Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Иммунохимические методы оценок в селекции хлопчатника на устойчивость к фузариозному вилту

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимические методы оценок в селекции хлопчатника на устойчивость к фузариозному вилту"

РОССИЙСКАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕЛй1Я НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

ИЛШУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНОК В СЕЛЕКЦИИ ХЛОПЧАТНИКА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУЗАРИОЗНОМУ ВИЛТУ

Специальность: 06.01.11 — Защита растений от вредителей

и болезней

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

ИЗЗАТ МОХАМЕД ХУСЕЙН

УДК 632.938,1:033.511

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Диссертационная работа выполнена в лаборатории иммунитета растений ВИЗР.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Гусева Н. Н.; доктор биологических наук, профессор Лескова Л. Я.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Гав-рилюк И. П.; кандидат биологических наук Ларина Э. И.

Ведущее учреждение — Институт биохимии им. Баха РАН.

Защита состоится 30 апреля 1992 г. в /2 час. на заседании Специализированного совета при Всесоюзном институте защиты растений по адресу: 189620, Санкт-Петербург—Пушкин-6, шоссе Подбельского, д. 3, ВИЗР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института защиты растений.

Автореферат разослан

1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

Г. А. Наседкина

Плата I. ВВЕДЕНИЕ-

Хлопок - культура чрезвычайно гатнгя и народной хоияРст-ве многих стран мира, в том числе'и в Египте. Ота культура в Египте является древнейшей. По мере увеличения урожаев нарастала вредоносность возбудителей вилта - фузариоэного и верти-циллезного происхождения. Во всем мире самый экологически и экономически оправдавший метод защиты от болезней - в!ращива-иие устойчивых сортов. А для того чтобы вывести новый сорт, надо владеть методами иммунологии.

Для селекции важно прежде всего владеть методами для ди-' агностики изменчивости патогена, а также методами определения устойчивости сортов.

Кардинальной проблемой фитоиммунитета является быстрая триспособляемость фитепатогенных грибов к сортам в ходе их сопряженной эволюции. Это приводит к обесцениванию новых устойчивых сортов. Поэтому решение вопросов сопряженности развития паразитов и хозяев, прогнозирования характера изменений з популяциях грибов и будет способствовать оснащению селекции «выми методическими подходами, направленными на создание сортов, способных длительное время сохранять устойчивость к болез-мм при воздельшании в производстве.

Актуальность темы. Для ускорения селекции необходимо ис-юльзовать методы иммунологии, позволяющие решать два основ-шх вопроса: изменчивость гриба и устойчивость растений хлоп-ттника. В Египте издавна ведется селекция сортов,относящихся : видам й.ЪзгЪайепзе и й.Ыгзц-Ьит. Возбудитель фузариоза )аспространен пр всем зонам возделывания культуры, поэтому подавленные методические исследования актуальны для решения во^* гросов селекции хлопчатника в .Египте,

Новизна исследований. Для системы "Хлопчатник - возбуди-'ель фузариоза" подтверждена перспективность использования ме-■одов анализа белков для.определения агрессивности клонов и вычленил устойчивых сортообразцов. Показана большая агрессивность :лонов гриба южной группы (район Сахаг). Рекомендована характе-1истика. клонов по\иммунохимическому и биохимическому анализу

- г -

белков, активности пектолитических ферментов и фузариевой кисло-тп. Для характеристики устойчивости использовали метод Ухтерло-ни и ш.шунофореза по Грабару.

Целью настоящего исследования и являлось обоснование селекции устойчивых к фузариозу сортов хлопчатника с использованием иммунохимических методов.

Для этого предстояло решить следующие задачи:

1) собрать в основных регионах возделывания хлопчатника в Египте изоляты гриба, получить клоны и характеризовать их по ' агрессивности и вирулентности;

2) осуществить получение сывороток к белкам патогена, адаптировать к системе "хлопчатник - возбудитель фузариоза" методики иммунохимических анализов;

3) охарактеризовать сорта хлопчатника Союза и Египта по фу-зариозоустойчивости иммунохимическим методом;

4) разработать методики иммунохимических исследований по белкам из зелёных растений и корней хлопчатника»

. Глава 2. МАТЕРИМЫ И МЕТОДУ ИССЛДОВАНИЙ

Гриб выделяли из растений в 4 основных регионах возделыва- . ния хлопка в Египте. Для проведения анализов были использованы сорта из коллекции ВИР 6 сортов, 2 сорта - из Египта'и 8 сортов из Туркмении.

