Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИНДУЦИРОВАННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВОЗБУДИТЕЛЯ ВЕРТИЦИЛЛЕЗНОГО ВИЛТА ХЛОПЧАТНИКА VERTICILLIUM DAHLIAE KLEBAN

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИНДУЦИРОВАННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВОЗБУДИТЕЛЯ ВЕРТИЦИЛЛЕЗНОГО ВИЛТА ХЛОПЧАТНИКА VERTICILLIUM DAHLIAE KLEBAN"

московская ордена ленина и ордена трудового красного знамени

: Сельскохозяйственная академия имени к. а. Тимирязева

л X/ & #а правше рукописи

ЧЕРКАСОВА Галина Викторовна

И ИДУЦИРОВАН НАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВОЗБУДИТЕЛЯ ВЕРТИЦИЛЛЕЗНОГО ВИЛТА ХЛОПЧАТНИКА

УЕЯТ1С11ЬШМ БАНЫАЕ КЬЕВА^

Специальной; 03.00Л7 — Микробиология

Автореферат

диссертаций на соискание ученой степеня кандидата биологических наук

* )іг -I' V

москва 1990

S " „V

V '*'

4 ' г

■ .н * « - * .

ftä^sli-i, ■«»»wr їй-. ,

, . Vi

-v?- : ;J&>< '%, .AT ¿1» . ? • - - л

эдител: Mit' H

■ 7

"ОфйвдйльніЩ

Бнрюзоаа В.

JBefcyiuee

ИЙ!

-ítóeeta состой^,; * il/Щ яЁаШЁ&ь в « • " » tf

к

. имена Ipfc'■

• •» лпэдздя

CA.

іШвдье '

M " "Ж ;"0¿iN>epa'

еввшгйлизирова кайдндаї био

__

t.

совета агадемім

Ученый

Ъ Мо -Тими-

st

? »tv» З- дг

J?' .-.-'А

общая характеристика работы

Актуацьность теми. Вертициллезное увядание хлопчатника, наносящее большой вред хлопководству, вызывается грибами рода Ver-ticiilium Меез et Won. Основной возбудитель этого заболевания в Средней Азии - v.dahlias Kieban, который изучается многими иссле-

возбудителя и механизмы его микроэволюции, а также такой важный признак, как инфекционная способность изучены слабо, что требует дальнейших исследований с использованием различных подходов и методов.

Изменчивость у.ааьнае в природных: популяциях приводит.к спонтанному возникновению вирулентных рас и биотипов, поражающие ранее устойчивые сорта. Поэтому выведение устойчивых сортов хлопчатника является сложной и многогранной проблемой.

Провокационные фоны, используемые для испытания селекционного материала должны'создаваться на основе различных по вирулентности и патогенности внутривидовых форм возбудителя. В связи с ЭТИМ следует использовать не только имеющееся в: природе внутривидовое разнообразие возбудителя вертициллезного вилта, но и его мутант-ные формы, отличающиеся от исходных форм по ряду признаков, в то»! числа по вирулентности и патогенности (Левитин, Федоров, 1272"; Касьяненко, 1981; М-уромцев и др., 1987; Сидорова, 1988; Во иго в а и др.,,1988.и др.).

Среди физических:мутагенов большое значение тлеют УФ-лучя. Характер мутаций, индущруемше УО-светом,существенно не отличается от такового при спонтанном мутационном процессе, что'особо эря-но при изучении изменчивости фитопатогенных грибов. _

■ Цель и запячя исследования. Цэлью настоящих исследований было разностороннее изучение изменчивости гриба у.ааьиэ.*, возшгка-

дователями в-различных аспектах. Однако внутриводовая структура

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Мввк. ввлекши».

им. К. А. Тимирявв!

ющей в результате УФ-облучения исходных слабопатогенного мицелиа-льного и сильнопатогенного микросішеродааяьного жташов., В работе ставились .следующие основные задача:

л

1. Получение мутантов V.dahlias.

2. Проверка некоторых мутантных форм гриба на патогенность по отношению к хлопчатнику.

*' 3. Сравнительное изучение ферментативной (пектинолитической) активнооти различных по степени патогенности мутантов.

4.-Изучение цито-кариологических и ультраструктурных особенностей гриба.

5. Изучение литичеоких свойств и вирусов V.aahliae.

Научная новизна работы. Впервые у гриба v.dahiiaa путем индукции УФ-лучами получены различные по морфологическим особенностям и степени патогенности штаммы (вплоть до авирулентных мутантов) .

Показано наличие связи степени патогенности о ферментативной активностью и ее отсутствие со способностью гриба к формированию покоящихся структур.

Установлено, что у V.aahliae УФ-лучи.индуцируют наряду с генными и геномные мутации; полиплоидные и полиядерные формы.

Выявлены различия в ультратонком строении ядерного аппарата у сильно- и слабопатогенных мутантных форм. Например,,показано увеличение количества хромоцентров (от 3 до 15 и более) у сильнопато-геннкх мутантов вместо 1-3 у исходных штаммов. "

Впервые у данного гриба выявлены микротельца, или-пероксисомы. Показаны различия в строении клеточной стенки у некоторых морфологических структур.* Так,, для конвдиальных и мицелиальных клеток характерна 3-слойная клеточная стенка, а для микросклероциев и хяа-мидоспор число чередующихся электронноплотных"и электроннопрозрач-ных слоев равно 15-16 и более.

