Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунологическая реактивность, иммунодиагностика и иммунопрофилактика при гельминтозах животных

ВАК РФ 03.00.20, Гельминтология

Автореферат диссертации по теме "Иммунологическая реактивность, иммунодиагностика и иммунопрофилактика при гельминтозах животных"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕЛЬМИНТОЛОГИИ имени К. И. СКРЯБИНА

Р Г Б ОД

На правах рукописи

2 Ц ОКТ

БЕРЕЖНО Вера Кузьминична

ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ РЕАКТИВНОСТЬ, ИММУНОДИАГНОСТИКА И ИММУНОПРОФИЛАКТИКА ПРИ ГЕЛЬМИНТОЗАХ ЖИВОТНЫХ

(Теоретические основы и экспериментальные исследования)

Специальность 03.00.20 — гельминтология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 1994

Рабога выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К. И. Скрябина.

доктор биологических наук;, профессор И. И. БЕНЕДИКТОВ, доктор биологических наук, академик Г. А. ЕРМОЛИН, доктор медицинских наук М. В. ДАЛИН.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я- Р. Коваленко.

на заседании специализированного совета Д-020.04.01 при Всероссийском научно^сследовательском институте гельминтологии имени К. И. Скрябина (ВИГИС).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС.

Официальные оппоненты:

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор ветеринарных наук

С. В. БЕРЕЗКИНА

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. В настоящее времн научная литература располагает значительным экспериментальным материалом, характеризующим различные аспекты иммунной реакции хозяина на антигены гельминтов. Тем не менее остаются недостаточно изученными и обоснованными особенности проявления имыуноаллергических реакций в зависимости от характера взаимоотношений, складывающихся между паразитом и хозяином, специфичности системы паразит-хозяин, выяснение которых позволит целенаправленно вести поиск путей повышения иыыунореактивности животных при тех или иных гельмиктозах, созданию иммунопроуллактических и иммунодиагностических препаратов при этих заболеваниях.

Успех оорьоы с гельминтозаыи во многом определяется и зависит от научной обоснованности комплекса мероприятий, осуцествление которых невозможно без знания разных стороны взаимоотношений в системе паразит-хозяин, что требует конкретных данных иммунологии. Очень слаоо изученными остаются вопросы местного иммунитета, который спосооен автономно, без включения общего системного иммунитета, распознавать и нейтрализовать возможные нарушения гомеостаза. Такой тип иммунной реакции вызывают в основном не мигрирующие гельминты, локализующиеся в желудочно-кишечном тракте, представителем которых являются геыонхи.

Интересным с иммунологической точки зрения является феномен естественного самоосвобождения "ее1£-сиге" от гельминтов, впервые зарегистрированный и описанный в 1328 г. Б1;о11 при геыонхозе овец. До настоящего вреиени остаются недостаточно изученными и обоснованными■иммунологические феномены этого явления, не выясненными особенности проявления его в зависимости от сроков инвазии, реинвазии, суперинвазии, возраста яивогных и других оощебиологиче-ских факторов. Решение этих научных вопросов треоовало проведение исследований в условиях эксперимента на агельминтных животных, что позволяет глубже раскрыть сущность взаимоотношений в системе пара-зиг-хозяия. Характер иммунологических реакций, возникающих при заражении гельминтами, непосредственно связан с их биологией, степенью адаптации, контактом с ииыунокоыпетентными оргаиаин хозяина, обеспечивающими проявление феноменов клеточного и гуморального иммунитета. Продуктом последнего является синтез специфических антител, относящихся к различным классам иммуноглобулинов, выявление которых составляет основу почти всех известных иммунологических и аллергические

- л

диагностических тестов при гельминтозах.

Применение современных иммунологических методов исследования позволяет проследить за динамикой развития специфических иммунных механизмов и на основании этого вести целенаправленный поиск иммун профилактических и иащнодиагыостических средств борьбы с гельминтами, искать источники иммуногенного материала среди непатогенных для с.-х. кивотных представителей растительного и животного пира, не представляющих опасности в эшзоогологическом плане, легко доступных для получения и накопления в большом количестве на искусственных питательных средах. Все это определяет необходимость изучения различных аспектов иммунологии при гельминтозах, включая и прикладные исследования такие как иммунодиагностика и иммунопрофилактика , познание закономерностей формирования иммуноаллергических реакций, профилактика гельминтозов гетерологичным иммуногенным материалом, являющихся основой разработки комплекса лечебно-профилак тических мероприятий при гельминтозах.

Цели и задачи исследования. Цель: а) Изучить в сравнительном аспекте в эксперименте особенности проявления иммуноаллергической реактивности животных в разных паразито-хозяинных системах на примере гемонхоза, аскаридоза и трихинеллеза, б) На основании результатов собственных исследований и обобщения литературных данных оха рактеризовать и теоретически обосновать перспективность иммунопрофилактики гельминтозов (на примере диктиокаулеза и аскаридоза) ге-терологичными иммуногенами свободноживущих, растительных нематод и паразитов насекомых, в) Разработать иммуноферыентный метод диагностики тенуикольного цистицеркоза.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следу щие задачи:

- изучить динамику гуморального иммунного ответа овец при ген хозе в условиях эксперимента после однократного эарашения, реинваз суперинвазии и многократного заражения;

- изучить феномены гуморального иммунного ответа в сычуге (ие сто обитания паразита) инвазировалшх гемонхами овец в процессе инвазии и при суперинвазии;

- выяснить особенности проявления иммуноаллергической реактм ности овец при экспериментальном гемонхозе в зависимости от сроког супериывазирования и возраста животных; уточнить феномены иммунног ответа, взаимосвязанные с явлением "самоосвобождения";

- провести сравнительное изучение некоторых аспектов клеточнс

и гуморального иммунного ответа при экспериментальном ларвальном аскаридозе и трихинеллезе в разных системах паразит-хозяин;

- выявить закономерности иммунного ответа в зависимости от хо-зяино-паразитньи взаимоотношений и дать теоретическое обоснование использования гетерологичных иммуногенов из непатогенных для с.-х. животных свободноживущих, растительных нематод и паразитов насекомых для иммунопрофилактики гельминтозов;

- разраоогать метод культивирования и стерилизации свободножи-вущих нематод Shabditis axei, изучить их антигенные свойства;

- изучить нммуногенные свойства свободнокивущих и растительных нематод и паразитов насекомых при экспериментальном аскаридозе и диктиокаулезе;

- провести иимунохиаический анализ и оценить диагностическую Э(рфективность антигенов Taenia hydatigena и Cysticercus tenui'-gollis;

- выделить наиболее перспективный диагностический антиген паразита и разраоогать гест-систему на основе мммуноферментной реакции для диагностики тенуикольного цистицеркоза у свиней.

Научная новизна и практическая ценность работы.

- Впервые дано теоретическое оооснование нового направления в гельминтологии - использования непатогенного для с.-х. животных иммуногенного биомагериала для иммунопрофилактики аскаридиза и дик-гиокаулеза. Впервые разраоотана методика культивирования и массового выделения свободноживущих нематод Ehabditis axei в лабораторных условиях на искусственных питательных средах.

- Впервые в мировой практике использованы в качестве вакцинного материала при экспериментальном аскаридозе и диктиокаулезе иммуногены растительных нематод Aphelenchus avenae и Ditylenchus destructor и паразита насекомых Ueoaplectana glaseri и установлена их эффективность. Способ изготовления аротивогельминтозной вакцины из растительных нематод защитен авторским свидетельством (te 474311).

- Впервые в условиях эксперимента воспроизведен феномен "само-' освобондения" овец от гемонхоз и проведено изучение иамуноаллерги-ческих изменений, происходящих в организме инвазированных животных при однократном заражении и при разных сроках повторного заражения.

- Установлены сроки появления в кровотоке и в слизистой сычуг;', инвазированных гемонхами овец специфических антител и их принадлзк ность к различным классам иммуноглобулинов.

- Определены особенности проявления иммуноадлергической реактивности овец при экспериментальной гемонхозе в зависимости от возраста «ивотных, сроков суперинвазироваяия и феномены иммунного ответа, связанные с явлением самоосвобождения.

- Разработаны условия постановки иымуноаллергических тестов для изучения реактивности животных к заражении гельминтами: реакции иымунодиффузии, имму'ноэлектрофореза, непрямая реакция гемагглю-тинации с эритроцитарныы диагностикумом длительного срока действия, реакции розеткоооразования,'реакция непрямой дегрануляции тучных клеток, пассивной ко&ной анафилаксии, иьшунофернетная реакция.

- Впервые в сравнительном аспекте представлены закономерности иммунного ответа в зависимости от характера хозяино-паразитных взаимоотношений, складывающихся в разных системах, показана взаимосвязь с жизненным циклом паразитов, зависимость от специфичности системы паразит-хозяин.

- Впервые на модели тенуикольного цистицеркоза у свиней изучена динамика антитологенеза при этой инвазии и оценены диагностические качества 4 типов антигенов паразита (стробилы T.hydatigena оболочки, жидкости тенуикольного пузыря и протосколексов паразита). Проведена иммунохимическая характеристика антигенов T.hydatigena

и Q.tonuicollis, изучен качественный и количественный аминокислотный состав экстрактов личиночной формы паразита, выделенных от двух хозяев (овцы и свиньи).

- Установлено с помощью гипершшунных сывороток близкое антигенное родство T.hydatigena с другими видами тениид: T.ovis

о vis, Т.оvia fcrabbei, T.parenchimatosa, Echinococcus granulosus и отсутствие такового родства с Д.зшш. Показано, что наилучшие диагностические качества имеет антиген протосколексов паразита, который содержит минимальный уровень неспеци^ических перекрестно реагирующих компонентов, обладает хорошими сорбционными свойствами на полистироле и может использоваться в диагностических исследованиях для оценки эпизоотической ситуации.

Проведенные динамические исследования некоторых аспектов иммунного ответа в разных хозяино-паразитных системах и сущности феномена самоосвобождения позволяют выявить закономерности в проявлен] иммуноаллергических реакций в зависимости от взаимоотношений, складывающихся между партнерами системы, взаимосвязь иммунных процессов ч реактивностью хозяина, с жизненным циклом паразита и специфичностью системы паразит-хозяин, что имеет научно-практическое значение i;j.h разработке способов иымунопро^илач1'»1"'« гельминтозов,открывает

возможности управления природным иммунным явлением с помощью стимуляторов местного иммунитета.

- Экспериментально доказана эффективность и перспективность вового направления в иммунопрофилактике гельминтозов с использованием непатогенных для сельскохозяйственных животных свободно-живущих, растительных нематод, не представляющих эпизоотологической опасности, легко доступных для получения в массовых количествах в лабораторных условиях на питательных средах, содержащих идентичные с паразитами с.-х. животных иммуногеии, обеспечивающие защитный эффект.

- Разработанный иимуноферыентный метод диагностики цистицер-коза тенуикольного свиней рекомендуем использовать как для дифференциального диагноза других гельминтозов (эхинококкоз,, трихинеллез, аскаридоз и др.), так и для проведения серозпизоотических исследований.

Полученные материалы по иммуноаллергической реактивности в разных хозяино-паразитных системах, по явлению "самоосвобождения", иммунопрофилактике и иммунодиагностике рекомендуем использовать в лекционных курсах по паразитологии при характеристике иммунитета при гельминтозах.

Научно-практические аспекты работы суммированы в статьях различных изданий. Но материалам диссертации опубликованы ^ методические рекомендации по проведению имиуаоаллергических реакций яри гельминтозах ("Методические рекомендации по проведению исследований в гельминтологии", П., ВАСХНИЛ, 1983 г.), '"Методические рекомендации по проведению исследований в фигогельминтологии", >1., ВАСХНИД, 1988 г.). Материалы работы доложены л положительно оценены на Ученых советах и научных конференциях ВИГИС по законченным темам (1976-1985 гг.); 3-х Всесоюзных-конференциях гельминтологов, на 1У интернациональном симпозиуме, ЧСФР, Высокие Татры, 1982 г., на 1-й научной конвенции по проблемам ветеринарной иммунологии, Ы., 1985г. 5-Я Закавказской конференции по паразитологии, Ереван, 1987; на 6-й научной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных, г.Киров, 1992 г.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Особенности проявления иммуноаллергической реактивности у овец при экспериментальном гемонхозе, взаимосвязь с феноменом "сами освобождения" в зависимости от сроков суперинвазии и возраста живо них.

2. Сравнительная оценка иммуноаллергической реактивное

различных системах паразит-хозяин (овца - Saemonchus contortus; морская свинка, кролик, свинья - Asearla suumj мышь, морская свинка, кролик, свинья - Trichiaella spiralis).

3. Теоретическое обоснование целесообразности использования гетерологичного антигенного материала из свободноживущих, растительных нематод и паразитов насекомых для иммунопрофилактики геньминто-зов.

4. Разработка методов культивирования и стерилизации свободно-живущих нематод Etmbditis axel.

5. Оценка иммуногенной эффективности свободыокивущих почвенных нематод axel, фитонематод ¿..avenae, D.destructor и паразита насекомых y.glaseri против аскаридоза и дикгиокаулеза в эксперименте.

6. Сравнительный имыунохимический анализ антигенов laenia bydatigena.

7. Оценка диагностической эффективности антигенов T.hydatlgena и Q.tenuicollis ПрИ экспериментальной и естественной инвазии свиней тенуикольными цистицерками.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 474 стр. машинописного текста (основной текст изложен на 419 стр.) и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 44 рисунками и 36 таблицами. Список литературы включает 608 источников, из них 169 отечественных и ¥39 зарубежных авторов.

I. ИШШОРЕАКТИВНОСТЬ ЖИВОТНЫХ ПРИ ГЕЛЬМИЙТОЗАХ,ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИММУНОДИАГНОСТИКИ И ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ ГЕЛЬШНТОЗОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Литературный обзор включает 5 разделов, посвященных вопросам, антигенного строения гельминтов, их функциональной активности, гуморально-клеточным механизмам иммунной реакции, при гельминтозах, иммунопрофилактике гелъминтозов гетерологичными иммуногенами, диагностической эффективности антигенов гельминтов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Диссертационная работа состоит из 3-х частей, каждая из которых ькльчает материалы и методы, результаты, их обсуждения и заключение.

II. ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ ИММУНОАЛЛЕРГИ ЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ К ГЕЛЬИТНТАМ В РАЗЛИЧНЫХ СИСТЕМАХ ПАРАЗИТ-ХОЗЯИН

2.1. Материалы и методы Животные: мыши - 619; крысы-305; морские свинки - 619;кролики -71; овцы - 144; свиньи - 21.

Инвазионный мате£иал_: личинки гемонхов,яйца аскарид,личинки трихи -нслл.

