Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

"ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОВЕРХНОСТНЫХ ТКАНЕЙ ПЛОДОВ ЯБЛОНИ PTRUS MALUS L. В СВЯЗИ С РАЗВИТИЕМ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ ""ЗАГАР"""

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме ""ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОВЕРХНОСТНЫХ ТКАНЕЙ ПЛОДОВ ЯБЛОНИ PTRUS MALUS L. В СВЯЗИ С РАЗВИТИЕМ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ ""ЗАГАР""""

V ФгШЗ

' АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ЛЕНИНА

_ИрСТЩТГ БИОХИМИИ 1М.А.Н.БАД _

На правах рукописи

Платонова Татьяна Анатольевна

ГИСТОХШИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОВЕРХНОСТНЫХ ТКАНЕЙ ПЛОДОВ ЯБЛОНИ ргяиз НАШЗ 1. Б СВЯЗИ С РАЗВИТИЕМ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ "ЗАГАР"

(Специальность 03.00.04 - биологическая химия)

-АВТОРЕФЕРАТ диоовргадюс на сожсканив ученой степени кандидата-биологических наук

Москва - 1973

Работа выполнена в лаборатории биохимии иммунитета растений Ордена Ленина Института биохимии им.А.Н.Баха АН СССР,

Научные руководители: доктор сельскохозяйственных наук.

профессор Л.В.МЕТЛИЦКИЙ

кандидат биологических наук Е.Г.САЛШВА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

В.И.КЕФЕЛИ

кандидат биологических наук

И.И.ФИЛИППОВИЧ

Ыа официальный отзыв работа направлена в ЬгавныИ Ботанический Сад АН СССР.

Автореферат разослан "¿^^од/71973 г.

Защита диссертации состоится чЯг* 1973 г. на

заседании Ученого Совета Ордена Ленина Института биохимии им. А.К.Баха АН СССР по адресу: Москва В-71, Ленинский проспект, 33.

С диссертацией мояво ознакомиться 5 библиотеке Биологического отделения АН СССР.

Ученый секретарь каядида* биологических наук /Н.Н.Дьячков/

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на широкое распространение в растительном пире различного рода физиологических заболеваний, их биохимическая природа еще мало изучена. Многие физиологические заболевания, внешне проявляющиеся в побурении тканей, служат причиной преждевременного старения и гибели растительных организмов. Примером может служить побурение тканей сочных плодов (яблок, груд, айвы, цитрусовых плодов) во время их хранения. Таким образом, дознание причин зтих заболеваний тесно связано с изучением всего комплекса процессов, лежащих в основе старения растительных организмов*

Одним из наиболее распространенных физиологических заболеваний плодов, в частности, яблок является "загар", характеризующийся поверхностным побурением тканей, что сильно ухудшает внешний вид плодов, а при сильно» развитии делает плоды непригодными к употреблению. Потери урожая плодов от этого заболевания весьма значительны.

Существуют разные точки зрения на происхождение "загара". Согласно одной из них, "загар" связан с некоторыми летучими веществами, выделяемыми самими плодами, к числу которых, в частности, относится фарнезен (НиеПп, СоБ€ю1вг 1968,1972), Другая точка зрения предполагает, что побурение тканей пря развитии "загара" является следствием декомпенсации процессов окисления и восстановления фенольных соединений (Иетлицкий, Цехоиская, 1958; ИетлицккЙ и др., 1972). Остается, однако, неясный, что приводит к этой декомпенсации, и как происходит процесс побурения, если по имеющийся данным фенолы и фермент, их окисляющий, локализованы в клетке в разных органоидах.

В связи с тем, что плод гисхофизиологически весьма разнороден, а заболевание начинается с локального побурения отдельных участков тканей, большое значение приобретает гистохимическое и глектронномикроскопическое изучение плодов, которое может дать более полное представление об обиенных процессах,

тесно связанных с нарушениями б их структурной организации. Такой подход к изучению физиологических заболеваний плодов был уже частично использован в ряде работ (Р1<11вг, 1950¡Ват, 1956; Ват,Мвгсвг, 1963). но исследования, объединяющие эти два направления, по существу еще не проводились.

Цель» настоящей работы было изучение особенностей поверхностных тканей плода яблони Ругне та1и» ь. при созревании, старении и развитии "загара".

Мы поставили перед собой следующие задачи:

1. Изучить строение поверхностного покрытия яблок - кутикулы, в значительной степени определяющей газовый режим внутри плода.

2. Определить активность и локализацию некоторых окислительных ферментов: цитохромоксидазы, пероксидазы и полифенол-оксидазы, как показателей физиологического состояния тканей и клеток плода, а также установить изменения в величине внутриклеточного рВ. которая во многой определяет направление обменных процессов в плоде.

8. Изучить локализацию веществ полифенольной природы, участвующих г процесса побурения тканей плода.

Определить изменения в ультраструктуре клеток плода.

5. На основе полученных данных охарактеризовать те функциональные и структурные нарушения в отдельных клетках плода, которые приводят к побуренлю тканей при развитии "загара".

* ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объект и методы исследования

В качестве объекта исследования служили плоды яблони руги* та1и* ь., которые являются прекрасной моделью для изучения процессов старения, так как по существующим представлениям климактерический подъем дыхания плодов означает кульминацию процессов созревания и переход к старению. Для изучения были выбраны плоды яблони известного русского сорта Антоновка»-

которые ухе г декабре-январе начинает поражаться "загарои". Плоды для опытов были получени из сада ВНИИ садоводства нечерноземвой полосы и на протяжении всей эксперииентальнон работы содержались в хранилище при t =. Исследование

проводили в течение пяти сезонов с 1966 года по 1972 год.

- В работе был использован ряд гистохимических методов и метод электронной микроскопии.

Для гистохимического изучения кутикулы яблок мы пользовались свегими срезаии, окрашивая их растворами судана И и судана черного В. Кроме того, срезы, фиксированные 10^-нщ формалином, окрашивали раствором нильского голубого.

Люникесцентко-иикроскопнческэе изучение кутикулы проводилось на свежих срезах, обработанных следующими флзэрохро-ыаыи: фосфином Зй (1:10 ООО), нильским голубым (1:10 ООО), нейтральным краевым (1:10 ООО) и насыщенным раствором судлиа ¡1. Флюоресценция возбуждалась синими лучами. Наблюдения проводили в люминесцентном микроскопе ШГ-1.

Для сравнительных измерений толщины кутикулы и еосксзого слоя пользовалась как свежим материалом, так и материалом, фиксированным в смеси спирта с формалином. Срезы окрашивали раствором судана т. Измерения проводили с помощью окулярного микрометра. Средние величины выводили из расчета 40 измерений по каждому показатели. Результаты обрабатывали статистически, принимая вероятность безошибочного прогноза = 0,95. Определяли значения средних арифметических - / м / к ошибку репрезентативное«* выборочного показателя — /л /. Высчитывали достоверность различий между вариантами (Плохинский, 1967).

Гистохимически концентрацию водородных ионов (рН) определяли с помощ&о окравизанин индикаторными красками - нейтральным красным и метияеновым красным (Бритиков. 1954). Значения рЕ получали на основании просмотра 10-15 срезов, взятых с разных плодов. ...

Для обнаружения веществ полкфенольной природы в тканях плодов пользовались нитрозореакцней (Джеясен. 1965). Контролем служили срезы с обратным порядком проведения нитрозореакцин.

Изучение окислительных ферментов проводили на свежих срезах. Для определения активности цнтохромоксвдазы был использован метод Берстона (Берстон, 1965; Дденсен, 1965). Перед проведением реакции на цитохроыоксидазу срезы обрабатывали 0,031 раствором диэ тилдит иокарбаыата На (ДЗДТК) с целью ивгибирования полифенолоксидазы. В качестве контроля служили срезы, обработанные перед проведением реакции 0.005М раствором азида натрия, а также срезы, инактивированные нагреванием до ВО0.

Активность пероксидазы определяли по широко распространенному бензидиновому методу (Бояркин, 1551). Контрольные срезы перед проведением реакции обрабатывали 0.005М раствором азида натрия или инкубировали в реакционной смеси без перекиси водорода.

Для изучения полифенолоксидазы пользовались методом Бояркина (Бояркин, 1954). В качестве контроля использовались срезы, обработанные 0,0211 раствором ДЭДТК натрия - специфическим ингибитором полифенолоксидазы, а также срезы, инактивированные нагреванием.

Для полуколичественной оценки активности окислительных ферментов время развития ферментативной окраски на срезах, выраженное в секундах (щги минутах), оценивали по десятибаль-ной системе. Результаты обработаны статистически. По средним данный /м /, взятым аз результатов, полученных в течение трех сезонов, строили графики изменений активности каждого фермента в процессе созревания, старения и при развитии "загара". На графиках показаны значения /га/.

При всех гистохимических процедурах препараты просматривали в микроскопе ЦБР и фотографировали с поиощью шкрофото-васадки МфН-12.

Для электронномикроскопического научения тканей плодов материал фиксировали в 2,5-5^-ноы глутаровом альдегиде, забу-Фереяноы о,2М фосфатным буфером с рН= 7,2-7,4, дофиксировали 2^-ным раствором обо4 и заключали в смесь бутил- и метил-иетакрилатов (4:1). часть материала заключали в эпоксидную сколу

о

Элон-812. Срезы толщиной 200-400 А, изготовленные на ультрамвкротоме ькв , контрастировали по Рейнодьдсу (Иеу-поХ<Зв^ 1963). Изучение ультратонках срезов проводили на электронной микроскопе ^т - 5ч с использованием увеличений микроскопа от 10 ООО до 30 ООО.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

