Характеристика транскрипционной и белок-связывающей активности промотора ретротранспозона LINE1 крысы

Федоров, Антон Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика транскрипционной и белок-связывающей активности промотора ретротранспозона LINE1 крысы
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика транскрипционной и белок-связывающей активности промотора ретротранспозона LINE1 крысы"

На правах рукописи

ФЕДОРОВ Антон Владимирович

Характеристика транскрипционной и белок-связывающей активности промотора ретротранспозона ШЕ1 крысы

03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Подгорная Ольга Игоревна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Корнилова Елена Сергеевна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

кандидат биологических наук, Галкин Алексей Петрович Санкт-Петербургский филиал института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Ведущая организация: Биолого-почвенный факультет

Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится «_зУ» июня 2006 года в ' О часов

на заседании диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, дом 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан мая 2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е В. Каминская

2ое><» А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Длинные диспергированные повторы LINEs (long interspersed nuclear elements) обнаружены в геномах многих высших эукариот. Элементы LINE являются автономными ретротранспозонами и способны размножаться в геноме с помошью механизма обратной транскрипции посредством РНК интермедиата; интегрированные копии LINE обычно фланкированы последовательностями TSDs (target site duplications). Наиболее распространенным семейством LINE млекопитающих, содержащим способные к ретротранспозиции элементы, является LENE1 (L1). Ретротранспозоны LINE1 появились незадолго до дивергенции млекопитающих около 100 миллионов лет назад и продолжают реплицироваться в их геномах; к настоящему времени L1 составляют примерно 1020% геномов млекопитающих (Furano, 2000). Элементы L1 содержат открытые рамки считывания ORFI и ORFII, кодирующие два белка, первый из которых -pORFI - является РНК-связывающим белком, специфически взаимодействует с транскриптами L1 и формирует рибонуклеопротеиновые частицы; второй белок обладает активностями обратной транскриптазы и эндонуклеазы. Предполагается, что оба эти белка необходимы для ретротранспозиции LINE1 (Ostertag and Kazazian, 2000).

Данные о функционировании элементов L1 и их возможной роли в рекомбинации, репарации двунитевых разрывов, ретротранспозиции клеточной ДНК, организации структуры хроматина, геномных перестройках и регуляции транскрипции близлежащих генов больше не позволяют рассматривать повторы L1 лишь как паразитическую ДНК в геномах (Ostertag and Kazazian, 2000; Furano, 2000). Очевидно, что свое влияние на геном элементы L1 могут оказывать просто благодаря тому, что составляют значительную его часть. Однако наиболее существенное воздействие элементы L1 реализуют посредством своей экспрессии, и последующей ретротранспозиции, а также предоставляя клетке обратную транскриптазу.

Экспрессия повторов L1 тканеспецифична, у мыши и человека она выявлена на определенных стадиях развития мужских половых клеток (Branciforte and Martin, 1994; Ergun et al., 2004), в клетках тератокарцином и в некоторых других опухолях (Swergold, 1990; Martin and Branciforte, 1993). Кроме этого, у мыши экспрессия L1 обнаружена в эмбриогенезе на стадии бластоцисты (Packer et al., 1993) и на определенных стадиях развития женских половых клеток (Trelogan and Martin, 1995). Репрессирование транскрипции L1 наблюдается в большинстве дифференцированных соматических клеток (Ostertag and Kazazian, 2000). Нарушение контроля регуляции экспрессии ретротранспозонов L1 может приводить к катастрофическим последствиям дестабилизации генома (Bourc'his and Bestor, 2004) и играть роль в малигнизации клеток (Yoder et al., 1997). Следовательно, существует четкий контроль активации и репрессии этих повторов in vivo. Однако механизмы такой специфичной регуляции экспрессии L1 до сих пор мало изучены.

Ретротранспозоны L1 транскрибируются РНК-полимеразой П (Ostertag and Kazazian, 2000). За транскрипционную активность элементов L1 отвечают последовательности, расположенные в 5'-нетранслируемых районах этих повторов

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ ' БИБЛИОТЕКА С.-Петербург

(Furano et al., 1988; DeBerardinis and Kazazian, 1999; Swergold, 1990). В отличие от областей, кодирующих белки, 5'-нетранслируемые районы L1 разных видов не являются гомологичными (Ostertag and Kazazian, 2000; Furano, 2000). Единственная общая черта видоспецифичных, не содержащих ТАТА-бокса промоторных районов L1 заключается в их GC-обогащенности и большом содержании динуклеотидов CpG (Furano et al, 1988; DeBerardinis and Kazazian, 1999; Swergold, 1990). Взаимодействие ядерных белков с промоторными районами L1, вероятно, является одним из механизмов, регулирующих экспрессию L1. Только для элемента L1 человека идентифицированы промотор-связывающие белки, способные влиять на его транскрипцию, а именно транскрипционные факторы YY1, RUNX3 и белки SOX-семейства (Ostertag and Kazazian, 2000; Yang et al., 2003). Примечательно, что негомологичные промоторные области способны обеспечивать сходный характер тканеспецифичной экспрессии элементов L1 разных видов (Ostertag et al., 2002); это делает особенно важным изучение промотор-связывающих белков у разных видов.

В настоящей работе в качестве модельного объекта выбрана лабораторная крыса (Ratlus norvegicus). Крыса является хорошо изученным и доступным лабораторным животным, недавно завершена программа по секвенированию ее генома. Для элементов L1 крысы (LIRn) известна видоспепифичная промоторная последовательность, отвечающая за их транскрипционную активность (Nur et al., 1988). Однако до сих пор не идентифицированы белки, специфически связывающие промотор L1 крысы. Анализ первичной последовательности промотора L1 крысы показывает, что он не содержит сайтов связывания для известных белков, участвующих в регуляции транскрипции L1 человека. Можно предположить, что в регуляции транскрипции элементов L1 разных видов принимают участие разные транскрипционные факторы, которые, тем не менее, способны обеспечить сходный характер экспрессии. Анализ структуры промоторных районов и изучение белков, специфически связывающих промотор L1 крысы в сравнении с уже известными транскрипционными факторами, взаимодействующими с промоторами элементов L1 других видов, является актуальным т.к. позволит приблизиться к пониманию общих механизмов тканеспецифичной регуляции экспрессии повторов L1 в геноме.

Цели и задачи исследования. Цель данного исследования - изучение регуляции экспрессии LINE1 крысы (LIRn); анализ транскрипционной и белок-связывающей активности промотора ретротранспозона LIRn. Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи;

1. Проанализировать характер экспрессии LIRn в разных тканях; выбрать для дальнейшего исследования ткани с разным уровнем экспрессии белка pORFI.

2. Провести поиск регуляторных элементов, известных для промоторов L1 других видов, в первичной последовательности промотора LIRn компьютерными методами.

3. Выявить ядерные белки, специфически связывающие промотор LIRn in vitro, в исследуемых тканях. Подобрать условия очистки выявленных белков с помошью последовательных ионообменной и аффинной хроматографий. Определить их молекулярную массу и сайты связывания. Идентифицировать белки, специфически связывающие промотор ретротранспозона LIRn.

4. Определить статус метилирования промотора LIRn в исследуемых тканях, изучить влияние метилирования промотора LIRn на связывание с ним ядерных белков.

5 Методом иммунопреципитации хроматина проверить ассоциацию выявленных белков с промотором LIRn в исследуемых тканях ¡n vivo.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ретротранспозоны LIRn имеют разный уровень экспрессии в тканях крысы: дискретные смысловые транскрипты LIRn и белок pORFT синтезируются в клетках семенников, но не в клетках печени.

2. Промотор LIRn частично деметилирован в клетках, экспрессирующих белок pORFI.

3. Белки Sp3 и МеСР2, но не YY1, взаимодействуют с промотором LIRn in vitro и in vivo.

Научная новизна. Определен тканеспецифичный характер экспрессии ретротранспозона LINE1 крысы, впервые показано наличие смыслового полноразмерного транскрипта LIRn в клетках семенников. С помощью компьютерных методов анализа впервые установлены потенциальные точки инициации транскрипции LIRn. Биохимическими методами впервые идентифицированы белки, специфически связывающие промотор LIRn in vitro, -Spl и Sp3. Определен уровень метилирования промотора LIRn в разных тканях, впервые показано частичное деметилирование промотора LIRn в клетках семенников. Проведен анализ влияния метилирования промотора LIRn на связывание с ним ядерных белков in vitro. Методом иммунопреципитации хроматина впервые показано, что белки Sp3 и МеСР2 взаимодействуют с промотором LIRn т vivo. Впервые установлено, что лишь половина элементов LIRn в геноме крысы, содержащих обе открытые рамки считывания, имеет в своем составе промоторный район. Произведено сравнение полученных результатов с известными данными о факторах, влияющих на экспрессию L1 у других видов.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные являются существенным вкладом в представления о механизмах регуляции экспрессии ретротранспозонов L1 в геноме эукариот; настоящая работа имеет фундаментальное значение. Для очистки промотор-связывающих белков была адаптирована методика, основанная на сочетании последовательных ионообменной и аффинной хроматографии. Данный метод может быть использован для анализа других ДНК-белковых взаимодействий.

Материалы диссертации используются в курсах лекций для бакалавров и магистров Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 3 статьи и 5 тезисов. Основные результаты работы были представлены на 12-ой Европейской студенческой конференции (Berlin, Germany, 2001), на 8-ой и 9-ой Международных Путинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2004, 2005), на 19-ой конференции Вильгельма Бернарда по клеточному ядру

(Wuerzburg, Germany, 2005), на XV Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005) и на научных семинарах Отдела клеточных культур Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 2S7. публикации. Работа изложена на 1 /^страницах машинописного текста и иллюстрирована 4{о рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение ядер и получение ядерного экстракта. Ядра клеток выделяли из семенников и печени крысы (Rattus norvegicus) или из монослойной культуры клеток крысы линии С6 согласно описанному методу (Belgrader et al., 1991) при 4°С. Ядерный экстракт получали добавлением к препарату ядер пяти объемов буфера, содержащего 10 мМ Трис- HCl, pH 8.0, 0.1 мМ MgCl2> 0.2 мМ PMSF, 0.5 мМ ДТТ, 5% глицерина и 0.35 М NaCl. После инкубации 1 ч при 4°С, раствор центрифугировали при 8000g 30 мин и использовали супернатант в дальнейшей работе. Концентрация белка в ядерном экстракте составляла 4 мг/мл, экстракт хранили при 20°С.

ДНК, плазмиды и олигонуклеотиды. Фрагмент 5'-нетранслируемой области LINE1 крысы длиной 408 п.н. был клонирован с помощью праймеров LIFor 5'-АAGTCCCACACCCGCGATC-3' и LIRewl 5'-GTGCACCAGGGTTCCAGАТ-3' (все используемые в работе олигонуклеотиды были синтезированы фирмой "Синтол") и «TOPO ТА Cloning» набора (Invitrogen) согласно рекомендациям производителя. Клонированный фрагмент был сиквенирован и назван PRLP (Part of Rat LINEl Promoter) (GenBank № DQ279827). Фрагмент PRLP соответствует участку 47-457 п.н. в консенсусной последовательности промоторного мономера LI крысы (Hayward et al., 1997). Для включения [а-32 Р] -dATP (Amersham) в последовательность PRLP использовали метод ПЦР. В качестве неспецифического конкурента в экспериментах по ретардации, Саузвестерн-блоттингу и аффинной хроматографии использовали озвученную до средней длины 500 п.н. геномную ДНК Escherichia coli, а также фрагмент З'-нетранслируемой области LIRn (длиной 437 п.н.). названный 3UTR, идентичный зонду V в экспериментах по гибридизации (см. ниже). В качестве специфического конкурента использовали амплифицированный с помощью ПЦР фрагмент PRLP. Олигонуклеотиды: nodel 5'-ТСAGGTGGGCАСТСС-3', shor 5'-GАТСТСAGGTGGGATAC-3'. delb 5'-AGATCCACTCCATACGA -3', Splwt 5' -ATTCGATCGGGGCGGGGCG AGC-3', Splmut 5'-

ATTCGATCGGTTCGGGGCGAGC-3'. YYlwt 5'-ATGTCAGCGCCATCTTGTAAG-3', Ebox-like 5 '-AG ATCCAGGTGATACGA-3' вместе с соответствующими комплементарными партнерами отжигали в эквимолярных количествах. Специфические консенсусные сайты связывания для транскрипционных факторов Spl (Kadonaga and Tjian, 1986) и YY1 (Becker et al., 1994) подчеркнуты, мугированные нуклеотиды указаны жирным шрифтом. Фрагменты олигонуклеотида

nodel в составе последовательностей shor, delb и Ebox-like подчеркнуты двойной линией. Олигонуклеотид nodel соответствует положениям 125-139 п.н. в консенсусной последовательности промоторного мономера L1 крысы. Олигонуклеотид nodel и его комплементарный партнер дополнительно содержали на 5'-концах последовательность 5'GATC для введения радиоактивной метки. В качестве зондов для гибридизации нуклеиновых кислот использовали фрагменты LINE1 крысы I-V (см. Рис. 1, А), меченные biotin-11-dUTP (Силекс) или [а-32 Р] -dATP (Amersham). Для амплификации фрагментов I-V использовали пары праймеров LIFor, LIRew 5'-GTCTCTCAGGCACAGGGGT-3'; Tethfor 5'-AGTTCTCTGCACCCAAATCC-3', Tethrew 5'-CGCCATCAGATTATCTCTAGTG-3'; ORFI-7 5'-CACTAGAGATAATCTGATGGCG-3 bhl5 5'-

CTTGTATCTACAGCTCCTTG-3'; P3620c 5'-

ATGGAAATAGAACCAATCAAGAAAG-3', P3622c 5'-

GTTTCTTGCTTCTTCTAGGGTATAG-3 ' ; E21 5 ' - A AC AG AG ACTG A AGGA A -3 ', E23 5'-AGTCTAGTTCACTGGGG-3' соответственно. Однонтевые зонды получали методом ПЦР с одним праймером на соответствующем очищенном фрагменте LINE1 крысы. Все манипуляции с ДНК проводились согласно описанным методам (Sambrook et al., 1989).

Метод торможения в геле (ретардация). Для выявления ДНК-связывающей активности использовали модифицированную методику торможения в геле (ретардации) (Strauss and Varshavsky, 1984). Реакционная смесь объемом 20-60 мкл содержала 1 нг меченого фрагмента PRLP или 0.1 нг меченого олигонуклеотида nodel, 1 мкл ядерного белкового экстракта или 5 мкл DEAE-фракций в ретардационном буфере А, содержащем 10 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 2 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 4% глицерина. Инкубация белков с зондами PRLP и nodel проводилась в присутствии 2 мкг и 0.2 мкг неспецифической конкурентной ДНК Ecoli, соответственно. Концентрация соли в пробе составляла около 150 мМ NaCl. После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре пробы наносили на 4%-ный (ретардация с зондом PRLP) или 6%-ный (ретардация с зондом nodel) полиакриламидный гель. Электрофорез проводили в 0.5-кратном ТАЕ буфере (20 шМ Трис-ацетат, рН 8.0, 0.5 мМ ЭДТА) (Sambrook et al., 1989) и анализировали методом авторадиографии. Для идентификации белков, входящих в специфичные ДНК-белковые комплексы, использовали метод супершифта. Коммерческие антитела против белков Spl, Sp3, YY1 (Santa-Cruz Biotechnology, Inc.) добавляли в ретардационную смесь после 30 мин инкубации к уже образовавшимся комплексам и инкубировали еще 1 ч перед нанесением на гель. Для исследования влияния метилирования цитозина в последовательности CpG на связывание белков с ДНК-зондом фрагмент PRLP метилировали in vitro метилазой SssI (Сибэнзим) согласно рекомендациям производителя.

