Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физические свойства биомолекул в растворах по данным СВЧ-диэлектрометрии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Физические свойства биомолекул в растворах по данным СВЧ-диэлектрометрии"

.її, .

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. В.Н. КАРАЗІНА

ГЛИБИЦЬКИЙ Геннадін Марксович

а

УДК: 577:621.3.029.65

ФІЗИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ БІОМОЛЕКУЛ У РОЗЧИНАХ ЗАДАНИМИ НВЧ-ДІЕЛЕКТРОМЕТРІЇ

03.00.02 — біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фізнко-математичних наук

Харків - 2000

, і t

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України.

Науковий керівник

доктор фізико-математичних наук, професор Малєсв Володимир Якович, Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України, завідувач відділу.

Офіційні опоненти:

-доктор фізико-математичних наук, професор Казанський Вадим

Борисович, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, професор;

-доктор фізико-математичних наук, професор Харкянен Валерій

Миколайович, Інститут фізики НАН України, завідувач відділу

(м. Київ).

Провідна установа

Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України, відділ молекулярної біофізики, м. Харків.

Захист відбудеться " /1$'' ______2000 року о Ж' годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна, 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд.7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім.В.Н.Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Діелектрометрія в надвисокочастотному (НВЧ) діапазоні дозволяє одержати інформацію про стан води в біологічних системах, про конформацію макромолекул та їх гідратацію. Гідратні оболонки біополімерів визначають їх стабільність, структуру та динаміку й відповідають за поглинання більшої частини енергії НВЧ випромінювання. Діапазон міліметрових довжин хвиль є найбільш інформативним для вивчення ступеня гідратації біомолекул та їх взаємодії з електромагнітним полем НВЧ, а одним з основних методів дослідження є метод діелектрометрії. Результатом вимірювань, в загальному випадку, є залежність комплексної діелектричної проникності від частоти, яка характеризує значення втрат і час релаксацій (властиві речовині). З індивідуальних внесків у діелектричний спектр може бути отримана специфічна інформація про структуру гідратної оболонки.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Результати дисертаційної роботи було одержано в межах виконання планових науково-дослідних робіт за темами: “Кварк”, реєстраційний № 81.093.675, постанова Президії АН УРСР № 604 від 25.12.80; “Кварк-2”, реєстраційний № 01.86.0086548, постанова Президії АН УРСР № 474 від 27.12.85; “Кор”, реєстраційний № 01.92 и 027978, постанова Бюро ВФА АН УРСР від 11.12.1991, протокол №10; “Гран”, № 01.96 006110, постанова Бюро ВФА НАН України від 19.12.95, протокол №9.

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було визначення фізичних властивостей біомолекул (ДНК, білка й малих молекул) у розчинах в широкому інтервалі температур на основі аналізу комплексної діелектричної проникності розчинів у надвисокочастотному діапазоні довжин хвиль.

Для досягнення цієї мети були поставлені та вирішені наступні задачі:

1. Розробка НВЧ - діелектрометра на основі методу змінної товщини в сантиметровому діапазоні довжин хвиль.

2. Визначення поглинання електромагнітних хвиль молекулами ДНК та її фрагментів у сантиметровому діапазоні довжин хвиль.

3. Розробка методу вимірювання діелектричних параметрів водних розчинів біомолекул у міліметровому діапазоні довжин хвиль при температурах 3070 °С.

4. Визначення гідратації молекул білка в розчині на прикладі сироваткового альбуміну людини (САЛ) в інтервалі температур 30-60°С.

5. Визначення комплексної діелектричної проникності водних розчинів малих біомолекул (гліцину, сахарози) в інтервалі температур 30-60°С.

Об'єкт дослідження - біомолекули у водних розчинах.

Предмет дослідження - діелектрична проникність розчинів біомолекул та їх гідратація в інтервалі температур 30-60°С.

Методи дослідження - діелектрометрія в надвисокочастотному діапазоні довжин хвиль, ультрафіолетова спектроскопія, гель-електрофорез, віскозіметрія.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Розроблено методику вимірювання комплексної діелектричної проникності розчинів з великими втратами при температурах 20-70°С.

2. В однохвильовому наближенні одержано математичне обгрунтування хвилеводного методу вимірювання комплексної діелектричної проникності із застосуванням герметизованої кювети.

3. Вперше одержано значення комплексної діелектричної проникності в міліметровому діапазоні довжин хвиль розчинів сироваткового альбуміну при концентраціях 10%, 15% і розчинів сахарози при концентраціях 10%, 20% в інтервалі температур 30-60°С та розчинів гліцину при концентрації 20% в інтервалі температур 20-70°С.