А. Гистохимические особенности поверхностных тканей плода

I. Поверхностное покрытие яблок - кутикула

Проведенное гистохимическое изучение кутикулы с помощью судановьсс красителей показало, что эти красители ве дают возможности идентифицировать отдельные группы липидов в пределах кутикулы и рассмотреть ее морфологию. Окраска нильским голубым позволяет, хотя бы грубо, отличить одни группы липидов от других. При этой окраске кутикула предстает в виде собственно кутикулы, окрашеивой в розовый цвет, и кутинизированных стенок зпидермальных клеток, окрашенных в голубой цвет* Розовая окраска кутикулы указывает на присутствие в ее составе большого количества соединений с ненасыщенными двойными связями. Голубой кутинизированный эпидермис, следовательно, несколько отличается по химическому состав; от основной кутикулы. Однако окраска в пределах этих слоев равномерная*

В люминесцентной микроскопе собственно кутикула светится однородным цветом, присущим данному флюорохрому, однако, по оттенку свечения она несколько отличается от поверхностного воска и кутинизярованного эпидермиса, что указывает на некоторые различия в их липидвом составе.

Сравнительное изучение кутикулы яблок других сортов (Славянка и Пепин Шафранный) ве выявило различий г морфологии и составе их поверхностного покрытия.

Б таблицу 19 X сведены результаты сравнительного изучения толщины кутикулы в цепом и поверхностного воска сразу после сбора плодов и спустя 36-дней хранения. Наблюдаемое за месяц хранения увеличение толщины кутикулы в полтора раза (разница между выборочными средними двух сроков достоверна), а также тенденция к накоплению.поверхностного воска свидетельствует об интенсивной синтезе кутикулярвых веществ и воснов в процессе послеуборочного созревания плода. Набдвде-ния за толщиной кутикулы мы проводила на протяжении 96 дней хранения плодов - срока, в течение которого происходит заметное накопление кутикулярвых веществ, тогда как в дальнейшем по мере старания плода их накопление приостанавливается.

Увеличение толщины кутикул» наблюдалось нами и у двух других сортов яблок - Славянка и Пеаин Шафранный, однако, побурение поверхностей; тканей развивается только у сорта Антоновка.

Таким образом, проведенное гистохимическое изучение позволило выявить общность состава кутикулы у разных сортов и общность в направлении некоторых процессов при послеуборочном созревании, но не дало ответа на вопрос, какими именно особенностями кутикулы определяется подверженность плодов "загару".

2. Изменение активности окислительных Ферментов в тканях плода в пропессд созревания.старения и развития "загара"

а) Дитргр2рйкс)щаэа

Изучение цнтохромоксидазы показало, что скорость образования реакционного продукта в срезах и интенсивность их окраски были различиы в зависимости от физиологического состояния исследуемого плода. В контрольных препаратах окраска отсутствовала.

Таблица К I

Тоодйа куишулы свежеубраняых пдодоз I после 86 дней хранения ( в нк) (И 1 ш)

I i

{ Свежатбраннв» плоды } Плоды поста Э6 дней хранения

!в области 1 в средней (в области! г облаем (в средней час-1в облаем

(плодоножки! части шиМчашечки (плодоножек 1ти плода !чадечки

I 1 да , 1 м 1 I 1

Поверхностный 3.64+0,4? 2,89+0,14 4,06+0,2 4,12+0,27 4,07+0,1 4,69+0,24 воск

Кутикула 13,54+р,45 Л,39+р,14 13,85+0,2 22,1+0,44 18,67+0,42 24,3+0,12 в целой

В тканях свежаубранных плодов наблюдалось постепенное увеличение активности фермента до декабря-января, после чего следовал спад активности цитохромоксидазы до марта. Эта закономерность проявлялась на проткненип трех сезонов хранения (рис. I). Полученная кривая изменения активности цитохромоксидазы совпадает по форме с кривой климактерического подъема дыхания плодов и активности малатдегидрогеназы декар-боксидирующей (Салькова, Звягинцева» 1972). Следует ответить, что, хотя активность цитохромоксидазы в старых плодах и ниже, чем при "пике", однако, она еще достаточно высока, что свидетельствует о жизнедеятельности тканей старого плода, и, в то же время, о затухании Этого процесса.

В пределах поверхностных тканей яаблвдается заметное уменьшение активности цитохромоксидазы от эпидермиса к паренхиме плода. Однако оценить эту разницу по тканям на одном срезе с помощь» применяемого нами полуколичественного метода не представляется возможным, так как окраска, как правило, развивается в течение длительного промежутка времени (от 10 до 60 минут), поэтому тканевые различия оценивались лишь по разнице в интенсивности окраски. Что касается одного тканевого слоя, то он также неоднороден по активности фермента* Наиболее сильную реакции дают всегда сосудистые пучки и клетки, сопровождающие их, что свидетельствует о высокой интенсивности обменных процессов в них. Наряду с этим,, обращают внимание на себя отдельные клетки или группы клеток с повышенной,по сравнению с другими, активностью цитохромоксидазы. Аналогичные описания клеточной разнокачественное™ встречаются и в литературе (Португадов, 1959; 1(ио(с1а,1970).

Что касается внутриклеточной локализации цитохромоксидазы, то при большом увеличении микроскопа (х900) фермент выявляется в виде довольно мелкой сине-фиолетовой зернистости в цитоплазме клеток. На основании наших наблюдений в световом микроскопе .невозможно определить к каким цитоплазматическим органоидам приурочена'обнаруженная ферментативная реакция. Однако в настоящее-время считается твердо установленным, что

10

>о М

(Ь .

