Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эпизоотическое состояние природного очага клещевого энцефалита и особенности вирусной популяции в лесостепном Приобье (Западная Сибирь)

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Эпизоотическое состояние природного очага клещевого энцефалита и особенности вирусной популяции в лесостепном Приобье (Западная Сибирь)"

РГб од

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И ЫЗДйЩШСОЙ ПРСВДПЛЕНШХЯИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ШО "ВЕКТОР" НАУЧНО-ИССЛЕДОМТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ шолопш

На правах рукописи

БАХВАЛОМ ВАЛЕНТИНА НИКОШБНА

ЭПИЗООТИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ПРИРОДНОГО ОЧАГА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА И ОСОБЕННОСТИ ШРУСНОЙ ПОПУЛЯЦИИ В ЛЕСОСТЕПНОМ ПЕЮББЗ (ЗАПАДНАЯ СИБИРЬ}

03.00.06 - Еирусологйя

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на ссдскаяне учёной степени кандидата биологических наук

Кольдово - 1994 г.

Работа выполнена в Институте систематики и экологии хгеотных Сибирского отделения Российской Академии наук

Научный руководитель: доктор медицинских паук Н.Н.Харитонова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

В.Б.Локтев

кандидат медицинских наук Н.Л.Галахарь

Ведущая организаций: Институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, г.Иркутск

Защита^ диссертации состоится " 1994г.

е час. на заседании Социализированного совета К 098.08.01 при научно-исследовательском институте молекулярной биологии ЩО "Бект.ор" по адресу: 633159,Новосибирская обл..Новосибирский район, п.Кольцове.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке научно-исследовательского института молекулярной биологии НПС'Вектор".

Автореферат разослан

" /¿* " 1994г.

Учёный, секретарь Специализированного совета кандидат хтшческшс наук ^ 1 Т.Н.Шубина

Общая характеристика работы

Актуальность теш. К настоящему Бремени накоплено немало сведений по эпизоотологии клещевого энцефалита (КЭ). Однако, для понимания географических особенностей функционирования очагов и пред-влдегшя их активности необходимо знание особенностей вирусных популяций, динамики эпизоотического состояния конкретных территорий. Активный процесс урбанизации, нередко приводящий к тому,что природные счаги КЭ оказываются в пределах крупных городов (Когеп-berg е. et ai,1934 ), делает особо актуальными исследования в пригородных лесах и лесопарках, где чаще всего происходит заражение людей.

В лесостепном Цриобье, в частности в правобережье Когосибирской области, расположены крупные сельские и городские населенные пунктн, большое число мест отдыха различного ирофиля. Особенности рельефа и других природных условий правобережья способствуют активному функционированию природных очагов КЭ. Здесь же находится-и Новосибирский научный центр СНЩ) - Академгородок РАН с ¿силой зоной, который изначально бац организован на территории природного очага КЭ. Окруяавдие КНЦ лесные массивы, превращенные е лесопарковую зону, являются частью ленточных приобских боров; к ним примыкают остатки мелколиственных лесов, тянущихся от предгорий Салаира. Учитывая чрезвычайную актуальность для данной территории проблемы КЭ, здесь вперше был организован мониторинг, вшпо-чзваий комплексные полевые зоологические, паразитологические, вирусологические, серологические исследования и серию экспериментов по изучению паразитарной системы КЭ. В настоящей работе обобщены вирусологические и серологические материалы за тринадцатилетний период (I9SO-IS92 гг.).

Целью наших исследований было изучение многолетней динашш эпизоотического состояния природного очага КЭ в северной лесостепи Лриобья и выявление региональных особенностей гарусной популяция.

Для реализации цели были поставлены следуювцге основные задачи:

1. В процессе многолетнего мониторинга изучить спонтанную зараженность вирусом КЗ имаго тае&ного клеща Ixodes persrulcatu3 sohuize а закономерности ее изменения во времени и пространстве.