Впервые у у.йаьнае наблюдалось явление лизиса, обусловленное присутствием в цитоплазме вирусоподобных частиц (или вирусов), которые характеризовались специфичностью и перевиваемоетыо. При ультрамикроскопировашш. выявлено их строение: специфическая форма С короткимОТ{ЮСТКОМ.

Практическая ценность работы. Полученные результаты дают возможность рекомендовать использование УФ-лучей для индуцирования различных по степени патогенности (и вирулентности) штаммов V.ааЬ-Нае, которые могут быть использованы при создании провокационных фонов с целью оценки устойчивости и восприимчивости сортов хлопчат ника к вилту в процессе их селекции.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Республиканском симпозиуме по вшиоустойчивости хлопчатника (1973) на юбилейной республиканской конференции по микробиологии, альгологии и микологии, посвященной 59-летию УзССР и Компартии Узбекистана (1974) и на У1 съезде Всесоюзного микробиологического общества (1980).

Структура и объем работы. Материал диссертации изложен на 182 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 56 рисунками^ 8 таблицами. Список использованной литературы включает.252 работы.

материал и метода исследования

Объекты исследования.■Объектами исследования слз'кшш шноспо-, / рОВКе ИЗОЛЯТЫ раЗЛИЧНЫХ ПО СТвПеПИ ПаТОГеННОСТП ШТаММОВ У.ааКПее

(I - мт-щелиалышй слабопатогенный штамм и II — шпсросклероккалыщй силыгапатогенный стада), выделенных из больных растений хлопчатника сорта 108-Ф и переданных нем лабораторией микологи;: Института

микробиологии АН УзССР, а также мутантные формы, полученные в результате воздействия на эти шташы УФ-лучами.

Облучению подвергали суспензию конидий культур 14-суточчого возраста в стеклянных бюксах диаметром 30 мм без крышек на расстоянии 25 см от источника излучения. Источником излучения служили

спаренные лампы КУФ-15 с синим светофильтром, пропускающим лучи с

• о -2

длиной волны 2347 А с мощностью дозы на уровне объекта 120-10

вт/м^ин при следующих экспозициях облучения: 1,2,4,8,10,12,14,16,

18 и 20 мин.

Облученную взвесь конидий высевали в темноте в чашки Петри на среду Чапека. Определяли кривую выживаемости "доза-эффект", а по мере роста микроколоний производили их анализ и подсчет. Морфологические мутанты отсевали на ту "же среду и культивировали при температуре +25°С.

Для изучения патогенных свойств мутантных штаммов использовали семена хлопчатника сортов 108-Ф и Ташкент-3. Растения выращивали в 30-килограммовых сосудах Вагнера, в каждый из которых добавляли по 5 г и Увлажняли Д° от полной влагоемкости. Семена хлопчатника после стерилизации концентрированной серной кислотой замачивали в течение суток в водной суспензии конидий гриба, приготовленной из 7-суточных культур, и высевали в вегетационные сосуда. Почва в сосудах была предварительно инфицирована 2 г (в пересчете на ВОЗДУШНО СУХОЙ Вес) 14-СутОЧНОЙ КУЛЬТУРОЙ : У.йаЬНае.

В каждый сосуд высевали по 10 семян хлопчатника. В дальнейшем было оставлено примерно по 3 одинаковых по степени развития растения. Азот ( МаИОд ) в виде подкормки вносили по 0,5 г на сосуд три раза в течение вегетации. Исследования проводили в продолжение трех лет.

Контролем служили растения, зараженные культурами исходных шти.1мов (первый контроль), а также неинфииированныо растения (вто-

рой контроль), выращенные из семян, которые в течение суток выдер-. живали в стерильной воде. Повторность оштов трех1фатная. В пределах каждой повторнооти исследовали по 9 растений.

Определение пектинолитической активности проводили по общепринятой методике (Мартенов, 1976) на 4,5,6 сутки развития гриба по. степени падения вязкости 0,5^-го раствора пектина.

Для цитологических исследований конидии гриба проращивали методом открытых капель на стерильных предметных стёклах с жидкой средой Чапека в чашках Петри при указанной выше температуре. Через 2,4,8,16,20,22,34,48,96 ч препараты фиксировали и окрашивали соответствующими красителями.

Окрашивание ядерного аппарата грибов для светооптических исследований осуществляли по методу Романовского-Гпмза в модификации Fíe каре кого (Пешков, 1955), Препараты окрашивали 20-^24 ч при комнатной температуре или I чао при 37°С. Для уменьшения интенсивности окрашивания цитоллаамы чдра дифференцировали 96°-ным спиртом в течение 10-20 сек с последующим 15-20-минутным промыванием в проточной воде. В отдельных, случаях для контрастирования цитоплазмы препараты обрабатывали 0,25#-ным водным раствором януса-зеленого в течение 1-4 мин.