4. Встановлено, що гідратація молекул білка знижується при збільшенні температури.

Практичне значення одержаних результатів. Методика вимірювання комплексної діелектричної проникності розчинів з великими втратами дозволяє одержувати дані при температурах 20-70°С. Математичне обгрунтування хвилеводного методу вимірювання може бути застосовано для розрахунків параметрів НВЧ сигналу при використанні герметизованих кювет.

Експериментальні дані про відсутність надлишкового поглинання розчинів нативної та фрагментованої ДНК, закономірності в зміні гідратних властивостей САЛ і діелектричні параметри розчинів сахарози і гліцину у широкому інтервалі температур можуть бути використані при з'ясуванні молекулярних механізмів взаємодії електромагнітних полів міліметрового діапазону з біологічними об'єктами.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих із співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає:

у роботах [1,9] - в участі в постановці біофізичного експерименту, одержанні експериментальних даних, їхньому аналізі; розробці і створенні вимірювального пристрою і вимірюванні коефіцієнта поглинання.

у роботах [2,10] - у розробці схеми діелектрометра, аналізі літературних даних, а також проведенні вимірювань;

у роботі [3] - у постановці експерименту, аналізі літературних даних, розробці змішувача і генератора, одержанні і аналізі експериментальних даних;

з

у роботі [8] - у розробці способу вимірювання проникності без застосування рухливих елементів пристрою;

у роботі [11,12] - у постановці експерименту, проведенні вимірювань і аналізі отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи були представлені й обговорені на: V конференції з спектроскопії біополімерів (Харків, 1984), VI конференції з спектроскопії біополімерів (Харків, 1988), International Conférence on Millimeter and Submillimeter Waves and Application (San-Diego, USA, 1994), International symposium "Physics and Engineering of Millimeter and Submillimeter Waves", (Kharkov, Inst. of Radiophysics and Electronics of National Academy of Sciences of Ukraine, 1994), семінарі Харківського відділення Українського біофізичного товариства (2000).

Публікації. Результати дисертації опубліковані у 13 наукових працях, в тому числі у 7 статтях, 1 авторському свідоцтві, у 5 матеріалах і тезах доповідей національних і міжнародних конференцій і симпозіумів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, З розділів і висновків. Повний обсяг дисертації складає 106 с., містить 21 рисунок і 17 таблиць. Список використаних літературних джерел - 138 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність теми дисертації, сформульовано мета та перелічені задачі, які необхідно вирішити для їх досягнення, вказано новизна та практичне значення, наведено дані про апробацію дисертаційної роботи.

У розділі 1 дисертації проведено аналіз літературних даних про сучасні уявлення щодо взаємодії електромагнітних хвиль НВЧ діапазону з біологічними об'єктами та про дослідження гідратації біомолекул у розчинах. Відзначається, що у зв'язку з високою насиченістю середовища штучно створеними електромагнітними полями уявляються важливими дослідження, в яких розкриваються механізми взаємодії мікрохвиль з біооб'єктами. Проаналізовано результати досліджень взаємодії біополімерів з електромагнітним випромінюванням НВЧ діапазону в широкому діапазоні довжин хвиль - від сантиметрових до субміліметрових. Представлено теоретичні положення, що пояснюють природу взаємодій: як у білках, так і в ДНК теорія передбачає можливість існування коливань, що виявляються в мікрохвильовому діапазоні довжин хвиль. Так, розвинуті моделі дозволяють розраховувати частоти, що знаходяться в міліметровому діапазоні довжин

хвиль і відповідають міждоменним рухам білка. Можливість існування у ДНК коливань субміліметрового діапазону довжин хвиль засновується на припущенні існування далеких кооперативних зв'язків.

Проведено аналіз різних схем діелектрометричних вимірювальних пристроїв і відповідних моделей, що використовуються при розрахунках проникності. Показано, що інтерпретація даних діелеісіричного методу дослідження значно спрощується у випадку вивчення властивостей тих самих зразків на різних частотах. Отримані таким чином дані фіксують спектральні компоненти речовини у розчині, що необхідно для повного аналізу процесів релаксації в зразку. На основі порівняння існуючих на цей час підходів до отримання даних про фізичні властивості біомолекул у розчинах зроблено висновок про перспективність застосування методу діелектрометрії для визначення поглинання розчинів та гідратації біомолекул.

У розділі 2 представлено методичні підходи, що були використані у дослідах розчинів біомолекул методом діелектрометрії.

