Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индукторы болезнеустойчивости на основе хитозана для защиты от грибных и вирусных болезней

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Индукторы болезнеустойчивости на основе хитозана для защиты от грибных и вирусных болезней"

На правах рукописи

КУЛИКОВ СЕРЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

ИНДУКТОРЫ БОЛЕЗНЕУСТОЙЧИВОСТИ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА ДЛЯ ЗАЩИТЫ ОТ ГРИБНЫХ И ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Специальность 03.00.23 -биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Щёлково - 2006

Работа выполнена в Центре "Биоинженерия" Российской Академии Наук

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук

Валерий Петрович Варламов

Сергей Николаевич Чирков

Галина Ивановна Воробьёва Лейла Асхатовна Габдрахманова

Ведущая организация: Институт Биологии

Уфимского Научного Центра Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится 19 мая 2006 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, г. Щёлково, Московская область, пос. Биокомбинат, ВНИТИБП.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП РАСХН. Автореферат разослан 18 апреля 2006г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ю.Д. Фролов

¿ОФбЬ

од

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из важнейших достижений мирового биотехнологического прогресса в области изыскания новых перспективных веществ за последние годы стало получение, изучение и внедрение в практику биополимеров хитина, хитозана и их производных. Особенности структуры хитозана обуславливают ряд привлекательных свойств этого поликатиона -гипоаллергенность, биодеградируемость, биосовместимость, а также иммуномодулирующие свойства.

Метод индуцирования неспецифической устойчивости у растений с помощью хитозановых элиситоров является одним из перспективных способов защиты сельскохозяйственных культр от грибных болезней. Метод основан на индуцировании врождённых защитных механизмов растения. Под действием хитозана происходит фенотипическая иммунокоррекция растений, в результате чего изменяется функционирование растительной ткани, связанное с уровнем экспрессии защитных генов. Такой механизм действия хитозанового элиситора в наименьшей степени влияет на полезную микрофлору агроценоза и обуславливает его экологическую безопасность.

Одним из уникальных и практически неизученных биологических свойств хитозана является его способность индуцировать устойчивость у растений к вирусным заболеваниям.

Для хитозана, который является гетерополимером, а также в силу специфики его получения характерна структурная неоднородность. Это обстоятельство существенно сказывается на его иммуномодулирующих свойствах, зависящие от особенностей структуры биополимера. До настоящего времени данные о связи между физико-химическими характеристиками хитозана и его биологическими свойствами носят разрозненный и не систематический характер.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение свойств низкомолекулярного хитозана и препаратов на его основе как индукторов устойчивости к грибным и вирусным заболеваниям.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:

- оценить влияние препарата АгроХит на основе низкомолекулярного хитозана на патогенную и сапротрофную микофлору картофельных посадок;

- провести сравнительный анализ влияния препарата АгроХит на микоценоз картофельных посадок в сравнении с другими препаратами;

- оценить влияние физико-химических свойств хитозана на его противовирусную активность в растениях;

- выявить возможные механизмы противовирусной защиты растений, индуцируемые хитозаном.

Научная новизна работы. Проанализировано влияние препарата на основе низкомолеклярного хитозана на патогенную и сапротрофную микофлору картофельных посадок. Проведён сравнительный анализ влияния элиситорного препарата на основе низкомолекулярного хитозана на микоценоз картофельных посадок в сравнении с препаратами, обладающих другими механаизмами действия. Показано, что в сравнении с биопрепаратом Триходермин и химическими пестицидами, элиситорный препарат на основе хитозана в большей степени влияет на патогенные грибы поражающие наземные части растений картофеля - Phytophthora sp. и Alternaría sp. и наиболее щадящим образом воздействует на непатогенную сапротрофную микрофлору, обнаруживая тем самым наименьший побочный эффект.

Показана способность хитозана индуцировать устойчивость у растений фасоли к заражению вирусом мягкой мозаики фасоли (ВММФ). Установлена молекулярная масса (мол. м.) олигомера хитозана, обладающая наибольшей противовирусной акивностью.

Проведена оценка влияния мол. м. хитозана на его противовирусные

свойства в растениях табака при их заражении вирусом табачной мозаики (ВТМ). Показано, что в изолированных протопластах табака хитозан индуцирует активность клеточной РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая, как известно, играет важную роль в противовирусной устойчивости у растений.

Практическая значимость работы. Показано, что элиситорный препарат на основе хитозана снижает численность таких грибных вредителей картофеля как Phytophthora sp., Alternaría sp. и Oospora sp., одновременно оказывая минимальное воздействие на непатогенную сапротрофную микофлору картофельных посадок. Предлагается применять элиситорные препараты на основе хитозана для обработки сельскохозяйственных культур для уменьшения масштабов применения синтетических фунгицидов.

Предложена оригинальная схема получения низкомолекулярного хитозана в бессолевых условиях для производства препарата АгроХит.

Способность хитозана индуцировать устойчивость у растений к заражению вирусами является предпосылкой к созданию противовирусных препаратов. Выяснение механизмов защиты растений от вирусов может стать важным для осознанного поиска эффективных форм антивирусных препаратов.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на VII Международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (Санкт-Петербург - Репино, 2003); VI Int. Conf. of EUCHIS «Advanced in chitin science» (Poznan, Poland, 2004); Международной научно-практической коференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», (Щёлково, 2005); ХП1 Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение», (Казань, 2005).

Личный вклад соискателя. Микологический анализ посевов картофеля проводили совместно с сотрудниками кафедры микробиологии КГУ (Казань). Изучение противовирусных свойств хитозана осуществляли совместно с сотрудниками кафедры вирусологии МГУ (Москва). Остальные исследования выполнены автором самостоятельно.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 статьи.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, методической части, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 4 рисунка, библиографию из 125 наименований.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использовали крабовый высокомолекулярный хитозан производства ЗАО «Биопрогресс», г. Щёлково.

РНКаза Bacillus intermedius (биназа) была любезно предоставлена Р.И. Яковлевым (Институт молекулярной биологии РАН, г. Москва).

MF-3 белок Pseudomonas fluorescens ("microbial factor 3") был любезно предоставлен В.Г. Джавахия (Институт фитопатологии РАСХН, г. Голицыно).

Измерение вязкости растворов хитозана проводили визкозиметрически. Рассчитывали величину характеристической вязкости (т]). Средневязкостную молекулярную массу хитозана (Mv) рассчитывали по уравнению Марка-Хаувинка.

Измерение динамической вязкости определяли на ротационном вискозиметре Брукфильда с цилиндрическим ротором при 30°С.

Степень деацетилирования хитозана (СД) определяли методом кондуктометрического титрования.

Фракционирование хитозана осуществляли ультрафильтрацией через мембраны YM30, РМ10 и YM5 (Millipore, США).

Средневесовую молекулярную массу CMw), среднечисловую молекулярную массу (Мп), значения полидисперсности flp = Mw/Mn), массу в пике СМр) хитозана определяли методом гель-проникающей ВЭЖХ на приборе

«Sykam» (Германия) с использованием тандема колонок Ultrahydrogel 250 и Ultrahydrogel 500 (Waters, США). Контроль и обсчёт хроматографии осуществляли с помощью программы «Мультихром» версия 1.6 (ЗАО «Амперсенд», Москва).

Комплексообразование хитозана и МРЗ-белка определяли по изменению электрофоретической подвижности белка. Вертикальный электрофорез проводили в 10% ПААГ в 0,05 М трис-ацетатном буфере рН 5,4 в приборе «MiniProtean» (США).

2.2 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.2.1 Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде

Технология бессолевого гидролиза предполагает предварительное переосаждение исходного хитозана, которое позволяет избежать потерь вещества по причине его высокой молекулярной массы с последующим растворением в расчётном количестве кислоты до оптимального для ферментативной деполимеризации значения рН. Такая технологическая схема позволяет избавиться от присутствия солей во время гидролиза, а следовательно и в конечном продукте, и получать хитозан, не требующий дополнительной очистки, с заданным противоионом - ацетатным, лактатным, хлоргидратным и другими.