Электрофоретическое разделение белков и иммуноблоттинг. Белки разделяли в 10%-ном полиакриламидном геле по методике Лэммли (Laemmli, 1970). Окраску серебром, перенос белков на мембрану Hybond-P (Amersham) и иммуноблоттинг осуществляли по стандартным методикам. Блот окрашивали субстратом для выявления щелочной фосфатазы. В качестве маркеров молекулярного веса использовали набор белков «Precision Plus Protein standard Dual

Color» (Bio-Rad). В работе использовали коммерческие поликлональные антитела против белков Spl, Sp3, YY1, полученные в кролике (Santa-Cruz Biotechnology, Inc.), а также моноклональные антитела rG24 против белка pORFI LINE1 крысы, любезно предоставленные Др. Г. Толстоногом (University of Hamburg, Hamburg).

Инкубация белков, иммобилизованных на мембране с меченой ДНК (Саузвестерн-блоттинг). Электрофорез и перенос белков на мембрану проводили, как описано выше. После ренатурации белков в буфере В (50 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 2 мМ MgCl2, 50 мкМ ZnS04 1мМ ДТТ, 50 мМ NaCl) в присутствии 2.5% БСА (бычьего сывороточного альбумина) в течение 5 ч, мембрану инкубировали 4 ч с меченым фрагментом ДНК (концентрация 50 нг/мл для фрагмента PRLP, 10 нг/мл для олигонуклеотида nodel) в буфере В, в присутствии 0.25% БСА и 1000-кратного молярного избытка неспецифической конкурентной ДНК Е coli Мембрану отмывали, высушивали и экспонировали на рентгеновскую пленку.

Ионообменная хроматография белков. Колонку с DEAE-сефарозой (Sigma) (15 см х 0.6 см) уравновешивали буфером С: 15 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0.1 мМ ЭДТА, 0.5 мМ ДТТ, 0.1 mM PMSF, 5% глицерина и 50 мМ NaCl. Перед нанесением ядерный экстракт разбавляли уравновешивающим буфером С без NaCl в 7 раз. Белки элюировали линейным градиентом NaCl от 0.05 М до 1М, общим объемом 20 мл и собирали фракции по 1 мл. Хроматографию проводили при комнатной температуре. Фракции хранили при -20°С.

Аффинная очистка белков Биотинилированный фрагмент PRLP связывали со стрептавидин-сефарозой (Novagen). Биотинилирование осуществляли с помощью ПЦР на плазмиде pPRLP с праймерами LI For, LIRewl. Амплификацию проводили в таких условиях, при которых в каждый фрагмент PRLP включались 1-2 молекулы биотина. Продукт ПЦР (200 мкг ДНК) инкубировали с 1 мл стрептавидин-сефарозы в буфере 20 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 0.5 мМ EDTA в течение 12 ч при 4°С и затем интенсивно промывали тем же буфером. Контрольную колонку готовили аналогично, иммобилизуя на стрептавидин-сефарозе меченый биотином фрагмент плазмиды pUC19. Очистку белков проводили по описанной методике (Лукьянов и др., 1999) с некоторыми изменениями. Для этого 50 ми получившейся PRLP-сефарозы инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре со 100 мкл DEAE-фракции 2 или 6 в буфере А с 10% глицерина и 0.05% Triton Х-100, добавляя избыток специфической или неспецифической конкурентной ДНК. После отмывки 4 раза по 5 мин в 500 мкл буфера А с 10% глицерина и 0.05% Triton Х-100 белки смывали этим же буфером с 0.7 М NaCl и немедленно анализировали методом торможения в геле и электрофорезом по Лэммли (Laemmli, 1970)

Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание. Клетки крысы линии С6 фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида в буфере PBS (135 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.5 мМ КН2Р04, 8 мМ Na2HP04), pH 7.4, содержащем 0.1% Triton X-100, в течение 10 мин. После 30-минутной инкубации в блокирующем растворе (буфер PBS с 3% БСА) клетки обрабатывали моноклональньтми антителами rG24, разведенными на буфере PBS-T (PBS с 0.1% Tween-20) с 3% БСА и затем, после промывок буфером PBS-T, обрабатывали антителами кролика против иммуноглобулинов мыши, конъюгированными с СуЗ (Jackson ImmunoResearch). Далее клетки отмывали, инкубировали в растворе 4'-6'-диамидино-2-фенилиндола

DAPI (Sigma) (0.5 мкг/мл, 2 мин) и заключали в среду VectaShield (Dako). Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа DMRXA (Leica Wetzlar GmbH) с использованием программного обеспечения QFISH (Leica Cambridge Ltd.)

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Клетки крысы линии С6 фиксировали, как это описано выше, обезвоживали и высушивали на воздухе. Далее, после обработки РНКазой А (100 мкг/мл), на препараты наносили гибридизационный буфер (2xSSC с 50% формамида, 10% декстрансульфата, 0.7 мкг/мкл ДНК из спермы лосося), содержащий биотинилированную ДНК (10 нг/мкл). Препараты инкубировали при 82°С 5 мин для денатурации ДНК зонда и клеток. Гибридизацию проводили при 37°С в течение 12 ч. После постгибридизационных отмывок и блокирования препаратов 3% БСА участки гибридизации детектировали авидином, конъюгированным с СуЗ (Vector Lab), с одним раундом амплификации сигнала биотинилированными антителами к авидину (Vector Lab). После инкубации в растворе DAPT препараты заключали в среду и анализировали, как указано выше.

Выделение ДНК. Гибридизация ДНК на мембранах. Геномную ДНК выделяли по стандартному протоколу из ядер клеток семенников, печени и глиомы С6; препарат ядер получали, как описано выше. Для гибридизации по Саузерну геномную ДНК переваривали рестриктазами MspT или НраП (Сибэнзим), фракционировали методом гельэлектрофореза, денатурировали и иммобилизовали на нейлоновой мембране Hybond N+ (Amersham) (Sambrook et al., 1989). Для дот-блот гибридизации соответствующие количества геномной ДНК крысы и немеченых фрагментов LIRn денатурировали и переносили вакуумным методом на нейлоновую мембрану Hybond N+ (Amersham). Гибридизацию с биотинилированными зондами проводили при 64°С без формамида по стандартному протоколу (Wahl, 1979). После отмывок и инкубации со стрептавидином, конъюгированным со щелочной фосфатазой, мембрану окрашивали субстратом для выявления щелочной фосфатазы.

Выделение РНК. Гибридизация РНК на мембранах. Выделение тотальной РНК из семенников и печени крысы проводили с использованием реагента Trizol (Invitrogen), следуя инструкциям производителя. РНК фракционировали методом гельэлектрофореза и иммобилизовали на нейлоновой мембране Hybond N+ (Amersham) (Sambrook et al., 1989). Гибридизацию с мечеными [а-32 Р] -dATP (Amersham) зондами проводили при 42°С в присутствии 40%-ного формамида по стандартному протоколу (Wahl, 1979). После отмывок мембрану высушивали и экспонировали на рентгеновскую пленку.

Иммунопреципитация. Белок pORFI преципитировали на белок-А сефарозу (ICN) антителами rG24. Иммунокомплексы элюировали буфером, содержащем 2% SDS, 5% глицерина, 0.125 М Трис-HCl, pH 6.8 и анализировали методом электрофореза по Лэммли (Laemmli, 1970).

Иммунопрецепитация хроматина. Иммунопреципитацию хроматина проводили по стандартной методике (Spencer et al., 2003). Наличие в преципитате изучаемого фрагмента ДНК проверяли методом ПЦР со специфическими парами праймеров: LlFor, LlRevvl для амплификации фрагмента PRLP и GapdhF 5'-

TGTGATGGGTGTGAACCACG-3 ', GapdhR 51 -CCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3 'для амплификации фрагмента гена Gapdh длиной 297 п.н.

Компьютерные методы исследования. Для сравнения последовательностей ДНК применяли программу BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Сайты связывания транскрипционных факторов анализировали, используя программу Transcription Element Search Software (http://www.cbil.upenn.edu/tess). Для исследования полноразмерных LINE1 элементов крысы пользовались базой данных LIBase (http://llbase.molgen.mpg.de/). Поиск и анализ элементов вторичной структуры ДНК, свойственных для MAR-районов проводили с помощью программы MAR-Wiz 1.0 (http://www.ftituresoft.org/MAR-Wiz/). Выявление изогнутой конформации в молекулах ДНК проводили с помощью ресурса (http://lfd.uiuc.edu/staf!7gohlke/curve/). Сравнительная денситометрия сигналов в экспериментах по ретардации, а также гибридизации по Саузерну и дот-блот гибридизации проводилась с использованием программного обеспечения Gel-Pro Analyser 3.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Тканеспецифичность экспрессии LIRn. Экспрессию ретротранспозона LINE1 крысы (LIRn), проявляющуюся в появлении транскриптов LIRn и возможном последующем синтезе кодируемых LIRn белков, в частности белка pORFl, изучали в разных тканях методами иммуноблоттинга и нозернблоттинга. Для анализа использовали семенники и печень трехмесячных крыс, как источники половых и соматических клеток. Кроме этого, исследовали семенники 19-дневных крыс, так как у мыши на соответствующем этапе развития в семенниках выявляется полноразмерный смысловой транскрипт LINE1 (Branciforte and Martin, 1994). С помощью нозернблоттинга в клетках печени обнаружили набор смысловых и антисмысловых транскриптов LIRn всевозможных длин в диапазоне от 1 до 5 т.н.. то есть дисперсный набор РНК. Эти данные соответствуют ранее охарактеризованной транскрипции L1Rn в клетках печени (Nur et al.. 1988). Дискретные смысловые транскрипты LIRn удалось обнаружить в клетках

Рис. 1. Исследование экспрессии LIRn в разных тканях А. Сравнительный анализ транскриптов элементов LIRn из разных тканей Тотальную РНК из семенников крыс в возрасте 19 дней (1,4), и 90 дней (2, 5) и из печени крыс (3. 6) гибридизовали с однонитевыми ДНК-зондами к смысловой (1-3) и антисмысловой (4-6) РНК района IV LIRn (см Рис 2, А) Стрелками отмечены положения выявляемых дискретных транскриптов Б. Выявление белка pORFT методом иммуноблотшша в белковых экстрактах из клеток i лиомы С6 (1), семенников 19-дневных крыс (2), семенников и печени 3-месячных крыс (3 и 4 соответственно) Стрелки указывают положение выявляемых белков В. Внутриклеточная локализация белка pORFI в клетках глиомы С6 Масштабный отрезок - 10 мкм

семенников крыс, причем полноразмерный транскрипт выявляется лишь в клетках семенников 19-дневных крыс (Рис. 1, А). Для того чтобы выяснить, транслируются ли обнаруженные транскрипты ЫЯп в исследуемых тканях, выявляли белок рОШ7! крысы методом иммуноблоттинга. Белки с ожидаемыми молекулярными массами около 40 и 45 кДа присутствуют в экстрактах из клеток семенников и глиомы С6 (Рис. 1, Б). Наличие белка рОЮТ в цитоплазме и ядрах клеток глиомы С6 подтверждено также методом иммуфлуоресценции (Рис. 1, В). В результате удалось обнаружить ткани - семенники и печень, с разным уровнем экспрессии белка р01Ш. Именно эти ткани мы использовали в дальнейшей работе для поиска белков, специфически связывающих промотор ЫЛл.

Геномная организация ЫЯп. Анализ промоторной области ЫЯп. За транскрипционную активность Ы крысы отвечают тандемно повторенные последовательности - промоторные мономеры (длиной 609 п.н.), расположенные в 5'-нетранслируемом районе Ы и отделенные от ОШЧ коротким немономерным участком (Рис. 2, А) (Миг е1 а1, 1988; Ригапо с1 а1., 1988). Большинство геномных последовательностей ЬГМЕ1 человека и мыши усечены на разном расстоянии от 3'-конца, поэтому они не содержат промоторной области и, следовательно, являются транскрипционно не активными. Важно установить, какая доля геномных элементов ЫЯп содержит промотор. Для этого определяли относительное количество различных участков ретротранспозона ЫЯп в геноме крысы методом дот-блот гибридизации. Результаты количественной оценки сигналов гибридизации показаны на Рис. 2, Г.

ияпУ>ГрГ>-1 ояр| ^-Г

Рис. 2. А. Схематическое изображение ретротранспозона 1,Шп и расположение используемых в работе ДНК-зондов Обозначения (здесь и далее). Рг - промоторный мономер, г-не мономерный участок, З'Цта - З'-нетранслируемая область, Ал - А-богатый участок, СЖИ, (ЖРП - участки, кодирующие белки; расположение ДНК-зондов Т-У и РКГ.Р показано черными отрезками, стрелка указывает положение зонда поёе! Б. Выявление элементов вторичной структуры, свойственных для МАЯ-районов, в последовательности ЬШп, характеризующих ее МАИ-потенциал -потенциальную способность связываться/не связываться с динамическим РНП-матртссом ядра Ось X - координага но длине последовательности ДНК ЬШп (т.п н) Ось У - рассчитанный МАЛ-потенциал (уел ед) Пунктиром показан уровень рассчитанного МАЯ-потенциала для известною МАЯ-района (ОспВапк № 877423) из генома крысы В. Выявление в последовательности ретротранспозона ЬШп участков ДНК имеющих изогнутую конфигурацию Стрелка указывает на наиболее изогнутый участок Промоторный район (Рг) - «прямой» Г. График иллюстрирует относительную копийность в геноме крысы участков 1-У (см Рис. 2, А) ретротранспозона Ь-Жп Ось X - координата по длине последовательности ДНК 1,1 Яп (тли) Ось У - относительная копийность различных областей ЫЯп

Учитывая, что промоторная область L1Rn организована в виде тандемных повторов, мы заключили, что как минимум у половины элементов LIRn, содержащих ORFI, отсутствуют промоторные последовательности.

На экспрессию элементов LIRn, содержащих промоторную последовательность, может влиять состояние хроматина в котором они находятся. Компьютерный анализ расположения элементов LIRn в геномном сиквенсе хромосом крысы (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) показал, что G-бэнды хромосом (за некоторыми исключениями) и хромосома X обогащены этими ретротранспозонами, что хорошо согласуется с расположением L1 элементов на хромосомах мыши и человека (Boyle et al., 1990; Korenberg and Rykowsky, 1988). Для локализации ретротранспозонов L1Rn в интерфазных ядрах клеток глиомы С6 использовали метод FISH с зондом к фрагменту ORFI LIRn. Оказалось, что LIRn локализуется преимущественно в DAPI-позитивном гетерохроматине, хотя выявляется также и в эухроматиновых областях.

Для того чтобы проверить, не обладают ли видоспецифичные промоторы элементов L1 разных видов сходной вторичной структурой, исследовали их промоторные районы на предмет наличия шпилек, образованных инвертированными повторами, изгибов молекулы ДНК, вызванных чередованием с определенной периодичностью А и Т нуклеотидов, а также других элементов вторичной структуры, характерных для MAR-районов (matrix attachment regions; участки связывания с динамическим РНП-матриксом ядра). Компьютерный анализ ретротранспозона LIRn (Рис. 2, Б) и элементов L1 человека и мыши показал, что их промоторные области не содержат элементов вторичной структуры, характерных для MAR-районов, которые могли бы связывать одинаковые структурно-специфичные белки (Fedorov et al., 2004). Кроме того анализ электрофоретической подвижности промоторной области L1 крысы в разных условиях показал, что промотор L1 крысы не содержит изгибов, т.е. является «прямой» последовательностью ДНК. Отсутствие изгибов в промоторной области L1 крысы (Рис. 2, В), а также в промоторных областях L1 человека и мыши было подтверждено с помощью компьютерного анализа.