Антигены : экстракты из половозрелых и личиночных форм свиной аскариды, гемонхов и трихинелл.

Сыво£отки: гипериммунные сыворотки к антигенам аскарид и трихинелл; иммунные сыворотки в динамике аскаридоза, трихинеллеза и гемонхоза. Экстракт слизистой сычуга овец,зараженных гемонхами-источник проти-вопаразитарных местных антител.

2.1.1. Получение инвазионного материала,антигенов-экстрактов, гипериммунных и иммунных сывороток

Инвазионную культуру H.contortus готовили культивированием личинок гемонхов в фекалиях овец при комнатной температуре в течение 7 дней,поддерживая их в увлажненном состоянии. Яйца аскарид культивировали до инвазионной стадии по общепринятой методике в 0,5^-ном растворе соляной кислоты.Инвазионные личинки трихинелл получали перевариванием фарша из тушек зараженных белых крыс (Владимирова,1965).

Методика приготовления антигенов-экстрактов включала два способа,которые отличались условиями гомогенизации и экстрагирования белков.При 1-ом способе подготовленный гельминтологический материал гомогенизировали в электрическом гомогенизаторе при 2500 otí/мин в течение 15 мин,белки жстрагировали при 4° двое суток в фосфатном буфере рН 7,2-7,4.При втором способе- подготовленный материал разбавляли фосфатным буфером в соотношении 1:4 и озвучивали 10 мин на ультразвуковом дезинтеграторе MSE - 100 при амплитуде 8 мкм и мощности генератора 60 кгц.Экстрагирование белков при 4°в течение ночи.

Антиген из личинок аскарид 2-й стадии развития готовили по методу Boroskova et al. (1974).

Получение гипериммунных сывороток против экстрактов исследуемых видов паразитов осуществляли гипериммунизацией кроликов -самцов,массой 2,5-3 кг (Бережко,Ю70).

2.1.2. Методы оценки гуморального иммунного ответа Условия проведения реакции иммунодиффузии (РлД) и иммуноэдектэгг

фореза (ИЭ§) для выявления противопаразитарных антител.Лля оценка гуморального иммунного ответа использовши РИЛ и mt.pewMh "i< л г ния которых пои каждом гельминтозе устанавливали •э».спвримч«-мль„г

Минимальная концентрация антигенов исследуемых гельминтов в РИД и ИЭФ в наших условиях составила соответственно 0,8-1 и 1-2 мг/мл (белка).

Оптимальные режимы проведения непрямой реакции гемагглютинации (НРГА). НРГА ставили по методу Boyden (1951) с разработанными нами эритроцитарными диагностикумами длительного срока действия к гемон-хам,аскаридам и трихинеллам.Рормалинизацию эритроцитов проводили по методу Crizmas (I960) в модификации Леви (1962).Условия танизации и сенсибилизации эритроцитов устанавливали экспериментально.Концентрация антигенов для сенсибилизации эритроцитов - 40-45 мкг белка/мл.

Использование иммуноферментной реакции (ИФР) для оценки уровня специфических антител при гельминтозах. Ш? ставили по стандартной методике Voller et' al..(1974) в модификации применительно к нашим условиям и объектам-:(раздел 6.3.).

2.1.3. Методы оценки сенсибилизирующих свойств антигенов гельминтов Отработка режимов проведения непрямого теста на тучных клетках. Динамику циркулирующих реагинов (класс IgE ) изучали непрямой реакцией ?згрануляции тучных клеток (НРДТК) по методик© 'Лшимовой и Зели-ченко (1967) с модификациями применительно к объектам.

Методика пассивного переноса гиперчувствительности осуществлялась с помощью реакций гомологичной пассивной кожной анафилаксии (ПКА) и гетерологичной Прауснитца - Кюстнера (ПК) в модификации Ovary (1958) с экспериментальной отработкой доз антигена и разными разведениями исследуемых сывороток.

Методика-оценки потенцирующего действия гельминтов на реагиновый ответ к непаразитарным антигена м. Моделью наших исследований были Т.spiralis -морская свинка и A.suum- морская свинка (ларвадьная стадия).Провели два опыта при трихинеллезе на морских свинках сенсибилизированных- подкожно яичным альбумином с адъювантом Фрейнда или гидроокисью алюминия (доза 0,2 мг в 0,2 мл физраствора и 0,2 мл адъв-ванта) с последующим заражением части животных на 10-й день после сенсибилизации'личинками трихинелл (доза 500 экз./голову).Кровь для исследования сыворотки в гомологичной РПКА брали еженедельно. Аналогичные эксперименты провели на 80 морских свинках при аскаридозе

2.1.4.. Реакция прилипания перитонеальных клеток к личинкам гельминтов Реакцию ставили по методу Ualvlya et al. (1979) с модификацией ппдучвния перитонеальных клеток морских свинок (Учитель,I97Ü).

2.1.5. Методы изучения иммуноглобулинов и мотивспаразитарных антител

Получение экстракта слизистой сычуга зараненных гемонхами овец -источника прогивопаразигарных местных антител проводили в динамике инвазии по методу Smith. (IS77) в модификации применительно к нашим условиям.

Сывороточные иммуноглобулины и иммуноглобулины слизистой сычуга. Кинетику сывороточных IgM и IgG в динамике аскаридоза, гемонхоза и трихинеллеза изучали гель-фильтрацией с использованием биогеля А-1,5, гель-сефадекса Г-200 и ДЕАЕ-А 50 (Дэвени,Гергей,1976), на колонках К 26/100, с фосфатно-солевым буфером 0,01 М рН 7,2. Спорость протока 28 и 15 мл/час. Чистоту фракций иммуноглобулинов проверяли ЙЭФ. Фракционирование ЭСС проводили при тех see условиях на биогеле А-1,5.

2.1.6. Методы изучения функционального состояния Т- и В- системы иммунитета

Оценку феноменов клеточного иммунитета провели на модели А.su.ua, морская свинка и A.suuSi - свинья. Исследовали селезенку (С),портальный (П), брыжеечный (Б) и средостенный (Ср) лимфоузлы. Суспензию моно-нуклеарных клеток получали по методу Prochazkova (1979). Активность Г-лимфоцитов (Е-розегки) оценивали по методу Stadecker et al.(I973), В-лимфоцитов реакцией комплементарного розеткообразования (ЕАС-розет-ки) по методу Komarek (1979) в нашей модификации, а функциональную активность В-лимфоцитов - реакцией иммунного В-розеткообра£ования с антигеном аскарид (ЕА-розетки) по методу Khoury, Soulaby (1977) с иодификацией связывания антигена с эритроцитами.

2 .2 .Результаты

2.2.1. Сравнительная оценка иммуноаллергической реактивности в различных системах паразит-хозяин (oB4a-H.contortus, морская свинка,кролик,свинья - А.ешицшшь, морская свинка, кролик - Т.spiralis)

2.2.1.1. Реактивность В-системы иммунитета у овец при экспериментальном геыонхозе Динамику иммунного ответа овец при первичном заражении,ре- и су-шринвазии и многократном заражении гемонхами изучили на 41 овце,сводных от гельминтов и содержащихся в условиях, исключающих спонтанно; сражение. Доза заражения во всех опытах составляла 10 тысяч личинок 'емонхов/овцу. Суперинвазирование проводили на 42-й день после перви-;-юго заражения, перед реинваэией овец дегелышнтизировали (36-й дел? [осле первого заранения), а спустя 7 дней (42-й день) повторно эар-j-шли личинками гемонхов.

Динамику иммунного ответа оценивали по уровню гуморальны/ лиги тел

преципитинов,гемагглютининов и реагинов.В результате установили,что при однократном заражении личинками гемонхов антителогенвз у овец ослаблен.Хотя в динамике инвазии у некоторых животных наблюдали индивидуальные различия в сроках появления специфических антител в кр< вотоке,раньше 14-го дня их не выявляли,в основном же положительные иммунореакции регистрировали на 37-42-й день после заражения.Число комплексов АГ-АТ в РИД не превышало одного,а титр гемагглютининов -в пределах 3,25 - 0,25 - 4,0. В эти же сроки,судя по НРДТК,гемонхи проявили слабое аллергенное воздействие на организм зараженных овец Заметные сдвиги в иммуногенезе в сторону усиления произошли у ре- и суперинвазированных овец,что выразилось повышением преципитирующей : гемагглютинирующей активности сывороток всех животных на 7-й день после проведения этих процедур.Причем у отдельных овец,судя по РИД, в антителогенвз включались качественно отличающиеся антигенные комп ненты паразита.Титр сывороточных агглютининов также повышался до 4,25 ± 0,43 - 5,75 ^ 0,25 (р<0,01) и оставался на таком уровне до 20-го дня после повторного заражения.Аналогичную закономерность отм тили при исследовании сывороток ИЭФ.Проявление новой полосы в облас подвижности глобулинов свидетельствует об усилении антителогенеза.Н 20-й день после ре- и суперинвазии отметили ослабление иммунного от вата,что выразилось как уменьшением титра агглютининов,так и менее четким проявлением в РИД полос преципитации. Некоторые сдвиги произ шли и в динамике реагинового ответа,хотя по показателям НРДТК,дейст вие аллергенов гемонхов даже после ре- и суперинвазии оставалось сл бым.Наиболее покзательной была реакция у реинвазироваНных овец,у ко торых наблюдали положительную НРДТК с количеством разрушенных клет в иммунной системе до 23,0 ^ 1,0 #.(р<0,05).

Многократное заражение предусматривало проведение эксперимента мак скмально приближенного к естественным условиям заражения животных. С иммунологической точки зрения эти овцы представляли особый интере поскольку они более объективно отреокали иммунореактивность к этому гельминту.Иммунологические реакции у этих животных после первого ци да заражения били отрицательными и только на 14-19-й день после вто го цикла у некоторых в кровотоке выявили преципитины и гемагглютини в очень низком титре -1:16. В большинстве случаев наблюдали неспеци ческую агглютинацию,что возможно-является следствием повыиекия уров неспецифических иммуноглобулинов.

Таким образом,однократное заражение оказывает на организм слабо антигенное воздействие,что выражается низкой преципитирующей и гема лвтинирующей активностью сывороток зараженных живтных.При многократ ном дробном заражении все иммунологические реакции у овец также был

на уровне слабоположительных или отрицательных.Низкий уровень сывороточных антител-реагинов при гемонхоэе дает основание предположить.что возможно,значительная доля их синтезируется в местах обитания паразита.Исследование динамики местных антител при гемонхозе позволит в некоторой степени определить роль местных факторов иммунитета в защите организма от последующего заражения.

Исходя из этого изучили кинетику сывороточных и местных (в сычуге) иммуноглобулинов и противопаразитарных антител в динамике первичной инвазии и на 7-й, 20-й день после суперинвазии.В результате установили увеличение содержания белка как в первой,так и во второй фракции. По данным ИЭФ эти фракции соответствовали IgM и IgG ,причем различия в четкости проявления линий преципитации в ИЭ-í в зависимости от срока взятия проб с момента заражения отражали изменения в количественном содержании сывороточных иммуноглобулинов.Макроглобулины достигли пика на 20-й день после суперинвазии,превысив контрольные показатели более,чем в 4 раза (91,7 Í 0,28 -мг/ЮО мл против 37,9 -0,53) Аналогичную закономерность отметили при исследовании белковых фракций ЗСС.В зависимости от срока инвазии и суперинвазии в этом материале элюировали 5-6 фракций,уровень белка в которых превысил контрольные показатели в 4 раза на 14-й день после первичного заражения.СледующиГ пик отметили на 7-й день после супериивазии.Преципитирующув активность, по данным ИЭФ,проявили не все фракции ( на 14-й день инвазии-первые три; на 37-й - первая; на 7-й день после суперинвазии - 2-5; на 20-й день - в первых трех).Специфические антитела-преципитины и гемагглвтинины регистрировали в низких титрах.Аналогичный анализ ЗСС и выделенных из него фракций также показал низкую специфическую пре-ципитирующую и гемагглютияирующую активность,однако последнее можно объяснить присутствием в этом материале антител классов IgE и IgA которые не выявляются в РИД и НРГА. И действительно последующими сра внительными исследованиями проб сывороток и ЭСС в РЛКА и НРДТК,основанных на выявлении антител-реагинов,была показана разница в степени проявления этих реакций в зависимости от источника антител.Как прави ло показатели в обоих тестах были несколько выше с антителами ЭСС, причем эта тенденция сохранялась и при анализе фракционированного ма териала.И тем не менее наши результаты показали низкую активность ал лергенов гемонхов,однако,учитывая,что во все сроки исследования пока затели в тестах,основанных на выявлении аллергических антител,были выше с ЭСС,можно заключить о локальном сенсибилизирующем действии паразита и о местном (в слизистой сычуга) синтезе антител-реагинов.

2.2.1.2. Особенности проявления иммуноаллергической

реактивности при экспериментальном гемокхозе и взаимосвязь с феноменом "самоосвобождения"

В зависимости от сроков суперинвазирования. Наши исследования достаточно убедительно показали,что иммунный ответ при гемонхозе характеризуется слабым проявлением системного иммунного ответа,однако независимо от этого у отдельных животных после повторной антигенной стимуляции наблюдали феномен "самоосвобождения",проявление которого зависело от сроков повторного заражения.С учетом этого изучили имму-ноаллергическую реактивность и проявление феномена "самоосвобождения у овец в зависимости от сроков суперинвазирования. Суперинвазию проводили на 5,10,15,35 и 70-й день после первичного заражения.Дозы личинок гемонхов в обоих случаях составляли 10000 экз./овцу.Оценку реактивности овец к заражение гемонхами проводили теми же реакциями.

Результаты этих исследований были убедительным подтверждением наших предыдущих данных о слабой антигенной активности гемонхов,хотя суперинвазирование,проведенное в ранние' сроки (5,10-й день) после пе; вой,несколько активизировало процесс антителогенеза.У овец с отдаленными сроками суперинвазии (35 и 70-я день) иммуноаллергические реакции сильнее проявлялись с 9-20 дня,что сопровождалось повышением пре-ципитирующей и гемагглютинирующей активности сывороток и повышением числа дегранулированных клеток в иммунной системе НРДТК.Тем не менее суперинвазия,наслоившаяся на 70-дневную первичную инвазию,линь у отдельных животных вызывала незначительное повышение реагинов в циркуляции, хотя у большинства из них произошло резкое снижение числа яиц гемонхов,а у отдельных полное освобождение от гемонхов.

