Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фетальные клетки в материнском кровообращении

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидат биологических наук, Бабочкина, Татьяна Ивановна, Базель

62 12/37

Фетальные клетки в материнском кровообращении: Выделение фетальных клеток и FISH анализ

Диссертация

на соискание научной степени

Доктора Философии

Представленная на Философско-естественно-научный факультет

Университета г. Базеля

От

Татьяны Ивановны Бабочкиной,

гражданки России

Базель, 2005

Оглавление

Оглавление..........................................................................2

Резюме................................................................................6

Цели...................................................................................8

1. Введение.........................................................................10

1.1. Инвазивный метод исследования крови, недостатки его использования.....................................................................10

1.2. Альтернативная неинвазивная диагностика...........................11

1.2.1. История открытия фетальных клеток и внеклеточной ДНК в материнском кровообращение................................................11

1.2.2. Разнообразие клеток плода в материнском кровообращение...................................................................12

1.3. Неинвазивная пренатальная диагностика на эмбриональных эритробластах, выделенных из крови беременных женщин: текущее положение дел.....................................................................16

1.З.1.. Количество клеток плода в материнском кровообращение при нормальных и анеуплоидных беременностях..........................16

1.3.2. Выделение эмбриональных эритробластов из материнской крови.................................................................................17

1.3.2.1. Метод градиентного центрифугирования.........17

1.3.2.2. Поверхностные антигены эритробластов.........18

1.3.2.3. Устройства для сортинга меченных антителами клеток................................................................................20

1.3.2.4. Обогащение НозейеБер...............................21

1.3.2.5. Галактозо-специфичное обогащение посредством агглютинина из сои, галактозо-специфичного лектина...................21

1.3.3. Анализ и идентификация обогащенных клеток............23

1.3.3.1. Идентификация эмбрионального происхождения изолированных из материнской крови эритробластов.....................23

1.3.3.1.1. Морфологические критерии..............23

1.3.3.1.2. Мечение фетального гемоглобина......23

1.3.3.2. Анализ эмбриональных эритроб ластов,

обогащенных из крови беременных женщин................................24

1.3.3.2.1. Цепная полимеразная реакция (ПЦР) ...25

1.3.3.2.2. Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH)................................................................................25

1.3.4. Клинические испытания неинвазивной диагностики.....26

1.3.5. Ограничения клинического применения неинвазивной диагностики........................................................................27

1.3.6. Роль и место эмбриональных клеток в неинвазивной пренатальной диагностике......................................................27

2. Результаты.....................................................................29

2.1. Оптимизация FISH на образцах крови пуповины.....................29

2.1.1. Предобработка. Пепсин, протеиназа К и HCL..............30

2.1.2. Предобработка препаратов при помощи микроволнового излучения...........................................................................30

2.1.3. Выбор проб для FISH анализа эритробластов...............32

2.1.4. Мечение Y хромосомы двумя различными пробами в одношаговой XYY-FISH гибридизации, в которой Y-хромосома была помечена двумя различными пробами (a- and Ill-satellite) того же самого цвета..............................................................33

2.1.5. Разработка методов иммуноцитохимии (ICC) на гликофорин (GPA) окрашенных клетках (идентификация клеток плода) и последующей FISH гибридизации (генетическая диагностика) на препаратах крови пуповины...............................34

2.1.6. Выводы по оптимизации FISH гибридизации на образцах пуповинной крови.................................................................35

2.2. FISH анализ на образцах из материнской крови.......................38

2.2.1. XYVysis FISH.....................................................38

2.2.2. XYY Qbiogene FISH..............................................40

2.2.3. XY Vysis FISH на препаратах, обработанных микроволновым излучением...................................................42

2.2.4. XYY Qbiogene FISH на препаратах, обработанных микроволновым излучением...................................................44

2.2.5. Анализ структуры популяции эритробластов при беременностях с плодом мужского пола по отдельности с обнаруженным Y сигналом и без Y сигнала................................47

2.2.6. XYY Qbiogene FISH на препаратах обработанных пепсином...........................................................................49