Для прижизненных лшинесцентно-цитохимических исследований ДОС-протеида использовали водный раствор акридинового-ораняерого 1:20000 (Мейсель, Эвварзина, 1947) или препараты флуорохромировали: в течение 10 мин раствором акридинового-оранжевого в концентрации 1:10000, приготовленным в 0,45 н Nací (Мейсель, Миролюбова,1959).

Выявление ядерной ДОК в люминесцентном микроскопе осущестрля-ли с помощью реакции Фельгена в модификации Е.Н.Хачатурсва при окраске риванолом - so2 (Хачатуров, Смирнова, I96G).

Окрашенные препараты,просматривали в микроскопах маркиÜÍ3Í-6 к Г.Ш-2 с последулпей кикро^ютосъемкой.

- б -

Для исследований в электронном микроскопе I, 2 и 3-суточные культуры v.dahiiae, выращенные как на жидкой, так и на агариэован-'ной среде Далека, фиксировали по Мюллеру (Бирюзова и др., 1963) 1,5^-НШ ВОДНЫМ раствором KMgO^ в течение 18 ч при 4 С с последующей промывкой водопроводной водой. Дофиксацшо-проводили О3О4 в фосфатном буфере с рН 6,8 в течение 2-х часов при 4°С. Обезвоживание проводили в спиртах возрастающей концентрации и 2 раза по 15 мин в абсолютном спирте и абсолютном ацетоне. Пропитку вели в оме-си (абсолютный ацетон + смесь смол в соотношении 1:2) в течение 2-х часов при комнатной температуре. Затем культуру заливали в капсулы С эпоном на сутки при 37°С.

Полимеризацию проводили при 60° в течение 2-х суток. Срезы образцов изготовляли на микротоме цсв-8802-А. Препараты контрастировали по Рейнольду ( Reynolds, 1963) азотнокислым свинцом и просматривали в ЭЛектрОШШХ МИКрОС»ОПах марки Jem-? И Jem-100-C.

Для изучения вируоов гриба исследовали как исходные штаммы, так и мутантные формы, полученные в результате УФ-облучекия, а также ряд микросклероциальных штаммов v.dahiiae, .выделенных с различных оортов хлопчатника и находящихся в коллекции лаборатории типовых культур, мшфоорганиэмов Института микробиологии АН .УзССР.

Подбор чувствительных.к вирусу культур осуществляли методом перекрестного испытания исследуемых штаммов путем наложения агаровых блоков (Раутенштейн, 1968).

Лизаты (надооадочная жидкость) готовили из 7-суточных 1культур, в которых предполагалось присутствие вируоов. Для этой цели в колбы с культурами добавляли хлороформ (в соотношении I чаоть хлороформа и 7 частей куЛьтуральной жидкости) и центрифугировали при 4,5 тыс. об/мин в течение 30 мин. Полученные лизаты хранили в холодильнике при -t5°C.

Наличие литического фактора в надосадочной жидкости определи-

ли нанесением 1-2 ее капель на 18-часовые газоны всех опытных штаммов гриба на среде Чапека.

Перевиваемоеть литического фактора проверяли общецринятым методом смыва питательной средой с зон отсутствия роста и последующей инокуляции свежеполученных лизатов на газонах чувствительных к данному вирусу (или вирусам) культур.

Математическую обработку.количественных показателей проводили с использованием критерия " г " Стысдента-Уайта.

Наличие или отсутствие связи патогенности с морфолого-биохимй-ческими признаками мутантннх штаммов рассчитывали методом корреляции рангов (Рокицкий, 1973).

результаты исследований и их обсукднше

морфологическая и цитологическая изменчивость штаммов

У.йаЬНае в норме и под действием уф-оелучишя

I. Микро- и макроморфологические особенности исходных мицели-ального и микросклероциального штаммов в онтогенезе

В процессе роста и развития исходные мицелиальный ( I ) и мик-росклероциальный ( П ) штаммы претерпевали род аналогичных преобразований, но тем не.менее различались между собой.

По показателям средних арифметических слабопатогенный мицелиальный штамм имеет длину конидий, равную 4,26±0,09 мкм, а более патогенный микросклероциальный - 4,8^0,08 мкы. Однако, анатазируя среднюю арифметическую длины у мутантных штаммов У.ааънае, мы не выявили какой-либо связи между названным показателем и патогенными свойствами культур.

Интенсивность образования конидий у микросклероцнального штамма была более интенсивной по сравнению с мицелиальным птаммом.

Мкцелиальная культура в качестве покоящихся структур образует хламцдоспоры,; а микросклероциальная - кккросклероции. Х-а-.птдоспорн

и микросклероции отличаются утолщенной клеточной оболочкой и образуются путем многократногопочкования во всех направлениях отдельных клетоц мицелия.

Шцелиальная форма на среде Чапека характеризуется белыми выпуклыми колониями с бархатистым воздушным мицелием, имеющим к 30 суткам диаметр 17-13 мм и относительно длинные (56,5 мкм) конидие-носцы. Ьщ1фосвдероциальная форма имеет довольнр плоские колонии с редким шерстистым темно-серого цвета воздушным мицелием. В среду культура выделяет черный пигмент. Диаметр колоний к 30 суткам роста достигает 63-85 мм. Конидиеносды довольно короткие (14-34 мкм). Иногда в колониях образуются белые секторы.