Расположение точек инициации транскрипции характеризует любой промотор и позволяет судить о механизмах его работы. До сих пор не известны точки инициации транскрипции ретротранспозонов L1 крысы. Существует методика, с помощью которой были определены предполагаемые точки инициации транскрипции эндогенных элементов L1 человека (Athanikar et al, 2004). Эта методика предполагает определение точек, в которых геномные элементы L1 обрываются с 5'-конца; такие точки, наиболее вероятно, соответствуют 5'-концам РНК L1, т.е. потенциальным точкам инициации транскрипции. С помощью такой методики проанализировали 109 полноразмерных ретротранспозонов LIRn, которые фланкированы последовательностями TSD, содержат консервативные открытые рамки считывания без стоп-кодонов и консервативный полиА сигнал. В результате анализа установили, что точки обрыва геномных элементов LIRn группируются в 7 областях промоторного мономера (Рис. 3, стрелки).

▼ff H vv

——© ©—

node!

Рис. 3. Взаимное расположение предполагаемых точек инициации транскрипции (белые и черные стрелки), инициаторных элементов (Тпг) и последовательности nodel, специфически связывающей белки Spl/Sp3 в составе промотора LIRn Цифры над стрелками показывают, сколько полноразмерных геномных копий LIRn из проанализированных элементов обрываются в окрестности соответствующего им района

Промотор ретротранспозона LIRn не содержит консервативного ТАТА-бокса (Furano et al, 1988). Известно, что на некоторых промоторах для РНК-полимеразы П, лишенных ТАТА-бокса, транскрипция может инициироваться посредством специальной инициаторной последовательности (Inr) (Weis and Reinberg, 1997). Мы выявили 6 предполагаемых Inr-мотивов (C/T)(C/T)A+1N(T/A)(C/T)(C/T), где А,, обычно является точкой начала транскрипции (Javahery et al., 1994), в составе промотора LIRn (Рис. 3). Важно отметить, что в окрестностях двух Inr-мотивов (Ам нуклеотиды в положениях 54 и 93) обрывается большинство геномных повторов LIRn (Рис. 3, Б, черные стрелки).

Анализ первичной последовательности видоспецифичного промотора LIRn не выявил сайтов связывания для известных к настоящему времени белков, влияющих на транскрипцию LINE1 человека, таких как YY1 (Athanikar et al, 2004), RUNX3 (Yang et al., 2003) и факторов SOX-семейства (Ostertag and Kazazian, 2000). Поэтому, для того, чтобы выяснить, какие белки способны взаимодействовать с промотором LIRn, нам предстояло биохимическими методами выявить и охарактеризовать промотор-связываюшую активность, а затем идентифицировать обнаруженные белки.

Выявление белков, связывающих промотор LIRn. Фрагмент промоторного мономера LIRn - последовательность PRLP (part of rat LINE1 promoter) длиной 408 п.н. (Рис. 2, А) - использовали в качестве зонда для поиска промотор-связываюших белков. Последовательность PRLP содержит сайт (длиной 15 п.н.), ответственный за связывание промоторного мономера с неидентифицированными ядерными белками (Furano, 2000), названный "nodel" (Рис. 2, А).

Ядерные белковые экстракты из разных тканей тестировали на наличие PRLP-связывающей активности методом торможения в геле. Белки из всех исследуемых тканей образуют комплексы pl-p5 с зондом PRLP (Рис. 4, А) в присутствии 2000-кратного избытка неспецифического конкурента - ДНК Е coli. Поскольку оказалось, что PRLP-связывающая активность не является тканеспецифической, то в дальнейших экспериментах по ретардации использовали белковый экстракт только из клеток семенников 3-месячных крыс.

Для проверки специфичности выявленных комплексов к инкубационным смесям дополнительно добавляли в избытке различную конкурентную ДНК -немеченый фрагмент PRLP; последовательность 3UTR, негомологичную PRLP, но имеющую приблизительно ту же длину; олигонуклеотид nodel, ответственный за связывание не идентифицированных белков с промотором LIRn (Furano, 2000);

PRLP 3UTR node!

YY1wt

X i х i х

О О О О О

S*4

-.01 -02 ~оЗ

Ф 1 2 3

Ф 1 2 3 4 56789

ф 1 2 3 4 5

Рис. 4. Выявление специфической LlRn-промотор-связывающей активности ядерных белков методом ретардации А. Инкубация ядерных белков из семенников крыс в возрасте 90 дней (1) и 19 дней (2), и из печени крыс (3) с зондом PRLP в присутствии ДНК Е col:. Ф (здесь и далее) -свободный меченый зонд PRLP Стрелки pl-p5 указывают положения PRLP-белковых комплексов Б, В. Ядерные белки из семенников 3-месячных крыс инкубировали с зондами PRLP (Б) или nodel (В) в присутствии ДНК Е coli и избытков конкурентных последовательностей ДНК, указанных над дорожками. Стрелки р)-рЗ, оЗ и ol, о2, о4, р4, р5 показывают (здесь и далее) положение неспецифичных и специфичных комплексов, соответственно ф (здесь и далее) - свободный меченый зонд nodel

и олигонуклеотид YYlwt, содержащий консервативный сайт связывания для белка YY1 (Рис. 4, Б). Добавление избытка специфического конкурента -последовательности PRLP показало, что лишь комплексы р4, р5 сформированы за счет специфичного связывания ядерных белков с зондом PRLP. Кроме этого удалось доказать, что сайт связывания специфично-взаимодействующих белков идентичен олигонуклеотиду nodel, а транскрипционный фактор YY1 не связывает последовательность PRLP in vitro. С помощью ретардации мы показали, что сам олигонуклеотид nodel способен специфически взаимодействовать с ядерными белками, формируя комплексы ol, о2, о4 (Рис. 4, В). Это позволило в дальнейшем использовать олигонуклеотид nodel, наряду с фрагментом PRLP, в качестве зонда для поиска LIRn промотор-связывающих белков.

Для дальнейшей характеристики выявленных промотор-связывающих белков уточнили их сайт связывания. Для этого в качестве конкурентов в ретардации использовали олигонуклеотиды shor и delb, соответствующие левой и правой части зонда nodel (см. материалы и методы). Результаты ретардации показывают, что левая часть олигонуклеотида nodel - последовательность shor, располагающаяся в положениях 125-133 п.н. промоторного мономера, ответственна за специфическое взаимодействие с ядерными белками (Рис. 5, А), что хорошо согласуется с ранее полученными данными (Furano, 2000). Определив последовательности ДНК, с которой взаимодействуют изучаемые белки, мы смогли исследовать эту последовательность на предмет наличия в ней сайтов связывания для известных

транскрипционных факторов. Результаты компьютерного анализа с помощью программы Transcription Element Search Software показали, что последовательность shor содержит мотивы GGTGGG (GT-бокс) и CAGGTG (Е-бокс) - потенциальные сайты связывания для белков Sp-семейства (Rahuel et al., 1992) и факторов bHLH-семейства (Simon and Burden, 1993), соответственно. Для того чтобы проверить, не ответственны ли белки этих семейств за выявленную LlRn-промотор-связывающую активность, мы использовали в качестве конкурентов в ретардации олигонуклеотиды Splwt, Ebox-L и Splmut, содержащие консервативные сайты связывания для белков Sp-семейства, bHLH-семейства и мутированный сайт связывания для белков Sp-семейства, соответственно. Результаты, представленные на Рис. 5, А, Б, показывают, что белки из Sp-семейства, но не из bHLH-семейства, являются вероятными кандидатами на роль белков, специфически связывающих промотор LIRn.

shor delb Spiv* SglnU Qxx.

S S

I §

t -.01 I —o2

( ~ri3 i —04

позе) So1w* ScVli

Л X S X S

я s s i I

tu IM tué ь-À i A L^Â «- '

щтщшщм

| 250 I 150

100 75

50 f » «

251

M 1 2

PRLP

ф 1 23456789 10 11

Ф 1 2 3 4 5 6

3 4

ncdei эо-д

, СП&Циф

- конкурент

Рис. 5. Уточнение сайта связывания выявленных nodel- и PRPL-связывающих белков Ядерные белки из семенников 3-месячных крыс инкубировали с зондами nodel (А) или PRLP (Б) в присутствии ДНК Ecoli и избытков конкурентных последовательностей ДНК, указанных над дорожками А. Специфичные комплексы ol, о2, о4 вытесняются последовательностями shor и Splwt Б. Специфичные комплексы р4, р5 вытесняются последовательностями nodel и Splwt Рис. 6. Определение молекулярной массы PRT Р- и яо(1е1-связывющих белков методом Саузвсстерн-блотгинга Инкубация ядерных белков из семенников 3-месячных крыс с мечеными зондами PRLP (1, 2) и nodel (3, 4) в присутствии ДНК Е coll Инкубационная смесь (2, 4) дополнительно содержала 100-кратный молярный избыток немеченых последовательностей PRLP и nodel, соответственно Стрелки указывают положение PRLP- и nodel-связьгеаюндах белков

Определение молекулярной массы PRLP- и nodel-связывающих белков. Молекулярную массу PRLP- и nodel-связывающих белков определяли методом Саузвестерн-блотгинга. Результаты, представленные на Рис. 6, демонстрируют, что зонд PRLP, так же как и зонд nodel, специфически взаимодействует с ядерными белками с молекулярными массами 115, 100 (двойная зона), 70 и 60 кДа. Видно также, что последовательности PRLP и nodel специфично взаимодействуют с одинаковым набором ядерных белков. Важно, что молекулярные массы PRLP-связываюших белков, очищенных с помощью последовательных ионообменной и аффинной хроматографий, совпадают с молекулярными массами промотор-

связывающих белков, выявляемых методом Саузвестерн-блотганга. Ионообменную и аффинную хроматографию проводили по методике, разработанной для белков, специфически связывающих промотор гена NOS2 (Coia et al., 2005). Известно, что белки Spl и Sp3 экспрессируются в семенниках крысы в виде изоформ с молекулярными массами 105, 95,60 кДа и 115, 60-70 кДа, соответственно (Wilkerson et al., 2002). Совокупность данных, а именно: молекулярные массы PRLP- и nodel-связывающих белков, их аффинность к консенсусному сайту связывания для белков Sp-семейства, наличие в составе олигонуклеотида shor последовательности GGTGGG, отвечающей за взаимодействие с белками Spl и Sp3 промотора гена mGH-V (Schanke et al., 1998), свидетельствует о том, что белки Spl и Sp3 могут быть вовлечены в формирование специфичных комплексов с последовательностями PRLP и nodel.

Идентификация PRLP- и nodel-связывающих белков. Участие белков Sp-семейства в формировании исследуемых ДНК-белковых комплексов было доказано методом супершифта. Предварительно с помощью иммуноблоттинга подтвердили, что коммерческие антитела против транскрипционных факторов Spl, Sp3 и YY1 выявляют в ядерном экстракте из клеток семенников белки с ожидаемыми молекулярными массами; и эти белки присутствуют в DEAE-фракциях, содержащих PRLP-связывающую активность.

Добавление в инкубационную смесь для ретардации антител к белку YY1 не вызывает замедления специфических nodel- и PRLP-белковых комплексов (Рис. 7, А, дорожки 4, 5; Рис. 7, Б, дорожка 2), в то же время добавление антител к белку Spl вызывает замедление комплексов ol и р4 (Рис. 7, А, дорожки 2. 3; Рис. 7, Б, дорожка 4), а добавление антител к белку Sp3 вызывает замедление комплексов о2, о4 и р4, р5 (Рис. 7, А, дорожки 6, 7; Рис. 7, Б, дорожка 3). Эти результаты доказывают специфическое связывание белков Spl и Sp3 с последовательностями PRLP и nodel in vitro (Fedorov et al., 2006).

A °spi*

gSpl aYYI oSp3 gSp3

уулЦуу^

Ф123456789 E coli А. К инкубационным смесям 2, 4, 6, 8 и 3, 5,7, 9 добавляли, соответственно, 2 мкг и 3 адкг указанных антител Стрелки о2, о4 и ol указывают положения Sp3-aodel и Spl-nodel комплексов, соответственно Б. К инкубационным смесям 2-5 добавляли 3 mki указанных антител Стрелки р4 и р5 указывают положения Spl-PRLP и Sp3-PRLP комплексов Названия антитет указаны над дорожками, комплексы антитела-белок-ДНК показаны звездочкой

со Т- Ч- СО

> Q. О. О- Q.

>- со <л (ла>

о о а о+о

-рЗ

ш т ' * , 3g

Ф 1 2 3 4 5

Рис. 7. Супершифт пос1е1-белконых комплексов (А) и РШЛ'-белковых комплексов (Б)

антителами против белков Эр1, БрЗ, УУ1 Ядерные белки го семенников 3-

месячных крыс

инкубировали с

зондами поде! (Л) или РЯЬР (Б) в присутствии ДНК

Состояние метилирования геномных промоторов LIRn и влияние метилирования промотора LIRn на связывание с белками Spl, Sp3 и МеСР2. Связывание белков Spl/Sp3 с промоторными последовательностями в некоторых случаях зависит от метилирования последних (Li et al., 2004). Показано, что метилирование CpG-богатого промотора LIRn существенно уменьшает его активность в экспериментах с репортерным геном (Nur et al., 1988). Поэтому, мы изучили состояние метилирования геномных промоторов LIRn в разных тканях с помощью рестрикционного анализа. Полное метилирование промоторов LIRn в клетках печени (Рис. 8, А) согласуется с ранее полученными данными (Nur et al., 1988). Мы впервые показали, что промотор LIRn частично деметилирован в клетках семенников 19-дневных крыс и в меньшей степени в клетках мозга и семенников 3-месячных крыс, а также значительно деметилирован в клетках глиомы С6 (Рис. 8, А).

Поскольку подавляющая часть промоторов LIRn оказалась метилированной в исследуемых тканях крысы, было необходимо изучить влияние метилирования последовательности PRLP на связывание с ней ядерных белков. В экспериментах по ретардации обнаружено, что метилирование in vitro динуклеотидов CpG в последовательности PRLP уменьшает связывание с ней белков Sp1 и Sp3 (Рис. 9, А). Денситометрический анализ показывает, что интенсивности специфических комплексов р4, р5, образованных белками Spl и Sp3 с неметилированным PRLP, в два раза больше интенсивностей соответствующих комплексов, образованных белками Spl и Sp3 с метилированным PRLP.

Известно, что белок МеСР2 связывает метилированные динуклеотиды CpG и может участвовать в репрессировании транскрипции с метилированных промоторов (Klose and Bird, 2006). Денситометрический анализ комплексов на Рис. 9, А

Рис. 8. Сравнительный анализ состояния метилирования геномных промоторов элементов LIRn в разных тканях А Картина гибридизации зонда I (см панель Б) с геномной ДНК из печени (1. 6, 12), мозга (2, 7), и семенников (5. 10, 11) 3- месячных крыс, семенников 19-дневных крыс (4, 9) и клеток глиомы С6 (3, 8), обработанной рестриктазами Mspl (1-5) и НраП (6-12) На дорожки 1-10 нанесено 5 ми ДНК, на дорожки 11, 12 -30 мк1 ДНК Слева обозначены положения маркерных полос (тпн) Стрелками указаны выявляемые продукты рестрикции Суммарная относительная интенсивность сигналов гибридизации от Hpall фрагментов длиной < 800 п н (относительный уровень гипометилирования) представлена цифрами над соответствующими дорожками За 100% принята интенсивность сигналов гибридизации от Mspl фрагментов длиной < 800 пне дорожки 1 Б. Схема расположения сайтов для рестриктаз Mspl/Hpall (i) в составе ретротранспозона LIRn Расстояния между сайтами рестрикции указаны в т п н

0 3,3 29,5 9,1 0,8 93 0 1§§1»11

показывает, что интенсивность зоны рЗ немного увеличивается в случае инкубации с метилированным зондом, что может быть обусловлено привлечением в комплекс дополнительного белка. Мы провели частичную очистку белка МеСР2 из клеток печени крысы с помощью ионообменной хроматографии и при помощи метода супершифта показали, что этот белок связывается с метилированной последовательностью PRLP in vitro, образуя комплекс с подвижностью, схожей с подвижностью комплекса рЗ (Рис. 9, Б).

