Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гемоглобин как индикатор реакционной способности доноров NO и редуктаза в модельных NO-генерирующих системах in vitro

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гемоглобин как индикатор реакционной способности доноров NO и редуктаза в модельных NO-генерирующих системах in vitro"

На правах рукописи

ЧУДИНОВА Екатерина Сергеевна

Гемоглобин как индикатор реакционной способности доноров NO и редуктаза в модельных NO-генерирующих системах in vitro

03 00 04 - биохимия ОО'-З

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2007

003175976

Работа выполнена в лаборатории химической физики ферментов отдела кинетики химических и биологических процессов Института проблем химической физики РАН, г Черноголовка, Московская обл

Научный руководитель доктор химических наук

Л А Сырцова

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор

Н Н Угарова

доктор биологических наук А Ф Топунов

Ведущая организация Институт физиологически активных веществ

РАН, г Черноголовка, Московская обл

Защита состоится ноября 2007 г в Ц 00 часов на заседании

диссертационного совета К 002 247 01 при Институте биохимии им Баха А Н по адресу 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 2, конференц-зал

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу 119071, Ленинский проспект, дом 33, строение 1

Автореферат разослан

/6 октября 2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совета К 002 247 01 кандидат биологических наук '' Г А Ф Орловский

© Чудинова Е С , 2007 г © Институт проблем химической физики РАН, 2007 г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Известно, что монооксид азота (N0) является уникальным биологическим регулятором В первую очередь его функции связаны с регуляцией тонуса кровеносных сосудов Определяющей стадией механизма действия N0 в этом процессе является координация с гемом гуанилатциклазы Основная форма хранения монооксида азота в организме - нитрит-ион (N02") Нитритредуктазная активность гемоглобина делает его самым распространенным восстановителем нитрита в организме (животных и человека) Метаболизм N0 также в значительной мере связан с образованием нитрозилированного по железу комплекса №N0

Понимание биохимии монооксида азота позволит прояснить механизмы действия различных лекарственных средств и облегчит возросший в последние годы поиск новых эффективных кардиопрепаратов

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института проблем химической физики РАН при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 06-03-32381а), Программы фундаментальных исследований ОХНМ РАН «Биомолекулярная и медицинская химия» и Программы Президента РФ по поддержке Ведущих научных школ (грант НШ-4525 2006 3)

Цели и задачи работы

Основной целью данной работы было исследование возможности участия гемоглобина в восстановлении органических нитратов в условиях, близких к физиологическим, а также изучение возможности его использования как индикатора реакционной способности ТчЮ-доноров Для этого было необходимо разработать методику исследования кинетики образования N0, которая была бы универсальной для всех изучаемых соединений Работа проводилась с двумя классами ЫО-доноров, для которых осуществлялось

1 изучение условий, в которых генерируется монооксид азота,

2 исследование кинетики образования N0, расчет констант скоростей элементарных стадий,

3 сравнение эффективности МО-донирования изучаемыми соединениями В связи с этим были поставлены следующие задачи

1 Разработать универсальную методику изучения кинетики образования монооксида азота

2 Исследовать ЫО-донорную способность новых железосерных нитрозиль-ных комплексов в протонных средах

3 Изучить кинетику образования нитрит-иона в системе «органический нитрат - цистеин (Суз)» и разработать метод оценки потенциальной вазодилататор-ной активности органических нитратов

4 Исследовать возможность участия гемоглобина в восстановлении органических нитратов в присутствии тиолов Определить константы всех изучаемых реакций

Научная новизна

Разработана оригинальная методика исследования кинетики реакций, протекающих с образованием монооксида азота Методика реализована с применением численных методов декомпозиции суммарных спектров поглощения НЬ и НЬЫО на индивидуальные составляющие Разработанная методика была проверена на новых соединениях различных классов 1ЧО-доноров, способных выделять N0 самопроизвольно Более того, с ее помощью удалось не только определить константы выделения N0, сравнив их с константами известных представителей данного класса, но и показать, что процесс выделения N0 может быть ассоциативным Показано, что гемоглобин при больших концентрациях может влиять на процесс ЫО-донирования этими комплексами, стабилизируя их Для ИО-доноров, принадлежащих к классу органических нитратов, изучена тройная система «нитрат-цистеин-гемоглобин» на примере 3,3-бис(нитроксиметил)оксетана (ЫМО) Обнаружено взаимодействие гемоглобина с интермедиатом реакции цистеина и органического нитрата - тионитратом цис-теина Это взаимодействие приводит к образованию монооксида азота, что имеет большое значение для метаболизма органических нитратов

Научно-практическая значимость исследования

Разработанная методика может выступать в роли универсального инструмента в биохимии монооксида азота Это позволит оценивать потенциальную вазодилататорную активность новых синтезированных препаратов еще на ранних стадиях исследований Большой интерес полученные результаты представ-

ляют для исследователей, занимающихся вопросами биохимии монооксида азота, биотрансформации органических нитратов и проблемами толерантности

Личный вклад автора

Автором была разработана и успешно применена в исследованиях методика регистрации кинетики образования монооксида азота Также в работе представлены результаты исследований, выполненных лично автором по ряду научно-исследовательских проектов, связанных с изучением различных классов NO-доноров Автор непосредственно участвовал в обосновании и постановке основной части экспериментов, в их проведении и в обобщении результатов исследований Математическое моделирование и расчет констант реакций в системе «NMO-Cys-НЬ» проведены к ф -м н Психой Б Л

Положения, выносимые на защиту

1 Методика изучения кинетики реакций, протекающих с образованием монооксида азота, реализованная с применением численных методов декомпозиции суммарных спектров НЬ и HbNO на составляющие

2 Гемоглобин как индикатор безактивационного выделения N0 железо-нитрозильными комплексами в протонных средах

3 Редуктазная активность гемоглобина, проявляющаяся в отношении ин-термедиата реакции взаимодействия цистеина с органическим нитратом

Апробация работы

Результаты исследований докладывались и обсуждались на Всероссийских и Международных симпозиумах и конференциях Всероссийский симпозиум «Современная химическая физика» (Туапсе, 2004 и 2006), Международная конференция «Биотехнологии состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), Национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005), Международная школа-конференция «Юность Наука Культура - Физхимия» (Обнинск, 2005), Всероссийская конференция-школа «Высокореакционные интермедиаты химических реакций» (Юность, 2006), Международная конференция им Воеводского В В «Physics and chemistry of elementary chemical processes» (Черноголовка, 2007), а также на научных семинарах и конкурсах научных работ в ИПХФ РАН

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в рецензируемых российских и международных журналах и 9 тезисов докладов

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 106-ти страницах, включает введение, литературный обзор, экспериментальную часть, результаты и обсуждения, выводы и список использованной литературы (121 наименование) В качестве иллюстраций использовано 22 рисунка, 6 таблиц и 8 схем

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Во введении обоснованы выбор и актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цели и задачи исследований, показана их научная новизна и практическая значимость

Глава 1 Обзор литературы

Литературный обзор состоит из трех частей Первая часть посвящена монооксиду азота Описаны пути биосинтеза N0, его биологические эффекты Рассмотрены основные методы детектирования монооксида азота, их преимущества и недостатки Рассмотрены классы доноров N0

Вторая часть посвящена органическим нитратам - самым известным ва-зодилататорам Рассмотрены возможные пути биотрансформации органических нитратов в результате взаимодействия с тиолами и под действием фермента ми-тохондриальной альдегиддегидрогеназы (гг^АЬБН), КФ 12 13 Затронута проблема толерантности

В третьей части идет речь о гемоглобине и его ферментативных свойствах Подробно рассмотрено взаимодействие гемоглобина с тринитроглицерином (СШ) Особое внимание уделено конформационным состояниям белка и их роли в функционировании гемоглобина как нитритредуктазы Изложены представления о возникшей в последнее десятилетие гипотезе, что гемоглобин в составе эритроцитов может являться одним из важнейших элементов системы биологической трансформации доноров N0 и транспортировки монооксида азота внутри организма

Материалы

В этой главе представлена экспериментальная часть исследований Описаны материалы, используемые в работе, гемоглобин выделяли из донорской крови человека по известной методике Все эксперименты проводились в атмосфере азота, для того, чтобы избежать окисления NO и оксигенации НЬ кислородом воздуха Подробно описаны техника работы в атмосфере азота и методика получения раствора дезоксигемоглобина Описаны методики изучения кинетики исследуемых реакций Для регистрации спектров поглощения использовали спектрофотометр «Specord М-40» (Cari Zeiss, Иена, Германия), снабженный компьютерным интерфейсом для численной регистрации спектров

Глава 3 Гемоглобин как индикатор реакционной способности доноров N0 Эта глава состоит из двух частей, в которых описаны соответственно (I) разработка методики детектирования образования N0 с помощью НЬ и (2) использование этой методики для изучения кинетики образования монооксида азота из железонитрозильных комплексов в протонных средах

Разработка методики определения монооксида азота Известно, что НЬ при взаимодействии с N0 образует комплекс HbNO При этом образующийся продукт имеет характерный спектр поглощения Пик поглощения Hb (X^* = 556 нм, с = 12 5 ммоль'1 л см"1) при образовании HbNO

расщепляется на два А.тах = 545 нм (е = 12 6 ммоль*1 л см"1) и А.тах = 575 нм (е = 13 0 ммоль"1 л см'1), в расчете на один гем для НЬ человека Поэтому НЬ в данной работе был использован для регистрации кинетики образования NO по накоплению HbNO На рисунке 1 приведены спектры НЬ и HbNO

Известно, что константа равновесия реакции комплексообразо-ченных экспериментально [Hb] = [HbNO] вания NO с темами НЬ имеет вели-= 4 7 10 M чину 3 Ю!0 моль'1 л Это позволяет

использовать НЬ в качестве «ловушки» NO

А (отн ед)

Рис. 1. Вид спектров НЬ и HbNO, полу-

Как видно и;) рисунка 1, в процессе преобразован и я НЬ В НоКО происходит перекрывание спектров. В связи с этим концентрацию НЬГчО оценивай*! путем декомпозиции экспериментальных спектров поглощения на составляющие (ПЬ и НЬЖ)). используя метол наименьших квадратов. Расчет проводился в диапазоне длил волн 450-650 нм но двумстам экспериментальным точкам. При наличии в реакционной системе теШЬ (о нём свидетельствует поглощения при ?.|1Ш # 63 1 им) подобным образом проводили декомпозицию спектра на три составляющих.