3 6

Щ

я

о. &

л 4 н

о §

£ 2

■ здоровая ткань побуревшая ткань

XI XII I II III 1У

Сроки

Рис. I . Изменение активности цитохромоксидазы в поверхностных тканях плода яблони при созревании, старении и развитии "загара".

терминальный фермент дыхательной цеп» - цктохромоксидаза - . локализована исключительно в митохондриях. В связи с этим, цитоллазиатическу» зернистость в клетках плода, дающую положительную реакцию на цитохромоксидазу, мы вправе считать связанной с митохондриями. .

В тканях, взятых из побуревших участков плода, активность цитохромоксидазы несколько выше, чем в здоровых тканях того же плода. Сами "загоревшие" бурые клетки реакцию на цитохромоксидазу не дают, однако, непосредственно прилежащие к участку "загара" клетки проявляют повышенную ферментативную активность, связанную, по-видимому, с изменением физико-химического состояния фермента, либо с большей доступностью субстрата для фермента в этих клетках. За счет этой усиленной локальной реакции и наблюдается повышение активности фермента в целом по всей площади среза. Однако в участках сильного "загара", где процент побуревдих клеток достаточно высше, общая активность цитохромоксидааы в этих тканях уже значительно ниже.

б) Педоксидаза

Бензидиновая реакция на пероксидазу в опытных срезах развивается очень быстро. В контрольных препаратах окраска отсутствовала.

На всех стадиях созревания и старения плода наиболее интенсивно и быстро реагирует эпидермис. Окраска здесь появляется уже через 5-10 секунд после нанесения инкубационной среды на препарат. Несколько позже (через 12-15 секунд) развивается окраска в гиподерме, давая, хотя и несколько меньшее, но довольно интенсивное окрашивание утолщенных колленхимншс клеточнгк стенок, вещества межклетников и срединной пластинки. Хотя и незначительная по сравнению с клеточными стенками, но все же заметная окраска появляется и в пристенном слое цитоплазмы гиподермальньк клеток. Через 20-25 секунд появляется реакция в паренхиме мезокарса, клеточные стенки которой дают

более слабую окраску, чем so всех вндеописанных тканях. Однако вещество межклетников реагирует столь se интенсивно, что и s гиподерме. Цитоплазма паренхимных клеток окрашивается очень незначительно. Такая множественная локализация фермента свидетельствует о присутствии в клетках плода нескольких изо-фермептов пероксидазы.

В ходе созревания и старения плода во всех его поверхностных тканях (эпидермисе, гиподерме и паренхиме) наблюдается' заметное снижение активности пероксидазы (рис. 2), что выражается в меньшей скорости образования продукта реакции и в меньшей интенсивности окраски самих клеток.

Вопрос об участии пероксидазы в побурении растительных тканей в настоящее время носит дискуссионный характер. В литературе на этот счет высказываются разные точки зрения» в частности, ее роль в побурении яблок многими авторами отрицается (Porting, Joelyn, 194Sj Bieáemann, 195b( Duden, 19Ь4). Согласно нашим наблюдениям, в побуревших участках плода активность пероксидазы уменьшается очень незначительно (рис. 2). а также отсутствуют заметные изменения в активности и локализации этого фермента в прилежащих к "зоне загара" клетках. Это может свидетельствовать о том, что пероксядаза не принимает непосредственного участия в побурении тканей плода при развитии "загара".

в) Полифенодоксидаза

Изучение полифенолоксидазы (о-дифенолоксидазы) показало. что и для этого фермента характерен тот же спад актrano ст и от эпидермиса к паренхиме плода, что и для цитохрож-оксидазы и пероксидазы. В контрольных препаратах реакция отрицательная.

При больших увеличениях микроскопа (х 400, х 300) хороюо видна локализация полифенолоксидазы в клетках плода. В тканях

— здоровая ткань

— побуревшая ткань

X XI XII I II III 1У

Сроки

Рис. г . Изменение активности пероксидазы в поверхностных тканях плода яблони при созревании, старении и развитии "загара".

свехеубранных плодов большая час» фермента выявляется в хлоролластах клеток« которые окрашиваются при этом очень интенсивно. Наряду с этим, в цитоплазме клеток обнаруживается незначительная реакция в виде мелкой буровато-малиновой зернистости* Такая локализация фермента свойственна как гидодермальным, так и паренхимным клеткам плода, и, вероятно, свидетельствует о присутствии в клетках поненьией мере двух ферментов, обладающих фенолазным действием.

Б пределах одной ткани, и в гиподерме, и в паренхиме наблюдается ярко выраженное неравномерное распределение активности фермента: проводящие пучки и клетки, прилежащие к ним, буквально забиты продуктом реакции, кроне того, встречаются отдельные клетки или небольшие группы клеток с повышенной ферментативной активности) по сравнению с однородными по анатомическим признакам клетками; В таких клетках более интенсивная окраска наблюдается, как правило, за счет увеличений ферментативной активности в цитоплазме, при этом продукт реакции может скапливаться преимущественно в какой-то одной части клетки.