2. Провести сравнительную оценку эффективности методов индикации вируса КЭ в спонтанно ищищгоовашшх клещах: биопробц ,

молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот и шггенного икмуно-«|е|взевтного анализа.

3. Сформировать коллекцию цриооских штаммоз вируса КЭ и на ее базе выявить региональные особенности вирусной популяции по антигенным свойствам, вирулентности и гомологичности геномов.

4. На примере многолетней динамики гемагглютинирушцей активности вируса проанализировать временную фенотипическую изменчивость природной популяции возбудителя.

5. В экспериментальных условиях оценить эпизоотическое значение некоторых видов дахих грызунов по способности к эффективному донорству вируса КЭ доя клещей.

6. Охарактеризовать степень контакта с вирусом КЭ разных групп мелких млекопитаюцих, населялцих очаг, на основе серологических исследований.

Научная новизна.

1. Впервые в лесостепном Праобье на основе материалов многолетнего мониторинга охарактеризовано эпизоотическое состояние природного очага КЭ.

2. Установлено, что циклическим колебаниям годовых значений кирусойорности имаго таёзшого клеща свойственна прямая достоверна! связь с изменениями его численности при условии сдвига рада вирусофорности на один год вперед.

3. Сформирована коллекция штаммов вируса КЭ, на основе которой выявлены фенотипачесхне (по вирулентности) и генотипические особенности природной популяции вируса КЭ в лесостепном Приобье.

4. Впервые на примере ьшоголетней динамики гемагглютинирую-щей активности проиллюстрирована временная фенотилнческая изменчивость природной популяции возбудителя КЭ. Выявлены достоверные коррелятивные отношения, указывающие на положительную связь между временной изменчивости) Еируса, степенью участия в циркуляции воз-будатетш мелких шгекопитажщих г их популяционной динамикой.

5. В экспериментах изучена донорская эффективность шести видов грызунов по отношению к штаммам Приобья, выявлено особо важное эпизоотическое значение узкочерепной полевки - высокоэффектив ного донора штаммов, доминирующих в очаге..

6. Впервые показано, что на обследуемой территории заболеваемость людей клещевым энцефалитом положительно коррелирует не с вн русофорностью и численность» переносчика, а с долей иммунных к вирусу КЭ мелких млекопитающих при условии сдвига рада серопозитив-

ности на один год вперед. Наибольшая зависимость обнаружена мек-ду заболеваемостью ладей и серопозитивностыо неполовозрелых зверьков.

Практическое значение. Сведения об эпизоотической ситуации в очаге ежегодно использовались Новосибирской службой санитарно-эшдешческого надзора и Медицинским управлением Сибирского отделения РАН дяя планирования профилактических мероприятий! Материалы диссертации в целях санитарно-просветктельной работы отражались в газетных статьях, буклетах и памятках.

С учетом результатов диссертационных исследований составлены "Методические рекомендации по проведению пятенного имыунофер-ментного анализа для определения антигена вируса клещевого энцефалита", переданные в Президиум Сибирского отделения РАЬ. в январе 1992 года.

ймвленные особенности вирусной популяции, эпизоотического состояния природного очага и их связь с заболеваемостью людей могут быть использованы при эпизоотическом и эпидемиологическом прогнозировании для оптимизации мер профилактики етещевого энцефалита.