Рве. 9. Влияние метилирования фрагмента PRLP на связывание с ним белков А. Ядерные белки из

семенников 3-месячных крыс инкубировали с не метилированным

(1) или метилированным

(2) зондом PRLP в присутствии ДНК E.coli. Фм (здесь и

далее) - свободный меченый метилированный зонд PRLP Б. Фракцию ядерных белков из печени крысы, содержащую МеСР2, инкубировали с не метилированным (1, 2) или метилированным зондом PRLP (3-6) в присутствии ДНК Ecoli Инкубационная смесь дополнительно содержала 100-кратный молярный избыток не метилированного (2, 4) или метилированного (5) фрагмента PRLP К инкубационной смеси (6) добавляли 3 мкг антител против бежа МеСР2. Стрелка указывает положение МеСР2-ДНК комплекса Комплекс антитела-МеСР2-ДНК показан звездочкой

Изучение связывания белков Spl, Sp3, МеСР2 с промоторами LIRn in vivo. Необходимо установить, могут ли выявленные белки Spl, Sp3, МеСР2 связываться с промоторной областью LI крысы in vivo. С помощью метода иммунопреципитации хроматина установили, что промотор LIRn копрецепитируется с антителами к белкам Sp3 и МеСР2 из клеток семенников 19-дневных крыс (Рис. 10, А) и клеток семенников 3-месячных крыс и лишь с антителами к белку МеСР2 из клеток печени 3-месячных крысы (Рис. 10, Б). Специфичность иммунопреципитации была подтверждена ПЦР-анализом с праймерами к непромоторному фрагменту гена Gapdh, который не копреципитировался с антителами ни к одному из исследуемых белков. Кроме этого, антитела к белку YY1, который не связывается с промотором LIRn in vitro, не копреципитировали промоторную последовательность LIRn в исследуемых тканях. Полученные результаты показывают, что промотор LINE 1 крысы связывается in vivo с белком МеСР2 в клетках печени и семенников, а с белком Sp3 лишь в клетках семенников, что может быть объяснено характером метилирования промотора LINE1 крысы в этих тканях.

+ +м специф ^ т конкурент

+ + + + &енТИР

juLyuaiin

Ф Ф" 1 2 3 4 5 6

Рис. 10. Анализ связывания белков Spl, Sp3, МеСР2 с промотором L1Rn m vivo методом иммунопрсципитации хромагана Преципитат из клеток семенников 19-дневных крыс (А) и клеток печени 3-месячных крыс (Б) анализировали методом ПЦР с праймерами специфичными к фрагменту промотора LIRn (панель LIJPr) и не промоторному фрагменту гена Gapdh (панель Gapdh) В качестве матрицы для ГП IP использовали фрагменты ДНК, неспецифично связавшиеся с носителем в отсутствие антител (-). фрагменты ДНК, копреципитировашиеся с антителами к белкам Spl (2), Sp3 (3), МеСР2 (4) или фрагменты ДНК, экстрагированные из озвученного хроматина до преципитации (Хр)

ОБСУЖДЕНИЕ

Предметом настоящей работы являлось выявление и идентификация белков, специфически связывающих промотор ретротранспозона L1 крысы. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что транскрипционные факторы Spl и Sp3 специфически взаимодействуют с промотором LIRn. Обнаружено тканеспецифичное взаимодействие белка Sp3 с промотором LIRn in vivo в тканях с разным характером экспрессии элементов LIRn и метилирования их промоторной области.

Для изучения белок-связывающей активности промотора L1 крысы, необходимо было выбрать ткани с разным уровнем экспрессии LIRn. Мы обнаружили экспрессию дискретных транскриптов LIRn и белка pORFI в клетках семенников крысы. Полноразмерные смысловые транскрипты LIRn, являющиеся матрицами для обратной транскрипции, выявляются лишь в клетках семенников 19-дневных крыс. Можно предположить, что именно в этой ткани происходят ретротранспозиции способных к дальнейшему размножению элементов LIRn. Дисперсные транскрипты LIRn в клетках печени возникают, по-видимому, за счет неспецифической транскрипции с соседних промоторов. Смысловые и антисмысловые транскрипты LIRn, выявляемые в клетках печени, вероятно, участвуют в образовании длинной двунитевой РНК. Такая двунитевая РНК может быть вовлечена в регуляцию экспрессии по механизму РНК интерференции (Diallo et al., 2003). Отсутствие белка pORFI в клетках печени показывает, что выявляемые в этом типе клеток дисперсные транскрипты L1 не транслируются. Установленная тканеспецифичность экспрессии L1 крысы хорошо согласуется со специфичностью экспрессии L1 элементов у других видов (Packer et al., 1993; Branciforte and Martin, 1994; Ergun, et al., 2004) и свидетельствует об общих принципах регуляции экспрессии ретротранспозонов L1.

Негомологичные промоторные последовательности могут участвовать в одинаковых регуляторных процессах благодаря тому, что обладают общими структурными особенностями. Оказалось, что видоспецифичные промоторы

повторов LI мыши, крысы и человека являются «прямыми» последовательностями ДНК и не обладают характерными для MAR-районов элементами вторичной структуры (Fedorov et al., 2004). Следовательно. MAR-связывающие, структурно-специфичные белки не могут принимать участие в организации тканеспецифической экспрессии LINE1 разных видов.

Поиск известных регуляторных последовательностей в составе промотора L1 крысы показал отсутствие сходных мотивов с промоторами LINE других видов. Известно, что промотор ретротранспозона Doc дрозофилы содержит DPE-мотив, который участвует в инициации транскрипции со специфической инициаторной последовательности (Contursi et al., 1995). В составе промотора L1 крысы не обнаружено консенсусной последовательности DPE-мотива в необходимых положениях относительно выявленных предполагаемых Inr-элементов. С регуляторной областью L1 человека взаимодействует белок YY1, его сайт связывания работает как компонент корового промотора, обеспечивающего инициацию транскрипции около положения +1 области 5TJTR (Athanikar et al., 2004). У мыши есть несколько семейств повторов L1, отличающихся своей промоторной областью (Ostertag and Kazazian, 2000). Промоторы LI элементов мыши семейства Tf содержат сайт связывания для белка YY1. В геноме многие L1 этого семейства начинаются в окрестностях сайта для YY1, что подтверждает его возможную роль в позиционировании транскрипционного комплекса (DeBerardinis and Kazazian, 1999). Однако в промоторной области элементов L1 мыши семейства А не обнаружено консервативного сайта для YY1 (Ostertag and Kazazian, 2000). Результаты наших экспериментов по ретардации, иммунопреципитации хроматина и компьютерный анализ промотора L1 крысы показали, что промотор L1 крысы не содержит сайт связывания для белка YY1 и не взаимодействует с этим фактором ни in vitro, ни in vivo. Следовательно, сходный характер экспрессии L1 элементов разных видов могут, вероятно, обеспечивать разные транскрипционные факторы.

Идентифицированные в работе белки, специфически связывающие промотор LIRn in vitro, являются известными транскрипционными факторами Spl и Sp3. Белки Spl/Sp3 экспрессируются во многих типах клеток млекопитающих. Белок Spl обычно работает как активатор транскрипции, a Sp3 - как активатор или репрессор. Известно, что белки Spl и Sp3 способны участвовать в регуляции транскрипции, связываясь с одними и теми же регуляторными мотивами в составе промоторов РНК-полимеразы II. Активаторные домены белков Sp1 и Sp3 высоко гомологичны и способны взаимодействовать с базальными факторами транскрипции ТВР и TAF110. Установленный в работе сайт связывания белков Spl/Sp3 в промоторе LIRn идентичен последовательности shor - TCAGGTGGG. Эта последовательность не является каноническим сайтом связывания для белков Sp-семейства, но содержит мотив GGTGGG, ответственный за взаимодействие белков Spl/Sp3 с промоторами некоторых генов (Schanke et al., 1998; Rahuel et al., 1992). Известно, что белок Spl может инициировать транскрипцию посредством привлечения фактора TFIID к Inr-элементам на Inr-coдержащих промоторах (Li et al., 2004; Lanía et al., 1997).

Мы предполагаем, что главным сайтом инициации транскрипции LIRn является Inr-элемент (с А.; нуклеотидом в положении 54 п.н промоторного мономера LIRn), в окрестностях которого обрывается большинство геномных

элементов LIRn (Fedorov et al., 2006). Роль этого района в контроле транскрипции поддерживает наблюдение, что отсутствие первых 56 п.н. в промоторе LIRn существенно уменьшает его активность (Segal-Bendirdjian and Heidmann, 1991). Мы предполагаем, что последовательности в окрестностях дополнительных районов обрыва могут служить минорными точками инициации транскрипции LIRn. В составе промотора L1 крысы Sp 1 /Sp3 -связы вающий мотив shor располагается правее главного предполагаемого района инициации транскрипции. Обычно сайты связывания для белков Sp-семейства, важные для базальной транскрипционной активности промоторов без ТАТА-боксов, располагаются левее сайта инициации транскрипции (Smale et al., 1990). Описано однако несколько примеров, когда расположенные правее точки инициации транскрипции сайты Spl/Sp3 участвовали в регуляции транскрипции с промоторов без ТАТА-боксов (Sheng et al., 2005). Поэтому можно предположить, что в составе промотора LIRn сайт shor и Inr-элемент в окрестности положения 54 п.н. могут совместно функционировать в инициации базальной транскрипции L1 крысы.

Эксперименты по иммунопреципитиции хроматина показали, что белки Sp1/Sp3 не взаимодействуют с промотором LIRn in vivo в клетках печени, где не экспрессируется белок pORFI; однако в клетках семенников, где выявлена экспрессия дискретной смысловой РНК LIRn и белка pORFI, транскрипционный фактор Sp3 взаимодействует с промотором LIRn in vivo Интересно, что белки Spl и Sp3 участвуют в регуляции транскрипции ретротранспозона мыши ЕТп, имеющего сходный с элементами L1 характер экспрессии (Maksakova and Mager, 2005).

Промотор LIRn является CpG-богатой последовательностью, метилирование которой может влиять на связывание с ней ядерных белков. Известно, что метилирование промоторов L1 элементов крысы и человека существенно уменьшает их активность в экспериментах с репортерным геном (Nur et al., 1988; Steinhoff and Schulz, 2003). В настоящей работе установлена корреляция между экспрессией белка pORFI и частичным деметилированием промотора LIRn в клетках семенников крысы, а также в клетках глиомы Сб. Уровень деметилирования промоторов LIRn существенно выше в клетках семенников 19-дневных крыс, где обнаруживается полноразмерный смысловой транскрипт LIRn, по сравнению с семенниками 3-месячных крыс. Такое различие может быть обусловлено существенным обогащением сперматоцитами на стадиях лептотены и зиготены профазы мейоза сперматогенного эпителия из семенников 19-дневных крыс по сравнению с семенниками 3-месячных крыс (Malkov et al., 1998). Именно в таких клетках выявляется коэкспрессия белка pORFI и полноразмерной РНК L1 в семенниках мыши (Branciforte and Martin, 1994). В экспериментах на культурах клеток человека показано, что уровень экспрессии pORFI коррелирует с деметилированием промотора L1 человека (Thayer, 1993); можно заключить, что в клетках с повышенным уровнем экспрессии элементов L1 разных видов наблюдается общее явление частичного деметилирования видоспецифичных промоторов L1.

Совокупность результатов, полученных в настоящей работе, и данных других авторов позволяет предположить, что метилирование промоторной последовательности L1 крысы играет роль в регуляции экспрессии этих элементов. Метилирование промоторной области может оказывать влияние на экспрессию,

непосредственно уменьшая связывание с ДНК активаторов транскрипции либо посредством привлечения белков, связывающих метилированную ДНК (Klose and Bird, 2006). В случае промотора LI крысы могут реализовываться оба механизма. В настоящей работе установлено, что метилирование промоторной последовательности LIRn уменьшает связывание с ней белков Spl и Sp3 in vitro. Стоит отметить, что аналогичная ситуация наблюдается в случае экспрессии ретротранспозона IAP мыши - метилирование промоторной области репрессирует его транскрипционную активность и уменьшает связывание активатора транскрипции - белка YY1 (Satyamoorthy et al., 1993). Результаты работы демонстрируют, что Sp3 связывается с промоторной последовательностью LI крысы in vivo лишь в клетках семенников, где наблюдается частичное деметалирование промотора LIRn.

Метилирование промотора LIRn вызывает связывание с ним in vitro белка МеСР2, возможное участие белка МеСР2 в регуляции экспрессии LIRn in vivo подтверждается экспериментами по иммунопреципитиции хроматина. Белок МеСР2 может выступать в качестве репрессора транскрипции на метилированных промоторах, непосредственно взаимодействуя с базальными транскрипционными факторами (Kaludov et al., 2000) либо привлекая корепрессорный комплекс, в который входит гистондеацетилаза HDAC1 (Klose and Bird, 2006). Стоит отметить, что транскрипционные факторы Spl и Sp3 могут обеспечивать тканеспецифичный характер экспрессии некоторых генов, когда работают в сочетании с тканеспецифичным метилированием промотора (Aoyama et al., 2004) или в сочетании с привлечением МеСР2 к тканеспецифично метилированному промотору (Chang et al., 2004).

На основании полученных результатов предложена модель регуляции транскрипции LIRn, согласно которой белок МеСР2 участвует в репрессировании транскрипции с метилированных промоторов LIRn, а транскрипционный фактор Sp3 вовлечен в активацию транскрипции с неметштированных промоторов L1Rn. Экспрессия ретротранспозонов LI у каждого отдельного вида, вероятно, может быть реализована с участием разных регуляторных мотивов и связывающих их транскрипционных факторов. Однако механизм регуляции тканеспецифического связывания этих транскрипционных факторов с промоторами LI имеет сходные признаки у разных видов.

выводы

1. В семенниках крысы экспрессируются дискретные смысловые транскрипты ретротранспозона LIRn и кодируемый LIRn белок pORFI. В клетках печени, где не обнаруживается белок pORFI, транскрибируется дисперсный набор смысловых и антисмысловых РНК LIRn.

2. Промотор LIRn содержит несколько вероятных сайтов инициации транскрипции, главный из которых располагается в положении 54 п.н. промоторного мономера. Более 80% геномных копий LIRn не содержат промоторной области.

3. Белки Spl/Sp3, но не YY1, специфично связываются с промотором LIRn in vitro. Сайт связывания транскрипционных факторов Spl/Sp3 идентичен последовательности, располагающейся в положениях 125-133 п.н. промоторного мономера LIRn.

4. Промотор LIRn частично деметилирован в клетках семенников и полностью метилирован в клетках печени крысы. Метилирование промотора LIRn уменьшает связывание с промотором белков Spl/Sp3 in vitro и вызывает связывание белка МеСР2.

5. In vivo, белок МеСР2 взаимодействует с промотором LIRn в клетках семенников и в клетках печени, а белок Sp3 - лишь в клетках семенников крыс.