Таким образом,суперинвазия повышала в некоторой степени интенсивность иммунных реакций системного и локального типов,однако феномен самоосвобождения наиболее наглядно проявлялся при отдаленных (35,70-й день) сроках суперинвазирования и достаточно высоком уровне первично:

инвазии. „

В зависимости от возраста овец. В опытах на овцах ¿,->,4,о и it-

месячного возраста показали,что в первых трех возрастных группах интенсивность инвазии гемонхами находилась в обратной корреляции со степенью иммуноаллергических реакций.Хотя у ягнят 2-месячного возраста.как после первичной,так и после суперинвазии отсутствовала систе1 нал иммуноаллергическая реактивность к антигенам гемонхов,тем не ме-яее у некоторых животных наблюдали феномен самоосвобождения.Элиминации гемонхов наблюдали также у двух ягнят 3-месячного возраста,у кот' рых отметили слабое проявление иммунных реакций после суперинвазии, '.'первые системную иммуноаллергическую реактивность на первичную инва-

зию проявили ягнята 4-месячного возраста,у которых,однако феномена самоосвобождения после суперинвазии не наблюдали.Аналогично у овец 8- и12- месячного возраста.у которых степень проявления иммуноалЛер-гических реакций была высокой,элиминации гемонхов после суперинвазии не отметили.Гистологические изменения в слизистой сычуга у овец всех возрастных групп при первичном заражении носили адаптационный харак тер,который нарушался после суперинвазии за счет интенсивной многогранной клеточной реакции.

2.2.1.3. Функциональная активность Т- и В.-системи иммунитета при экспериментальном ларвальном аскаридозе в разных системах паразит - хозяин

Кинетика сывороточных иммуноглобулинов ( хкМ , гкб ) и гуморальных специфических антител при экспериментальном ларвальном в аскаридозе Учитывая,что иммукореактивность к гельминтам тесно связана с характе ром взаимоотношений в системе паразит-хозяин,которые,в свою очередь, определяются различиями в биологии возбудителей,провели сравнительно' изучение некоторых аспектов иммунного ответа при аскаридозе и трихинеллезе. Иммунологическую реактивность разных видов животных к заражению аскаридам:-, оценивали на основании изучения феноменов Т- и В-сис-темы иммунитета,сопоставляя полученные данные с хсизненным циклом пар' зита.В кинетике сывороточных иммуноглобулинов при аскаридоз", отметили увеличение их уровня в первые дни инвазии с максимальным подъемом на 15-19-й день,когда вез клеточные реакции находятся в минимальной фазе развития.Пик макроглобулиновой фракции отметили на 15-й день, в последующие сроки уровень их снижался,но оставался выше нормы до 24-го дня инвазии,когда личинок аскарид в организме не было.Увеличе-сывороточного также происходило в первые дни,но более постепенно достигнув максимума на 19-й день.Повторное заражение вызывало повыше ние уровня 1вИ и на 2-3-й день,однако к 10-му дно их концентрация не достигала величин,регистрируемых при первичном заражении,одна ко этот факт свидетельствует о функциональной активности В-системы по вторичному иммунологическому ответу и о наличии при аскаридозе Т-клеток памяти.Ярким проявлением функциональной активности В-системы иммунитета является выработка специфических гуморальных антител. 1 морских свинок я кроликов специфические антитела регистрировали в кровотоке с 5-10 дня,у специфичного хозяина - свиньи антитела -преци питины к антигенам аскарид проявляись на 19-24-й день.гемагглютини-нееколько раньше (9-10-й день).Динамика антителогенеза при этом гел». минтозе свидетельствует о разной реактивности лабораторных кивотши и свиней к этому паразиту,но у всех основннми стимуляторами лиматиг.

ной системы являются антигены личинок 2- и 3-й стадии,а иммунный ответ развивается с общими закономерностями формирования гуморального иммунитета,но в соответствии с жизненным циклом паразита.

Оценка функционального состояния Т- и В-систем иммунитета при экспериментальном аскаридозе.Общую и специфическую репродуктивную активность В-лимфоцитов изучили реакциями комплементарного (ЕАС) и иммунного розвткообразования.(ЕА-розетки).Увеличение популяции В-кле-ток с рецепторами для комплемента наблюдали с 1-го дня после заражения в селезенке,портальном и брыжеечном л/узлах,с 2-3 дня в средосте^ ном л/узле.Процесс активизировался в период миграции личинок и достиг пика во всех органах на 7-12й день инвазии.В последующие сроки наступила понижающая фаза этой популяции клеток до реинвазии (21-й день).Увеличение популяции иммунных В-клеток происходило на 3-й день, максимального уровня эта клеточная популяция достигла в селезенке на на 7-й,а в лимфоузлах (Б, П и Ср) соответственно -на 5-й, 9 и 12-й день инвазии. Реинвазия активизировала функциональную и пролифератив-ную способность В-лимфоцитов. Характерным для Т-системы иммунитета при аскаридозе является также увеличение Т-клеток с первых дней инвазии, однако у специфичного хозяина разница в показателях в сравнении с контролем была статистически недостоверной.Максимального уровня эта клеточная популяция.у последних достигла на 13-й день,затем наступила понижающая фаза активности Т-клеток.Реинвазия приводила к повышению числа Т-лимфоцитов,образующих характерные розетки,но этот процесс был кратковременным и не достигал величин,регистрируемых при первичной инвазии.

2.2.1.4. Сенсибилизирующие свойства аскарид

Динамика развития реагиновой активности в сыворотке зараженных аскаридами животных характеризовалась наличием реагинов в циркуляции •с 5-9-го дня инвазии и максимальном уровне их,по показателям НРДТК, на 12-15-й день у морских свинок и на 25-я - у кроликов и свиней. Реагкновая активность сохранялась до 35-40 дня,повторная антигенная стимуляция вновь активизировала синтез реагинов уже в первые дни. Сенсибилизирующая активность аскарид с выработкой антител-реагинов была подтверддена в РПКА. В этой реакции проявлялось два типа антител, одни из которых сохранялись в гомологичной системе до 6 дней,что доказывает их принадлежность к 1еЕ,а другие- выявляли при коротком латентном периоде. Во всех случаях кинетика реагинового ответа коррелировала с этапами жизненного цикла аскарид.Отдельным экспериментом на морских свинках было показано,что аскариды усиливают реагиновый ответ к непаразитаэным антигенам,например,к яичному альбумину,что может быть причиной иммунодефицитных состояний и других патологических проявлений.

2.2.1.5. Реактивность В-сисгемы иммунитета при экспериментальном трихинеллезе

Динамика гуморального иммунного ответа и сывороточных иммуноглобулинов irm и ipft при экспериментальном трихинеллезе продемонстрировала, что этот паразит является самым интересным с иммунологической точки зрения объектом наших сравнительных исследований.Каждая стадия т.spiralis отличается высокой иммуногенностьс и способна стимулировать сильную системную иммунную реактивность во всех системах паразит-хозяин.В динамике гуморального иммунного ответа отметили процесс накопления специфических антитэл-преципитинов и гемагглютини нов.У отдельных животных преципитины выявляли уже на 7-10-й день с максимумом на 35-я день инвазии. У свиней преципитирупщая активность иммунных сывороток была ниже -преципитины выявляли не ранее 14-21 дня.Аналогичную динамику наблюдали в титре гемагглютининов,которые регистрировали с 7-го дня с последующим повышением и сохранением на высоком уровне до конца наблюдений (210 дней).Супериквазия во всех случаях усиливала иммунный ответ.В начальный период трихинеллеза (7-8 недель) в иммунной сыворотке превалируют макроглобулины,в после дующие вроки повышается уровень IgG .достигающий максимума, яа 117145-й день инвазии.Анализ фракций сыворотки на наличие специфических антител показал,что повышение концентрации иммуноглобулинов при трихинеллезе происходит за счет специфических антител всех классов иммуноглобулинов, включая и реагины.

2.2.1.6. Кинетика аллергенной активности трихинелл

Действие аллергенов трихинелл проявляется с первой недели и со -

провождается выработкой антител -реагинов,что было установлено НРДТК и РГЖА.Реагиновая активность сывороток постепенно повышалась,достигая максимального уровня на 23-35-й день с последующим постепенным снижением к 145-175 дню инвазии.Как и при аскаридозе в РПКА определи ли два типа антител,одни из которых вызывали реакцию при коротком, а другие- при продолжительном (72 час,6 суток) латентном периоде сен сибилизации. Трихинеллы,как и аскариды вызывали потенцирование реаги вого ответа к непаразитарным антигенам.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши экспериментальные результаты и данные литературы подтверждп ют существование при гельминтозах характерных отличительных особенно стей в развитии иммунных реакций для каждой системы паразит-хозяин. Последние проявляются в интенсивности и продолжительности иммунного ответа,в преобладании локальных или системных иммунных механязм;:а С этих позиций наиболее существенные различия отмечены между rtMCf?j -

ми,аскаридами и трихинеллами,различия в биологии которых наложили отпечаток на всю кинетику иммунных процессов.При гемонхозе преобладают локальные иммунные механизмы,которые активизируются метаболитными антигенами личинок гемонхов.Но и в этом случае только при определенной степени инвазии,зависящей от индивидуальной реактивности животных и дозы заражения,в действие могут вступать специфические факторы.Б противном случае активизируются неспецифические факторы резистентности, которые препятствуют созданию в организме хозяина достаточного уровня антигенов паразита-стимуляторов системного ответа.'Именно этим можно объяснить отсутствие иммуноаллергической реактивности системного типа у овец при многократном заражении небольшими дозами личинок гемонхов, хотя у большинства из них отметили изменения в сычуге,свойственные неспецифическому воспалению и обеспечивающие резистентность к реинва-зии,а у некоторых явление "самоосвобождения".Такой механизм реактивности ,по нашему мнению.является доминирующим при спонтанном гемонхозе.Гемонхи проявляют наименьшую антигенность и иммуногенность .поскольку их контакт с организмом хозяина ограничен иммунекомпетентными элементами желудочно-кишечного тракта,следствием которого является преобладание локальной иммунной реакции.Системную иммунореактивность на первичную инвазию проявили 4-месячные ягнята,однако однократное заражение стимулировало кратковременный иммунный ответ с низким уровнем специфических антител,относящихся к 15м , и 1еЕ .Ре- и суперинвазия повышала интенсивность иммунных реакций,сопровождающихся явлением самоосвобождения,причем наиболее наглядно при отдаленных сроках суперинвазии и при достаточно высоком уровне первичной инвазии. На интенсивность иммунореакций,приживаемость гельминтов и феномен "самоосвобождения" существенно влияет возраст животных.Процесс элиминации гемонхов происходил даже у 2- и 3-месячных ягнят,у которых не регистрировали или слабо проявлялась реактивность к антигенам паразита, что н-э исключает существование самостоятельных механизмов,ответственных за самоосвобождение и другие иммунные механизмы,препятствующие поиживаемости гемонхов. При аскаридозе и трихинеллезе в силу различи; в биологии возбудителей этих гельминтозов от гемонхоза.обеспечивающи: им тесный и продолжительный (особенно при трихинеллезе) контакт с им мунекомпетентными органами,развивается более интенсивный иммунный ответ.Однако и при этих-гельминтозах первым барьером на пути внедрившейся инвчзии выступает реакция в кишечнике и в механизме защиты не не лсключается роль неспеци^ичеаких факторов резистентности.Тем не менее высокая антигенность и иммуногенность трихинелл и обособленность их от организма хозяина капсулой обеспечивала,по сравнению с

аскаридами,большую специфичность иммунноаллергических реакций с высоким титром длительно сохраняющихся в кровотоке специфических антител.Судя по нашим экспериментальным данным,действие аллергического компонента у гемонхов также значительно слабее,чем у аскарид и трихинелл, и в большей степени оно проявляется в сычуге,поскольку уровень антител-реагинов у зараженных овец был выше в экстракте слизистой сычуга, чем в циркуляции.Характерным для всех исследуемых гельминтов является то,что в иммунный процесс вовлекаются не все антигены их возбудителей и в адаптированных системах паразит-хозяин иммунный ответ выражен слабее,хотя все клеточные и гуморальные механизмы развиваются в соответствии с жизненным циклом паразита.В иммуногенезе основную роль играют антигены личинок,действие которых при гемонхо-36 направлено в первую очередь на стимуляцию иммунокомпетентных элементов сычуга,включая и антителообразувщие клетки слизистой оболочки, а затем лимфоидных органов,ответственных за системные иммунные реакции; при аскаридозе и трихинеллезе стимуляция лимфоидной системы также осуществляется антигенами личинок,однако довольно сложный миграционный путь последних в организме хозяина обеспечивает более бывтрое попадание их антигенов в иммунокомпетентные органы и соответственно быструю ответную реакцию.В последующем процесс иммуногенеза поддерживается клетками "памяти"..действие которых особенно наглядно проявляется после ре- и суперинваэии животных усилением всех имм^ноаллер-гических реакций.Наши результаты и данные литературы позволяют заключить, что иммунный ответ при гельминтозах носит комплексный характер; причем в зависимости от бчологаи возбудителей и характера складывающихся взаимоотношений в системе хозяин-паразит,степень выраженности иммуноалл ргической реактивности значительно различается.В то же время не исключается независимость проявления эффекторных механизмов, вызывающих элиминацию паразитов из желудочно-кишечного тракта.и других иммунных процессов,подавляющих миграции и приживаемость гельминтов в организме хозяина.

Ш. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДПОСЫЛКИ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ НЕКОТОРЫХ ГЕЛЬ-ШНТ030В ГЕТЕРОЛОГИЧНШИ АНТИГЕНАМИ:ИММУНОГЕННАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ СВОБОДНОЖИВУЩИХ, РАСТИТЕЛЬНЫХ НЕМАТОД И ПАРАЗИТОВ НАСЕКОМЫХ 3.1. Материалы

Свободноживущие почвенные нематоды Khabditis axel; фитонематоды Aphelenchus avenae, Ditylenchus destructor, паразит насекомых Ыео-aplectana glaseri; инвазионные яйца свиной аскариды, инвазионные личинки дикгиокаул овец; белковые экстракты почвенных нематод, афе-ленхов, дитиленхов, неоаллектан, фасциолы обыкновенной и гигантской, свиной аскариды, трихинелл, иониезий и тизаниезий; гипериммунные сыворотки против экстракта почвенной нематоды; иммунные сыворотки от овец с естественной инвазией диктиокаулеза; иммунные сыворотки от Морских свинок, зараженных личинками диктиокаул.

3.2. Методы получения гегерологичного материала для иммунопрофилактических исследований

3.2.1. Методы культивирования и сохранения почвенных свободноживущих нематод Ehabditis axel

Нематоды Eh.axei были выделены из почвы, определены до вида и пересажены на питательную среду (расплавленный агар Дифко 20 г/л дрожжевой воды с добавлением 5 г поваренной соли). Получив определенное количество нематод приступили к изысканию более легко доступных дешевых питательных сред для культивирования и получения большой биомассы нематод. Испытали: сухой питательный агар, агар Эндо, сухой агар с эозин-метиленовым синим, сухой бактоагар Плоскирева, агар на мясо-пептонном бульоне, среду Игла. Культивирование проводили в лабораторных условиях при 18-22°С без соблюдения стерильности.