Спектрофотометричеекий метод с использованием гемоглобина для определения N0 является более универсальным по сравнению с основными (электрохимический. метод электронного парамагнитного резонанса, хемилгоминес-центньш) методами, применяемыми для этой цели. Достоинствами спектрофо-тометрического метала являются высокая селективность и чувствительность: возможность проведения дли тельных кинетических измерений.

Помимо всего перечисленного, выбор НЬ для анализа эффективности допоров МО представляет также и научный интерес, поскольку метаболизм МО в организме в значительной мере связан с образованием митрозклированпого по железу комплекса НЬ в эритроцитах.

Использование гемоглобина а качестве индикатора NO-донорнон способности железоинтри.тлышх комплексов в нротонных средах.

Разработанную методику интересно было иснытать и исследованиях с такими NO-донорами, которые самостоятельно выделяют N0 без использования дополнительных, активаторов. Такими соединениями являются, например, желе-зов итрозильные комплексы, Ряд соединений этого класса был синтезирован соЛ («си. сд)

о

Рне. 2. Изменение разностных спектров поглощения во времени при взаимодействии комплекса 4 (2- Í0"4 моль-л"5} е ПЬ (7.5-J0"c' моль-л"'1!. Время регистрации ti минутах - Зфужка.ми отмечены изо-бестические точки. Условия - растворитель 0.05 М фосфатный буфер рН 7.0, содержащий 3,5 % DMSO. температура 25 °С.

«л

¡U

0.2

ил

45(1

М)

550

600

трудниками лаборатории С M Алдошина (ИПХФ РАН) и любезно представлен нам для работы Дня исследования кинетики образования N0, генерируемого железонитрозильными комплексами (1-7) (Таблицы 1 и 2), регистрировали изменение спектров по!лощения реакционных систем, содержащих НЬ и изучаемый комплекс (рис 2) Поскольку все сера-нитрозильные комплексы железа поглощают в видимой области, регистрировали разностные спектры поглощения буфера и опытной системы с гемоглобином, содержавших соответствующий комплекс в одинаковой концентрации Компьютерная регистрация спектров и обработка полученных данных проводилась, как описано выше

На рисунке 2 приведены изменения разностных спектров поглощения во времени при взаимодействии НЬ с комплексом 4 В аналогичных условиях было исследовано взаимодействие комплексов 1-3, 5-7 с НЬ При этом во всех случаях наблюдалось уменьшение оптической плотности в области максимума спектра поглощения НЬ при 556 нм и нарастание при 545 и 575 нм, что свидетельствует об образовании комплекса HbNO Регистрацию заканчивали после того, как спектр переставал меняться Данные по кинетике образования HbNO для комплекса 4 приведены на рисунке 3

[HbNOf, мкмочь i

ft VHUI

Рис 3. Кинетика образования НЬМО при взаимодействии комплекса 4 (2 10"4 моль л"1) с НЬ (7 5 10 6 моль л ') по данным опыта, приведенного на рисунке 2 Сплошная линия - теоретическая кривая Описывается уравнением вида ;(г) = о(1 -е ") и соответствует указанным экспериментальным точкам, к = (6 6 ± 0 7) 10"3 с '

Оказалось, все кинетические зависимости, полученные для 1-7 хорошо описываются в рамках формализма реакций первого порядка

Изучаемый процесс можно описать двумя последовательными реакциями - распад железонитрозильного комплекса с выделением N0 и образование НЫЧО

ко 1 ¡п ¡екс—-—> Ж) —-—> НЬМО Поскольку скорость взаимодействия НЬ с N0 близка к диффузионной (кц = 1 02 108 моль"1 л с '), то для данной схемы реакций выполняется условие кн » к

{кь=кц [НЬ]) При этом справедливо описание кинетики накопления №N0 в системе уравнением

[НЬМО](() = [НЬМ01 (1 - е~к1) (1)

Как видно из таблицы 1, величина кь на пять порядков превышает полученные в эксперименте константы скорости образования НЬЖ), поэтому погрешность этого приближения составит -0 01%

Таким образом, НЫЧО образуется с такой же скоростью, с какой N0 выделяется в раствор, а НЬ выступает в роли «ловушки» монооксида азота Используя уравнение (1), были получены эффективные константы скорости первого порядка (к) изученных реакций для комплексов 1-6. Полученные данные приведены в таблице 1, для комплекса 7 - в таблице 2, строка 1

Таблица 1. Эффективные константы скорости первого порядка (к) взаимодействия комплексов 1-6 с НЬ

Обозначение Формула комплекса к 103, с"1

1 Ыа2[Ре(8203)2(М0)2] 4Н20 4 5 ± 0 45

2 [Ре(82С4Н,М6)(ЫО)2] 1/2Н20 1 84 ± 0 18

3 [Ре2(5С2НзМ4)2(МО>4] 2Н20 1 72 + 0 17

4 [Ре2(8С2Н3М4)2(МО)4] 6 6 + 0 66

5 [Ре2(С3Н3М28)2(МО)4] 8 85 ± 0 9

6 [Ре2(8С4Н5М2)2(МО)4] 3 46 + 0 35

красная соль Русина Ма2[Ре282(>Ю)4] 8Н20 0 061 ±0 006

*Экспериментальные условия как в подписи к рисунку 2 Концентрация комплексов 1-6 была равна 2 10"4 моль л концентрация НЬ (6-7 5) 10 6 моль л 1

Было проверено, отличаются ли скорости выделения МО-групп комплекса 7 в раствор при распаде изучаемых комплексов Для этого была использована функция (2), описывающая кинетику протекания параллельных процессов

У (О = У о + я, (1 - е"*1') ■+ а2 (1 - еч) (2)

Оказалось, что к/ = к2, при этом они равны константе, получаемой при использовании функции (1) Это означает, что МО-группы в комплексе 7 в таких условиях выделяются с одинаковыми скоростями

Но на скорость реакции также может влиять эффект взаимодействия комплексов с белковой глобулой НЬ, что будет приводить к изменению микроокружения сера-нитрозильного комплекса и, в конечном счете, к изменению скорости Ж)-донирования Поэтому в работе было исследовано влияние кон-

центрации НЪ и соотношения [М<3-донор]/'[НЬ] на константу скорости выделения N0 в раствор комплексом 7 (Таблица 2),

Таблица 2, Константы скорости выделения N0 в раствор (А') комплексом 7 и ШЫОатом*

Комплекс 1 Комплекс |-104, моль-л"1 (НВД-Ю5, моль-л"1 МО4, с1

[re2(SC5H4N)3(NO)4j 2 0,5 59 + 6

(Fe2(SC5ll,N)2(NO),] 2 2 6.2 ± 0.7

[Fe2(SC5H^"Nb(KO)4j 0.5 2 к, =• 6.2» 0,7 кг = 0.50 ± 0.05

NONOaT - дготи.чентриамнн 2 2 0.80 + 0.08

Условия экспериментов как подписи к рисунку 2.

Была определена эффективная ко;(станта скорости реакции первого порядка для комплекса 7 при концентрации НЬ 2-10 5 моль-в"1 и соотношении [ЫО-донор]/[НЬ] = 10 (таблица 2, строка 2). При 4-кратном уменьшении концентрации комплекса 7 в системе константа скорости реакции уменьшается (Таблица 2, строка 3). Анализ кинетики показал, что наблюдается два параллельных процесса выделения N0 в раствор, происходящих по первому порядку. Один из них совпадает с описанным выше, а второй -идет на порядок медленнее (Таблица 2, строка 3).

При 4-кратном повышении концентрации НЬ до 8-1 О*5 моль-л'1 также происходит стабилизация комплекса 7 (рис. 4), Из-за недостаточного изменения поглощения в области перекрываний спектров, корректно провести разложение и определить константу скорости выделения N0 не удается.

По-видимому, наблюдаемая стабилизация комплекса может быть объяснена частичной абсорбцией комплекса 7 макромолекулой гемоглобина. Это уменьшает его контакты с водной фазой, замедляй выделение N0.

Рис, 4. Изменение разностных спектров поглощения при взаимодействии комплекса 7 с Hb. (комплекс] = 2'10"4 моль-л"1, [IIb] = 8-I0"5 моль-л"1, Время регистрации в часах. Условия как в подписи к рисунку 2.

Ii исследуемых комплексах железо имеет степень окисления (1+) и, поэтому, ¡гелъзя ожидать, что IIb будет выступать как восстановитель в реакциях образования N0. Дейст вительно, образования метгемоглобииа при взаимодействии IIb с железонитрозильлыми комплексами не наблюдалось. Более вероятным является выделение N0 в результате взаимного окислен и я - восстановлю н и я нит-розильных групп изучаемых комплексов в протонных средах;

К. + жп Ж.

J'

и. * ,НО ,Fcf

VC

L — NO + Гс:~ + NO + L"

IГ N0 Г N0

различия в величинах констант к (Таблица 1 и 2) обусловлены природой лигандов, входящих в их состав, и типом связывания лигаидов с атомами желе-

Для сравнения с комплексами 1-7 также были исследованы известные МО-доноры: красная соль Русина Ма2[Ре2$2(^0),.|]-81-Ь0, нитропруссид натрия На2[Ре(СН)51\Ю]'2Н20 (ЗМР) и диэтилентриамин, относящийся к классу

ЫОЫОатов.

л (о™. ад) 0,4

450

S00

550

600

X, им

Рис. 5. Изменение разностных спектров поглощения во времени при изаимодейст-вии 5ЫР (2- ] О"4 моль-л"1) с НЬ (£2-10* моль-л*1). Время регистрации в минутах приведено на рисунке. Условия как в подписи к рисунку 2.