2. Морфологическая и цитокариологическая изменчивость v.dahlias под воздействием УФ-облучения •

С увеличением экспозиции УФ-лучей выживаемость КОНИДИЙ V.dah-liae снижается. Однако полученные кривые "доза-эффект" у исследованиих шташов по своему характеру различны. У мицелиального штамма она s-образная, у микросклероциального - экопоненциалыгая. На рис. I прослеживается более высокая устойчивость конидий микр9скле-роциального штамма при относительно длительной экспозиции УФ-облучения.

В исследованных пробах суспензий было выявлено наличие двух ядер у 13$ конидий мицелиального штамма. Двуядерность микросклероциального штамма нами не обнаружена.

Последующим выращиванием колоний из облученных конидий было воспроизведено 7? морфологических мутантов. В спектре этих мутантов наблюдались как одинаковые с исходным (контроль), варианта!,и типы морфологических изменений, так и довольно отличные, проявляющиеся только при воздействии УФ-лучами. На основе мицелиального штамма было индуцировано 35 морфологических мутантов,.а микросклероциального - 42. Принципиальных различий■меяду выходом мутаций у разных

исходных штаммов в зависимости от экспозиции обнаружено не было.

Морфологические мутанты различались по форме и топографии колоний, размерам конидий, степени развития и 01фаске воздушного мицелия, скорости роота, интенсивности спороношения и образования покоящихся структур и др. Были также выявлены мутантные.шталмы со олабораспочковшшыми микросклероциями или же только с цепочками хламидоспор, а также мутанты, не образующие в цикле развития микро-склероциев.

Для последующей работы было взято по 4 резко отличающихся от исходных штаммов мутанта (см. схему).

Штамп (мутант) й 58, народу о очень мелкими колониями, имел коралловидный мицелий (с укороченными и утолщенными клетками). Дяя штамма .№ 67, отмечены различия в строении конидиального аппарата," выражающиеся в наличии цростых неразэетвлешшх конвдиеносцев. У штамма № 63 обнаружено уокоренное развитие конидий новой генерацит.

1

Рис. I. Кривые выживания у.ааьнае после УФ-облучения

Условные обозначения:---мицелиальный штамм; ■

- микросклероциальыый штамм

Мутанты 68-о и 21-с отличались от мутантов Ш 68 и 21 наличием секторов.

Схема получения исследованных мутантных штамаов

У.ааЪНае УФ-лучи

Лищелиальный штамм (I группа)

Морфологические мутанты

/микросклероциальный штамм (П.группа)

Морфологические мутанты

68-

68-с

6?

39

21-

21-с 58

63

При анализе длины конидий мутантных штатов по сравнению о походными были выявлены достоверно как более крупные, так и более мелкие конидии.

При определении количества ядер в конидиях (исследовалось но 100 конидий) мутантных штампов установлено увеличение количества двуядерных конидий (табл. I). Кроме того, у мутантных штаммов М 58 и 67 были обнаружены более крупные, предположительно полиплоидные,

одра. •

Таблица 1

Количество ядер в конидиях исходных и мутантных штаммов, %

Штаьаш Количество ядер в конидиях

I 2 Полиплоидные ядра

№щелналышй исходный штакм 8? 13 0

39 ь7 33 0

68 3? ' 63 0 .

6&-с 60 40 0

67 64 35 I

Мшсроокдероциалышй исходный

штамм 100 0 0

21 63 37 0

21-е 56 44 0

58 74 „с X

63 74 20 и

Как для исходных, так и для мутантных штампов У.ааьнае отмечено образование анастомозов между гифами и обнаружена миграция ядер из одной гифы в другую через анастомозный мостик, а'также попарное совмещение ядер в анастомозной клетке. Это свидетельствует о наличии ге^ерокариоза, а, возможно, и парасексуального процесса у данного гриба, причем гетерокариоз ограничен только анастомозны-ми клетками.

Анализ полученных данных позволяет полагать, что мутанты у. ааънае с заторможенным образованием покоящихся структур, а также без микросклероциев имеют ядерную природу. Последнее основывается, на том, что биосинтез меланина в микросклероциях грибов р.УезЧ!-о11Ишп контролируется идентифицированными, судя по литературным данным (Шевцова и др., 1986; Шевцова,!988), ядерными генами, соответственно, потеря способности к биосинтезу.меланина - аллелями этих генов.

ПАТОГЕННОСТЬ МУТАНТНЫХ ШТАММСВ И ЕЕ СВЯЗЬ С ФЕРМШТАТИЫ10Й

АКТИВНОСТЬЮ И ДРУГИМИ ПОКАЗАТЕЛЯМИ

Использовали 6 указанных в предыдущей главе мутантных штаммов, фомв того, объектом исследования бил авирулентный штамм А-26, переданный нам из Среднеазиатского Института защиты растений, Е&ла предпринята попытка, выявления патогенных свойств исследуемых штаммов и связи этих свойств с показателями ферментативной активности, диаметра колоний, длины конидий, размера ядер в конидиях и интенсивности образования микросклероциев. •

I. Изучение патогенных свойств мутантных штатов

Исследования патогенных свойств мутантных штампов проводник в три сезона. Растения выращивали в уоловйях незащищенного грунта (на открытой площадке). Семена хлопчатника высевали в конце апреля.

