and Cicer arietinum.-3h.dian J.Exp.Biol., 1979, V.I7, N.12, p.I/i-05-1407. 49» Bajaj Y.P.S.. Regeneration of plants from potato meristems freeze preseirved for 24 months. Euphytica,I98I, v.$0, W. I, p.141-145.

44. Barnabas В., Rajki E. Fertility of deep-frozen maize (Zea mays L.) pollen.-Ann. Bot,, I98I, v.48, N. 6, p.861-864.

45. Beamish K. The effect of pollen aging on seed development in Solanum. Amer. Potato J., 195, v.5I, W. II, p.366.

46. Blanc A. Histophysiologie vegetale.-Relation entre :l»avance de la tuberisation de germes de pomme de terre cultives in vitro sous l»effet d trait ement thermigue et la modification de l»activite de l»invertase.- C.R. Acad.Sci., Paris, 1979, 289,serie D, К.З, p.279-283.

47. BlomSuist A.W,, Lauer F.I. A simplified technigue for handling and storing potato pollen.-Amer. Potato J.; 1962, v.39, N. 9. p. 340-343.

48. Chapman H.V/. A tissue culture method of studying the potato plant. Amer. Potato J., 1954, v.31, N. II, p.367*

49. Chapman H.W. Potato tissue cultures. Potato J., 1955, V.32, N. 6, p.207-

50. Collins F C Lertmongkol V., Jones J.P. Pollen storage of certain agronomic species in liguid air. Crop Seience, 1975, v.I$, F. 4, p.493-9.

52. Denton I.E., \7estcott R.J., Pord-Lloiyd B.V. Phenotypic variation of Solanum tuberosum L. cv. Dr. Megntosh 3?egenerated directly from shoot-tip culture.- Potato research, 1977i V.20, N. 2, p, I3I-I56.

53. Doebhler G.F., Rowe A.W., Einfret A.P. Freezing of mammalian blood and its constj.tuents. In: Cryobiology (Ed. H.T.Meryman), London, New Tork: Acad, press, 1966, p,407-450.

54. Dougall D.K. Current status of cryogenic storage of plant tissue cultures. In vitro, 1977, v.I5, N. 5, p.19.

55. Emilsson B. Studies on the rest period and dormant period in the potato tuber. Acta agriculturae suecana, 1949, V.5, N.5, p.189-28;

56. Pinkie B.J., Ulrich J.M., Rains D.W., Tisserat B.B, Schaeffer G.V/. Sur:lval of alfalfa, rice and date palm callus after liguid nitrogen freesing. Cryobiology, 1979, v.I6, N. 6, p.585.

57. Pinkie B.J., Ulrich J.M., Tisserat B.B., Rains D.W. Regeneration of date palm and alfalfa plants lafter freezing callus tissues to -I96*C in a combination of cryoprotective agents. Crgrbiology, I98O, v.I7, N.6, p.625-626.

58. Pinkie B.J., Ulrich J.M., Stavarek S., Rains D.W. Cryogenic behavion of alfalfa callus cultures. Cryobiology, 1983, v.20, N. 6, p.78.

59. Pisher J., Simon N.; Vincent J. The red book,Wildlife in danger. London, 1969. 47S p.

60. Gamhotg O.L., Murashige Т., Thorpe T.A., Vasil I.E. Plant tissue culture media. In vito, 1976, v.12, IT.7, p»73478.

61. Garcia (Torres L., Gomez Oampo C. In vitro tuberization of potato sprouts as affected bu ethrel and gibberellic acid. Potato research, 1975, v.I6, U.I, p.75-79 69» Goodwin P.B., Adisarwanto T. Propagation of potato by. shoot tip culture in petri dishes. Potato research, 1980, V.25, N. 4, p.445-448.

62. Gray D. Fluid drilling and other methods for sowing seeds with potential for potato true seeds. In. Plannig Gonf. Product. Potatoes True Seed. Manila, Philippines, 1979» p.II7-I5I« 63. Greiff D., Rightsel W, Freezing and freeze-drying of viruses. In; Gryobioldgy XEu.lT.T.Keryiaan). "Xondon-, Nevr-Xork: Acad, press, 1966,p.698--728.:

64. Grout B.W.W., Henshaw G.G. Freeze preservation, of potato shoot-tip cultures. Ann. Bot., 1978, v.42, N. 181, p. 1227-1229. 75» Grout B.W.W., Henshaw G.G. Structural observations on the growth of potato shoot-tip cultures after thawing from liguid nitrogen. Ann. Bot., 1980, y.46, N. 2, p.245-248.

