Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетико-биохимические особенности реакции Xenopus lasvis на окислительный стресс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Генетико-биохимические особенности реакции Xenopus lasvis на окислительный стресс"

На правах рукописи

Хепориз 1ае^в НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС

О3.00.04 - биологическая химия 03.00.15 - генатх-пса

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 1997

Работа выполнена в НИИ Биологии Ростовского государственного университета.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Е.П.Гуськов (Ростов-на-Дону), кандидат биологических наук, доцент Н.П. Милютина (Ростов-на-Дону).

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор М.М. Асланян (МГУ, Москва); доктор биологических наук, вед. науч.сотр. И.А. Горошинская (НИИ Онко-логии, Ростов-на-Дону).

Ведущая организация: Нижегородский государственный университет им. Лобачевского.

ИЗ

Защита состоится ..... декабря 1997г. на заседании специализированного совета Д 063.52.08 в Ростовском государственном университете (г.Ростов-на-Дону, ул.Большая Садовая. 105, ауд.203, в 9 часов).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РГУ (344006, г.Ростов-на-Дону. ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан "■^Р" ноября 1997 года.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук,

профессор С/^Ч Т.И. Бондаренко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы в биологической литературе все большее место занимают работы, связанные с исследованием роли свободных радикалов в биологических процессах. Установлена важная роль свободнорадикальных процессов (СРП) при возникновении патологических состояний клеток, тканей, органов и организма в целом. В то же время, значительное место уделяется фундаментальным исследованиям роли свободных радикалов в норме, их участию в процессах клеточного деления, детерминации, диффе-ренцировки и органогенеза. Как правило узловым моментом в этих исследованиях является анализ причин, приводящих к переходу от физиологически контролируемых эффектов свободных радикалов на патологические (СегзЬгаап, 1954; НоИие11. Агиоша, 1991).

В то время как изучение механизмов окислительного стресса широко проводятся на млекопитающих и микроорганизмах, другие классы позвоночных, как правило, остаются достаточно редкими объектами этих исследований. С этой точки зрения изучение последствий окислительного стресса на таком классическом объекте как Хепориэ 1аеу1з ЭошИп является вполне оправданным. Достоинством этого вида амфибий является также то, что именно на этом объекте можно изучать влияние окислительного стресса в течение всех этапов органогенеза, что методически трудно сделать на эмбрионах млекопитающих.

Анализ цитогенетических и биохимических последствий, связанных со становлением антиоксидантного статуса в нормальных условиях и после окислительного стресса, может дать новую информацию о становлении, развитии и регуляции активности систем анти-оксидантной защиты у амфибий.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы явилось исследование генетико-биохими-ческих механизмов формирования систем антиоксидантной защиты у Хепориэ 1аеу1з на разных этапах развитая в условиях окислительного стресса.

Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:

1) изучить уровень аберраций хромосом на различных этапах

онтогенеза шпорцевой лягушки в норме и после воздействия гипер-барооксигенацией (ГБО) в режиме 0,7 МПа при экспозиции 1 час:

2) изучить интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по уровню содержания его молекулярных продуктов и активность антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы - в раннем онтогенезе в норме и после воздействия ГБО (0,7 МПа: 1 час);

3) определить чувствительность различных тканей взрослого организма Хепориэ 1аеу1Б к воздействию ГБО. (0,7 МПа: 1 час);

4) изучить влияние ГБО на интенсивность ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов в различных тканях взрослых Хепориз 1аеу1з , предобработанных ГБО в режимах 0,2 МПа; 1 час и 0,7 МПа; 1 час на стадии вылупления личинки (35 стадия развития).

Научная новизна работы.

- 1. Показано, что в раннем онтогенезе Хепориз 1аеу1э, от стадии средней бластулы до начала метаморфоза, происходит уменьшение содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ, накопление конечных продуктов ПОЛ, увеличение активности антиоксидантных ферментов и уменьшение уровня спонтанных нарушений хромосом. Впервые изучен уровень аберраций хромосом, состояние антиоксидантных систем ксенопусов, а так же интенсивность перекисного окисления липидов после окислительного стресса в процессе раннего индивидуального развития и во взрослом состоянии.

2. Впервые двумя независимыми методами - цитогенетическим и биохимическими - показана большая чувствительность к действию кислорода под повышенным давлением личиночных стадий развития Ксенопуса и устойчивость к окислительному стрессу эмбриональных стадий.

3. Впервые показано, что однократное воздействие ГБО на ранних этапах онтогенеза изменяет способность антиоксидантных систем взрослого организма реагировать на окислительный стресс.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Экспериментально показаны особенности изменения систем ан-тиоксидантной защиты в процессе эмбрионального и личиночного развития.

Наиболее важным вкладом в понимание механизмов действия ГБО на амфибий явилась прямая корреляции между критическими точками морфогенеза амфибий и изменением биохимических показателей, оп-

ределякицих антиоксидантных статус организма.

Выявлена возможность преадаптировать взрослый организм к окислительному стрессу однократной обработкой ГБО на ранних этапах развития.