В процессе созревания плода активность полифенолоксидазы значительно возрастает вплоть до декабря-января, а затем в процессе старения несколько падает и потом поднимается вновь (рис. 3).

В постклимактерических плодах распределение фермента по тканям такое же, как и в свежеубранных плодах. Однако в локализации полифенолоксидазы в клетке отмечаются некоторые изменения, а именно, хлоропласт окрашивались менее интенсивно, чем в клетках свежеубранных плодов, в то же время, более значительной становилась цитодлазкатическая реакция. На этой стадии жизни плода еще более очевидно проявляется разнокачественное» клеток по содержанию фермента.

Б тканях,. взятых из "загоревших" участков плода активность полифенолоксидазы значительно вше. чем в здоровые тканях того же плода (рис. 8). В таких тканях обращают внимание на себя клетки, непосредственно прилегающие к^оне загара".

здоровая ткань побуревшая ткань

I | _______ Сроки

И X XI XII I II III

Рис. Э . Изменение активности полифеяолоксид&зи в поверхностных тканях плода яблони при созревании, старении и развитии "загара".

В цитоплазме этих клеток наблюдается очень интенсивная реакция на долифеколоксидазу, что свидетельствует о подъеме цитоплазматичесхой активности фермента в клетках, которые стоят на "пути к загару". Согласно литературным данным (Салькова, деменюк,1970; Самородова-Вианки Д972),в период развития заболевания увеличивается низкомолекулярная фракция полифеяолоксдаазы, что говорит в пользу того, что лобуревоая ткань является физиологически более старой, чем окружающая ее здоровая ткань.

Таким образом, полученные данные расширяют и дополняют сведения об изменении структуры и активности полифеколокси-дазы в пораженных клетках*

Б связи с проведенным изучением полифенолоксидазы, а также учитывая ту особую роль, которая отводится системе полифенолы - лолифенолоксидаза в побурении плодов при возникновении "загара", представляло естественный интерес изучение локализации полифенолоз в тканях л клетках плодов, тем более, что до настоящего времени мы еще мало знаем о том, каким образом происходит взаикодействие полифенолов с поли-феволоксидазой, приводящее к побурению тканей, если, по имеющимся данным, они локализованы в клетке в разных органоидах.

3; Фенодьзые соединения в тканях и клетках плода

Проведенное изучение тканей плодов с помощью нитрозо-реакции показало, что срезы окрашиваются в интенсивный мали-иово-красный цвет, что свидетельствует о присутствии в тканях яблока солифенолов типа катехина и хлорогеновой кислоты, которые,как известно, участвуют в образовании "загара". Наибольшая интенсивность окраски наблюдается в апидермальной ткани. В пределах гиподермы клетки весьма разнокачественвы -по содержанию полифевсяов. Здесь встречаются грунты клеток или отдельные клетки, которые, как правило, крупнее остальных.

имеют Солыаув вакуоль, дающую очень интенсивную реакцию на полифенолы. Наряду с подобндаи клетками в гиподерме плода встречаются клетки ^ гораздо меньшей концентрацией полифенолов в вакуолях. Оба вида описанных вше клеток мы можем отнести к категории фенол-содержащих клеток гиподермы яблока. В противоположность им, отдельные клетки гиподермы вообще не дают реакции на полифенолы. Как правило, с 4-5 сдоя клеток гиподермы процент таких "нефевольных" клеток возрастает по направлению к паренхиме плода. В паренхимных клетках концентрация веществ полифенольной природы значительно меньше и они более диспергированы внутри вакуолей. Среди обычных паренхимных клеток с одной или несколькими вакуолями иногда также выделяются отдельные клетки или пары клеток, имеющие чрезвычайно большую концентрацию полнфенолов. В таких клетках реакцию на полифенолы дает либо наиболее крупная вакуоль, а все остальные остаются неокрашенными, либо наличие полнфенолов обнаруживается сразу в 2-3 вакуолях. Такие же богатые фенолами клетки характерные и для участков тканей, непосредственно прилегающих к сосудисто-волокнистым пучка».

Однако в некоторых случаях в клетках плода наблюдается и иная локализация продукта нитрозореакции, а именно, окрашиваются клеточные стенки и пристенный слой цитоплазмы, в то время как вакуоль остается неокрашенной, либо вообще не просматривается в клетке. По нашему мнению, это явление -артефакт, образующийся в результате повреждения клетки в момент приготовления среза. По мнени ю некоторых авторов (ве«*в, 1967), наблюдавших аналогичное явление, это объясняется диффузией продукта реакции из мест первоначальной локализации, вследствие чего имеет место его внутриклеточная адсорбция на поверхности клеточных стенок.