2.2.7. Анализ FISH с Qbiogene Хс- и 18с- хромосомными пробами.............................................................................50

2.2.8. Заключение: FISH на образцах материнской крови.......53

2.3. Сравнительный анализ эритробластов, культивированных при различных концентрациях кислорода........................................56

2.4. FISH гибридизация после инкубации при 3%- и 20%-ой концентрациях кислорода.......................................................62

2.5. Измерения эритробластов..................................................63

2.6. TUNEL (Deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling) анализ эритробластов................................................68

2.6.1. TUNEL и FISH анализ ядер эритробластов из крови пуповины...........................................................................68

2.6.2. TUNEL анализ ядер эритробластов в материнской

крови.................................................................................69

2.7. Детекция клеток плода в цельной крови................................73

2.8. Оценка возможностей галактозо-специфического обогащения посредством агглютинина из сои, галактозо-специфичного лектина, для изоляции эритробластов из материнской крови.......................78

2.9. Спектральный морфометрический сравнительный анализ эритробластов из материнской и пуповинной крови......................83

2.10. Единичных клеток ПЦР анализ эритробластов (Taqman), изолированных, при помощи Laser Microdissection and Pressure Catapulting (LMPC) технологии................................................88

2.10.1. ПСР анализ в реальном времени эритробластов полученных путем микродиссекции из крови пуповины...............88

2.10.2. Единичных клеток ПЦР анализ с Taqman пробами эритробластов, микродиссектируемых из материнской крови..........92

3. Дискуссия.......................................................................96

3.1. Большинство эритробластов в материнской крови невозможно проанализировать посредством FISH анализа..............................96

3.2. Обогащение посредством галактозо-специфического агглютинина из сои, галактозо-специфичного лектина, для изоляции эритробластов.....................................................................99

3.3. XYY - FISH анализ на цельной крови.................................100

3.4. Спектральный морфометрический сравнительный анализ эритробластов из материнской и пуповинной крови.....................102

3.5. Будущие направления......................................................104

4. Материалы и методы......................................................107

5. Литература....................................................................118

Резюме

На сегодняшний день является актуальной задача развития безопасных, эффективных, неинвазивных альтернативных методик для предродовой диагностики. Для решения этой задачи нами разработаны новые методы изоляции и анализа клеток плода из крови беременных женщин. Хотя эмбриональные клетки были обнаружены еще в 1893 в материнской крови, эффективная методика для неинвазивного анализа окончательно все еще не найдена. Эта ситуация существует на сегодняшний момент вследствие того, что с одной стороны, количество эмбриональных клеток в материнской крови очень незначительно, 1 эмбриональной клетка на 106- 107 материнских ядерных клеток, и с другой стороны, что эмбриональные клетки не имеют никаких специфичных клеточных маркеров.

Наше исследование было сосредоточено на совершенствовании, развитии и оценке новых эмбриональных методов обогащения клеток. Одна из задач этого исследования состояла в том, чтобы оценить галактозо-специфическое обогащение посредством агглютинина из сои, галактозо-специфичного лектина, для изоляции эритробластов из материнской крови, и сравнить эту новую методику с обычной методикой CD71 выделения.

Следующая проблема, которую необходимо решить, состоит в том, что надо проанализировать хромосомное содержание тех немногих эмбриональных клеток, которые выделяют из материнского кровообращения. Так как эмбриональные эритробласты активно не делятся, то невозможно использовать стандартные цитогенетические методы. Относительно этой задачи были развиты и проанализированы следующие методы для анализа эмбриональных клеток: многоцветная флюоросцентная in situ гибридизация (FISH) и единичных клеток полимеразная цепная реакция (ПЦР). В опубликованных ранее научных трудах сообщается, что эффективность обнаружения эмбриональных клеток при помощи FISH анализа для X и Y хромосом является очень низкой. Мы попробовали оптимизировать процедуру FISH гибридизации, применяя различные методики обработки ядра и сравнивая различные виды флуоресцентных проб, используя в качестве модельной системы - эритробласты, изолированные из крови пуповины. Затем после оптимизации, лучшие FISH протоколы использовались для FISH гибридизации на эмбриональных клетках, обогащенных из материнской крови, причем каждая эмбриональная клетка была сфотографирована до гибридизации, а ее местоположение было «запомнено» с