Особливості розповсюдження електромагнітних хвиль у вимірювальному пристрої характеризуються наявністю відбиття хвиль в декількох шарах, якими є герметизуючі пластини, шар з рідиною та повітрям. Для з'ясування фізичних процесів, що відбуваються у вимірювальній кюветі під час експерименту, була розроблена еквівалентна схема кювети.

' Базовим припущенням моделі є уявлення дифракційного поля в проміжку між торцями вхідного та вихідного хвилеводів ділянкою плоскої хвилі, злегка розмитої на кінцях, що розповсюджується в межах циліндра з діаметром, який дорівнює внутрішньому діаметру хвилевода. Тому з'єднання декількох хвилеводних відрізків круглого поперечного перетину, котрі відрізняються значеннями комплексної діелектричної постійної розчину, що їх заповнює, при малих розмірах шару з розчином сі можна розглядати як спрощену модель, що описує процес поширення потужності в пристрої. Еквівалентна схема кювети зображена на рис. 1.

Вираз амплітуди хвилі А}, що пройшла крізь систему шарів, через амплітуду А|, має вигляд:

А ¡=А і( 1 + V 4)С 12С23С34, (1)

або в загальному випадку

І-п-І

А.=А,(І+У^)ПС]і]+І,

гі

Сі.ім=ехр(іЬі+,^0+іХ1+^)/(1+Уімехр(2іЬіМсіі^м))1 (3)

Ь] - константа розповсюдження, V) - коефіцієнт відбиття.

1 1 1 ... 1...

• / £ 2 с'* е" - е 3, Є 3 -V є'4 -

Є'І ¿5

а,2. <і23 і ¿и о

Рис. 1. Еквівалентна схема кювети.

Відповідно до методу змінної товщини необхідно визначити відношення інтенсивностей сигналів при двох величинах шарів розчину (¿о и (10 +Дс! ) і набіг фаз:

Wм=((Re(A^(d0)))2+(Im(A5(do)))2)/((Re(A5(do+Дd)))J+(Im(Aз(do+Дd)))2)> (4)

0м=aгctg(Im(A5(do+Дd))Лle(A5(do+Дd)))-

-arctg(Im(A5(do+Дd))/Re(A5(do+Дd))). (5)

Відношення інтенсивностей сигналів \УМ, WE (функція поглинання НВЧ потужності в розчині) і різниця аргументів ©м, ©е (функції фазового зсуву НВЧ-хвилі на довжині Дd) є незалежними величинами (позначки М, Е визначають величини, розраховані за моделлю й визначені в експерименті).

В процесі визначення величин е’ і є" розчину вирішуються наступні задачі:

1) пряма задача - знаходження констант К© при вимірюванні речовин з відомими є', є"; при цьому вирішуються рівняння

\ум(сі<ьдаІє\є")-к:*'адо^)=о, (6)

©м(сїлАс1,е',Е*)-Кв0Е(«їо.Аа)*О; (7)

2) оберігша задача - за значеннями WE і 0Е (для розчинів з невідомими є', є”) із отриманих раніш залежностей К\у=Г(№е) і Кє=Д©е) визначаються відповідні

значення констант і при вирішенні системи (6-7) розраховуються величини є', є*.

У роботі вивчалися: розчини ДНК з концентрацією 5 мг/мл, виділеної з Е. соїі, розчини ДНК з концентрацією 6 мг/мл з еритроцитів курчат (препарат фірми “Кеапаї”), розчини сироваткового альбуміну людини з концентрацією 10% та 15% (препарат фірми “Кеапаї”), розчини сахарози з концентрацією 10% та 20% (“Реахим”, чда), розчини гліцину з концентрацією 20% (препарат фірми “Кеапаї”).

Для вимірювання комплексної діелектричної проникності було розроблено відповідні пристрої. Пристрій для вимірювання проникності розчинів у сантиметровому діапазоні довжин хвиль методом змінної товщини містить: генератор НВЧ, направлені відгалужувані, хвилемір, атенюатор, допоміжний детектор НВЧ, цифрові вольтметри, феритовий вентиль, підсилювачі вимірювальну секцію.

Дня дослідження властивостей рідин у міліметровому діапазоні довжин хвиль при підвищених температурах був розроблений діелектрометл, який містить: НВЧ генератор, феритові вентилі й направлені відгалужувачі, вимірювальні атенюатор та фазообертач, вимірювальну кювету.