3.2.2. Получение нематод растений афеленхов, дитиленхов ■ , и паразита насекомых иеоаплектан

Афеленхов культивировали стерильно нэ мицелии гриба Alternaria tenuis, выращенного в матрасных колбах на картофелъно-глюкозном агаре. Неоаплектаны были любезно предоставлены для работы д.б.б, В.И.Таракановым.

3.2.5. Способы бактериологической стерилизации

свободаоживущих почвенных нематод Rh.axei

Стерилизацию нематод проводили в конических колбах из расчета 300 экз./мл в течение 2-х часов при 37° и 24 часа при 26° растворами антибиотиков, в качестве которых испытали пенициллин натриевую соль, стрептомицин сульфат, неомицин сульфат, тетрациклин гидрохлорид, по-Jiiiiii'KvüiK Б сульфат, нистатин и различные сочетания антибиотиков. s.reiiw.i-HOCri нематод проверяли в МП А и МПБ.

3.2.4. Получение инвазионных личинок диктиокаул

Культуру инвазионных личинок диктиокаул готовили по общепринятой методике под тонким слоем воды в чашках Петри при комнатной температуре в течение 12 дней с ежедневной аэрацией и сменой воды через день.

3.2.5. Изучение антигенности свободнспшвущих нематод Иммунохимический анализ нематод проводили в РИД, ИЭФ и реакцией

на яивых личинках (Бессонов, 1966) с использованием гомологичных пре-ципитирующих сывороток, которые получали к антигенам нематод гипериммунизацией кроликов (Бережко, 1970). На весь цикл иммунизации с реим-мунизацией каждому кролику вводили 6,4 мл белка.

3.2.6. Сравнительный электрофоретический и иммунохимический анализ антигенов некоторых видов нематод - паразитов растений, насекомых и сельскохозяйственных животных

Метод диск-электрофореза использовали для характеристики белкового спектра экстрактов D.filarla - паразита овец, A.avenae - нематоды растений и H.glaserl - паразита насекомых. Объем наносимого образца 0,15 мл (300 мкг белка). Электрофорез проводили при силе тока 80-100 1>;А, напряжении 300 в в течение 3 час., в качестве свидетеля электрофоретического разделения белков использовали бромфеноловый синий

3.2.7. Методы изучения иммуногенных свойств свободноживущих

неыатод,фитонематод и паразита насекомых

Исследования при аскаридозе. Оценку иммуногенных свойств свободно-живущих нематод при ларвальном аскаридозе провели на 150 белых мышах и 30 морских свинках. Иммунизирующую дозу нематод в количестве 10 или 20 тыс. экз. в 0,2 мл физраствора вводили животным 2- или 3-кратно подкожно или интраперитонеально с адъювантом Фрейнда или без него с интервалом меаду инъекциями 7,12 дней. Проверочное заражение всех животных в дозе 10 тыс. инвазионных яиц аскариды проводили через 8 или 14 дней после- последней инъекции. Убой и исследование органов осуществляли методом Бермана на 2-3, 4, 7, 9, 11-12-й день после заражения.

Иммуногенные свойства неоаплектан при экспериментальном ларвальном аскаридозе изучили на 80 морских свинках при подкожном и интра-перитонеальном способе их введения животным в месячным интервалом в возрастающих дозах (3,6 и 9 тыс. нематод в 1-ом опыте и 2, 4, 5 тыс нематод с адъювантом Фрейнда подкожно и без адъюванта интраперитонеаг" но. Спустя 4 недели провели лроверочное заражение инвазионными яйцам1., аскариды в дозе 10 тыс. яиц в 0,2 мл воды перорально. Защитный эффег. определяли на основании сравнения количества выделенных личинок аст риды в легких и печени иммунизированных и контрольных мышей.

И.тауннore иные свойства растительной нематоды A.avenae прмлар

зальном аскаридозе изучили на 144 нелинейных и 40 линейных мышах. Иммунизацию проводили 2- и 3-кратно в дозе 20 -50 тыс афеленхов в О02 мл стерильного физраствора подкожно или интраперитонеально с интервалом 7-8 дней.Проверочное заражение иммунизированныхинеиммунизи-рованкых мышей проводили через 8-12 дней после последней инъекции инвазионными яйцами свиной аскариды.Доза заражения подопытных мышей, сроки убоя и исследования органов на наличие личинок паразита аналогично опытам с почвенными нематодами.

Для изучения иммуногенных свойств растительных нематод - дитилен-хов использовали 60 йелых мышей,массой 16-20 г.Иммунизацию проводили подкожно или интраперитонеально 3-кратно в дозе 20 или 50 тыс. нематод,интервал 7-8 дней. Проверочное заражение подопытных мышей осущест вляли через 10 дней инвазионными яйцами аскариды. Доза заражения, сроки исследования органов подопытных мышей,как в предыдущих опытах.

Исследования при экспериментальном диктиокаулезе .Для изучения иммуногенных свойств почвенных нематод при экспериментальном диктиокаулезе провели три опыта на 84 морских свинках и 17 ягнятах„Морских свинок иммунизировали одно- и двукратно с 2-недельным интервалом подкожно в дозе 30 тыс. нематод/животное.Отдельно группу животных иммунизировали подкожно 2-кратно с 2-недельным интервалом экстрактом нематод (доза 0,5 мл - 2 мг белка).Проверочное заражение проъели через 2 и 4 недели после последней инъекции личинками диктиокаул в дозе 1000 экз. на животное.Убой проводили на 2-4,7,14,21 и 28 день после заражения, исследуя в ранние сроки лимфоузлы и легкие животных кояпрессорно и по Берману0 через 21 и 28 дней проводили полное гельминтологическое вскрытие легких.

Опыты на ягнятах провели в экспериментальном хозяйстве,животных вакцинировали внутривенно 2-кратно с 5-6-недельным интервалом 30 и 60 тыс. нематод в 2 мл стерильного физраствора,Проверочное заражение вакцинированных и невакцинированных ягнят провели через 6-7 недель инвазионными личинками диктиокаул в дозе 4000 экз./голову.У бой и исследование органов подопытных ягнят провели через 7 и 35-40 дней после заражения.Кусочки органов животных фиксировали в 10^-ном формалине и жидкости Карнуа для гистологических исследований. Иммуногенность афеленхов и дитиленхов при экспериментальном диктиокаулезе изучили на 50 морских свинках и 26 ягнятах.Морских свинок иммунизировали подкожно 15 и 30 тыс. афеленхов или дитиленхов,через :,8 дней инъекцию нематод повторили удвоив дозы вакцинирующего материала.Проверочное заражение вакцинированных и невакцинированных жи-:>пткы* тротзвлм через 4 недели после последней инъекции личинками здктиокаул с лозе 500 экз./голову.Убой и исследование органов морски

свинок на наличие гельминтов проводили через 24 дня после заражения.

Иммуногенность афеленхов при диктиокаулезе на ягнятах провали так же в экспериментальном, хозяйстве,животных иммунизировали 2-кратно, внутривенно с интервалом 5-6 недель 30 и 50 тыс. нематод в I мл стерильного физраствора.Проверочное заражение вакцинированных и невакци-нированных ягнят провели через 6-7 недель личинками диктиокаул. в дозе 4000 экз./голову,убой и исследование органов на наличие паразитов на 35-40-й день после заражения.

Аналогичные исследования были проведены на ягнятах с использованием в качестве вакцинирующего материала дитиленхов,суспензию которн> в количестве 60 тыс. в I мл физраствора вводили животным внутривеннс 2-кратно с 5-6-недбльным интервалом.Сроки проверочного заражения,доз? личинок диктиокаул и сроки убоя с последующим^иррледованием органов на наличие паразитов осуществляли как и в предыдущем опыте.

3.3. Результаты,

3.3.1. Оценка антигенной'активности и иммуногенной эффективно сти свободноживущих почвенных нематод,фитонематод и паразита насекомых

3.3.1.1. Эффективность различных культуральных сред при

получении биомассы почвенных нематод,оценка способов их стерилизации

Результаты исследований по культивированию,.нематод НЬ.ахе! в лабораторных, условиях показали,что испытанные нами питательные среды неодинаково влияют на их рост и развитие.Как правило,если среда для нематод была благоприятной,то на 4-й день на поверхности отмечали скопление большого количества яиц нематод,а на б-7-й день появлялись личиночные стадии. Процесс активизировался до 12-14 дня.Причем появление Личинок нематод сопровождалось освобождением поверхности среды от посторонней микрофлоры.В период максимальной плотности с одной чашки получали не менее 1,5 мл осадка нематод,что составляло более 720 *ыс. экз. Однако такая плотность была зарегистрирована на двух средах: на агаре с гидролизатом рыбы или китовой муки и агаре на мясопеп тонйом бульоне.На всех остальных средах эти нематоды не развивались, как правило.основная масса их погибала в первые же дни. В своих последующих исследованиях для наработки биомассы почвенных нематод ис-льзовали сухой питательный агар с гидролизатом рыбы или китовой муки, дешевый доступный препарат,выпускаемый в сухом виде отечественной би промышленностью.На рост и размножение нематод оказывает влияние тем пература:при 37° они плохо развивались.в условиях же холодильника (4°) они оставались живыми более 2 месяцев (соок. наблюдений).но развивались очень медлечно. Неблагоприятное действие оказывал« на

тод обработка их растворами антибиотиков,основная масса их погиба-ла.Последнее связано с чрезвычайно слабо развитой ферментативной деятельностью рабдитид,приспосабливающихся к существованию в гнилостной среде,где очень высока ферментативная активность самих бактерий. И тем не менее данные по бактериологической стерилизации нематод показали, что эффективность испытанных антибиотиков была неодинаковой и зависела как от времени,так и от температуры: при 2-часовой экспозиции ни один из антибиотиков не освобождал нематод полностью от бактерий, хотя число колоний было значительно меньше по сравнению с контрольными препаратами.При 24-часовой экспозиции полное стерилизующее действие оказали тетрациклин и полимиксин,однако после обработки взрослые нематоды теряли жизнеспособность,а отдельные сохранившиеся личинки не размножались на стерильном МПА.По-видимому эти организмы с интенсивным обменом веществ при обильном снабжении кислородом воздуха требуют несколько иных подходов при стерилизации,чем паразитические черви позвоночных животлых и растений.

3.3.1.2. Характеристика' антигенов свободкоживущих нематод Результаты анализа антисывороток к экстракту почвенных нематод с гомологичным антигеном в РИД показали их слабую активность (один комплекс АГ-АТ).Реиммунизация активизировала процесс антителогенеза: на ¿-й день антисыворотки проявляли в гомологичном экстракте 2-3; на 15 и 25-й - 2-4 комплекса АГ-АТ,однако титр антисывороток оставался низким,что возможно зависит от химического состава тела почвенных нематод,содержащих по сравнению с другими беспозвоночными большее количество (19,5$) липидов и меньше белка,а также с их слаборазвитой ферментативной системой.Йммуноэлектрофоретический анализ позволил определить в гомологичной системе до 5-6 антигенных компонентов в экстракте почвенных нематод с антисывороткой,полученной на 15-й и 25-й день после реиммунизации. Антисыворотки ранних сроков иммунизации по активности в РИД и ИЭФ не отличались.Аналогичный анализ,проведенный с гетерологичными экстрактами гельминтов с.х, животных показал,что свободноживущие нематоды имеют с некоторыми из них определенное антигенное родство.Причем в большей степени (два общих компонента) оно проявилось с диктиокаулами,ценурусами,мультицепсами,в меньшей (один общий компонент)- с аскаридами и трихинеллами.С экстрактами из фасии ол и мониезий реакция была отрицательной,что может свидетельствовать об отсутствии общих антигенных детерминант у этих паразитов с почвен шми нематодами. Учитывая наибольшее антигенное родство почвенных нематод' с диктиокаулами,значительный научно-поактичвский интерес пре ставдяло проведение исследований с сыворотками зараженных диктиокау-чачи животных,чтобы по возможности установить серологическую иденти-

чнвсть макромолекул,несущих перекрестную реактивность у этих нематод Полученные данные показали,что два антигенных компонента диктиокаул, участвующие в синтезе антител при диктиокаудезе,имеют общие детерминанты с антигенами нематод Rh.axei .причем один из них был серологически идентичен у обоих видов нематод.Наличие общих антигенов у диктиокаул и почвенных нематод было продемонстрировано также реакцией преципитации на живых личинках.

3.3.1.3. Электрофоретическая и иммунохимическая характеристика антигенов гельминтов-паразитов растений,насекомых и сельскохозяйственных животных Учитывая,что в процессе эволюции происходят изменения в системе паразит-хозяин,влияющие на антигенные структуры паразитов в сторону ослабления их иммуногенных свойств для хозяина,возникает необходимость изыскания новых,легко доступных и безопасных антигеноактивных средств,обладающих высокой иммуногенностью при гельминтозах.Среди последних пожалуй особое место занимают паразиты растений и насекомых, антигены которых,как показали наши экспериментальные исследования, имеют определенное родство с антигенами гельминтов с.х. животных.

К числу методов широко используемых для характеристики белков различных биоматериалов относится диск-электрофорез.который мы исполь зовали для сравнительного анализа белкового спектра трех видов нематод - D.filarla -паразита овец; A.avenae -нематоды расте -:ий и N. glaseri -паразита насекомых.Помимо этого исследовали серологическую активность экстрактов из афеленхов и неоаплектан в выявлении специфических антител к антигенам диктиокаул у зараженных овец.

Электрофореграммы исследуемых экстрактов нематод были представлены характерными'белковыми спектрами для каждого вида с определенным сходством и различиями между ними.В экстракте афеленхов и неоаплектан проявилось по 22,в экстракте диктиокаул - 23 белковых фракции.В первых двух представлено соответственно 5 и б белковых компонентов,имеющих одинаковую подвижность с белками экстракта диктиокаул. Для всех исследуемых нематод одинаковую электрофоретическую подвижность имели только два компонента.Исследования по серологической активности экстрактов афеленхов и неоаплектан показали иг способность выявлять специфические антитела к антигенам диктиокаул у зараженных овец.Причем проявленные в РЛД линии преципитации раполагались в разных зонах электрофореграмм,что может быть связано с разной подвижностью,но оди наковой специфичностью белков,участвующих в реакции АГ-АТ.