Для выделения грибов .из пораженных растений корни и стебли, тщательно промытые водопроводной водой.и поверхностно простери-лизованные 7С$ спиртом, промывали стерильной водой и.разрезали на кусочки таким образом,' чтобы захватить пораженное пятно и часть тканей вокруг него; раскладывали на агаровую среду.Чапе-ка-Докса и чашки Петри. Стерилизация была.проведена концентрированной серной кислотой.

Проводилось клонирование популяций возбудителей увядания.' Для характеристики агрессивности использовали биохимические тесты: активность некоторых гидролитических ферментов и спектро-фотометрическое определение фузариевой кислоты. Спектрометрическое определение фузариевой кислоты проводили по Нс^тап (1955

в модификации Оголовца (1906).

Выделяли белки из листьев и корней хлопчатника по методике (ВИЗР (1982). Сыворотку готовили путем введения кроликам соответствующего антигена.

При иммунохимическом анализе белков постановку реакции осуществляют в 1% геле агар-агара.

■ При кругообразном расположении в центральную лунку помещали антисыворотку, периферические лунки заполняли гомологичным и гетерологичными антигенами.

Различия в белках изучаемое объектов выявляли также методом иммунозлектрофореза. Эти различия отражались в числе полос преципитации и расположении их на иммуноэлектрофореграммах.

Глава 3. ШМУН0ХШ1ЧЕС11ИЕ МЕТОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ ГРИБА-ВОЗБУДИТЕЛЯ ФУЗАРИОЗА ХЛОПЧАТНИКА

Возбудителями фузариозного увядания являются грибы, принадлежащие К виду РизагАит озгусрогии Г.уазЗл^есЬига.

Современное представление о белках, как носителях феноти-пических свойств живого организма, дают основание предполагать возможность использования их структурных различий в качестве тестов, свидетельствующих о генетической гетерогенности отдель-ы ных таксонов.

В целях обнаружения этих различий изучаются электрохимические и иммунологические свойства белков.

Иммунологическая разнородность белков различных организмов может быть вьявлена с помощью серологического метода. Н.Н.Вое-Неег Т1960) отмечал, что " применение серологии предполагав!»' ценные дополнительные'возможности для исследования филогенетических связей среди грибов".

Большое разнообразие и исключительная изменчивость культу-ральных и морфологических признаков представляет значительные трудности для разграничения отдельных таксономических единиц этого рода, тем более учитывая интересы селекции.

Исследование природы изменчивости возбудителя, его морфоло го-культурал.ьных, цитофизиологических, кариологических, приспособительных, формообразовательных признаков, как в условии чистых культур (вне клетки хозяина), так и при взаимодействии клеток гриба с клетками хозяина-хлопчатника, дает возможность понять механизм заболевания вилтом, что в свою очередь является важннл фактором для сознательного подбора средств защиты растений и важно для селекции.

В природе встречаются очень много штаммов фитопатогенних грибов, в том числе и возбудителя вилта хлопчатника, которые различаются между собой по культурно-морфологическим особенностям и по степени агрессивности в отношении к питающему растению Существующие методы оценки агрессивности штаммов (искусственные заражения, вьращивание хлопчатника на зараженных фонах и др.) требуют много времени, определённых условий работы.

В Египте условно можно выделить 3 основные зоны возделывания хлопчатника: , '

I - северная - Дельта, П - центральная - Асыот, Ш - южная - Сахаг (рисЛ).

Во всех зонах имеет распространение сорт Дандара, в серев-ной зоне, кроме него, высеваются сорта.группы Гиза. •

С основного сорта в 3-х зонах проводилось выделение гриба, чтобы представить популяции возбудителя фузариоза в этих регионах . .

Для характеристики штаммов пользовались традиционными фи-топатологическими методами. Заболевание учитывалось в динамике: на 15, 30^ 45 день после заражения. ' .'•

Бее штаммы показали достаточно высокую патогенность, и все они имели характеристики,' свойственные виду Раааг1ит охуарог!ш £ .уаб1^ес-Ьит (табл.р.

Из 13 штаммов было выделено 4 для дальнейшего изучения их гетерогенности: №№ 13, 8, I, 10.

Проводилось'клонирование штаммов на среде с ограничителями роста, для получения 30 клонов из каждого штамма. Ставилась задача выделить на первом этапе 'наиболее агрессивные клоны,

Рис. 1, Карта расположения хлопкосеющих регионов . в Египте

Таблица I.