Данные, представленные в работе, позволяют как количественно, так и качественно оценить вклад гипероксии в окислительное повреждение различных тканей амфибий во взрослом состоянии, а также оценить различную степень чувствительности к ГБО на ранних стадиях индивидуального развития.

Материалы исследований используются при чтении лекции по специальным курсам "Генетика развития" и "Мутагены окружающей среды" на кафедре генетики РГУ.

Основные положения выносимые на защиту.

1. В процессе индивидуального развития Хепориэ 1аеу1з Б. в норме снижается уровень аберраций хромосом, уменьшается содержание диеновых коньюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА), увеличивается количество шиффовых оснований (ШО), повышается активность супероксидцисмутазы (СОД) и каталазы.

2. Ранние стадии эмбрионального развития по вышеперечисленным показателям являются устойчивыми к ГБО, в то время как стадии личинки демонстрируют высокую чувствительность к окислительному стрессу.

3. Количественное содержание первичных (ДК) и конечных (ШО) продуктов ПОЛ. а также активность антиоксидантных ферментов -СОД и каталазы свидетельствуют о том, что дифференцированные ткани взрослого организма демонстрируют разную чувствительность к окислительному стрессу.

4. Однократная обработка ксенопусов ГБО на ранних этапах развития изменяет антиоксидантный статус животных во взрослом состоянии.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференциях молодых ученых РГУ (Ростов-на-Дону, 1995, 1996, 1997), на Международной коференции "Медицина и адаптация" (Индия. 1995). на 24 Международном конгрессе по анатомии (Югославия, 1996).

Публикации. По материалам данного исследования опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация написана на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы, включающего 104 отечественных и 67 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 17 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на шпорцевых лягушках ХепориБ 1аеу1Б ОоисИп. Для стимуляции созревания гамет проводили однократную инъекцию хориогонином, растворенным в растворе Рингера. Самцам вводили 100-200 МЕ, самкам - 300-400 МЕ за 12-14 часов до желаемого срока откладки яиц. Зародыши развивались при температуре 230С. Время наступления стадии фиксировали по Ньюкопу и Фаберу ШешЛоор Р.Б., ГаЪег Л., 1965). Исследовали зародыши на ранних стадиях онтогенеза: эмбриональные, или предличиночные, - 8 ст. (поздняя бластула), 24 ст. (стадия хвостовой почки). 35 ст. (начало вылупления); стадии личинки - 40 ст. (начало кровообращения в жабрах). 50 ст. (активный органогенез). 62 ст. (одна из стадий метаморфоза). А также в эксперименте использовали взрослых особей, достигших двухгодичного возраста.

Для цитогенетического анализа и изучения интенсивности ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов на ранних стадиях индивидуального развития шпорцевой лягушки в норме и после воздействия ГБ0 животных разделили на 3 группы: 1) контрольная - Хепориэ Ь. на разных стадиях зародышевого развития; 2) Хепориэ Ь. на разных стадиях зародышевого развития, которых подвергали действию ГБ0 в режиме 0,7МПа, при экспозиции 1 час: фиксацию проводили через 1 час после воздействия ГБ0; 3) Хепориэ Ь. на разных стадиях зародышевого развития, которых подвергали действию ГБ0 в режиме 0,7МПа, при экспозиции 1 час; фиксацию проводили через 24 часа после воздействия ГБ0. Так как на эмбриональных стадиях развитие амфибий идет с большой скоростью, на стадиях 8, 24, 35, котроль-ными группами, соответствующими варианту "24 часа после действия" ("24ч п/д") служили контрольные группы стадий 24, 35, 40. На 40-ой стадии для варианта "24ч п/д" ставился специальный контроль. На стадиях 50 и 62 постановка контролей для варианта "24ч п/д" не представлялась необходимой, так как развитие лягуш-

ки на этот момент происходит довольно медленно, и продолжительность этих стадий составляет несколько суток.

С целью исследования интенсивности ПОЛ и активности анти-оксидантных ферментов в различных тканях взрослых особей Хепориэ 1аеу1з после предварительного воздействия на них повышенным давлением кислорода на стадии 35 развития взрослые особи Хепориэ 1аеу1з были разделены на 6 групп: А - контроль - интактные взрослые особи Хепориз 1аеу1з; Б - взрослые особи Хепориэ 1аеу1з после воздействия ГБО в режиме 0.7 МПа при экспозиции 1ч.; В -взрослые особи Хепориэ 1аеу1з, которые были подвергнуты воздействию ГБО в режиме 0,2 МПа при экспозиции 1ч. на стадии 35 зародышевого развития; Г - взрослые Хепориз. 1аеу1з после воздействия ГБО в режиме 0,7 МПа при экспозиции 1 ч., ранее обработанные ги-пероксией в режиме 0,2 МПа -1ч. на стадии 35 онтогенеза; Д -взрослые особи Хепориэ 1аеУ1з , которые на стадии 35 зародышевого развития подвергались воздействию ГБО в режиме 0,7 при экспозиции 1ч.; Е - взрослые Хепориэ Ьаеу1з_ после воздействия ГБО в режиме 0,7 МПа -1ч., которых на стадии 35 онтогенеза обрабатывали в условиях гипероксии в режиме 0,7 МПа - 1 ч. В данном эксперименте варианты А. В и Д являются контролями, соответствующими вариантам Б, Г и £.