Била разработана 5-<Заильная шкала, позволяющая характеризовать

степень патогенности исследуемых штаммов. В соответствии со шкалой ш смогли дифференцировать'штаммы по степени патогенности (табл.

Среди- мутантов были как одинаковые по патогенным свойствам о исходными штаммами 39, 21-с, 67), так и отличающиеся от них в той или иной степени. Крайним же проявлением различий была полная потеря вирулентности, как например, у штамма $ 58. Этот штамм индуцирован из сильнопатогенного микросклероциального штамма, но несмотра на потерю вирулентности, сохранил его способность интенсивно образовывать микросклероции. Выше указывалось, что мутантный шташ № 58 обладал карликовыми колониями, диаметр которых к 30 суткам инкубации достигал всего лишь 19 мм (табл. 3).

При сопоставлении такого признака как интенсивность образования мшфосклероциев (использовалась разработанная' нами 5-балльная шкала) с патогенностью исследованных штаммов было установлено следующее: чем интенсивнее отепень образования микросклероциев мутант-ных штаммов гриба, тем меньше, за небольшим исключением, проявление их патогенных свойств (табл. 3).

Зависимости же между патогенностью и показателями диаметра 30-суточных колоний (табл. 3), а также длины конидий и размера ядер практически установлено не было.

2. Выявление связи патогенности с ферментативной активностью

Для выявления связи патогенности исследуемых штаммов о ферментативными свойствами была предпринята попытка сравнительного изучения пектинолитической активности этих штаммов."

Было установлено, что наибольшей пектинолитической активностью обладали штаммы й№ 68 и 68-с, идентифицированные как сильно-и очень сильнопатогбнный соответственно. Наименьшая нектинолитичо-ская активность была характерна для авирулентного штамма й 58 и алабопатогенного штамма'А-26 (рис. У). Исходные штаммы обладали

Таблица 2

Степень патогенности различных штаммов у.ааьнаа

Шташы ^рактерксткка степени патогенности Индекс шкалы

Мицелиальный (исходный) Зд. штамм среднепатогенный П. II

67 П

68 сильнопатогенный Ш

68-с очень сильнопатогенный 1У

Микросклероциальный (исходный) штамм среднепатогенный 11

58 авирулентный - 0

21 слабопатогенный I'

21-с среднепатогенный П

63 сильнопатогенный ш

А-26 слабопатоге нный I

Таблица 3

Связь степени патогенности со способностью к образованию микросклероциев и интенсивностью роста

М№ мутантных щгамиов Степень патогенности Интенсивность образования микросклероциев Диаметр колоний, мм

58 0 ++++ 19

21 I +++ 72

21-о п ++ 72

39 п ++ 37

63 ш 0 58

68 ш + 48

68-с 1У 0 50

Га= - 0,86 Р <. 0,01

га - коэ^фиидент корреляции рангов Спирмена

- II - .

приблизительно одинаковой пектинолитической активностью и патоген-ностью.

Рис. 2. Пектинолитичеекая активность различных по патогенносте шташов у.ааьііае

Полученные материалы позволяют предполагать сцепленнооть детерминант, контролирующих патогенность и ферментативную активность, В сравнении с этим вирулентность (и патогенность) и способность к образованию покоящихся структур, по-видимому,, контролируется разными ядерными генами. Подтверждением последнего может быть тот факт, что мутант № 58, потеряв вирулентность исходного микросклероциаль-ного штамма, сохранил способность к образованию микросклероциев.

кариолоптсеские особенности и тіш деления ядер исходных

И МУТАНТНІЙ ШТА1.І.І0В В ОНТОГИШСЕ

Установленоі что все морфологические структуры исходных и мутантних шташов у.ааьііае, за исключением коїшдий и анастомозных клеток, имели по одному ЯДРУ-

Однако при изучении индуцированных мутантных форм было замечено возросшее, кок указывалось вше, число дв у ядерных конидий.

•

В процессе роста и развития как у исходных, так и мутантных шташов наблгадается последовательная смена типов деления и преобразований ядра в соответствии со схемой, разработанной Л. К.ХакимовоЙ (1971), Г.Шаабдурахмановой (1973), Н.В.Мацкевич (1981) и др., а именно: классический митоз, способ деления с образованием сборных хромосом, Ди- и полиплоидизацни ядер и атипичный митоз.

Излагаемые ниже данные, полученные преимущественно на исходном мицелиальном и слабопатогенном штамме и сильнопатогенном му-тантном штаыме ¿5 68, свидетельствуют о некоторых различиях сопоставляемых штаммов по показателям поведения и особенностям деления их ядер в онтогенезе.

1. Деление ядер по типу классического митоза

Данный тип деления как у исходного, так и у мутантного шташов характерен в основном для конидий и первых мицелиальных клеток. На этих этапах развития гриба заметных различий в поведении ядер между указанными штаммами не выявлено. Большинство ядер в этом типе деления имеет 3-5 хромосом.

