Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гомеостатическая регуляция рН апопласта хвои сосны и лиственницы при воздействии минеральных кислот, входящих в состав аэропромышленных выбросов

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Гомеостатическая регуляция рН апопласта хвои сосны и лиственницы при воздействии минеральных кислот, входящих в состав аэропромышленных выбросов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ

ГОНЕОСТАТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ рН АПОПЛАСТА ХВОИ СОСНЫ И ЛИСТВЕННИЦЫ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ МИНЕРАЛЬНЫХ КИСЛОТ, ВХОДЯЩИХ В СОСТАВ ЛЭРОПРОШШЛЕНКЫХ ВЫБРОСОВ

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

\

На правах рукописи УДК 581.2.02

НЕФЕДЬЕВА Татьяна Владимировна

Иркутск 1997

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН

Научный руководитель: член-корреспондент РАН

Р.К.Саляев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

А.С.Плешанов

доктор биологических наук, член-корреспондент Академии аграрного образования И.Э.Илли

Ведущее учреждение: Институт леса им В.Н.Сукачева, г.Красноярск

Защита состоится 19 марта 1997 года в Й часов на заседании специализированного совета К 003.25.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г.Иркутск, ул.Лермонтова 132.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан £ " С^&^ШЯ 1997 г.

Ученый секретарь

специализированного совета, л

ш

кандидат биологических наук ^//¡и/м Г.П.Акимова

Актуальность темы. В результате промышленного производства в атмосферу Земли ежегодно выбрасываются многие миллионы тонн газообразных токсических отходов. Такое глобальное загрязнение атмосферы является одним из наиболее серьезных факторов, с которым связывают повреждение и гибель огромных лесных массивов.

Среди воздушных промышленных выбросов наиболее серьезную опасность для растений представляют потенциально кислые газы (БОг, Шх, № и С12), а также аэрозоли кислот, образующиеся в атмосфере в результате взаимодействия этих газов с парами воды. Проникая в растение и попадая в межклеточную жидкость (жидкость апопласта), они образуют при этом сильные минеральные кислоты. Появление кислоты в жидкости апопласта опасно не только в плане изменения внешней среды функционирования клеток, но и последующим повреждением мембран и нарушением внутриклеточных процессов. Именно в системе апопласт-клетка происходят основные события по нейтрализации воздействия кислых газов и восстановлению нормальной клеточной среды. Поэтому способность ткани сохранять постоянство кислотности межклеточной среды (гомеостаз рН) при действии кислых газов,во многом, определяет обшую жизнеспособность растительного организма. Однако, несмотря на очевидную важность понимания механизмов, которые обеспечивают поддержание рН-гомеостаза в ткани листа, они все еще изу- и чены слабо.

Дель и задачи исследования. Цель настоящей работы - исследовать особенности функционирования гомеостатической системы, регулирующей рН в жидкости апопласта тканей листа при воздействии минеральных кислот, входящих в состав аэропромышленных выбросов. Для достижения этой цели необходимо было решить ряд задач:

1. Определить диапазон гомеостатического и стрессового регулирования рН в жидкости апопласта;

2. Выявить эффект кислотной и анионной составляющих в токсическом действии минеральных кислот на ткани листа (рН-статус жидкости апопласта, физиологическое состояние клеток, содержание пигментов) ;

3. Исследовать роль неорганических катионов (калия, натрия, кальция, магния) в механизме поддержания рН жидкости апопласта.

Научная новизна. Обнаружено, что ткани хвои сосны и лиственницы поддерживают в межклеточной жидкости гомеостатический уровень рН, который для сосны составил 4,65 единицы, для лиственницы -

3,8. Выявлены области кислотностей жидкости апопласта,регулируемы гомеостатическим и стрессовым механизмами. Появление в межклеточ ной жидкости сульфат-, нитрат-, фторид-анионов не влияло на уро вень рН-гомеостаза, однако, могло определять ширину гомеостатичес кого и стрессового диапазонов, сдвигая нижнюю границу гомеостати ческой области в более кислую или менее кислую сторону. Предложе метод получения суспензии изолированных клеток хвои лиственницы Показано, что изолированные клетки лиственницы обладают высоко жизнеспособностью и могут жить в переживающем режиме до 4 суток Установлено, что реакция клеток хвои лиственницы на воздействи азотной, серной, соляной и фтористоводородной кислот, имитирующи эффект соответствующих кислых газов, сходна с реакцией целого рас тения. На основании этого впервые предложено использовать изолиро ванные клетки хвои как модельную систему при определении степен токсичности ксенобиотиков для растения. Обнаружено, что внутрикле точное значение рН клеток хвои лиственницы ниже, чем у сосны. Это наряду с более кислым значением рН жидкости апопласта в норме мо жет определять высокую жизнеспособность клеток хвои лиственниц при действии кислот. Выявлено, что от вида аниона зависит как спо собность тканей противодействовать избыточному содержанию протоно в жидкости апопласта, так и общая жизнеспособность клеток. Опреде лено, что ткани хвои реагируют на появление избыточной концентра ции кислот в жидкости апопласта выбросом в межклеточное пространс тво эндогенных катионов. При этом наиболее массовым является выхо катионов кальция, затем следуют катионы калия, магния и натрия Предложена модель процессов по регуляции рН в жидкости апопласта позволяющая проследить цепь событий при противодействии клеток за кислению межклеточной жидкости.