Коефіцієнт поглинання визначається при закритому каналі порівняння виміром продетектованих сигналів ^ і іг, що відповідають двом товщинам розчину Х| і Х}.-

а = (1п(^І1))/2(Х2-Х1). (8)

Фазова постійна вимірюється звичайним мостовим методом, тобто визначаються показання фазообертача фі і ф2 для відповідних довжин шару речовини Х| і Х2 при встановленні нульового балансу на детекторі:

Р = (Фі-Ф2)/(Х,-Х2). (9)

За значеннями а і Р легко обчислити дійсну є' і уявну є" частини комплексної діелектричної проникності для довільної довжини хвилі:

є' = Жц, + (ХУ2п)2(Р2 - а2), (10)

е" = 2(Х/27і)2аР, (II)

де \ - довжина хвилі у вільному просторі, Х,р - критична довжина хвилі.

Для забезпечення стабільності геометричних параметрів при перезавантаженні розчинів, було розроблено діелектрометр з кюветою, яка не потребує розбирання при перезавантаженні. Крім того, для підвищення

чутливості було застосовано супергетеродинну систему реєстрації сигналу. Діелектрометр містить генератор та гетеродин, виконані на діодах Ганна, які випромінюють НВЧ сигнал на частотах 44.0 і 44.05 ГГц відповідно. Вимірювання поглинання і фазового зсуву сигналу у кюветі проводилися за допомогою каліброваних вимірювального атенюатора і фазообертача. Смуги пропускання підсилювача і селективного мікровольтметра СМВ складають відповідно 10 МГц і 1 кГц, чутливість описаної схеми не менше 115 дБ.

У розділі 3 наведено результати досліджень властивостей розчинів молекул за даними НВЧ-діелектрометрії.

Дослідження поглинання розчинами ДНК НВЧ випромінювання в діапазоні 9-12 ГГц було проведено для перевірки теоретичних уяв і експериментальних результатів інших авторів. Зразками для досліджень були:

1. Розчин високомолекулярної ДНК, виділеної з E. coli.

2. Розчин низькополімерної ДНК з еритроцитів курчат, а також її фрагментів, які були отримані після обробки розчину ультразвуком.

3. Розчин фрагментів ДІЖ з E. coli, що були отримані ферментативним гідролізом.

За низькополімерний зразок було взято препарат фірми “Reanal” -еритроцитарну ДНК. Вимірювання було виконано також з розчинами, що містять фрагментовані двома методами молекули ДНК - ультразвуковим опроміненням і гідролізом за допомогою ферменту дезоксирибонуклеази. Значення концентрації ферменту складало 0.1 мг/мл; час опромінення ультразвуковими хвилями і частота складали 80 хвилин і 22 кГц, відповідно.

Аналогічна серія зразків була підготовлена з ДНК, виділеної з E. coli. Для контролю величини довжин фрагментів ДНК, отриманих як опроміненням ультразвуком, так і розщепленням ДНКазой, фрагменти ДНК аналізувалися за допомогою гель-электрофорезу.

Контрольні вимірювання в діапазоні 9-12 ГГц параметрів води і розчинів солей показали, що значення абсолютних коефіцієнтів поглинання відрізняються від значень, відомих за літературними даними, не більш як на 3%.

Результати вимірювань подано в табл.1. Відносні коефіцієнти поглинання для розчинів нативної (P’n) і опроміненої ультразвуком (Руз) ДНК із еритроцитів курчат (з концентрацією 5 мг/мл) близькі до одиниці, як і величини середніх значень коефіцієнтів Р'ф той самой ДНК з концентрацією 6 мг/мл, але фрагментованої ферментом ДНКазой. Для аналогічних розчинів ДНК з E. coli з концентрацією 5 мг/мл відповідні коефіцієнти поглинання для нативної ДНК (P"n) і ДНК, фрагментованої ДНКазой (Р"фі), також не відрізняються від одиниці.

Таблиця 1.

Відносні коефіцієнти поглинання розчинів нативної та фрагментованої ДНК у

діапазоні 9-12 ГГц.

F, ГГц P'n P'n Р уз Р'ф Р"Фі Р"ф2

8.81 0.9910.01 1.02±0.01 0.98±0.01 1.0110.01 1.0110.01 1.0010.01

9.41 0.99±0.01 1.00±0.01 1.0010.01 1.0010.01 1.0110.01 1.0010.01

9.81 0.9910.01 l.OQtO.Ol 1.00Ю.01 1.0010.01 1.0110.01 1.0010.01

10.08 . 1.00Ю.01 - 0.99Ю.01 1.01Ю.01 1.0110.01

10.24 1.00Ю.01 . 0.99Ю.01 • - 1.0ІЮ.0!