комплексов 1-3, 5-7). Их наличие свидетельствует о том, что в суммарный спектр вносят вклад только НЬ Я НЬМО. В случае (Рис, 5) видно искажение изо б ест и часки х точек. Это говорит о том, что в процессе реакции образуется не-

В случае красной соли Русина выделение N0 происходило медленнее, константа скорости оказалась на два порядка меньше, чем для комплексов 1-6 (Таблица 1). В случае SNP (Рис. 5) изменение спектра поглощения Hb начиналось через 50 минут и в течение последующих 4,5 часов концентрация IlbNO нарастала незначительно.

На рисунке 2 в разностных спектрах для комплекса 4 четко Видны изобестические точки при 551, 570 и 595 нм (аналогично для

которое количество продукта взаимодействия НЬ с SNP, вносящего вклад в спектр поглощения в области 450-650 им

Для NONOaTa изменение спектров поглощения НЬ, указывающее на образование HbNO, происходило медленнее, чем для комплексов 1-7 Константа скорости реакции при одинаковых концентрациях реагентов оказалась на порядок ниже, чем для комплекса 7

Известно, что красная соль Русина и SNP (в отличие от NONOaTa) требуют дополнительной активации (например, восстановительной) Но в нашем случае НЬ не мог выступать как восстановитель, так как в ходе реакции метге-моглобин не образовывался

Таким образом, разработанная методика регистрации кинетики образования NO была проверена на новых соединениях класса железонитрозильных комплексов, способных выделять N0 самопроизвольно С помощью этого метода удалось определить константы выделения NO, сравнив их с константами известных представителей данного класса, и показать, что выделение N0 может происходить в нескольких параллельных процессах

Также показано, что при больших концентрациях гемоглобина возможна стабилизация железонитрозильных комплексов и замедление их гидролиза Этот эффект позволяет предположить пролонгированный механизм действия таких препаратов in vivo, несмотря на то, что самопроизвольное выделение NO в безбелковой среде такими комплексами происходит достаточно быстро

Глава 4 Гемоглобин как редуктаза в реакциях с органическими нитратами Эта глава также состоит из двух частей, которые посвящены, соответственно (/) кинетике образования нитрит-иона в системе «нитрат-восстановитель» и (2) кинетике образования монооксида азота в системе «нит-рат-цистеин-гемоглобин»

Кинетика образования нитрит-иона в системе «нитрат-восстановитель» Известно, что скорость образования нитрит-иона из органических нитратов коррелирует с их вазодилататорной активностью Основываясь на этом, был предложен метод анализа скорости образования нитрит-иона из органических нитратов, позволяющий судить об их эффективности как потенциальных вазо-дилататоров

Для этого было изучено образование нитрит-иона из NMO в присутствии природных восстановителей - цистеина, глутатиона, аскорбата и NADH Ско-

13

рость накопления N02" дала ряд 0 36, О 11, 0 10, 0 04 мкмоль л"1 мин'1, соответственно Таким образом, лучшим восстановителем является цистеин - аналог тиолового кофактора и активного центра ггПАЬОН

На примере NN40 была изучена кинетика накопления N02" в реакции с Суэ при различных концентрациях реагентов (см рис 6, точки) Концентрацию нитрит-иона определяли по реакции Грисса

Методом ТСХ установлено, что через 40 ч при взаимодействии NMO с Суэ обнаруживается лишь N00 (З-гидроксиметил(З-нитроксиметил)оксетан) -продукт восстановления одной нитроэфирной группы NMO (11е=0)

Опыты, проведенные при различных значениях рН, показали, что при рН 8 5 скорость накопления N02^ ~ в 30 раз выше по сравнению с рН 7 0, а при рН 6 0 реакция практически не идет Поскольку рК БН-группы Суэ равно 8 2,

то наблюдаемая зависимость от рН свидетельствует о том, что восстановителем является тиолат-ион (И.' Б")

На модельной системе «нитрат-цистеин» было проведено сравнение эф-фективностей нескольких органических нитратов Активность падала в ряду GTN > МРБЭ > NMO > БМРЭ > 01В0 > ЖЛ* Величина частичного положительного заряда на атоме азота при ОЧЧ связи в нитроэфирах зависит от индукционного эффекта остальной части молекулы А поскольку Я'Б" является нук-леофилом, то снижение активности в ряду вышеперечисленных соединений связано, скорее всего, с количеством нитрогрупп и пространственной структурой молекулы

Реакция ММО с цистеином может проходить по одному из двух механизмов - либо в одну стадию как тримолекулярная (уравнение 4), либо как последовательность двух бимолекулярных реакций (уравнения 5, 6)

Кинетическое моделирование показало, что в первом случае совпадения экспериментальных данных (точки) и расчетных кривых не наблюдается (рис 6а), а

'МРЭВ - 2-оксиметил-2-оксипропандиол-1,3-динитрат, ЭМРО - динитрат 2-метилпропандиола-1,3, ОИШ — динитрат изобутендиола, — Ы-[2-гидроксиэтил] никотинамид (никорандил) Все органические нитраты (кроме СШ) предоставлены сотрудниками лаб Корепина А Г ИПХФ РАН

(3)

ЛОШ2 + 2К'5Н NО - + КОН + - БК' + Н +, ЯО-ИО, +Н* —'^КОН + КБ-ИО^ Л'5 - АЮ2 + —N0' + Я'5 -

2 >

(4)

(5)

(6)

во втором - набдюлйстся полное соответствие (рис, <ЗЬ), Таким, оёразому уста после!Ю, что процесс образования нитрит-иона из органических нитратов - процесс двустадийный.

¡N0/1, мкмоль-.Г1 |М05"], мк'миЛ!. - г

ментальный данные, линии - теоретически рассчитанные для одностадийного (л) и двустадийного (Ь) механизма. (/) [NMO] = 3-10'3 моль-л"1, [Cys] - I0'2 молт=-л":; (2) gNMO] = 3-Ю-1 моль-л-1, [Cys] 5-10"3 моль-л '; (3) fN'MOJ * 1.5-10 ; моль-л , [Cys] 5-10'3 моль-л"1; (4) [NMO] - 1.5-10"3 моль-л-1, [Cys] - ¡О"3 моль-;;"1.

Для нахождения констант скорости реакций была составлена система дифференциальных кинетических уравнений, соответствующая схеме реакций (5-6), при постоянстве pl I 7.0 и с учетом равновесия K.[R'SH] = [R'S'|[H+], l Ly-тем численного решения получепной системы уравнений при начальных условиях ([RONOzKO) ■ |.RONO>|>; [R'SN03](0) = [N02"1 = 0; начальные колi;cim рации lR'SH|(0) н [R'S ](0) находятся из уравнений равновесия и материального баланса: [R'SH](0) + [R'S~](0) = [R'SH]0) строили расчетную зависимость р0Л'-'ис% (рис. Щ при заданных величинах к/ и кг- Искомые к/ и к? удовлетворяли условию минимального значения функционала F(k|,it-,) = Itl^OTl'""1 -[KOj^ ~~ число точек в опыте, [N02~]jhKl:nl и

[N02~Jj ' ~~ экспериментальные и расчетные значения [N02~] в момент времени tj. I [слученные значения констант скорости I; и кг приведены в таблице 3.

LI)

0,8 {1,6 e,4 0,2 0,0

А (от«, tu)

Кинетика образования монооксида азота в системе «нитрат-цистеин-

босст аиоаи тел ь»

Изучив бинарную систему, мы перешли к1 более сложной, тройной системе с участием гемоглобина.

Из литературы известно, что НЬ восстанавливает ©ТТМ до нитрит-иона. Однако обнаружено, что он восстанавливает не все органические нитраты, например, Поэтому была поставлена задача выяснить, может ли NМО в реакционной системе, близкой к физиологической, т.е. в присутствии тиола и НЬ, образовывать N0. Изменение спектров поглощения реакционной системы, содержащей НЬ, N.N'10 и Суя представлено на рис. 7. Спектры были обработаны, как описано выше. Полученные данные по накоплению

450

5 00

5S0

600

X, им

Рис, 7. Изменение спектров поглощения при взаимодействии $ЙМО (3-10 моль-л"') с НЬ {'.7.4-!()"') моль-л' в присутствии Суз (10'2 моль-л"1). Первый спектр записан в начальный момент, второй — через 15 мин, остальные — с интервалом 60 мин. Условия как в подписи к рисунку 2.

НЫ\0 (точки) представ левы на рисунке 8.

[1Ш>'0), .чкмвяь-л1

Рис. 8. Сопоставление экспериментальных точек 2, .>) и расчетных кривых (/', 1", 2', 2". 3') накопления HbNO Li системе Hb-NMO-Cys. Расчет проведен без учета (/2") и с учетом (Г, 2', 3') реакции (10). Концентрации NMO 3-10'"' моль-л"1: Cys 10"2 моль-л"'; Hb I7.4-10"6 моль-л"! (/, 3), 6.7-1Ö"0 моль-л"1 (2).

В случае (.¥) - после предварительной инкубации в течение 10 ч реакционной систем® описанной в подписи к рис.8, с последующи,« прибавлением lib до концентрации П.4-10"6 моль-л"1.