Динамика развития болезни при заражении сорта Дандара штаммами Риааг1ша охузрог1ит f,vasinfвotuзa, представляющими популяции разных регионов Египта

штаммов Происходив Динамика развития болезни, %

1Ь день 30 день 45 день

I 0 . _ Дельта ' 50,0 20,0 73,3 20,0 96,6 36,6

3 — 33,3 50,0 60,0

4- Гиза 30,0 30,С 60,0

5 50,0 63,3 06,6

6 — 33,3 60,0 73,3

7 — 8 - Зл Минья ■ 40,6. 63,3 «3313 66,6 93,3 100

9 - . 36,6 63,3 66,6

10 Асьют 53,3 66,6 ■ 100

II — 40,0 ■' 76,6 . 86,6

1.2 — Сухаг ЬЗ у 3 80,0' 80,0

13 • 50,0 76,6 ' ' • 96,6

используя показатели активности' пектологических ферментов, в частности, полигалактуроназы. Также использовали-тест-активность специфического токсина - фузариевой кислоты.

Далее проводилась оценка О наиболее агрессивных 'клонов по характеристике их свойств, используя тест "белок к белку", Таким образом была использована следующая схема оценок возбудителя фузариозя хлопчатника: -

13 изолятов дали 13 штаммов и. вс,е они были патогенные, 4 штамма по 30 клонов составили материал для анализа гетерогенности популяций, представляемых ¡этими штаммами. Было выделено 0 наиболее агрессивных по активности полигалактурона-

Таблица 2.

Наиболее агрессивные клонк штаммов, выделенные из разных популяций гриба, охарактеризованные по биохимическому тесту - активности полигалактурназы

штамм 13 штамм 8 штамм I штамм . 10

клон макс. показ. клон макс. показ. клон макс. показ. клон макс. показ.

актив .,относ. актив. ,относ. актив. ,относ. актив., относ.

день един. день един. день един.- день един.

4 б. . 58 5 6 59 10 18 69 19 6 58

3 16 . 58 15 14 69 ' 12 6 58 27 6 91

5 . 6 58 28 б 80 16 18 58 28 6 69

9: 18 58 30 22 69 26 ' 18 69

13. 14 58 30 10 58 _

14 18 58

15 10 59

24 6 ' 80

эн и фузариевой кислоте.

Приведем результаты оценки клонов по свойствам агрессивности, используя тест-активность полигалактуроназы ПГ (табл.2)

Анализ полученных.данных показал, что фермент активен у всех клонов ьсех 4 штаммов гриба. Однако характер проявления активности у разных клонов был различным. Так, клон I шт. 13 имел активность фермента ПГ с 6 по 14 день, на 18 и 22 сутки фермент не определялся. Такая же закономерность отмечена у клонов штамма 1-1, 4, 7, 9, 17, 18, 23, 30. Таким образом, проявление активности ПГ с динамикой до 14 дня характерна для 8 клонов .только у штамма № I.

Максимальное проявление активности ПГ отмечалось в сроки с б по 14 день, далее по учету - 18 и 22 дни по всем клонам отмечено снижение активности ПГ. К числу наиболее агрессивных отнесены все клоны, имеющие показатели более 50 (в относительных единицах).

Самое большое число агрессивных клонов было выделено у штамма 13 (8 из 30), затем у штамма I (5 из 30) и наименьшее

- '3 из 30 у штамма 10. ■ ; .

Самый высокий показатель имел на б день клон 27 шт. 10 ■

- 91 отн. единиц.

Наибольшее количество клонов с активной фузариевой кислот той имел штамм 8, а наименьшее - штамм 10: 27 и 5, соответственно.

. К 18-22 дню у всех клонов с активной фузариевой кислотой отмечено увеличение количественных показателей. Максимальные показатели синтеза фузариевой кислоты отмечены у 24-го клона штамма I •- 45,98 и 10-го клона штамма 13 - 45,86 (табл,3).

Активность фузариевой кислоты и ЦТ по 3 клонам, штамм 13 в динамике показана на рис. 2 и 3.