Практическая ценность работы. Настоящая работа направлена н изучение адаптивных возможностей хвои при действии на нее кисль промышленных токсикантов. Сделан вклад в изучение механизма, под держивающего постоянство кислотности межклеточной среды в хво! лиственницы и сосны. Полученная суспензия изолированных клето хвои является удобной экспериментальной системой для изучени: действия ксенобиотиков. Кроме того, она может быть использован для экспресс-диагностики действия токсикантов на растение.

Апробация работы. На научной сессии СИФИБР 1995 г. На между народной конференции "Экологически чистые технологические процесс

в решении проблем охраны окружающей среды" (Иркутск, 1996 г.).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 4 публикациях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части (4 главы), общего обсуждения, выводов, списка литературы (181 наименование) и приложения. Работа изложена на 121 странице машинописного текста, включая 14 рисунков и 9 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. Для экспериментов использовали хвою 10-летних деревьев лиственницы сибирской (Larix sibirica Ldb.) и хвою первого года 10-13-летних деревьев сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), во второй половине вегетационного периода. Анатомически хвоинка состоит из толстостенной эпидермы с мощной кутикулой и глубоко посаженными устьицами (Эсау, 1969), мезофилла, состоящего из паренхимных клеток с извилистыми стенками, выступы которых у одних клеток заходят за выступы других клеток (Рейвн » др., 1990) и проводящих пучков.

В качестве токсикантов, имитирующих действие кислых промышленных газов (N0X, SO2, CI2, HF), использовали азотную, серную, соляную и фтористоводородную кислоты.

Методы.

Определение pH жидкости апопласта и гомогената ткани. За основу метода определения pH жидкости апопласта был взят метод, описанный в работе Пузанова и Саляева (1984). Кусочки хвои помещали ] колбы с раствором 0,55М маннита, в которые вносили серную, шн азотную, или фтористоводородную кислоты различной величины р[ (1,5; 2.0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0). Ткань инкубировали 2 часа, измеряя pH каждые 30 мин (точность измерения 0,05 единиц pH). На протяжении всего периода измерений колбы с тканью держали в водяном термостате при температуре 20°С. Соотношение ткань/раство] по весу было 1:2. При определении pH гомогената хвою растирали i фарфоровой ступке при температуре 6°С. Измельченную ткань отжимал] через капроновую сеточку и в полученной жидкости измеряли pH.

Изолированные клетки. Промытые кусочки хвои помещали в раствор следующего состава: 0,65М маннита, 50мМ КНгРО^ЫаОН (pH 5,8)

2% мацерозима. Ткань инкубировали в течении суток при 8°С+1° холодильной камере. После инкубации хвою дважды промывали раст ром 0,6М маннита, NaaHPO.^/лимонная кислота (рН 4 - для тка лиственницы, рН 4,8 - для сосны), встряхивали в течении 30-40 с фильтровали через двухслойную капроновую сеточку и концентриров полученную суспензию осаждением клеток в течении 20 мин в этом растворе. Жизнеспособность клеток определяли окрашиванием препа та метиленовой синью, по плазмолизу клеток при добавлении раств 0,8М маннита и по движению цитоплазмы. Жизнеспособность оценив в процентах в течении 4 суток, помещая клеточную суспензию в ра воры 0,55 М маннита с добавлением азотной (или серной или соля или фтористоводородной) кислоты. Кислотность инкубационного ра вора составила рН 1,5; 2,5; 3,5 (контроль рН 4,7). Для определе цитоплазматического рН выделенные клетки лиственницы помещали раствор метилового красного при рН 4, способного окрашивать вн\ риклеточное содержимое в малиновый цвет, если его рН ниже 3, единицы. В качестве буфера использовали NagHPO^лимонная кислот Наблюдение за клетками проводили под микроскопом NU-2E (ГДР). < торегистрацию осуществляли фотоаппаратом "Зенит-TTL" на цветь пленку "Pro Foto 100" (Kodak).