Поскольку Hb восстанавливает нитрит-ион до NO, было проанализировано, соответствует ли количество монооксида азота, образовавшегося в тронной

системе, тому количеству И02 , который образуется при взаимодействии ЫМО с цистеином И можно ли описать процесс образования N0 в системе НЬ^МО-СуБ реакциями (3, 5-9)

МЛ + НЬ + /Г —> Ж) + теШЬ + ОН~, (7)

НЬ + N0 > НЬЫО, (8)

тс/ПЬ + К'БИ —НЬ + Я'Х +1Г (9)

Так же, как и в случае двойной системы, было проведено исследование обратной задачи и опредетение констант скорости второго порядка по экспериментальным данным для тройных систем При этом рассматривалась последовательность шести реакций (3, 5-9) Константы скорости реакции второго порядка к1 и кг определили для двойной системы NMO-Cys, как описано выше, к3 и к} быпн найдены из независимых экспериментов исследования кинетики взаимодействия НЬ с нитритом натрия и восстановления тсШЬ под действием Суз

При анализе реакций также принималось во внимание, что НЬ существует в двух конформациях - Г и Я, которые имеют различные ИесЮх-потенциалы и обладают разтичной реакционной способностью Взаимодействие НЬ, который находится в Т-копформации, с нитрит-ионом (а также с алкилнитритами), проходит под аллостерическим контролем - так как взаимодействие N0 с гемом переводит всю молекулу НЬ в более реакциоиноспособную И-конформациго Поэтому скорость реакции возрастает по мере увеличения глубины реакции

В связи с этим выражение для константы скорости к3 было записано в виде а,¡л = / +к , I где к3(0 - эю константа скорости реакции взаимодейст-\ \llbl)

вия НЬ с N02 , определяющая весь ход реакции, [НЬ\0 — начальная концентрация НЬ, [НЬ\ - текущая концентрация свободного НЬ, кзи и кз ] - константы скорости реакции на первом и на втором этане Это выражение обеспечивает линейный рост константы Аз с глубиной протекания процесса и содержит два параметра к3„ и к< /, которые были оценены из независимого эксперимента по кинетике взаимодействия НЬ с №N02 Полученные значения А)и и к3 / приведены в табтице 3

Таблица 3. Константы скоростей второго порядка реакций (5-9)

Константа скорости моль'^л с"1 Источник

к, 3 3±03 Данная работа

к2 (98 + 16) 10"2 Данная работа

кзо (5 8 ±07) 10"1 Данная работа

к3, 1 3±02 Данная работа

к4 108 АМотт е/ а!

к5 (4 3 ±04) 102 Данная работа

к6 (4 5 ±03) Ю-3 Данная работа

Математические расчеты показали, что всю совокупность экспериментальных данных (рис 8) нельзя описать только пятью константами к/ - к5 Оказалось, что наблюдаемая в эксперименте скорость образования НЬ>ГО в тройной системе превышает рассчитанную, если считать, что №N0 образуется только путем взаимодействия НЬ с тем N02 который нарабатывается в двойной системе NMO-Cys Для объяснения этого эффекта возможны три варианта

1 Суэ увеличивает скорость взаимодействия НЬ с N02 ~ Проверяя эту возможность, мы исследовали взаимодействие N02 ~ с НЬ в присутствии Суа, и оказалось, что константа скорости реакции при этом не увеличилась Следовательно, первый вариант отпадает

2 В двойной системе NM0-Cys происходит восстановление N02 ~ в N0 Для проверки второй возможности был проведен опыт с предварительной инкубацией NN10 с Сув в обычных условиях работы (описаны в подписи к рис 2) и затем прибавили НЬ (кривая 3, рис 8) Сразу после прибавления НЬ был записан спектр поглощения реакционной системы и №N0 не был обнаружен Его концентрация нарастала постепенно При этом скорость образования №N0 была выше, чем в таком же опыте без предварительной инкубации (кривая 1, рис 8) и соизмерима с к3 Это свидетельствует о том, что в процессе инкубации наработался нитрит-ион, который затем был восстановлен гемоглобином Таким образом, и второй вариант отпадает

3 Суз обеспечивает другой путь взаимодействия NN40 с НЬ Для выяснения возможности этого варианта мы решили включить в последовательность реакций (5-9) реакцию (10)

Л- Ы02 + НЬ —!»-> N0 + теШЬ + Я'8 , (10)

восстановление гемоглобином интермедиата (тионитрата Cys - RS-NO2), который образуется из NMO и Cys в реакции (5)

Также как и для двойной системы, была составлена система дифференциальных уравнений, соответствующая полной схеме реакций (кs - к6), с учетом равновесия K[R'SH] = [R'S ][Н+], постоянства рН системы ([Н+] = const) и квазистационарности процесса по [NO] Система решалась численными методами с учетом начальных условий [R0N02](()) = [RONO2]0, [R'SN02](0) = [N02"] = [metHb](0) = 0, [Hb](0) = [Hb]0, начальные концентрации [R 'SH](0) и [R Х](0) не совпадают с их исходными значениями [/? 'SH]о и с нулем и находятся из условий равновесия (3) и уравнения материального баланса в начальный момент времени [Л /5'//](0) + [/? 2Г](0) = [/? 57/]о Численное решение системы уравнений позволяет рассчитать экспериментально измеряемую величину [HbNO](t) из

уравнения dlHbN°] = ic,[Hb][NO;]+kt[HblR'SN02] dt

Значение неизвестной константы скорости реакции к6 находили из условия минимизации функционала Г}(к6) = Y^P„Yj{HbNufl"'Ln)-[HhNuf,paL'')J ' где m ~

число опытов, п} - число точек в _)-м опыте, ру - весовые коэффициенты, [НЬТчЮ],'31^ и [HbNO]|<pacч' - экспериментальные и расчетные значения концентрации [№N0], соответственно В результате обработки экспериментальных данных (рис 8) было получено среднее значение констант скоростей второго порядка реакций (5-9) (Таблица 3) и хорошее соответствие расчетных кривых экспериментальным точкам на значительном участке зависимости Далее реакция в эксперименте идет с большей скоростью, что характерно для реакций НЬ, проходящих под аллостерическим контролем

Предполагается, что тионитрат претерпевает так называемую тионитрат-ную перегруппировку и находится в равновесии с сульфенил- или сульфинил-нитритом

сульфинилнитрит

R'SO• + 'NO

IV S

сульфенилнифш ()

Вполне возможно, что у НЬ проявляется повышенная реакционная способность именно к сульфенилнитриту, поскольку это соединение является структурным аналогом алкилнитритов. Хотя НЬ и не реагирует с нитроэфирами — алкилнитра-тами, известно, что он проявляет высокую реакционную способность по отношению ¡с алкилнитритам. Константа скорости реакции для разных алкилнитритов с образованием МО составляет от 14.5 до 1420 моль'-л-с"1, что значительно больше кз! (Таблица 3) для взаимодействия НЬ с N0, Схематично предлола-

NO ,

N0

гаемый процесс восстановления NMO б присутствии цистеина отображен на рис. 9.

До сих пор остается непонятной причина необходимости тиолов для био-траясформации органических нитратов и механизм развития толерантности. Обнаруженная редуктазная активность IIb, проявляющаяся в отношении тионитрата цистеина - промежуточного продукта реакции NMO и цистеина, имеет больше значение для метаболизма нитроэфиров. Такое взаимодействие обеспечивает восстановление, по-видимому, любого нит-роэфира в присутствии тиола. Это позволяет объяснить абсолютную необходимость тиолов для биотрансформации нитратов и развитие толерантности в терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

R'S-ONO Рис. 9. Предполагаемая схема восстановления органических нитратов с участием гемоглобина и цистеина.

выводы

1, Разработана оригинальная методика изучения кинетики реакций, протекающих с образованием моноокснди азота, основанная на спектр о фотометр и ческой регистрации спектра поглощения комплекса №N0.

2, Определены константы скоростей распада семи новых железонитрозиль-ных комплексов с выделением монооксида азота. Показано, что эти комплексы являются 1\'0-донорами, выделяющими N0 за счет гидролиза в протонной среде. Установлено, что константы скоростей генерирования N0 для изученных комплексов на два порядка выше, чем у МО-доноров сравнения. Показано, что при больших концентрациях гемоглобина возможна стабилизация комплексов и замедление процесса их гидролиза.

3 Проведено сравнение природных восстановителей - цистеина, глутатиона, аскорбата и NADH по скорости образования ими нитрит-иона из органического нитрата на примере NMO Установлено, что лучшим восстановителем является цистеин

4 Исследована кинетика образования N02~ из органических нитратов на примере NMO Установлено, что реакция проходит в две стадии через интермедиат тионитрат цистеина Определены константы скоростей обеих стадий Показано, что восстановителем является тиолат-ион цистеина Сделан вывод о том, что снижение активности в ряду GTN > MPDD > NMO > DMPD > DIBD > NKR связано с количеством нитрогрупп и пространственной структурой молекулы

5 Определены константы скорости взаимодействия гемоглобина с нитрит-ионом и метгемоглобина с цистеином Обнаружена новая редуктазная активность НЬ, проявляющаяся в отношении тионитрата цистеина - промежуточного продукта реакции NMO и цистеина Путем моделирования кинетики реакции системой уравнений, описывающей равновесие между всеми реагирующими компонентами системы, определены константы всех протекающих процессов

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Sanina N А , Syrtsova L А , Shkondina N I, Rudneva Т N , Malkova Е S , Bazanov Т А , Kotelmkov А I, Aldoshin S M Reaction of sulfur-nitrosyl iron complexes of «g=2,03» family with hemoglobin (Hb) Kinetics of Hb-NO formation in aqueous solutions//NitricOxide Biology and Chemistry, 2007, Vol 16, No 2, pp 181-188

2 Сырцова Л A , Психа Б Л , Малкова Е С , Шкондина И И , Котельников А И Экспресс-метод оценки потенциальной вазодилататорной активности органических нитратов // Прикладная биохимия и микробиология, том 43, № 3, 2007, с 354-357

3 Сырцова Л А , Котельников А И , Психа Б Л , Малкова* Е С , H И Шкондина, Гайнуллина Е И Восстановление нитроэфиров - доноров N0 - гемоглобином с участием цистеина // Изв АН Сер Хим , 2007, № 4, с 725-731

4 Санина H А , Сырцова Л А , Шкондина H И , Малкова* Е С , Котельников А И , Алдошин С M Стабилизация гемоглобином тетранитрозильного биядерного комплекса железа с пиридин-2-тиолом в водных растворах // Изв АН Сер Хим , 2007, №4, с 732-736

5 Малкова Е С , Сырцова Л А , Котельников А И , Королев A M Новые свойства миоглобина как фермента Тезисы докл XVI Всероссийского Симпозиума «Современная химическая физика», Туапсе, 2004, Стр 184-185

* фамилия Малкова изменена на Чудинову на основании свидетельства о браке 11-ИК № 639138