Для гидролиза высокомолекулярного хитозана нами использовался промышленный ферментный препарат Целловиридин Г20х на основе гидролитического комплекса микромицета Trichoderma viride. Гидролиз высокомолекулярного 1%-ного хитозана проводили при фермент-субстратном соотношении 1:400, рН 5,2 и температуре 55°С. Степень гидролиза определяли по падению динамической вязкости. После окончания гидролиза динамическая вязкость образцов падала более чем на два порядка и для образцов в форме ацетата, лактата и хлоргидрата составила 4,9; 5,9 и 7,5 сП, соответственно (табл.1).

Таблица 1.

Изменение динамической вязкости (сП) 1%-ного раствора хитозана при ферментативном гидролизе в бессолевой среде с различными противоионами

время гидролиза, мин

кислота 0 30 60 120 240

АсОН > 1000 21,6 11,2 6,3 4,9

LacOH > 1000 31,1 15,8 8,4 5,9

НС1 > 1000 46,5 23,2 11,0 7,5

Таким образом, показана эффективность деполимеризации хитозана при его гидролизе ферментативным комплексом микромицета Т. viride в бессолевых условиях. Данная технология получения низкомолекулярного хитозана может стать основой для получения элиситорных и ветеринарных биопрепаратов.

2.2.2 Структура комплекса микромицетов филлосферы

Было установлено, что во всех вариантах на листьях растений присутствовали возбудители фитофтороза, ранней (Alternaría sp.) и бурой (Cladosporium sp.) пятнистостей, трахеомикозного (Fusarium sp.) и вертициллёзного (Verticillium sp.) увяданий, доминирующее положение среди которых занимали представители родов Fusarium и Alternaría (табл. 2).

Обработка АгроХитом и Триходермином, как и в эталонном варианте, способствовала уменьшению популяционной плотности грибов рода Alternaría в июле до определенного предела с последующим восстановлением в августе уровня, превышающего исходный в июне. Возбудитель поздней пятнистости появлялся сразу в заметном количестве только в июле и практически не прогрессировал в августе. На распространённость фитофторы влияли все

8

используемые препараты, уменьшая частоту встречаемости микромицета в два раза по сравнению с контролем. По-разному они проявляли себя по отношению к Fusarium sp. АгроХит, как и эталонный вариант, сдерживал распространение фузариоза во время интенсивного опрыскивания в июне и июле, но после прекращения обработок в августе показатели почти достигали контрольного. На этом фоне Триходермин проявил себя как и в случае почвенной инфекции -восстановления уровня популяционной плотности Fusarium sp. не происходило. Более того, плотность популяции фитопатогена к концу вегетации уменьшилась, переместившись из разряда типично частых в разряд типично редких.

Среди сапротрофных микромицетов доминирующее положение занимали представители родов Мисог и Pénicillium, вследствие их высокого пула в почве до посадки растений.

Aureobasidum sp. появляется в конце процесса вегетации на зрелых листьях с разной частотой встречаемости в контрольном и опытном вариантах (табл. 2). Botrytis sp. обнаруживался в период цветения картофеля.

Поражение посадок картофеля такими фитопатогенами как Cladosporium sp., Stemphilium sp., Botrytis sp., Verticillium sp. было незначительным и эпизодическим в процессе вегетации, что не поволяет говорить об эффективности фунгицидов и биопрепаратов по отношению к этим микромицетам.

Таблица 2

Микологический анализ филлосферы картофеля*

Частота встречаемости, %

Контроль Эталон АгроХит Триходермин

Микроорганизм VI VII VIII VI VII VIII VI VII VIII VI VII vin

Fusarium 65,0 85,0 98,0 62,5 60,0 90,0 72,5 65,0 77,5 40,0 27,0 17,5

Phytophthora - 22,5 20,0 - 12,5 12,5 - 10,0 10,0 - 7,5 10,0

Alternaria 62,5 67,5 95,0 55,0 37,5 70,0 57,5 27,5 75,0 50,0 42,5 82,0

Cladosporium 5,0 - 22,5 5,0 - 17,5 5,0 - 25,0 5,0 , - 20,0

Aspergillus - 7,5 - - 12,5 - 2,5 2,5 5,0 7,5 -

Pénicillium fellutanum 22,5 17,5 12,5 12,5 5,5 - 15,0 7,5 - 12,5 7,5 -

P.regulosum 10,0 15,0 20,0 7,5 10,0 17,0 7,5 12,5 22,5 5,0 10,0 17,5

Mucor 72,5 70,0 67,5 44,5 32,5 80,0 45,0 32,5 100,0 57,5 45,0 75,0

Trichoderma 7,5 10,0 7,5 7,5 7,5 - 12,5 10,0 - 12,5 45,0 25,0

Verticillium 2,5 5,0 ! - - 2,5 - - 2,5 - - - 2,5

Botrytis - 5,0 10,0 - 2,5 5,0 - 2,5 7,5 - - -

Sthemphilium - - 10,0 - - 7,5 - - 10,0 - - 5,0

Aureobasidium - 10,0 17,5 - 5,0 12,5 - 7,5 15,0 - 2,5 5,0

Acremonium 7,5 10,0 10,0 - - - 2,5 - - 2,5 - -

Fusidium 7,5 5,0 5,0 5,0 - - 2,5 , - 1 - 2,5 - -

* VI - июнь; VII - июль; VIII- август

2.2.3 Микологический анализ клубней картофеля

С клубней непротравленного семенного картофеля было выделено 13 родов микромицетов, из которых к опасным возбудителям заболеваний относились 7 родов: Phytophthora, Fusarium, Phytium, Oospora, Geotrichum, Rhizoctonia, Alternaria (табл. 3). Существенную долю фитопатогенных изолятов составляли Phytophtora sp., Rhizoctonia sp. и Fusarium sp., относящиеся к группе типично редких и типично частых видов. Реже в составе комплекса обнаруживались представители родов Phytium и Oospora.

В контрольном варианте отмечено усиление поражения клубней нового урожая фитопатогенными микромицетами примерно в 1,5-2 раза по сравнению с поражением клубней посевного картофеля.

Предпосадочная обработка посевных клубней и последующее опрыскивание растений в ходе вегетации синтетическими препаратами способствовали снижению популяционной плотности на клубнях нового урожая возбудителей фитофтороза и фузариозной гнили клубней, примерно в 2 раза уменьшилась частота встречаемости сапротрофов из родов Мисог и Pénicillium. С другой стороны в эталонном варианте на клубнях отмечено увеличение частоты встречаемости возбудителей бугорчатой и чёрной парши, резиновой и фузариозной гнилей, что может указывать на появление форм грибов, устойчивых к данным препаратам.

Применение биопрепаратов способствовало улучшению фитосанитарного состояния клубней нового урожая. Однако, препараты не подавляли рост и развитие возбудителей бугорчатой и чёрной парши, хотя АгроХит оказывал слабое угнетающее действие на возбудителей фузариоза.

Отмечено увеличение популяционной плотности указанных микромицетов к моменту уборки урожая. Вместе с тем, при использовании препарата на основе триходермы прослеживается тенденция уменьшения частоты встречаемости грибов рода Fusarium.

Таблица 3.