Апробация работы. Материалы диссертации долокены на научной сессии Биологического института СО РАН (апрель 1986, г.Новосибирск), УН Совещании энтомологов Сибири (февраль 1989, г.Новосибирск), региональной научно-практической конференции "Клещевой энцефалит" (апрель 1969, г.Новосибирск), Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (январь 1989, Рига), XIX научной сессии общего собрания СО РАМН по медицинским проблемам экологии Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера (ноябрь 1989, г.Новосибирск), Всесоюзном Совещании по проблемам теоретической и прикладной акарологии (апрель 1990, г.Ашхабад), Всесоюзном симпозиуме "Современные проблемы эпидемиологии; диагностики и профилактики клещевого энцефалита" (сентябрь 1990, г.Иркутск), I Международной конференции по патогенам, переносимым клещами (сентябрь 1992, Миннесота, ША)С

По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура заботы. Диссертация изложена на 166 страницах машинописи (без списка литератур!); состоит из введзния, четырех глав, заключения и выводов. Материалы диссертации иллюстрированы 14 рисунками и 26 таблицами. Список литератур! зкяючает

193 источника оте-мствянных и 75 заруба-хных.

РАЙОН РАБОТ, ПОЛЕВОЙ МАТЕРИАЛ, ЫЕТОДИ

Краткая физико-географическая характеристика лесостепного Цриобья составлена по данным литературы.

Места стационарных исследований и полевой материал. Исследования проводили главный образом б правобережной части лесостегшого Приобья,- на .территории Новосибирской области. Участок стационарных наблюдений расположен в 30 ил к ¡ату от г. Новосибирска, в лесопарковой зоне ННЦ. Площадь лесопарка около 90 км2, часть территории занята узкой полосой сосновых и березо-во-сосновых лесоЕ. 1С ним примыкают сравнительно крупные массивы осиново-березовых лесов," переходящих в березовые перелеска, рассредоточенные между сельскохозяйственными угодьями. Развита сеть небольших речек, заросших по берегам кустарниками, и оврагов с березово-осиновыш лесами по склонам. В иксодофауне доминирует таёжный клещ. Главная роль в прокормлении имаго принадлежит диким яивотным - лосям, зайцам, белкам; домашний скот в прокормлении участвует незначительно (Сапегина и соавт.,1985). Однако, серологическое обследование 100 овец из Экспериментального хозяйства СО РАН, выполненное в нашей лаборатории, выявило 6,0 + 2,4% особей, серопозитивных к вирусу КЗ, что свидетельствует об участии сельскохозяйственных животных в эпизоотическом процессе КЭ на обследуемой территорли. Основную кассу личинок с нимф таённого клеща прокармливают обыкновенная бурозубка, красная полевка, лесная иышовкд, полевая шшь, узкочерепная полевзса, полевка-экономка (Салегина и соавт., 1985, добротворский, 1592).

На стационарном участке с 1980 г по 1992 г изучена вирусо-форность 1670 пулов (19440 экз.) половозрелых клещей;''па наличие антител к вирусу КЭ исследована кровь 2246 мелких млекопитающих 23 видов. Здесь же отлавливали зверьков и для проведения экспериментов.

Слежение за спонтанной зараженностью переносчика в 1981-1990 гг ш осуществляли такие в пограничных со ставдонарным участком и иных, эндемичных по КЭ, адапнистратив-ных районах области ( 5 районов ), расположенных в северной части лесостепного Приобья, преимущественно в правобережье. Всего за указанный период здесь исследовано 1211 пулов ( 16025 экз.) имаго таёжного клеща.

Методы исследований. Половозрелых клещей, собранных с растительности, на спонтанную-зараженность вирусом КЭ исследовали пулами, обычно по 10 экз., иногда по 15, 20. Вирус выделяли метопом биопроб на белых беспородных мышах весом 6-8 гр. Цдентифика-цию изолятов проводили в реакции подавления гемагглютинацни(РПГА) i реакции нейтрализации с иммунной и нормальной сыворотками про-!зводства ТомНИИВС. Мозговые гемагглютинирующие антигены готови-ш методом боратно-солевон экстракции с последущей очисткой про-с ашнсу льФат ом о

С целью определения оптимальной схемы индикации вируса КЭ в шоктанко инфицированных клещах проведено изучение эффективности аетодов ускоренного тестирования патогена: молекулярной гибридз-¡ации нуклеиновых кислот (ШЖ) и пятенного иымуноферментного шализа (ПИФА) по сравнению с биопробой. Дот-гибридизацию осу-¡ествляли с ^2Р-меченым кДНК-зондом (Добрикова и соавт.,1986), ША ( Hawkea, 1986 ) исполняли в модификации сотрудников НИБХ !0 РАН (Матвеев с соавт., 1989).