6 Malkova* E S , Shkondina NI, Syrtsova L A, Sanina N A, Rudneva T N , Aldoshin S M , Kotelnikov AI Use of myoglobin and hemoglobin for search of effective medical preparations Third Moscow International congress «Biotechnology state of the art and prospects of development», 2005 Congress Proceedings Parti p 135

7 Котельников А И , Санина H A , Сырцова JI А , Руднева T H , Малкова* Е С , Алдошин С M Реакции органических и неорганических доноров монооксида азота с гемоглобином кинетика образования HbNO Сб трудов 4-ой национальной научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиок-сиданты и здоровье человека» Смоленск, 2005, Стр 47-48

8 Малкова* Е С , Сырцова J1 А , Шкондина H И , Котельников А И Изучение NO-донирующей способности органических нитроэфиров в новой модельной системе Тезисы докл Международной школы-конференции «Юность Наука Культура - Физхимия», Обнинск, 2005, Стр 183-185

9 Сырцова JI А , Малкова* Е С , Психа Б Л , Шкондина H И , Котельников А И Восстановление нитроэфиров - доноров NO гемоглобином с участием цистеина через интермедиат нитритотиол Тезисы докл 1-ой Всероссийской конференции-школы «Высокореакционные интермедиа™ химических реакций» Юность, 2006, Стр 40

10 Малкова Е С , Сырцова Л А , Шкондина H И , Котельников А И Модельные системы для подбора лекарственных препаратов на основе органических нитроэфиров Альманах клинической медицины, T XII II Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине», 2006, Стр 121

11 Шкондина H И, Санина H А, Сырцова Л А, Малкова* Е С , Котельников А И, Алдошин С M Гемоглобин как ловушка NO в реакциях гидролиза нитро-зильных [lFe-S] И [2Ре-2В]-комплексов Тезисы докл XVIII Всероссийского симпозиума «Современная химическая физика» Туапсе, 2006, Стр 283

12 Малкова Е С , Психа Б Л , Сырцова Л А , Шкондина H И , Котельников А И Механизм реакции между органическими нитратами и сульфгидрильными соединениями Тезисы докл XVIII Всероссийского симпозиума «Современная химическая физика» Туапсе, 2006, Стр 275

13 Syrtsova LA, Kotelnikov AI, Psikha BL, Malkova* ES, Shkondma NI, Gainullina EI Kinetic modeling of reaction of nitroesters biotransformation with participation of hemoglobin Book of abstracts of VII Voevodsky conference «Physics and chemistry of elementary chemical processes» Chernogolovka, 2007, pp 278-279

Заказ № 168/10/07 Подписано в печать 11 10 2007 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495)797-75-76,(495)778-22-20 , \тт ср пл , е-тай т[о@с/г т

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Чудинова, Екатерина Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность работы.

Цели и задачи работы.

Научная новизна.

Научно-практическая значимость исследования.

Личный вклад автора.

Апробация работы.

Публикации.

Структура и объём диссертации.

Краткое содержание глав диссертации.

Список принятых сокращений.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Монооксид азота.

1.1.1. Биосинтез монооксида азота.

1.1.2. Биологические эффекты монооксида азота.

1.1.3. Методы определения монооксида азота.

1.1.4. Доноры монооксида азота.

1.2. Органические нитраты.

1.2.1. Пути биотрансформации органических нитратов.

1.2.2. Абсолютная необходимость тиолов и толерантность.

1.3. Гемоглобин.

1.3.1. Структура и свойства гемоглобина.

1.3.2. Конформационные состояния гемоглобина.

1.3.3. Взаимодействие гемоглобина с GTN.

1.3.4. Свойства гемоглобина как нитритредуктазы.

1.3.5. Диоксигенация и нитрозилирование гемоглобина.

1.3.6. Гипотеза сохранения активности монооксида азота в организме через образование S-нитрозогемоглобина.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. ГЕМОГЛОБИН КАК ИНДИКАТОР РЕАКЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ ДОНОРОВ N0.

3.1 Разработка методики определения монооксида азота.

3.2. Использование гемоглобина в качестве индикатора NO-донорной способности железонитрозильных комплексов в протонных средах.

ГЛАВА 4. ГЕМОГЛОБИН КАК РЕДУКТАЗА В РЕАКЦИЯХ С ОРГАНИЧЕСКИМИ НИТРАТАМИ.

4.1 Кинетика образования нитрит-иона в системе «нитратвосстановитель»

4.2. Кинетика образования монооксида азота в системе «нитрат-цистеин-гемоглобин».

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гемоглобин как индикатор реакционной способности доноров NO и редуктаза в модельных NO-генерирующих системах in vitro"

Многообразие биологических эффектов монооксида азота (N0) можно разделить на три типа: регуляторное, защитное и повреждающее. Уникальные свойства N0 проявляются во всех аспектах функционирования живого организма - от регулирования нейротрансмиссии и иммунитета до ингибирования агрегации тромбоцитов и их адгезии на стенках кровеносных сосудов. Эти свойства стали предметом интересов многих ученых и породили огромную волну исследований в биологии и химии монооксида азота.

Данные о многофункциональной биологической активности NO in vivo используются при разработке фундаментальных основ создания нового поколения лекарственных препаратов, в первую очередь применяемых в терапии сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Практически все используемые в медицине препараты такого спектра действия (к ним не относятся, например, NO-стимуляторы) представляют собой экзогенные источники или доноры N0, из которых монооксид азота может высвобождаться по механизмам различных типов.

Ярким предметом регуляторного действия N0 является его вазодилата-торная активность. Сосудорасширяющее действие N0 связано с активацией растворимой формы фермента гуанилатциклазы. Как и все остальные физиологические эффекты N0, вазодилатация проявляется при очень низких, почти исчезающих концентрациях монооксида азота. А его чрезвычайно высокая ре-акционоспособность (время полужизни 2-5 с in vivo), затрудняет его определение. Обычно для детектирования N0 используются три основных метода: электрохимический, люминесцентный и метод ЭПР. Все они относятся к методам прямого определения N0. Но у каждого из них есть свои недостатки, не позволяющие применять их в кинетических исследованиях. Кроме этих трех, существует еще множество косвенных методов, но все они в основном обладают низкой чувствительностью. Их применение сопряжено со сложной про-боподготовкой и с большим числом мешающих компонентов.

Органические нитраты - это наиболее известный класс вазодилататоров

- представляют собой экзогенные доноры N0. В процессе биотрансформации нитроэфиры в результате восстановления образуют N02 а затем N0. Образование нитрит-иона из органических нитратов может происходить под действием восстановителей, например тиолов. Интересен тот факт, что в отсутствие или при истощении запасов внутриклеточных тиолов наблюдается толерантность - снижение эффективности действия при повторных применениях. Кроме того, скорость образования нитрит-иона из нитратов под действием цис-теина коррелирует с их вазодилататорной активностью. Помимо этого факта накоплен большой материал, свидетельствующий о том, что NO2 присутствующий в крови в концентрации 3-Ю"7 моль-л"1, представляет собой самую большую форму хранения N0 в организме.

Далее нитрит-ион превращается в N0 путём реакции с восстановителями, например, различными гемсодержащими белками, ксантиноксидоредукта-зой, а также тиол-содержащими ферментами. Недавно была показана нитрит-редуктазная активность гемоглобина - белка, выполняющего функцию переноса кислорода. При этом максимальная скорость взаимодействия его с нитритом наблюдается в условиях гипоксии - при 50%-ном насыщении кислородом. Без сомнения гемоглобин является самым распространенным восстановителем нитрита, поскольку его концентрация (свободного и эритроцитарного) составляет ~ 12-10"3 моль-л"1.

В отличие от органических нитратов и других синтетических N0-доноров (органических и неорганических) нитрозильные железосерные комплексы генерируют N0 без применения дополнительных активаторов - в результате гидролиза в протонной среде. Кроме того, что эти соединения могут выступать в роли «депо» эндогенного и экзогенного N0 (за счет реакций транснитрозилирования), они также являются удобным инструментом для исследований. В реакциях с НЬ эти соединения образуют нитрозилированный по железу комплекс HbNO, устойчивость которого зависит от концентрации кислорода in vivo.

Как становится ясно, роль гемоглобина в организме не ограничивается только функцией переноса кислорода. В последнее десятилетие активно разрабатывается гипотеза, что гемоглобин в составе эритроцитов является одним из важнейших элементов системы биологической трансформации доноров N0 и транспортировки N0 внутри организма. Но это предположение остается до конца не выясненным, оставляя поле деятельности для будущих исследований.

Актуальность работы

Известно, что монооксид азота (N0) является уникальным биологическим регулятором. В первую очередь его функции связаны с регуляцией тонуса кровеносных сосудов. Определяющей стадией механизма действия N0 в этом процессе является координация с гемом гуанилатциклазы. Основная форма хранения монооксида азота в организме - нитрит-ион (N02~). Нитрит-редуктазная активность гемоглобина делает его самым распространенным восстановителем нитрита в организме (животных и человека). Метаболизм N0 также в значительной мере связан с образованием нитрозилированного по железу комплекса HbNO.

Понимание биохимии монооксида азота позволит прояснить механизмы действия различных лекарственных средств и облегчит возросший в последние годы поиск новых эффективных кардиопрепаратов.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института проблем химической физики РАН при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 06-03-32381а), Программы фундаментальных исследований ОХНМ РАН «Биомолекулярная и медицинская химия» и Программы Президента РФ по поддержке Ведущих научных школ (грант НШ-4525.2006.3).

Цели и задачи работы

Основной целью данной работы было исследование возможности участия гемоглобина в восстановлении органических нитратов в условиях, близких к физиологическим, а также изучение возможности его использования как индикатора реакционной способности NO-доноров. Для этого было необходимо разработать методику исследования кинетики образования N0, которая была бы универсальной для всех изучаемых соединений. Работа проводилась с двумя классами NO-доноров, для которых осуществлялось:

1. изучение условий, в которых генерируется монооксид азота;

2. исследование кинетики образования N0, расчет констант скоростей элементарных стадий;

3. сравнение эффективности NO-донирования изучаемыми соединениями.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать универсальную методику изучения кинетики образования монооксида азота.