Определение содержания ионов калия, натрия, кальция и мать в жидкости апопласта и гомогенате ткани. Нарезанные кусочки тк помещали в раствор 0,55М маннита с добавлением серной, солянс азотной кислот (рН 1,5; 2,5; 3,5) и фтористоводородной кислоты ( 2,5; 3,5). Контролем служил раствор 0,55М маннита с рН 4,8. Тю инкубировали в течении двух часов, затем отбирали инкубационн раствор и в нем измеряли содержание К+, Na+, Са2+, Mg2+. на ш менном фотометре.

Определение пигментного состава ткани. Отобранные кусоч ткани после 2-х часовой инкубации в растворах 0,55М маннита с д бавлением кислот с рН 3,5 (лиственница) и рН 4,0 (сосна) перенос ли в охлажденные ступки и быстро растирали в смеси со стеклянн песком. Полученную массу отфильтровывали, наносили на хроматогр фическую бумагу и проводили бумажную хроматографию по методу Ба лавской, Трубецковой (1964). Полученную хроматограмму анализиров ли с помощью спектрофотометра СФ-10 в отраженном свете. Результа спектрального анализа представляли в относительных единицах ( отношению к контролю), измеряя высоту пиков. Контролем являл

препарат, выдержанный при тех же условиях, что и экспериментальные образцы, но в растворе без добавления кислоты.

Все эксперименты проводили в 4-5-кратной повторности. В каждый эксперимент вовлекалась хвоя не менее, чем с 7-10 деревьев. Статистическую обработку результатов проводили стандартным методом. Ошибка измерений не превышала 2-4%.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Определение рН жидкости апопласта и гомогената ткани хвои. Ткани хвои лиственницы и сосны при добавлении в среду инкубации кислот различной рН изменяли кислотность окружающего раствора, причем характер изменений мало зависел от используемой кислоты -во всех случаях качественно реакция ткани была одинаковой (Рис.1 и 2). Различия касались лишь степени реагирования на подкисление. Можно условно выделить три диапазона рН среды, в которых ткань хвои показывала специфические реакции. В первом, наименее кислом диапазоне, ткань изменяла рН среды до уровня 3,8 единицы для лиственницы и 4,65 единицы - для сосны. Причем достижение этого уровня рН происходило как из более кислых растворов, так и из менее кислых. Ранее было показано, что значение рН среды, которое устанав- . ливается после инкубации ткани в более кислых и более щелочных растворах является гомеостатическим уровнем (Саляев, Пузанов, 1984, 1985). Обнаруженные значения рН для тканей хвои сосны (рН 4,65) и лиственницы (рН 3,8) удовлетворяют этим условиям и являются, следовательно, гомеостатическими уровнями.

Интересен вопрос о величине рН внутриклеточного содержимого по сравнению с кислотностью гомеостатического уровня жидкости апопласта. Зная, какой объем в ткани листа занимает апопласт - не более 8-12% (Pfanz, Dietz, 1887; Mimura et al„ 1990), естественное значение рН в межклеточной жидкости (гомеостатический уровень) и гомогената ткани (по нашим данным для тканей сосны он составил рН 3,7; для тканей лиственницы - рН 3,55) можно рассчитать кислотность цитопласта. Для тканей хвои сосны она составила 3,66 единицы, для тканей лиственницы - 3,53. Видно, что кислотность внутриклеточного содержимого ниже, чем жидкости апопласта. В пользу этого свидетельствовали также и эксперименты с накоплением красителя метилового красного в изолированных клетках лиственницы, которые по-

РисЛ. Динамика изменения рН тканью хвои лиственницы при внесении в ной (А), серной (Б), фтористоводородной (В) кислот.

среду азот-

Рис.2. Динамика изменения рН тканью хвои сосны при внесении в среду азотной (А), серной (Б), фтористоводородной (В)" кислот.

казали, что внутриклеточная величина рН ниже 3,75 единицы. Тага образом, и гомеостатический уровень рН, и рН внутриклеточного сс держимого у тканей хвои лиственницы были ниже, чем у сосны.