помощью электроники, используя, автоматизированный искатель местоположения. Анализ FISH сигналов гибридизации на эритробластах из материнской крови показал, что приблизительно половина клеток были негативны после гибридизации. Дополнительно, мы проверили, связана ли вероятность позитивного FISH сигнала с размером ядра. Мы сравнили эритробласты из материнской крови с эритробластами из крови пуповины. Морфометрический анализ показал существенное различие в размере между эритробластами, циркулирующими в материнской крови и в крови пуповины. Дополнительно, мы хотели определить, препятствовало ли присутствие фрагментированной ДНК успешному FISH анализу. Результаты Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling (TUNEL) анализа показали, что эффективному FISH анализу препятствовало присутствие плотных ядер, а не ядер, содержащих фрагментированную ДНК. Для нас было интересно найти возможные причины сокращения размера ядер эритробластов в материнском кровообращении. Мы выдвинули гипотезу, что изменения в размерах ядра эритробластов могли быть приписаны различиям в концентрациях кислорода в эмбриональной и материнской системах кровообращения. Мы проверили и подтвердили эту гипотезу, используя в качестве модельной системы культивирование при низких и нормальных концентрациях кислорода.

Другая интересная задача для нас была - подробно исследовать организацию ядра и цитоплазмы эритробласта на спектральном уровне, используя спектральный морфометрический анализ изображения, и затем сравнить результаты, полученные для эритробластов из материнского кровообращения и крови пуповины. Этот анализ также подтвердил различия между эритробластами в материнской и в пуповинной крови. На сегодняшний день остается нерешенным вопрос, какие эмбриональные клетки лучше всего подходят для анализа. Наша задача состояла в том, чтобы оценить способность выполнить FISH анализ эмбриональных клеток, в цельной крови без какого либо обогащения. Наша последующая задача состояла в том, чтобы улучшить детекцию эмбриональных клеток, применяя XYY FISH анализ как альтернативу традиционному XY FISH анализу.

Как сообщено многими исследователями, эффективность ПЦР анализа в режиме реального времени больше чем эффективность FISH анализа. Мы проверили эмбриональный статус диссектированных при помощи лазерной микродиссекции и собранных в пул эритробластов с маленьким плотным ядром, которые, были невосприимчивы к FISH анализу, при помощи ПЦР метода.

Кроме того, мы исследовали возможности единичных клеток ПЦР анализа в режиме реального времени на эритробластах, выделенных при помощи метода галактозо-специфического обогащения посредством агглютинина из сои, галактозо-специфичного лектина, и микродиссектированных при помощи технологии лазерной микродиссекции и катапультирования лазерным давлением (LMPC) с предметных стекол, покрытых мембранами.

Все вышеперечисленные задачи составляли объект нашего исследования. В данной работе мы даем объяснение выполненных исследований в деталях.

Цели

Главная цель этого исследования - развитие неинвазивных методик анализа клеток плода в кровообращение беременных женщин для предродовой диагностики. В частности, целями нашего исследования являлось решение следующих задач:

1) оценить метод галактозо-специфического обогащения посредством агглютинина из сои, галактозо-специфичного лектина для выделения эритробластов из материнской крови и сравнить это обогащение с обычным CD71 обогащением;

2) оптимизировать эффективность FISH анализа на клетках из крови пуповины, сравнивая различные типы проб и различные протоколы;

3) после оптимизации применить протоколы FISH анализа на образцах из материнской крови;

4) проверить, зависит ли эффективность FISH анализа от выбора хромосомы (FISH гибридизация с пробой, специфичной к 18 хромосоме);

5) сравнить морфометрические параметры, в соответствие с FISH сигналами при анализе эритробластов, выделенных из крови беременных женщин и крови пуповины;

6) проверить апоптозный статус эритробластов в крови беременных женщин и крови пуповины, применяя TUNEL метод;