2. Исследовать NO-донорную способность новых железосерных нитро-зильных комплексов в протонных средах.

3. Изучить кинетику образования нитрит-иона в системе «органический нитрат - цистеин (Cys)» и разработать метод оценки потенциальной вазодила-таторной активности органических нитратов.

4. Исследовать возможность участия гемоглобина в восстановлении органических нитратов в присутствии тиолов. Определить константы всех изучаемых реакций.

Научная новизна

Разработана оригинальная методика исследования кинетики реакций, протекающих с образованием монооксида азота. Методика реализована с применением численных методов декомпозиции суммарных спектров поглощения НЬ и HbNO на индивидуальные составляющие. Разработанная методика была проверена на новых соединениях различных классов NO-доноров, способных выделять N0 самопроизвольно. Более того, с ее помощью удалось не только определить константы выделения N0, сравнив их с константами известных представителей данного класса, но и показать, что процесс выделения N0 может быть ассоциативным. Показано, что гемоглобин при больших концентрациях может влиять на процесс NO-донирования этими комплексами, стабилизируя их. Для NO-доноров, принадлежащих к классу органических нитратов, изучена тройная система «нитрат-цистеин-гемоглобин» на примере 3,3-бис(нитроксиметил)оксетана (NMO). Обнаружено взаимодействие гемоглобина с интермедиатом реакции цистеина и органического нитрата - тионитратом цистеина. Это взаимодействие приводит к образованию монооксида азота, что имеет большое значение для метаболизма органических нитратов.

Научно-практическая значимость исследования

Разработанная методика может выступать в роли универсального инструмента в биохимии монооксида азота. Это позволит оценивать потенциальную вазодилататорную активность новых синтезированных препаратов еще на ранних стадиях исследований. Большой интерес полученные результаты представляют для исследователей, занимающихся вопросами биохимии монооксида азота, биотрансформации органических нитратов и проблемами толерантности.

Личный вклад автора

Автором была разработана и успешно применена в исследованиях методика регистрации кинетики образования монооксида азота. Также в работе представлены результаты исследований, выполненных лично автором по ряду научно-исследовательских проектов, связанных с изучением различных классов NO-доноров. Автор непосредственно участвовал в обосновании и постановке основной части экспериментов, в их проведении и в обобщении результатов исследований. Математическое моделирование и расчет констант реакций в системе «NMO-Cys-НЬ» проведены к.ф.-м.н. Психой Б.Л.

Апробация работы

Результаты исследований докладывались и обсуждались на Всероссийских и Международных симпозиумах и конференциях: Всероссийский симпозиум «Современная химическая физика» (Туапсе, 2004 и 2006); Международная конференция «Биотехнологии: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005); Национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005); Международная школа-конференция «Юность. Наука. Культура. - Физхимия» (Обнинск, 2005); Всероссийская конференция-школа «Высокореакционные интермедиаты химических реакций» (Юность, 2006); Международная конференция им. Воеводского В.В. «Physics and chemistry of elementary chemical processes» (Черноголовка, 2007), a также на научных семинарах и конкурсах научных работ в ИПХФ РАН.

Публикации

По результатам работы опубликовано 9 тезисов докладов и 4 статьи.

Тезисы:

1. Малкова Е.С., Сырцова JI.A., Котельников А.И., Королев A.M. Новые свойства миоглобина как фермента. XVI Всероссийский Симпозиум «Современная химическая физика», Туапсе, 20 Сентября - 1 Октября, 2004, Тезисы докладов, Стр. 184-185.

2. Malkova E.S., Shkondina N.I., Syrtsova L.A., Sanina N.A., Rudneva T.N., Al-doshin S.M., Kotelnikov A.I. Use of myoglobin and hemoglobin for search of effec- , tive medical preparations. Third Moscow International congress «Biotechnology: state of the art and prospects of development» March 14-18, 2005, Congress Proceedings. Part 1. p. 135.

3. Котельников А.И., Санина H.A., Сырцова JI.A., Руднева Т.Н., Малкова Е.С., Алдошин С.М. Реакции органических и неорганических доноров монооксида азота с гемоглобином: кинетика образования HbNO. 4-ая национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» Смоленск, Сентябрь 26-30,2005, Сборник трудов, Стр. 47-48.

4. Малкова Е.С., Сырцова JI.A., Шкондина Н.И., Котельников А.И. Изучение NO - донирующей способности органических нитроэфиров в новой модельной системе. Международная школа-конференция «Юность. Наука. Культура. -Физхимия» Обнинск, Декабрь 5-7,2005, Тезисы докладов, 183-185.

5. Сырцова JI.A., Малкова Е.С., Психа Б.Л., Шкондина Н.И., Котельников А.И.Восстановление нитроэфиров - доноров N0 гемоглобином с участием цистеина через интермедиат нитритотиол. 1-ая Всероссийская конференция-школа «Высокореакционные интермедиаты химических реакций» Юность, Апрель, 9-12,2006, Тезисы докладов. Стр. 40.

6. Малкова Е.С., Сырцова JI.A., Шкондина Н.И., Котельников А.И. Модельные системы для подбора лекарственных препаратов на основе органических нитроэфиров. Альманах клинической медицины. Т. XII. II Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» Май 16-19, 2006, Стр. 121.

7. Шкондина Н.И., Санина Н.А., Сырцова Л.А., Малкова Е.С., Котельников А.И., Алдошин С.М. Гемоглобин как ловушка NO в реакциях гидролиза нит-розильных [IFe-S] И [2Fe-2S]-KOMroieKCOB. XVIII Всероссийский симпозиум «Современная химическая физика» Туапсе, Сентябрь 22-30, 2006, Тезисы докладов, с. 283.

8. Малкова Е.С., Психа Б.Л., Сырцова Л.А., Шкондина Н.И., Котельников А.И. Механизм реакции между органическими нитратами и сульфгидрильны-ми соединениями. XVIII Всероссийский симпозиум «Современная химическая физика» Туапсе, Сентябрь 22-30,2006, Тезисы докладов, с. 275.

9. Syrtsova L.A., Kotelnikov A.I., Psikha B.L., Malkova E.S., Shkondina N.I., Gainullina E.I. Kinetic modeling of reaction of nitroesters biotransformation with participation of hemoglobin. VII Voevodsky conference «Physics and chemistry of elementary chemical processes» Chernogolovka, June 24-28, 2007, Book of abstracts, p. 278-279.

Статьи:

1. Sanina N.A., Syrtsova L.A., Shkondina N.I., Rudneva T.N., Malkova E.S., Ba-zanov T.A., Kotelnikov A.I., Aldoshin S.M. Reaction of sulfur-nitrosyl iron complexes of «g=2,03» family with hemoglobin (Hb): Kinetics of Hb-NO formation in aqueous solutions I I Nitric Oxide: Biology and Chemistry, 2007, Vol. 16, No. 2, pp: 181-188.

2. Сырцова JI.A., Психа Б.Л., Малкова E.C., Шкондина Н.И., Котельников А.И. Экспресс-метод оценки потенциальной вазодилататорной активности органических нитратов «Прикладная биохимия и микробиология», том 43, № 3, 2007, с. 354-357.

3. Сырцова Л.А., А.И. Котельников, Б.Л. Психа, Е.С. Малкова, Н.И. Шкондина, Е.И. Гайнуллина Восстановление нитроэфиров - доноров N0 - гемоглобином с участием цистеина. Известия Академии наук, Серия химическая, 2007, №4, с. 725-731.

4. Санина Н.А., Сырцова Л.А., Шкондина Н.И., Малкова Е.С., Котельников А.И., Алдошин С.М. Стабилизация гемоглобином тетранитрозильного биядер-ного комплекса железа с пиридин-2-тиолом в водных растворах. Известия Академии наук, Серия химическая, 2007, № 4, с. 732-736.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 106-ти страницах, включает введение, литературный обзор, экспериментальную часть, результаты и обсуждения, выводы и список использованной литературы (121 наименование). В качестве иллюстраций использовано 22 рисунка, 6 таблиц и 8 схем.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Чудинова, Екатерина Сергеевна

выводы

1. Разработана оригинальная методика изучения кинетики реакций, протекающих с образованием монооксида азота, основанная на регистрации спектра поглощения HbNO.

2. Показано, что все изученные сера-нитрозильные комплексы железа являются N0-донорами, выделяющими монооксид азота безактивационно в протонной среде. Определены константы скоростей распада семи новых железо-нитрозильных комплексов с выделением N0. Проведено сравнение с известными представителями класса железонитрозильных комплексов и NONOaroM. Установлено, что эффективные константы скоростей реакций псевдопервого порядка составляют (4.5-8.9)-103 с'1, что на два порядка выше, чем у N0-доноров сравнения. Показано, что при больших концентрациях гемоглобин может стабилизировать комплексы, замедляя процесс гидролиза.

3. Проведено сравнение природных восстановителей - цистеина, глутатио-на, аскорбата и NADH по скорости образования ими нитрит-иона из органического нитрата на примере NMO. Установлено, что лучшим восстановителем является цистеин.

4. Исследована кинетика образования N02~ из органических нитратов на примере NMO. Установлено, что реакция проходит в две стадии через интер-медиат тионитрат цистеина. Определены константы скоростей обеих стадий,

Л | |

3.3 ± 0.3 и (9.8 ± 1.6)-10" моль-л" с", соответственно. Показано, что восстановителем является тиолат-ион цистеина. Сделан вывод о том, что снижение активности в ряду GTN > MPDD > NMO > DMPD > DIBD > NKR связано с количеством нитрогрупп и пространственной структурой молекулы.