3,3.I.А. Иммуногенные свойства свободноживущих почвенных нематод Etwaxei и паразита насекомых при ларвальном аскаридозе. Результаты проведенных опытов на мышах с подкожной и интраперито-неальной иммунизацией показали способность почвенных нематод стимулировать защитные механизмы организма животных,однако степень защиты была различной в зависимости от способа введения нематод и сроков убоя после проверочного заражения.Наиболее выраженный защитный эффект немагоды проявили на 2-й день после заражения мышей аскаридами,иммуно генный эффект составил при подкожном способе иммунизации 98,9%,а при интраперитонеальном - 93,5%.В последующие сроки инвазии стимулирующее действие нематод ослабевало и к П-му дню различий в количестве выделенных личинок аскариды у вакцинированных и контрольных животных не отметили.В последующих опытах использование дополнительного стиму-лятора-адъювантаФрейнда-позволило активизировать защитные механизмы, что значительно снизило количество выделенных личинок аскарид из органов иммунизированных мышей в течение всего миграционного периода. Иммуногенная эффективность была в пределах 95,2-74,5% (р<0,01). Достаточно сильный защитный эффект при ларвальном аскаридозе был достигнут при интраперитонеальном способе иммунизации без адъюванта.но с 2-кратным введением нематод в дозе 20 тыс.экз. На 3-й день после проверочного заражения эффект защиты составил 91,2$ .постепенно снижаясь до 63,05? на 11-й день.

Аналогичные исследования при ларвальном аскаридозе,проведенные с неоаплектами также показали,что иммунизация мышей стимулирует их защитные механизмы,существенно влияющие на миграционную способность личинок аскарид.Количество обнаруженных личинок аскариды у контрольных мышей было более,чем в 6 раз выше,чем у иммунизированных (в среднем 467 t 60,0 против 73,2 i 18,2%).Иммуногенная эффективность на 4-й день инвазии составила 64,42,на 7-й - 12,9% (р 0,01).Значительно усиливался защитный эффект при одновременном введении животным неоапле-ктан с адъювантом Фрейнда (на 3-й день инвазии -91,в%, на 7-й -86,3?)

3.3.1.5. Иммунопрофилактика ларвального аскаридоза гетероло-гичными вакцинами из фитонематод Экспериментами на белых мыпах,вахцинированных афеленхами с последующим проверочным заражением яйцами аскаридц..было показано,что в процессе вакцинации у животных создается определенной степени иммунитет, влиясщий на миграцию личинок аскарид. Однако,как и в опытах . с почвенной нематодой,отметили различия в степени проявления защитных механизмов в зависимости от способа иммунизации.Наиболее сильный им-

муногенный эффект отметили при ннтраперитонеальном введении нематод на 7-й и П-й день после проверочного заражения (соответственно 85,4 и 91,5$?). Иммунизация дозой в 20000 афеленхов способствовала более равномерному стимулированию иммунных механизмов независимо от способа их введения- при подкожной вакцинации степень иммуногенности со 2-го по 7-й день аскаридоза была в пределах 81,2 -72,2%; при интраперито-неальной -89,3 - 58$. Подобная закономерность сохранялась и в последующих экспериментах,хотя показатели эффективности иногда были ниже. Разноречивость данных в некоторой степени могла быть результатом неодинаковой иммунореактивкости беспородных мышей,поэтому отдельным экспериментом на линейных мышах была проверена иммуногенная эффективность этого .биоматериала при ларвальном аскаридозе.Результаты этих исследований не только подтвердили способность афеленхов создавать иммунитет к заражению асхаридами.но оказались более показательными (иммуногенный эффект составил на 4-й и 7-й день после проверочного заражения 85,8 и 7Q,Z%%, р<0,01).

Аналогичные исследования на мышах„вакцинированных дитиленхами также показали способность последних стимулировать защитные механизмы, противостоящие заражению яйцами аскариды.Судя по результатам,иммуногенная эффективность также была неодинаковой и зависела от способа вакцинации. Наибольшую эффективность регистрировали при интра-перитонеальной иммунизации мышей дозой в 20000 нематод (на 2-й день после проверочного заражения - 92,2%-, в последующие сроки в пределах 63,Повышение иммунизирующей дозы дитиленхов до 50000 экз./мышь привело к обратному результату,что возможно ввязвио с перегрузкой иммунной система подопытных животных.В последующих опытах дити-ленхи при итраперитонеальном способе иммунизации проявили еще большую эффективность,которая сохранялась на довольно высоком уровне до П-го после проверочного заражения (92,7$; 81,9£).

3.3.1.6. Эффективность вакцины из почвенных свободноживущих нематод кь.васе! при экспериментальном диктиокаулезе

Активная иммунизация животных является одним из основных способов повышения иммунореахтивности и предохранения от заражения,однако трудность получения достаточного количества гельминтного мате риала-источника вакцина,быстрая потеря иммуногенных свойств и необходимость в отдельных случаях содержать животных-доноров делает эту проблему трудноразрешимой с Именно поэтому важное практическое значение приобретает разработка методов иммунопрофилактики гетерологичными видами,особенно свободкояивуоими популяциями,на првдсгавзськшк опасности з эпизотическои отношении.

Исходя из сказанного и учитывая антигенное родство диктиокаул и почвенных нематод,изучили иммуногенные свойства последних при экспериментальном диктиокаулезе.Исследования на морских свинках оказались недостаточно показательными,хотя на ранних стадиях диктиокаулеза (2-14 дней) число обнаруженных личинок диктиокаул в органах предварительно иммунизированных животных было меньше,чем у контрольных,в более поздние сроки разница эта была недостоверной.Тем не менее в сыворотках иммунизированных свинок,взятых на 14-й и 21-й день после проверочного заражения личинками диктиокаул, выявили в РИД с антигеном почвенных нематод две,а с антигеном диктиокаул -одну линию преципитации. Аналогично в сыворотках животных контрольной группы (зараженной, невакцинированкой) в гомологичной системе проявилось две линии преципитации. Интересно отметить,что сыворотки этих животных,фактически никогда не имевших контакта с почвенными нематодами,положительно реагировали с экстрактом почвенных нематод,что еще раз подтверждает родство антигенов диктиокаул и почвенных нематод.

Учитывая разноречивость результатов в опытах на морских свинках иммуногенные свойства почвенных нематод при диктиокаулезе изучили на овцах-специфичном хозяине.Исследования показали,что двукратная иммунизация овец в дозе 300000 нематодЛкивотное создает достаточно сильный иммунный ответ. В зависимости от срока убоя после проверочного заражения иммуногенная эффективность составляла 75-90%. Доза в 600 тыс. нематод для некоторых животных оказалась очень высокой,превышающей возможности их иммунной системы.

3.3.1.7. Эффективность вакцины из фитонематод A.avenae и D.destructor при экспериментальном диктиокаулезе овец

Выбор афеленхов и диткленхов в качестве вакцинирующего материала при диктиокаулезе был неслучайным,поскольку фитонематоды, не адаптированные к существованию в организме с.х. животных,проявили,по нашим иммунохимическим исследованиям,антигенное родство с диктиокаулами. В опытах на ягнятах,вакцинированных внутривенно двукратно с 5-6-не-дельным интервалом афеленхами в дозе 300 и 600 тыс. нематод/животное установили наиболее сильный иммунный ответ при дозе 600 тыс. В это> случае иммуногенная эффективность составила 99,8$, доза в 300 тыс., , судя по результатам вскрытия через 35-45 дней после проверочного заражения, варьировала: у одной овцы обнаружил^ только 7 неполовозрелых диктиокаул,тогда как у другого животного более 1000 экз. Последнее может быть результатом индивидуальной реактивности.

Аналогичные исследования,проведенные на овцах с использованием в качестве вакцинирующего средства дитиденхов также показали обнаде-

¡кивающие результаты.У вакцинированных овец после проверочного заражения выделили единичные экзепляры неполовозрелых диктиокаул.в то время как животные контрольной невакцинированной группы были сильно заражены (в среднем 151 Í 31,8 диктиокаул),Защитный эффект был в пределах 90-982 ( р<0,001).

Данные патоморфологических исследований органов вакцинированных ягнят показали более выраженную макрофагальную реакцию в брыжеечных лимфоузлах,пролиферацию фолликулов селезенки и средостенных лимфоузлов с эозинофилией и отеком в последних,значительным количеством плазматических клеток в средостенных лимфоузлах,что является характерным для аллергической реакции замедленного типа.

3.5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты наших экспериментов и немногочисленные данные литературы по вопросу иммунопрофилактики некоторых гельминтозов гетероло-гичными непатогенными для сельскохозяйственных животных нематодами дают основание говорить не только о целесообразности использования этого биоматериала в качестве вакцинирующего средства,но и о дальнейшем расширении исследований по этой проблеме,открывающей новые возможности для получения мммунопрофилактических и иммунодиагностических препаратов при гельминтозах,

•Учитывая особенности проявления иммунной реакции при этих заболеваниях, где, помимо специфических,значительное место в защитном механизме занимают неспецифические факторы резистентности,становится вполне оправданным такой подход в создании иммунопрофилактических средств.Защитная реакция;вызываемая непатогенными для животных нематодами .обеспечивается, во-первых, филогенетическим и антигенным родством этих нематод с гельминтами и,во-вторых,изменением реактивности организма иммунизированных животных,обусловленным сенсибилизацией и развитием аллергической воспалительной реакции,изменяющей иммунологический фон,на который наслаивается заражение патогенным возбудителем, что в большинстве случаев сопровождается усилением резистентности к патогену.О филогенетическом родстве представителей подотряда Rhab-ditata и Strongylats указывал Frick (1968). Антигенное родство свободноживуших нематод Sh.axeí (два общих компонента) с D.filarla, С.cerebrails и M.multiceps и (один копонент) с А.зиида и Т.apira-lis установлено нами в иммунохимических исследованиях с использованием гипериммунных сывороток.Подобный анализ,проведенный с сыворотками зараженных диктиокаулами морских свинок,не только подтвердил это родство,но позволил получить еще- более интересную информацию о полной серологической идентичности одного из этих компонентов.Убеди-

тельным подтверждением общности некоторых антигенов диктиокаул и сво-бодноживущих нематод являются также данные реакции преципитации на живых личинках в гомологичных и гетерологичных системах,показавшие идентичность образуемых преципитатов на ротовых и экскреторных отвер-ствиях нематод Rh.axel .помещенных в сыворотки зараженных диктиокау лами морских свинок и личинками в.filarle и теми же антисыворстка-ми. Наши данные показывают,что,по крайней мере,два антигенных компонента диктиокаул.участвующих в синтезе антител при заражении,имеют подобные в антигене почвенных нематод.Аналогичный иммунохимический анализ,проведенный с сыворотками спонтанно инвазированных диктиокау-лами овец и экстрактами A.avenae и N.glaseri, также показал антигенное родство между этими нематодами и D.filaria .Иммунизация гете рологичным биоматериалом сопровождалась у подопытных овец выработкой антител-преципитинов,уровень которых повышался не только после повторной иммунизации,но и после проверочного заражения личинками диктиокаул, что,в конечном итоге,сопровождалось развитием резистентности к заражению.Эти данные говорят о вовлечении в защитный механизм против заражения диктиокаулами вакцинированных непатогенным биоматериалом овец гуморальных иммунных факторов.В пользу этого свидетельствуют также данные Нисенбаум (1978) об усилении плазмоцитаркой реакции в регионарных лимфоузлах у иммунизированных животных.Другой,действующий одновременно с этим механизм защиты при таком способе иммунопрофилактики выражается в предварительной сенсибилизации организма вакцинированных животных аллергенами непатогенных гетерологичных нематод,проявляющейся эозинофилией.макрофагальной реакцией,пролиферацией клеток в фолликулах,большим лимфоидным скоплением в брыжеечном, бронхиальном и средостенном лимфоузлах и селезенке,значительно изменяющим их иммунореактивность в сторону усиления резистентности к инвазии.Сенсибилизирующая способность свободноживущих,растительных нематод и паразита насекомых достаточно четко прдемонстрирован.. в наших исследованиях (Ершов и др.,1973) и в работе Корчаговой и Буслаева (1976),установивших перекрестную реактивность антител против диктиокаул и этих нематодв реакции анафилаксии, пассивной кожной анафилаксии и Праустница-Кюстнера.Создание вакцин и иммунодиагностических препаратов из числа неадаптированных к хозяину-животному неспецифических видов открывает новые перспективные возможности,поскольку позволяет при обработке мутагенами такого биоматериала выделя мутанты, иммунологически идентичные по антигенной структуре гельминтам.

1У„ ¡ШУШШИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ АНТИГЕНОВ ПОЛОВОЗРЕЛОЙ И ЛИЧИНОЧНОЙ форм taenia hydatigeha

4.1. Материалы

Животные: 15 порооят8 20 кроликов. 10 собак, козел. Антигены: экстракты T.nyaatigena, C.tenuicollis (протосколексы, оболочка и жидкость пузыря; экстраты T.ovis ovis, T.ovis ЗггаЪЪе! и Т.рагепсhiinatоза.

Антисыворотки: гипериммунные к перечисленным гельминтам; иммунные от 15 экспериментально зараженных яйцами тении гидатигенной поросят, сыворотки от убойных свиней в количестве 1353 пробы из разных регионов страны.

Получение половозрелых T.hydatigena. Половозрелых паразитов выделяли из кишечника 5 экспериментально зараженных собак тенуикольными пузырями от свиней или овец в количестве 5-6 пузырей/собаку. Гипериммунные сыворотки к каждому из указанных экстрактов гельминтов готовили путем гипериммунизации кроликов (см.раздел П). Иммунные сыворотки получали от £5 поросят 3-месячного возраста, экспериментально зараженных яйцами тении гидатигенной в дозе 10000 яиц/голову и исследовали дс и на 10, 15, 24, 37, 60, 80 и 115-й день инвазии. Сыворотки от убойных свиней получали на мясокомбинатах гг. Тулы, Подольска, Ровно, Ставрополя, Владикавказа и Вильнюса в количестве соответственно 153, 200, 297, 112, 75 и 202. пробы.

4.2. Методы физико-химического и иммунохимического исследования

4.2.1. Иммунохимическая характеристика экстрактов T.hyda-cigena Id C.tenuicollis

Иммунохимический анализ осуществляли РИД и ЙЭФ, используя различные штампы в зависимости от поставленной цели. Для установления специфичных компонентов в экстрактах использовали метод адсорбции гетерологичных антител.

4.2.2. Аминокислотный анализ экстрактов c.tenuicollis

от свиней и овец

Исследовали экстракты из протосколексов, оболочки и жидкости тенуикольного пузыря. Подготовка материала для проведения анализа включала следующие этапы: осаждение белка, обработка его спирт-эфиром, гидролиз белка и непосредственно качественный и количественный анализ аминокислот яа автоматическом аминокислотном анализа50ре AAA-b8I.