Бри рассмотрении второго, более кислого диапазона видно, ча ткани хвои хотя и понижают кислотность среды (на 0,5-1 единих рН), бо вывести ее на гомеостатический уровень уже не могут. Эт область кислотности жидкости свободного пространства по классиф! кации Веселовского с сотр.(1993) может быть отнесена к стрессово! где гомеостатическая система растения уже не может функционировав и уступает место другой системе - стрессовой, обладающей больше мощностью, но уже не обеспечивающей таких благоприятных услов! для физиологических процессов. Третий, еще более кислый диапазо! характеризовался неспособностью ткани сколько-нибудь значителы приблизить рН среды к гомеостатическому уровню, т.к. наблюдаемл сдвиг кислотности в апопласте был не более, чем на 0,2 единицы р) Характерное для более высоких значений рН нелинейное подщелачивг ние среды тканью, сменяется" здесь более равномерным изменением р! Это связано, скорее всего, с физической деструкцией клеток и ра: бавлением внешнего раствора менее кислым клеточным содержимым.

Таким образом, все использованные нами значения рН среды мез но разбить на три диапазона. В первом происходит гомеостатическс регулирование рН, во втором - стрессовое, в третьем - наблюдаете гибель клеток.

Эксперименты по влиянию серной, азотной и фтористоводородно кислот на способность тканей хвои поддерживать рН-гомеостаз выяв* ли некоторые количественные отличия в ответах тканей хвои листве* ницы и сосны. У лиственницы реакции на подкисление азотне (Рис.1А) и серной кислотами (РисДБ) мало чем отличались друг с друга: гомеостатический диапазон рН лежал в границах 3,0-3,8 ({ 3,0 можно назвать пограничным значением между гомеостатическим стрессовым диапазонами), к стрессовому диапазону можно отнес1 лишь одно значение (рН 2,5) и к летальному - рН 2,0 и 1,5.

Что касается фтористоводородной кислоты (Рис.1В), то здес отчетливо наблюдалось смещение всех трех диапазонов в менее кисл^ область: гомеостатический диапазон находился вблизи рН 3,8. Погрг ничным значением является, очевидно, рН 3,5. К стрессовому диаш зону можно отнести рН 3,0, а к летальному - рН 2,5.

Ткань хвои сосны реагировала на изменения кислотности сре?

сходным образом (Рис.2). При действии азотной (Рис.2А) и серной (Рис.2Б) кислот на графике обнаруживались также три диапазона: при рН среды от 5,0 до 4,0 ткань выводила рН среды на гомеостатический уровень 4,65. При рН среды от 3,5 до 2,5 уровень кислотности среды хотя и уменьшался тканью, но не достигал гомеостатического уровня. При рН 2,0-1,5 кислотность среды уменьшалась, оставаясь весьма далекой от гомеостатического уровня. При внесении в среду инкубации фтористоводородной кислоты (Рис.2В) гомеостатический диапазон кислотности оказывался в границах 4,0-5,0, стрессовый - при рН 3,0-3,5 СрН 4,0 можно считать пограничным значением между гомеос-татическим и стрессовым диапазонами) и, наконец, летальному диапазону соответствовало значение рН 2,5.

Таким образом, еидно, что ни один из исследованных анионов не оказывал влияния на величину гомеостатического уровня рН. Вместе с тем, ширина гомеостатического и стрессового диапазонов оказалась подвержена действию анионов.

Характеристика изолированных клеток и их реакция на подкисле-ние среды. При действии азотной, серной, соляной и фтористоводородной кислотами на суспензию изолированных клеток лиственницы обнаружилось, что жизнеспособность клеток при понижении рН среды до 3,5 серной и азотной кислотами на протяжении трех суток была такой же, что и в контрольных условиях (Табл.1). Продолжение инкубации прогрессивно уменьшало количество живых клеток, и к концу четвертых суток таких клеток в поле зрения микроскопа оказалось не более 10-30%. При увеличении кислотности среды до рН 2,5 уже через сутки после начала инкубации в растворе с азотной кислотой оставалось не более 10% живых клеток, а в растворе, где присутствовала серная кислота - все клетки погибали. Примерно такую же реакцию давало внесение в среду соляной кислоты, которая действовала даже более интенсивно. Наиболее сильно клетки реагировали на среду с рН 1,5. При этом под микроскопом можно было наблюдать резкое пожелтение клеточного содержимого и его коагуляцию в течении 10-20 сек. Самый значительный эффект на жизнеспособность клеток оказывало внесение в среду фтористоводородной кислоты. Даже весьма незначительные ее концентрации были гибельными для клеток. Уже при рН 3,5 количество живых клеток быстро сокращалось в первые же часы, а при рН 2,5 клетки погибали в пределах нескольких минут. Таким образом, при низких концентрациях загрязнителя (серная и азотная кислоты) в