Кровь для серологического тестирования мелких млекопитающих, иловленных в стандартные 50-метровые канавки с пятью цилиндра-си, собирали в июле, августе, а в некоторые годы и в июне, индя-¡идуально от каждого животного на стандартные диски из обеззо-[енннх фильтров (Пчелкина и др., 1967). Иммунологическую актив-гость животных в отношении вируса КЭ определяли в боратно-соле-их элюатах дисков посредством РИГА с 8АЕ антигена по общеприня-0Й методике Clarke u Casala (1958).

В процессе работы от имаго таёяного клеща выделено 385 штаммов, от больных КЭ людей - 7, что позволило сформировать кол-:екцию приобских штаммов вируса КЭ. На примере 40 ттаммоЕ из той коллекции мы исследовали фенотипические и генотипические собенности приобской популяции. Штаммы перед опытами дважды пао-ировали через мозг белых щшей и на уровне 9 пассажа анализиро-¡али по следующим признакам: антигенные свойства, вирулентность дя нелинейных белых мышей и степень гомологии геномов в сравне-ии с эталонным штаммом Софьин.

Нммунотипирование 25 штаммов выполнено в РДПА на основе ад-орбции иммунной сыворотка к штамму Софьин стандартными дозами реципитирующих антигенов в лаборатории ИПВЭ РАМН (г.Москва)под уководством д. кип. С.Г.Рубина. Тестирование антигенной структу-ы 7 штаммов проведено посредством иммуяоферлентного анализа 0®А) лаборатории ИПВЭ РАШ под руководством к.м.н. А.С.Караванова.

При этом использовали набор из 15 мояоклоквжышх антител (МКАТ) к. гяикопротепну Б шта\иа Софьин. Антигены для РДПА к ®А получены на перевиваемой линии клеток СПЭВ,

Нейровирулентность 40 штаммов изучали на белых беспородных шшах весом 6-8 г общепринятый способом.

Степень генетической гомологии 30 шташов исследована точечным вариантом метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (ШЖ). 3 реакции использовали ^Р-кеченые зонды ,представляющие плазшдные клонированные фрагменты кДНК, несущие крупные (3002000 пар оснований) участки генома'вируса КЭ, п II синтетических деэоксиолпгоиуклеотидов, комплементарных вариабельным ш коястр^в»-. тишым областям генома штамиа Софыга, длиною.в 18-27 основан^, йхрусную РНК выделяли из головного но зга зараженных белых шцгей методом февольной экстракции и иммобилизовали на нитроцелявлодше фильтра ВА85 по 2 мкг на точку. Гкбрядкзацгю образцов фоводалг по методу К.Шерер (1972) в модификациях сотрудников HHSX СО РАЯ, г.Новосибирск (Шаманив, 1990 ).

Эффективность даккх грцзунов s качестве доноров вируса для клещед оценивали в экспериментах аналогично С.П.Чунихицу с соввт., (I9B2). Способность фор,щровать эшзооотичесзш эначгт.шй уровень виру cet,1ии ( i- 3,0 З-бЛД^/о пз^ в ответ на дозкровангое подкокное заражение (3-4 г&ИДзд) изучена у взрослых особей аести видов. Индикацию порсистиругадего возбудителя в органах эксперт гекгальадх зверьков осуществляли на +85-е сутк: после ааратеякя. Перед теств-роЕпклеп етвотным инокулировала циклофоефаи по схеиз ' ir в довах, как ошсано Т.В.Фроловой и соавт. (1982). Гомогенен органов опытных квотных исследовали биопробой на мших с последующим изучением крови биопробных jmîbothhx второго пассата в РИГА и ' ИМ. Отбор штаммов различной вирулентности для инфицирования ¿шеотнш; проводили по величине периферических титров согласно критериям, предложенным Г.Н.Леоновой с соавт. (1990).