4.2.3. Методика определения серологической активности антигенов C.tenuicollis И T.hydatigena В

имыуноферментной реакции (ЙФР)

Иммуноферментную реакцию использовали как для оценки ответа В-си стемы иммунитета, так и в качестве диагностического теста. Отработку параметров ЙФР, включающих определение концентрации антигена (по белку), время и температурный режим его фиксации на носителе, разведение .конъюгата, титр исследуемых сывороток, проводили экспериментально. Одним из необходимых реагентов реакции являются конъюгаты--белковые комплексы из общеглобулиновой или классоспецифической глобулииовой фракции белков сыворотки, связанных химически с каким-ли бо ферментом. Не располагая коммерческими конъюгатами к глобулинам сыворотки свиньи, мы готовили их в лабораторных условиях. Конъюгиро-вание выделенных igG - антител с пероксидаэой проводили по методу Wilson, Hakane (1978).

4.2.4. Получение специфичных серологически активных

антигенов паразита

Очистку антигенов от балластных веществ колоночной хроматографией на носителе TSK-Gel - 50(тонкий). Колонки диаметром 26 ми, высота столба геля -1м, объем наносимого образца - 10 мл (50 мг белка), объем каждой фракции - 5 мл. Элюирование проводили фосфатно-солевыы буфером рН-7,2, скорость протока его - 10 мл/час. Регистрацию осуществляли на Увикорде - ькв при 280 ни,, сбор фракций в коллектор Мужьтирак, оценку серологической активности фракций - в ИФР.

4.3. Результаты

4.3.1. Оценка иммунохимических исследований,серологической активности и диагностической эффективности антигенов T.hydatigena и C.tenuicollis

4.3.I.I. Сравнительный иымунохимический анализ экстрактов половозрелой и личиночной форм паразита

Анализ экстрактов паразита в гомо- и гетерологичных системах с гипервммунными сыворотками показал, что большинство входящих в их состав белков являются антигенами и вызывают синтез антител. Наибольшую антигенную активность проявил экстракт тении, затем оболочки, жидкость пузыря и экстракт протосколексов цистицерков. В гомологичной системе в экстракте тении выявили 9 комплексов АГ-АТ. Эта же антисыворотка сж жидкостью проявляла более 5, а с эктрактами оболочки и протосколексов соответственно 4-5 и 3-4 комплекса АГ-АТ.Антисыворотка к кидкости пузыри проявляла в РИД с -гомологичным экстрактом 7-8, а с i'ßSöposGrirt.-.bu-i'. чксграктаик не Солее 4-5 ккиуншос комплексов.

Активным антигеном оказался экстракт оболочки пузыря,антисыворотка которого в гомологичной системе проявляла 6-7 комплексов АГ-АТ. С экстрактами стробилы паразита и протосколексов тенуикольных цксти-церков эта антисыворотка выявляла соответственно 5 и 3-4 преципити-руощих системы АТ-АГ,три из которых в обоих вариантах,судя по слиянию линий в РИД, были идентичными. Аналогичный анализ в гетерологичной системе с жидкостью пузыря проявил не менее 4-5 комплексов АГ-АТ.

Менее активным антигеном оказался экстракт протосколексов тенуикольных цистицерков,сыворотка к которому,хотя и выявляла в гомологичной системе не менее 6-7 комплексов АГ-АТ,представляющие их линии пре ципитации в РИД были слабее выражены.Такое же количество систем АГ-АТ проявляла эта антисыворотка с экстрактом оболочки пузыря,причем в это системе линии преципитации проявлялись четче.Не менее 4-5 комплексов АГ-АТ выявили в гетерологичной системе с экстрактом половозрелых червей.Сходная картина была получена при анализе исследуемых экстрактов И0±>,хотя концентрирование антисывороток позволило несколько увеличить число выявляемых комплексов АГ-АТ как в гомологичных,так и в гетеро-логичных системах,что свидетельствует о значительном антигенном родстве и большом числе общих компонентов „ Исследуемые экстракты проявили значительное антигенное родство также с другими видами тениид и эхинококком. Причем в наибольшей степени это родство проявилось межд>' этими паразитами,половозрелыми тениями и экстрактом оболочки тенуикольного пузыря (3-6 комплексов АГ-АТ),в меньшей степени с протоско-лексами и жидкостью тенуикольного пузыря (с-3 общих системы АГ-АТ). В последующем методом адсорбции гетерологичных антител в исследуемых экстрактах определили'специфические компоненты,число которых после полной адсорбции гетерологичных антител составило для стробилы тении гидатигенкой и жидкости пузыря два. Антитела к антигенам протосколек сов и оболочки пузыря полностью нейтрализовались гетерологичными эк- • страктами и жидкостью пузыря.Близкое антигенное родство на первый взгляд является достаточно веским основанием для использования любог< из них в .¡^мунодиагностических исследованиях. Однако в этом случае немаловажное значение приобретают данные о родстве антигенов парази та с белками хозяина,что значительно влияет на специфичность иммуно-тестов.Такие исследования в РИД с антисывороткой против глобулинов сыворотки свиньи показали наличие общих компонентов с белками хо -зяина в экстрактах протосколексов,оболочки и жидкости тенуикольного пузыря.¡Ьимем в наибольшей степени это родство проявляется с оболочкой пузыря и заполняющей его жидкостью.В экстракте половозрелых тений такие компоненты не обнаружены.Отрицательной была реакция и меж-

ду исследуемыми экстрактами и антисывороткой к антигенам аскариды.

4.3.1.2. Антигенное родство taenia hydatigena с другими видами тениид

Учитывая близкое антигенное родство различных видов цестод,большое значение при выделении из них диагностически ценных антигенных компонентов приобретают данные по иммунохимическому анализу.С учетом этого провели исследование антигенов цестод рода Taenia - Т.ovia ovia; T.cvis krabbei ; T.parenchimatosa и T,hydatigena в РИД с помощью гомологичных и гетерологичных гипериммунных сывороток.В результате анализа в экстракте T.ovls ovis в гомологичной системе выявили 9-Ю комплексов АГ-АТ.Зта же антисыворотка с экстрактами T.ovis krabbei и T.parenchimatosa проявила 5-6 преципитирующих систем.а с экстрактом тении гидатигвнной число таких систем соответствовало п< казателям гомологичной системы.Причем в этом случае почти все проявленные в РИД линии преципитации»за исключением двух,были идентичными что свидетельствует о значительном антигенном родстве этих паразитов Актисыворотка к T.ovls krabbei в гомологичной иммунной системе проявляла 7-8 комплексов АГ-АТеиз которых только один представлен четко! линией преципитации.Эта же антисыворотка в гетерологичных системах с T.ovls ovis и T.parenchimatosa проявила соответственно 7 и 4 иммун них комплексов.Еще большую активность проявила эта антисыворотка в гетерологичной системе с экстрактом тении гидатигенной,что является признаком антигенной близости все трех цестод.Менее активной оказалась антисыворотка к экстракту T.parenchimatosa .которая в гомологи чной РИД проявляла меньше комплексов АГ-АТ,чем в гетерологичных. Количество линий преципитации между антисывороткой к экстракту тении гидатигвнной и гомологичным антигеном доходило до 5,с гетерологичны-ми экстрактами не превышало 3-4.

Данные иммунохимического анализа показали,что в состав экстракто исследуемых гельминтов входит большое число активных антигенов,вызывающих синтез антител у животных,причем,по нашим результатам,наиболь шуь антигенную активность проявили T.ovis ovis , T.ovíb krabbei и Т.hydatigena .экстракт« из которых выявляли больше иммунных комплексов как в гетерологичных,так и в гомологичных системах реакции. Подтверждением антигенной близости исследуемых цестод явились резуль таты анализа в РИД на идентичность выявляемых ими линий преципитации по которым также установили наибольшую близость T.ovis ovis , Т. ovie krabbei и Т.hydatigena .Вероятно антигенное родство T.ovis ovis и Т.hydatigena обусловлено одинаково* средой обитания как в личиночной,так и в имагинальной стадии,а незначительные антигенные

различия между первыми двумя цестодами,возможно,являются следствием паразитирования личиночной стадии T.ovis кгаЪЪе1 у оленьих.

4.3.1.3. Качественный и количественный анализ аминокислотного состава экстрактов Cyaticercus tenuicollis , выделенных от овец и свиней

Результаты анализа показали,что качественный аминокислотный состав экстрактов протосколексов,оболочки и жидкости тенуикольного пузыря от овец и свиней не отличался и включал соответственно 17, 16 и 16 амино кислот.Однако в количественном отношении отмечены различия в экстракте личинок паразита,выделенных от разных хозяев.3 жидкости тенуикольного пузыря от овцы больше содержалось глутамина и аспарагина,меньше пролина и метионина.в экстракте протосколексов обнаружили больше лизи на и лейцина,очень малые количества метионина и цистеина.Причем цисте ин не обнаружен ни в жидкости,ни в экстракте оболочки пузыря,хотя в последнем материале количественное содержание всех аминокислот превосходило показатели в жидкости и особенно в экстракте протосколексов паразита.Однако содержание глицина,валина и метионина в экстракте оболочки было сравнительно низким и составило соответственно б,б ¿0,1 6,3 i 0,9 и 0,95 - 0,22.Подобные различия имели место и в экстрактах цистицерков,выделенных от свиней.Различия качественного и количествен ного содержания аминокислот,по мнению исследователей,могут влиять на антигенность.С этих позиций,полученные нами данные по аминокислотному анализу в некоторой степени согласуются с нашими исследованиями по ан тигенной характеристике экстрактов тенуикольных цистицерков„Наиболь-шуо антигенную активность проявили в порядке уменьшения экстракт оболочки,жидкость тенуикольного пузыря и экстракт протосколексов,хотя в плане специфичности получили противоположные результаты.Во всех имму-нореакциях лучшие результаты регистрировали с экстрактом протосколексов,-в котооом количественное содержание аминокислот было меньше.

4.3.1.4. Диагностическая эффективность антигенов Cysticercua tenuicollis и Taenia hydatigena , динамика про-тивопаразитарных антител при экспериментальном тенук-хольном цистицеркозе

Учитывая,что иммунохимический анализ не характеризует диагностиче ские качества антигенов,наши дальнейшие исследования были направлены на испытание экстрактов половозрелой и личиночной форм паразита в серологических тестах,за основу которых били взяты РИД и ИФР„ Первую использовали в основном для подбора положительных референс-сывороток из числа экспериментально зараженных тенуикольными цистицерками свиней для отработки режимов основного иммунодиагностического тест-т-Л^'

Иммуннопреципитационный метод позволил выявить в сыворотках экспериментально зараженных поросят антитела к антигенам паразита на 24-й день инвазии (1-2 линии преципитации),в последующие сроки антитела-преципитины не регистрировали.Эти сыворотки были использованы для отработки режимов ИФР; концентрации антигенов по белку для сенсибилизации планшет - 3-6 мкг/мл; титр сывороток -1:100 и разведение приготов ленного нами классоспецифического конъюгата - I:1000.Поскольку в пред верительных испытаниях наилучшие диагностические качества проявили в иммунореакциях экстракты половозрелой тении и протосколексов тенуи-кольных цистицерков они были взяты за основу в дальнейших исследованиях.Оба антигена испытали в ПФР с 112 сыворотками,взятыми в динамике экспериментального тенуикольного цистицеркоза от свиней,(оценка чувствительности) и 75 сыворотками свиней,зараженных аскаридами (32), трихинеллами (10) и эхинококками (33) (оценка специфичности").

В результате установили достаточно высокую чувствительность обоих антигенов,выявляющих специфические антитела с Ю-го дня инвазии,однако специфичность экстракта протосколексов цистицерков была выше и составила 87,1? против 12,&% для экстракта половозрелой тении.Перекрестные реакции регистрировали в основном с сыворотками зараженных эхинококками свиней.Динамика антителогенеза при экспериментальном тенуи-кольном цистицеркозе свиней показала,что специфический иммунный ответ при однократном заражении кратковременный,продолжительность его ограничивается 115 днями (срок наблюдений),когда уровень специфических ан титея достоверно не отличается от контрольных показателей.Регистрируются они с Ю-го дня инвазии,достигая максимума на 24-й день.Наблюда-емые некоторые различия индивидуа кого характера в иммунном ответе свиней на заражение тенуикольными цистицерками,проявляющиеся разным уровнем противопаразитарных антител,являются отражением их иммунореак тивности к этому паразиту.Аналогичные исследования.проведенные с сыворотками убойных свиней в количестве 323 пробы,из которых 123 были от зараженных тенуикольными цистицерками животных со слабой интенсив-костью инвазии (1-2 редко 3-4 цисты),остальные от свиней,не имевших видимых паразитарных поражений внутренних органов,показали в некоторых случаях статистически недостоверные различия в уровнях оптической плотности с сыворотками зараженных и незараженных животных.Однако и в этом случав лучшие диагностические качества проявил антиген протосколексов цистицерков,преимуцества которого • сводились как в выявлении большего количества зараженных животных,так к в меньвем числе сомнительных результатов,что также является косвенным подтверждением присутствия в этом препарате большего числа специфических антигенных компонентов.

4.3.1.5. Реактивность очищенных фракций экстракта протосколексов СувЪ1сегсиз terпlicollis

Учитывая недостаточную диагностическую эффективность антигенов тенуикольных цистицерков в ИФР при естественной инвазии,провели их очистку от неспецифических компонентов,являющихся одной из причин ложноположительных ответов в иммунологических реакциях,гель-фильтрацией.Полученные в результате фракционирования экстракта протосколексов тенуикольных цистицерков 90 белковых фракций были испытаны в ИФР с целы) определения их серологической активности.Анализ количественного распределения белка-антигена по фракциям показал,что большая его часть находилась в низкомолекулярном спектре,в то время как диагносту ческую эффективность проявили компоненты высокой молекулярной массы. Серологическую активность,позволяющую по разнице оптической плотности между положительными и отрицательными контрольными сыворотками судить о чувствительности и специфичности антигенного препарата,проявили из 90 фракций только 8 (27-34 прообы; 8,8$),остальные либо проявляли очень низкую активность,либо ими невозможно было дифференцировать сыворотки зараженных от клинически здоровых животных.

Аналогичный анализ фракций экстракта стробилы тении гидатигенной не показал подобной закономерности.Существенные преимущества диагностического характера не проявила ни одна из полученных белковых фракций.Возможно, что антигенные компоненты одной иммунологической специф:' чности,проявляющие диагностические свойства в цельном экстракте,элю-ируются во фракциях белков с различной молекулярной массой,что значительно снижает их активность и делает непригодными для диагностических исследований.Последующие сравнительные испытания диагностической эффективности цельного экстракта протосколексов цистицерков и выделенных из нее 8 серологически активных фракций как с сыворотками экв спериментально.так и спонтанно зараженных свиней не показали особых преимущест очищенного антигенного препарата.