10.90 0.99±0.01 - 0.9910.01 - - 1.0010.01

11.26 0.9910.01 - 0.9910.01 - - 1.01Ю.01

Отримані дані також не дозволяють зробити висновок про зміну поглинання під час дії ферменту: відносні коефіцієнти поглинання розчину ДНК в залежності від часу дії ДНКази практично не відрізняються від одиниці.

Y зв'язку з тим, що зменшення в'язкості розчину спостерігалося практично відразу після розчинення ферменту, контроль за розміром сигналу виконувався в перші секунди і хвилини після введення ферменту. Навіть невелика зміна коефіцієнта поглинання (на декілька відсотків) повинна була б привести до помітної зміни значення вихідного сигналу; однак такого ефекту зареєстровано не було. Таким чином, дослідження показало відсутність поглинання НВЧ випромінювання високополімерною ДНК з Є. coli і коротких фрагментів цієї ж ДНК, а також низькомолекулярної ДНК.

Інша група результатів має відношення до дослідження зміни ступенів гідратації зі зміною температури. Дані вимірювань діелектричних характеристик 10% і 15% розчинів сироваткового альбуміну людини (САЛ) подано в табл. 2 і табл. 3. З таблиць видно, що поглинання і фазовий зсув зменшуються, коли температура розчину підвищується.

Таблиця 2.

Діелектричні характеристики 10% розчину CAJI.

т,°с а, неп/мм ß, рад/мм є' Е*

23 2.11 ±0.06 4.0±0.2 16.912.3 24.6±1.4

зо 2.1310.06 4.2±0.2 19.612.4 26.311.5

40 2.1310.06 4.6±0.2 23.912.7 28.3±1.5

47 2.0810.06 4.7±0.2 26.512.7 28.611.5

53 2.00Ю.06 4.9±0.2 28.6±2.8 28.311.5

60 1.91 ±0.06 5.0±0.2 31.3±2.5 27.7±1.4

Таблиця 3.

Діелектричні характеристики 15% розчину САЛ.

Т,°С а, неп/мм Р, рад/мм є' є”

23 1.97±0.06 4.010.2 17.712.3 22.811.3

30 1.9810.06 4.110.2 19.212.4 23.611.3

40 1.9810.06 4.410.2 23.112.6 25.511.4

50 1.9210.06 4.710.2 26.912.7 26.211.4

60 1.76Ю.06 4.8Ю.2 30.212.8 24.911.3

65 1.67Ю.06 4.8Ю.2 30.312.8 23.511.3

Як видно з табл. 2 і 3, відносні зміни коефіцієнтів поглинання і фазової постійної практично еквівалентні для розчину білка і для води: так, для води загасання при 60°С на 18.4% більше, ніж при 30°С, а для розчину білка - на 18.3%; розмір фазового зсуву для розчину при температурі 60°С склав 88% від значення фазового зсуву при 30°С, а для води - 85%. З іншого боку, відношення величини поглинання для води при 50°С до величини поглинання при 23°С склало 4.8% у бік зменшення, а для розчину САЛ - 2.6% у той же бік; відношення відповідних коефіцієнтів фазових зрушень при цих же температурах для води склало 24,1% у бік збільшення, а для розчину САЛ -17.9% також у бік збільшення. Тому можна припустити, що з підвищенням температури змінюються не тільки властивості води, але й характер взаємодії води з білком.

Розрахунок гідратації проводився за формулою

Дє,=рс [(є0-єо„і)У+(є0-&»і)\Ч, (12)

де величина Де, = еи-Єр, визначається різницею статичних проникностей води та розчину; р - коефіцієнт, який залежить від форми молекули; с - концентрація (у грамах розчиненої речовини на один грам розчину);

V =0.74 - питомий об'єм розчиненого білка; W- об’єм зв'язаної води. Таким чином, вираховуючи із експериментальних даних значення величини Єр5, за допомогою виразу (12) ми можемо знайти кількість зв'язаної води, що відповідає одному граму розчиненого білка. При обчисленні гідратації білка як геометричну модель молекули був взятий еліпсоїд обертання з відношенням осей а:Ь=4; значення коефіцієнта р=1.6.

Розраховані значіння ступенів гідратації W (в грамах води на один грам білка) для 10% і 15% розчинів САЛ наведено на рис.2.

Рис.2. Значення ступенів гідратації V/ (в грамах води на один грам білка).