Методы учета клещей и мелких млекопитающих на стацио~ нарном участке описаны B.Q. Сапегиной (1985) и А.К.Добротворс-ким (1992), любезно предоставивши нам даннне по пх. численности. Сведения по заболеваемости людей КЭ на обследуемой территории получены от Ю.Б.Умнова (Госсанэпиднадзор, Новосибирск).

Статистическую обработку материала проводили общеприняты!® методами биометрии (Яакин, 1980, Плохинский, 1980).

СПОНТАННАЯ ЗАРАЗЕННОСТЬ ТАЁННОГО КЛЕЩА ВИРУСОМ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

Согласно нашим материалам, среднешоголетняя спонтанная зараженность вирусом КЗ пулов шлаго таеяного клеща за период наблюдений составила на стационарном участке (лесопарковая зона ННЦ) 12,0 + 0,8^, в пограничных с лесопарком и иных, эндешчных по КЭ, районах Новосибирской области - 15,3 + 1,0%, в целом на обследованной территории - 13,4 + 0,6$ . Амплитуда колебаний вирусо-форяостз тагасе была неодинаковой. В лесопарке ННЦ максшашшз и минимальные значения различались в 8,4 раза, в эндемичных районах- 17,5.раз, в среднем - 9,3 раза. Тем не менее тип многолетней динамики зараженности клещей повсеместно обнаруживает рааенное сходство: изменения носили синхронный и однонаправленный характер, отчетливо променивается цикличность колебаний с периодом 3-4 года (рис.1).

70

60 •

О

1Э80 1982 198-1 1386 1988 1990 1992

Рдс.I. Годовне значения вяруоофорностп таёжного клеща в лесопарке Новосибирского научного центра (••••) и эядег.ггчных по кяецевому онцефалату адаинлстратив-нцх районах Новосибирской области (-)

На всей обследованной территории в 1985 год? отмечен зна-. чительннй подъем вирусофорности, достигшей в 1986 году максимального уровня, достоверно иревысншего (р < 0,05) величину показателей в остальные года наблюдений. Близкие величины' и сходный характер межгодошх изменений шрусофоряости в лесопарке ННЦ н прилегающих к нему районах области дшот основание полагать * что закономерности развития паразитарной састеш КЭ едины на всей обследуемой территории. Исходя из этого, более детальный анализ вирусофорности проводили по материагам стационарного участка.

Согласно полученным нами данным, среднемноголетзшй уровеш вирусофорности клещей различного пола практически одинаков I мае, июне и в целом за сезон. Наряду с этим, обращает внимание высокая меагодовая вариабельность- спонтанной зараженности саы-цов, значительно превышающая таковую самок.'Максимальный и минимальный показатели вирусофорности самцов различались между сезона*® в 40 раз (0,0 - 40,8 + 7,0%%), в то время 'как амплитуда колебаний зараженности самок не превшата 3,5 (7,0 + 2,1 -- 24,5 +6,00). Примечательно, что рост шрусофорности клещей з 1986 году был обеспечен в основном высоким уровнем зараженноста самцов. Попарное сравнение различных групп клещей не по фактическому проценту, а по удельному, выявило, что в среднемноголез нем сезоне зараженность клещей обоих полов в мае вше, чем з июне; при этом число вирусофорных самок превалирует. Чтобы исключить тшяяие годовых колебаний вирусофорности на результат анализа, годовое соотношение вирусофорности в каждой паре еы-ражадк в процентах, принимая за 100$ з,*лксимащ>ное в этом году значение одной из двух сравниваемых групп. .