Таким обоазом,теоретическое предположение о том,что освобождение цельного экстракта от низкомолекулярных компонентов должно улучиить его диагностические качества не нанло практического подтверждения. Возможно,что антигенные компоненты одной иммунологической специфично сти имеют разную мол. массу и распределяются по разным белковым фрак циям.что снижает активность фракционированного антигена.А с другой стороны,возможно,что перекрестная реактивность антител,синтезируемых в процессе эхинококкоза и тенуикольного цистицеркоза,обусловлена идентичностью иммуногенов этих цестод.

4.3.1.6. Диагностическая эффективность антигена протосколексов Cysticercus tenuicollis при спонтанном тенуикольном цистицеркозе

Учитявая.что объективную оценку иммунодиагностической эффективности любого антигена можно получить только при исследовании естественно инвазированных животных,провели испытания антигенов протосколексов тенуикольных цистицерков с сыворотками свиней,полученными из разных регионов страны.Причем по возможности сыворотки приобретали от убойных животных относительно благополучных и неблагополучных по це-стодозам и другим гельминтозам.хозяйств.К числу первых относились пробы сывороток свиней из Подольского и Вильнюсского мясокомбинатов. Приобретенные на других мясокомбинатах (гг.Тула,Ровно,Владикавказ) пробы имели в своем составе сыворотки свиней зараженных тенуикольны-ми цистицерками,эхинококками и другими гельминтозами.

В результате исследований установили наибольшую чувствительность теста при анализе сывороток свиней,взятых на Владикавказском мясокомбинате, однако незначительный процент (не более зараженных тенуи-кольными цистицерками животных не позволяет судить об объективности полученной информации.В то же время большое число проб сывороток от зараженных эхинококками свиней снизило специфичность »WP-теста до 51%,Почти такую же специфичность теста получили при исследовании сывороток свиней на Ровненском мясокомбинате,где число зараженных эхинококками животных довольно высоко.Чувствительность теста при ана лизе этого материала составила 79,6%,причем,если учесть,что число зараженных тенуикольными цистицерками свиней в этом случае было болев 12%,го существенно повышается объективность оценки используемого антигена в иммунореакциях.Тем не менее коррективы в оценке качества антигена протосколексов.особенно по критерию специфичности,могли внести Исследования сывороток свиней из Подольского и Вильнюсского мясокомбинатов,где не регистрировали ни тенуикольный цистицеркоз.ни не эхинококкоз. Анализ этого материала показал,что не менее 20% проб сывороток дают ложноположительный ответ с антигеном протосколексов цистицерка,основная масса которых (32£) приходится на группу животных с очаговыми изменениями печени.Специфичность теста -7Q%.

Таким образом.акализ спонтанного материала фактически подтвердил данные,полученные в условиях эксперимента.Было показано,что испытуемый антиген не обладает строгой специфичностью и в определенное степени неспецифически реагирует с сыворотками клинически здоровых и пораженных другими гельминтами животных.И тем не менее,на наш взгляд отработанный тест на основе ЙФР с антигеном протосколексов трчуккольных иистицепков может использоваться для оценки эпизотиче-ской ситуации и иммунного статуса животных.

4.5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты иммунохимического анализа и диагностической эффективности антигенов тении гидатигенной и цистицерков тенуикольных достаточно убедительно показывают,что проблема дифференциальной иммунодиагностики тенуикольного цистицеркоза.как впрочем и других ларвальных цестодозов,представляет особую сложность.Трудности решения этой проблемы связаны не только антигенным родством тенуикольного цистицерка с белками хозяина,другими видами тениид и эхинококками,но,что немаловажно, степенью иммунореактивности свиней к заражению этим гельминтом, что существенно отражается на процессе иммунного ответа и синтеза специфических антител, на выявлении которых базируются почти все иммунологические тесты.Иммунохимический анализ 4 антигенных препаратов гельминта- экстрактов стробилы тении,оболочки,жидкости тенуикольного пузыря и протосколексов тенуикольных цистицерков с гипериммунными сы воротками в гомологичных и гетерологичных системах иммунодиффузии в геле показал как их высокую антигенную активность,так и очень близкое антигенное родство входящих в их состав компонентов.Однако метод адсорбции гетерологичных антител позволил выявить в исследуемых экстрактах и специфичные антигенные компоненты. Значительная общность антигенов паразита,за исключением экстракта стробилы тении,установлена с белками хозяина-свиньи.й большей степени это родство проявляют экстракты оболочки пузыря и содержащейся в ней жидкости,менее экстракт протосколексов тенуикольных цистицерков.Учитывая,что большинство иммунодиагностических тестов основаны на выявлении специфических антител в циркуляции,большую научно-практическую значимость приобретают данные по динамике антителогенеза у свиней,экспериментально загаженных яйцами тении гидатигенной,особенно,если учесть,что использование двух тестов - ИФР и РИД - позволило охарактеризовать иммунный троцесс как с позиции динамичности,так и набора синтезируемых антите/ Ьлученные данные позволяют заключить,что функциональные антигены па-)азита вызывают у свиней кратковременный иммунный ответ,который,судя ю уровню гуморальных антител в кровотоке,через 3-3,5 месяца,при от-¡утствии новой антигенной стимуляции,не проявляется иммунореакциями. 'ем не менее было установлено,что циркулирующие антитела к антигенам гаразита, регистрируются с Ю-го дня после заражения,достигая максиму ¡а на 24-й день с постепенным снижением их уровня в последующие срок^ 1нвазии.Прослеживаются различия индивидуального характера в иммунном !твете поросят к заражению тенуикольными цистицерками,проявляющиеся 1азным уровнем специфических антител.что является отражением их им-;унореактивности к этому пчоазиту.Лоичем четкой корреляции между раз-

витием иммунореакций и интенсивностью инвазии у зараженных свиней не наблюдали.Не отличается большим разнообразием и набор антител,синтезируемых свиньями в процессе заражения.По данным РИД,даже в период максимального уровня противопаразитарных антител в кровотоке (24~й день),количество выявляемых комплексов АГ-АТ не превышало двух,что подтверждает существенные различия потенциальной и функциональной активности антигенов тенуикольных цистицерков.И тем не менее синтеэи руеные антитела являются отражением количественных и качественных из менений антигенного состава паразита,что необходимо учитывать при разработке иммунотестов.Основным препятствием дифференциального диагноза при цестодозах является перекрестная реактивность антител, синтезируемых при различных цестодозах и особенно при тенуикольном цистицеркозе и эхинококкозе,что существенно снижает специфичность иммунологических тестов.Наши иммунодиагностические исследования с сыворотками убойных свиней с подтвержденным диагнозом тенуикольного цистицеркоза и эхинококкоза убедительно показали,что в отдельных случаях более 30# зараженных эхинококками свиней давали сероположи-тельный ответ с антигенами тенуикольного цистицерка.Но и в этих условиях наибольшую специфичность в иммунотестах проявлял антиген про-тосколексов паразита,с которым регистрировали меньше ложноположи-тельных ответов с сыворотками животных с гетерологичными инвазиями. И,хотя экстракт стробилы тении не имел общих компонентов с белками хозяина,диагностическая эффективность его была ниже.Безуспешной оказалась попытка улучшить диагностические качества этого экстракта ме тодом гель-фильтрации,она привела к ослаблению его активности. Не исключено,что процесс очистки привел к распределению диагностических антигенных компонентов полного экстракта по различным фракциям в зависимости от молекулярной массы,что привело к потере чувствительности. Аналогичная процедура очистки экстракта протосколек-сов тенучкольных цистицерков.хотя и позволила выделить 8 активных диагностических фракций,тем не менее она не освободила их от компонентов, реагирующих с сыворотками зараженных эхинококками свиней. Последующие иммунодиагностические исследования с сыворотками убойных свиней показали идентичность антител,синтезируемых на определенном этапе инвазионного процесса при тенуикольном цистицеркозе и эхинококкозе,что не исключает закономерности такого положения для всех ларвальных цестодозов.С этих позиций,на наш взгляд,наиболее информативными и практичными выступают иммунодиагностические исследования многоцелевого характера с одновременным анализом сывороток животных с разными антигенами.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

1. Иммуноаллергическая реактивность в различных паразито-хозяин-ных системах (Н. contortus - овца; A.suum - морская свинка, кролик, свинья; Т.spiralis - мышь, морская свинка, кролик) имеет отличительные особенности, зависящие от характера взаимоотношений между партнерами системы и различий жизненных циклов исследуемых гельминтов. Продолжительность и интенсивность проявления иммунных реакций зависит от специфичности системы, степени адаптации паразита и индивидуальной реактивности животных - хозяев.

2. В системе паразит-хозяин (Н.contortus - овца) установлена низкая антигенность и иммуногенность гемонхов в силу ограниченного контакта антигенов паразита с клетками иммунокомпетентных органов хозяина - овцы, что сопровождается стимулированием слабого системного иммунного ответа у зараженных животных.

Относительно низкая иммунореактивность овец к гемонхам при первичном заражении обусловлена адаптационным характером паразито-хозя-инных отношений и сопровождается слабовыраженными иммуноаллергичес-кими реакциями у инвазированных овец, с -низким уровнем циркулирующих специфических антител - агглютининов, преципитинов и реагинов, относящихся к IgM, IgG и IgE.

Минимальная доза личинок гемонхов, способная стимулировать у зараженных овец слабый системный иммунный ответ зависела от индивидуальной реактивности хозяина и составляла для одних - 3000, для других - 5000 и 10000 личинок Н.contortus. -

3. Повт рная антигенная стимуляция (ре - и суперинвазия] приводит к измечениям паразито-хозяинных отношений в системе Н.contortus - - овца, выражающихся в усилении иммуноаллергической реактивности хозяев к антигенам паразита. Последнее сопровождается развитием иммунных реакций как локального, так и системного типов с увеличением уровня специфических антител в кровотоке и усилением патоморфологи-ческих и иммуноморфологических изменений в сычуге. Активизация иммунных факторов у большинства животных сопровождается феноменом "самоосвобождения" от взрослых гемонхов и задержкой в развитии личинок гемонхов ре - и суперинеазирующей дозы.

4. Проявление феномена "самоосвобождения" при гемонхозе зависит от срока суперинвазии, возраста животных и интенсивности первичной инвазии. Введение суперинвазируюшей дозы личинок гемонхов овцам ранее 35-го дня первичной инвазии, хотя и вызывает усиление иммуноал-лергичеоких реакций,но не приводит к элиминации взрослых гемонхов. У

ягнят 2 - 3 - месячного возраста с интенсивной первичной инвазией наблюдается феномен "самоосвобождения" от взрослых гемонхов независимо от степени проявления иммуноаллергического ответа.

5. Многократное заражение овец небольшими дозами личинок Н.соп-tortus в течение месяца не стимулирует системную иммуноаллергическую реакцию, вызывает локальные изменения, свойственные неспецифическому воспалению, что сопровождается развитием резистентности и,явлением самоосвобождения. Динамика иммунного ответа в системе Н. contortus -овца свидетельствует о комплексности факторов, способствующих элиминации гемонхов и возможное существование самостоятельных механизмов, ответственных за "самоосвобождение" и другие иммунные проявления, препятствующие приживаемости гемонхов.

6. При сравнительной оценке паразито-хозяинных систем, формируемых видами Н.contortus.A.suum и Т.spiralis, установлены существенные различия в иммунологической реактивности животных к этим паразитам. Иммунный ответ при заражении аскаридами и трихинеллами, по сравнению с гемонхами, проявляется сильнее с преобладанием системной иммунной реакции, что обусловлено тесным и продолжительным (особенно при трихинеллезе) контактом личинок этих паразитов с клетками иммунокомпе-тентных органов хозяев. Но во всех системах, формируемых исследуемыми паразитами, первым барьером на пути инвазии выступает реакция в желудочно-кишечном тракте и в механизме защиты не исключается роль локальных иммуных реакций и неспецифических факторов резистентности.

7. Высокая антигенность и иммуногенность трихинелл, большая продолжительность их жизни в изолированной от организма хозяина капсуле обеспечивает в паразито-хозяинных системах. Формируемых Т.spiralis по сравнению с таковыми, образуемыми A.suum, продолжительный системный иммунный ответ (не менее 210 дней - срок наблюдений) с высоким титром' специфических антител в кровотоке, относящихся к различным классам иммуноглобулинов (IgM.IgG,IgE).

8. Теоретически обосновано новое направление в иммунопрофилактике гельминтозов. основанное на использовании в качестве иммуногенно-го препарата при ларвальном аскаридозе и диктиокаулезе гетерологич-ного антигена непатогенных для сельскохозяйственных животных свобод-ноживущих нематод Rh.axel.Впервые с положительным результатом испытаны в качестве иммуногенов при указанных гельминтозах растительные нематоды A.avenae, D. destructor и паразит насекомых N.glaseri.

9. Иммунохимический анализ с использованием гипериммунной сыворотки к антигенам свободноживущей нематоды Rh.axel показал антигенное сродство Rh.axel с D.filarla, A.suum и Т.spiralis. Аналогичными

исследованиями с сыворотками зараженных диктиокаулами овец установлено наличие в экстракте Rh.axel антигенных компонентов идентичных функциональным антигенам D.filarla.Перекрестно реагирующие антигены обнаружены у D. filarla. A. avenae и N.glaserl.

10. Иммунизация животных свободноживущими растительными нематодами вызывает усиление плазмоцитарной реакции в регионарных лимфоузлах, синтез антител - преципитинов и сенсибилизацию организма вакцинированных животных с развитием эозинофильной. макрофагальной реакций, скоплением лимфоидных клеток в лимфоузлах и селезенке, способствующих изменению иммунореактивности хивотных и повышению их резистентности к последующему заражению специфичным видом гельминта.

11. Сравнительный иммунохимический анализ белковых экстрактов T.hydatlgena и С.tenulcollls реакцией иммунодиффузии в геле с использованием гипериммунных сывороток в гомологичных и гетерологичкых системах показал их высокую антигенную активность и близкое антигенное сродство входящих в их состав антигенных компонентов.

Установлено по два специфичных антигена в экстрактах стробилы паразита, оболочки и жидкости тенуикольного пузыря. Антитела к экстракту протосколексов С. tenulcollls полностью нейтрализуются антигенами жидкости пузыря.

В исследуемых экстрактах выделены перекрестно реагирующие антигены с Е.granulosus, T.avis ovls, T.ovls krabbel, T.parenchlmatosa и отсутствие таковых с A.suum. Установлена общность исследуемых экстрактов с белками хозяина - свиньи, за исключением экстракта стробилы T.hydatlgena.