Повышенное давление кислорода создавали в барокамере со щелочным поглотителем углекислоты. Компрессию и декомпрессию проводили со скоростью 0,2 МПа/мин. Действие кислорода под повышенным давлением исследовали при 0,7 МПа и 0,2 МПа. Экспозиция составляла 1 час.

У взрослых животных после декапитации быстро извлекали мозг, легкие, печень, скелетные мышцы; кровь собирали в сосуды с гепарином . Развивающиеся личинки на стадиях 8, 24, 35 гомогенизировали полностью , студенистую оболочку удаляли с помощью О,015М раствора дитиотреитола в 0.01М трис-НС1 буфере (рН 7,8) Шз1еу е! а1., 1979); у личинок на стадиях 40, 50, 62 выделяли мышечную ткань туловища и хвоста. Гомогенаты готовили в Трис -НС1 буфере (рН 7,4). Об активности ПОЛ судили по содержанию первичных продуктов -диеновых коньюгатов(ДК), вторичных - малонового диальдегида (МДА).конечных продуктов - шиффовых оснований (ШО). Из гомогенатов экстрагировали липиды по методу (В11е11, Эу-

er; 1959). Количество продуктов ПОЛ с коньюгированным типом связи определяли спектрофотометрически при длине волны 233 нм на Specord UV VIS и выражали в нмолях на мг липида (Владимиров, Ар-чаков, 1972). Содержание шиффовых оснований измеряли на спект-рофлуориметре Hitachi 650-60 (Япония), оценивали по интенсивности флуоресценции липидного экстракта при длине волны возбуждающего света 360 нм и максимуме флуоресценции 440 нм ( Bidlack, Tapell,1973) и выражали в относительных единицах флуоресценции в 1 мг общих липидов. Концентрацию МДА определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) и выражали в нМолях/мг белка (Стальная, Горишвили, 1977). Количество общих липидов определяли фосфованилиновым методом (Колб, Камышников, 1982). Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по методу (Fried, 1975). активность каталазы - по методу Королюка (Королюк и др.. 1988) после предварительной обработки гомогенатов тканей тритоном Х-ЮО в конечной концентрации 0,5% (Вартанян, Гуревич, 1992). К гемолизату для осаждения гемоглобина добавляли смесь этанол/хлороформ (5:3). Активность СОД и каталазы выражали, соответственно, в ед /мг белка ( в крови - ед/мг гемоглобина) и нмоль Н202 / мг белка (в крови - нмоль Н202/ мг гемоглобина). Содержание общего белка определяли модифицированным методом Лоури (Schackter-le. Pollack, 1973). Содержание гемоглобина - гемоглобинцианидным методом в модификации (Каракашов, Вичев, 1968). Аберрации хромосом (АХр) анализировали в анафазах клеток зародышей шпорцевой лягушки . предварительно зафиксированных этанол - уксусным фиксатором и окрашенных ацетоорсеином.

Результаты экспериментов обрабатывали статистически, достоверность различий оценивали по t - критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ДИНАМИКА АБЕРРАЦИЙ ХРОМОСОМ, ИНТЕНСИВНОСТИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ Xenopus laevis Результаты проведенных исследований позволили нам установить некоторые закономерности в изменении уровня аберраций хромосом и их взаимосвязь с перекисным окислением липидов и состоянием антиоксидантной системы в процессе развития Xenopus laevis.

Из полученных данных следует, что уровень АХр на эмбриональных стадиях развития шпорцевой лягушки выше, чем на стадиях личинки (рис. 1). Максимальный уровень аберрантных анафаз зарегистрирован на 8-ой стадии зародышевого развития - стадии средней бластулы, где он составляет 6,2%. На последующих стадиях предличиночного развития он составил 4,1% и 3,8%, на 24-ой и 35-ой стадиях развития, соответственно. В процессе дальнейшего развития личинки наблюдается резкое снижение количества аберрантных анафаз . На 40-ой стадии развития уровень аберраций хромосом составил 0,9%; на 50 - 1,4%. На всех исследуемых стадиях раннего развития зародыша амфибий основной вклад в становление аберраций хромосом вносят одиночные и множественные фрагменты, доля которых от общего числа аберраций хромосом составляет 53 -77« . Такого рода перестройки чаще всего приводят к гибели клетки.

Существуют данные, из которых вытекает, что гаструляция, нейруляция'и закладка осевого комплекса, то есть очень сложные формообразовательные процессы, включающие в себя первичную индукцию, детерминацию и клеточную дифференцировку, отбор клонов клеток и строго синхронизированную их пролиферацию, морфогенети-ческие движения, могут осуществляться у зародышей млекопитающих и при наличии клеток с частично утраченной генетической информацией. Однако, хромосомные мутации детальны для млекопитающих во время органогенеза (Дыбан, Баранов. 1978).