2. Деление ядер с образованием сборных хромосом

Приурочено в основном к более поздним срокам развития гриба и преобладает в молодых гифах с гомогенным содержимым.

При сравнительном изучении деления ядер с образованием сборных хромосом у походного и мутантного штаммов нами были выявлены некоторые различия, а именно; в молодых мицелиальных клетках сильнопатогенного штампа )» 68 довольно чаото встречались ди- и полиплоидные ядра, которые на этом этапе развития не наблюдалиоь у походного- шташа. Однако репродуцировались они аналогично неподиддо-вдиыы ядрам, т.а. по типу образования сборных хромосом.

3.. Полишюидизац&я и атипичный митоз.(анеуачоидия) ядер

Ди- и иолипловдпзация ядер вги'1алышх клетках У.йелНав при-

.урочены к более поздней стадии развития гриба, а именно к образованию покоящихся структур- Однако у мутактного штадма ''.8 полиплоидные ядра в значительном количестве выявляются уг.е в ростковых трубках и молодых гифальных клетках и характеризуются наличием скоплений из 16-32 хромосом, располагающихся в одной плоскости, или в виде одной-двух ядерных нитей. В сравнении с этим у исходного штамма полиплоидные ядра имеют преимущественно 5-6 или 7-8 хромосом.

Делятся ди- и полиплоидные ядра аналогично неполиплоидным с образованием сборных хромосом, а также по тину классического штоза.

В результате атипичного митоза, имеющего место как у исходного, так и у мутантного штаммов, происходило разделение ядерного вещества на неодинаковые части. В результате сестринские ядра оказываются анеуплоидными и содержат разное число хромосом.

Из приведенных экспериментальных данных следует, что в резуль-. тате сравнительного: изучения различных по патогенности штаммов V, йаЬНае у. сильнопатогенного штш.эла ]а 68 ди- И: полиплоидные ядра выявлены в относительно ранних фазах онтогенеза, а их полиплоид— ность прогрессивно возрастала с возрастом культуры и достигала максимума к периоду закладки покоящихся структур. Шли выявлены ядра даже с 32 хромосомами.

Таким образом, можно полагать, что полиплоидия в онтогенезе тг.ааьнае имеет преимущественно приспособительное или функциональное значение и обусловливает при ее большой выраженности относительно высокую патогенность по отношению к хлопчатнику. Однако не исключен и формообразовательный эффект полиплоидии, а также анеуплои-дии, возникающей вследствие атиппчного митоза;

Можно также предположить,, что не только полиплоидия, но и .наличие относительно большого числа двуадерных копидпй в:популяциях мутантных штаммов обусловливает их патогенные свойства.

срашиткшое изучение ультратшсого строшш ;.отант1шх штлгй.юв

Поскольку. была выявлена тенденция к увеличению плолдности ядер у сильнопатогенного штамма № 68, представляло интерес исследовать ядерный, аппарат и другие ультраструктур™0 особенности исходных и мутантных штаммов v.dahliae.

I. Ультратонкое строение клетки

При сравнительном изучении различных по степени патогенности штам.юв никаких различий в ультраструктуре клеток выявлено не было.

У клеточной стенки конидий и гифальных клеток обнаружено 3 основных слоя: 2 электронноплотных (наружный и внутренний) и один электроннопрозрачный и более широкий промежуточный мой.

13 сравнении с этим клеточная стенка хлаыидоспор и ыинросклеро-циев очень толстая и многослойная. Число чередующихся электронно-' плотных и злектроннопрозрачных слоев оболочки у нее достигает 12, а иногда и больше. Однако при прорастании остается только 3 внутренних слоя, непосредственно прилегающих к цитоплазматической мембране.

Перегородки у гифальных клеток у.аапнае не имеют пор ж образованы путем инвагинации внутреннего слоя клеточной стенки.

Цитоплазкатическая мембрана, или плазмалемма. расположенная под клеточной оболочкой представляет собой 3-слойную структуру й имеет различные очертания.

Цитоплазма (гиалоялазма) относительно гомогенная, обладающая слабой электронной плотностью; в ней расположены клеточные структуры.

Митохондрии в клетках гиф и конвдий овальные, удлиненные, неопределенной фор»ш или вытянутые вдоль клетки., четко ограниченные хорошо различимой 3-слойной мембраной. Локализуются они недалеко Ът ядра, эндошгазматического ретикулуыа (ЭПР), а часто и в непосредственной близости от цитоплазматической мембраны.

- ш -

Компоненты экпоплазматического неттаупша окружены элементарной мембраной, которая значительно тоньше цитоплазматичеокой мембраны и зрелых мембран аппарата Гольдки (АГ). Расположен ЭПР в непосредственной близости от ядра или же недалеко от клеточной оболочки и митохондрий. ЭПР преобладает в молодых и активно растущих клетках.

Аппарат Гольджи представлен в ввде пузырьков и цистерн и локализован в основном между цктоплазматической мембраной и ЭПР.

Вакуоли в клетках мицелия единичные к небольших размеров. По мере формирования хламидоспор количество их увеличивается,; а сами они укрупняются.

Лизосоглн и Дагосомц встречаются как в мицвлиальных, так и ко-нидиальных клетках. Имеют вид лопастных образований; ограниченных однослойной мембраной.