12. Иммунореактивность свиней в системе С. tenulcollls - свинья характеризуется кратковременностью системного иммунного ответа и индивидуальными различиями, проявляющимися у зараженных животных разным уровнем специфических антител, регистрируемых с 10-го дня инвазии с максимумом на 24-й день. Динамика иммуногенеза в системе явля-этся отражением жизненного цикла паразита, проявляющего наибольшую энтигенность и иммуногенность в период миграции цистицерков в брюш-íyio полость и сальник ( 18 - 25-й день). В кровотоке инвазированных свиней в период максимального иммунного ответа антитела синтезируются не более, чем на два антигенных компонента паразита.

13. Наибольшая диагностическая эффективность антигена протоско-тексов с. tenulcollls, проявляющаяся меньшим количеством ложноотрица-гельнкх и лозЕНоп-.-лсаительиых результатов, установлена с сыворотками îKcnt;¡'ментально и естественно инвазированных тенуикольными вдсти-

свиней. Основная масса нсспецифических реакций регистрирует-

- Vf -

ся с сыворотками свиней, зараженных эхинококками, что является следствием наличия у этих паразитов общих антигенных детерминант.

14. В экстракте'протосколексов С. tenulcollis выявлено восемь активных белковых фракций с мол. массой 400 кД, обладающих высокими сорбционными свойствами на полистироле и содержащих минимальный уровень неспецифических перекрестно реагирующих компонентов с Е. granulosus, наличие которых обусловлено идентичностью некоторых функциональных антигенов тенуикольных цистицерков и эхинококков. Полученные антигены используют в тест-системе на основе ИФА для выявления специфических антител.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты исследований по характеристике особенностей проявления иммуноаллергической реактивности в различных паразито-хозяин-ных системах, формируемых тремя видами нематод - Haemonchus contor-tus, Ascaris suum и Trlchlnella spiralis, рекомендуем использовать в лекционных курсах и практических занятиях по гельминтологии в ветеринарных институтах по вопросам иммунитета, аллергии и иммунобиологическим методам исследований при гельминтозах. При этом необходимо акцентировать внимание на такие аспекты иммунной ответной реакции при заражении гельминтами, как интенсивность и продолжительность иммунных реакций, преобладание локальных или системных иммунных механизмов. роль неспецифических факторов резистентности. • являющихся следствием различий в биологии возбудителей инвазий и в характере взаимоотношений, складывающихся в системе паразит - хозяин..

2. Материалы, характеризующие перекрестно реагирующие антигены у гельминтов с.х. животных (A. suum. D.filaria и Т. spiralis и др.) и непатогенных для с.х. животных свободноживущих нематод Rhabditls axel, фитонематод Ahpelenchus avenae. Dltylenchus destructor, паразита насекомых Neoaplectana glaserl, их способность вызывать при парентеральном введении защитную реакцию к последующему заражению аскаридами. диктиокаулами. могут быть рекомендованы в качестве методического пособия по использованию гетерологичного иммунизирующего биоматериала при аскаридозе и диктиокаулезе; полученные данные могут служить обоснованием дальнейшего поиска общих антигенов у различных груш паразитов, их детального иммунохимического изучения с • целью использования в иммунодиагностике и иммунопрофилактике особо опасных гельминтозов. Данные по выявлению перекрестно реагирующих антигенов

_ 4 5 -

у свободножмвущих нематод, фитонематод, паразитов насекомых и гельминтов с.-х. животных рекомендуем использовать также в лекционных курсах сравнительной и эволюционной иммунохимии.

3. Методику культивирования свободноживущкх нематод Kh.axei предлагаем использовать для получения биомассы нематод с целью проведения иммун ахимическнх, иммунопрофилактических и иммун одна гностических исследований при гельминтозах.

4. Результаты по сравнительному иммунохимическому анализу и диагностической эффективности антигенов Taenia hydatigena и Cysticercus tenuicollis, характеристике иммунной ответной реакции в системе с.tenuicollis - свинья, рекомендуем включить в курс лекций по иммунологии ларвальных цестодозов.

Разработанный иммуноферментный тест на основе использования антигена протосколексов цистицеряов рекомендуем для проведения се-роэпизоотологических исследований при тенуикольном цистицернозе.

Антиген протосколексов с.tenuicollis, содержащий, по сравнению с другими антигенами паразита, минимальный уровень перекрестно реагирующих компонентов с другими цестодами, предлагаем использовать в дифференциальных иммунодиагностических исследованиях при ларвальных цестодозах.

Основные положения диссертаций опубликованы в следующих работах:

1. Беренко В.К. Изучение антигенности свободноживущей нематоды Bhabditis axel // Бюл. Всес. ин-та гельминтол. - 1973. - Вып.10. - С. 16-18.

2. Бережко В.К. Получение и сохранение почвенных нематод Hhabditis axe i в лабораторных условиях // Бюл. Всес. ин-та гельминтол. - 1973. - Вып. 10. - С. 20-24.

3. Ершов B.C., Бережно В.К., Кашинский А.Д. и др. Аллергические реакции у животных, вызываемые почвенными и паразитически®! нематодами и возможности вакцинации при гельминтозах // Тр. Всес. ин-та гельминтол. - 1973. - Т. 20. - С. 77-82.

4. Ершов B.C., Бережко В.К., Нисвнбаум И.А. Изучение нммуногев-ных свойств почвенной (свободноживущей) нематоды Ehabditis axel при экспериментальном диятиокаулезе на морских свинках в овцах // Тр. Всес. ии-ta гельминтол. - 1973. - Т. 20. - С. 83-89.

5. Тараканов В.И., Бережно В.К., Нисенбауи И.А. Бакгервологз-ческая стерилизация свободноживущих нематод Ehabditis axai Ц Бал. Всес. ин-та гельминтол. - 1972. - Вып. 7. - С. 49^53.

6. Бережно В.К., Тараканов В.И., Нисвнбаум ИД. йзучвввв яиц?-

иогенных свойств растительной нематода Aphelencfaus avenae при' аскаридозе на мышах и диктиокаулезе овец // Бюл. Всес. ин-та гельминтол.-1974. - Вып. 13. - С'. 36-43.

7. Бережно В.К., Тараканов В.И., Нисенбаум И.А. Изучение имму-ногенных свойств растительной нематоды Ditylenchus destructor // Бел. Всес. ин-та гельминтол. - 1974. - Вып.14. - С.10-13.

8. Erschov V.S., Berezhko V.K., Kashlusky A..D., Naumytcheva M.I. and Nisehbaum I.A.. Allergic reactions in animals caused by soil end parasitic nematodes and the possibility of vaccination in helminth infections // Parasitic zoonoses. Clinical and Experimental studies. Bd. by K.I.L.Soulsby. Acad. Press. INC. - 1974. - P. 543-348.

9. Бережно B.K., Нисеноаум И.А. Вакцинация при гельминтозах ге-терологичвыии антигенами // Антропозоогельминтозы и перспективы их ликвидации. Тезисы дшл.научн.конф. - Самарканд-Тайляк. - 1975. -С.7-8.

10. Бережно В.К. Возможность иммунизации лабораторных животных гетерологичными нематодами против аскаридоза // Тр.. Всес. ин-та гельминтол. - 1975. - Т. 22. - С. 9-14.

11. Тараканов В.И., Берекко В.К. Вакцинация овец облученйыми дичинками Dictyocaulus filaria // ВНИЙТЭЙ - сельхоз.отдел обзорной информации. - 1976.

12. Берекко В.К. Повышение титра реагиновых антител у сенсибилизированных яичным альбумином морских свинок после заражения личинками Trichine11а spiralis// 3-й Международный симпозиум гельминтологического ин-та САН, Кошице. - 1976.

ГЗ. Berezhko У.К. Ее ag in-like, hemagglutinating and precipitating antibodies in Trichinellosis Kinetics // 4-Xnt. congr. of Parasitology. (19-26 August). - 1978. - Warszawa.

I«» Andreeva G.Я., Berezhko V.K. Protein spectrum and antigenic relationship between Dictyocaulus filaria, Neoaplectana glaseri, ip-balenctnis avenae and possibilities of their use imiminodl agnostic s of Dictyocanlosis // Jisiaa Congress of Parasitology. - Bombay. - 1978. -P. 71-72.

15. Беремо ВЛ. Реагиновые антитела в динамике грихинедлезной инвазии // II яонф. Украинского паразитов, общества. Тезисы докл. -I960. - Ч. I. - С. 71-72.

16. Бережко B.JC., Курочгиаа К.Г. Иммунрлогические изменения енворотди кров* оаец в процессе феномена естественного самоосвобожде-елв от гемонхов // Боаезь* оаец я меры борьбы с ними. (Тезисы докл. Jtaec. ваучл. ковф. ао инфекционным, .паразитарным и незаразным болезням овец. - 19BD. - С. 128-129-

17. Андреева Г.Н., Бережно B.K. Сравнительный имыунохиыический анализ некоторых видов нематод - паразитов растений, насекомых и с.-х. животных И Тр. Всес. ин-та гельминтол. - 1980. - Т.25.-С.15-21.

18. Бережно В.К., Курочкина К.Г. Иммунологические и аллергические изменения в слизистой сычуга и сыворотке крови овец в процессе гемонхозной инвазии // ГУ Inter. Symp. of the Helminthol. institute of the SAS Kosice, 1982 in High Tatras. - Czechoslovakia.-S.I3I-I32.

19. Береяко B.K., Курочкина К.Г. Динамика реагиноподобншс антител при экспериментальном трихинеллезе // Тр. Всес. ин-та гельминтол.-1983. - Т. 26. - С. 14-23.

20. Акулин ¡i.A., Бервлко В.К., Бузмакова P.A., Курочкина К.Г. Гельминтологические и иммуноыорфологические исследования при гемонхозь овец в процессе однократного заражения и суперинвазии // Тр. Всес. ин-га гельыинтол. - 1984. - Т. 27. - С. 5-12.

21. Акулин H.A., Береяко В.К., Курочкина К.Г. Влияние однократного заражения, супер- и реинваэии инвазионными личинками Haemonchus contortus на приживаемость гемонхов и иммунологические реакции у овец // Тр. Всес. ин-та гельминтол. - 1985. - Т.28. - С. 3-9.

22. Бережко В.К., Курочкина К.Г. Иммунные механизмы самоизлечения при гемонхозе овец // Проблемы ветеринарной иммунологии. -11., 1985. - С. 186-189.

23. Береыко В.К., Курочкина K.P. Гуморальный иммунный отвег у овец при экспериментальном гемонхозе в зависимости от срока суперин-вазирования // Тр.Все с. ий-та гельиинтол. -1985 .-Т.28 .-С .21-27.

24. Бузиакова P.A., Беренко В.К., Акулин H.A., Курочкина К.Г. Феномен самоосвобождения при геионхозе овец // Ветеринария. - 1985. -fe I. - С. 40-43.

25. Бережно В.К., Борошкоза 3., Бенкова М. Динамика иммуноглобулинов и иымунокомпегентных лимфоцитов у морских свинок при экслери-* ментальном аскаридозе // Паразитология.-1987.-Т.21.-fe 1.-С.50-57.

26. Berezhko Т.К., Akulin N.a., Buzmskova H.a., Kurochkina K.G. Immunoallergic reaction and phenomen of self-cure in experimental haeiaonchosis (Haemonchus controtus) of sheep depending on host's age // Helainthologia. - 198?. - v. 24. - P. 11^-131.

27. Береако B.K. Видоспецифичесние антигены гельминтов и ах использование в диагностике гельаантозов иьшуноферыентнш» методом // Тр. Всес. ин-та гельиинтол. - 1988. - Т. 29. - С. 8-22.

28. Береашо В.К., Роиаиенко JLH. Антигенное родс$во цесгод рода Taenia // Паразитология. - 1989. - Т.23. - к 2. - С. 153-158.

29. Берекко B.K. Сравнительная иммунохиыическая характеристика и серологическая активность антигенов Cysticercus tenuicollis и Taenia hydatigena // Паразитология.-1989.-Т.23.-№ 5. - С.399-406.

30. Берекко В.К., Тараканов В.И., Нисенбаум H.A. Авторское свидетельство й 4-743II. Способ изготовления противогельминтозной вакцины.197!

51. Benkova M., Boroskova L., Berezkova IT.К. Dynami. ka a distribue Ii T а В dependentnych Xymfocytov v Iflrmfoidnych organoch morciat pri expe-rimentalnej askaridoze/Aeterinarni Medicina. - 1984-. - 29> (LVII). -С. I. - 5^-4-6.

32. Boroskova L., Benkova №., Berezko V.K., Eosival J., Toth G. Stimulacny vplyv vitamimi A na T а В Lymfocyty pri experimentaInej askaridoze prasiat//Veterinami medicina. - 1985. - 30 (LVIII). - C.6, 331-556.

33. Бережно B.K., Пенькова P.A., Халина P.P. Сравнительный анализ белкового спектра Trichinella spiralis и Trichinella spiralis var. nativa // Материалы докл. к П-Ш Всес. конф. по проблеме трихинеллеза человека и животных. - 1985. - Ереван. - С. 63-65.

34. Бережко В.К. Иммунохиыический анализ и диагностическая эффективность антигенов из Taenia bydatigena и Cysticercus tenuicollis it 5-ая Закавказская конф. по паразитологии. - 1987. - Ереван. (18-20 мая 1987 г.). - С. 77-78.

35. Бережко В.К., Рсманенко H.H., Комарова О.И. Сравнительный иммунохиыический анализ цестод Taenia ovis ovis, T.ovis kratbei, T.parenchimatosa и T.hydatigena ¡J 5-ая Закавказская конф. по паразитологии. - 1987. - Ереван. (18-20 мая 1987 г.).- С. 78-90.

36. Шеховцов И.В., Бережко В.К., Написанова Л.А. Сравнительная эффективность РНИФ и ИФР в диагностике трихинеллеза свиней // Ветеринария. - 1989. - » 12. - С. 39-41.

37. Бережко В.К., Борошкова 3., Бенкова ¡i., Белозеров С.Я. Разработка режимов иммуноферментной реакции для диагностики ларвального аскаридоза // Тр. Всес. ин-та гелышнтол. - 1989. - Т.ЗО. - С. 26-33.

38. Berezhko V.K. Cysticercus tenuicollis antigens and diagnosis of cysticercosis. VII Int. Congr. Paris. - 1990. Syppl I.-Т.е. - S.908.

39. ßepecto B.K. Динамика развития гиперчувсгвительной реакции немедленного типа в уровня сывороточных иммуноглобулинов при экспериментальном трихинеллезе // Матер. 6-ой научи, конф. по проблеме .трихинеллеза человека и животных. - 1992. - Г.Киров'. - С. 39-44.

40. Berezhko V.T Thmemics of the reaction of hyper sensitiveness of immediate type in experimental trichinellosis. // 6 Intern, conf. on Trichinellosis. - Orvieto, Italy 7-10 september-1995.