65. Haskins R.H., Kartha K.K. Freeze preservation of pea meristems. cell survival. Can. J. Bot., 1980, v. 58, N. 8, p.855-840. 75» Hollen b.B., Blakely L.M. Effects of freezing on cell susmension cultures of Haplopappus ravenii. Plant Physiol* 1975, v,56, N. 2, p.59.

66. Meijers C,P,, Veldhuisen G, Langdurige bewaring van aardappelen. Instituut voor bewaring en verwerking van landbouwprodukten, Wageningen publikatie, 1979» D«5I7, s,I-I4, 67. Mellor F,C., Stace-Smith R. Development of excised potato buds in nutrient culture. Can, J.Bot., I969j v.47, N.IO, p,I6I7-I62I.

68. Mellor F.C, Stace-Smith R. Virus-free potatoes by tissue culture. In: Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue and organ culture, (Ed, J.Reinert and T,P,S,

69. Morel G., Wetmore R.H. Tissue culture of monocotyledons. M e r J.Bot., I95It V.38, N 2, p.158-140.

70. Morel G., Martin G. Guerison de dahlias atteints d*une maladie a virus. C.R.Acad.Sci., Paris, 1952, t.255, N 20, P.I524-I525.

71. Morel G., Muller J.-F. Physiologie vegetale. La culture in vitro du meristeme apical de la pomme de terre. C.R. Acad. Sci., Paris, 1964, t.258, N 21, p.52505252.

72. Mtinster J., Cornu P., Dvorak V., Gbiaegl P., Aemy J. Precedes d*utilisation des produits antigerminatifs sur pomme de terre; leur efficacite et leur influence sur la concentration residuaire dIPC et de CIPC. Revue suisse d»agriculture, 19791 v.II, N 5, p.229-259»

73. Murashige Т., Skoog P. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol, plantarum, 1962, V.I5, N 5, p.475-497.

74. Murashige Т., Nakano R. Chromosome complement as a determinant of the morphogenic potential of tobacco cells.Amer. J.Bot., 1967, v.54, N 8, p.965-970. 106, Murashige T. Plant propagation through tissue

75. Nath З:., Anderson J.O. Effect of freezing and freeze-drying on the viability and storage of lilium longiflorum L. and Zea mays. L. pollen. Gryobiology, 1975» V. 12, N I, p, 81-88,

76. Okada K.A. Ejcploration, conservation and evaluation of potato germplasm in Argentina. Potato research, 1976, v,I9, N 5, p. 265-269.

77. Reinert J., Backs-Hiisemann D., Zebrak H. Determination of embryo and root formation in tissue cultures from Caucus carota. In: Les cultures de tissue de plantes.Paris: Centre Wat. rech. sci., I97I, p. 261-268.

78. Richardson D.G., Weiser C.J. Foliage frost resistance in tuber-bearing solanums. Hort Sci., 1972, v. 71, N I, p.19-22.

79. Roberts E.H. Problems of long-term storage of seed and pollen for genetic resources conservation. In: Crop genetic resources for today and tomorrow. London N.Y. Melbourne: Cambridge university press, 1975, p269-296.

80. Roest S., Bokelmann G.S. Vegetative propagation of Solanum tuberosum L. in vitro. Potato research, 1976, v.19, N 2, p.175-178.

81. Rowe A.W., Lenny L.L. Fifteen year cryogenic storage of blood frozen by a droplet freezing technique and a low glycerol parid freezing procedure. Cryobiology, 1985, V.20, N 6, p.717.

83. Sakai A. Survival of plant tissue at super-low temperatures. III. Relation between effective prefreezing temperatures and the degree of frost hardiness. Plant physiol., 1965, V.40, N 5, p. 882-887

84. Sakai A., Yoshida S. Survival of plant tissue at superlow temperature, VI. Effects of cooling and rewarming rates on survival. Plant Physiol., 1967, v.42, N 12, p.I695-I70I.

85. Sakai A., Otsuka K, A method for maintaining the viability of less hardy plant cells after immension in liquid nitrogen. Plant Cell Physiol., 1972, v.15, N 6, P.II29-II55.

86. Sakai A,, Nishiyama У. Cryopreservation of winter vegetative buds of hardy fruit trees in luquid nitrogen. Hort science, 1978, section I, Ы 5i p.225-228.