6. Предложена схема репрессии транскрипции с метилированных промоторов LIRn при участии белка МеСР2 и активации транскрипции с неметилированных промоторов LIRn при участии транскрипционного фактора Sp3.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Fedorov А , Lukyanov D, Rogolimki J, Widlak P, Podgomaya О, and Rieszowska-Wolny J 2004 The nuclear protein p30 specifically interacts with a nuclear matrix attachment region from rat genome. Cell.&Mol. Biol. Lett. 9(1): 153 - 165.

2. V Coia, S Juliger, В Mordmuller, A Kreidenweis, A Stroh, С Ortega, A Vindigni, J Dengjel, D. Lukyanov, G Destro-Bisol, A Fedorov, О Podgomaya, J Кип 2005 Analysis of polymorphic sites in the promoter of the nitric oxide synthase 2 gene. Biochem. and Biophys. Res. Commun. 335(4): 1123-1131.

3. Fedorov A.V., Lukyanov D V, Podgomaya ОI 2006 Identification of the proteins specifically binding to the rat LINE1 promoter. Biochem. and Biophys. Res. Commun. 340(2): 553-559.

4. Fedorov A V, Podgomaya 0 1 2001 Detection and purification of protein that recognize 5'UTR of LINE 1 repetitive sequence. 12th European students conference at Charite, Berlin, abstracts p. 105.

5. Федоров А В, Подгорная ОМ 2004 Выявление белков, связывающих промотор L1 крысы. 8-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, тезисы докл. с. 37.

6. Федоров АВ, Лукьянов ДВ, Подгорная О.И 2005 Исследование структуры промоторной области L1 крысы. 9-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, тезисы докл. с. 58-59.

7. Fedorov A V, Podgornaya ОI 2005 Potential of promoter activity of rat LINE1 5'-untranslated region. The 19th Wilhelm Bernhardt International Workshop on the Cell Nucleus, Wuerzburg, abstracts p. 52-53.

8 Федоров А В., Лукьянов ДВ, Подгорная О И. 2005 Выявление и очистка белков, связывающих промотор L1 крысы. XV Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра», Санкт-Петербург. Цитология. 47(9): 837.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Лукьянов Д.В, Решетникова ГФ, Подгорная Off 1999 Аффинная очистка AIu-связывающих белков из

соматических клеток человека Биохимия 64(1) 25-33 Аоуата Т, Okamnto Т, Sagayama S, Nishyo К hhibe 7', Yasura К, Nakayama Т, Nakamura Т, ToguchidaJ 2004 Methylaiion in the core-promoter region of the chondromodulm-I gene determines the cell-specific expression by regulating the binding of transcriptional activator Sp3 J Biol Chem 279(27) 28789-28797 Athamkar JN, Badge RM, Moran JV 2004 A YYl-bmding site is required for accurate human LINE-1

transcription initiation Nucl Acids Res 32(13) 3846-3855 Becker KG., Jedlicka P, Templeton NS, Liotta L, Ozato К 1994 Characterization of hUCRBP (YY1, NF-E1, delta) a transcription factor that binds the regulatory regions of many viral and cellular genes Gene 150(2) 259-266

Relgrader P, Siegel A 1 Rerezney R 1991 A comprehensive study on the isolation and characten?ation of the

HeLa S3 nuclear matrix, J Cell Sci 98(3) 281-291 Bourc'his D, Bestor TH. 2004 Meiotic catastrophe and retrotransposon reactivation m male germ cells lacking

Dnmt3L Nature 431(7004) 96-99 Boyle AL, Ballard SG, Ward DC 1990 Differential distribution of long and short interspersed element sequences m the mouse genome chromosome karyotyping by fluorescence in situ hybridization Proc Natl Acad Sci USA 87(19) 7757-7761 Branciforle D, Martin S L. 1994 Developmental and cell type specificity of LINE-1 expression in mouse testis

implication-; for transposition Mol Cell Biol 14(4") 2584-2592 Chang Y.S., Wang L, Suh YA, Mao I, Karpen SJ, Khuri FR, Hong WK, Lee HY 2004 Mechanisms underlying lack of insulin-like growth factor-binding protem-3 expression in non-small-cell lung cancer Oncogene 23(39) 6569-6580 Contursi C, Mmchiotti G, Di Nocera P P 1995 Identification of sequences which regulate the expression of

Drosophila melanogaster Doc elements J Biol Chem 270(44) 26570-26576 DeBerardims R.J Kazaztan H HJr 1999 Analysis of the promoter from an expanding mouse retrotransposon

subfamily Genomics 56(3) 317-323 Diallo M, Arenz С, Schmitz К, Sandhoff K, Schepers U 2003 Long endogenous dsRNAs can induce complete

gene silencing in mammalian cells and primary cultures Oligonucleotides 13(5) 381-392 Ergun S Buschmann С, Heukeshoven J, Damnumn К, Schnieders F, Lauke H, Chalajour F, Kilic N, Siratlmg WH, Schumann G.G 2004 Cell type-specific expression of LINE-1 open reading frames 1 and 2 in fetal and adult human tissues J Bio! Chem 279(26) 27753-27763 Furano A V 2000 The biological properties and evolutionary dynamics of mammalian LINE-1 retrotransposons

Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 64 255-294 Furano A.V, Robb SM, Robh FT. 1988 The structure of the regulatory region of the rat LI (LIRn, long

interspersed repeated) DNA family of ttansposable elements Nucleic Acids Res 16(19) 9215-9231 Hayward B.E, Iavanellt M, Furano A V. 1997. Recombination creates novel LI (LINE-1) elements in Rattus

norvegicus, Genetics 146(2) 641-654 Javahery R, Khachi A, Lo К, Zenzie-Gregory B, Smale ST 1994 DNA sequence requirements for

transcriptional initiator activity in mammalian cells Mol Ceil Biol 14(1) 116-127 KadonagaJT, Tjian R 1986 Affinity puntlca'ron of sequence-specific DNA binding protems Proc Natl Acad

Sci USA 83(16) 5889-5893 KaludovNK, Wolffe A P 2000 MeCP2 driven transcriptional repression m vitro selectivity for methylated DNA, action at a distance and contacts with the basal transcription machiners Nucleic Acids Res 28(9) 19211928

Klose RJ, Bird A P 2006 Genomic DNA methylation the mark and its mediators Trends Biochem Sci 31(2) 89-97

Korenberg J R, Rykowski MC 1988 Human genome organization Alu, Lines, and the molecular structure of

metaphase chromosome bands Cell 53(3) 391-400 Ixiemmli, UK 1970 Cleavage of the structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227(5259) 680-685

Ixrnia L, Majello B, De Luca P 1997 Transcriptional regulation by the Sp family proteins Int J Biochem Cell Biol 29(12) 1313-1323

LiL.HeS Sun J M, Davie J R 2004 Gene regulation by Spl and Sp3 Biochem Cell Biol 82(4) 460-471 Maksakova I A, Mager DL 2005 Transcriptional regulation of early transposon elements, an active family of

mouse long terminal repeat retrotransposons S Virol 79(22) 13865-13874 Malkov M, Fisher Y, Don J 1998 Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow

cytometry Biol Rcprod 59(1) 84-92 Wartm S L, Branciforte D 1993 Synchronous expression of LINF-1 RNA and protein m mouse embryonal

carcinoma cells Mol Cell Biol 13(9) 5383-5392 Nur I, Pascale E, Furano A V 1988 The left end of rat LI (LIRn, long interspersed repeated) DNA which is a

CpG island can function as a promoter Nucleic Acids Res 16(19) 9233-9251 Ostertag E M, DeBerardims R J, GoodierJL, 7hang Y, Yang N, GertonG L, Kazazian HII Jr 2002 A mouse

model ofhuman LI retrotransposition Nat Genet 32(4) 655-660 OitertagEM, KcaazianHHJr 2001 Biology of mammalian L1 retrotransposons Annu Rev Genet 35 501538

Packer At, Manoxa K, Bachvarova RF 1993 A discrete LINE-1 transcript m mouse blastocysts Dev Biol 157(1) 281-283

Rahvel C, Vimt MA, Lemarchande! V, Cartron .IP, Romeo PH 1992 Frythroid-specific activity of the glycophonn B promoter requires GATA-1 mediated displacement of a repressor EMBO J 11(11) 40954102

Sambrook J, Fritch Et & Mamatis T 1989 Molecular cloning A laboratory Manual, second ed Cold Spring

Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY Satyamoorthy K, Park K, Atchison ML, Howe CC. 1993 The intracistemal A-particIe upstream element interacts with transcription factor YY1 to activate transcription pleiotropic effects of YY1 on distinct DNA promoter elements Mol Cell Biol 13(11) 6621-6628 Schanke JT, Durnmg M Johnson KJ, Bennett I K, Golos TG 1998 SPl/SPVhmdmg sites and adjacent elements contribute to basal and cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-stimulated transcriptional activation of the rhesus growth hormone-variant gene in trophoblasts Mol Endocrinol 12(3) 405-417 Segal-Bendirdjian E, Heidmann T 1991 Fvidence for a reverse transcription intermediate for d marked line

transposon m tumoral rat cells Biochem Biophys Res Commun 181(2) 863-870 Sheng Y, li J Dvfau ML , Tsai-Morris C H 2005 The gonadotropin-regulated long-chain acyl CoA synthetase gene A novel downstream Spl/Sp3 binding element critical for transcriptional promoter activity Gene 360(1) 20-26.

Simon A M Burden S J 1991 An F-box mediates activation and repression of the acetylcholine receptor delta-

subunit gene during myogenesis Mol Cell Biol 13(9) 5133-5140 Smale ST, Schmidt MC, Berk A.J Baltimore D 1990 Transcriptional activation by Spl as directed through TATA or initiator specific requirement for mammalian transcription factor 11D Proc Natl Acad Sci IJSA 87(12) 45094513

Spencer VA, Sun JM, Li L, Davie JR 2003 Chromatin immunoprecipitation a tool for studying histone

acetylation and transcription factor binding Methods 31(1) 67-75 Stemhoff C, Sthulz W A 2003 Transcriptional regulation of the human LINE-1 retrotransposon I 1 2B Mol Genet Genomics 270(5) 394-402

Strauss F, Varshavsfy A 1984 A protein binds to a satellite DNA repeat at three specific sites that would be

brought into mutual proximity by DNA folding in the nucleosome Ceil 37(3)' 889-901 Swergold G D. 1990 Identification, characterization, and cell specifity of a human LINE-1 promoter, Mol Cell Biol 10(12) 6718-6729

Thayer RE, Singer MF, Fanning TG 1993 Undermethylation of specific LINF-1 sequences m human cells

producing a LINE-1-encoded protein Gene 133(2) 273-277 TreloganSA Martin SL 1995 Tightly regulated, developmental^ specific expression of the first open reading frame from LINE-1 during mouse embryogenesis Proc Natl Acad Sci USA 92(5) 1520-1524

Wahl G M, Stern M„ Stark G R. 1979 Efficient transfer of large DNA fragments from agarose gels to diazobenzyloxymethyl-paper and rapid hybridization by using dextran sulfate Proc Natl Acad Sci USA 76(8) 3683-3687

Weu L, Reinberg D 1997 Accurate positioning of RNA polymerase II on a natural TATA-less promoter is independent of TATA-bindmg-protein-associated factors and initiator-binding proteins Mol Cell Biol 17(6) 2973-2984

Wilkerson DC, Wolfe SA, Grimes SR 2002 Hlt/GC-box and Hlt/TEl element are essential for promoter activity of the testis-specific histone Hit gene Biol Reprod 67(4) 1157-1164

Yang N. '¿hang L, Thong Y, Kazazian H H Jr 2003 An important role fro RIJNX3 in human LI transcription and retrotransposition Nucleic Acids Res. 31(16) 4929-4940

YoderJA, Walsh C P, Bestor T.H 1997 Cytosme methylation and the ecology of intragenomic parasites Trends Genet 13(8) 335-340

2hu WG, SrimvasanK, Dai Z Duan W Druhan 1. J DmgH, Yee I, Vitlalona-Cakro MA , Plans C, Otterson GA 2003 Methylation of adjacent CpG sites affects Spl/Sp3 binding and activity m the p21(Cipl) promoter Mol Cell Biol 23(12) 4056^065

Тиражирование и брошюровка выполнены в учреждении «Университетские телекоммуникации» 197101, Санкт-Петербург, Саблинская ул., 14 Тел. (812) 233 4669 Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федоров, Антон Владимирович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Цели и задачи исследования

Основные положения, выносимые на защиту

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. История открытия семейства повторов LINE

2. Структура повторов LINE

3. Консенсусные последовательности элементов LINE1 разных видов

4. Зарегистрированные ретротранспозиции LINE

5. Предполагаемые механизмы ретротранспозиции элементов LINE

6. Воздействие элементов LENE1 на геном млекопитающих

7. Промоторные последовательности LENE

8. Тканеспецифичность экспрессии LINE

9. Белки, связывающиеся с видоспецифичными промоторами элементов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Выделение ядер и получение ядерного экстракта

2. ДНК, плазмиды и олигонуклеотиды

3. Метод торможения в геле (ретардация)

4. Электрофоретическое разделение белков и их окрашивание в геле

5. Инкубация белков, иммобилизованных на мембране с меченой ДНК (Саузвестерн-блоттинг)

6. Иммуноблоттинг

7. Ионообменная хроматография белков

8. Аффинная очистка белков

9. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание

10. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

11. Выделение ДНК. Гибридизация по Саузерну и дот-блот гибридизация

12. Выделение РНК. Электрофорез РНК в формальдегидном агарозном геле. Нозернблоттинг.

13. Иммунопреципитация

14. Иммунопрецепитация хроматина

15. Компьютерные методы исследования 53 РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Тканеспецифичность экспрессии L1 крысы.

2. Геномная организация LIRn. Анализ промоторной области LIRn.

3. Выявление белков, связывающих промотор элементов L1 крысы in vitro.

4. Определение молекулярной массы PRLP- и nodel-связывающих белков. Аффинная очистка этих белков.

5. Идентификация PRLP- и nodel-связывающих белков.

6. Определение предполагаемых точек инициации транскрипции LIRn

7. Состояние метилирования геномных промоторов LIRn и влияние метилирования промотора LIRn на связывание с белками Spl, Sp3 и

МеСР2. •

8. Изучение связывания белков Spl, Sp3, МеСР2 с промоторами LIRn in vivo.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика транскрипционной и белок-связывающей активности промотора ретротранспозона LINE1 крысы"

Изучение геномов высших эукариот показало, что они содержат огромное количество повторяющихся последовательностей ДНК, функции которых в последнее время только начинают раскрываться. В геномах млекопитающих повторяющиеся последовательности ДНК составляют около 50%, в то время как гены — менее 5%. Среди повторяющихся последовательностей ДНК можно выделить пять классов: простые повторы, например (A)n, (CGG)n; сегментные дупликации, состоящие из блоков длиной примерно 30-100 т.п.н.; тандемно повторенные последовательности, такие как центромеры и теломеры; ретропозированные копии клеточных генов - процессированные псевдогены; и мобильные элементы, часто относимые к диспергированным повторам (Lander et al, 2001). При этом, большую часть повторяющихся последовательностей ДНК млекопитающих (примерно 40-45% генома) составляют мобильные элементы — траиспозоны и ретротрапспозопы (Lander et al, 2001).

Широкое распространение мобильных элементов в геномах обусловлено существованием эффективного механизма размножения этих последовательностей. Некоторые семейства мобильных элементов кодируют белки, необходимые для перемещения и встраивания в геном их копий. Такие мобильные элементы являются автономными.