Сопоставление зараженности клещей,в различных местообитаниях показало, что распределение вирусофорных клещей по-территории неравномерное, "пятнистое" Стабильность и уровень зара-кенности переносчика зависит от микроклиматических условий.релз ефа, характера растительности местообитания. Эпизоотический процесс более стабилен в биотопах смешанных высокотравных лесоз ивняков и в понижениях рельефа, что .скорее всего, обусловлено устойчивостью оптимальных экологических условий для всех сочленов паразитарной системы и относительно небольшим антропогенным воздействием. Наиболее низкая и неустойчивая зараженное^ вирусом свойственна переносчику в лесах с примесью ш преобладанием сосны, где условия обитания близки к пессиыальным. При-

мечательно, что среднемноголетний показатель вирусофорносги не Есегда четко отракаат зависимость ее от особенностей биотопа, более информативен временной ряд.

Вирусофсрнооть при непосредственном сопоставлении не коррелирует с численностью клещей за период наблюдении (г = 0,06). Однако, при с ы еще'н ии ряда виру со фор -п о с т и на один год вперед коэч&щиент кор-ре«1Я14;и дос:^гс.с.о высокого значения (г = 0,85 + 0,11, р< 0,01). V.TO свидетельствует, что дяя обследованной территории характерна высокая степень связи ¡«езду колебаниям:: численности и шрусофорцостл клецей, но изменения зараженности происходят,как правило, с опережением изменений численности на один год (pre.2)

Рис.2. Межгодовые изменения шрусофорности (-•-)

численности С --—о—— ) клещей и заболеваемости людей КЭ (......).

мы полагаем, что выявленный характер зависимости меэду этими ддуш показателями отражает экологичес -кие особенности северной лесостепи Приобья, определяющие биологию переносчика. Указанная зависимость мскет быть обусловлена неблагоприятными дош тарного клеща условиями на этой территории (ДобротЕорский, 1992), в связи с чем в очаге, по-видимому, постоянно длапаузирует значительная часть нимф. Так как диалаузирукхцие особи "теряют" основное количество вируса (Катин, Пустовалов, 1983), то виру сонорные имаго - это преимущественно особи, вышедшие из нимф с бездиапаузннм развитием. Часть нимф, ушедших в даапаузу, оказывает заметное влияние лишь на численность имаго, причем не ранее, чем через год после изменения вируоофорности. 3 такой ситуации ыезду виру соборностью и численностью клещей формируются связи, подобные выявленной нами.

Важное значение с эпидемиологической '¿очки зрения имеет характер зависимости меда заболеваемостью людей КЭ, шрусофор-ностью и численностью переносчика. На обследованной территории эти показатели не коррелировали с заболеваемостью: в-обоих случаях найдена (си.рис.2) обратная, по статистически недостоверная связь. Коэйдщиент корреляции заболеваемости с влрусофорнос-тыо клещей составил - О,ЗУ + 0,29, с численностью -(-0,33 + й,ЗХ

Определение оптимального способа индикации вируса в клещах среди трех методов: биопробы, молекудшриой гибридизации нуклеа-ноеых кислот ШШК) к пят энного шл.уцо^ерментного акализа(ШЙА)

проведено в двух опытах. 3 первой анализировали 116 пулов клещей; МГНК и ШФА исследовали гомогенаты клощея, ыозг всех био-проб!шх мышей исходного заражения и двух последовательных пас-сакей. Во втором опыте изучили 1Е4 пула переносчика; посредствен Ж1К и ШВА тестировали только исходные суспензии клещей, мозг мышей не исследовали. Согласно нашим дашшм, '.ИНК и ГША уступают биопробе по чувствительности к вирусу в исходных гомогенатах спонтанно инфицированных переносчиков: оба теста выявляет примерно 70$ образцов из числа положительных в биопробе. Так, во втором опыте из 42 гомогенатов, вирусофор-ных по данным биопробы, Еирусная ЕНК тестирована в 30 исходных суспензиях клещей, антиген вируса - в 28, что составило 71,4 + + 7,Й и 66,7 + 7,3$, соответственно. Оба теста достигали равной с биопробой чувствительности к патогену лишь при исследовании проб, предварительно обогащенных двухкратным пас-

сированием на мышах; при этом результаты МГНК отличались 10С$ специфичностью относительно положительных ответов биопробы. В то же время, повышение шявляемости вируса Ш®А за счет обогащения исходных гомогенатов на мышах сопровождалось незначительным снижением специфичности его ответов.