Табл.1. Жизнеспособность изолированных клеток лиственницы (в б£ л ах) при добавлении в раствор инкубации азотной, серной, соляно£ фтористоводородной кислот

Кислота РН 1-ый день 2-ой день 3-ий день 4-ый де

через 1 час через 4 часа через 24 часа

HF 2,5 - - - - -

HF 3,5 2 1 - - - -

НШз 1.5 - - - - - -

HN03 2,5 3 2 1 - - -

НЮ3 3,5 5 4 4 3 2 о Î,

H2SO4 1,5 - - - - - -

H2SO4 2,5 3 2 - - - -

H2S04 3,5 5 4 4 3 2 1

НИ 2,5 3 1 - - - -

1 контроль 4,7 5 4 4 3 2 ' 2

все клетки погибли 3 - менее 50% живых клето

1 - менее 10% живых клеток 4 - менее 75% живых клето

2 - менее 30% живых клеток 5 - до 95% живых клеток

анопласте (рН 3,5, соответствующий гомеостатической области дл. гканей хвои лиственницу) клетки могли существовать столько же вре мели, сколько и в контроле. При кислотности, соответствующе: стрессовому диапазону (рН 2,5), где ткани не способны вывести р] до гомеостатического уровня, жизнеспособность клеток закономерн( рвеньшалась, и большинство клеток не переживало в стрессовых усло-

виях более суток (Табл.1). При кислотности среды еще более высокой (рН 1,5) можно предполагать повреждение плазмалеммы и других клеточных мембран. Физическое разрушение клеток и освобождение их содержимого, очевидно, и обеспечивало тот подъем рН в среде инкубации, соответствующий летальному диапазону, который показан на рисунках 1 и 2.

Клетки хвои сосны по форме были похожи на клетки лиственницу, однако, намного уступали последним в жизнеспособности. Это не позволило зафиксировать их реакцию на подкисление среды.

Анализируя жизнеспособность изолированных клеток лиственницы при добавлении в их суспензию вышеназванных кислот, можно заключить, что ряд токсичности минеральных кислот для суспензии изолированных клеток (Г- > (С1~; 3042") > N03") идентичен ряду выстроенному для целых деревьев (Сергейчик, 1985; Рожков, Михайлова, 1989). А если иметь в виду, что, во-первых, суспензия изолированных клеток является экспериментальной системой, намного более простой по сравнению с целым растением или органом, что значительно облегчает получение информации об устойчивости клеток к ксенобиотикам и, во-вторых, клеточный ответ проявляется намного быстрее, то это дает основание предложить клеточную суспензию в .качестве модели для изучения реакции целого растения. С другой стороны, предложенный подход является достаточно универсальным инструментом по определению степени токсичности загрязнителей для растения и может быть с успехом использован для исследования токсического действия любых других (в том числе и совершенно новых) водорастворимых ксенобиотиков.

Определение влияния анионных групп на содержание суммы хлоро-филлов и каротиноидов в тканях хвои. Воздействие азотной, серной, соляной и фтористоводородной кислот на содержание пигментов в клетках хвои лиственницу и сосны воспроизвело ряд токсичности, обнаруженный на суспензии изолированных клеток лиственницы. Для го-меостатической области (рН 4,0 - для тканей хвои сосны, рН 3,5 -для тканей хвои лиственницы) (Рис.3) наименьшее влияние на относительное содержание пигментов оказывала азотная кислота, далее следовала серная, затем - соляная и, наконец, фтористоводородная кислоты. Азотная и серная кислоты в данной ситуации незначительно разрушали хлорофиллы а и Ь и каротиноиды. Через 2 часа после начала инкубации содержание пигментов в тканях хвои сосны и лиственни-

I'

о н 8 ш

К С

I) К

к о Я а.

и «

о о

100 90 -80 -70 -60 50 И 40 30 Н 20 Ю Н 0

100

Нитрат Сульфат Хлорид Фторид 1/////1 Хлорофиллы 1\\\\М Каротины

о

(Н

к

о

2 к к

о к

¡я «

м

о,

и «

о о

Нитрат Сульфат Хлорид Фгорид I/////IХлорофиллы ¡МИМКаротины

Рис.3. Влияние анионных кислотных групп на содержание пигментов (по отношению к контролю) в тканях хвои сосны (А) и лиственницы (Б) после инкубации в растворах кислот с рН 4,0 для сосны и рН 3,5 для лиственницы

цы уменьшалось на 5-10% по сравнению с контролем. Бри этом эффект этих кислот на деструкцию каротиноидов и хлорофиллов отличался мало. Соляная и фтористоводородная кислоты обладали более мошным действием на содержание пигментов. После двухчасовой инкубации с соляной кислотой в тканях хвои сосны хлорофиллов а и Ь осталось 56,5%, каротиноидов - 78%, в тканях хвои лиственницы содержание хлорофиллов а и Ь было 48%, каротиноидов - 70,5%. Инкубация с фтористоводородной кислотой приводила к тому, что хвоя сосны имела хлорофиллов а и Ь - 29%, а каротиноидов - 64,5%, в то время как хвоя лиственницы содержала хлорофиллов а и Ь - 17,5%, каротиноидов - 43%.