7) проверить эффект влияния концентрации кислорода на количество эритробластов и их морфометрические свойства на примере модели культивирования в условиях низкой и нормальной концентрациях кислорода;

8) оценить и сравнить способность выполнить XY-FISH, YY-FISH и XYY-FISH анализ эмбриональных клеток без обогащения из крови беременных женщин;

9) проанализировать и сравнить хроматиновую организацию и организацию цитоплазмы эритробластов, выделенных из крови беременных женщин и крови пуповины на спектральном уровне;

10) проверить эмбриональный статус эритробластов, характеризующихся отсутствием какого-либо FISH сигнала посредством единичных клеток ПЦР анализа в режиме реального времени с Tagman пробами, после их изоляции посредством технологии LMPC;

11) оптимизировать единичных клеток ПЦР анализ в режиме реального времени после метода галактозо-специфического обогащения посредством агглютинина из сои, галактозо-специфичного лектина.

1. Введение

1.1. Инвазивный метод исследования крови, недостатки его использования.

В настоящее время, пренатальная диагностика генетических характеристик плода основывается на инвазивных процедурах таких как: амниоцентез, исследование ворсинок хариона и анализ эмбриональной крови. Однако все эти подходы повышают риск потери плода и могут вызывать осложнения для матери, кроме того, для всех них остается нерешенной проблема надежности и точности результатов. Амниоцентез является трудоёмким анализом, его результат зависит от результатов культивирования. В 1 % образцов амниотической жидкости, к сожалению, не возможно произвести успешное культивирование. Кроме того, у 0.5 % образцов наблюдается явление хромосомного мозаицизма (Hsu and Perlis, 1984). Серьезные осложнения у беременных женщин, такие как брюшные судороги, влагалищные кровотечение и потеря амниотической жидкости, происходят у 3 % женщин. Иногда, существенная потеря амниотической жидкости может вызывать последующие осложнения у новорожденных (Finegan et al., 1990). В рандомизированном эксперименте, в который были вовлечены 4606 женщин с невысоким риском осложнений, в возрасте 25-34 лет, было показано, что риск спонтанных выкидышей вследствие амниоцентеза был 1 % (Tabor et al., 1986).

Проблема анализа ворсинок хориона состоит в том, что есть несоответствие между цитогенетическими результатами культивированных клеток и фактическим кариотипом эмбриона. Одна из причин этого несоответствия - мозаицизм плаценты вследствие строения ворсинок хориона (Slunga-Tallberg and Knuutila, 1995). Частота подтвержденного плацентарного мозаицизма оценивается на уровне 1.5 % (Hahnemann and Vejerslev, 1997). Другая причина несоответствия - это явление, названное «потеря трисомии» (Ledbetter and Engel, 1995). Естественный отбор, направленный против анеуплоидии, часто приводит к потере анеуплоидной хромосомы в эмбрионе, первоначально имеющим трисомию. Кроме того, считается, что анализ ворсинок хориона - процедура больше сопряжена с риском, чем амниоцентез, вероятность ошибки приблизительно 2 % (Rhoads et al., MRC Working Party, 1991). Процедура анализа крови эмбриона связана с риском спонтанного аборта приблизительно в 2 % случаев (Buscaglia et al., 1996). Главные причины потери плода -

разрыв мембран, хорноамниоцентез, и прокол артерии пуповины, связанные с этим кровопотери и длительные брадикардии. Частота потерь связанных с процедурой может быть уменьшена методами, такими, как например, скрининг сыворотки, который позволяет выявить женщин с повышенным риском нарушений при развитии плода. Однако, скрининг сыворотки - статистический метод, который идентифицирует только 60-70 % зародышей с синдромом Дауна (с 5%-ой ложно положительными результатами) (Phillips и др., 1992). Главный недостаток всех этих анализов - то, что они не могут предоставить фетальные клетки для последующего хромосомного анализа. Из-за неопределенностей скрининга и повышенного риска инвазивных методов диагностики, развитие альтернативной неинвазивная диагностики представляет собой значительный интерес.

1.2. Альтернативная неинвазивная диагностика.

Развитие неинваз