Учитывая полученгае результаты, а также быстроту исполнения МГНК и Ш1ФА, считаем, что эти методы правомерно применять для непосредственной индикации возбудителя в клещах при необходимости срочной предварительной оцешш эпизоотической ситуации в природном очаге; бочее точное выявление вируса в переносчиках возможно только после предварительного обогащения исходного материала на восприимчивых биологических системах. Одьако, при этом нельзя не учитывать, что радиоактивный вариант ¡.ЕГНК требует специальных условий-'и резсима работы, частого приготовления или получения свежих 32Р-меченых зондов. Исходя из сказанного, при изучении вирусофорности голодных клещей в очаге мы отдаем предпочтение биопробе.

ВИРУСНАЯ ПОПУЛЯЦИЯ

При антигенной идентификации установлено, что штаммы исследуемой приобской популяшш вируса КЭ относятся к персулька-гусному антигенному типу вируса КЭ; сопоставление в РДПА со нгшм-лом Софьин (по акгисыворотке к штамму Софьин) показало,что между яэппми штаммами и жеммом Софьин существуют количественные зтличия, выявляемые при дозе адсорбирующего антигена в 8 преци-штирующзх единиц. При увеличении сорбирующего антигена до 32 дахмщ различия не регистрируются.

Тестирование антигенной структуры ыташов Приобья посредством 1ЙА с применением 15 МКаТ.к гликопротеину В не выявио ¡таммов, отличающихся по антигенной структуре от дальнеьосточно-'о штамма Софьин. Для каждого штата получено 16 графических ривых тятровагаш (15 ЖАТ и один препарат поликлоналышх антй-ел), иллюстриругацих антигенное единообразие и сходство их акти-энной структуры со ит&чмом Софьин.

При титровании зтяммов на нелинейных белых мшах средние еличины титров при церебральной инокуляции составили 7,1 + 0,1 хеЛД50, при периферически! -5,2+0,16 хцЛД^. При-яутримозговом заражении показатели вирулентности варьировали пределах 5,8-3,5 ХвЛДдд, при подкожном - 2,7-7,0 З-еЯДэд. Ин-;кс инвазивности {Л ) изменялся в пределах 0,3-4,3, средний

показатель У? составил 1,9 + 0,1.

Ш провели сравнительную оценку вирулентности изучаемой популяции Приобья с популяциями Восточного Зауралья, западной части Западной Сибири и Дальнего Востока (Приморье и Приамурье! При этом использовали литературные сведения в отношении штаммов, изолированных в очагах только от иксодовых клещей, что служило основанием для адекватного сопоставления популяций. Наиболее детально приобскую популяцию сравнивали с дальневосточной (Приамурье), так как при изучении свойств штаммов мы использовали в качестве эталонного дальневосточный штамм Софыга. Кроме того, для приавдрских штаммов авторы (Берета и соавт., 1976) приводят фактические титры, что 'позволило осуществить дополнительный анализ интересующего нас материала. Сопоставление пгтаммов Приобья и Приамурья проводили по группам с титрами,различающимися на I х^ЛД^; для сравнения с ост&тьяыми популяциями приобские и приамурские итаммы распределяли в группы, согласно величинам титров, использованных авторами публикаций (ЦустоЕалс ва, Катин, 1984; Леонова и соаЕТ., 1990).