Микологический анализ клубней картофеля*

Частота встречаемости, %

Контроль Эталон АгроХит Триходермин

Микроорганизм V VIII IX VIII IX vni IX VIII IX

Fusarium sambosinum 22,5 52,5 57,5 37,5 45,0 17,5 12,5 15,0 10,0

F.gibbosum 17,5 30,0 30,0 20,0 30,0 10,0 10,5 7,5 5,0

Rhizoctonia 32,5 50,0 72,5 17,5 30,0 40,0 52,5 37,5 47,5

Phytophthora 27,5 15,0 12,5 12,5 5,0 5,0 2,5 - 2,5

Alternaria 5,0 7,5 5,0 5,0 - 5,0 2,5 - -

Geotrichum 12,0 15,0 25,0 15,0 25,0 12,5 15,0 15.0 15,0

Oospora 15,0 10,0 22,0 17,5 32,5 7,5 17,5 25,0 45,0

Phytium 10,0 15,5 22,5 2,5 10,0 7,5 5,0 5,0 2,5

Cladosporium 7,5 - 10,0 - 5,0 - 5,0 - 5,0

Aspergillus - - 7,5 - 2,5 - 7,5 - 5,0

Pénicillium 87,5 85,0 40,0 57,5 45,0 75,0 32,5 85,0 32,5

Mortierella - - 7,5 - - 7,5 2,5 5,0 -

Mucor 85,0 100,0 52,5 100,0 57,5 80,0 37,5 75,0 57,5

Trichoderma 7,5 - 10,0 - 12,5 - 5,0 77,5 57,5

Nigrospora 15,7 - - - 2,5 - - - -

Chaetomium - - - - - 10,0 10,0 - -

Chephalosporium - - - - - - 7,5 - 2,5

* V - май, посевной материал; VIII - август; IX - сентябь.

ю

2.2.4 Продуктивность картофеля и качество урожая

В результате обработок картофельных посадок различными препаратами показано увеличение показателя урожайности во всех вариантах по сравнению с контролем (табл. 4).

Таблица 4.

Продуктивность картофеля и эффективность препаратов

Вариант Урожайность

ц/га % от контроля

Контроль 89 100

Эталон 110 123,6

АгроХит 120 134,8

Триходермин 103 115,7

2.2.5 Противовирусная активность хитозана на растениях фасоли

Известно, что противовирусная активность хитозана зависит от структуры молекулы, в частности, от его мол. м. Однако, в большинстве работ по оценке биологической активности хитозана в качестве характеристики препарата обычно используют его средневязкостную мол. м. (Му), которая не отражает величину полидисперсности хитозана. Это затрудняет интерпретацию и сравнение экспериментальных данных. Поэтому необходимым является получение как можно более однородных по молекулярно-массовому составу фракций хитозана и более подробная физико-химическая характеристика препаратов.

С этой целью последовательным фракционированием низкомолекулярного хитозана на мембранах были получены 4 образца хитозана с разными мол. м. (табл. 5). Основную долю, примерно в равном массовом соотношении, составляли фракции 1 и 2, и лишь незначительное количество хитозана было сосредоточено в 3 и 4 фракциях.

Результаты хроматографического анализа показывают, что по сравнению с исходным гидролизатом хитозана его отдельные фракции имеют заметно

меньшее значение полидисперсности 1р.

Таблица 5.

Характеристика образцов хитозана (гель-проникающая ВЭЖХ'|

№ фракции хитозана Mw (кДа) Мп(кДа) IP Массовая доля фракции, %

Нефракционированный хитозан 40,4 7,4 5,41 100

1 30,3 8,3 3,60 51

2 10,1 3,3 3,00 42

3 2,2 1,3 1,68 2

4 1,2 0,7 1,63 4

Mw - средневесовая масса; Мп - среднечисловая масса; 1р - значение

полидисперсноста.

Это свидетельствует о большей однородности полученных образцов по мол. м. Особенно характерно это для фракций с Mw 2,2 и Mw 1,2, которые, как видно из таблицы, состоят из молекул хитозана, очень близких по размерам.

Противовирусную активность этих фракций сравнивали при подавлении системной инфекции ВММФ в растениях фасоли Phaseolus vulgaris cv. Contender. Такая модельная система для изучения влияния хитозана на вирусные инфекции растений была использована впервые.

Данные, представленные в табл. 8, показывают, что на 14 сутки после заражения накопление вируса удалось обнаружить в инокулированных листьях, однако по сравнению с контролем оно оставалось значительно подавленным. При этом наибольшей противовирусной активностью обладали самые низкомолекулярные фракции хитозана с Mw 2,2 и Mw 1,2.

Подавление размножения вируса в инокулированных листьях, обработанных хитозаном с Mw 2,2 и Mw 1,2, оказалось настолько велико, что системного распространения вируса в этих растениях не было обнаружено и через 2 недели после заражения (табл. 6). Следует отметить, что обработка растений хитозанами с большей Mw также приводила к задержке проникновения вируса в верхние листья.

Таблица 6.

Накопление ВММФ в инокулированных и верхних листьях фасоли на 14 сутки после заражения (% от контроля)

ОбраЗцш ХИГОЗ&пбв Концентрация хитозана, мкг/мл

10 100 10 100 1

Инокулированые листья Верхние листья

М\¥ 40,4 (до фракционирования) 0,8 - 39 0,2

М\у 30,3 - - 33 4,2

М\у 10,1 19 - 35 0,04

М\у2,2 0,5 - н.о. н.о.

Mw 1,2 0,3 - н.о. н.о.

Глюкозамин 100 100 90 97

Ы-ацетилглюкозамин 100 100 100 100

«н.о.» - вирус не обнаружен;

«-» - вирус не определяли.

Важно отметить, что нефракционированный образец хитозана обладал противовирусной активностью меньшей, чем низкомолекулярные фракции, входящие в его состав, но более высокой, чем фракции с М\у 10,1 и 30,3. По всей вероятности, это означает, что активность нефракционированного хитозана обусловлена в основном его низкомолекулярными фракциями с М\у 2,2ИМ\У1,2.

Мономеры - гшокозамин и Ы-ацетилглюкозамин не обладали

противовирусной активностью: в обработанных ими растениях вирус

накапливался так же, как и в листьях контрольных растений (табл. 6).

Известно, что препараты хитозана могут существенно отличаться по

молекулярно-массовому распределению в зависимости от способа гидролиза.

Кроме того, олигомеры, полученные из одного и того же хитозана кислотным и

15

ферментативным гидролизом, могут различаться по распределению ацетил ированных остатков, что может иметь значение для их биологической активности. Во многих работах была отмечена необходимость ацетилирования олигомеров для проявления ими элиситорных свойств, хотя это не всегда подтверждается корректным анализом используемых образцов. В нашей работе был использован хитозан со степенью деацетилирования 85%, то есть в образцах с М\¥ 2,2 и Муу 1,2, полученных ферментативным гидролизом, в среднем один-два остатка являются ацетилированными. Известно, что при ферментативном гидролизе ацетилированные остатки расположены, как правило, на концах полимерной цепи. Это позволяет предположить возможность сближения в пространстве концевых К-ацетилированных остатков нескольких молекул олигомеров с образованием блока, обладающего повышенной биологической активностью. В случае более высокомолекулярных цепей у фракции с Миг 10,1 и Миг 30,3 такое пространственное сближение менее вероятно.

Таким образом, нами показано возрастание противовирусной активности хитозана при понижении его мол. м. Самыми активными были фракции с М\у 2,2 и Мш 1,2, что примерно соответствует степени полимеризации олигомера от 6 до 11. Повышенная противовирусная активность низкомолекулярных фракций связана, возможно, с особенностями их структуры, а также лучшей проникающей способностью небольших молекул хитозана через растительные наружные покровы.

2.2.6 Противовирусная активность хитозана на растениях табака Мсойапа ¡аЬасит су. ватяип пп

Важным фактором, влияющим на противовирусную активность хитозана, является биологический вид растения. С этой целью мы исследовали влияние мол. м. хитозана на растениях табака ШсоНапа гаЪасит су. ватшии пп (табл 7).

Таблица 7

Зависимость противовирусной активности хитозана от его молекулярной

Образцы хитозана* ВТМ, мкг/мл в % к контролю

контроль 100

0,2-1.5 к Да (олигомеры) 115

2,1 кДа 7Л

4,2 кДа 90

7,5 кДа 17

13 кДа 27

18 кДа 100

57 кДа 74

* молекулярная масса в хроматографичсском пике - Мр

Как видно, противовирусная активность хитозана зависела от мол. м. и на этом виде растений. Однако, в отличие от растений фасоли, накопление вируса на 4 сутки после заражения заметно ингибировали хитозаны с мол. м. 7,5 и 13 кДа. Наименее эффективными оказались низкомолекулярные образцы хитозана с мол. м. 2,1 и 4,2 кДа и олигомеры, а также более высокомолекулярные - 18 и 57 кДа. Это позволяет сделать вывод, что хитозан с мол. м. в диапазоне 5-15 кДа обладает наибольшей противовирусной активностью в растениях табака.