Все наиболее агрессивные клоны 4-х штаммов гриба имели достаточно высокие показатели степени заражения: от 56,6 до 90,0. Причем у одних клонов'отмечался низкий синтез фузариевой кислоты и повышение активности фермента полигалактуроназы'(например ,. клон 4 штамма I, клон 14 штамма 13, клон-5 штамма 10,

Рис .'¿. Активность синтеза фуэариевой кислота .у клонов штацца 13

Рис. 3. ''Активность ПГ у ялонов штамма 13'

клон 4 штамма 8). У остальных клонов отмечено равно высокое содержание и того и другого показателя агрессивности.

Важным показателем патогенных свойств гриба является наличие перекрестнореагирующих белков. Для характеристики результатов реакций преципитации имеет значение проводимость белка по. агаровому субстрату и место положения полосы преципитации от старта.'

Если сопоставить результаты определений реакций преципитации по разнш концентрациям антигена, то концентрации 3 мг/мл являются недостаточными, а 13 - избыточными. Оптимальной концентрацией является б мг/мл.' Приведем для сравнения результаты по анализу клонов (табл.4).

Таблица 3.

Сопоставление биохимических характеристик с показателем агрессивности по кланам

1! штамма I? клона 'Макс.содержание фуз.к-ты, мкг/мл Макс.содержание ПГ, отн.ед. .'Максимальные поражения,

I 2Ь 24 4 • 33,4 46,0 •1,7 40 32 40 ' '70,0 70,0 86, б

13 10 20 • 14 45,8 34,0 0,3 ■ ■ 40 . Ь0 ' ■ 90,0 • 63,3 76,6

0 23 7 4 35,3 , 24,0 ' 10,5': 40 49 ' 32' .63,6 73,3 ез

10 . 21 20 и. 34,Ь 12,7 0,0 32 40 32 ■ 83,3 06, с 80,0

Таблица 4.

Зависимость реакций преципитации от концентрации

антигена

Концентрация Полож. реакций преципптации с белком клонов антигена, -

мг/мл

14 шт. 13 10 шт. 13 смесь 12 клонов

3 4.4 5

6 . ' 10 II ' 9

13 5 9 4

При концентрации 3 мг/мл образуется в 2,5 раза меньше реакций, при 13 мг/мл - почти в 2 раза меньше.

Важно также установить как различаются реакции преципитации при получении сывороток к белкам отдельных клонов и их смеси.

Приведем п таблице 5 результаты по этим опытам.

Таблица 5.

.Реакция с клонами разных штаммов сыворотки к белкам клона 14 шт.13 (из культуральной жидкости)

Клоны штаммов

Расположение полос преципитации, мм

0,5-1 2-3 4-5

I ' '0 + , О

8 О О О

10 О О О

13 0 + - +

Таким образом, у клонов штаммов 8 и 10 не отмечено полос преципитации. Самые интенсивные реакции отмечены у клонов штамма 13. Та же -закономерность отмечена при получении сыворотки к клону 10 того хе штамма 13.

Таблица 6.,

Реакция клбнов разных штаммов к сыворотке, полученной к белкам клона 10.штамма 13 из культуральной жидкости

Клоны штаммов Расположение полос преципитации, мм.

0,5 - I 2 - 3 4-5

I . 0 + + .

8 . 0 + ' +

10 0, 0 0

13 + 0 +

Если получить сыворотку к смеси клонов из разных штаммов (в наших опытах их было 12 из 41, то результаты бупрт следующими (табл.10. .

Таблица 7.

Наличие положительных реакций преципитации у клонов гриба при разной концентрации антигена

Кснцент. антигена, мг/мл Положительные реакции к сыворотке грибницы клонов

14 шт. ,13 10 шт. 13 , смесь 12 клонов

3 3 ' 3 4

б 3 ; з ;• 7-

13 . • 2 ' 4 Б'.

Белки патогенов возможно выделить' как из культуральной' жидкости, так и из грибницы. Целесообразно было также подобрать концентрацию антигена. Если сопоставить реакции преципитации по тем же концентрациям антигена,' то картина наблюдается следующая: лучший вариант также был отличен при использовании .концентрации антигена б мг/мл (рис.4).Но если мы сопоставим результаты табл. 4 и 7,то легко можно убедиться в преимуществе

постановки реакций с белками гриба, вццсленнш из культураль-ной жидкости. Различия были почти вдвое: 34 и 61.