Таким образом, можно заключить, что наибольшим токсическим действием в наших экспериментах обладала фтористоводородная кислота (Рис.3), которая при тех же концентрациях оказывала на ткани сосны и лиственницы заметно более негативное воздействие, чем азотная, серная или соляная кислоты. Это касалось всех измеренных нами параметров: уровня рН (Рис.1 и 2), жизнеспособности клеток (Табл.1) и содержания пигментов (Рис.3). Значительное снижение содержания хлорофиллов и каротиноидов при добавлении соляной и фтористоводородной кислот, заметное смещение нижних границ гомеоста-тического и стрессового диапазонов рН жидкости апопласта при воздействии азотной, серной и фтористоводородной кислоты, а также резкое понижение жизнеспособности изолированных клеток лиственницы при внесении в среду инкубации фтористоводородной кислоты свидетельствуют о том, что от вида действующего аниона зависит как способность тканей противодействовать негативному влиянию закисления межклеточной жидкости, так и жизнеспособность клеток.

Определение концентрации ионов калия, кальция, магния и натрия в жидкости апопласта. Анализ относительного вклада катионов калия, кальция, магния и натрия в общем выходе этих катионов в среду при ее подкислении (азотная, серная, соляная, фтористоводородная кислоты) заметных различий между тканями сосны и лиственницы не выявил. И в том, и в другом случае основную долю в общем пуле ионов, вышедших в инкубационный раствор, занимал ион кальция (65-90%), затем следовал ион калия (10-25%), и, наконец, ионы магния (4-10%) и натрия (1-4%).

Зависимость суммарной концентрации ионов калия, кальция, натрия и магния в среде инкубации от ее кислотности в экспериментах с

тканями хвои лиственницы и сосны представлены на рисунке 4. Ви что при повышении кислотности среды суммарная концентрация ка нов увеличивалась; при одном и том же первоначальном рН фтори водородная кислота оказывала на суммарный выход катионов в с инкубации значительно большее влияние, чем азотная, серная или ляная кислоты, действие которых различалось незначительно, тканей хвои лиственницы (при первоначальной рН 3,5) суммы кати в среде инкубации при действии азотной, серной и соляной ки варьировали в пределах 1,1-1,2-ММ, при воздействии фтористов родной кислоты это значение составило 3,3 мМ. При первоначал рН 2,5: 2,4-2,9 мМ (воздействие азотной, серной и соляной кисл ми) и 7,1 мМ (фтористоводородной кислотой). При первоначально 1,5 воздействие азотной, серной и соляной кислотами приводил выходу катионов из ткани в среду в суммарной концентрации 5,6 мМ (Рис.4А).

Подобная же картина наблюдалась и для тканей хвои сосны: первоначальной рН 3,5 суммарная концентрация катионов при под. лении среды азотной, серной и соляной кислотами находилась в ницах 0,6-0,7 мМ, при подкислении фтористоводородной кислот 1,7 мМ, при первоначальной рН 2,5: 2,4-2,6 мМ (азотная, серна соляная кислоты) и 5 мМ (фтористоводородная кислота), при перв чальной рН 1,5: 4,3-4,7 мМ (азотная, серная и соляная кисл (Рис.4Б).

Таким образом, при подкислении среды инкубации азотной, кой, соляной (первоначальная рН 3,5; 2,5 или 1,5) и фтористов родной (первоначальная рН 3,5 или 2,5) кислотами, концентрация тионов в среде инкубации увеличивалась: чем ниже был первонач ныи рН, тем выше концентрация вышедших катионов. Такая законо ность прослеживалась и для тканей лиственницы, и для тканей с при всех использованных кислотах и для всех четырех исследова катионов. Следовательно, можно считать, что ткани хвои сос лиственницы имеют эффективный механизм реакции на подкисление I ды. Иерархия реакции ткани здесь может быть следующей. При неб( шом увеличении кислотности среды происходит связывание избыто' протонов и обмен их на катионы клеточной стенкой. Если кислот» среды повысилась более значительно, то обмен протонов на кат: происходит уже с цитоплазмой, и здесь могут быть задейство: мембранные переносчики. Наконец, когда протонов в среде еще бо