В старом плоде распределение фенолов по тканям такое же. что я в созревающем плоде. В "загоревших" участках плода интенсивность окраски всего среза заметно слабее, что свидетельствует об уменьшении концентрации полифенолов в побурев-пей зоне. Эти наблюдения хороао коррелируют с биохимическими

давними об уменьшении содержания фенольных веществ в побуревших плодах (Салькова, Бекбулатова. 1965). Сами "эагоревоие*1 клетки сильно скаты и деформированы, содержимое их бурое и, по-видимому, представляет собой комплексы.продуктов окисления полифенолов с цитоллазыатяческими белками.

Б целом, анализируя активность и локализацию системы полифенолы-полифенолоксидаза в плодах в процессе созревания, старения и развития "загара" мы можем провести ряд сопоставлений.

Субстрат и фермент пространственно отделены в клетке друг от друга: полифенолы локализованы в вакуолях, а полифенол оксидаза находится в хлоропластах и цитоплазме клеток.

Градиент концентрации полифенолов от поверхности вглубь плода характерен и для активности полифенолоксидазы, то есть, в том тканевом -слое, где наблюдается большая концентрация субстрата - наибольшая активность фермента.

16 "загоревшие" участках плода увеличивается активность полифенолоксидазы и одновременно уменьшается содержание полифенолов, что свидетельствует о частичном ферментативном окислении полифенолов и превращении их в флобафены.

Однако в большинстве случаев невозможно прямо сопоставить концентрацию субстрата и активность фермента в одних и тех же клетках плода, в связи с чем можно лияь строить разные предположения относительно функционирования системы полифенолы-полифенолоксидаза в этих клетках. Так. фенол-содержаще клетки гиподермы с повышенным содержанием субстрата могут обладать большей активностью полифенолоксидазы. чем обычные гиподермаль-ные клетки. В атом случае, именно с фенол-содержащих клеток гиподермы может начаться процесс побурения тканей плода. С другой стороны, можно предположить, что нолифенол оксид аза в фенол-содержащих клетках, наоборот, может быть менее активна, чем Бапрочих клетках' этой ткани, или фермент здесь просто неспецифичен к субстрату, находящемуся в вакуоли. Тогда эти фенол-содержащие клетки* будут > более стабильны и их роль сгодится линь к запасанию^ хранению полифенолов, необходимы! для различны^случаев жизни плода.

- го -

Не исключена возможность, что большая активность поли-фенолоксидазы мохет приходиться ва обычные гиподермальныа клетжж с меньжей концентрацией субстрата, по сравнению с вше-вазванными фенол-с одержакдаыи клвтк8)л> Это обстоятельство может явиться одной из причин того,«о именно в мех клетках будет наблюдаться сдвиг в окислительно-восстановительном рав-вовеоии в сторону необратимого окисления полифенолов, и эти клетки наложат начало процессу побурения.

f " 4. Изменение величины рН в тканях иддаадри разуитир "загара*

Для различных процессов жизнедеятельности плода больше значение имеет величина рН его тканей и клеток.хоторвя во многом определяет направление обменных процессов в них. В частности, со сдвигом в величине рН тканей плода связывают, в какой-то степени, развитие функциональных расстройств плода. В связи с этим, мы провели гистохимическое определение величины рН в тканях и клетках оостклвмахтерических здоровых и "загоревших" плодов.

Результаты проведенных наблюдений показывав«, что величина рН вакуоляриого содержимого большинства клеток гиподермы и наружной паренхимы здоровых участков старых плодов колеблется от 4,4 до 5,2. Обращает на себя внимание тот факт, что отдвлв-нав клетки гиподермы, а иногда и паренхимы плода дают болев высокие значения рН, часто до 5,6-6,0. Сами побуревшие отмершие клетки целиком адсорбируют красители, в связи с чем, установить рН з них с достаточной точностью уже не представляется возможный. Что же касается клеток, непосредственно прилегающих к воне "гагара™, то, в большинстве случаев, они дают также более высокие, чем остальные клетки» звачения рН (от 5,4 до 6.2). что согласуется с данными о декарбоксилировании яблочной кислоты и накоплении ацетальдегида в атжх участках тканей.

Полученные данные заставляют предполагать, что с увеличением значений рВ. с приближением их к нейтральной зоне, в от-

дельных участках тканей плодов может начаться процесс побуре-г ния. это связано с тем, что при значениях рН, близких к нейтральный, создаются условия для неферментативного окисления лолифенолов, а также усиливается активность некоторых окислительных ферментов, в частности, полифенолоксидазы, что может привести в отдельных клетках к необратимому окислению феиоль-ных веществ. В связи с этим, можно предположить, что в тех клетках из здоровых участков плодов, где имеют место более высокие значения рН (5,6-6.0). создаются наибольшие предпосылки для возникновения "загара".

Б. Элеатронвомикроскопическяе особенности здоровых и пораженных ^загаром" плодов

Функциональные изменения в тканях и клетках плода, происходящие в процессе старения и развития "загара", наводят на мысль, что побурение тканей при развития этого заболевания связано с изменением в тонкой структуре клеток плода.