К объяснению этой закономерности можно высказать следующее предположение. Результаты взаимоотношений паразитов и растений хозяев решаются на уровне "ферйелт-белок" или "фермент-субстрат". При исследованиях в области иммунитета Т.Н. Федотова, Н.Н.Гусева, Б.В.Громова использовали результаты анализа белков альбуминов. Эта группа белков содержит основную массу ферментов, число которых составляет многие десятки. Поэтому возможно^ и в наших опытах белки из культуральной жидкости гриба дали большое число положительных результатов и как заключительный вывод из исследований по изменчивости гриба - возбудителя фузариоза хлопчатника - можно отметить большую патоген-ность клонов, принадлежащих штамму 13. Они же характеризовались и большой агрессивностью,.

1Н|И К.ж <.Ик1> Х>/ сНеЛО

0 о

57 ЩО О С

Чм 9 *

РН '¡¡1[* к >ч

О

И||3

I ф

ЮЦ? О

Ч ¡13

14 ^ ' нЦ{ и¡13

Рис 4. В центре - антиген 6 мг/мл

по периферии - сыворотка концентрированная к белкам клонов гриба ■ .

Иммуноэлектрофоретический анализ белков из культуральной жидкости гриба (после удаления мицелия на 22 день роста) показал, что более эффективные реакции на Сыворотку белков к смеси 12 клонов, чем на один клон (табл. 8).

, Таблица 8.

Результаты иммуноэлектрпфоретического анализа ■ белков разных клонов

№№ клонов и штаммов Количество полос преципитации

к клону 10 штамма 13 к смеси 12 клонов.,

30 мг/мл 60 мг/мл 30 мг/мл 60 мг/мл

10-13 i 1 ++ • +

14-13 - - + +

28-13 - - - +

21-10 ++ . - +++++ + -Н- +

29-10 +-Н- ++ ++

7-8 - + - ++++

24-1 - + - +

23-8 +++ + ++ - -

25-1 - - - + .

Примечание: Выделены клоны 24/1, 14/13, 10/13, .. , 25/1, 28/13 и 7/8 (30 мг/мл), а также клоны 10/13, 14/13, 28/13, 21/10, 25/1 (60 мг/мл).

Глава 4. ШМУНОХИМИЧЕСКИЕ МКТ0ДН В ДИАГНОСТИКЕ УСТОЙЧИВОСТИ ХЛОПЧАТНИКА К ВОЗБУДИТЕЛЮ ФУЗЛРЙОЗНОГО ВШ1ТЛ

Свойство устойчивости растений определяется характерным обменом веществ в его генетической структуре, информация с которой реализуется в процессе биосинтеза белка.

Поэтому целесообразно использовать подходы, основанные на возможно большем разрыве е темпах сопряженной эволюции .паразитических органов и растений-хозяев, выборе исходных

форм растений, белки которых менее сходни с белками фитопато-гегнных микроорганизмов. •'

В 1935 году профессор Т.И.Федотова установила важную закономерность: наличие перекрестно-реагирующих антигенов растений и возбудителей их болезней как обязательного условия для возникновения патогенных процессов. Через три десятилетия это положение подтвердилось иммунохимическими и инмуно-электрофоретическими методами в ряде стран.

Подбор исходных форм для селекции на устойчивость следует проводить по.сравнительному анализу белков растений и патогенов, отдавая предпочтение менее сходным по белкам, что выявляется серологическим, иммунохимическим методами и при соединении метода электрофореза в ПААГ с иммунохимией.

Выли проведены сопоставления иммунохимического сходства сорта Аш-25 с перспективными в Туркмении сортами. Различая не были установлены.

Таблица 9. .

Устойчивость Реакция преципитации к в поле антигенам сорта Аш-25

' Аш-53 восприимчивый +3

■ Аш-54 средний по устойчивости +3

Аш-58 относительно устойчивый +2

Аш-60 восприимчивый -(3

8763-И восприимчивый , +3

9647-И воспиимчивый +3

Иммунофоретический анализ выделил лишь сорт Аш-58, который, по данным С.А.Седовой, показал себя как относительно устойчивый.

Электрофоретическое разделение белков семян разных по устойчивости-сортов тонковолокнистого хлопчатника не дает представлений о степени их устойчивости. Электрофоретотес-

кое разделение белков туркменской селекции показало различие по 1-2 фракциям в зоне белков с самой низкой электрофоретичес-кой подвижностью: .