• - 10% САЛ, о - 15% С АЛ

З приведених даних видно, що при підвищенні температури відбувається зменшення ступеню гідратації 10% білка у розчині від одного грама води на один грам білка при 23°С до 0.16 г при 60°С, тобто на 0.84 г води на один грам білка; для 15% розчину зменшення гідратації спостерігалося від 0.41 г білка на один грам води при 23°С до 0.02 г води на один грам білка при 60°С, або на

0.39 г води на один грам білка. Крім того, з отриманих даних можна зробити висновок, що при збільшенні концентрації білка ступінь його гідратації зменшується для всього інтервалу температур.

Зменшення гідратації може бути пояснено з точки зору двох граничних випадків:

1) в першому випадку розглядається розведений розчин білка, в якому головний внесок у зміну взаємодії розчину з електромагнітним полем міліметрового діапазону довжин хвиль дають зміни в гідратних оболонках окремих макромолекул, що не взаємодіють між собою у розчині;

2) у другому випадку розглядається “конденсований стан”, коли контактують макромолекули, об'єднані внаслідок процесу агрегації.

Як у першому, так і в другому випадку зменшення кількості зв'язаної води може пояснюватися молекулярними перебудовами всередині та на поверхні білкової глобули; у другому випадку зменшення кількості зв'язаної води може відбуватися внаслідок зменшення кількості міст зв'язування за рахунок молекулярних груп, що конкурують з водою.

На рис. З, 4 наведено залежності складових комплексної проникності (позначених як є’5ю.2о, е"5ш.2о) від температури, які були розраховані для 10%, 20% розчинів сахарози.

е’.е"

Рис.З. Діелектричні параметри 10% розчину сахарози: • -є',ю, о - є",ю

е’.е"

Рис.4. Діелектричні параметри 20% розчину сахарози: • -є'й0, о - є",2о

Для визначення залежності зміни властивостей розчинів сахарози від концентрації було проведено розрахунок відносних змін складових комплексної проникності за формулами

^е'іо~(є'ж-є'іоУє'ж, (13)

^Б 20 (^ і*“Е 2о)/Б ш» (14)

<іє'' І о=(е"ж-е" І о)/е"и, (15)

^Б"20=(е"*-Е"20У Е"«> (16)

а також їх відношень для відповідних температур (рис.5):

є'іо/2о= ^е'ц/ гіє'го» (17)

Е"і(У20= ^"іс/dБ"20, (18)

де е'„» е"„ - складові комплексної проникності чистої води.

На рис.6 наведено значення складових комплексної проникності (позначених як б'гл, б"гя), які були розраховані для 20% розчину гліцину.

Для розрахунку статичної діелектричної проникності необхідні дані про значення комплексної діелектричної проникності розчинів гліцину в широкому діапазоні частот.

Рнс.5. Залежність відносних значень е' Рис.6. Діелектричні параметри 20%

і е" від температури: розчину гліцину: • -є'гл. о - e"„

• * С* 10/20. О ■ є” 10/20

З отриманих у результаті проведеного дослідження даних можна зробити висновок, що жодна з біофізичних моделей, які пояснюють механізми впливу електромагнітного випромінювання на біооб'єкти, не є повною, якщо не брати до уваги один з головних чинників - взаємодію електромагнітного поля з водою.

ВИСНОВКИ

1. Методика вимірювання діелектричної проникності рідин, яка розвинута, дозволяє визначати діелектричні параметри розчинів з великими втратами у НВЧ діапазоні довжин хвиль в інтервалі температур 20-70°С.

2. Отримано математичне обгрунтування в однохвильовому наближенні хвилеводного методу вимірювання комплексної діелектричної проникності із застосуванням герметизованої кювети.

3. Розчини ДНК із E. coli у сантиметровому діапазоні довжин хвиль, а також розчини той самой ДНК, але фрагментованої ультразвуком або ферментом ДНКазой (при різних концентраціях) не мають надлишкового поглинання відносно розчинника.

4. Вперше одержано значення комплексної діелектричної проникності розчинів сироваткового альбуміну людини при концентраціях 10%, 15% і розчинів сахарози при концентраціях 10%, 20% в інтервалі температур 30-60°С,

розчинів гліцину при концентрації 20% в інтервалі температур 20-70°С, що були виміряні у міліметровому діапазоні довжин хвиль.

5. Встановлено, що гідратація молекул білка (сироваткового альбуміну людини) при концентраціях 10%, 15% в інтервалі температур 30-60°С знижується при збільшенні температури.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Maleev V. Ya., Kashpur V.A., Glibitskiy G.M., Krasnitskaya A.A., Veretelnik E.V. Does DNA absorb microwave energy? Il Biopolymers.- 1987.- №9.-P.1966-1970.