Высокий уровень спонтанного мутагенеза на предличиночных стадиях может быть следствием повышенного содержания в этот период развития продуктов ПОЛ, в том числе, МДА. Мутагенные эффекты этих метаболитов установлены для разных объектов. Так синг-летный кислород, гидроксильный радикал и перекиси индуцируют генные мутации у бактерий ( Baiin et al., 1976: de Olivera et al., 1992; Anderson. Wallance, 1992), аберрации хромосом в клетках растений и млекопитающих (Emerit et al., 1981), вызывают разрывы ДНК в фибробластах и культуре лимфоцитов человека (Ка-minskas, Lei, 1992). Установлена достаточно высокая положительная корреляционная зависимость между уровнем вторичных продуктов ПОЛ. главным образом, МДА. и выходом Ахр в клетках костного мозга крыс (Шкурат и др., 1993).

Результаты исследований свободнорадикального ПОЛ свидетель-

ствуют об изменении его интенсивности в раннем онтогенезе в зависимости от стадии развития. При этом динамика начальных и конечных этапов процесса не одинакова. Как видно из рис. 2 содержание первичных и вторичных молекулярных продуктов ПОЛ - диеновых коньюгатов и МДА - максимально на стадии 8 эмбриогенеза, а на последующих этапах наблюдается снижение их уровня . В тоже время содержание конечных продуктов ПОЛ повышается в ходе развития. В соответствии с этим, изменение уровня естественного мутирования в ходе раннего онтогенеза амфибий можно согласовать с нашими данными о динамике свободно-радикального ПОЛ в гомогена-тах ХепориБ 1аеу1з на различных стадиях развития. Высокое содержание первичных продуктов окисления на эмбриональных этапах развитая лягушки можно объяснить разными причинами, одна из которых - высокое содержание в развивающемся яйце эндогенных липидов, являющихся субстратом перекисного окисления (Руднева-Титова, 1994). Действительно, по данным литературы в эмбриональных клетках на ранних этапах развития зародыша наиболее активное радика-лообразование обнаруживается в ядрах и желточных гранулах (Мелехова и др., 1982). В интенсивно идущих в эмбриогенезе процессах утилизации желтка определенную роль может играть ПОЛ, поскольку желток представляет собой фосфолипидный комплекс.

Сопоставление результатов иследований уровня аберраций хромосом и выживаемости животных в контроле и после воздействия ГБО указывает на то, что именно 50 стадия личинки, стадия активного органогенеза:^ является критической в развитии амфибий. Именно на этой стадии происходит падение выживаемости личинок в контроле. Если до 50 стадии при нормальном процессе развития выживает 90% личинок, то после 50 стадии до метаморфоза доходит только 70% личинок. Аналогичная картина наблюдается и у зародышей, обработанных повышенным давлением кислорода: в период прохождения личинкой стадий активного органогенеза выживаемость животных резко падает.

Другая причина этого явления может быть связана с постепенным формированием антиоксидантной системы. На рисунке 3 приведены данные, из которых следует, что активность антиоксидантных ферментов существенно возрастает в процессе развития зародыша. Однако, динамика активности ферментов не равномерна и зависит от стадии развития. Активность СОД в гомогенатах снижается на 24-ой

7 б 5-п. 4

5

* з 2 1

СИ-

24 35 40 стадия развития

П контроль НГБО 1ч п\ц □ ГБО 24ч п\д

Рис.1. Уровень аберраций хромосом в клетках зародышей Хепориэ ¡аеугё на ранних стадиях развития в норме и после действия ГБО.

е-а

стадия развития

Рис.2. Динамика диеновых коньюгатов, малонового ддиальдегида и шиффовых оснований на ранних стадиях развития Хепориэ 1аеу1з.

□ сод

В гаталаза

стадия развития

Рис.3. Динамика активности СОД и каталазы на ранних стадиях развития Хепориэ 1аеу1з (в % от стадии 8).

□ ГБО 1чп\ц В ГБО 24ч п\ц

стадия развития

Рис.4. Динамика содержания диеновых коньюгатов на разных стадиях развития Хепориэ 1аеуш после воздействия ГБО .

и 35-ой стадиях развития на 40% и 53% соответственно по сравнению с 8-ой стадией эмбриогенеза . Затем наблюдается повышение активности фермента : увеличение активности СОД на 40-ой стадии составляет 67%, на 50-ой стадии - 68%, на 62-ой стадии - 158%, в мышцах взрослых особей - 842%. Если активность СОД у ксенопусов возрастает постепенно со стадии 35, то активность каталазы, незначительно изменяясь от стадии 8 до стадии 40 зародышевого развития, резко возрастает на стадии 50 (225%) и достигает максимума на стадии 62 (703%), в мышцах взрослых особей активность каталазы по сравнению со стадией 8 увеличивается на 74% . Следует отметить, что на стадиях 50 и 62 в хвостовых отделах головастика активность антиоксидантных ферментов также значительно повышается по сравнению со стадией 8, причем в несколько раз больше, чем в туловищных отделах на тех же стадиях. Особый интерес представляет динамика МДА при инкубации проб в течение двух часов при 37°С, так как отражает в определенной мере емкость антиоксидантных систем личинок шпорцевой лягушки на ранних стадиях онтогенеза. Уровень МДА в инкубированных пробах увеличивается только на 50 стадии (на 52%). Можно предположить, что антиокислктельная система личинок ксенопусов в раннем онтогенезе, оцениваемая по уровню МДА при инкубации гомогенатов, имеет наименьшую мощность на 50-ой стадии развития. В остальные сроки уровень МДА не претерпевает существенных изменений в ходе инкубации, что свидетельствует о достаточной емкости антиокислительной системы клеток зародыша.

Результаты многих исследований, проводимых в последнее время по изучению физиологической роли свободных радикалов, подтверждают необходимость регуляторной функции свободных радикалов в клетках эмбриона, в системе активно делящихся клеток.

С другой стороны, как уже отмечалось ранее, аберрации хромосом, как правило ведут, к гибели клетки, причем этот тип клеточной гибели происходит по типу апоптоза, является физиологическим процессом, противоположным митозу и. как считают в настоящее время, программированным (Новиков, 1996). Большую роль в эмбриональной программированной клеточной гибели (ПКГ) некоторые исследователи отводят продукции свободных радикалов (Pierce et al., 1989; Parchment, 1993; Hochenbery et al., 1993 ; Korsmeyer et al., 1995). Наши исследования укладываются в эту гипотезу:

программа клеточной гибели запускается свободнорадикальиыми реакциями, продукты которых фрагментируют ДНК, приводя клетку к апоптозу. Гибнет та часть клеток, в которых уровень свободнора-дикальных процессов превосходит антиоксидантную емкость. Гибнущая популяция клеток - поставщик как веществ для энергетического и пластического обмена, так и низкомолекулярных антиоксидантов (Гуськов. Лукаш, 1989). Судя по нашим результатам, в активно делящихся клетках эмбриона наблюдается дефицит ферментативных антиоксидантов. Таким образом, система апоптоза представляет собой неспецифическую защиту от свободных радикалов активно пролифери-рующих клеток. Свободным радикалам можно отвести роль основного регулятора эмбриональной клеточной гибели, пролиферации и диффе-ренцировки.

Изменения всех исследуемых нами показателей на стадиях эмбриогенеза: высокий уровень аберраций хромосом, повышенная по сравнению со стадиями личинки интенсивность ПОЛ, достаточно низкая активность антиоксидантных ферментов - указывают на состояние зародыша в этот период, подобное стрессорному. По-нашему мнению, это похожее на стресс состояние, длится до исчезновения желтка и вылупления.

При переходе к периоду терминальной дифференцировки (стадии личинки) вступает в действие новая метаболическая система: по мере развития яйца повышается число митохондрий и содержание в них цитохромоксидазы, радикалообразование из ядер и желточных гранул перемещается в митохондрии (Мелехова, 1982). В это время резкое возрастание активности СОД и каталазы способствует защите клеточных мембран от кислородных радикалов в период активного органогенеза.

По-видимому, различная "биологическая стратегия" клеток зародыша на эмриональных и личиночных стадиях развития определяет и их ответную реакцию на окислительный стресс.

ДИНАМИКА АБЕРРАЦИЙ ХРОМОСОМ, ИНТЕНСИВНОСТИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ ХепориБ 1аеу1з ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ГБО

Как видно из полученных нами данных, эмбриональные стадии развития шпорцевой лягушки демонстрируют устойчивость к воздейс-

твию кислорода под давлением . Цитогенетический анализ состояния хромосомного аппарата клеток предличинки после воздействия ГБО не выявил никаких изменений. Отсутствует инициация ПОЛ после воздействия повышенным давлением кислорода на предличиночных стадиях развития головастика. Различный ответ антиоксидантных ферментов на окислительный стресс (снижение активности СОД и ка-талазы на всех изученных стадиях, за исключением стадии 35, на которой - резкое возрастание активности СОД ) говорит о том, что в процессе развития зародыша могут функционировать и другие звенья антиоксидантной защиты, такие как глутатионпероксидаза и низкомолекулярные антиоксиданты. которые, по данным литературы, были обнаружены в значительных количествах в развивающейся икре рыб и амфибий (Дудкин, Гарагуля. 1988).

Экспозиция Хепориз 1аеу1э различных стадий раннего онтогенеза в условиях ГБО приводит к значительной инициации свободно-радикального ПОЛ в гомогенатах на поздних этапах развития, начиная с 50-й стадии (рис. 4). При этом изменение содержания ДК на личиночных стадиях развития головастика происходит в разные сроки после окончания действия окислительного стресса. Следует отметить, что наиболее резкая стимуляция ПОЛ после действия ГБО отмечена в тканях хвостового отдела головастиков на стадиях 50 и 62.

Отмечая стадию 50, как критическую в ответной реакции на окислительный стресс, следует подчеркнуть особое состояние антиокислительной системы личинок на этой стадии. Только на стадии 50 в контрольной группе отмечен существенный прирост МДА ( на 50 и 35%, соответственно) при инкубации гомогенатов туловища и хвостового отдела, что может свидетельствовать о недостаточной емкости антиокислительной системы. Это, по-видимому, вносит определенный вклад в инициацию ПОЛ при окислительном стрессе на стадии 50 зародышевого развития.

С другой стороны, свободно-радикальные процессы, активизирующиеся после ГБО, могут, вероятно, влиять на количество аберрантных анафаз, которое на стадиях 40 и 50 развития личинки после воздействия ГБО более чем в 2 раза превышает количество их в контроле (рис.1). Причем, высокий уровень аберраций хромосом на стадии 50 наблюдается через 1ч после действия ГБО и сохраняется через 24 ч после воздействия, а на стадии 40 в течение указанно-

го времени он возрастает. Это говорит о том, что при окислительном стрессе свободные радикалы не только непосредственно действуют на хроматин, инициируя разрывы ДНК, но и вызывают глубокие изменения в метаболических процессах дифференцирующейся клетки.

Ранее было показано, что повышенное давление кислорода вызывает значительное увеличение количества аберрантных клеток в костном мозге, роговице, лимфоцитах периферической крови человека через сутки после действия агента и оно сохраняется в течение нескольких клеточных поколений (Гуськов, Шкурат, 1985; Гуськов и др., 1990; Сивкоу е!.а1., 1990).Вместе с тем, была отмечена различная чувствительность к кислороду генеративной и соматической тканей, в частности было показано, что кислород не индуцирует доминантных деталей у млекопитающих.

Причиной возникновения разрывов хромосом после ГБО могут быть либо ферментативные процессы,связанные с активацией различных нуклеаз.так и не ферментативные свободно-радикальные процессы. инициирующие первичные разрывы ДНК, ведущие к деградации хроматина.

После действия окислительного стресса на зародыши Хепориэ 1аеу1Б отмечена активация начальных этапов ПОЛ на стадии 50, которую можно рассматривать как критическую в возникновении чувствительности к кислороду. Активация конечных этапов ПОЛ обнаружена только на стадии завершения метаморфоза (стадия 62) .что свидетельствует о некомпенсированном -усилении свободно-радикального окисления липидов в процессе раннего развития ХепориБ 1аеу1з, являющегося важнейшим звеном в развитии кислородной интоксикации (Кричевская и др., 1980; 1983). .

Повышенный уровень интенсивности ПОЛ, пониженная активность антиоксидантных ферментов говорят о стрессорном состоянии, в котором находится организм даже спустя сутки после воздействия ГБО.

ВЛИЯНИЕ ГИПЕРБАРИЧЕСКОЙ ОКСИГЕНАЦИИ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ ПОЛ И АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ТКАНЯХ ХЕЯОРиЗ ЬАЕУ13 ПОСЛЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АДАПТАЦИИ К ПОВЫШЕННОМУ ДАВЛЕНИЮ КИСЛОРОДА

В экспериментах на млекопитающих было показано, что предва-

рительная обработка взрослых животных малыми давлениями кислорода повышает их устойчивость к сублетальным давлениям (Кгауе1г й., 1980). В то же время в литературе отсутствуют данные о том, влияет ли воздействие ГБО на ранних стадиях онтогенеза на состояние системы антиоксидантной защиты взрослого организма. В этой связи была поставлена задача изучить реакцию различных тканей взрослых особей Хепориэ 1аеу1з, обработанных ГБО на стадии 35, на окислительный стресс.

Судя по полученным нами результатам (рис. 5), самыми устойчивыми к окислительному стрессу у интактных взрослых амфибий оказались мышечная ткань и печень, а наиболее чувствительным -мозг. В крови и легких наблюдали увеличение активности суперок-сиддисмутазы, активность каталазы была несколько снижена. Незначительные изменения уровня первичных продуктов ПОЛ могут быть связаны с резкой активацией СОД. В то же время, обнаруженная дискоординация в функционировании сопряженных антиоксидантных ферментов - СОД и каталазы, может привести к дополнительной интенсификации ПОЛ, так как происходит недостаточно эффективная утилизация Н202, которая является источником одного из самых ци-тотоксических активных форм кислорода - гидроксильного радикала. Это подтверждается существенным накоплением конечных продуктов ПОЛ - шиффовых оснований.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что однократное воздействие повышенного давления кислорода на личинок стадии 35 изменяет антиоксидантный метаболизм, который сохраняется во взрослом состоянии, то есть информация, полученная презумптивны-ми клетка!® в ювенильном периоде, сохраняется после прохождения всех стадий дифференцировки. Так у животных, обработанных кислородом под повышенным давлением на стадии вылупления личинки, не зависимо от режима обработки, во взрослом состоянии зарегистрирована повышенная активность ферментов антиоксидантной защиты именно в мозге, легких и крови по сравнению с интактным контролем. Причем, если в легких и крови - за счет индукции активности СОД. то в мозге - за счет повышенной активности каталазы. Однако, в этих же тканях интенсивнее идут и свободно-радикальные процессы (СРП), о чем говорит повышенное содержание продуктов ПОЛ. Причем, если после обработки ГБО в режиме 0,2 МПа в мозге регистрировали повышенное содержание только Ш0, а в легких - толь-

ко ДК. то после обработки личинок ГБО в режиме 0,7 МПа у взрослых лягушек в мозге наблюдали повышение содержания ШО в 4 раза, а в легких - повышенный уровень и ДК, и ШО. Накопление ШО после токсического режима ГБО наблюдали и в крови уже взрослых лягушек.

В то же время, несмотря на повышенную активность ПОЛ и ан-тиоксидантных ферментов, по-видимому, существует определенный баланс между свободнорадикальными процессами и системой антиок-сидантной зьпциты. -

' После вторичного воздействия ГБО у амфибий, предобработан-ных на стадии 35 развития кислородом в режиме 0,2 МПа, в тканях, которые обнаружили наиболее значительные изменения после обработки интактных взрослых животных, изменений в содержании продуктов ПОЛ и активности ферментов антиоксидантной защиты не произошло. Таким образом, у лягушек, предобработанных кислородом на ранних стадиях развития в режиме 0,2 МПА; 1 час, равновесие между интесивностью ПОЛ и уровнем антиокислительной активности практически не нарушено по сравнению с результатом однократной предварительной обработки.

Вторичное воздействие гипероксии на животных, предобработанных ГБО в режиме 0,7 МПа , 1 час, приводило к 50% летальности животных этой группы, где зафиксировали резку» интенсификацию перекисного окисления липидов мозга. У выживших животных чувствительность легких к окислительному стрессу оказалась неоднозначной.

Анализируя результаты, полученные при исследовании групп животных, предобработанных ГБО в режиме 0,7 МПа - 1 час на 35-ой стадии развития (группа 5), и животных, предобработанных этим же режимом ГБО. после вторичного воздействия избыточным давлением кислорода (группа £), мы пришли к выводу о необходимости разделить животных этих групп на подгруппы. При этом мы руководствовались резким различием в уровне ШО и активности СОД в легких. В группе Л у всех животных содержание ДК в легких превысило контроль на 161%, а количество ШО у одних животных увеличено на 130%, у других - на 656% . Также существовали различия и в активности антиоксидантных ферментов: активность каталазы была понижена на 33% по сравнению с контролем у всех животных, активность СОД у одних животных превысила контроль на 137% (рис.5 "легкие 1").

Рис. 5. Влияние ГБО на интенсивность ПОЛ и активность антиоксидант ных ферментов в тканях амфибий, ранее обработанных различными режимами ГБО на стадии: 35 онтогенеза (□ % к интактному контролю).

Рис. 5. Влияние ГБО на интенсивность ПОЛ и активность антиоксидант ных ферментов в тканях амфибий, ранее обработанных различными режимами ГБО на стадии ■' 35 онтогенеза (в % к интактному контролю). Продолжение.

у других достоверно не изменялась (рис.5 "легкие 2") .

После вторичной обработки (группа £) в своем ответе на окислительный стресс животные также разделились на две группы. В одной - интенсификация процессов ПОЛ не наблюдалась (рис.5 "легкие 1"), в другой - количество ДК возросло на 92% (рис.5 "легкие 2") по сравнению с соответствующим вариантом предобработки (группа Д). В обеих группах значительно повышается активность СОД (на 318% и 517% по сравнению с соответствующим контролем, что на 884% и 242% выше интактного контроля), так на фоне достаточно резкого повышения активности СОД у всех организмов, у некоторых обнаружено ингйбирование ПОЛ, у других - активация этих процессов, что указывает на индивидуальную чувствительность животных к окислительному стрессу.

Таким образом, устойчивая долговременная адаптация к окислительному стрессу у взрослых ксенопусов зависит от возраста адаптируемого организма, когда клетки органов-мишеней (в данном случае мозг, легкие и кровь) не потеряли способность к формированию клеточной и тканевой основы долговременной адаптации. Если для взрослого организма необходимо учитывать параметры интенсивности, продолжительности и кратности воздействия, то для развития устойчивой долговременной адаптации достаточно одиночного воздействия в раннем онтогенезе, интенсивность которого не истощала бы, а мобилизовала и развивала адаптационные свойства организма. При этом, тканью, наиболее чувствительной к изменению режима предобработки гипероксией и биохимически реактивной во взрослом состоянии, оказалась нервная ткань. Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что предобработка более низкими дозами стрессирующего агента оставляет длительный метаболический след в системах организма, характеризующихся высоким уровнем обменных процессов. Это может положить экспериментальную основу в создание концепции адаптиогенеза к окислительному стрессу.