Петюксисомы. Описания пероксисом у у.ааьнае в доступной нам . литературе мы не встречали и тем не менее наш выявлена группа довольно крупных пероксисом с одинарной мембраной, тесно прилегающих друг к другу. Пероксисомы значительно крупнее попавших в срез митохондрий.

Еировые включения обнаружены в гифальных клетках и локализуются в цитоплазме. С возрастом культуры и формированием покоящихся стадий количество их возрастает.

2. Ультратонкое строение ядерного аппарата

В каждой клетке нами, как и Г.Шаабдурахмановой (1Э73), было выявлено по одному ядру, ограниченному З-слойной ядерной оболочкой, имеющей внешний и. внутренний электронноплотные слои и средний элек-троннопрозрачяый слой.

,В ядерной оболочке выявлены поры4 Число их 3-5. Мембраны ядерной оболочки в каналах ядерных пор-соприкасаются и представляют, по-видимому, единое целое. •

В гифальных клетках на полюсах -ядра ядерная оболочка часто пз виристая, а у коквдий в основном ровная. Ядрышко нами не выявлено.

В ядерной зоне четко выявлялся хроматин в виде небольших округлых или овальных гранул-телец, часто именуемых как хромоцентры., Число таких хромоцентров у исходных штаммов в большинстве случаев 1-3, тогда как у мутантных оно варьирует от 3 до 15.

Ядра с относительно большим числом хроматиновых гранул гораздо крупнее ядер с их меньшим числом и занимают большую часть объема клетки. Это может служить возможным подтверждением полиплоидно— сти данных ядер. Ядра с относительно большим числом хроматиновых комплексов обнаружены нами у сильпатогенных мутантных штамлов №№ 68, 68-с и 63; что еще раз свидетельствует о прямой овяаи патогенносте с подиплоидностью.

Промежутки между структурами ядра заполнены ядерным содержимым, или кариолим^юй. Она имеет мелкозернистое строение с диффузно рассеянными гранулами.

ИЗУЧЕНИЕ ЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ВИРУСОВ У.с1аЫ1ае

Поводом для выявления вирусов У.йаЬНае явилось обнаружение на агаризованной среде Чапека лиаиоа воздушного мицелия в колониях некоторых мутантных штаммов.

Объектами исследования были исходные штаммы и их мутанты, а также ряд штамлов, выделенных с различных сортов хлопчатника, и природный материал.

В результате проведенных исследований наряду с лизисом выявле • на перевиваемость литичеСкого фактора, подтверждающая наличие виру са (или вирусов).

Обнаружена также высокая специфичность вирусоподобных частиц, ■ -

или.вирусов (интерпретация различных авторов), заключающаяся в том что зоны отсутствия роста на индикаторных культурах наблвдались то-

- 20 - . • лысо у тех штаммов гриба, у которых они были ранее обнаружены. Одновременно один и тот же штамм мог кметь собственные вирусные час-типы и быть чувствительным к вирусам других штаммов.

Литическиш свойствами обладали, кроме, того, лизаты, пркготог вленные из образцов почвы и растений хлопчатника. Зто свидетельствует о большой встречаемости миковируоов возбудителя вилта.

При микроскопировании лизировашшх участков колоний были обнаружены клетки, содержащие небольшое количество цитоплазмы, утратившие тургор, но сохранившие клеточную стекку. •

С помощью электронномикроскопических исследований, которые были проведены на сильнопатогенном мутантном штамме № 68, в цитоплазме его клеток были обнаружены вирусоподобные частицы сферической формы, диаметром 100 нм, имеющие электронноплотный нуюгеоид, оболочку и короткий хвостовой.отросток.

выводы

1. УФ-Ойлучение КОНИДИЙ гриба Verticillium dahliae Kleban вызывает как их гибель, так и появление мутантных форм. Мицелиаяьннй исходный шташ I гриба менее устойчив к воздействию УФ-лучеми, чем микросклероцйальный штамм П.

2. [Лутантные формы v.dahliae в количестве 77 штаммов, полученных в результате УФ-облучения, отличались от исходных штаммов морфолого-культурапышми признаками и функциональными свойствами: окраской мицелия, размерами колоний и конидий, строением мицелия, конидиального аппарата и покоящихся структур, продолжительностью цикла развития, количеством двуедерных конидий* способностью к по-лиллоидизацки ядер, изменением патогенных свойств, вплоть до потери вирулентности.

3. Сильнопатогенные мутанты на примере шташов 68 и 68-с характеризовались наиболее • шсстоши, показателя?® пекткнолнтикеской

активности.' В сравнении с этим наименьшая пектинолитическая активность была характерна для авирулантного мутанта ¡Ь 58 и слабопато-гённого коллекционного штамма А-26.

4. У мутантных штаммов выявлена прямая зависимость меяду степенью патогенности и способностью к образованию полиплоидных или полиядерных клеток, что подтверящалось и данными электронношкро-окопических исследований, и обратная зависимость.меаду степенью патогенности и интенсивностью образования покоящихся структур.