У млекопитающих наиболее распространенным семейством автономных мобильных элементов, содержащим способные к перемещению копии, является семейство LINE1 (long interspersed nucleotide element 1). Элементы LINE1 занимают примерно 10-20% генома млекопитающих, они способны размножаться в геноме с помощью механизма обратной транскрипции посредством РНК интермедиата и поэтому являются ретротранспозонами (Ostertag, Kazazian, 2001). Белки, кодируемые LINE1, способствуют ретротранспозиции не только этих элементов, но и другой клеточной ДНК, в том числе ДНК неавтономных ретротранспозонов (Wei et al, 2001; Dewannieux et al, 2003).

Данные о функционировании элементов LINE I и их возможной роли в рекомбинации, репарации двунитевых разрывов, ретротранспозиции клеточной ДНК, организации структуры хроматина, геномных перестройках и регуляции транскрипции близлежащих генов больше не позволяют рассматривать повторы LINE1 лишь как «паразитическую» ДНК в геномах (Furano, 2000; Ostertag, Kazazian, 2001). Свое влияние на геном элементы LINE1 оказывают главным образом посредством ретротранспозиции, требующей экспрессии РНК LINE1 и кодируемых ими белков. Неконтролируемая ретротранспозиция элементов LINE1 может приводить к негативным последствиям дестабилизации генома клеток (Bourc'his, Bestor, 2004). Несмотря на это, ретротранспозиция элементов LINE1 не является абсолютно запрещенной у млекопитающих и происходит в определенных типах клеток (Brouha et al, 2002; Ostertag et al, 2002; Prak et al, 2003). Следовательно, существует четкий контроль активации и репрессии этих повторов in vivo. Одним из главных способов контроля ретротранспозиции элементов LINE1 является регуляция их экспрессии. Экспрессия элементов LINE1 тканеспецифична, однако механизмы ее регуляции до сих пор мало изучены. Белки, специфически связывающие регуляторные районы элементов LINE1, играют важную роль в контроле экспрессии этих ретротранспозонов. Поэтому можно ожидать, что изучение белков, специфически связывающих промоторные последовательности ретротранспозонов LINE1, позволит приблизиться к пониманию механизмов тканеспецифичной регуляции экспрессии повторов LINE1 в клетках млекопитающих.

Выявление и идентификация белков, специфически связывающих промотор ретротранспозона LINE1 крысы, являлось предметом настоящей работы.

Цели и задачи исследования

Цель данного исследования — изучение регуляции экспрессии LINE1 крысы (LIRn); анализ транскрипционной и белок-связывающей активности промотора ретротранспозона LIRn.

Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Проанализировать характер экспрессии LIRn в разных тканях; выбрать для дальнейшего исследования ткани с разным уровнем экспрессии белка pORFL

3. Выявить ядерные белки, специфически связывающие промотор LIRn in vitro, в исследуемых тканях. Подобрать условия очистки выявленных белков с помощью последовательных ионообменной и аффинной хроматографий. Определить их

• молекулярную массу и сайты связывания. Идентифицировать белки, специфически связывающие промотор ретротранспозона LIRn.

5. Методом иммунопреципитации хроматина проверить ассоциацию выявленных белков с промотором LIRn в исследуемых тканях in vivo.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Промотор LIRn частично деметилирован в клетках, экспрессирующих белок pORFT.

3. Белки Sp3 и МеСР2, но не YY1, взаимодействуют с промотором LIRn in vitro и in vivo.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Федоров, Антон Владимирович

выводы

1. В семенниках крысы экспрессируются дискретные смысловые транскрипты ретротранспозона LIRn и кодируемый LIRn белок pORFL В клетках печени, где не обнаруживается белок pORFI, транскрибируется дисперсный набор смысловых и антисмысловых РНК LIRn.

Автор признателен Диме Лукьянову за обучение основным экспериментальным методам на начальном этапе настоящей работы. Хотелось бы поблагодарить всех сотрудников Группы некодирующей ДНК за плодотворное обсуждение результатов исследования. Особую благодарность автор выражает научному руководителю Ольге Игоревне Подгорной за предоставленную тему и огромную поддержку, оказываемую на протяжении всей работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федоров, Антон Владимирович, Санкт-Петербург

1. Лукьянов Д.В., Решетникова Г.Ф., Подгорная О.И 1999. Аффинная очистка Alu-связывающих белков из соматических клеток человека. Биохимия. 64: 25-33.

2. Adams J.W., Kaufman RE., Kretschmer P.J., Harrison M., NienhuisA.W. 1980. A family of long reiterated DNA sequences, one copy of which is next to the human beta globin gene. Nucleic Acids Res. 8:6113-6128.

3. Adey N.B., Schichman SA., Graham D.K., Peterson S.N., Edgell M.H., Hutchison С A. 1994. Rodent LI evolution has been driven by a single dominant lineage that has repeatedly acquired new transcriptional regulatory sequences. Mol Biol Evol. 11:778-89.

4. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. 1990. Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215:403-410.

5. Asch H.L., Eliacin E., Fanning T.G., Connolly J.L., Bratthauer G., Asch B.B. 1996. Comparative expression of the LINE-1 p40 protein in human breast carcinomas and normal breast tissues. Oncol Res. 8:239-247.

6. Athanikar J.N., Badge RM., Moran J. V. 2004. A YY1 -binding site is required for accurate human LINE-1 transcription initiation. Nucl. Acids Res. 32:3846-3855.

7. Bailey J A., Carrel L., Chakravarti A., Eichler E.E. 2000. Molecular evidence for a relationship between LINE-1 elements and X chromosome inactivation: the Lyon repeat hypothesis. Proc Natl Acad Sci USA. 97:6634-6639.

8. Becker K.G., Jedlicka P., Templeton N.S., Liotta L., OzatoK. 1994. Characterization of hUCRBP (YY1, NF-E1, delta): a transcription factor that binds the regulatory regions of many viral and cellular genes. Gene. 150:259-266.

9. Belancio V.P., Hedges D.J., Deininger P. 2006. LINE-1 RNA splicing and influences on mammalian gene expression.Nucleic Acids Res. 34:1512-21.

10. Belgrader P., Siegel A J., Berezney R 1991. A comprehensive study on the isolation and characterization oftheHeLa S3 nuclear matrix. J. Cell. Sci. 98:281-291.

11. BenitL., Lallemand J.B., Casella J.F., Philippe H., Heidmann T. 1999. ERV-L elements: a family of endogenous retrovirus-like elements active throughout the evolution of mammals. J Virol. 73:3301-3308.

12. Beraldi R., Pittoggi C., Sciamanna I., Mattei E, Spadafora C. 2006. Expression of LINE-1 retroposons is essential for murine preimplantation development Mol Reprod Dev. 73:279287.

13. Bibillo A., Eickbush TJI. 2004. End-to-end template jumping by the reverse transcriptase encoded by theR2 retrotransposon. J Biol Chem. 279:14945-14953.

14. Bird A.P. 1980. DNA methylation and the frequency of CpG in animal DNA. Nucleic Acids Res. 8:1499-1504.

15. BirdA.P. 1986. CpG-rich islands and the function ofDNA methylation. Nature. 321:209-213.

16. Bird A.P., TaggartM.H., Nicholls R.D., HiggsD.R 1987. Non-methylated CpG-rich islands at the human alpha-globin locus: implications for evolution of the alpha-globin pseudogene. EMBO J. 6:999-1004.

17. Boissinot S., Chevret P., Furano A.V. 2000. LI (LINE-1) retrotransposon evolution and amplification in recent human history. Mol Biol Evol. 17:915-928.

18. Boissinot S., Entezam A., Furano A.V. 2001. Selection against deleterious LINE-1-containing loci in the human lineage. Mol Biol Evol. 18:926-935.

19. Boulikas T. 1995. Chromatin domains and prediction of MAR sequences. Int Rev Cytol.162A:279-388.

20. Bourchis D., Bestor T.H. 2004. Meiotic catastrophe and retrotransposon reactivation in male germ cells lacking Dnmt3L. Nature. 431:96-99.

21. Boyes J., Bird A. 1991. DNA methylation inhibits transcription indirectly via a methyl-CpG binding protein. Cell. 64:1123-1134.

22. Boyle A.L., Ballard S.G., Ward D.C. 1990. Differential distribution of long and short interspersed element sequences in the mouse genome: chromosome karyotyping by fluorescence in situ hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:7757-7761.

23. Branciforte D., Martin SX. 1994. Developmental and cell type specificity of LINE-1 expression in mouse testis: implications for transposition. Mol. Cell. Biol. 14:2584-2592.

24. Bratthauer G.L., Fanning T.G. 1992. Active LINE-1 retrotransposons in human testicular cancer. Oncogene. 7:507-510.

25. Breathnach R., Chambon P. 1981. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annu Rev Biochem. 50:349-83.

26. Brouha B., Meischl C., Ostertag E., de Boer M., Zhang Y., Neijens H., Roos D., Kazazian H.H. Jr. 2002. Evidence consistent with human LI retrotransposition in maternal meiosis L Am J Hum Genet. 71:327-336.

27. Brown S.D., Dover G. 1981. Organization and evolutionary progress of a dispersed repetitive family of sequences in widely separated rodent genomes. J Mol Biol. 150:441-466.

28. Brulet P., Condamine H., Jacob F. 1985. Spatial distribution of transcripts of the long repeated ETn sequence during early mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 82:2054-2058.

29. BucherP. 1990. Weight matrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase II promoter elements derived from 502 unrelated promoter sequences. J Mol Biol. 212:563-578.

30. Buratowski S. 1994. The basics of basal transcription by RNA polymerase n. Cell. 77:1-3.

31. Burke W.D., Calalang C.C., Eickbush T.H. 1987. The site-specific ribosomal insertion element type II of Bombyx mori (R2Bm) contains the coding sequence for a reverse transcriptase-like enzyme. Mol Cell Biol. 7:2221-2230.

32. Burton F.H., Loeb D.D., Chao S.F., Hutchison C.A., Edgell M.H. 1985. Transposition of a long member of the LI major interspersed DNA family into the mouse beta globin gene locus. Nucleic Acids Res. 13:5071-5084.

33. Burton F.H., Loeb D.D., Voliva C.F., Martin S.L., Edgell M.H., Hutchison CA. 1986. Conservation throughout mammalia and extensive protein-encoding capacity of the highly repeated DNA long interspersed sequence one. J Mol Biol. 187:291-304.

34. Burwinkel B., Kilimann M.W. 1998. Unequal homologous recombination between LINE-1 elements as a mutational mechanism in human genetic disease. J Mol Biol. 277:513-517.

35. Butler J.E., Kadonaga J.T. 2002. The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression. Genes Dev. 16:2583-2592.

36. Cabot E.L., Angeletti B., Usdin K., Furano A.V. 1997. Rapid evolution of a young LI (LINE-1) clade in recently speciated Rattus taxa. J Mol Evol. 45:412-423.

37. Casavant N.C., Scott L., CantrellMA., Wiggins L.E., Baker R J., Wichman HA. 2000. The end of the LINE?: lack of recent LI activity in a group of South American rodents. Genetics. 154:1809-1817.

38. Chang Y.S., Wang L., Suh YA., Mao L., Karpen SJ., Khuri F.R., Hong W.K., Lee H.Y 2004. Mechanisms underlying lack of insulin-like growth factor-binding protein-3 expression in non-small-cell lung cancer. Oncogene. 23:6569-6580.

39. Christensen S., Pont-Kingdon G., Carroll D. 2000. Comparative studies of the endonucleases from two related Xenopus laevis retrotransposons, TxlL and Tx2L: target site specificity and evolutionary implications. Genetica. 110:245-256.

40. Contursi C., Minchiotti G., Di Nocera P.P. 1995. Identification of sequences which regulate the expression of Drosophila melanogaster Doc elements. J. Biol. Chem. 270:26570-26576.

41. Cost G.J., Feng Q., BoekeJ.D. 2000. Initiation of LI transposition in vitro. Presented at Keystone Symp. Transposition and Other Genome Rearrangements, Santa Fe, NM. (Abstr. 119)

42. Cost G.J., Golding A., Schlissel M.S., Boeke J.D. 2001. Target DNA chromatinization modulates nicking by LI endonuclease. Nucleic Acids Res. 29:573-577.

43. CoureyAJ., Holtzman DA., Jackson S.P., Tjian R. 1989. Synergistic activation by the glutaminerich domains of human transcription factor Spl. Cell. 59:827-836.

44. D'Ambrosio E, Waitzkin S.D., Witney F.R., Salemme A., Furano A.V. 1986. Structure of the highly repeated, long interspersed DNA family (LINE or LIRn) of the rat Mol Cell Biol. 6:411-424.

45. DeBerardinis RJ., Kazazian H.HJr. 1999. Analysis of the promoter from an expanding mouse retrotransposon subfamily. Genomics. 56:317-323.

46. Deragon JM., Sinnett D., Labuda D. 1990. Reverse transcriptase activity from human embryonal carcinoma cells NTera2Dl. EMBO J. 9:3363-3368.

47. Dewannieux M., EsnaultC., Heidmann T. 2003. LINE-mediated retrotransposition of marked Alu sequences. Nat Genet. 35:41-48.

48. Dewannieux M., Heidmann T. 2005. LINEs, SINEs and processed pseudogenes: parasitic strategies for genome modeling. Cytogenet Genome Res. 110:35-48.

49. Diallo M., Arenz C., Schmitz K., Sandhoff K., Schepers U. 2003. Long endogenous dsRNAs can induce complete gene silencing in mammalian cells and primary cultures. Oligonucleotides. 13:381-392.

50. Dombroski BA., Feng Q., Mathias S.L., Sassaman DM., Scott A.F., Kazazian H.H. Jr, Boeke J.D. 1994. An in vivo assay for the reverse transcriptase of human retrotransposon LI in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 14:4485-4492.

51. Dunn MJ. 1993. Gel electrophoresis: Proteins. BIOS Scientific Publishers, Oxford NY.

52. Dynan W.S., Tjian R. 1983a. Isolation of transcription factors that discriminate between different promoters recognized by RNA polymerase n. Cell. 32:669-680.

53. Dynan W.S., Tjian R. 1983b. The promoter-specific transcription factor Spl binds to upstream sequences in the SV40 early promoter. Cell. 35:79-87.

54. Eickbush T.H. 2002. Repair by retrotransposition. Nat Genet. 31:126-127.

55. Evans J.P., Palmiter R.D. 1991. Retrotransposition of a mouse LI element. Proc Natl Acad Sci U S A. 88:8792-8795.

56. Fanning T.G. 1983. Size and structure of the highly repetitive BAM HI element in mice. Nucleic Acids Res. 11:5073-5091.

57. Farkash EA., Kao G.D., Horman S.R, PrakE.T. 2006. Gamma radiation increases endonuclease-dependent LI retrotransposition in a cultured cell assay. Nucleic Acids Res. 34:1196-1204.

58. Fawcett D.H., Lister C.K., Kellett E., Finnegan D.J. 1986. Transposable elements controlling I-R hybrid dysgenesis in D. melanogaster are similar to mammalian LINEs. Cell. 47:1007-1015.

59. Feng Q., MoranJ.V., Kazazian H.H. Jr., Boeke J.D. 1996. Human LI retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell. 87:905-916.

60. Fitch D.H., Bailey WJ., Tagle DA., Goodman M., Sieu L., Slightom J.L. 1991. Duplication of the gamma-globin gene mediated by LI long interspersed repetitive elements in an early ancestor of simian primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 88:7396-7400.

61. FlorlA.R, Lower R, Schmitz-Drager B.J., Schulz WA. 1999. DNA methylation and expression of LINE-1 and HERV-K provirus sequences in urothelial and renal cell carcinomas. Br J Cancer. 80:1312-1321.