В связи с этим, бшо предпринято электроняомикроскопичес-кое изучение тканей плода в процессе созревания» старения ■ развития "загара". Основное внимание при этом было привлечено к определенным клеточным органоидам, таким, как хлоропласт и митохондрии, а также к вакуолярному содержимому клеток, так как, именно с ними, по литературным данным (B»in,*»rc«r, 19И) Bain, 19M) связаны основные. функциональные нарушения, имеющие место в стареющей и "загоревшей" ткани.

Как показывали электронномикроскопические наблюдения, наиболее лабкхьнши структурами клеток плода в процессе созревания и старения являются хлоропласт«. Хотя структурна» организация хлоропластов илодos отхичаетсн от таковой у фотосжи-тезирующих тканей, все же в свежеубранных плодах хлороидасти имеют ярко выраженную гранальвув структуру* Однако уже в декабре-январе, когда прочие клеточные органокды «и* сохраняли свое нормальное строение, хжоропласты претерпевали значятель-

ные деструктивные изменения. В этот период наблюдалось значительное разрушение ламеллярной системы хлоропластов и образование в них большого числа липидных глобул. Продолжающаяся далее прогрессивная липоидная глобуляция хлоропластов является, по мнению ряда авторов (Натиенко и др.,1968; ?отару,1968), частью общего ладюфанероза - процесса разрушения липопротеид-ных мембран клетки и характеризуется как признак старения плодов. Этот процесс затрагивает не только пластидный аппарат клетки, но и всю цитоплазму, свидетельством чего является наличие липидных глобул во многих участках клетки. Дальнейшее разрушение структуры хлоропластов с потерей ими окружающей мембраны и образование дезориентированных мембран и липидных глобул в клетках старых' и "загоревших" плодов может повлечь за собой выход в цитоплазму таких ферментов, как полифенолоксидаза, локализованных на мембранах хлоропластов.

В процессе созревания и старения плода митохондрии клетки выглядят гораздо более устойчивыми, чем хлородласты. В дост-климактернческом плоде, на фоне интенсивной вакуолизации цитоплазмы, митохондрии сохраняли свою нормальную структурную организацию: были окружены двойной мембраной и имели четко выраженные кристы. ЫитохондриальныЙ матрико светлый. Даже в совсем старом плоде (в феврале-марте) митохондрии выглядели вполне нормальными. По нанки наблюдениям в плодах с лешими признаками "загара" митохондрии хотя' и были лишены крист и выглядели плотными, но были еще вполне распознаваемы, и только в сильно побуревших участках плода митохондрии полностью теряли свойственную им структуру. Такая устойчивость митохондрий объясняет высокий уровень цитохромоксидазной активности в старом плоде, а также, вероятко. способность плода к длительному существованию в отрыве от материнского организма*

Таким образом, наблюдаемые нами изменения структуры хлоропластов и отчасти митохондрий, свойственны нормальному старению клеток. Эти изменения лишь усугубляются по мере развития "загара". В то же время, со стороны вакуоляриого содержимого отмечаются значительные различия между клетками здоровых и побуревших участков плода.

- га -

Как показали наблюдения, в вакуолях большинства гиподер— мальвюс и, частично, паренхимных клеток пр едкл им акт ериче ских плодов содержится электронно-плотный материал в виде гранулярного вещества различной морфологии. Этот материал, по-видимому,-^ представлен веществами полифенольной природы, в пользу чего говорит убыль его по направлению от гиподермы к паренхиме плода, что хорошо согласуется с результатами проведенного нами гистохимического изучения поляфенолов, а также с литературными данными (*1тата,19бО) 'ва1п,Мегевг>1965* Коадз,1971).

5 электронном микроскопе особенно заметкой становится разнокачественность клеток по содержанию полифенолов в вакуолях. Кроме того, в пределах самой клетки одна вакуоль бывает богата электронно-плотным материалом, а другая не содержит его совсем.

В старых плодах без признаков "загара" содержание, морфология и локализация электронно-плотных веществ отличается от таковых у предклимактерических плодов. Заметно уменьшается количество электронно-плотного материала внутри вакуолей и все большее количество его в виде отдельных скоплений и агрегатов оседает на тонопласте. Наблюдения за динамикой электронно-плотных веществ в вакуолях, позволяет предположить, что на этой стадии жизни плода происходят качественные изменения в содержимом вакуолей, выражающиеся в частичном образовании продуктов окисления полифенолов. Здесь речь может идти как о ферментативном, так, частично, и о иефераентативнои окислении поли* фенолов, условием для которого может служить обнаруженный нами в отдельных случаях сдвиг величины внутриклеточного рН в щелочную сторону.

Далее, по мере старения плода все большее количество электронно-плотного материала аккумулируется на тонопласте до появления на нем в отдельных клетках сплошного электронно-плотного слоя, наличие которого является критическим моментом в жизни клетки и приводит к разрушению тонопласта. Этому субмикроскопическому признаку соответствуют первые признаки побу-рения на поверхности плода.

- 2А -

Сан по себе факт разрушения тонопласта является характерной, почти универсальной чертой старения растительной клетки. Наблюдаемые нами в клетках стареющего плода отложения большой кассы электронно-плотного материала на мембране тонопласта лишь ускоряют разрушение тонопласта, в пользу чего говорит резкое изменение картины цитоплазматического матрикса в этот период (появление в цитоплазме грубых структур).