2. Глибицкий Г.М., Кашпур В.A. Метод измерения диэлектрической проницаемости в миллиметровом диапазоне растворов биоматериалов в зависимости от температуры // Исследование взаимодействия электромагнитных волн миллиметрового и субмиллиметрового диапазонов с биологическими объектами. -Киев, 1989.-С. 10-14.

3. Глибицкий Г.М., Ижик Э.В. Генератор и смеситель СВЧ миллиметрового диапазона длин волн // Научное приборостроение в миллиметровом и субмиллиметровом диапазонах радиоволн. -Харьков, 1992,- С. 90-94.

4. Glibitskiy G.M. Microwave measurement receiver with frequency modulation // Intem. J. Infra-Red and Millimeter Waves.-1996.- V.17, №12.-P. 76-79.

5. Глибицкий Г.М. Диэлектрические свойства водных растворов сахарозы на частоте 44 ГГц в диапазоне температур 30-60°С // Радиофизика и электроника.- 1997.-Т. 2, № 2.-С. 156-159.

6. Глибицкий Г.М. Применение электродинамической модели при измерениях диэлектрической проницаемости водных растворов // Вісн. ХДУ.-1999.-№450. Біофіз. вісн.-№2.-С. 31-34.

7. Глибицкий Г.М. Свойства растворов глицина в интервале температур 20-70°С по данным СВЧ-диэлектрометрии и вискозиметрии // Там же. -№466. Біофіз. вісн.- №З.-С. 44-46.

8. А.с. 1195229 СССР, МКИ G 01 N 22/00. Устройство для определения диэлектрической проницаемости растворов / Г.М. Глибицкий, В.А. Кашпур, В .Я. Малеев (СССР). №3583946/24-09; Заявлено 25.04.83; Опубл. 30.1 1.85, Бюл. №44. - 3 с.

9. Кашпур В.А., Малеев В.Я., Глибицкий Г.М. Микроволновое поглощение растворов ДНК // Тр. V конф. по спектроскопии биополимеров. -Харьков (У край на).-1984.-С. 110-111.

Ю.Глибицкий Г.М., Кашпур В.А. СВЧ -диэлектрометр для исследования биополимеров // Тр. VI конф. по спектроскопии биополимеров. -Харьков (Украина).- 1988.-С.96-97.

П.Кашпур В.А., Глибицкий Г.М., Малеев В.Я., Чмутов О.В. Термодиэлектрические свойства растворов некоторых белков // Тр. VI конф. по спектроскопии биополимеров. -Харьков (Украина).-1988.-С. 159160.

12.GHbitskiy G.M., Izhyk E.V., Veremey V.V. The measurement chamber for liquid dielectrics // Proc. International Conf. on Millimeter and Submillimeter Waves and Application.- San-Diego (USA), 1994. №2211.-P.628-632.

13.GIibitskiy G.M. Supergeterodyne with the amplitude modulation and his application // Proc. International Conf. on Physics and Engineering of Millimeter and Submillimeter Waves. - Kharkov (Ukraine), 1994.-V. 3.- P. 456457.

АНОТАЦІЯ

Глибицький Г.М. Фізичні властивості біомолекул у розчинах за даними НВЧ-діелектрометрії. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2000.

Розвинуто методику і отримано математичне обгрунтування хвилеводного методу вимірювання комплексної діелектричної проникності рідин в інтервалі температур 20-70°С. Встановлена відсутність надлишкового поглинання відносно розчинника розчинів ДНК із Е.со1і, нативної ДНК з еритроцитів курчат і той самой ДНК, фрагментованої ультразвуком або ферментом ДНКазой. Одержано значення величин комплексної діелектричної проникності, що були виміряні в міліметровому діапазоні довжин хвиль: розчинів сироваткового альбуміну при концентраціях 10%, 15% і розчинів сахарози при концентраціях 10%, 20% в інтервалі температур 30-60°С, розчинів гліцину при концентрації 20% в інтервалі температур 20-70°С. Визначено значення ступенів гідратації молекул сироваткового альбуміну.

Ключові слова: діелектрична проникність, міліметровий діапазон довжин хвиль, нуклеїнова кислота, білок, гідратація, сахароза, гліцин.

АННОТАЦИЯ

Глибицкий Г.М. Физические свойства биомолекул в растворах по данным, СВЧ - диэлектрометрии. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физикоматематических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Харьковский национальний университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2000.