Таблица 10. Различие в синтезе белков ПЛАТ

Сорта

. Белковые фракции с

0,05 0,12 0,20 0,29 0,37 0,46, 0,65 0,72 0,79

Аш-25 + ■+ 4 4 4 4 . 4 4 4

6763-И + + . ' + 4 4 4 • 4 . 4

9732-И. - + • 4 • 4 4 4 4 4

9647-И - + . + 1 4 4 4 4 4 4

Аш-25, по данным С.А.Седовой, является более устойчивым , однако по спектрам белков можно лишь сказать, что сорта все близки по альбуминам..

Испытывались сыворотки к белкам культуральной жидкости и • грибницы, разные их концентрации и разведение. Результаты приведены в таблице II.

Таблица II.

. Реакция преципитации белков из корней и листьев с сыворотко: белков культуральной жидкости и грибницы

Части

расте- Поражаемость ния растений

Реакция преципитации с белком* 30 мг/мл 60 мг/мл 30 мг/мл 60 мг/мл

культуральной жидкости

грибницы

Корни .Здоровые 4 4444 _ —

Корни Больные' . • 4 44 44 -

Листья Здоровые 44 44 44' +

Листья Больные 44 '44 44 4

- сыворотка получена к смеси 12 клонов.

4 Рис. 5 ШБ)

• Ч»» <?Г , Г—*» л-г-лг г» — с ~~ • 1

■./• . •'• *?Ч 'Ч

* '* V. .'ч. )

Рис.

' . " ^г''

Рис. 5.Б.

Реакция Ухтерлони белков семян сортов разнггх по устойчивости групп отличаются по расположению линий преципитации от старта

На рис.Ь представлены результаты определения степени устойчивости сортов группы Тащчент (верхний рис. Б.А и с-4727,

(нижний рис! ¡¡.П) к сыворотка!.! к возбудителю фуоариппного увядания.

Положительная реакция отмечена практически со всех вариантах: из корней и листьев. Использование увеличений • концентраций - в 60 мг/мл картину но изменило.

Для определения свойства устойчивости растений хлопчатника' к фузариозному увяданию нами бил отобран метод с использованием сывороток к экзопродуктам патогена.' Известно, что . растения характеризуются возрастной устойчивостью. Исследованиями было установлено, что существует специфика взаимодействия патогена и растения, выявляемая на молекулярном уровне в связи с возрастными изменениями в метаболизме расте -ний. Поэтому стремились установить наличие .иммунохимического сходства протеинов, характеризующих разные органы растения (лист, корни, семена)/ чтобы можно было составить представление о растении как о целостном организме.

Следует, сказать, что белки, выделенные из вегетирующих-растений (листья и корни), обнаруживают слабое иммунохимичес-кое сходство с протеинами экзометаболитов гриба. Это обнару-• живается в наличии одной полосы преципитации в иммунофорети-ческом анализе.

Белки семян хлопчатника оказываются более сходными с протеинами патогена, и в частности, с его окзолродуктами, что обнаруживается в образованиям нескольких полос преципитации. При этом следует сказать, что выявляется это сходство у всех сортов с белками агрессивного клона 10/13, Интересен и тот факт, что взаимодействие патоген-хозяин на молекулярном уровне, с антигенами сортов египетской селекции отличается от взаимодействия с сортами селекции АзНПХИ и СЛФ-ВМР. Белки та-•■ ких сортов, как Лндгекгн-9 и Андижан-П, селекции САФ-Узбекис-тан вообще не обнаруживают полипептидных цепей иммуносходных ни с одним клоном гриба египетской'популяции. Белки ае образ, цов 3038, 104, 38 селекции ЛзНИХИ образуют в перекрестной им-мунохимическоР реакции по одной полосе преципитации только с агрессивным клоном. Это и не удивительно, поскольку патоген .выделен из популяции гриба, распространенного в Египте. Несмс ря на то, что гриб - факультативный патоген, все же обнаруживается его приуроченность к сорту Дандарп, который возделыва-

ся около 30 лот. При иммунофоретическом анализе почти весь ектр белков семян этого сорта обнаруживает сходство с про-инами агрессивного клона. Другой сорт - Гиза, также египет-ой селекции, но возделываемый последние 5-7 лет. Он предвидя ет интерес тем, что каждый год возделывается новая лия этого сорта.

Естественно предположить, что генетические реакции между ниями по тем или инш признакам, в том числе по устойчивос-к фитопатогену, невелики. Поэтому и приуроченность патоге-к растениям этого сорта также выявляется в наличии лишь скольких полос преципитации.