87. Sakai A., Yamakawa M,, Sakada D., Harada Т., Yakuwa T. Development of a whole plant from an excised strawberry runner apex frozen to -I96*C. Low Temp, Sci., 1978, V.36, ser, Б, N I, p.5I-58.

88. Sala F., Cella R., Hollo P. Freeze-preservation of rice cells grown in suspension culture. Physiol, plantarum, 1979, V.45, N I, p.170-176.

89. Saxena H.K., Saini J.P. Effect of storage on viability of regal lily pollen grains. Indian J. Plant Physiol., 1979, V.22, H 5, p.269-271.

91. Seibert M. Freeze preservation of excised shoot tips. In vitro, 1977, V.I5, N 5» p.194. 154» Seibert M,, Wetherbee P.J, Increased survival and differentiation of frozen herbaceous plan organ cultures

92. Siminovitch D., Eheaume B, Survival capacity of winter rye seedlings in the desiccated or frozen-desiccated state. Gryobiology, 1979, v.16, N 6, p.585.

93. Shepard J.F., Totten R.E. Mesopbyll cell protoplasts of potato. Plant Physiol., 1977, v.60, N 2, p. 515516.

94. Shepard J.F. Abscisic acid enhanced shoot initiation in protoplast derived calli of potato. Plant Sci. Letters, 1980, v.18, N 4, p.527-533. 139» Stanwood P. Seed cryopreservation. Gryobiology, 1979, V.I6, H 6, p.584.

95. Sugawara Y., Sakai A. Survival of suspension cultured sycamore cells cooled to the temperature of liquid nitrogen. Plant Physiol., 1974, v.54, N 5, p.722-724.

96. Sukumaran Ш.Р., ?/eiser C.J. An excised leaflet test for evaluating potato frost tolerance. Hort science, 1972, V.7, N 5, p.467-468.

97. Sumida S. Resumption of activity of rat hearts cryopreserved for 7 years in liquid nitrogen. Gryobiology, 1985, V.20, I 6, p. 702-705. T 145. Sun C.N, The survival of excised pea seedlings after drying and freezing in luquid nitrogen. Bot. Gaz., 1958, V.II9, N 4, p.254-256.

98. Sutter E., Langhans R.W. Abnormalities in chrysanthemum regenerated from long term cultures. Ann.Bot., I98I, V.48, N 4, p.559-568. s. 505-

100. Ulrich J.M., Firikle B.J., Moore P.H., Ginoza H, Effect of a mixture of cryoprotectants in attaining liquid nitrogen survival of callus cultures of a tropical plant. Cryobiology, 1979, v,I6, N 6, p.550-556.

101. Ulrich J.M., Finkle B.J., Tisserat B.H. Effects of cryogenic treatment on plantlet production from frozen and unfrozen date p a M callus. Plant Physiol., 1982, v.69, N 5, p.624-627. 158* Upadhya M. Potential for potato production from true seed under developing country conditions. In: Planning Conf. Product. Potatoes True Seed. Manila, Philippines, 19791 p.18-20. 159» Visser T. Germination and storage of pollen. In: Meded. Landbou. V/agen. Wageningen, 1955» v.I, p.1-68.

102. Wang C.Y., Buta J.G., Moline H.E., HruschkaH.W. Potato sprout inhibition by camptothecin, a naturally occurring plant growth regulator J. Mer.Soc.Hort.Sci., I98O, V.IO5, H I, p.120-124.

103. Wang P.-J., Huang L.-C. Callus cultures from potato tissues and the exclusion of potato virus X from plants regenera-

104. Weatherhead M.A., Grout B.W.W,, Henshaw G.G. Advantages of storage of potato pollen in liquid nitrogen» Potato research, 1978, v.21, N 4, p.351-55

105. Whittingham D.G., Leibo S.P., Mazur P. Survival of mouse embryos frozen to -196® and -269**G. Science, 1972, V.I78, N 4039, p.411-414. 168. V/ithers L.A., Street H.E. Freeze preservation of cultured plant cells. III. The pregrowth phase. Physiol. Plantarum, I977f v.39, N 2, p.I7I-I78. 169» Withers L.A. The freeze-preservation of synchronously dividing cultured cells of Acer pseudoplatanus L. Cryobiology, 1978, V.I5, N I, p.87-92.

106. Withers L.A. A fine-structural study of the freezepreservation of plant tissue cultures. II The thawed state, Protoplasma, 1978, v.94, N 3-4, p.233-247.