62. Fukuda Y. 2000. Interaction of nuclear proteins with intrinsically curved DNA in a matrix attachment region of a tobacco gene. Plant Mol Biol. 44:91-98.

63. Furano A.V. 2000. The biological properties and evolutionary dynamics of mammalian LINE-1 retrotransposons. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 64:255-294.

64. Furano A.V., Robb SM., Robb F.T. 1988. The structure of the regulatory region of the rat LI (LIRn, long interspersed repeated) DNA family of transposable elements. Nucleic Acids Res. 16: 9215-9231.

65. Gadhavi P.L., Greenwood M.D., Strom M., King I A., Buxton RS. 2001. The regulatory region of the human desmocollin 3 promoter forms a DNA four-way junction. Biochem Biophys Res Commun. 281:520-528.

66. Gardiner-Garden M., Frommer M. 1987. CpG islands in vertebrate genomes. J Mol Biol. 196:261-282.

67. Garrett J.E, Knutzon D.S., Carroll D. 1989. Composite transposable elements in the Xenopus laevis genome. Mol Cell Biol. 9:3018-3027.

68. Gasior S.L., Wake man T.P., Xu B., Deininger P.L. 2006. The human LINE-1 retrotransposon creates DNA double-strand breaks. J Mol Biol. 357:1383-1393.

69. Gibbs RA., Weinstock GM., Metzker M.L., Muzny DM., Sodergren E.J et al. 2004. Genome sequence of the Brown Norway rat yields insights into mammalian evolution. Nature. 428:493-521.

70. Gill G., Pascal E., Tseng Z.H., Tjian R 1994. A glutamine-rich hydrophobic patch in transcription factor Spl contacts the dTAFIIllO component of the Drosophila TFIID complex and mediates transcriptional activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 91:192-196.

71. Goodier J.L., Ostertag EM., Du K, Kazazian H.H. Jr. 2001. A novel active LI retrotransposon subfamily in the mouse. Genome Res. 11:1677-1685.

72. Goodier J.L., Ostertag EM., Kazazian H.H. Jr. 2000. Transduction of 3-flanking sequences is common in LI retrotransposition. Hum Mol Genet 9:653-657.

73. Gorlich £>., Kutay U. 1999. Transport between the cell nucleus and the cytoplasm. Annu Rev Cell DevBiol. 15:607-660.

74. Haas N.B., Grabowski JM., SivitzA.B., BurchJ.B. 1997. Chicken repeat 1 (CR1) elements,which define an ancient family of vertebrate non-LTR retrotransposons, contain two closely spaced open reading frames. Gene. Sep 197:305-309.

75. Hagen G., MullerS., BeatoM., Suske G. 1992. Cloning by recognition site screening of two novel GT box binding proteins: a family of Spl related genes. Nucleic Acids Res. 20:5519-5525.

76. Han J.S., Szak S.T., Boeke J.D. 2004. Transcriptional disruption by the LI retrotransposon and implications for mammalian transcriptomes. Nature. 429:268-274.

77. Hardies S.C., WangL., Zhou L., Zhao K, CasavantN.C., HuangS. 2000. LINE-1 (LI) lineages in the mouse. Mol Biol Evol. 17:616-628.

78. Hayward B.E., Zavanelli M., Furano A.V. 1997. Recombination creates novel LI (LINE-1) elements in Rattus norvegicus, Genetics. 146:641-654.

79. Hirose Y., ManleyJ.L. 1998. RNA polymerase II is an essential mRNA polyadenylation factor. Nature. 395:93-96.

80. Hohjoh H., Singer M.F. 1996. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA EMBO J. 15:630-639.

81. Hohjoh H., Singer M.F. 1997. Sequence-specific single-strand RNA binding protein encoded by the human LINE-1 retrotransposon. EMBO J. 16:6034-6043.

82. Holmes S.E., Singer MJ?., Swergold G.D. 1992. Studies on p40, the leucine zipper motif-containing protein encoded by the first open reading frame of an active human LINE-1 transposable element. J Biol Chem. 267:19765-19768.

83. Javahery R., Khachi A., Lo K., Zenzie-Gregory B., Smale S.T. 1994. DNA sequence requirements for transcriptional initiator activity in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 14:116-127.

84. Jones P.L., Veenstra GJ, Wade PA., VermaakD., KassS.U., Landsberger N., Strouboulis J., WolffeA.P. 1998. Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription. Nat Genet. 19:187-191.

85. Jubier-Maurin V., Cuny G., Laurent AM., Paquereau L., Roizes G. 1992. A new 5' sequence associated with mouse LI elements is representative of a major class of LI termini. Mol Biol Evol. 9:41-55.

86. JurkaJ. 1997. Sequence patterns indicate an enzymatic involvement in integration of mammalian retroposons. Proc Natl Acad Sci USA. 94:1872-1877.

87. Kadonaga J.T., CoureyAJ., Ladika J., Tjian R. 1988. Distinct regions of Spl modulate DNA binding and transcriptional activation. Science. 242:1566-1570.

88. Kadonaga J.T., Tjian R. 1986. Affinity purification of sequence-specific DNA binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:5889-5893.

89. Kaludov N.K., Wolffe A.P. 2000. MeCP2 driven transcriptional repression in vitro: selectivity for methylated DNA, action at a distance and contacts with the basal transcription machinery. Nucleic Acids Res. 28:1921-1928.

90. Kazazian H.H. Jr., Wong C., Youssoufian H., Scott A.F., Phillips D.G., Antonarakis S.E. 1988. Haemophilia A resulting from de novo insertion of LI sequences represents a novel mechanism for mutation in man. Nature. 332:164-166.

91. Kim K, Thu N., Saville B., Safe S. 2003. Domains of estrogen receptor alpha (ERalpha) required for ERalpha/Spl-mediated activation of GC-rich promoters by estrogens and antiestrogens in breast cancer cells. Mol Endocrinol. 17:804-817

92. Kimmel B.E., ole-MoiYoi O.K., Young J.R. 1987. Ingi, a 5.2-kb dispersed sequence element from Trypanosoma brucei that carries half of a smaller mobile element at either end and has homology with mammalian LINEs. Mol Cell Biol. 7:1465-1475.

93. Kingsley C., Winoto A. 1992. Cloning of GT box-binding proteins: a novel Spl multigene family regulating T-cell receptor gene expression. Mol Cell Biol. 12:4251-4261.

94. Klose RJ., Bird A.P. 2004. MeCP2 behaves as an elongated monomer that does not stably associate with the Sin3a chromatin remodeling complex. J Biol Chem. 279:46490-46496.

95. Klose RJ., Bird A.P. 2006. Genomic DNA methylation: the mark and its mediators. Trends Biochem. Sci. 31:89-97.

96. Klose RJ., SarrafSA., Schmiedeberg L., McDermott SM., Stancheva I., Bird AJ>. 2005. DNA binding selectivity of MeCP2 due to a requirement for A/T sequences adjacent to methyl-CpG. Mol Cell. 19:667-678.

97. Kolosha V.O., Martin S.L. 1997. In vitro properties of the first ORF protein from mouse LINE-1 support its role in ribonucleoprotein particle formation during retrotransposition. Proc Natl Acad Sci USA. 94:10155-10160.

98. KomatsuM., Shimamoto K, KyozukaJ. 2003. Two-step regulation and continuousretrotransposition of the rice LINE-type retrotransposon Karma. Plant Cell. 15:1934-1944.

99. Koop B.F., Baker R.J., Genoways H.H. 1983. Numerous chromosomal polymorphisms in a natural population of rice rats (Oryzomys, Cricetidae). Cytogenet Cell Genet. 35:131-135.

100. Korenberg J.R., Rykowski M.C. 1988. Human genome organization: Alu, Lines, and the molecular structure of metaphase chromosome bands. Cell. 53:391-400.

101. KuJfEL., Lueders K.K. 1988. The intracisternal A-particle gene family: structure and functional aspects. Adv Cancer Res. 51:183-276.

102. Kulpa DA., Moran J.V. 2005. Ribonucleoprotein particle formation is necessary but not sufficient for LINE-1 retrotransposition. Hum Mol Genet. 14:3237-3248.

103. KurachiS., Deyashiki Y., TakeshitaJ., KurachiK. 1999. Genetic mechanisms of age regulation of human blood coagulation factor IX. Science. 285:739-743.

104. Kurose K, Hata K, HattoriM, Sakaki Y. 1995. RNA polymerase III dependence of the human LI promoter and possible participation of the RNA polymerase II factor YY1 in the RNA polymerase III transcription system. Nucleic Acids Res. 23:3704-3709.

105. Kutach A.K., Kadonaga J.T. 2000. The downstream promoter element DPE appears to be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters. Mol Cell Biol. 20:4754-4764.

106. JM., Datto M.B., Shen X., Hu P.P., Yu Y, Wang X.F. 1998. Spl, but not Sp3, functions to mediate promoter activation by TGF-beta through canonical Spl binding sites. Nucleic Acids Res. 26:2449-2456.

107. L., He S., Sun JM., Davie J.R. 2004. Gene regulation by Spl and Sp3. Biochem. Cell. Biol. 82:460-471.

108. Maio J J., Brown F.L., McKenna W.G., Musich P.R. 1981. Toward a molecular paleontology of primate genomes. H The Kpnl families of alphoid DNAs. Chromosoma. 83:127-144.

109. Majello B., De Luca P., Lania L. 1997. Sp3 is a Afunctional transcription regulator with modular independent activation and repression domains. J Biol Chem. 272:4021-4026.

110. Maksakova IA., Mager D.L. 2005. Transcriptional regulation of early transposon elements, an active family of mouse long terminal repeat retrotransposons. J. Virol. 79:13865-13874.

111. Malik H.S., Burke W.D., Eickbush T.H. 1999. The age and evolution of non-LTR retrotransposable elements. Mol Biol Evol. 16:793-805.

112. MalkovM., Fisher Y, Don J. 1998. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Reprod. 59:84-92.

113. Martin F., Maranon C., OlivaresM., Alonso C., Lopez M.C. 1995. Characterization of a non-long terminal repeat retrotransposon cDNA (LITc) from Trypanosoma cruzi: homology of the first ORF with the ape family of DNA repair enzymes. J Mol Biol. 247:49-59.

114. Martin S.L. 1991. Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol. 11:4804-4807.

115. Martin S.L., Branciforte D. 1993. Synchronous expression of LINE-1 RNA and protein in mouse embryonal carcinoma cells. Mol. Cell. Biol. 13:5383-5392.

116. Martin S.L., Branciforte D., Keller D., Bain D.L. 2003. Trimeric structure for an essential protein in LI retrotransposition. Proc Natl Acad Sci USA. 100:13815-13820.

117. Martin S.L., Bushman F.D. 2001. Nucleic acid chaperone activity of the ORF1 protein from the mouse LINE-1 retrotransposon. Mol Cell Biol. 21:467-475.

118. Martin S.L., Li J., Weisz J A. 2000. Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1. J Mol Biol. 304:11-20.

119. Martin S.L., Li W.L., Furano A.V., Boissinot S. 2005. The structures of mouse and human LI elements reflect their insertion mechanism. Cytogenet Genome Res. 110:223-228.

120. Mathias S.L., Scott A.F. 1993. Promoter binding proteins of an active human LI retrotransposon. Biochem Biophys Res Commun. 191:625-632.

121. Mathias S.L., Scott A.F., Kazazian H.H. Jr, Boeke J.D, Gabriel A. 1991. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element Science. 254:1808-1810.

122. McCracken S., Fong N., Yankiilov K, Ballantyne S., Pan G., Greenblatt J., Patterson S.D., Wickens M., Bentley D.L. 1997. The C-terminal domain of RNA polymerase II couples mRNA processing to transcription. Nature. 385:357-361.

123. McDevitt MA., Imperiale MJ., Ali H., Nevins J.R. 1984. Requirement of a downstream sequence for generation of a poly(A) addition site. Cell. 37:993-999.

124. McLauchlan J., Gajjfhey D., Whitton J.L., Clements J.B. 1985. The consensus sequence YGTGTTYY located downstream from the AATAAA signal is required for efficient formation of mRNA 3' termini. Nucleic Acids Res. 13:1347-1368.

125. McMillan J.P., Singer M.F. 1993. Translation of the human LINE-1 element, LIHs. Proc Natl Acad Sci USA 90:11533-11537.

126. Meischl C., BoerM., Ahlin A., Roos D. 2000. A new exon created by intronic insertion of a rearranged LINE-1 element as the cause of chronic granulomatous disease. Eur J Hum Genet. 8:697-703.

127. Meunier-Rotival M., Soriano P., Cuny G., Strauss F., Bernardi G. 1982. Sequence organization and genomic distribution of the major family of interspersed repeats of mouse DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 79:355-359.

128. Minakami R, Kurose K, Etoh K, Furuhata Y., Hattori M., Sakaki Y. 1992. Identification of an internal cis-element essential for the human LI transcription and a nuclear factors) binding to the element Nucleic Acids Res. 20:3139-3145.

129. Minchiotti G., Contursi C., Di Nocera P.P. 1997. Multiple downstream promoter modules regulate the transcription of the Drosophila melanogaster I, Doc and F elements. J Mol Biol. 267:37-46.

130. MoranJ.V., DeBerardinisRJ., Kazazian H.H. Jr. 1999. Exon shuffling by LI retrotransposition. Science. 283:1530-1534.

131. Moran J. V., Holmes S.E., Naas T.P., DeBerardinis RJ., Boeke J.D., Kazazian H.H. Jr. 1996. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells. Cell. 87:917-927.

132. Morrish TA., Gilbert N. Myers J.S., Vincent BJ., Stamato T.D., Taccioli G.E., Batzer MA., Moran J.V. 2002. DNA repair mediated by endonuclease-independent LINE-1 retrotransposition. Nat Genet 31:159-165.

133. Morse B., RothergP.G., South V.J., Spandorfer JM., Astrin SM. 1988. Insertional mutagenesis of the myc locus by a LINE-1 sequence in a human breast carcinoma. Nature. 333:87-90.

134. Naas T.P., DeBerardinis RJ., Moran J.V., Ostertag EM., Kingsmore S.F., Seldin M.F., Hayashizaki Y., Martin S.L., Kazazian H.H. 1998. An actively retrotransposing, novel subfamily of mouse LI elements. EMBO J. 17:590-597.

135. Nan X., Campoy FJ., Bird A. 1997. MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin. Cell. 88:471-481.

136. Nan X., NgH.H., Johnson CA., Laherty C.D., Turner B.M., Eisenman R.N., Bird A. 1998

137. Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex. Nature. 393:386-389.

138. Nekrutenko A., Li W.H. 2001. Transposable elements are found in a large number of human protein-coding genes. Trends Genet. 17:619-621.

139. Nigumann P., RedikK., MatlikK., SpeekM. 2002. Many human genes are transcribed from the antisense promoter of LI retrotransposon. Genomics. 79:628-634.

140. Nocera P.P., Casari G. 1987. Related polypeptides are encoded by Drosophila F elements, I factors, and mammalian LI sequences. Proc Natl Acad Sci USA. 84:5843-5847.

141. Nocera P.P., Graziani F., Lavorgna G. 1986. Genomic and structural organization of Drosophila melanogaster G elements. Nucleic Acids Res. 14:675-691.

142. Noma K., Ohlsubo H., Ohtsubo E. 2000. ATLN elements, LINEs from Arabidopsis thaliana: identification and characterization. DNARes. 7:291-303.

143. Nur I., Pascale E, Furano A.V. 1988. The left end of rat LI (LIRn, long interspersed repeated) DNA which is a CpG island can function as a promoter. Nucleic Acids Res. 16:9233-9251.