5. Типы деления и преобразования ядер в онтогенезе мутантных штаммов аналогичны исходным и характеризуются следующей последовательностью: классический митоз, тип деления с образованием сборных хромосом, явления поли- и анеуплоидии. Однако переход к ди- и поли-дяоидизации ядер у мутантных штампов может происходить в более ранней фазе онтогене за.

6. Злектронношкроскошческими исследованиями обнаружено наличие у хламидоспор и микросклероциев гриба 12 и больше слоев оболочки, из которых:при прорастании остаются только три внутренних слоя.

Впервые в клетках у.ааьнав выявлены микротельца, или.перо-ксисош. 6

7. У мутантных форм и природных популяций \r.dahiiae впервые наблвдалось явление лпзиса, обусловленное присутствием в цитоплазма вирусов-'(-или вирусоподобных частиц), характеризовавшихся специфичностью и перевиваемостыо. Цри ультраыикроскопировании установлена их сферическая форма и наличие короткого отростка.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах

1. Сафиязов S., Шаабдурахманова Г., Черкасова Г.В. Цито-хими-ческое изучение различных трупп возбудителя вилта хлопчатника. -Республиканский симпозиум по вилтоустойчивости хлопчатника. - ФАН. - Ташкент. - IS73. - С. 117.

2. Черкасова Г.В., Сафиязов д., Еиваева А.Б., Гриберг. А. Л. Об изменчивости Vert.dahliae Kleb. // Материалы юбилейной, конференции по микробиологии, альгологии и-микологии, посвящзнной 50-летию УзССР и Компартии 'Узбекистана. - МН. - Ташкент. - 1974. -

С. 32-33.

3. Сафиязов Ж., Шаабдурахманова Г., Черкасова Г.В. Кариологи-ческке-особенности возбудителя вилта хлопчатника vertioilliura dahliae Kleb. // Докл. АН УзССР. - 1974. - IS 3. - С. 50-51.

4. . Черкасова Г.В., Сафиязов К. Влияние УФ-облучения на изменчивость гриба Vertioillium dahliae Kleb. // В сб. :' Структура и метаболизм микроорганизмов. - ФАН. - Ташкент; - 1975. - С. 61-68.

5. Атакузиева P.A., Черкасова Г.В., Сафиязов К; Действие УФ-облучения на оксидоредуктазную активность гриба Vert.dahliae Kleb. // В сб.: Экология, физиология и изменчивость микроорганизмов. -ФАН. - Ташкент. - 1976. - С. 289-295.

6. Черкасова Г.В., Атакузиева P.A. * Сафиязов Ж. Определение вирулентности и ферментативной активности различных штаммов vert, dahliae Kiob., полученных в результате УФ-обдучения // В сб. : Экология, физиология и изменчивость микроорганизмов. -'Ш1. - Ташкент.

- С. 296-300.

. 7. Черкасова Г.В. О делении адер Vert.dahliae Kleb.// В сб.: Водоросли и грибы водоемов и. почв Средней Азии., - ФАН. - Ташкент.

- 1977. - С. 213-222.

.8. Сафиязов Ж., Черкасова Г.В. Ультрасткртурная особенность ■

мутантных штампов V.dahliae Kleb. tJ Докл. Ail УзССР. - IS7S. -tö II. - G. 72-73.

9.. Сафиязов S., Черкасова Г.В. Полиплоидия.и вирулентность гриба Vert.dahilae Kleb. // У1 съезд Всесоюзного микробиологического общества. T. I. Прогресс в познании микробного мира. - Рига.

- IS80. - С. 43.

10. Сафиязов Ï., Черкасова Г.В. О лизогении вилта хлопчатника Vert.dahlias Kleb. // Докл. ВАСХНИЛ. - 1980. - II. - С. 23-24.

11. Ыурадов U.M., Черкасова Г.В. Явление лизиса в культуре Vert.dahliae Kleb, // в сб. : Биология и селекция микроорганизмов.

- Ф АН. - Ташкент. - 1980. - С. II9-I25.*

12. Черкасова Г.В., Сафиязов ÏÏ. Изучение структуры клеточной стенки покоящихся структур у различных штаммов Vert.dahilae Kleb. // Докл. АН УзССР. - 1988. - * 8. - С. 51-53..

' - 'С :'

, V V**

1

ч! Ч'л

- V

«Л • ' '

. »

V

г Ж* ^ * ч .Vе 7 -

1>*» , * Л -У^' ^

• „. . , • V. ч V"

- > % ^ • • ■ * 'Х-» ' >

• ' -л 5\Г ;

. •'1 V* * . - ••' ■ •■ • •

- . 1 , •• •• " .-1 '

* '^-"Ч. " . ■•Л'**** 'ч 1 **

V-, > . • ' ...-л* 4 »к - •

> ' * ч 13*-

• > Г " ■

< -< - - - -

* - - - ■ •• 4; - , >г* ч - - - "-"V' "

Г 4 1 , '

11 *

. --

«л.' -

% X.,

- * -г 5

Объем IV, п. л. Заказ <263Ь- ; Тираж 100

.....-..... * • • 1—

Типография Московской с,-х, акаЖгагеЙ *к;; К. Л'. Твмирйэева 127550, Москва И-550, ТиХврЯЗевСкая уЛ./ 44 \ ""

--«V ! 4% "•-.'»54.