Исследование динамики накопления вируса в инокулированных листьях показало, что ингибирующее действие хитозана на вирусную инфекцию сказывается по крайней мере в течение двух недель (табл. 8).

Таблица 8

Влияние хитозана с молекулярная массой (Мр) 7,5 Ша на динамику накопления ВТМ в инокулированных листьях N. шЪасит су. Батвип пп

Сутки после заражения ВТМ мкг/мл

Хитозан Контроль

4 9 34

7 115 204

13 344 600

Ингибирование вирусной инфекции в инокулированных листьях способствовало также замедлению системного распространения вируса из заражённых листьев. У растений, обработанных хитозаном, вирусная мозаика в верхушечных листьях появляется позднее, чем у необработанных растений (табл. 9).

Таблица 9

Влияние хитозана с молекулярной массой (Мр) 7,5 Ша на динамику накопления ВТМ в верхушечных листьях N. шЬасит су. Батвип пп

Сутки после заражения Симптомы мозаики в верхушечных листьях, % растений

Хитозан Контроль

14 0 30

18 30 70

26 70 100

2.2.7 Противовирусная активность хитозана на растениях табака N.

1аЬасит ст. ватзип NN

Для оценки влияния молекулярной массы хитозана на его противовирусную активность были также использованы растения табака N. ¡аЬасит с\. Батвип NN. устойчивые к ВТМ. Как известно, растения с доминантным геном устойчивости реагируют на заражение образованием местных некрозов, что препятствует системному распространению вируса. Подсчёт некрозов, образовавшихся после заражения ВТМ, показал, что количество некрозов зависит от мол. м. хитозана (табл. 10). Самым эффективным, как и в случае экспериментов с системными табаками (п.2.2.7.), оказался хитозан с мол. м. 7,5 кДа, который вдвое уменьшал количество местных некрозов. Препараты хитозанов с большей и меньшей мол. м. оказались менее активными.

Таблица 10

Зависимость противовирусной активности хитозана со СД 85% от

Образцы хитозана Количество некрозов в % к контролю

контроль 100

0,2-1.5 кДа (олигомеры)* 100

4 кДа** 65

7,5 кДа* 48

750 к Да** 95

* молекулярная масса (Мр - молекулярная масса в пике) полученная методом гель-проникающей ВЭЖХ ** средневязкостная масса (Му)

Таким образом, хитозан индуцирует противовирусную устойчивость как в системных, так и в некротических сортах табака. Эти эксперименты показывают, что устойчивость к ВТМ, индуцированная хитозаном, может быть обусловлена ингибированием межклеточного распространения вируса.

2.2.8 Индукция хитозаном РНК-зависимой РНК-полимеразной активности в изолированных протопластах табака

Влияние хитозана может быть также связано с подавлением репликации вируса. С этой целью мы изучали влияние хитозана на активность клеточной РНК-зависимой РНК-полимеразы. Этот фермент играет ключевую роль в механизме постранскрипционного умолкания генов, участвуя в деградации матричных и вирусных РНК. Ранее было показано, что в протопластах табака хитозан индуцирует белок с мол. м. около 130 кДа, соответствующий по массе РНК-зависимой РНК-полимеразе (Чирков и др., 1995). Однако, ферментативная активность этого белка не была изучена.

Ферментативную активность определяли в гомогенате изолированных протопластов табака N. ¡аЪасит су. Загшип с использованием РНК ВТМ и полиаденилата в качестве однонитевой матрицы (8сЫеЬе1 е/ а1., 1993). Мы

19

показали, что хитозан с мол.м. (М\у) 40 кДа в концентрации 0,1 мг/мл индуцирует в протопластах табака активность РНК-зависимой РНК-полимеразы (рис. 1).

2500

50000 40000 30000 20000 10000 0

контроль хитозан

контроль хитозан

Рисунок 1. Влияние хитозана на активность РНК-зависимой РНК-полимеразы в протопластах табака. А: с использованием однонитевой поли (А) матрицы; В: с использованием РНК ВТМ.

Данные результаты позволяют предположить, что одним из факторов противовирусного действия хитозана в растениях табака является индукция им РНК-зависимой РНК-полимеразной активности.

2.2.9 Противовирусная активность МТЗ-белка и РНКазы в комплексе с хитозаном на растениях табака

Нами было показано, что МРЗ-белок с молекулярной массой 17 кДа из бактерии Р. /¡иогейсет индуцирует в растениях табака N шЬасит су. Хап1Ы устойчивость к ВТМ, проявляющуюся в подавлении образования местных некрозов. Однако, элиситорное действие МРЗ-белка проявлялось только при его втирании в лист с использованием целита в качестве абразива.

Хитозан широко используется как средство доставки различных веществ

внутрь клеток. Поэтому нами была изучена возможность применения хитозана

для облегчения проникновения МРЗ-белка через растительные покровы. Для

проверки эффективности действия МРЗ-белка в комплексе с хитозаном

20

растения табака обрабатывали раствором, содержащим 0,01 мг/мл МРЗ-белка и 0,1 мг/мл хитозана с мол. м. 6 кДа. Как видно из таблицы 11, опрыскивание растений комплексом хитозана и МРЗ-белка уменьшало количество некрозов в три раза, в то время как по отдельности ни хитозан ни МРЗ-белок не влияли на образование некрозов.

Таблица 11

Противовирусное действие хитозан-белкового комплекса на растениях N шЬасит су. Хапйи

Вариант Количество некрозов Количество некрозов, % к контролю

Контроль ИЗ 100

Хитозан 108 96

МРЗ-белок 100 88

МРЗ-белок + хитозан 33 29

Это позволяет предположить, что элиситорный эффект оказывает МрЗ-белок, а хитозан выполняет роль доставщика. Возможно, образуя комплекс с МЕЗ-белком, хитозан изменяет его конформацию, облегчая проникновение белка через покровы листа. Возможно также, что хитозан воздействует на растительные клетки, увеличивая проницаемость плазматической мембраны.

Образование комплекса хитозана с М]?3-белком определяли по способности хитозана изменять его электрофоретическую подвижность (рис. 2).

МИЗ-белкок, имеющий р13,4, при рН 5,0-6,0 должен обладать суммарным отрицательным зарядом. Исходя из аминокислотного состава МРЗ-белка в состав которого входят 27 кислых аминокислот и 14 основных, можно сделать вывод, что каждая молекуля белка несёт суммарно 13 отрицательных зарядов. Звено хитозана с молекулярной массой 169 несёт один положительный заряд. Таким образом, для полного связывания отрицательных зарядов 1 гр МРЗ-белка необходимо примерно 0,12 гр хитозана.

№ белок/хитозан белок/хитозан комплексо-образование

мкг/мкг -/+

1 1:0,5 1:3,28 -Н-+

2 1:0,3 1:1,97 +++

3 1:0,1 1:0,65 ++

4 1:0,03 1:0,19 +

5 1:0,01 1:0,065 -

6 1:0,003 1:0,019 -

7 0:0,5 0:3,28 Контроль хитозана

8 1:0,5 (глюкозамин) 1:3,28

9 0:0,5 (глюкозамин) 0:3,28 Контроль глюкозамина

10 1:0 1:0 Контроль МРЗ-белка

Рисунок 2. Электрофореграмма белка в 10% ПЛАТ, входящего в гель в отсутствии связывания с хитозаном.

Теоретические расчёты подтверждаются данными представленными на рис.2. Хитозан полностью связывает белок когда число положительных зарядов хитозана равно или больше количества отрицательных зарядов белка (№№ 1, 2). При уменьшении концентрации хитозана в комплексообразование вовлекается только часть белка, а несвязавшийся белок входит в гель (№№ 3,4). При дальнейшем уменьшении количества хитозана комплексообразование практически не наблюдается и весь белок входит в гель (№№ 5,6). Таким образом образование комплекса между хитозаном и МРЗ-белком осуществляется за счёт электростатического взаимодействия и для успешного комплексообразования требуется соотношения противоположных зарядов 1:1.