144. Osheim Y.N., Proudfoot NJ., Beyer A.L. 1999. EM visualization of transcription by RNA polymerase II: downstream termination requires a poly(A) signal but not transcript cleavage. Mol Cell. 3:379-387.

145. Ostertag EM., DeBerardinis RJ., Goodier J.L., Zhang Y, Yang N., Gerton G.L., Kazazian H.HJr. 2002. A mouse model of human LI retrotransposition. Nat Genet 32:655-660.

146. Ostertag EM., Kazazian H.HJr. 2001. Biology of mammalian LI retrotransposons. Annu. Rev. Genet. 35:501-538.

147. Ovchinnikov I., Troxel A.B., Swergold G.D. 2001. Genomic characterization of recent human LINE-1 insertions: evidence supporting random insertion. Genome Res. 11:2050-2058.

148. Packer A J., Manova K, Bachvarova R.F. 1993. A discrete LINE-1 transcript in mouse blastocysts. Dev. Biol. 157:281-283.

149. Padgett R.W., Hutchison CA., EdgellM.H. 1988. The F-type 5' motif of mouse LI elements: a major class of LI termini similar to the A-type in organization but unrelated in sequence. Nucleic Acids Res. 16:739-749.

150. Pascal E., Tjian R. 1991. Different activation domains of Spl govern formation of multimers and mediate transcriptional synergism. Genes Dev. 5:1646-1656.

151. Penzkofer T., Dandekar T., Zemojtel T. 2005. LIBase: from functional annotation to prediction of active LINE-1 elements, Nucleic Acids Res. 33:D498-500.

152. Perepelitsa-Belancio V., Deininger P. 2003. RNA truncation by premature polyadenylation attenuates human mobile element activity. Nat Genet. 35:363-366.

153. Pickeral O.K., Makalowski IV., Boguski M.S., Boeke J.D. 2000. Frequent human genomic DNA transduction driven by LINE-1 retrotransposition. Genome Res. 10:411-415.

154. Pittoggi C., Sciamanna /., Mattei E., Beraldi R., Lobascio AM., Mai A., Quaglia M.G., Lorenzini K, Spadafora C. 2003. Role of endogenous reverse transcriptase in murine early embryo development. Mol Reprod Dev. 66:225-236.

155. Poulter K, Butler M., Ormandy J. 1999. A LINE element from the pufferfish (fugu) Fugu rubripes which shows similarity to the CR1 family of non-LTR retrotransposons. Gene. 227:169-179.

156. Prak E.T., Dodson A.W., Farkash EA., Kazazian H.H. Jr. 2003. Tracking an embryonic LI retrotransposition event. Proc Natl Acad Sci U S A 100:1832-1837.

157. Pugh BJF., Tjian R 1991. Transcription from a TATA-less promoter requires a multisubunit TFIID complex. Genes Dev. 5:1935-1945.

158. Rahuel C., Vinit M.A., Lemarchandel V., Cartron J.P., Romeo P.H. 1992. Erythroid-specific activity of the glycophorin B promoter requires GATA-1 mediated displacement of a repressor. EMBO J. 11:4095-4102.

159. Reik W., Dean W., Walter J. 2001. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293:1089-1093.

160. Rinehart TA., Grahn RA.f Wichman HA. 2005. SINE extinction preceded LINE extinction in sigmodontine rodents: implications for retrotranspositional dynamics and mechanisms. Cytogenet Genome Res. 110:416-425.

161. Sambrook J., Fritch E.F. &Maniatis T. 1989. Molecular cloning: A laboratory Manual, second ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY

162. Saxton J A., Martin S.L. 1998. Recombination between subtypes creates a mosaic lineage of LINE-1 that is expressed and actively retrotransposing in the mouse genome. J Mol Biol. 280:611-622.

163. ScherrM., Morgan MA., EderM. 2003. Gene silencing mediated by small interfering RNAs in mammalian cells. Curr Med Chem. 10:245-256.

164. Schichman SA., Adey N.B., Edgell M.H., Hutchison CA. 1993. LI A-monomer tandem arrays have expanded during the course of mouse LI evolution. Mol Biol Evol. 10:552-570.

165. Schmid C.W., Deininger P.L. 1975. Sequence organization of the human genome. Cell. 6:345358.

166. Schmitz E., Mohr E., Richter D. 1991. Rat vasopressin and oxytocin genes are linked by a long interspersed repeated DNA element (LINE): sequence and transcriptional analysis of LINE. DNA Cell Biol. 10:81-91.

167. Schwahn U., LenznerS., Dong J., Feil S., Hinzmann B., van Duijnhoven G„ Kirschner R., Hemberger M., Bergen A A., Rosenberg T., Pinckers A J., FundeleR., Rosenthal A.,

168. Cremers F.P., Ropers H.H., Berger W. 1998. Positional cloning of the gene forX-linked retinitis pigmentosa 2. Nat Genet 19:327-332.

169. Schwarz-Sommer Z, Leclercq L., Gobel E., SaedlerH. 1987. Cin4, an insert altering the structure of the A1 gene in Zea mays, exhibits properties of nonviral retro transposons. EMBO J. 6:3873-3880.

170. Scott A.F., Schmeckpeper BJ., AbdelrazikM, Comey C.T., O'Hara B., Rossiter J.P., Cooley T., Heath P., Smith K.D., Margolet L. 1987. Origin of the human LI elements: proposed progenitor genes deduced from a consensus DNA sequence.Genomics. 1:113-125.

171. Segal-Bendirdjian E., Heidmann T. 1991. Evidence for a reverse transcription intermediate for a marked line transposon in tumoral rat cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 181:863-870.

172. Semon M., Duret L. 2004. Evidence that functional transcription units cover at least half of the human genome. Trends Genet. 20:229-232.

173. Severynse DM., Hutchison CA., Edgell M.H. 1992. Identification of transcriptional regulatory activity within the 5' A-type monomer sequence of the mouse LINE-1 retroposon. Mamm Genome. 2:41-50.

174. Shafit-Zagardo B., Brown F.L., Zavodny P.J., MaioJJ. 1983. Transcription of the Kpnl families of long interspersed DNAs in human cells. Nature. 304:277-280.

175. Sheng Y., Li J., Dufau M.L., Tsai-Morris C.H. 2005. The gonadotropin-regulated long-chain acyl CoA synthetase gene: A novel downstream Spl/Sp3 binding element critical for transcriptional promoter activity. Gene. 360:20-26.

176. Shpigelman E.S., Trifonov E.N., Bolshoy A. 1993. Curvature: software for the analysis of curved DNA. Comput Appl Biosci. 9:435-440.

177. Shrivastava A., Calame K. 1994. An analysis of genes regulated by the multi-functional transcriptional regulator Yin Yang-1. Nucleic Acids Res. 22:5151-5155.

178. Simon AM., Burden S.J. 1993. An E-box mediates activation and repression of the acetylcholine receptor delta-subunit gene during myogenesis. Mol. Cell. Biol. 13:5133-5140.

179. Singer M.F. 1982. SINEs and LINEs: highly repeated short and long interspersed sequences in mammalian genomes. Cell. 28:433-434.

180. SingerM.F., Thayer R.E., Grimaldi G., Lerman M.I., Fanning T.G. 1983. Homology between the Kpnl primate and BamHl (M1F-1) rodent families of long interspersed repeated sequences. Nucleic Acids Res. 11:5739-5745.

181. Singh G., Kramer J., and Krawetz S. 1997. Mathematical model to predict regions of chromatin attachment to the nuclear matrix. Nucl. Acids Res. 25:1419-1425.

182. Skowronski J., Fanning T.G., Singer M.F. 1988. Unit-length line-1 transcripts in human teratocarcinoma cells. Mol Cell Biol. 8:1385-1397.

183. Smale S.T., Schmidt M.C., Berk AJ., Baltimore D. 1990 Transcriptional activation by Spl as directed through TATA or initiator: specific requirement for mammalian transcription factor IID. Proc Natl Acad Sci USA. 87:4509^513.

184. Smale S.T., Schmidt M.C., Berk AJ., Baltimore D. 1990. Transcriptional activation by Spl as directed through TATA or initiator specific requirement for mammalian transcription factor IID. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:4509-4513.

185. Soares M.B., Schon E., Efstratiadis A. 1985. Rat LINE1: the origin and evolution of a family of long interspersed middle repetitive DNA elements. J Mol Evol. 22:117-133.

186. Sowa Y, Orita T., Minamikawa-Hiranabe S„ Mizimo T., Nomura H., Sakai T. 1999. Sp3, but not Spl, mediates the transcriptional activation of the p21/WAFl/Cipl gene promoter by histone deacetylase inhibitor. Cancer Res.59:4266-4270.

187. SpeekM. 2001. Antisense promoter of human LI retrotransposon drives transcription of adjacent cellular genes. Mol Cell Biol. 21:1973-1985.

188. Spencer VA., Sun JM., Li L., Davie J.R. 2003. Chromatin immunoprecipitation: a tool for studying histone acetylation and transcription factor binding. Methods. 31:67-75.

189. Steinhoff C.f Schulz WA. 2003. Transcriptional regulation of the human LINE-1 retrotransposon L1.2B. Mol Genet Genomics. 270:394-402.

190. Strauss F., Varshavsky A. 1984. A protein binds to a satellite DNA repeat at three specific sites that would be brought into mutual proximity by DNA folding in the nucleosome. Cell. 37:889-901.

191. Suske G. 1999. The Sp-family of transcription factors. Gene. 238:291-300.

192. Swergold G.D. 1990. Identification, characterization, and cell specifity of a human LINE-1 promoter, Mol. Cell. Biol. 10:6718-6729.

193. Szak S.T., Pickeral O.K., Makalowski W., Boguski M.S., Landsman D., Boeke J.D. 2002. Molecular archeology of LI insertions in the human genome. Genome Biol. 3 : research0052

194. Takai D., Yagi Y., Habib N. Sugimura T., Ushijima T. 2000. Hypomethylation of LINE1 retrotransposon in human hepatocellular carcinomas, but not in surrounding liver cirrhosis. Jpn J Clin Oncol. 30:306-309.

195. Tchenio T., Casella J.F., Heidmann T. 2000. Members of the SRY family regulate the human LINE retrotransposons. Nucleic Acids Res. 28:411-415.

196. Tchenio T., Segal-Bendirdjian E., Heidmann T. 1993. Generation of processed pseudogenes in murine cells. EMBO J. 12:1487-1497.

197. Thayer KE., Singer M.F., Fanning T.G. 1993. Undermethylation of specific LINE-1 sequences in human cells producing a LINE-1-encoded protein. Gene. 133:273-277.

198. Torigoe T., Izumi H., Yoshida Y, Ishiguchi H., Okamoto T., Itoh H., Kohno K. 2003. Low pH enhances Spl DNA binding activity and interaction with TBP. Nucleic Acids Res. 31:45234530.

199. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76:4350-4354.

200. Trelogan SA., Martin S.L. 1995. Tightly regulated, developmentally specific expression of the first open reading frame from LINE-1 during mouse embiyogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:1520-1524

201. UsdinK., ChevretP., CatzejlisF.M., VeronaR, FuranoA.V. 1995 LI (LINE-1) retrotransposable elements provide a "fossil" record of the phylogenetic history of murid rodents. Mol Biol Evol. 12:73-82.

202. Vandergon T.L., Reitman M. 1994. Evolution of chicken repeat 1 (CR1) elements: evidence for ancient subfamilies and multiple progenitors.Mol Biol Evol. 11:886-898.

203. Wahl GM., Stem M., Stark G.R 1979. Efficient transfer of large DNA fragments from agarose gels to diazobenzyloxymethyl-paper and rapid hybridization by using dextran sulfate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:3683-3687,

204. Wakefield KI., Smith B.O., Nan X., Free A., Soteriou A, Uhrin D., BirdA.P., Barlow P.N. 1999. The solution structure of the domain from MeCP2 that binds to methylated DNA. J Mol Biol. 291:1055-1065.

205. Waterston R.H., Lindblad-Toh K., Bimey E., Rogers J., Abril J.F. et al. 2002. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420:520-562.

206. Watt F., Molloy P.L. 1988. Cytosine methylation prevents binding to DNA of a HeLa cell transcription factor required for optimal expression of the adenovirus major late promoter.Genes Dev. 2:1136-1143.

207. Wegner M. 1999. From head to toes: the multiple facets of Sox proteins. Nucleic Acids Res. 27:1409-1420.

208. Wei W., Gilbert N. Ooi S.L., Lawler J.F., Ostertag EM., Kazazian H.H., Boeke J.D., Moran J. V. 2001 Human LI retrotransposition: cis preference versus trans complementation. Mol Cell Biol. 21:1429-1439.

209. Weis L., Reinberg D. 1997. Accurate positioning of RNA polymerase II on a natural TATA-less promoter is independent of TATA-binding-protein-associated factors and initiator-binding proteins. Mol. Cell. Biol. 17:2973-2984.

210. Whitcomb JM., Hughes S.H. 1992. Retroviral reverse transcription and integration: progress and problems. Annu Rev Cell Biol. 8:275-306.

211. Wilkerson D.C., Wolfe SA., Grimes S.R. 2002. Hlt/GC-box and Hlt/TEl element are essential for promoter activity of the testis-specific histone Hit gene. Biol. Reprod. 67:1157-1164.

212. Woodcock DM., Williamson M.R, Doherty J.P. 1996. A sensitive RNase protection assay to detect transcripts from potentially functional human endogenous LI retrotransposons. Biochem Biophys Res Commun. 222:460^65.

213. Wurtele H, Gusew N., Lussier R, Chartrand P. 2005. Characterization of in vivo recombination activities in the mouse embryo. Mol Genet Genomics. 273:252-263.

214. YangN., Zhang L., Zhang Y, Kazazian H.H.Jr. 2003. An important role fro RUNX3 in human LI transcription and retrotransposition. Nucleic Acids Res. 31:4929^940.

215. Yang Z., Boffelli £>., Boonmark N. Schwartz K., Lawn R. 1998. Apolipoprotein(a) gene enhancer resides within a LINE element. J Biol Chem. 273:891-897.

216. YoderJA., Walsh C.P., Bestor T.H. 1997. Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites. Trends Genet. 13:335-340.

217. Yu B., Datta P.K., Bagchi S. 2003. Stability of the Sp3-DNA complex is promoter-specific: Sp3 efficiently competes with Spl for binding to promoters containing multiple Sp-sites. Nucleic Acids Res. 31:5368-5376.

218. Yu F., Thiesen J., Stratling W.H. 2000. Histone deacetylase-independent transcriptional repression by methyl-CpG-binding protein 2. Nucleic Acids Res. 28:2201-2206.

219. Yu F., Zingler N., Schumann G., Stratling W.H. 2001. Methyl-CpG-binding protein 2 represses LINE-1 expression and retrotransposition but not Alu transcription. Nucleic Acids Res. 29:4493-4501.

220. Zawel L., Reinberg D. 1993. Initiation of transcription by RNA polymerase II: a multi-step process. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 44:67-108.

221. Zhu W.G., Srinivasan K., Dai Z., Duan W., Druhan L.J., Ding H., Yee L., Villalona-Calero MA., Plass C., Otterson GA. 2003. Methylation of adjacent CpG sites affects Spl/Sp3 binding and activity in the p21(Cipl) promoter. Mol. Cell. Biol. 23:4056-4065.

Информация о работе

Федоров, Антон Владимирович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2006
ВАК 03.00.25

Диссертация

Характеристика транскрипционной и белок-связывающей активности промотора ретротранспозона LINE1 крысы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы