Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическое картирование аллозимных локусов у четырех видов сосен, формирующих леса Восточной Европы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическое картирование аллозимных локусов у четырех видов сосен, формирующих леса Восточной Европы"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ

УДК. 575.116:582.475

- 7 <;

1* I. Л \ 2

ПАДУТОВ АЛЕКСАНДР ЕВГЕНЬЕВИЧ

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ АЛЛОЗИМНЫХ ЛОКУСОВ У ЧЕТЫРЕХ ВИДОВ СОСЕН, ФОРМИРУЮЩИХ ЛЕСА ВОСТОЧНОЙ ЕВРОПЫ

03.00. 15 -генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1998

Работа выполнена в Институте леса Национальной Академии Наук Беларуси

Научный руководитель: Член-корреспондент HAH Б,

доктор биологических наук, профессор Гончаренко Г. Г.

Официальные оппоненты: Член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор Корочкин Л. И.

Доктор биологических наук, гл. н . с. Каминская Л.Н.

Оппонирующая организация: Институт биологии развития

им. Н.К.Кольцова РАН ( г.Москва )

Защита состоится 19 мая 1998 года в 1400 часов на заседании Совета по защите диссертаций Д 01.31.01 в Институте генетики и цитологии Национальной Академии наук Беларуси по адресу: 220072, г. Минск, улица Академическая, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Я. Коласа Национальной Академии наук Беларуси

Автореферат разослан « /6 » апреля 1998 г.

Ученый секретарь

Совета по защите диссертаций

кандидат биологических наук

¿fffcyy*^' Л. А. Тарутина

Актуальность темы диссертации. Генетические карты являются тем необходимым фундаментом, без которого невозможно развитие многих направлений генетических и селекционных исследований. Они способствуют выявлению неслучайных ассоциаций аллелей разных локусов, позволяют изучать процессы рекомбино- и мутагенеза, проводить многолокусную оценку параметров скрещивания, картировать селекционно-важные признаки, осуществлять биотехнологические и генноинженерные работы (Clegg et al., 1972; Shaw et al., 1981; Vallejos, Tanksley, 1982; Sederoff, Ledig, 1985). Особую актуальность генетическое картирование приобретает в связи с необходимостью ускоренной и направленной селекции организмов в животноводстве, растениеводстве и лесном хозяйстве.

Одними из главных лесообразующих видов Восточной Европы являются сосны. Только в Беларуси сосновые насаждения занимают более 50% всей лесо-покрытой площади. Однако, несмотря на важное хозяйственное значение сосен, исследования, посвященные анализу структурной организации их генома и генетическому картированию, до последнего времени не проводились в связи с полным отсутствием адекватных генных маркеров. У сельскохозяйственных растений генетические карты первоначально строились на основе фенотипическях признаков, которые у сосен не могли быть использованы, так как их генетическая детерминация до сих пор практически не выяснена. Это связано с тем, что для проведения анализирующих скрещиваний у таких долгоживущих и медлен-носозревающих видов, как хвойные, необходимы десятилетия. Появление моле-кулярно-генетических методов, одним из которых является электрофоретиче-ский анализ изоферментов, и особенности формирования гаплоидных мегагаме-тофитов хвойных дало возможность начать работы по исследованию генома сосен и построению генетических карт без специальных скрещиваний. К настоящему времени анализ сцепления аллозимных локусов и картирование некоторых из них проведено более чем для 20 видов хвойных. Лучше других в этом плане изучены американские сосны, для 10 из которых осуществлена локализация аллозимных генов. В то же время картирование генов у сосен европейского континента ограничивается только тремя видами из одиннадцати: Pinus sylvestris L., P. leucodermis Ant. и P. pallasiana Asch. (Rudin, Ekberg, 1978; Niebling et al. 1987; Szmidt, Muona, 1989; Morgante et al., 1993; Goncharenko et al., 1994a).

Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертационная работа выполнена в Институте леса HAH Беларуси в ходе исследований по следующим фундаментальным темам и программам: "Исследование и разработка генетико-селекционных методов для создания теоретических основ лесо-восстановления и лесоразведения" (1991-1995 гг. № госрегистрации 19951416); "Дать анализ характера распределения радиоиндуцированных мутаций в генетическом материале хвойных на основе локализации генов" (1995 г. № 33-10); "Анализ структурной организации генетического материала и определение спо-

собов реализации генетического потенциала ценных древесных пород" (19962000 гг. № госрегистрации 19961682). Исследование сцепления аллозимных генов у сосны обыкновенной проводилось также в рамках темы "Построение генетических карт у основных лесообразующих и хозяйственно-важных хвойных растений Беларуси" (1995-1996 гг. № госрегистрации 19951414), финансируемой Белорусским Республиканским Фондом фундаментальных исследований (№ Б94-029), а также при поддержке фонда Сороса при выполнении темы: "Оценка генетических последствий аварии на Чернобыльской АЭС в неотселенных районах Беларуси, загрязненных радионуклидами".

Цель и задачи исследования. Целью исследования было построение генетических карт на основе анализа сцепления генов, кодирующих изоферменты у четырех основных видов двухвойных сосен Восточной Европы: сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.); сосны горной (Р. mugo Turra); сосны черной (P. nigra Arn.) и сосны брутской (P. brutia Ten.). В процессе работ решались следующие основные задачи:

■ провести электрофоретический анализ материала деревьев четырех видов сосен из различных частей их ареалов с использованием 24 генов, кодирующих изоферменты, для выявления и отбора особей, гетерозиготных по двум и более изученным локусам;

■ на основании исследования эндоспермов у отобранных дигетерозиготных деревьев провести анализ сцепления генов по всем имеющимся в наличии дву-локусным комбинациям у каждого вида и выявить сцепленные пары локусов;

■ локализовать сцепленные гены и построить генетические карты для четырех видов сосен.

■ проанализировать характер распределения функционально связанных генов в геномах изученных видов сосен.

■ провести сравнительный анализ локализации гомологичных аллозимных генов в группах сцепления у двухвойных сосен Восточной Европы.

Научная новизна полученных результатов. Впервые для сосны обыкновенной проведена совместная локализация генов Aat-1, Gpi, уточнена локализация генов Dia-2 и Рер-3 и картировано 8 локусов в первой группе сцепления. Генетическая карта Р. sylvestris также дополнена двумя новыми группами сцепления, включающими четыре гена.

В ходе исследований впервые построены генетические карты: сосны горной, включающей 14 аллозимных локусов в четырех группах сцепления; сосны черной, включающей 12 генов в трех группах сцепления и сосны брутской, состоящей из четырех генов в одной группе сцепления.

Показан дисперсно-кластерный характер организации генетического материала в группах сцепления у сосен.

Подтверждена высокая степень консерватизма генетического материала хвойных видов на примере сосен, формирующих леса Восточной Европы.

Практическая значимость полученных результатов. Полученные в ходе исследования генетические карты сосны обыкновенной были использованы при

анализе характера распределения радиоиндуцированных, в результате аварии на Чернобыльской АЭС, мутаций в генетическом материале хвойных.

Наличие генетических карт позволило начать в Беларуси работы по изучению рекомбиногенеза у хвойных видов.

Генетические карты создали базу для использования изоферментных локу-сов в селекционной работе в качестве маркеров генных блоков, а также для интерпретации многолокусной генетической структуры, сертификации семенных наборов и решения вопросов сохранения генетической изменчивости популяций в процессе лесовосстановления.

Экономическая значимость полученных результатов. Работа относится к фундаментальным исследованиям, что не позволяет на данном этапе оценить непосредственный экономический эффект от полученных результатов. Однако, учитывая необходимость в генетических картах для разных направлений лесной науки, они будут с успехом использованы в ряде генетико-селекционных и лесо-восстановительных программ, а также в лесном семеноводстве, что несомненно даст существенный экономический эффект.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Четырнадцать генов у сосны обыкновенной и сосны горной, 12 генов у сосны черной и 4 гена у сосны брутской достоверно картированы и локализованы в 4-х группах сцепления.

2. Десять локусов не сцеплены ни между собой, ни с локализованными генами и дисперсно распределяются по 8 группам сцепления.

3. Структурно-функциональная организация генетического материала в группах сцепления носит дисперсно-кластерный характер.

4. Состав групп и линейное расположение локусов совпадает у всех изученных видов. Сохранение линейного порядка генов в группах сцепления свидетельствует о консервативности организации генетического материала, по крайней мере в пределах двухвойных сосен Восточной Европы.

Личный вклад соискателя. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены непосредственно автором работы в лаборатории генетики леса Института леса НАНБ. В сборе семенного материала сосен и его изо-ферментном анализе принимали также участие в.н.с. Падутов В.Е., с.н.с. Силин А.Е. и м.н.с. Болсун С.И., которых автор благодарит за помощь в работе. Автор выражает признательность доктору Адольфу Корчаку (Польша) и профессору Ладиславу Пауле (Словакия) предоставившим часть семенного материала сосны обыкновенной и сосны горной.

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации докладывались на Международной научно-практической конференции "Генетика и селекция - на службе лесу" (Воронеж, 1996), Международной конференции IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) "Проблемы изучения и сохранения генетических ресурсов лесных древесных видов на территории СНГ" (Беловежская пуща, 1996), VII съезде БОГиС (Горки, 1997) и Международной конферен-

ции "Молекулярная генетика и биотехнология" (Минск, 1998).

Опубликованность результатов. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, общим объемом 63 страницы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 3-х глав, включающих обзор состояния проблемы по данным литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, а также заключения, выводов, приложений и списка цитируемой литературы, который содержит 270 наименований, в т.ч. 228 на иностранных языках. Работа изложена на 135 страницах, проиллюстрирована 7 рисунками, 9 таблицами и приложениями.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Материал для анализа был собран в Латвии, Словакии, Польше, Беларуси, Украине и России с 920 деревьев Р. sylvestris в 28 природных популяциях, 118 деревьев Р. mugo в 5 популяциях, 215 деревьев P. nigra в 9 популяциях и 176 деревьев P. brutia в 7 популяциях. В целом, для определения многолокусных генотипов каждого изученного дерева и картирования 24 изоферментных генов был проведен анализ 402070 электрофоретических локус-тестов.

Электрофоретический анализ изоферментов проводили в 13-14% крахмальном геле, с использованием трех буферных систем: (А) трис-ЭДТА-боратной pH 8,6, (Б) трис-цитратной pH 6,2 и (В) трис-цитрат/трис-HCl pH 6,2/8,0 (Goncharenko et al., 1992). Экстракция ферментов и их гистохимическое окрашивание велось по стандартным методикам, описанным в ряде руководств (Conkle et al., 1982; Cheliak, Pitel, 1984; Гончаренко и др., 1989), с небольшими модификациями. Каждое дерево исследовалось по 14 ген-ферментным системам (аспартатаминотрансфераза - ААТ, алкогольдегидрогеназа - ADH, глюкозофос-фатизомераза - GPI, диафораза - DLA, лейцинаминопептидаза - LAP, флюоресцентная эстераза - FL-EST, 6-фосфоглюконатдегидрогеназа - 6-PGD, глутаматде-гидрогеназа - GDH, малатдегидрогеназа - MDH, фосфоглюкомутаза - PGM, кислая фосфатаза - АСРН, изоцитратдегидрогеназа - IDH, аконитаза - ACO, пепти-даза - PEP), которые как было установлено ранее, кодируются 24 локусами (Goncharenko et al., 19946; Goncharenko et al., 1995; Silin, Goncharenko, 1996). Генотип каждого дерева устанавливался на основе анализа 8-10 эндоспермов.

Генетическая символика и обозначения аллелей давались по общепринятой номенклатуре (Lewontin, Hubby, 1966; Prakash et al., 1969). Обозначение фермента составляется из наиболее употребляемого его названия в сокращенном виде прописными латинскими буквами (лейцинаминопептидаза - LAP). При обозначении соответствующих локусов первая буква пишется прописной, а остальные строчными ( например LAP - Lap). Если синтез фермента контролируется не одним, а несколькими неаллельньши структурными генами, то они нумеруются

арабскими цифрами в порядке уменьшения их электрофоретической подвижности (например, Ьар-1, Ьар-2). При обозначении аллельных изоферментов (алло-зимов) и кодирующих их генов использовались цифровые символы, пишущиеся в надстрочнике и отражающие электрофоретическую подвижность фракций фермента относительно наиболее часто встречающегося варианта, которому присваевается символ 1,00.

Картирование генов основывалось на исследовании гаплоидных эндоспермов, которые у хвойных являются прямыми продуктами мейоза, что при наличии деревьев гетерозиготных по двум и более локусам позволяет анализировать сцепление без специальных скрещиваний. В двулокусном расщеплении у дигетерозиготных деревьев эндоспермы разделялись на два класса ("нормальный" и "рекомбинантный"). Поскольку заранее не было известно, какой класс является нормальным у исследуемого дерева, то за рекомбинантный принимался меньший по численности (Яи(1т, ЕкЬег§, 1978). Частота рекомбинации (Л) между локусами вычислялась по формуле: Я=гШ, где г - число рекомбинантов, а -¿V - общее число проанализированных эндоспермов, а ошибка частоты рекомбинации по формуле: 5 = - Я) / N . Достоверность отклонения по классам гамет от ожидаемого соотношения 1:1 оценивалась с помощью метода хи-квадрат. С этой целью подсчитывалось три значения хи-квадрат. Для каждого из локусов образующих пару и в целом для сцепления. Если по паре локусов встречались деревья, имеющие более 40% рекомбинантов, то такая пара локусов не рассматривалась в качестве сцепленных. При анализе нескольких деревьев, показавших достоверное сцепление по определенной паре локусов, вычислялась средняя частота рекомбинации. Расстояние между генами рассчитывалось в сантиМорганах (сМ) по формуле Косамби И = 25 1п [(1+2/?)/(1-2й)], где Я - частота рекомбинации (КоватЫ, 1944). Линейное расположение генов определялось в результате анализа деревьев гетерозиготных по 3 и более локусам.

Результаты и обсуждение

Анализ сцепления аллозимных локусов у четырех видов восточноевропейских сосен

Сосна обыкновенная

В ходе анализа природных популяций сосны обыкновенной изменчивость была обнаружена по всем 24 генам. Однако, вследствии слабого полиморфизма некоторых локусов, были найдены дигетерозиготные деревья несущие 232 дву-локусные комбинации из 276 возможных (табл. 1). Только восемнадцать пар локусов показали достоверное сцепление между собой. Результаты анализа сцепления вышеуказанных пар локусов приведены в таблице 2. Исходя из данных этой таблицы было определено 4 группы сцепления у сосны обыкновенной.

Первую группу составили 8 локусов: АаМ, Ор1, Б1а-2, Рер-3, АсШ-1, АсШ-2, Ьар-2, Аа1-2. Тесное сцепление выявлено между генами АсШ-1 и АсШ-2. Из 728 проанализированных эндоспермов только 8 оказались рекомбинантными,

Таблица 1

Двулокусныс комбинации, число деревьев, используемых для анализа сцепления (верхняя правая часть), и результаты статистического тестирования (нижняя левая часть) у Pinns sylvestris

Локус Aal-1 Aal-2Aat-3 Adh-I Adh-2 Gdh Gpi Dia-I Dia-2 Lap-1 Lap-2 Mdh-lMdh-2Mdh-3Mdh-4Fl-Esl Pgm-1 Pgm-2 Pgd-1 Pgd-2 Idh Acph Aco Pcp-3

Aat-1 2 3 1 2 3 2 4 _ 3 2 1 - 2 4 3 2 2 2 4 2 - -

Aat-2 H 6 6 5 4 5 4 4 5 2 2 3 5 5 3 2 5 4 2 1 1 1

Aat-3 II II 7 5 7 6 4 4 4 4 2 1 7 7 5 2 3 6 4 1 2 2 2

Adh-I *** *** r. 13 4 3 6 3 3 7 2 1 5 4 6 2 2 3 2 1 2 2 2

Adh-2 *** II II *** 6 3 5 2 3 5 2 1 4 4 3 2 2 5 5 - 2 3 -

Gdh 11 II H II H 2 4 3 2 1 2 1 4 6 4 3 2 4 5 2 4 2 -

Gpi *** II II *** *** Ii 3 1 4 3 1 - 4 3 4 2 1 3 3 - 1 - -

Dia-I II II II II и и и 4 5 5 1 1 5 3 6 2 2 6 4 1 2 - 1

Dia-2 - II II *** *** H и - 1 - - 2 3 4 2 1 3 2 1 2 2 -

Lap-1 II H II II H и и ii - 6 2 - 5 4 7 2 1 5 4 1 2 - -

Lap-2 H *** H *** *** H и и II и 1 - 6 2 5 1 1 3 5 - 2 - 1

Mdh-I II II II II II II и ii - ii ii - 1 2 3 1 - 3 3 - 1 - -

Mdh-2 - II 11 II II II u - - - - 2 1 1 1 - 1 1 - - - -

Mdh-3 II II 11 II II II и и и ii ii и ii 7 6 2 4 3 3 2 1 - 1

Mdh-4 II II II II H II H H и H H ii и 5 4 4 4 5 2 4 2 -

Fl-Est II II II II II 11 ii и и *** ii и и и ii 3 2 6 4 2 3 1 -

Pgm-J ii ii ii ii ii H и ii и H и ii и ii ii и 1 2 2 - 2 1 -

Pgm-2 ii H H II ii ii и и ii и ii - - *** ii ii и 2 1 1 1 - -

Pgd-1 ii ii ii H ii H и и и и и H H n и и и л 5 - 4 2 1

Pgd-2 H H H ii ii ii и и ii ii ii ii и H H и и и и 1 3 2 1

Idh - ii ii ii - *** - H H H - - - а и и - H - и - - -

Acph ii ii ii ii ii ii и и ii ii ii ii - и и и ii ii ii ii - 2 1

Aco - ii ii ii ii ii - и - - - - - ii и и - и и - ii 1

Pep-3 - ii ii *** - - - и - - 4** - - и - - - - h и - ii и

Примечание: - - двулокусные комбинации не анализировались и - нет достоверного сцепления локусов

*** - достоверное сцепление. Уровни значимости: * 0,05; ** 0,01; *** 0,001.

Число эндоспермов Частота Ошибка . ,2 Расстояние

Пары локусов проана- рекомби- реком- частоты X в сМ

лнзир. нантных бинации рекомб.

Aat-1 : Gpi 112 3 0,027 0,015 100,321 2 7***

Aat-1 : Adh-1 52 7 0,135 0,047 27,769 13,8***

Aat-1 : Adh-2 98 14 0,143 0,035 50,000 14 7***

Gpi : Dia-2 46 2 0,043 0,030 38,348 4 4***

Gpi: Adh-1 112 25 0,223 0,039 34,321 24,0***

Gpi : Adh-2 116 18 0,155 0,034 55,172 16,0***

Dia-2 : Adh-1 119 18 0,151 0,033 57,891 15,6***

Dia-2 : Adh-2 95 9 0,095 0,030 62,411 9

Pep-3 : Adh-1 68 1 0,015 0,015 64,059 1,5 ***

Pep-3 : Lap-2 48 12 0,250 0,063 12,000 27,5***

Adh-1 : Adh-2 728 8 0,011 0,004 696,400 1 i***

Adh-1 : Lap-2 286 71 0,248 0,026 72,504 27,2***

Adh-2 : Lap-2 209 55 0,263 0,030 46,895 29,3***

Adh-1 : Aat-2 174 56 0,322 0,035 22,092 38,2***

Lap-2 : Aat-2 193 27 0,140 0,025 100,109 14 4***

Lap-1 : Fl-Est 278 62 0,223 0,025 85,309 24,0***

Idh : Gdh 94 0 0 0 94,000 Q##*

Pgm-2 : Mdh-3 174 2 0,011 0,008 166,092

Уровни значимости: * 0,05; ** 0,01; *** 0,001.

что составило 1,1 сМ по Косамби (табл. 2). Сходное сцепление между двумя ло-кусами алкогольдегидрогеназы установлено ранее в работах по таким видам сосен, как Pinns sylvestris, Р. contorta и P. jeffreyi (Rudin, Ekberg, 1978; Conkle, 1981; Szmidt, Muona, 1989).

Для изучения расстояния между локусами Aat-1 и Gpi было найдено только два дигетерозиготных дерева, анализ материала которых показал тесное сцепление между этими генами (табл. 2). Следует отметить, что одно из этих деревьев, 200-летнее дерево произрастающее в Национальном парке "Беловежская пуща" (Беларусь), оказалось также гетерозиготным по гену Adh-2. Это позволило однозначно определить взаиморасположение локусов Aat-1, Gpi и Adh-2 (рис. 1). Сцепление между локусами, предположительно соответствующим нашим Aat-1 и Gpi, выявлено и для ряда других видов сосен: Pinus rígida, P. taeda, P. contorta, P. jeffreyi, P. strobus, P. attenuata, P. radiata (Guries et al., 1978; Adams, Joly, 1980; Conkle, 1981; Eckert et al., 1981; Moran et al., 1983; O'Malley et al., 1986; Strauss, Conkle, 1986).

Pinus sylvestris

II

III

IV

Aai-l Dia-2 Adh-2 I Gpi I Pep-31 Adh-1

Lap-2 Aat-2

2.7 4.4 1.5 1.1

Fl-Est

27.2 14.4

Lap-1

24.0 Idh Gdh

Pgm-2 Mdh-3

Pinus mugo

Aat-1 Gpi

Dia-2 Pep-3 Adh-1 Adh-2

x /

Lap-2 Aat-2

9.4 16.9 ' 7.5

Fl-Esl

18.1

21.2 Lap-1

II

III

IV

32 2 Idh Gdh

Pgm-2 Mdh-3

Pinus nigra

Aal-l Gpi Dia-2 Pep-3 Adh-1 Adh-2

I

Lap-2 Aai-2

ТЭТ"

II IV

Fl-Est

Lap-1

25.5 Pgm-2 Mdh-3

2.0

Pinus brutia

Gpi Adh-1 Adh-2

Aat-2

10 20 30 40 50

I I I I_1

Шкала для карт в сМ

9.6

.1

I

10.6

35.4

I

Рис. 1. Генетические карты четырех видов сосен Восточной Европы, построенные на основе сцепления аллозимных локусов. Дистанция дана в сантиМорганах (сМ)

Из более 900 проанализированных деревьев сосны обыкновенной только одно (ТБ-69) оказалось дигетерозиготным по локусам Gpi и Dia-2, что дало возможность установить генетическое расстояние между ними, которое составило 4,4 сМ (табл. 2). Изучение представителей рода Pinus позволило ранее продемонстрировать локализацию генов, предположительно соответствующих Gpi и Dia-2 в данной работе, для четырех видов сосен, причем расстояние между этими двумя локусами у разных видов варьировало от 14,1 до 23,9 сМ (Conkle, 1981; Strauss, Conkle, 1986; Niebling et al., 1987). Исследованное нами дерево ТБ-69, дигетерозиготное по Gpi и Dia-2, оказалось также гетерозиготным и по ло-кусу Adh-1. В ходе анализа 46 эндоспермов у данного тригетерозиготного дерева было обнаружено 2 рекомбинанта между Gpi и Dia-2, 7 рекомбинантов между Dia-2 и Adh-1 и 9 рекомбинантов между Gpi и Adh-1. Таким образом локус Dia-2 расположен на генетической карте P.sylvestris между локусами Gpi и Adh-1 (рис. 1). Данные таблицы 2 показывают также, что Adh-2 расположен ближе к локусам Gpi и Dia-2, чем Adh-1.

Тесное сцепление локусов Рер-3 и Adh-1 с расстоянием в 1,5 сМ выявлено на основании данных по двум дигетерозиготным деревьям (табл. 2), одно из которых было также гетерозиготно и по Lap-2. Это позволило локализовать Рер-3 слева от локуса Adh-1. Учитывая тот факт, что Dia-2 в наших исследованиях находится дальше от Adh-1 (15,6 сМ), чем Рер-3 (1,5 сМ), на карте первой группы сцепления Рер-3 был расположен между Dia-2 и Adh-1 (рис. 1). Необходимо отметить, что локализация гена Pep в первой группе сцепления до настоящего времени указывалось только в одной работе (Niebling et al., 1987), причем местоположение Pep LGG-B в этом исследовании в целом совпадает с нашим.

Вправо от Adh-2 и Adh-1 на карте первой группы локализуются гены Lap-2 и Aat-2 (рис. 1). Размещение Aat-1, Gpi, Dia-2 и Lap-2, Aat-2 по разные стороны от локусов, кодирующих алкогольдегидрогеназы, обусловлено тем, что между этими группами генов наблюдается независимое расщепление. Ранее на нескольких видах сосен уже показывалось, что Lap-2 и (или) Aat-2 сцеплены хотя бы с одним из выше рассмотренных локусов первой группы сцепления: Aat-1, Gpi, Dia-2, Рер-3, Adh-1, Adh-2 (Rudin, Ekberg, 1978; Adams, Joly, 1980; Conkle, 1981; Eckert et al., 1981; Strauss, Conkle, 1986; Niebling et al., 1987; Szmidt, Muona, 1989; Geburek et al., 1990).

В целом, установленное расположение 8 локусов I группы сцепления, совпадает с их локализацией, проведенной у Р. sylvestris скандинавскими (Rudin, Ekberg, 1978; Szmidt, Muona, 1989) и американскими исследователями (Niebling et al., 1987). В то же время, следует добавить, что в этих работах не проводился одновременный анализ Gpi и Aat-1. Кроме того, в отличии от нашей работы, у Ниеблинга с соавторами (Niebling et al., 1987) Dia-C (предположительно соответствует Dia-2 у нас) расположен на генетической карте влево от Pgi-B и является краевым маркером.

Вторую группу сцепления образовали локусы Lap-1 и Fl-Est (рис. 1). Величина генетического расстояния между ними оказалась равной 24,0 сМ (табл. 2),

что несколько меньше, чем установлено в работе Шмидта и Муоны (Szmidt, Muona, 1989) в скандинавских популяциях Р. sylvestris. Сцепление между Lap-1 и Fl-Est к настоящему времени подтверждено ещё для нескольких видов сосен, причем расстояние между этими двумя локусами составило у P. jeffreyi 25,6 сМ, Р. contorta 35,6 сМ, P. taeda 45,6 сМ (Conkle, 1981), P. attenuata 35,0 сМ (Strauss, Conkle, 1986).

В третью группу сцепления входят два локуса - Idh и Gdh (рис. 1). Анализ расщепления показал полное отсутствие рекомбинантов между ними (табл. 2). Ранее совместная локализация генов, кодирующих изоцитратдегидрогеназу и глутаматдегидрогеназу в одной группе сцепления, была определена только для двух видов сосен, причем у сосны скрученной они расположены на расстоянии 2,7 сМ друг от друга, а у сосны ладанной, как и в нашем случае, в одной точке генетической карты (Conkle, 1981).

Четвертая группа представлена близко расположенными локусами Mdh-3 и Pgm-2 (рис. 1). При анализе расщепления из 174 эндоспермов было выявлено только 2 рекомбинанта (табл. 2). Следует отметить, что тесное сцепление Mdh-3 и Pgm-2 было обнаружено также при исследовании сосны жесткой, у которой частота рекомбинантных гаплотипов составила 0,013 (O'Malley et al., 1986).

Таким образом, в результате исследования у сосны обыкновенной было картировано 14 локусов в 4-х группах сцепления (рис. 1). Общая длина генетической карты у этого вида составила 84,5 сМ при плотности 6,0 сМ на 1 локус.

Сосна горная

В природных популяциях Р. mugo полиморфизм был найден по 23 локусам. Из 253 возможных двулокусных комбинаций, которые образуют полиморфные гены у сосны горной, в нашем распоряжении оказалось только 169. Четырнадцать пар локусов показали достоверное сцепление между собой. Результаты анализа сцепления этих пар локусов приведены в таблице 3. В результате исследования у сосны горной было картировано 14 локусов в 4-х группах сцепления (рис. 1).

Линейное расположение генов в группах сцепления у Р. mugo в целом совпадает с локализацией соответствующих локусов у Р. sylvestris. В первую группу, как и у предыдущего вида, входят Aat-1, Gpi, Dia-2, Pep-3, Adh-1, Adh-2, Lap-2 и Aat-2. В отличие от сосны обыкновенной, у сосны горной отсутствуют рекомбинанты между Adh-1 и Adh-2 (табл. 3), поэтому взаиморасположение этих локусов дано условно (рис. 1). В нашем распоряжении имелось лишь одно дерево из 118 проанализированных, дигетерозиготное по пептидазе-3 и одному из локусов первой группы сцепления. Это дерево (ДВ-19/3) показало достоверное сцепление между Рер-3 и Dia-2 на расстоянии в 7,5 сМ (табл. 3). Локус Рер-3 помещен на генетической карте Р. mugo между Dia-2 и Adh-1 по аналогии с Р. sylvestris. Необходимо также отметить, что генетические карты первой, второй и четвертой групп сцепления у Р. mugo в целом оказались несколько длиннее, чем у Р. sylvestris, за счет увеличения генетического расстояния между некото-

Пары локусов Число эндоспермов Частота рекомбинации Ошибка частоты рекомб. х2 Расстояние в сМ

проана-лизир. рекомои-нантных

Aat-1 : Gpi 43 4 0,093 0,044 28,488

Gpi: Dia-2 43 7 0,163 0,056 19,558 16,9***

Gpi: Adh-1 51 14 0,275 0,062 10,373 30,8**

Gpi: Adh-2 67 21 0,313 0,057 9,328 36,8**

Dia-2: Pep-3 27 2 0,074 0,050 19,593 7,5***

Dia-2: Adh-1 75 13 0,173 0,044 32,013 18,1***

Dia-2: Adh-2 75 13 0,173 0,044 32,013 18,1***

Adh-1 : Adh-2 128 0 0,000 0,000 128,000 0,0***

Adh-1 : Lap-2 60 12 0,200 0,052 21,600 21,2***

Adh-2: Lap-2 70 21 0,300 0,055 11,200 34,7***

Lap-2: Aat-2 68 10 0,147 0,043 33,882 15,2***

Lap-1: Fl-Est 148 42 0,284 0,037 27,676 32,2***

Idh : Gdh 10 0 0,000 0,000 10,000 0,0**

Pgm-2: Mdh-3 37 1 0,027 0,027 33,108 2,7***

Уровни значимости: * 0,05; ** 0,01; *** 0,001. рыми локусами.

Таким образом, в результате исследования у сосны горной было картировано 14 локусов в 4-х группах сцепления (рис. 1). Общая длина генетической карты у сосны горной составила 115,7 сМ при плотности 8,3 сМ на 1 локус.

Сосна черная

В наших исследованиях у сосны черной два локуса - Idh и Acph оказались полностью мономорфными, а ряд других генов слабополиморфными. Поэтому из 231 возможной двулокусной комбинации, которые образуют 22 полиморфных гена, у P. nigra проанализированно 125. Четырнадцать пар локусов показали достоверное сцепление между собой. Результаты анализа сцепления этих пар локусов приведены в таблице 4. В результате исследования у сосны черной было выявлено три группы сцепления, в состав которых входит 12 генов.

У P. nigra в первой группе сцепления картировано 8 локусов (рис. 1). Линейное расположение генов в этой группе полностью совпадает с таковым у Р. sylvestris и Р. mugo, но между локусами Aat-1 и Gpi не найдено рекомбинантов (табл. 4), и на карте они располагаются совместно. Так же, не найдено рекомбинантов между генами Adh-1 и Adh-2 (табл. 4). При анализе сцепления локуса, кодирующего пептидазу-3, имелось в наличии лишь одно дерево (НК-1/3), кото-

Пары локусов Число эндоспермов Частота рекомбинации Ошибка частоты рекомб. х2 Расстояние в сМ

проана-лизир. рекомои-нантных

Aat-1: Gpi 28 0 0,000 0,000 20,000 о***

Aat-1: Adh-1 52 12 0,231 0,058 15,077 25,0***

Gpi: Dia-2 133 22 0,165 0,032 59,556 J7 2***

Gpi: Pep-3 67 12 0,179 0,469 27,597 18,7***

Gpi: Adh-1 235 63 0,268 0,029 50,557 29

Gpi: Adh-2 101 28 0,277 0,045 20,050 31,2***

Dia-2: Adh-1 213 37 0,174 0,026 90,709 18,1***

Dia-2 : Adh-2 80 14 0,175 0,043 33,800 18,3***

Pep-3 : Adh-1 67 7 0,104 0,037 41,925 10,6***

Adh-1: Adh-2 273 0 0,000 0,000 273,000 0,0***

Adh-1 : Lap-2 141 43 0,305 0,039 21,454 35,4***

Lap-2 : Aat-2 48 7 0,146 0,051 24,083 15,0***

Lap-1 : Fl-Est 34 8 0,235 0,073 9,529 25,5**

Pgm-2 : Mdh-3 98 2 0,020 0,014 90,163 2 0***

Уровни значимости: * 0,05; ** 0,01; *** 0,001.

рое оказалось тригетерозиготно по Gpi, Рер-3 и Adh-1. Анализ расщепления материала этого дерева позволил картировать Рер-3 между Gpi и Adh-1 на расстоянии 10,6 сМ от Adh-1.

Вторая и четвертая группы сцепления у P. nigra также совпадает с таковыми у описанных ранее Р. sylvestris и Р. mugo (рис. 1). К сожалению, в результате того, что все проанализированные деревья P. nigra оказались мономорфными по Idh, не удалось локализовать гены Gdh и Idh, которые по аналогии с предыдущими видами могли составить третью группу сцепления.

В целом, в результате исследования у сосны черной картировано 12 локусов в 3-х группах сцепления (рис. 1). Общая длина генетической карты у этого вида составила 113,2 сМ при плотности 9,4 сМ на 1 локус.

Сосна брутская

При исследовании популяций P. brutia из 24 локусов ровно половина оказались полностью мономорфными. Из 66 возможных двулокусных комбинаций, которые образуют 12 полиморфных генов у Р. brutia проанализировано 49. Из них пять пар локусов показали достоверное сцепление между собой (табл. 5). Это позволило картировать четыре гена Gpi, Adh-1, Adh-2 и Aat-2, которые локализуются в первой группе сцепления, как и у других изученных в данной ра-

Пары локусов Число эндоспермов Частота рекомбинации Ошибка частоты рекомб. х2 Расстояние в сМ

проана-лизир. рекомои-нантных

Gpi: Adh-1 162 27 0,167 0,029 72,000 17,3***

Gpi: Adh-2 99 14 0,141 0,035 50,919 14,5***

Adh-1 : Adh-2 181 0 0,000 0,000 181,000 q#**

Adh-1: Aat-2 178 64 0,360 0,036 14,045 45,3***

Adh-2: Aat-2 191 64 0,335 0,034 20,780 40,6***

Уровни значимости: * 0,05; ** 0,01; *** 0,001.

боте видов (рис. 1).

В результате исследования у сосны брутской картировано 4 гена в одной группе сцепления. Длина генетической карты у этого вида составила 55,1 сМ при плотности 13,8 сМ на 1 локус.

Несцепленные гены и возможности дальнейшего картирования аллозимных локусов у сосен

Ранее ряд авторов при изучении сосен установили сцепление и некоторых других локусов, использующихся в нашей работе. Так, Ниеблингу с соавторами (Niebling et al., 1987) в исследовании по Р. sylvestris удалось локализовать два гена, кодирующих малатдегидрогеназы Mdh-A и Mdh-C (соответствующие нашим Mdh-1 и Mdh-З). У этих авторов Mdh-C включен в группу сцепления с Lap-A (соответствует Lap-1 у нас), a Mdh-A, в одну группу с б-Pgd-A и Got-C (соответствуют нашим 6-Pgd-l и Aat-3). Однако, попытки выявить связь между всеми этими генами в нашей работе не увенчались успехом, так как не было обнаружено четкого сцепления ни по одной паре локусов. Более того, как было показано выше, Lap-1 локализуется в группе II вместе с Fl-Est, а Mdh-З в группе IV совместно с Pgm-2 (рис. 1).

В литературе имеется сообщение о тесном сцеплении генов 6-Pgd-B и Pgi-B у Р. leucodermis (Morgante et al., 1993). Специальные исследования, проведенные на всех четырех видах сосен, не выявили сцепления между этими локусами ни у одного вида (64,8 - 81,5 сМ).

Конкл для Р. jeffreyi указывает на сцепление локусов Idh и Асо с расстоянием 2,8 сМ (Conkle, 1981). В нашем распоряжении не было деревьев дигетеро-зиготных по Idh и Асо ни по одному из исследованных видов, но было проведено для сосны обыкновенной исследование сцепления Асо с Gdh, локусом, который тесно сцеплен с Idh. Анализ двух таких дигетерозиготных деревьев показал

отсутствие сцепления между Асо и Gdh (72,3 сМ).

Не удалось подтвердить сцепление и ряда других пар локусов, указанных в литературе как сцепленные у некоторых видов сосен. Например, пары Mdh-2/ Adh-1 (соответствуют нашим Mdh-3/Adh-l), которая показана для Р. ponderosa (O'Malley et al., 1979) или Mdh-3/Pgm-l, найденной у Р. rígida (O'Malley et al., 1986).

Необходимо подчеркнуть, что в настоящее время картирована только часть использующихся исследователями аллозимных локусов. И в этом смысле возможности генов, кодирующих изоферменты еще не исчерпаны. Перспективна также совместная локализация аллозимных генов и ДНК-х маркеров. Используя широкий набор RFLP-маркеров и ряд аллозимных локусов Девэй с соавторами построил генетическую карту для P. taeda покрывающую более 600 сМ (Devey et al., 1994). В последнее время все чаще для генетического картирования используют RAPD-маркеры, что позволило еще более расширить генетические карты сосен (Nelson et al., 1994; Plomion et al., 1995a,b; Yazdani et al., 1995; Kubisiak et al., 1996).

Тем не менее, несмотря на широкое использование прямых ДНК-х маркеров, таких как RFLP и RAPD, дальнейшее картирование аллозимных генов, которые отражают структурную часть генома сосен, по-прежнему остается актуальным, поскольку информации о других структурных генах у хвойных практически нет.

Структурно-функциональная организация генетического материала у восточноевропейских сосен

В связи с имеющимися в литературе данными о том, что функционально родственные гены могут быть сцеплены между собой и в ряде случаев образовывать кластеры, в данном исследовании специальное внимание было уделено сложным ген-ферментным системам, у которых синтез фермента контролируется несколькими неаллельными структурными генами. Таких ген-ферментных систем при анализе локализации аллозимных генов у восточноевропейских сосен использовалось несколько, это ААТ, ADH, LAP, MDH, PGM, DIA и 6-PGD.

Аспартатаминотрансфераза. Данный димерный фермент, являющийся важнейшим звеном, связующим обмен аминокислот с обменом углеводов (Малер, Кордес, 1970), кодируется тремя структурными генами (Aat-1, Aat-2 и Aat-3) и проявляется на геле в виде трех четких зон активности. Как было показано выше, два локуса этой ген-ферментной системы (Aat-1 и Aat-2) локализованы у изученных сосен в первой группе сцепления. Однако, несмотря на нахождение в одной группе, они расположены на расстоянии 59,4 - 85,7 сМ (в зависимости от вида) и не образуют тесного кластера. Третий локус этой системы (Aat-3) не показал достоверного сцепления ни с одним из изученных 24 генов и локализован отдельно в неиндентифицированной группе сцепления.

Алкогольлегиярогеназа. Контролируется алкогольдегидрогеназа двумя ге-

нами (Ас1Ь-1 и АсШ-2). Как видно из рисунка 1 оба эти локуса картированы в первой группе сцепления у всех проанализированных сосен, причем они образуют настолько тесный кластер, что между ними почти полностью отсутствуют рекомбинанты.

Лейпинаминопептилаза. Этот фермент, имеющий, в отличие от предыдущих, мономерную структуру, кодируется у сосен двумя генами. Как установлено в процессе исследования, оба гена, контролирующие синтез лейцинаминопепти-дазы, не только не сцеплены между собой, но и достоверно локализованы в разных группах сцепления. Один (Ьар-2) входит в состав первой группы, а другой (Ьар-1), совместно с геном, кодирующим флюоресцентную эстеразу, образует вторую группу сцепления (рис. 1).

Малатлегилрогеназа. Данный фермент, ответственный за перевод Ь-малата в оксалоацетат в цикле Кребса и глиоксилатном цикле (Малер, Кордес, 1970), является одним из наиболее сложных при интерпретации спектра электрофоре-тической активности. Малатдегидрогеназа, как было показано ранее (Соп-сИагепко с! а1., 1995), контролируется у сосен четырьмя неаллельными структурными генами. При этом, если МёЬ-1 и Мс1Ь-4 на геле, в процессе гистохимического выявления, имеют хорошо различающиеся особенности, то МсШ-2 и МсШ-З, возникшие, по-видимому, в результате тандемной дупликации относительно недавно, настолько сходны между собой, что гибридизуются в цитоплазме с образованием межлокусного гетеродимера, проявляющегося на геле в виде дополнительной фракции (рис. 2). В связи с вышеизложенным, ожидалось, что гены МсШ-2 и М(1Ь-3 тесно сцеплены и образуют кластер в одной группе сцепления. Однако проведенные исследования показали отсутствие какого-либо сцепления между этими локусами у изученных видов сосен. Ген МсШ-З локализован в четвертой группе сцепления совместно с Р§щ-2, а МсШ-2 оказался не сцепленным ни с одним из исследованных нами локусов. Остальные локусы, кодирующие малатдегидрагеназу, также дисперсно распределены по геному сосен.

Фосфоглюкомутаза. диафораза и 6-фосфоглюконатлегидрогеназа. Все три фермента кодируются двумя генами каждый, которые при анализе не показали попарного сцепления, и структурно не связаны.

MDH-1|$ = MDH-2 i,oo —

гетеродимер

1,00

MDH-3 0,95 0,70

MDH-4 i,oo

Рис. 2. Электрофореграмма малатдепщрогеназы из эндоспермов Pinns sylvestris

Таким образом, проведенное исследование выявило, что распределение функционально родственных локусов в генетическом материале восточноевропейских сосен носит дисперсно-кластерный характер.

Необходимо также отметить, что картированная часть генома у исследованных нами видов уже сейчас дает возможность провести сравнительный анализ организации генетического материала сосен Восточной Европы. На рисунке 1 хорошо видно, что у всех четырех видов сосен порядок и расположение гомологичных генов в исследованных группах сцепления полностью совпадают. Полученные данные указывают на то, что в ходе независимой эволюции видов рода Pinus, в течение нескольких миллионов лет (Бобров, 1978; Козубов, Муратова, 1986), не произошло каких-либо крупных инверсий, транслокаций и других существенных хромосомных перестроек, по крайней мере в пределах проанализированных генных блоков и между ними.

Сохранение линейного порядка генов в изученных группах сцепления, на примере сосен Восточной Европы, еще раз подтверждает данные цитологического и генетического анализа (Pederick, 1970; Saylor, 1972; Conkle, 1981) о консервативности организации генетического материала у сосен.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе проведен анализ сцепления 24 ашгозимных генов у четырех видов восточноевропейских сосен и представлены результаты их картирования.

В ходе исследования точно картировано 14 генов в 4-х группах сцепления у Р. sylvestris. У этого вида уточнена локализация в первой группе сцепления локусов Dia-2 и Рер-3, впервые проведена совместная локализация генов Aat-1 и Gpi и построены третья и четвертая группы сцепления, ранее никем для этого вида не отмечавшиеся. Также впервые картировано 14 генов в 4-х группах сцепления у Р. mugo, 12 генов в 3-х группах у P. nigra и 4 гена в одной группе у Р. brutia (Гончаренко, Падутов, 1996, 1997; Гончаренко и др., 1996; Падутов, Гончаренко, 1997; Goncharenko et al., 1998а,b)

Общая длина построенных генетических карт составляет: для сосны обыкновенной - 84,5 сМ при плотности 6,0 сМ на 1 локус; для сосны горной - 115,7 сМ при плотности 8,3 сМ на 1 локус; для сосны черной -113,2 сМ при плотности 9,4 сМ на 1 локус; для сосны брутской - 55,1 сМ при плотности 13,8 сМ на 1 локус.

Полученные данные по локализации аллозимных генов однозначно свидетельствуют о том, что распределение функционально родственных локусов в генетическом материале восточноевропейских сосен имеет дисперсно-кластерный характер (Падутов, Гончаренко, 1997; Гончаренко и др., 1998; Goncharenko et al., 1998а). Неаллельные структурные гены, контролирующие синтез фермента со сложной ген-детерминацией могут образовывать тесные кластеры (Adh-1, Adh-2), находиться в одной группе сцепления, но на значи-

тельном расстоянии друг от друга (Aat-1, Aat-2), или быть распределены по разным группам сцепления (Lap-1, Lap-2).

Подводя итог, необходимо отметить, что картированная часть генома у исследованных нами видов уже сейчас дает возможность провести сравнительный анализ организации генетического материала сосен Восточной Европы. Порядок и расположение гомологичных генов в исследованных группах сцепления у всех четырех видов сосен полностью совпадают. Это указывает на то, что в ходе независимой эволюции видов рода Pinus не произошло каких-либо существенных хромосомных перестроек, по крайней мере в пределах проанализированных генных блоков и между ними (Гончаренко, Падутов, 1996, 1997; Гончаренко и др., 1996; Goncharenko et al., 1998а,b).

Сохранение линейного порядка генов в изученных нами группах сцепления, на примере сосен Восточной Европы, еще раз подтверждает данные цитологического и генетического анализа о консервативности организации генетического материала у сосен.

Выводы

1. Используя метод электрофореза изоферментов, проанализировано более 1400 деревьев четырех видов двухвойных сосен Восточной Европы (сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), сосны горной (Р. mugo Turra), сосны черной (Р. nigra Arn.) и сосны брутской (P. brutia Ten.)) из различных частей ареала, для выявления всей изменчивости данных видов. У каждого дерева определен его многолокусный генотип по 24 генам.

2. При изучении попарного сцепления аллозимных генов проведен анализ 575 двулокусных комбинаций у всех четырех видов восточноевропейских сосен и определены для каждого вида локусы, показавшие тенденцию к сцеплению.

3. В результате исследования проведено точное генетическое картирование локусов Aat-1, Aat-2, Dia-2, Gpi, Pep-3, Adh-1, Adh-2, Lap-1, Lap-2, Fl-Est, Pgm-2, Mdh-З, Idh и Gdh, и установлено, что 14 генов у сосны обыкновенной, 14 генов у сосны горной , 12 генов у сосны черной и 4 гена у сосны брутской локализованы в 4-х группах сцепления.

4. Анализ полученных материалов показал, что десять локусов (Aat-3, Dia-1, Mdh-1, Mdh-2, Mdh-4, Pgm-1, 6-Pgd-l, 6-Pgd-2, Acph и Асо) не сцеплены ни между собой, ни с локализованными генами и распределены по остальным 8 группам сцепления на значительном расстоянии друг от друга.

5. В ходе картирования генов установлено, что структурно-функциональная организация генетического материала в группах сцепления у восточноевропейских сосен носит дисперсно-кластерный характер.

6. Выявлено, что состав групп и расположение гомологичных локусов совпадает у всех изученных видов. Сохранение линейного порядка генов в группах сцепления свидетельствует о консервативности организации генетического материала, по крайней мере в пределах двухвойных сосен Восточной Европы.

Статьи

1. Гончаренко Г. Г., Падутов А. Е., Хотылева Л. В. Построение генетических карт для четырех видов сосен, формирующих леса Восточной Европы// Доклады АНБ. - 1996. - Т. 40. - № 5. - С. 78-83.

2. Падутов А. Е., Гончаренко Г. Г. Картирование аллозимных генов у основных лесообразующих и хозяйственно-важных хвойных растений Беларуси// Проблемы лесоведения и лесоводства. - 1997. - Вып. 45. - С. 92-107.

3. Goncharenko G. G., Silin А. Е., Padutov А. Е., Padutov V. Е. Genetic resources of pine, spruce and fir species of the former Soviet Union: analysis of their gene pools, phylogenetic relationships and genome organization// Proc. IPGRI Workshop "Sustainable Forest Genetic Resources Programmes in the Independent States of the Former USSR", September 1996, Belovezhskaja puscha. - Rome, Arbora Publisher. - 1998. - P. 3-19.

4. Goncharenko G. G., Padutov A. E., Khotyljova L.V. Genetic mapping of allo-zyme loci in four two-needle pine species of Europe// Forest Genetics. - 1998. -Vol. 5. - N. 2 - P. 76-93.

5. Гончаренко Г. Г., Падутов А. Е., Падутов В. Е., Силин А. Е., Болсун С. И. Молекулярно-генетические маркеры, как инструмент анализа структурно-функциональной организации наследственного материала в условиях радиационного поражения// Молекулярная генетика и биотехнология: Материалы Меж-дун. конф. - Минск, 1998. - С. 27-28.

Тезисы докладов

6. Гончаренко Г. Г., Падутов А. Е. Построение генетических карт у некоторых сосен Евразии// Генетика и селекция - на службе лесу: Тез. докл. Междун. научн.-практ. конф. - Воронеж, 1996. - С. 5.

7. Гончаренко Г. Г., Падутов А. Е. Генетическое картирование у ряда основных лесообразующих хвойных Восточной Европы: Тез. докл. VII съезда БО-ГиС. - Горки, 1997. - С. 28-29.

РЭЗЮМЭ

Падутау Аляксандр Яугенав1ч

Генетычнае картыраванне алаз1мных локусау у чатырох ßiaay сосен, фарм1руючых лясы Усходняй Еуропы.

Ключавые словы: генетычныя карты, счапленне генау, 1заферменты, Pinus sylvestris L., Р. mugo Turra, Р. nigra Am., Р. brutia Ten.

Метадам электрафарэтычнага анал1за ¿заферментау у крухмальным гел1 вывучалась счапленне i лакал1зацыя 24 алаз1мных локусау у чатырох вщау двухвойных сосен Усходняй Еуропы: сасны звычайнай (Pinus sylvestris L.), сасны горнай (Р. mugo Turra), сасны чорнай (Р. nigra Arn.) i сасны бруцкай (Р. brutia Теп.).

У ходзе даследванняу вызначаны шматлокусныя генатыпы (па 24 генах) кожнага з 1429 дрэу чатырох вщау двухвойных сосен i3 розных частак арэалау для выяулення усей змешпвасш дадзеных в1дау. Пры вывучэнш папарнага счаплення алаз1мных генау праанал1завана, у цэлым, 575 двулокусных камбшацый.

Праведзена дакладнае генетычнае картыраванне локусау Aat-1, Aat-2, Dia-2, Gpi, Pep-3, Adh-1, Adh-2, Lap-1, Lap-2, Fl-Est, Pgm-2, Mdh-3, Idh i Gdh, i вызначана, што гэтыя гены у вывучаных вщау лакал!заваны у 4-х групах счаплення з 12-ui магчымых. Упершыню пабудаваны генетычныя карты, змяшчаючыя 14 алаз1мных локусау у чатырох групах счаплення у сасны горнай, 12 генау у трох групах счаплення у сасны чорнай i чатыры гены у адной групе счаплення у сасны бруцкай. Значна разшырана генетычная карта сасны звычайнай, у якой праведзена сумесная лакалгзацыя генау Aat-1 i Gpi, удакладнена лакал1зацыя генау Dia-2 i Рер-3, картыравана 8 локусау у першай групе счаплення i чатыры гены у двух новых групах счаплення. Дзесяць локусау (Aat-3, Dia-1, Mdh-1, Mdh-2, Mdh-4, Pgm-1, 6-Pgd-l, 6-Pgd-2, Acph i Асо) не паказаш счаплення Hi памЬк сабой, Hi з лакал1заваным1 генам1 i размешчаны па астатшм 8 групам счаплення на значнай адлегласщ адзш ад другога.

У вытку картыравання генау устаноулена, што структурна-функцыянальная арган1зацыя генетычнага матэрыяла у групах счаплення усходнееурапейск1х сосен мае дысперсна-кластэрны характар.

Вызначана, што склад груп i размяшчэнне гамалапчных локусау супадае ва ycix вывучаных в!дау. Захаванне лшейнага парадку генау у групах счаплення сведчыць аб кансерватыунасщ арган1зацьп генетычнага матэрыяла, ва усяляюм выпадку у межах двухвойных сосен Усходняй Еуропы.

Падутов Александр Евгеньевич

Генетическое картирование аллозимных локусов у четырех видов сосен, формирующих леса Восточной Европы

Ключевые слова: генетические карты, сцепление генов, изоферменты, Pinus sylvestris L., Р. mugo Turra, P. nigra Arn., P. brutia Ten.

Методом электрофоретического анализа изоферментов в крахмальном геле изучалось сцепление и локализация 24 аллозимных локусов у четырех видов двухвойных сосен Восточной Европы: сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), сосны горной (Р. mugo Turra), сосны черной (Р. nigra Arn.) и сосны брутской (Р. brutia Ten.).

В ходе исследования определены многолокусные генотипы (по 24 генам) каждого из 1429 деревьев четырех видов двухвойных сосен из различных частей ареалов, для выявления всей изменчивости данных видов. При изучении попарного сцепления аллозимных генов проанализировано, в целом, 575 двулокусных комбинаций.

Проведено точное генетическое картирование локусов Aat-1, Aat-2, Dia-2, Gpi, Pep-3, Adh-1, Adh-2, Lap-1, Lap-2, Fl-Est, Pgm-2, Mdh-3, Idh и Gdh, и установлено, что эти гены у изученных видов локализованы в 4-х группах сцепления из 12-ти. Впервые построены генетические карты, включающие 14 аллозимных локусов в четырех группах сцепления у сосны горной, 12 генов в трех группах у сосны черной и четыре гена в одной группе сцепления у сосны брутской. Существенно расширена генетическая карта сосны обыкновенной, у которой проведена совместная локализация генов Aat-1 и Gpi, уточнена локализация генов Dia-2 и Рер-3, картировано 8 локусов в первой группе сцепления и четыре гена в двух новых группах сцепления. Десять локусов (Aat-3, Dia-1, Mdh-1, Mdh-2, Mdh-4, Pgm-1, 6-Pgd-l, 6-Pgd-2, Acph и Асо) не показали сцепления ни между собой, ни с локализованными генами и распределены по остальным 8 группам сцепления на значительном расстоянии друг от друга.

В результате картирования генов установлено, что структурно-функциональная организация генетического материала в группах сцепления у восточноевропейских сосен носит дисперсно-кластерный характер.

Выявлено, что состав групп и расположение гомологичных локусов совпадает у всех изученных видов. Сохранение линейного порядка генов в группах сцепления свидетельствует о консервативности организации генетического материала, по крайней мере в пределах двухвойных сосен Восточной Европы.

Genetic mapping of allozyme loci in four East European forest forming pine species

Key words: genetic maps, linkage, isozymes, Pinus sylvestris L., P. mugo Turra, P. nigra Arn., P. brutia Ten.

Linkages among 24 allozyme loci and their locations in the linkage groups in four two-needle pine species of Eastern Europe, Pinus sylvestris L., P. mugo Turra, P. nigra Arn. and P. brutia Ten., were determined by starch-gel electrophoresis.

To reveal levels of genetic variation in the above species, we determined a mul-tilocus genotype of each of the 1429 trees sampled from different segments of distributions of these two-needle pines on the basis of analysis of 24 genes.

In studies of linkage among the allozyme genes, on the whole, 575 two-locus combinations were analyzed.

The Aat-1', Aat-2, Dia-2, Gpi, Pep-3, Adh-1, Adh-2, Lap-1, Lap-2, Fl-Est, Pgm-2, Mdh-3, Idh and Gdh loci were mapped and four linkage groups of twelve were revealed. For the first time 14 allozyme loci were mapped in four linkage groups in P. mugo, 12 allozyme loci were mapped in three linkage groups in P. nigra and 4 loci were mapped into one group in P. brutia. The genetic map was markedly expanded for P. sylvestris in which Aat-1 was mapped together with Gpi into one group, locations of Dia-2 and Pep-3 were refined, 8 loci were mapped in the first linkage group and 4 loci were mapped in two new linkage groups. Ten loci (Aat-3, Dia-1, Mdh-1, Mdh-2, Mdh-4, Pgm-1, 6-Pgd-l, 6-Pgd-2, Acph and Aco) were linked with neither each other no the genes localized and were arranged in the remaining 8 linkage groups at a considerable distance from each other.

The results of gene mapping show that the structural and functional arrangement of genes in linkage groups in East European pine is of the disperse and cluster nature.

It is revealed that the order and locations of homologous genes in the linkage groups in different species are similar. The linear order of genes in the linkage groups indicate that the gene arrangement is conservative, at least within the two-needle pine species occurring in Eastern Europe.

Ih' \

Автореферат

Падутов А. Е. Генетическое картирование аллозимных локусов у четырех видов сосен, формирующих леса Восточной Европы

Подписано к печати 10. 04. 1998 г.

Формат бумаги 60 х 84 1/16 Бумага писчая N 1. Печ. л. 11,5 Зак. N466. Тираж 100 экз.

Отпечатано: г. Гомель, Институт леса HAH Беларуси, 246654, ул. Пролетарская, 71