ВЫВОДЫ

1. В раннем онтогенезе Хепориэ 1аеу1Б, от стадии средней бластулы до начала метаморфоза, уровень спонтанных нарушений хромосом уменьшается.

2. В раннем онтогенезе Хепорив 1аеу1з, от стадии средней '

бластулы до начала метаморфоза, происходит уменьшение содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ, накопление конечных продуктов ПОЛ, в то время как активность антиоксидантных ферментов увеличивается.

3. На эмбриональных стадиях зародышевого развития количество аберрантных анафаз не изменяется в различные сроки после окончания воздействия ГБО (0,7 МПа, 1 час). Действие гипероксии индуцирует увеличение количества клеток с нарушениями хромосом на стадиях личинки.

4. В период эмбрионального развития обработка повышенным давлением кислорода не инициирует процессы ПОЛ и не изменяет активность антиоксидантных ферментов (СОД и каталазы): увеличение интенсивности процессов ПОЛ и изменения активности СОД и каталазы наблюдается только после воздействия ГБО на зародышей постэмбрионального развития , при этом 50 стадия отмечается как критическая.

5. Обработка взрослых животных ГБО показала, что по интенсивности ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов у всех исследуемых групп самыми устойчивыми к окислительному стрессу оказались мышечная ткань и печень, а наиболее чувствительными -мозг, кровь и легкие.

6. Воздействие ГБО на стадии вылупления личинки (35), независимо от режима обработки (0,2 МПа - 1ч или 0,7 МПа - 1ч), во взрослом состоянии вызвало повышенную активность ферментов СОД и каталазы и интенсификацию процессов ПОЛ в мозге, легких и крови по сравнению с интактным контролем.

7. Повторная обработка ГБО взрослых амфибий, предобработан-ных в ювенильном периоде ГБО в режиме 0,7 МПа, приводила к 50% летальности животных этой группы, у выживших животных наблюдалась существенная инициация переписного окисления липидов мозга и резкая активация СОД в легких при неизменной активности каталазы.

8. После повторной обработки ГБО взрослых амфибий, предоб-работанных на стадии 35 развития кислородом в режиме 0,2 МПа, в мозге, крови, легких изменений в содержании продуктов ПОЛ и активности ферментов антиоксидантной защиты не зарегистрировано.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. И.В.Тимофеева, Г.М.Федоренко, Е.П.Гуськов. Изменение ультраструктуры клеток костного мозга крыс после воздействия ГБО // Тезисы 6-й Ростовской областной научно-практической школы-семинара "Механизмы адаптации животных и растений к экстремальным факторам среды", г.Ростов-на-Дону, 1990,- Т.2,- С.21-22.

2. Т.П.Шкурат, И.В.Тимофеева, Г.М.Федоренко, Е.П. Гуськов. Реакция клеток костного мозга на окислительный стресс // Цитология, 1991.- Т.33.- N5.- С.143.

3. А.Э. Нечепуренко, Т.А. Кощеева, И.В. Тимофеева. Мутагенное действие газовых смесей под давлением // Материалы VI Всесоюзного съезда ВОГ и С, Минск, 1992, 25-28 ноября.

4. Т.П. Шкурат, Н.П.Милютина. А.Э.Нечепуренко. Т.А.Кощеева. В.М. Сапожников, Е.И. Новикова, И.В.Тимофеева, Е.И.Шиманская, Б.С.Дашевский. Перекисное окисление липидов и хромосомные аберрации у мышей после многократного воздействия гелиокислородной дыхательной смесью в режиме гипербарии // Физиол.журн.. 1993,-Т.39.- Ml.- С.89-96.

5. I.V. Timofeeva, O.V. Kravtchenko. N. P. Milutina. Development of different stages reaction in Xenopus laevis to oxidative stress // IV World congress of adaptive medicine, India,

1995,- P.23.

6. I.V. Timofeeva. Influence of oxydant stress on nervous tissues of Xenopus laevis // Book of Abstracts of 24. Congress of YAA with international participants. Folia anatómica, Novi Sad.

1996,- P.155.

7. Милютина Н.П., Тимофеева И.В., Шкурат Т.П Влияние гипербарической оксигенации на интенсивность перекисного окисления липидов и активность антиоксидантных ферментов в тканях Xenopus laevis после предварительной адаптации к кислороду// III Международный симпозиум "Медицина и охрана здоровья", г. Тюмень, сентябрь 1997г.

8. Гуськов Е.П., Тимофеева И.В., Милютина Н.П., Шкурат Т.П.. Штельмах С.Л. Влияние гипербарической оксигенации на развитие Xenopus laevis // Онтогенез, 1997.- Т.28.- N5,- С.352-358.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ПОЛ - переписное окисление липидов;

ДК - диеновые коньтогаты;

ШО - шиффовы основания;

МДА - малоновый диальдегид;

СОД - супероксиддисмутаза;

ГБО - гипербарическая оксигенация:

МПа - мегапаскаль; .

АО - антиоксиданты.