Отсутствие элиситорного действия РНКазы В. intermedins в комплексе с хитозаном возможно объясняется её основными свойствами (изоэлектрическая

22

точка равна 9,6), что препятствует электростатическому взаимодействию с одноимённозаряженным хитозаном.

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана в бессолевых условиях и получена опытная партия препарата АгроХит - индуктора болезнеустойчивости и росторегулятора растений.

2. Проведена оценка влияния препарата АгроХит на основе низкомолекуляриого хитозана на патогенную и сапротрофную микофлору картофельных посадок. Обнаружено, что обработка АгроХитом снижает численность патогенных грибов родов Phytophthora, Alternaria и Oospora.

3. Установлено, что препарат АгроХит в сравнении с Триходермином и синтетическими пестицидами в меньшей степени влияет на сапротрофную микофлору. Препарат на основе триходермы был особенно эффективен против Fusarium sp. Синтетические пестициды, подавляя большинство патогенных и сапротрофных грибов, существенно изменяли структуру сообщества сапротрофных мшсромицетов, что способствовало увеличению численности патогенов родов Oospora и Geotrichum.

4. Установлено, что у растений фасоли и табака хитозан индуцирует устойчивость к заражению вирусами. Наибольшей эффективностью подавления вирусной инфекции в растениях фасоли обладал хитозан с молекулярной массой 1-2 кДа, а в растениях табака хитозан с молекулярной массой 5-15 кДа.

5. Показано, что в протопластах табака хитозан индуцирует активность клеточной РНК-зависимой РНК-полимеразы, что может являться одним из механизмов противовирусной устойчивости у растений.

6. Методом электрофореза в полиакриламидном геле показано, что

комплексообразование хитозана и MF3-белка Pseudomonas fluorescens

23

происходит за счёт электростатического взаимодействия. Элиситорное действие МРЗ-белка обусловлено возможностью образования комплекса с хитозаном.

Практические предложения. Разработана методика «Получение низкомолекулярного хитозана методом ферментативного гидролиза в бессолевых условиях», утверждена директором Центра «Биоинженерия» 28 сентября 2005.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Куликов С.Н., Алимова Ф.К., Захарова Н.Г., Немцев C.B., Варламов В.П. Препараты «АгроХит» и «Триходермин» против болезней картофеля // Мат. 7-ой Международной конф. "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М: ВНИРО, 2003. - С.86-90.

2. Shumilina D.V., Il'ina A.V., Kulikov S.N., Dzhavakhiya V.G. Elicitor activity of MF3-protein from Pseudomonas fluorescens and combination of MF3-protein with chitosan in different host - pathogen pairs // Ргос.б"1 Int. Conf. Of EUCHIS-04 / Ed. H. Struszczyk, A. Domard, M.G. Peter, H Pospieszny. Poznan, Poland, -2005. P.275-278.

3. Куликов C.H., Ильина A.B., Албулов А.И., Варламов В.П., Гринь A.B. Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевых условиях // Мат. Международной научно-практической коференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щёлково, 2005. -С.435-438.

4. Куликов С.Н., Ильина A.B., Варламов В.П. Применение гидролитического комплекса ферментов Trichoderma viride в бессолевой деполимеризации хитозана // Мат. XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение», Казань, 2005г. - С.51-53.

5. Куликов С.Н., Алимова Ф.К., Захарова Н.Г., Немцев C.B., Варламов В.П. Биопрепараты с разным механизмом действия для борьбы с грибными болезнями картофеля // Прикладная Биохимия и Микробиология. - 2006. -Т.42. - № 1 - С.86-92.

6. Куликов С.Н., Чирков С.Н., Ильина A.B., Лопатин С.А, Варламов В.П. / Влияние молекулярной массы хитозана на его противовирусную активность в растениях // Прикладная Биохимия и Микробиология, 2006. - Т.42. - № 2 -С.224-228.

Принято к исполнению 12/04/2006 Заказ № 260

Исполнено 1304/2006 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

ЛРОбк

3-909

№•7 90©

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Куликов, Сергей Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Хитина и хитозан - биогенные элиситоры

1.2 Хитин и хитозан: химическое строение и свойства

1.3 Взаимодействие хитина с растительным организмом

1.4 Взаимодействие хитозана с растительным организмом

1.5 Элиситорная активность хитина и хитозана

1.5.1 Ионные потоки

1.5.2 Активные формы кислорода и азота

1.5.3 Вторичные метаболиты

1.5.4 Ферменты

1.6 Элиситорная активность хитина и хитозана в отношении грибных заболеваний

1.7 Биопрепараты на основе хитина и хитозана в защите растений от грибов

1.8 Элиситорная активность хитина и хитозана в отношении вирусных заболеваний

1.9 Биологическая активность хитозана, связь с химической структурой

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

• 2.1 Материалы и методы

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде

3.2 Полевые испытания препаратов

3.2.1 Биометрические показатели посевов картофеля

3.2.2 Микологический анализ почвы

3.2.3 Распространённость и развитие заболеваний растений

3.2.4 Структура комплекса микромицетов филлосферы

3.2.5 Микологический анализ клубней картофеля

3.2.6 Продуктивность картофеля и качество урожая

3.3 Противовирусная активность хитозана на растениях

3.3.1 Противовирусная активность хитозана на растениях фасоли

3.3.2 Противовирусная активность хитозана на растениях табака N. tabacum cv. Samsun nn

3.3.3 Противовирусная активность хитозана на растениях табака N. tabacum cv. Samsun NN

3.3.4 Индукция хитозаном РНК-зависимой РНК-полимеразной активности в изолированных протопластах табака

3.3.5 Противовирусная активность МРЗ-белка и РНКазы в комплексе с хитозаном на растениях табака

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Индукторы болезнеустойчивости на основе хитозана для защиты от грибных и вирусных болезней"

Одним из важнейших достижений мирового биотехнологического прогресса в области изыскания новых перспективных веществ за последние годы стало получение, изучение и внедрение в практику биополимеров хитина, хитозана и их производных. Особенности структуры хитозана обуславливают ряд привлекательных свойств этого поликатиона -гипоаллергенность, биодеградируемость, биосовместимость, а также иммуномодулирующие свойства.

Актуальность темы. Метод индуцирования неспецифической устойчивости у растений с помощью хитозановых элиситоров является ф одним из перспективных способов защиты сельскохозяйственных культр от грибных болезней. Метод основан на индуцировании врождённых защитных механизмов растения. Под действием хитозана происходит фенотипическая иммунокоррекция растений, в результате чего изменяется функционирование растительной ткани, связанное с уровнем экспрессии защитных генов. Такой механизм действия хитозанового элиситора в наименьшей степени влияет на полезную микрофлору агроценоза и обуславливает его экологическую безопасность.

Одной из уникальных биологических активностей хитозана является его способность индуцировать устойчивость у растений к вирусным

• заболеваниям.

Для хитозана, который является сополимером глюкозамина и N-ацетилглюкозамина, а также в силу специфики его получения характерна структурная неоднородность. Это обстоятельство существенно сказывается на его иммуномодулирующих свойствах, зависящих от особенностей структуры биополимера. До настоящего времени данные о связи между физико-химическими характеристиками хитозана и его биологическими ® свойствами носят разрозненный и не систематический характер.

Целью настоящей работы являлось изучение свойств низкомолекулярного хитозана и препаратов на его основе как индукторов устойчивости к грибным и вирусным заболеваниям.

Для достижения поставленной цели были определены следующие основные задачи:

- оценить влияние препарата АгроХит на основе низкомолекулярного хитозана на патогенную и сапротрофную микофлору картофельных посадок;

- провести сравнительный анализ влияния препарата АгроХит на микоценоз картофельных посадок в сравнении с другими препаратами;

- оценить влияние физико-химических свойств хитозана на его противовирусную активность в растениях;

- выявить возможные механизмы противовирусной защиты растений, индуцируемые хитозаном.