Рис.4. Влияние кислотности среды (первоначальное рН 1,5; 2,5; 3,5) при внесении азотной (О), серной (д), соляной (+), фтористоводородной (*) кислот на суммарный выход в среду инкубации ионов кальция, калия, натрия и магния для тканей хвои сосны (А) и лиственницы (Б)

и задействованных мощностей недостаточно, в обмене протонов н тионы участвует, скорее всего, вакуоль, располагающая горазд лее значительным пулом катионов. Очевидно, что ионы щелочных лочноземельных металлов, в частности К+ и Са2+ являются той " той", с помощью которой работают и гомеостатическая и антистр вая системы. Ионы натрия и магния, как было показано, тоже у вуют в защитных процессах, но, вследствии меньшего содержали: физиологическая значимость, вероятно, несколько меньше.

ОБЩЕЕ ОБСУЖДЕНИЕ

Данные, представленные в настоящей работе свидетельству» том, что при появлении в межклеточной жидкости избыточной ког рации протонов ткани хвои сосны и лиственницы, стремясь восса вить естественную для жидкости апопласта величину рН (гомеоса ческий уровень), выбрасывают в околоклеточную среду катионь первую очередь, кальция и калия. Последовательность событий действии различных кислот разных концентраций можно предстг следующим образом (Рис.5).

Внесение кислоты в межклеточную жидкость вызывает как бы ветвленную цепную реакцию, причем, скорее всего, некоторые звенья начинают работу при достижении некоторой критической центрации протонов. Если на ткани хвои сосны или лиственницы д твует одна из трех кислот - азотная, серная или соляная, то р ция ткани будет определяться той концентрацией протонов, кот при этом образуется в среде. Если рН межклеточной среды, изме шись, находится в гомеостатической области, то эффективен гом татический механизм, который возвращает рН жидкости алоплас исходному уровню. При этом наблюдается выброс катионов в жидк апопласта, благодаря которому повышенная, вследствие поступлен межклеточную жидкость кислот, кислотность среды возвращается к меостатическому уровню. Поэтому жизнеспособность клеток не изм ется по сравнению с контролем, и токсическое действие не каса одной из самых чувствительных органелл - хлоропластов - а, зн пигменты не разрушаются. Действие фтористоводородной кислоты раздо сильнее. При тех же рН фтористоводородная кислота, очеви за счет воздействия фторид-аниона, оказывает сильное токсиче действие на ткани хвои: резко снижается жизнеспособность кле

Проникновение кислого токсиканта в лист У

Растворение его в межклеточной жидкости с образованием протонов и анионов

I I

| Изменение рН жидкости апопласта |

1_I

Рис.5. Качественная модель процессов регуляции рН жидкости апопласта при поступлении в ткань кислых токсикантов

Т

разрушаются пигменты и, хотя выход катионов становится более тенсивным (по сравнению с действием других кислот), он, тем н нее, не может компенсировать токсическое воздействие фтористо родной кислоты.

Если поступление кислого токсиканта в ткань настолько ве что гомеостатический механизм недостаточен для возвращения исходному уровню, то включается стрессовый механизм. Здесь твие азотной, серной и соляной кислот также оказывается мене бительным для клеток в сравнении с эффектом фтористоводор кислоты. Благодаря еще большему выбросу катионов в межклет жидкость ее кислотность также смещается в менее кислую облает гомеостатический уровень уже не достигается. В этом случае т приходится противодействовать не только повышенному содер протонов, которое не удается полностью снизить за счет обме катионы, но и токсическому воздействию анионов, концентрация рых также увеличивается и которые оказывают воздействие на сп ность клеток препятствовать закислению межклеточной жидкости, но, что возросший прессинг интоксикации приведет к снижению неспособности клеток. Фтористоводородная кислота и в стрес диапазоне действует намного сильнее: рН межклеточной жидкости изменяется клетками, и их жизнеспособность резко уменьшается, конец, если концентрация поступающих ксенобиотиков становится редельной, то резкое увеличение в жидкости апопласта ионов во да и анионов разрушает клеточные мембраны и клетки погибают.