5. Определены константы скорости взаимодействия гемоглобина с нитрит-ионом и метгемоглобина с цистеином. Обнаружена новая редуктазная активность НЬ, проявляющаяся в отношении тионитрата цистеина - промежуточного продукта реакции NMO и цистеина. Путем моделирования кинетики реакции системой уравнений, описывающей равновесие между всеми реагирующими компонентами системы, определены константы всех протекающих процессов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Чудинова, Екатерина Сергеевна, Москва

1. Ванин А.Ф. Оксид азота регулятор клеточного метаболизма // Соро-совский образовательный журнал, 2001, том 7, № 11, стр.7-12.

2. Artz J.D., Yang K., Lock J., Sanchez C., Bennett B.M., Thatcher G.R.J. Reactivity of thionitrate esters: putative intermediates in nitro vasodilator activity // Journal of Chemical Communication, 1996, Vol. 73, pp: 927-928.

3. Зеленин K.H. Оксид азота (II): новые возможности давно известной молекулы // Соросовский образовательный журнал, 1997, № 10; стр.105-110.

4. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985, стр. 590.

5. Сосунов А.А. Оксид азота как межклеточный посредник // Соросв-ский образовательный журнал, 2000, Том 6, № 12, стр: 27-34.

6. Williams D.L.H. A chemist's view of the nitric oxide story // Organic and biomolecular chemistry, 2003, Vol. 1, No. 13, pp: 441-449.

7. Kuhn L.P. The Ionization of Ethyl Nitrate in Sulfuric Acid I I Journal of the American Chemical Society, 1947, Vol. 69, No. 8,1974-176.

8. Кольман Я., Рём К.Г. Наглядная биохимия М., «Мир», 2000, стр. 347.

9. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (N0). Новый путь к поиску лекарств. Вузовская книга, М., 2004, стр. 59.

10. Michel Т., Li G.K., Busconi L. Phosphorylation and Subcellular Translocation of Endothelial Nitric Oxide Synthase // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1993, Vol. 90, No. 13, pp: 6252-6256

11. Balbatun A., Louka F. R., Malinski T. Dynamics of nitric oxide release in the cardiovascular system // Acta biochimica polonica, 2003, Vol. 50, No. 1; pp: 6168.

12. Wang P.G., Cai T.B., Taniguchi N. (Eds.); Nitric Oxide Donors, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2005,360 p., Germany.

13. Yao D., Vlessidis A.G., Evmiridis N.P. Determination of nitric oxide in biological samples // Microchimica Acta, 2004, Vol. 147, No 1-2, pp: 1-20.

14. Bedioui F., Villeneuve N. Electrochemical nitric oxide sensors for biological samples-principle, selected examples and applications // Electroanalysis, 2003, Vol. 15, pp: 5-18 *

15. Fan C., Li G., Zhub J., Zhua D. A reagentless nitric oxide biosensor based on hemoglobin-DNA films // Analytica Chimica Acta, 2000, Vol. 423, pp: 95-100.

16. Mitchell K.M., Michaelis E.K. Multimembrane Carbon Fiber Electrodes for Physiological Measurements of Nitric Oxide // Electroanalysis, 1998, Vol. 10, No 2, pp: 81-88.

17. McMurtry M.S., Kim D.H., Dinh-Xuan Т., Archer S.L. Measurement of nitric oxide, nitrite and nitrate using a chemiluminescence assay: an update for the year 2000II Analysis, 2000, Vol. 28, pp: 455-465.

18. Kang D., Vlessidis A.G., Evmiridis N.P. Dialysis membrane sampler for on-line flow injection analysis, chemiluminescence-detection of peroxynitrite in biological samples // Talanta, 2003, Vol. 59, pp: 55-65.

19. Vanin A.F., Van Faassen E. (eds) Radicals for Life: The Various Forms of Nitric Oxide p. 1., Elsevier, Amsterdam 2007, p. 56.

20. Mordvintcev P., Mtilsch A., Busse R., Vanin A. On-line detection of nitric oxide formation in liquid aqueous phase by electron paramagnetic resonance spectroscopy // Analytical Biochemistry, 1991, Vol. 199, No. 1, pp:142-146.

21. Mikoian V.D., Kubrina L.N., Khachatrian G.N., Vanin A.F. Protonation of nitrite is an obligatory stage in the generation of nitric oxide from nitrite in biological systems // Biofizika, 2006, Vol. 51, No. 6, pp:968-975.

22. Kubrina L.N., Caldwell W.S., Mordvintcev P.I., Malenkova I.V., Vanin A.F. EPR evidence for nitric oxide production from guanidino nitrogens of L-arginine in animal tissues in vivo II Biochimica et biophysica acta, 1992, Vol. 1099, No. 3, pp: 233-237.

23. Kalyanaraman В., Detection of nitric oxide by electron spin resonance in chemical, photochemical, cellular, physiological, and pathophysiological systems // Methods in Enzymology, 1996, Vol. 268, pp: 168-187.

24. Волынец В.Ф., Волынец М.П., Аналитическая химия азота, Наука, М., 1979, стр. 93.

25. Miles A.M., Wink D.A., Cook J.C., Grisham M.B. Determination of nitric oxide using fluorescence spectroscopy // Methods of Enzymology, 1996, Vol. 268, 105-120.

26. Химическая энциклопедия в пяти томах под. ред. Кнунянц И.Л., М. 1992, «Большая российская энциклопедия», том 2, стр. 613.

27. Chen Z., Zhang J., Stamler J.S. Identification of the enzymatic mechanism of nitroglycerin bioactivation // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 2002, Vol. 99, No. 12, pp: 8306-8311.

28. Fiorucci S., Antonelli E., Burgaud J.L., Morelli A. Nitric Oxide-Releasing NSAIDs: a Review of There Current Status // Drug Safety, 2001, Vol. 24, No. 11, pp: 801-811.

29. Fukuhara K., Kurihara M., Miyata N. Photochemical Generation of Nitric Oxide from 6-Nitrobenzoa.pyrene // Journal of the American Chemical Society, 2001, Vol. 123, No. 36, pp: 8662-8666.

30. Feelisch M. The use of nitric oxide donors in pharmacological studies // Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol, 1998, Vol. 358, pp: 113-122.

31. Kowaluk E.A., Seth P., Fung H.L. Metabolic activation of sodium nitro-prusside to nitric oxide in vascular smooth muscle // The journal of pharmacology and experimental therapeutics, 1992,262, No. 3, pp: 916-922.

32. Boese M., Mordvintcev P.I., Vanin A.F., Busse R., Miilsch A. S-nitrosation of serum albumin by dinitrosyl-iron complex // The Journal of Biological Chemistry, 1995, Vol. 270, No. 49, pp: 29244-29249.

33. Gaston В., Reilly J., Drazen J.M., Fackler J., Ramdev P., Arnelle D., Mul-lins M.E., Sugarbaker D.J., Chee C., Singel D.J., Loscalzo J., Stamler J.S. Endogenous nitrogen oxides and bronchodilator S-nitrosothiols in human airways //

34. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 1993, Vol. 90, No. 23, pp: 10957-10961.

35. Barnett J., Rios A., Williams D.L.H. NO-group transfer (transnitrosation) between S-nitrosothiols and thiols. Part 2. // Journal of Chemical Society. Perkin Trans., 1995, Vol. 2, pp: 1279-1282.

36. Anthony A.R., Rhodes P. Chemistry, analysis, and biological roles of S-nitrosothiols II Analytical Biochemistry, 1997,249, No l,pp: 1-9.

37. Doyle M.P., Pickering R.A., Conceicao J. Structural Effects in Alkyl Nitrite Oxidation of Human Hemoglobin // The Journal of Biological Chemistry, 1984, Vol. 259, No. 1, pp: 80-87.

38. Doyle M.P., Pickering R.A., DeWeert T.M., Hoekstra J.W., Pater D. Kinetics and mechanism of the oxidation of human deoxyhemoglobin by nitrites // The Journal of Biological Chemistry, Vol. 256., No. 23, 1981, pp: 12393-12398.

39. Williams D.L.H. Nitrosation Book Review., Cambrige university press, England, 1988, pp: 201-206.

40. Yeates R.A., Laufen H., Leitold M. The reaction between Organic Nitrates and Sulfhydryl Compounds. A Possible Model System for the Activation of Organic Nitrates // Molecular Pharmacology, 1985, Vol. 28, pp: 555-559.

41. Laustiola K., Vuorinen P., Vapaatalo H., Metsa-Ketela T. Effects of cysteine and nitroglycerin on bovine heart guanylate cyclase and on tissue cyclic GMP and lactate of rat atria // European Journal of Pharmacology, 1983, Vol. 91, No. 23, pp:301-304.

42. Thatcher G.R.J., Weldon H. NO problem for nitroglycerin: organic nitrite chemistry and therapy // Chemical Society Reviews, 1998, Vol. 27, pp: 331-337.

43. Mukerjee N., Pietruszko R. Inactivation of human aldehyde dehydrogenase by isosorbide dinitrate // The Journal of Biological Chemistry, 1994, Vol. 269, No. 34,pp: 21664-21669.

44. Vallari R.C., Pietruszko R. Human aldehyde dehydrogenase: mechanism of inhibition of disulfiram // Science, 1982, Vol. 216, No. 4546, pp: 637-639.

45. DeMaster E.G., Redfern В., Nagasawa H.T. Mechanisms of Inhibition of Aldehyde Dehydrogenase by Nitroxyl, the Active Metabolite of the Alcohol Deterrent Agent Cyanamide // Biochemical Pharmacology, 1998, Vol. 55, No. 12, pp: 2007-2015.

46. Sakai K., Akima M., Saito K., Saitoh M., Matsubara, S. Nicorandil Metabolism in Rat Myocardial Mitochondria // Journal of Cardiovascular Pharmacology, 2000, Vol. 35, No. 5, pp: 723-728.

47. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств. Вузовская книга, М., 2004, стр. 95.

48. Artz J.D., Toader V., Zavorin S.I., Bennett B.M. Thatcher G.R. In vitro activation of soluble guanylyl cyclase and nitric oxide release: a comparison of NO donors and NO mimetics // Biochemistry, 2001, Vol. 40, No. 31, pp: 9256-9264.

49. Noack E. Investigation on structure-activity relationship in organic nitrates // Methods and findings in experimental and clinical pharmacology, 1984, Vol. 6, No. 10, pp: 583-586.