Научная новизна работы. Проанализировано влияние препарата на основе низкомолеклярного хитозана на патогенную и сапротрофную микофлору картофельных посадок. Проведён сравнительный анализ влияния элиситорного препарата на основе низкомолекулярного хитозана на микоценоз картофельных посадок в сравнении с препаратами, обладающих другими механаизмами действия. Показано, что в сравнении с биопрепаратом Триходермин и химическими пестицидами, элиситорный препарат на основе хитозана в большей степени влияет на патогенные грибы поражающие наземные части растений картофеля - Phytophthora sp. и Alternaria sp. и наиболее щадящим образом воздействует на непатогенную сапротрофную микрофлору, обнаруживая тем самым наименьший побочный эффект.

Показана способность хитозана индуцировать устойчивость у растений фасоли к заражению вирусом мягкой мозаики фасоли (ВММФ). Установлена молекулярная масса полимера хитозана, обладающая наибольшей противовирусной акивностью.

Проведена оценка влияния молекулярной массы и степени ф деацетилирования хитозана на его противовирусные свойства в растениях табака при заражении их вирусом табачной мозаики (ВТМ). В изолированных протопластах табака показан, индукцированный хитозаном, синтез белка с молекулярной массой 125-130 кДа, предположительно РНК-зависимой РНК-полимеразы, и усиление данной ферментативной активности. Что позволяет предположить механизм противовирусной защиты растений как хитозан индуцируемое замалчивание генов.

Практическая значимость работы. Предложена оригинальная схема получения низкомолекулярного хитозана в бессолевых условиях для производства препарата АгроХит.

Показано, что элиситорный препарат АгроХит на основе хитозана снижает численность таких грибных вредителей картофеля как Phytophthora, Alternaria и Oospora, одновременно оказывая минимальное воздействие на непатогенную сапротрофную микофлору картофельных посадок. Предложено применять элиситорные препараты на основе хитозана для обработки сельскохозяйственных культур для уменьшения масштабов # применения синтетических фунгицидов.

Способность хитозана индуцировать устойчивость у растений к заражению вирусами является предпосылкой к созданию противовирусных препаратов. Выяснение механизмов защиты растений от вирусов позволит осознанно создавать эффективные антивирусные препараты.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертация содержит введение, обзор литературы, методическую часть, раздел с обсуждением экспериментальных результатов, выводы, список литературы, приложение. Работа изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 4 рисунка, библиографию из 125 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Куликов, Сергей Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана в бессолевых условиях и получена опытная ф партия препарата АгроХит — индуктора болезнеустойчивости и росторегулятора растений.

2. Проведена оценка влияния препарата АгроХит на основе низкомолекулярного хитозана на патогенную и сапротрофную микофлору картофельных посадок. Обнаружено, что обработка АгроХитом снижает численность патогенных грибов родов Phytophthora, Alternaria и Oospora.

3. Установлено, что препарат АгроХит в сравнении с Триходермином и синтетическими пестицидами в меньшей степени влияет на сапротрофную микофлору. Препарат на основе триходермы был особенно эффективен против Fusarium sp. Синтетические пестициды, подавляя большинство патогенных и сапротрофных грибов, существенно изменяли структуру сообщества сапротрофных микромицетов, что способствовало увеличению численности патогенов родов Oospora и Geotrichum.

4. Установлено, что у растений фасоли и табака хитозан индуцирует устойчивость к заражению вирусами. Наибольшей эффективностью подавления вирусной инфекции в растениях фасоли обладал хитозан с молекулярной массой 1-2 кДа, а в растениях табака хитозан с молекулярной массой 5-15 кДа.

5. Показано, что в протопластах табака хитозан индуцирует активность клеточной РНК-зависимой РНК-полимеразы, что может являться одним из механизмов противовирусной устойчивости у растений.

6. Методом электрофореза в полиакриламидном геле показано, что комплексообразование хитозана и MF3-белка Pseudomonas fluorescens происходит за счёт электростатического взаимодействия. Элиситорное действие MF3-белка обусловлено возможностью образования комплекса с хитозаном.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Куликов, Сергей Николаевич, Щёлково

1. Ильина А.В., Ткачёва Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин• Г20х // Прикл. Биохим. Микробиол. 2002. - Т.38. - №1. - С.5-13.

2. Rege R.R, Block L.H. Chitosan processing: influence of process parameters during acidic and alkaline hydrolysis and effect of the processing sequence on the resultant chitosan's properties // Carbohydrate research. 1999. -V.321. - №3-4. - P.235-245.

3. Shibuya N., Kaku H., Kuchitsu K., Maliarik M.J. Identification of a novel high-affinity binding site for N-acetylchitooligosaccharide elicitor in the membrane fraction from suspension-cultured rice cells // FEBS Lett. 1993. -329.-№ 1-2.-P.75-78.

4. Ito Y., Kaku H., Shibuya N. Identification of a high-affinity binding protein for N-acetylchitooligosaccharide elicitor in the plasma membrane of suspension-cultured rice cells by affinity labeling // Plant J. 1997. - V.12. - №2. -P.347-356.

5. Day R.B., Okada M., Ito Y., Tsukada K., Zaghouani H., Shibuya N., Stacey G. Binding site for chitin oligosaccharides in the soybean plasma membrane // Plant Physiol. 2001. - V.126. - №3. - P.l 162-1173.

6. Stacey G., Shibuya N. Chitin recognition in rice and legumes // Plant and Soil. 1997. - V.194. - P.161-169.

7. Saito M., Chikazawa Т., Matsuoka H., Nishizawa Y., Shibuya N. Elicitor action via cell membrane of a cultured rice cell demonstrated by the single-cell transient assay // J. Biotechnol. 2000. - V.76. - № 2-3. - P.227-232.

8. Hadwiger L.A., Beckman J.M. Chitosan as a component of Pea-Fusarium interactions // Plant Physiol. 1980. - V.66. - P.205-211.

9. Yamada A., Shibuya N., Kodama O., Akatsuka T. Induction of phytoalexin formation in suspension-cultured rice cells by N-acetylchitooligosaccharides // Biosci. Biotech. Biochem. 1993. - V.57. - №3. -P.405-409.

10. Staehelin C., Granado J., Muller J., Wiemken A., Mellor R.B., Felix G., Broughton W.J., Boiler T. Perceptin of Rhyzobium nodulation factors by tomato cells and inactivation by root chitinases // PNAS. 1994. - V.91. - P.2196-2200.

11. Young D.H., Kohle H., Kauss H. Effect of chitosan on membrane permeability of suspension-cultured Glycine max and Phaseolus vulgaris cells // Plant Physiol. 1982. - V.70. - P. 1449-1454.

12. Hadwiger L.A., Beckman J.M., Adams M.J. Localization of fungal components in the Pea-Fusarium interaction detected immunochemically with anti-chitosan and anti-fungal cell wall antisera// Plant Physiology. 1981. - V.67. -P. 170-175.

13. Choi J. J., Klosterman S.J., Hadwiger L.A. A Comparison of the effects of DNA-damaging agents and biotic elicitors on the induction of plant defense genes, nuclear distortion, and cell death // Plant Physiol. 2001. - V.l25. - P.752-762.

14. Schwochau M.E., Hadwiger L.A. Regulation of gene expression by actinomycin D and other compounds which change the conformation of DNA // Arch. Biochem. Biophys. 1969. -V.134. - P.34-41.

15. Hadwiger L.A., Schwochau M.E. Specificity of DNA intercalating compounds in the control of phenylalanine ammonia lyase and pisatin levels // Plant Physiol. 1971. - V.47. - P.346-351.

16. Parsons M.A., Hadwiger L.A. Photoactivated psoralens elicit defense genes and phytoalexin production in the pea plant // Photochem. Photobiol. -1998.- V.67. -P.438-445.