Значительный интерес представляют полипептидные цепи, означенные нами " & ", которые у всех сортов участвуют в рекрестнюс реакциях с антигенами патогена. Во всех этих по-:пептидлх идентифицируются фитогемагглютипинм сходные с^локнам и листьев.

Известно (Громова, 1,986, 1988; Любимова, 1980), что фито-магглютинины обусловливают неспецифическое взаимодействие с .тогеном и, очевидно поэтому не могут быть показателями вос-

1иимчипости.

В соответствии с изложенным мы считаем, что взятье в ис-:едования сорта хлопчатника селекции ЛзИИХИ и СЛФ-БИР к кло-' 10/13 устойчивы.

Хотелось бы отметить разрешающие возможности двух методов, ¡ше описанные данные получены методом иммунофореза, но если 1 мы ограшгчились реакцией преципитации в модификации Грабера !962), то не смогли бы решить вопрос'о таксономии перекрестно ¡агируюцих антигенов, поскольку в этой-модификации полосы пре-шптации не давали никакой другой информации,' кроме как 'о нашим перекрестно реагирующих антигенов и в некоторой степени ) их количестве. Что свидетельствует о необходимости ислоль->вания метода иммунофореза с целью определения устойчивости ютений к фузариозному увяданию. .

Следует, еще отметить использование белков вегетирующих ютений хлопчатника для диагностики по ним устойчивости к папину. Установлено, что белки листьев и корней растений об-

нарухиваю'т иммунохимическое сходство с эндопротеинами патогена (мицелий) в противоположность белкам семян. Его не выявляют у исследуемых сортов.Только на основании таких данных можно сделать вывод о непоражаемости растений. Однако . данные, полученные в перекрестных реакциях протеинов листьев и корней на примере сорта Дандара, свидетельствуют о том, что полипе*1-тидние цепи с катодной подвижностью сходны с протеинами обоих клонов. У растения больше полипептидных цепей/сходных с более агрессивным - 10/13 клоном патогена, чем с Ыалоагрес- ■ сивным 14/13. '

В данном варианте сочетаний антиген-антитело, так же,как в системе антиген (семена) - антитело (экзопродукты) - обна-а руживают сходство с патогеном фитоагглютинины листьев, на биологической функции которых мы кратко остановились ранее.

■ Наличие агглютининов - лектинов в листьях убедительно . показано с использованием сыворотки,•приготовленной к лекти-нам. В биополимерах корней также идентифицированы фитоагглютинины. Они обнаруживают сходства с экзопродуктами .патогена. Но нам не представилось возможности установить,сходны ли они с эндоантигенами патогена, что представляется необходимым осуществить в дальнейших исследованиях.

Исследования, направленные на раскрытие природы паразитизма в системе патоген-хозяин, выдвигают задачу изучения взаимоотношения растения с патогеном на уровне его экзогенных продуктов обмена и их иммуыохимических свойств.

Прежде чем выявлять иммунохимическое сходство белков растения-хозяина и экзопродуктов патогена, необходимо выявить их биохимическую природу, а также определить иммунохимические свойства, позволяющие уловить тонкие структуры различия, будь то белки, гликопротеиды, полисахариды, нуклеопротеиды.

По данным литературы, экзопродукты представлены очень сложным комплексом-веществ. Среди экстрацеллюлярных ваделений фштопатогенов определяются липиды и жирные кислоты (Корнилова Агеева, Кузнецов, 1966), вещества, обладающие цитокининовой активностью (Витол, Попов и др., 1986), углеводы (Проценко, Смирнова, Щербухин, 1966), также гидролитические ферменты как

протеазы (Новикова, Выборных и др., 1986), амилазы ( и,;.Усг

1964).

Для проведения этих исследований культуральную жидкость, получоннур после выращивания грибницы разных рас возбудителя фитофтороза, концентрировали и диализировали, чем и освобождались от низкомолекулярных соединений. В 'иммунохимических свойствах белково-ферментного комплекса экзогенных продуктов обмена патогена были обнаружены различия, характеризующие специфичность исследуемых патогенов. Это выражалось в специфических иммунологических спектрах при использовании гомологичных антигенов и снворотов. Наряду с этим в иммунохгалическом спектре культуральной жидкости разных рас также¿как и в белках грибницы патогена обнаруживаются компоненты белков, характерные, по-видимому, в целом для вида патогена. Эти компоненты выявляются в белках культуральной жидкости сывороткой, приготовленной к экзобиополимерам водораств'ордаых белков грибницы.