Описанная цепочка событий может быть характерна, в обще де, для тканей и сосны, и лиственницы. Что касается частного ложения к каждому из двух видов деревьев, то имеет смысл верн к различиям в уровне рН гомеостаза и величине кислотности, ветствующей нижней границе гомеостатического диапазона. Как показано в настоящей работе, кислотность гомеостатического у| и нижняя граница гомеостатического диапазона в жидкости апоп. для тканей хвои лиственницы были существенно выше, чем для т хвои сосны. Действительно, одна и та же кислотность среды (рН для тканей хвои лиственницы лежит в гомеостатическом диапазон! для сосны - в стрессовом. Поэтому ткани лиственницы еще могут мально функционировать, практически возвратив рН жидкости ало] та к физиологически оптимальному (гомеостатическому) уровню, : как ткани сосны изменят кислотность среды только до 3,7, ч:

целую единицу ниже гомеостатического значения рН жидкости апоплас-та. Результаты настоящей работы свидетельствуют, что большая устойчивость лиственницу к кислым газам может объясняться не только ежегодным сбрасыванием хвои, но также и большей мощностью механизма рН-гомеостаза, который способен восстановить физиологически оптимальную рН жидкости апопласта из более кислых областей и, следовательно, обеспечить нормальное функционирование растения при более высоких концентрациях кислых промышленных газов и аэрозолей кислот в ткани.

Таким образом, можно заключить, что устойчивость хвойных к кислым токсикантам, в значительной степени, может определяться го-меостатически поддерживаемым уровнем рН в жидкости апопласта и модностью механизмов, регулирующих кислотность межклеточной и внутриклеточной среды в ткани.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что ткани хвои сосны и лиственницы поддерживают в межклеточной жидкости гомеостатический уровень рН. Для лиственницы он равен 3,8 единицы рН, для сосны - 4,65 единицы.

2. Выявлены регулируемые гомеостатическим и стрессовым механизмами области кислотности межклеточной жидкости. Расположение гомеостатически регулируемой области рН жидкости апопласта лиственницы в более кислом диапазоне способствует, очевидно, большей устойчивости тканей ее хвои к действию кислых токсикантов.

3. Определено, что экзогенные анионы не влияют на уровень рН гомеостаза в межклеточной жидкости, но могут определять величину гомеостатического и стрессового диапазонов, сдвигая нижнюю границу гомеостатической зоны в менее кислую или более кислую область.

4. Выявлен эффект анионной составляющей в токсическом действии минеральных кислот на ткани хвои сосны и лиственницы. Показано, что от вида аниона зависит как способность тканей противодействовать избыточному содержанию протонов в жидкости апопласта, так и общая жизнеспособность клеток.

5. Определена реакция тканей хвои на закисление среды, которая заключается в выходе в апопласт катионов кальция, калия, магния и натрия и замене ими протонов. Показано, что наиболее массовым является выход катионов кальция, затем следуют катионы калия,

магния и натрия.

6. Обнаружено, что внутриклеточное значение рН клеток лиственницы ниже, чем у сосны. Этот факт, наряду с более к межклеточным содержимым может определять более высокую жизн собность клеток хвои лиственницы при действии кислот.

7. Установлено, что реакция изолированных клеток на азо серную, соляную и фтористоводородную кислоты, имитирующих дей соответствующих кислых газов, сходна с реакцией целого раст Предложено использовать суспензию изолированных клеток хвои в честве индикатора степени токсичности ксенобиотиков, а такж экспериментальную систему для изучения, механизмов устойчивое загрязнителям.

8. Предложена качественная модель процессов регуляции жидкости апопласта при поступлении в ткань кислых промышл токсикантов.

1. Нефедьева Т.В., Саляев Р.К. Гомеостатическое регулиро рН жидкости апопласта хвои сосны и лиственницы в связи с воз твием кислых аэротехногенных выбросов// Сибирский экологич журнал,- 1995.- N б,- С.495-498.

2. Нефедьева Т. В., Русакова Л.В., Саляев Р. К. Степень по дения фотосинтеткческого аппарата хвойных различными компоне воздушных промвыбросов// Проблемы экологии сибирского per вып.1. Сборник научных трудов Сибирского института права, эко ки и управления.- Иркутск, 1996.- С.61-66.

3. Нефедьева Т.В., Саляев Р.К. Новые данные о механизме твия воздушных промвыбросов на хвою сосны и лиственницы// Про экологии сибирского региона, вып.1. Сборник научных трудов Си кого института права, экономики и управления.- Иркутск,

- С.67-70.

4. Нефедьева Т.В., Саляев Р.К. Изолированные клетки хво: индикатор токсичности промышленных загрязнителей// Экологи чистые технологические процессы в решении проблем охраны окр щей среды, тезисы докладов международной конференции (Ирк 18-22 июня 1996).- Иркутск, 1996.- Т.2,- С.85.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