17. Granado J., Felix G., Boiler T. Perception of fungal sterols in plants (subnanomolar concentrations of ergosterol elicit extracellular alkalinization in tomato cells) // Plant Physiol. 1995. - V.l07. - №2. - P.485-490.

18. Lapous D., Mathieu Y., Guern J., Lauriere C. Increase of defense genetranscripts by cytoplasmic acidification in tobacco cell suspension // Planta. -1998. V.205. - P.452-458.

19. Young D.H., Kauss H. Release of calcium from suspension-cultured Glycine max cells by chitosan, other polycations, and polyamines in relation toф effects on membrane permeability // Plant Physiol. 1983. V.73. - P.698-702.

20. Lecourieux D., Mazars C., Pauly N., Ranjeva R., Pugin A. Analysis and effects of cytosolic free calcium increases in response to elicitors in Nicotiana plumbaginifolia cells // Plant Cell. 2002. - V.14. - P.2627-2641.

21. Dolmetsch R.E., Lewis R.S., Goodnow C.C., Healy J.I. Differential1. О Aactivation of transcription factors induced by Ca response amplitude and duration //Nature. 1997. - V.386. - P.855-858.

22. Yang Т., Poovaiah B.W. A calmodulin-binding/CGCG box DNA-binding protein family involved in multiple signaling pathways in plants // J. Biol. Chem. 2002. V.277. - P.45049-45058.

23. Mehdy M.C. Active oxygen species in plant defense against pathogens // Plant Physiol. 1994. - V.105. - № 2. - P.467-472.

24. Degousee N., Triantaphylides C., Montillet J.L. Involvement ofoxidative processes in the signaling mechanisms leading to the activation of glyceollin synthesis in soybean // Plant Physiol. 1994. - V. 10. - P.945-952.

25. Lamb C., Dixon R.A. The oxidative burst in plant disease resistance //

26. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. - V.48. - P.251-275.

27. Zhao J., Hu Q., Guo Y.Q., Zhu W.H. Elicitor-induced indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus cell cultures is related to Ca2+-influx and the oxidative burst//Plant Sci. 2001. - V.l 61. - P.423-431.

28. Thoma I., Loeffler c., Sinha A.K., Gupta M., Krischke M., Steffan B. Cyclopentenone isoprostanes induced by reactive oxygen species trigger defense gene activation and phytoalexin accumulation in plants // Plant J. 2000. - V.34. -P.363-375.

29. Lin W., Ни X., Zhang W., Rogers W.J., Cai W. Hydrogen peroxide mediates defence responses induced by chitosans of different molecular weights in rice // J. Plant Physiol. 2005. - V.162. - №8. - P.937-944.

30. Ванин А.Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований // Биохимия. 1998. - Т.63. - №7. - С.867-869.

31. Ванин А.Ф. Оксид азота: регуляция клеточного метаболизма без ^ участия системы клеточных рецепторов // Биофизика. 2001. - Т.46. - №4.1. С.631-641.

32. Hausladen A., Stamler J.S. Nitric oxide in plant immunity // PNAS. -1998. V.95. - P.10345-10347.

33. Delledone M., Xia Y., Dixon R.A., Lamb C. Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance //Nature. 1998. - V.394. - №6. - P.585-588.

34. Durner J., Wendehenne D., Klessig D.F. Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP, and cyclic ADP-ribose // PNAS. 1998. -V.95. №17. - P.10328-10333.

35. Ильинская Л.И., Озерецковская О.Л. Продукты липоксигеназного окисления жирных кислот как сигнальные молекулы в индуцированнии устойчивости растений // Прикл. Биохим. Микробиол. 1998. - Т.34. - №5. -С.467-479.

36. Obara N., Hasegawa М., Kodama О. Induced volatiles in elicitor-treated and rice blast fungus-inoculated rice leaves // Biosci. Biotechnol. Biochem. -2002. 66. - №12. - 2549-2559.

37. Дячок Ю.В., Дмитриев А.П., Гродзинский Д.М. Роль Са2+ как вторичного мессенджера в индукции синтеза фитоалексинов и каллозы в культуре клеток Allium сера L. // Физиология растений. 1997. - Т.44. - №3. -С. 385-391.

38. Kendra D.F., Hadwiger L.A. Characterisation of the smallest chitosan oligomer that is maximally antifungal to Fusarium solani and elicits pisatin formation in Pisum sativum II Experimental Mycology. 1984. - V.8. - P.276-281.

39. Khan T.A., Peh K.K., Ch'ng H.S. / Reporting degree of deacetylation values of chitosan: the influence of analytical methods // J. Pharm. Pharm. Sci. -2002. V.5. - №3. - P.205-212.

40. Roby D., Gadelle A., Toppan A. Chitin oligosaccharides as elicitors of chitinase activity in melon plants // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. -V.143. - №3. - P.885-892.

41. Ghaouth A.E., Arul J., Grenier J., Benhamou N., Asselin A., Belanger R. Effect of chitosan on cucumber plants: supression of Pythium aphanidermatum and induction of defense reactions // Phytopathology. 1994. - V.84. - №3. -P.313-320.

42. Mauch F., Hadwiger L.A., Boiler T. Antifungal hydrolases in pea tissue // Plant Physiol. 1988. - V.87. - P.325-333.

43. Keen N.T., Yoshikawa М. p-l,3-endoglucanase from soybean releases elicitor-active carbohydrates from fungus cell walls // Plant Physiol. 1983. -V.71. P.460-465.

44. Wan J., Zhang S., Stacey G. Activation of a mitogen-activated protein kinase pathway in Arabidopsis by chitin // Molecular Plant Pathology. 2004. -V.5. - №2. P.125-135.

45. ESTs // Plant Mol. Biol. 2003. - V.52. - №3. -P.537-551.

46. Bhaskara Reddy M.V., Arul J., Angers P., Couture L. Chitosan treatment of wheat seeds induces resistance to Fusarium graminearum and improves seed quality // J. Agric. Food Chem. 1999. - V.47. - №3. - P.1208-1216.

47. Benhamou N., Theriault G. Treatment with chitosan enhances resistance of tomato plants to the crown and root rot pathogen Fusarium oxysporum f. sp.

48. Radicis-lycopersici // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1992. - V.41. - P.33-52.

49. US Patent 4964894 «Plant growth regulators derived from chitin».

50. US Patent 5733851 «Formulation and procedure to increase resistance of plants to pathogenic agents and environmental stress».

51. US Patent 5374627 «Methods for protecting vegetables, turfgrass, rice and fruit trees from fungi and bacteria».

52. US Patent 6524998 «Biological compositions and methods for enhancing plant growth and health and producing disease-suppressive plants».

53. Pospieszny H., Atabekov J.G. Effect of chitosan on the hypersensitive reaction of bean to alfalfa mosaic virus // Plant Science. 1989. - V.62. - P.29-31.

54. Pospieszny H., Struszczyk H., Chirkov S.N., Atabekov J.G. New application of chitosan in agriculture // Chitin world / Eds. Karnicki Z.S., Brzaski M.M., Bykovski P.J., Wojtasz-Pajak A. Gdynya: Wirshafitsverlag NW. 1995, P.246-254.

55. Pospieszny H., Struszczyk H., Cajza M. Biological activity of Aspergillus-degraded chitosan // Chitin Enzymology / Ed. R.A.A.Muzzarelli. Atec Edizioni, 1996. V.2. - P. 385-389.

56. Pospieszny H. Inhibition of tobacco mosaic virus (TMV) infection by chitosan // Phytopath. Polonica. 1995. - V.22. - №10. - P.69-74.

57. Pospieszny H., Chirkov S., Atabekov J. Induction of antiviral resistance in plants by chitosan // Plant Science. 1991. V.79. - P.63-68.

58. Surguchova N.A., Varitsev Yu.A., Chirkov S.N. The inhibition of systemic viral infections in potato and tomato plants by chitosan treatment // J. Russ. Phytopathol. Soc. 2000. - V.l. - P.59-62.