Определив специфичность белкового коматекса экзогенных продуктов обмена патогена, нам представилось возможным провести работу по выявлению иммунохимического сходства указанного комплекса с протеинами растения. В результате анализа проведенной работы нами обнаружено, что-спектр иммунохимического сходства довольно специфичен.

Контролем за тем, какие полипептидные цепи белков семян проявляют иммунохимическое сходство с антигенами патогена, является электрофоретический спектр. На основании данных о элек-трофоретических фенотипах сортов можно судить о их генетической близости или различии.

Вс;е исследованные сорта при. наличии сходных по подвижности полипептидных цепей характеризуются большой вариабильнос-тью спектра, или фенотипа сорта. Ото можно продемонстрировать, проанализировав сорта селекции разных институтов. Так, сорт хлопчатника селекции СЛФ Андижан II больше "похож" на 108 Ф по представленности полипептидных цепей с катодной подвижностью.

Андижан-9 отличается по подвижности в геле агар-агара эт протеинового спектра семян Андижан^!! и от всех проанали-

зированнкх иортов.

Сорт хлопчатника 33 и 104 селекции АэНИХИ, хотя и характеризуется устойчивостью к клону египетской популяции патогена, но по спектру белков у них выявляются различия, определяемые' в анодной части протеинограммы. Сорт 3038 по числу фракций и их электроподвижности похож на растения сорта 33, но при этом и отличается от них по количеству белка во фракциях. . А 4 сорта египетской селекции незначительно отличаются друг от друга. Гиза отличается от Дандары наличием одной- лишь полипептидной цепи у с.тарта.

Установлено, что ни с числом полипептйдных цепей (элек-трофоретических фракций > ни с количеством белка в них не представляется возможным срязать характеристику сорта'по признаку устойчивости к возбудителю фузариоза. Это возкожно осуществить, что и было выполнено;лишь на основании изучения имму-нохимических свойств белков "партнеров", а именно установив у них перекрестно, реагирующие белки.

В К В 0 Д Ы

1. Изоляты Из популяции Уис!пг1шп. ог^/ярогчп Г.

бьяи отнесены к патогенным штаммам, клонированием в последующем исследовании и охарактеризовали по агрессивным свойствам.

2. Все клоны имели различия по активности пектолитичес-кий фермент ^ полигалактуразу, наибольшая активность которой проявлялась на 6 день.

3. У всех клонов отмечено образование активной фузариоз-ной кислоты на 6-18 день, преимущественно на 6 день.

4. У большинства клонов отмечено равно,высокое содержание ПГ и фузариевой кислоты. Однако' у 4-х клонов отмечена низкая активность фузариевой кислоты и высокая активность фермента ПГ.

5. Подобрана оптшальная концентрация антигена ~ мг/мл показана перспективность получения сыворотки к белкам из:г кул! туральной жидкости гриба.

6. Выделены как более агрессивные и вирулентные клоны 13 штаммов южного региона возделывания хлопчатника в Египте.'

7. Для диагностики устойчивости перспективного использо-ания методов иммунофореза по Грабару и установления иммунохи-ического сходства белков паразита и хозяина по Ухтерлони.

8. Из числа проанализированных сортов туркменской селек-ии нельзя назвать устойчивых. Относительной устойчивостью арактеризовалсл лишь сорт Аш-25.

9. Из сортов египетской селекции более устойчив Гиза. орт дандара показал себя как средний по устойчивости.

10. Установлено, что взаимодействие возбудителя фузариоза растений хлопчатника на молекулярном уровне связано с особой руппой биополимеров - лектинами.

Ими обуславливается проявление неспецифическая реакция в истеме патоген-растение.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Целесообразно выделять белки из культуральной жидкос-и патогена и использовать антиген в концентрации 6 мг/мл.

2. Патогенные штаммы- гриба рекомендуется клонировать и ыделять более агрессивные клоны по биохимическим тестам активности фузариевой кислоты и полигалактуразы).

3.- Белки растения следует выделять из корней и листьев ' астений и при получении сыворотки использовать апробированную ами схему.

4. В селекции хлопчатника в Египте учитывать зональную пецифику популяций и степень устойчивости сортов.

усейн Иззат Мохамед. Изучение популяций-возбудителя фуза-риозного увядания хлопчатника для оценки на устойчивость. - IX Всесоюзное совещание по-иммунитету растений к болезням и вредителям. Тезисы докладов. Минск, сентябрь 1991, т.П, ' ' с.193.