50. Bennett B.M., Nakatsu K., Brein J.F., Marks G.S. Biotransformation of glyceryl trinitrate by human hemoglobin // Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, 1984, Vol. 62, No. 6, pp: 704-706.

51. Топунов А.Ф., Петрова Н.Э. Гемоглобины: эволюция, распространение и гетерогенность // Успехи биологической химии, 2001, т. 41, стр: 199-288.

52. Блюменфельд JI.A. Гемоглобин // Соросовский образовательный журнал, 1998, №4,33-38.

53. Wyman J.Jr. Linked functions of reciprocal effects in hemoglobin: a second look II Advances in Protein Chemistry, 1964, Vol. 19, pp: 224 286.

54. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985, стр. 188.

55. Antonini Е., Brunori М. Hemoglobin and myoglobin in the reactions with ligands, in. Neuberger A, Tatum E.L. (Eds.) // North-Holland research monographs. Fronties of biology. North-Holland Publishing company, Amsterdam-London. 1971, Vol. 21, P. 276.

56. Roche C.J., Dantsker D., Samuni U., Friedman J.M. Nitrite reduktase activity of Sol-Gel-encapsulated deoxyhemoglobin // The journal of biological chemistry,, 2006, Vol. 281, No. 48, pp: 36874-36882.

57. Perutz M.F., Kilmartin J.V., Nagai K., Szabo A., Simon S.R. Influence of Globin Structures on the State of the Heme: Ferrous Low Spin Derivatives // Biochemistry, 1976, Vol. 15, No. 2, pp: 378-387.

58. Perutz M.F., Ladner J.E., Simon S.R., Ho C. Influence of Globin Structure on the State of the Heme: Human Deoxyhemoglobin // Biochemistry, 1974, Vol. 13, No. 10, pp: 2163-2173.

59. Starke D.W., Blisard K.S., Mieyal J.J. Substrate specificity of the monooxygenase activity of hemoglobin // Molecular Pharmacology, 1984, Vol. 25, No. 3, pp: 467-475.

60. Noonan P.K., Benet L.Z. Formation of mono- and dinitrate metabolites of nitroglycerin following incubation with human blood // Archives of Biochemistry and Biophysics, 1958, Vol. 77, No. 2, pp: 478-492.

61. Clark D.G., Litchfield M.H. Role of inorganic nitrite in methaemoglobin formation after nitrate ester administration to the rat // British Journal of Pharmacology, 1973, Vol. 48, No. 1, pp: 162-168.

62. Keen J.H., Habig W.H., Jakoby W. B. Mechanism for the several activities of the glutathione S-transferases // The Journal of Biological Chemistry, 1976, Vol. 251, pp: 6183-6188.

63. Mittal C.K., Arnold W.P., Murad F. Characterization of protein inhibitors of guanylate cyclase activation from rat-heart and bovine lung // Journal of Biological Chemistry, 1978; Vol. 253, No. 4, pp: 1266 -1271.

64. Tsikas D., Frolich J.C. Is circulating nitrite a directly acting vasodilator? // Clinical Science, 2002, Vol. 103, part 1, pp: 107-108.

65. Meier R. Studien uber methamoglobinbildung. VII. Nitrit. Arch. Exp. Path. Pharmakol., 1925, Vol. 110, pp: 241-264.

66. Kiese M. The biochemical production of ferrihemoglobin-forming derivatives from aromatic amines and mechanisms of ferrihemogiobin formation // Pharmacological Reviews, 1966, Vol. 18, No. 3, pp: 1091-1161.

67. Mansouri A. Oxidation of human hemoglobin by sodium nitrite-Effect of p-93 thiol groups // Biochemical and Biophysical Research Communications, 1979, Vol. 89, No. 2, pp: 441-447.

68. Brooks J. The action of nitrite on haemoglobin in the absence of oxygen // Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, 1937, Vol. 123, No. 832, pp: 368-382.

69. Kosaka H., Tyuma I. Mechanism of Autocatalytic Oxidation of Oxyhemoglobin by Nitrite // Environmental Health Perspectives, 1987, Vol. 73, pp: 147-151.

70. Huang Z., Louderback J.G., Goyal M., Azizi F., King S.B., Kim-Shapiro D.B. Nitric oxide binding to oxygenated hemoglobin under physiological conditions // Biochimica et Biophysica Acta, 2001, Vol. 1568, No. 3, pp: 252-260.

71. Dejam A., Hunter C.J., Pelletier M.M., Hsu L.L., Machado R.F., Shiva S., Power G.G., Kelm M., Gladwin M.T., Schechter A.N. Erythrocytes are the major intravascular storage sites of nitrite in human blood // Blood, 2005, Vol. 106, No 2, pp: 734-739.

72. Gladwin M.T., Crawford J.H., Patel R.P. The biochemistry of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin: role in blood flow regulation review. // Free Radical Bioogy and Medicine, 2004, Vol. 36, No. 6, pp: 707-717.

73. Tocheva E.I., Rosell F.I., Mauk A.G., Murphy M.E, Side-on copper-nitrosyl coordination by nitrite reductase // Science, 2004, Vol. 304, No. 5672, pp: 867-870.

74. Gladwin M.T., Schechter A.N., Kim-Shapiro D.B. et al. The emerging biology of nitrite anion // Nature Chemical Biology, 2005, Vol. 1, pp: 308-314.

75. Kim-Shapiro D.B., Schechter A.N., Gladwin M.T. Unraveling the Reactions of Nitric Oxide, Nitrite, and Hemoglobin in Physiology and Therapeutics!I Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 2006, Vol. 26, No. 4, pp: 697-705.

76. Liu X.P., Miller M.J.S., Joshi M.S., Sadowska-Krowicka H., Clark D.A., Lancaster J.R. Diffusion-limited reaction of free nitric oxide with erythrocytes // The Journal of Biological Chemistry, 1998, Vol. 273, No. 30, pp:18709-18713.

77. Moore E.G., Gibson Q.H. Cooperativity in dissociation of nitric-oxide from hemoglobin // The Journal of Biological Chemistry, 1976, Vol. 251, No. 9, pp: 2788 -2794.

78. Stamler J.S., Jia L., Eu J.P., McMahon T.J., Demchenko I.T., Bonaventura J., Gernert K., Piantadosi C.A. Blood flow regulation by S-nitrosohemoglobin in the physiological oxygen gradient // Science, 1997, Vol. 276, No. 5321, pp:2034 -2037.

79. Шайтан K.B. Каким образом электрон движется по белку // Соросов-ский образовательный журнал, 1999, № 3, стр: 55-62.

80. Winterbourn С.С., Carrell R.W. Oxidation of human haemoglobin by copper. Mechanism and suggested role of the thiol group of residue beta-93 // The Biochemical Journal, 1977, Vol. 165, No. 1, pp: 141-148.

81. Kharitonov V.G., Sundquist A.R., Sharma V.S. Kinetics of Nitrosation'of Thiols by Nitric Oxide in the Presence of Oxygen // The Journal of Biological Chemistry, 1995, Vol. 270, No. 47, pp: 28158-28164.

82. Санина H.A., Алдошин C.M. Синетез, строение и свойства моделей нитрозильных 2Fe-2S., [lFe-2S] протеинов и перспективы применения их в биологии и медицине // Российский химический журнал, 2004, Том 48, № 4, стр: 12-19.

83. Санина Н.А., Филипенко О.С., Алдошин С.М., Ованесян Н.С. // Известия Академии Наук. Серия химическая, 2000, Том 49, № 6, стр: 1115-1118.

84. Ракова О.А., Санина Н.А., Шилов Г.В., Шульга Ю.М., Мартыненко В.М., Ованесян Н.С. Алдошин С.М. Новый NO-донор: синтез, структура и некоторые свойства комплекса Fe2(n.-SC5H4N)2(NO)4. // Координационная химия, 2002, Том. 28, № 5, стр: 364-369.

85. Королёв A.M., Еременко JI.T. Синтез динитрата изобутендиола и некоторых его производных // Известия академии Наук СССР, Серия химическая, 1972, № 3, стр: 663-665.

86. Королёв A.M., Ерёменко JI.T., Мешихина JI.B., Ерёменко И.Л., Александров Г.Г., Коновалова Н.П., Лодыгина В.П. // Известия Академии Наук. Серия химическая, 2003, № 8, стр. 1763-167.

87. Antonini Е., Brunori М. Hemoglobin and myoglobin in the reactions with ligands, in. Neuberger A, Tatum E.L. (Eds.) // North-Holland research monographs. Fronties of biology. North-Holland Publishing company, Amsterdam-London. 1971, Vol. 21, P. 2-3.

88. Mayhew S.G. The redox potential of dithionite and SO-2 from equilibrium reactions with flavodoxins, methyl viologen and hydrogen plus hydrogenase // European Journal of Biochemistry, 1978, Vol. 85, No. 2, pp: 535-547.

89. Торчинский Ю.М. Сульфгидрильные и дисульфидные группы белков. М.: Наука, 1971, 229 с.

90. Yamada S., Suruga К., Ogawa М., Наша Т., Satoh Т., Kawachi R., Nishio Т., Oku Т. Appearance of nitrite reducing activity of cytochrome с upon heat denaturation // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2002, Vol. 66, No. 10, pp: 2044-2051.

91. Jiantao Pang J., Fan C., Liu X., Chen Т., Li G. A nitric oxide biosensor based on the multi-assembly of hemoglobin/montmorillonite/polyvinyl alcohol at a pyrolytic graphite electrode // Biosensors and Bioelectronics, 2003, Vol. 19, pp: 441 445.

92. Кольман Я., Рём К.Г. Наглядная биохимия М., «Мир», 2000, с. 106107.

93. Мусил Я., Новакова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах. Мир, Москва, 1981,215 с.

94. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств. Вузовская книга, М., 2004, стр. 64.

95. Sakai К. Nicorandil: animal pharmacology // American Journal of Cardiology, 1989, Vol. 63, No. 21, pp: 2J-10J.