59. Chirkov S.N., Surguchova N., Atabekov J.G. Chitosan inhibits systemic infections caused by DNA-containing plant viruses // Arch. Phytopath. Pflanz. -1994.-V.29.-P.21-24.

60. Pospieszny H. Antiviroid activity of chitosan // Crop Protection. 1997. V.16. - №2. - P.105-106.

61. Чирков C.H. Противовирусная активность хитозана // Прикл. Биохим. Микробиол. 2002. - Т.38. - №1. - С.5-13.

62. Чирков C.H., Сургучёва H.A., Атабеков И.Г. Стимуляция синтеза клеточных белков и ингибирование вирусной инфекции хитозаном в изолированных протопластах табака // Доклады Академии Наук. 1995. -Т.341. - №6. - С.836-838.

63. Schiebel W., Haas В., Marinkovic S., Klanner A., Sanger H.L. RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. I. Purification and physical properties // J. Biol. Chem. 1993. - V.268. - №16. - P. 11851-11857.

64. Schiebel W., Haas В., Marinkovic S., Klanner A., Sanger H.L. RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. II. Catalytic in vitro properties. // J. Biol. Chem. 1993. - V.268. - №16. - P.l 1858-11867.

65. Schiebel W., Pelissier Т., Riedel L., Thalmeir S., Schiebel R., Kempe D., Lottspeich F., Sanger H.L., Wassenegger M. Isolation of an RNA-directed RNA polymerase-specific cDNA clone from tomato // Plant Cell. 1998. - V.l0. - №12. - P.2087-2101.

66. Xie Z., Fan В., Chen C., Chen Z. An important role of an inducible RNA-dependent RNA polymerase in plant antiviral defense // PNAS. 2001. -V.98. - №11. - P.6516-6521.

67. Sathiyabama M., Balasubramanian R. Chitosan induced resistance components in Arachis hypogaea against leaf rust caused by Puccinia arachidis Speg // Crop Protection. 1998. - V.l7. - №4. - P.307-313.

68. Dalmay Т., Hamilton A., Rudd S., Angell S., Baulcombe D.C. An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required forposttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus // 2000.-V.101.-P.543-553.

69. Kuchitsu K., Kikuyama M., Shibuya N. N-acetylchitooligosaccharides, biotic elicitor for phytoalexin production, induce transien membrane depolarization in suspension-cultured rice cells // Protoplasma. 1993. V.174. -P.79-81.

70. Kukiyama M., Kuchitsu K., Shibuya N. Membrane depolarization induced by N-acetylchitooligosaccharide elicitor in suspension-cultured rice cells // Plant Cell Physiol. 1997. - V.38. №8. - P.902-909.

71. Felix G., Baureithel K., Boiler T. Desensitization of the perception system for chitin fragments in tomato cells // Plant Physiol. 1998. - V.117. -№2.- P.643-650.

72. Khan W., Prithiviraj В., Smith D.L. Chitosan and chitin oligomers increase phenylalanine ammonia-lyase and tyrosine ammonia-lyase activities in soybean leaves // J. Plant Physiol. 2003. - 160. - №8. - P.859-863.

73. Kauss H., Jeblick W., Domard A. The degrees of polymerization and N-acetylation of chitosan determine its ability to elicit callose formation insuspension cells and protoplast of Catharanthus roseus II Planta. 1989. - V.178.- P.385-392.

74. Чирков C.H., Сургучёва H.A., Гамзазаде А.И., Поспешны Г. Сравнительная эффективность производных хитозана при подавлении вирусной инфекции растений // Доклады Академии Наук. 1998. - Т.360. -№2. - С.271-273.

75. Struszczyk М.Н., Pospieszny Н., Schanzenbach D., Peter M.G. Progress on chemistry and application of chitin and its derivatives. // Ed. Struszchyk H. Lodz: Polish Chitin Society. 1998. - V.5. - P.71-77.

76. Hadwiger L.A., Ogawa Т., Kuyama H. Chitosan polymer sizes effective in inducing phytoalexin accumulation and fungal suppression are verified with synthesized oligomers // Mol. Plant Microbe Interact. 1994. - V.7. - №4. P.531-533.

77. Чирков C.H. Противовирусные свойства хитозана // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М.: Наука, 2002. - С.327-338.

78. Kim H.J., Chen F., Wang X., Rajapakse N.C. Effect of chitosan on the biological properties of sweet basil {Ocimum basilicum L.) // J. Agric. Food Chem. 2005. - V.53. - №9. - P.3696-3701.

79. Тагер A A // Физико-химия полимеров. M.: Химия, 1968. - 536с.

80. Koping-Hoggard М., Mel'nikova Y.S., Varum К.М., Lindman В., Artursson P. Relationship between the physical shape and the efficiency of oligomeric chitosan as a gene delivery system in vitro and in vivo II J. Gene Med.- 2003. V.5. - №2. - P.130-141.

81. Ильина A.B., Варламов В.П. Влияние степени ацетилирования на ферментативный гидролиз хитозана препаратом целловиридин Г20х // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т.39. - №3. - С.237-277.

82. Sashiwa Н., Saimoto Н., Shigemasa Y., Ogawa R., Tokura S. Distribution of the acetamide group in partially deacetylated chitins // Carb. Polymers. 1991. - V.l6. - P.291-296.

83. Il'ina A.V., Tatarinova N.Yu., Varlamov V.P. The preparation of low-molecular-weight chitosan using chitinolytic complex from Streptomyces kurssanovii // Process Biochemistry. 1999. - V.34. - P.875-878.

84. Zhang H., Du Y., Yu X., Mitsutomi M., Aiba S. Preparation of chitooligosaccharides from chitosan by a complex enzyme // Carbohydrate Research. 1999. - V.320. - P.257-260.

85. Lin H., Wang H., Xue C., Ye M. Preparation of chitosan oligomers by immobilized papain // Enzyme and Microbial Technology. 2002. - V.31. -P.588-592.

86. Ikeda I., Sugano M., Yoshida K., Swaki K., Iwaamoto Y., Hatano K. Effects of chitosan hydrolyzates on lipid absorption and on serum and liver lipid concentration in rats // J. Agric. Food Chem. 1993. - V.41. - № 3. - P.431-435.

87. Wang W., Bo S., Li S., Qin W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degree of deacetylation // Int. J. Biol. Macromol. 1991. - V.13. - №5. - P.281-285.

88. Твердохлебова И.И. Конформация макромолекул (вискозиметрический метод оценки). М.: Химия, 1981. - 281с.

89. Bell А.А., Hubbard J.C., Davis R.M., Subbarao K.V., Liu L. Effects ofchitin and chitosan on the incidence and severity of fusarium yellows of celery // Plant Dis. 1998. - V.82. - №3. - P.322-328.

90. Воловик A.C., Глёз B.M., Замотаев А.И., Зейрук В.Н., Литун Б.П. // Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков. М.: Агропромиздат, 1989.-205с.

91. ГОСТ 11856-66 «Картофель семенной, отбор образцов и методы определения посевных качеств».

92. ГОСТ 7194-69 «Картофель свежий, отбор пробы и методы определения качества».

93. Karasev A.V., Chirkov S.N., Kaftanova A.S., Miroshnichenko N.A., Surgucheva N.A., Fedotina V.L. // Intervirology. 1989. -V.30. - P.285-293.

94. Aiba S. Preparation of N-acetylchitooligosaccharides by hydrolysis of chitosan with chitinase followed by N-acetylation. // Carbohydr. Res. 1994. -V.265. - №2. - P.323-328.

95. Il'ina A.V., Tikhonov V.E., Albulov A.I., Varlamov V.P. Enzymic preparation of acid-free-water-soluble chitosan // Process Biochemistry. 2000. -V.35. P.563-568.

96. Гамзазаде А.И. Структурная неоднородность как фактор изменчивости свойств хитина и хитозана // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М.: Наука, 2002. - С.112-118.

97. Ding S.W., Li Н., Lu R., Li F., Li W.X. RNA silencing: a conserved antiviral immunity of plants and animals // Virus Res. 2004. - V.102. - №1. -P.109-115.