Следствием разрушения тонопласта является также исчезновение свойственного здоровой клетке тургора, сжатие побуревших мертвых клеток под давлением близлежащих здоровых клеток и появление плотных гомогенных структур, внешне проявляющихся в бурых пятнах на кожице плода. Таким образом, разрушение тонопласта указывает на то, что клетка находится на последнем этапе своей жизни, за которым следует смерть.

Все изложенное позволяет заключить, что обнаруженные в отдельных клетках плода отклонения в уровне интенсивности обменных процессов, которые выражаются в более раннем по времени повышении внутриклеточной величины рН, увеличении активности цитоплаэиатической полифенолоксидазы, прогрессивном разрушении клеточных мембран лежат в основе преждевременного старения и отмирания этих клеток, внешним проявлением чего и является побурение поверхности плода, определяемое, как физиологическое заболевание "загар*.

ВЫВОДЫ

1. Гистохимическое изучение кутикулы показало увеличение ее толщины в процессе созревания плодов, а также позволило выявить различия в липядном составе поверхностного воска, собственно кутикулы и кутинизированного эпидермиса, заключающиеся -в преобладании в собственно кутикуле соединений с ненасыщенными двойными связями.

2. Выявлены гистофизиологические различия поверхностных тканей плода, заключающиеся в уменьшении концентрации полифенолов и снижении активности окислительных ферментовшитохромоксв-

даэы, пероксидазы и полифенолоксидазы от поверхности вглубь плода. Кроме того, обнаружена значительная цитофизиологичес-кая разнокачественность отдельных клеток в пределах однородной в анатомическом плане ткани (гиподермы и паренхимы): по содержанию полифенолов, величине внутриклеточного рН и активности окислительных ферментов.

3. Активность цитохромоксидазы наблюдается в течение всей жизни плода. Кривая изменения активности зтогс фермента совпадает с кривой климактерического подъема дыхания плода.

В ходе созревания и старения плода активность пероксидазы во всех тканях уменьшается. Пероксидаза в тканях плода локализована в клеточных стенках, срединной пластинке, веществе межклетников и пристенном слое цитоплазмы.

5. В процессе старения плода происходит перераспределение полифенолоксидазы в клетке - в связи с разрушением структуры хяоропластов происходит выход фермента в цитоплазму и увеличение цитоплазматкческой активности полифенолоксидазы. Полифенолы в тканях плода локализованы в вакуолях клеток.

6. В процессе старения плода происходит нарушение внутриклеточной организации: быстрая дезорганизация хлоропластов, частичное и более медленное нарушение структуры митохондрий, вакуолизация цитоплазмы.

7. В тканях, прилежащих к зоне "загара", наблюдается значительная активация цитохромоксидазы и цитоплазматической полифенолоксидазы.

8. Развитие "загара" является результатом усиления процессов старения в отдельных клетках плода, о чем свидетельствует более раннее разрушение тонопласта в них, вызванное отложением на нем веществ полифенольной природы.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Морозова Н.П., Салькова Е.Г., Платонова Т.А.1968. - Биохи-

мическое изучение кутикулы яблок в период их роста. Прикладн.биохим.и микробиол.,т.4. стр. 139-146.

2. Салькова Е.Г., Платонова Т.А. 1968. - Фенольные вещества

плодов и их влияние на ферментативный аппарат возбудителей плодовых гнилей. В сб.: "Фенольные соединения и их биологические функции", Косква, "Наука", стр.275-261,

3. Платонова 7.А.. Салькова Е.Г. 1969. - Гистохимия окисли-

тельных ферментов в тканях созревающих плодов. Докл. АН СССР, т.185, стр. 1379-Х381.

4. Платонова Т.А. 1969. - Гистохимическое изучение тканей

здорового и больного плода, В сб.: "Биохимия иммунитета и покоя растений". Москва, "Наука", стр. 152-173.

5. Салькова Е.Г., Морозова fi.II.. Платонова Т.А. 1969. - Биохи-

мическая природа физиологических заболеваний плодов. Труды 5-го Всесоюзного совещения по иммунитету растений, ВЫП. 14, стр. 3-5.

6. Салькова Е.Г., Платонова Т.А. 1970. - Участие полифенол-

охсидазы и эндогенных полифенолов в развитии побурения тканей. Тезисы П Всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям. Алма-Ата, "Наука".

7. Платонова Т.А., Ыетлицвий Л.В. 1972, - Локализация полифе-

нолов и полифенолоксядазы в растительной клетке и их взаимодействие при физиологических заболеваниях плодов. В сб.i "Иммунитет и покой растений". Москва. "Наука", стр. 50-57.

Материалы диссертации доложены на Симпозиуме по фенольным соединениям, 1966, Москва.

Подписано к печати О! 1Ч>1Ж г.

Усл. печ. _. Тираж £00 экз. заказ

Отпечатано в множительной лаборатории геологического факультета МГУ, Москва, Лекторы.

*