Развита методика и получено математическое обоснование волноводного метода измерения комплексной диэлектрической проницаемости жидкостей в интервале температур 20-70°С. Установлено отсутствие избыточного поглощения относительно растворителя растворов ДНК из Е. coli, нативной ДНК из эритроцитов цыплят и той же ДНК, фрагментированной ультразвуком или ферментом ДНКазой. Получены значения величин комплексной диэлектрической проницаемости, измеренные в миллиметровом диапазоне длин волн: растворов сывороточного альбумина при концентрациях 10%, 15% и растворов сахарозы при концентрациях 10%, 20% в интервале температур 30-60°С, растворов глицина при концентрации 20% в интервале температур 20-70°С. Определены значения степеней гидратации молекул сывороточного альбумина.

Ключевые слова: диэлектрическая проницаемость, миллиметровый

диапазон длин волн, нуклеиновая кислота, белок, гидратация, сахароза, глицин.

SUMMARY

Glibitskiy G. М. Physical properties of biomolecules in solutions according to the data of microwave dielectrometry. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.02 - Biophysics. -Karazin National Kharkov University, Kharkov, 2000.

The electrodynamic model of measuring cell taking into account appearance reflected waves in the dielectric elements of cuvette is worked out. The articulation of several waveguide intervals of round transversal section which differ by the values of the dielectric permittivities is considered as a simplified model describing the process of spreading of the power in the cell. The method of the calculation of the parameters of the output signal of measuring cell on its waveguide model with allowance of influence of reflections from layers with different dielectric parameters is developed.

The installation for the metering of the dielectric losses of liquids in santimeter band of the lengths of waves is described; the wave length in a measuring cell was

assumed optimal at condition that all re-reflections in solution (from the walls of cuvette and from the ends of waveguides) practically are absent and the made up value is not less then 6 mm.

Schemes of the dielectrometers intended for measurement composing the permittivity of liquids with large losses at temperature interval 30-60°C in millimeter range of the band of the lengths of waves are presented. The procedure of the measurement of the absorption and the phase shift in the cell consisting of the balancing of microwave bridge as to the amplitude and phase at two values of gaps between input and output waveguides is described. The dielectric characteristics of distilled water are found in the temperature interval 23-80°C; the data on the frequency dependence of the parameters of water for 20°C are also given.

The investigation of the microwave power absorption by solutions of the high-molecular DNA in the interval of frequencies 9-12 GHz was carried out. The DNA solution distinguished from E. coli, solution of low-molecular DNA from the erythrocytes of chickens and its fragments received after the processing of solution by ultrasound and DNA solution received by fermentative hydrolysis were the samples under investigation. The relative coefficients of absorption for solutions of native and DNA irradiated by ultrasound from the erythrocytes of chickens (with concentration of 5 mg/ml) are close to 1, as the values of the average values of coefficients of this DNA with concentration of 6 mg/ml, but fragmented by ferment DNase. The coefficients of absorption for native DNA and DNA fragmented by DNase for similar solutions of DNA from E. coli as well as the relative coefficients of the absorption of DNA solution depending on the time of action Dnase do not differ from 1 either.

The meanings of the values of the complex permittivity of the solutions of the human serum albumen in the interval of temperatures 20-70°C measured in range of mm wavelengths at concentrations 10% and 15% are obtained; the values of the hydration of molecules are defined. From the calculated values of hydration (in the g water per 1 g protein) and the quantity of the molecules of water per one molecule of protein for 10% and 15% solutions the human serum albumen may be inferred, which, at the temperature rise, results in the decrease of the hydration of 10% solution from 1 g of water per 1 g of protein at 23°C to 0.16 g at 60°C, i.e. 0.84 g of water per 1 g of protein; for 15% solution the decrease of hydration composed from 0.41 g of protein per 1 g of water at 23°C to 0.02 g of water per 1 g of protein at 60°C, or 0.39 g of water per 1 g of protein. Besides, from received information it may be concluded that at the increasing of the concentration of protein the degree of its hydration decreases for the whole interval of temperatures.

The meanings of the complex permittivity of the solutions of saccharose in the interval of temperatures 30r60°C measured in range of mm wavelengths at

concentrations 10% and 20% are received. The decrement change at 30-45°C for the values of e'io and e'20 was, in the average, 42% (44% for the values of e"|0, £"20); the change of decrement in the interval of temperatures 50-60°C the e'10 and e'2o averaged 67% (79% for values e"i0, £"20)- These results are evidence of the absence of the linear dependence between the concentration of the solution of saccharose and values composing its complex permeability. The meanings of the values of the complex permittivity of the solutions of glycine in the interval of temperatures 20-70°C measured in the range of mm wavelengths at the concentration of 20% are received.

Key words: permittivity, range of mm wavelengths, nucleic acid, protein, hydration, saccharose, glycine.