По усредненным показателям нейровирулентности вирусная популяция Приобья достоверно не отличается ни от дальневосточных, ни от иных западносибирских популяций. Однако, структура приобской популяции ' по вирулентности обнаруживает сходство только с западносибирскими популяциями ; по отношению к дальневосточным прослеживается достоверный сдвиг структур приобской и других западносибирских популящй з сторону снижения вирулентности как при внутршозговом,так и пр! подкоксном способах заражения (табл.1, ряс.З). К примеру, по величине периферических титров в Приморье и Приамурье превалируют высокоьирулентные штаммы (титры> 6,0 1бЛ5£ составляющие здесь 59,5 + 7,5% и 53,6 + 8,5%,соответственно; в Приобье число таких штаммов достоверно (р < 0,01) ниае -25,0 + 6,95?. Напротив, умеренновирулентяые штаммы (титры 4,1-5,9 з.еЯДзд) преобладают в приобской популяцк (62,5 + 7,8$) , в дальневосточных их доля составляет менее 40$ (рис. 3,В). Наряду с этим, как средние величины ин декса инвазивности, так и структура популяций по этому показателю не различаются.

Таблица I

Структура вирусных популяций по вирулентности для белых беспородных мышей в различных природных очагах КЗ

Место выделения Автор % штаммов в группах с различными титрами (1е Щ^д)

штаммов Шутримозговое инфицирование подкожное инфицирование

>9.0 8.9-7.1 4 7.0 > 5.0 4.9-3,5 < 3,5

Западная Сибирь •

1.юговосточная часть Западной Сибир* -лесостепное Приобье Сооствен-нЬр данные 0,0 55,0^8.0 45,0-^7.9 60.0^7.8' 37,5±7.8

2.сападная часть Западной Сибири Пустовал о-ва,Катин, 1984 4,4 39,1±7,9 56,5±7,8 60,8^7,2 28,4±6,7 ТО. 8

Восточное Зауралье _«_ 6,3 43,7±7,3 50,0±7,4 63,0±5,3 2G,2¿o,Л 1С. 8

Дальний Восток

различные ландшафтные зоны Приамурья Берета и соавт., 1976 33,3± 8,3 51,5±8,8 15,2^6,4 87,8^5,8 12,2±5,8 0,0

Примечание: анализ материалов публикации Л.А.Береты в соавт. (1976) выполнен В.Н.БахвалоЕой.

^ис.З. Структура вирусных популяций по вирулентности для белых мышей в природных очагах различных регионов.

Условные обозначешш. (-) - Западная Сибирь-Приобье,(---) -

-Дальнгй Восток-Приамурье (Верета и соавт.1Э76), (■•••)-Дальяа£ Восток-Приморье (Леонова и соавт.Д990).

Исследование генетической гомологии штаммов выполнены методом МГНК с вдНК-зондом в мягких и жестких услошях и с набором II синтетических дезоксаолигонукчеотидов. Гибридизация кЗДК-зок-да с РНК наших штаммов была активной как в водном растворе, так и в присутствии 50$ формамида (ФА) при 45°С (рис.4).

Температурный реаим Тестируемые штаммл Контроль

фильтр I) -фильтр 2 фильтр 3 г б

45°С •

55°С ш? *

65°С О

Рис.4. Гибридизация кЗЩК-зонда с РНК мозга мышей, инфицированиях штаммами вируса КЭ, при различных температурах в присутствии 50$ формамида.

Условные обозначения: а - РНК мозга интактннх мышей", б - РНК мозга мышей, инфицированных штаммом Софьин.

При усилении жесткости условий (50? ФА, 55°С) эффективность гибридизации несколько снизилась - в среднем уровень ее относительно штамма Софьин уменьшился до 67,3 наиболее жестком режиме (5С% ФА, 65°С) штаммы характеризовались очень низкой способности) • к гибридизации с дальневосточным штаммом: лишь у восьми штагл.юв из 30(26,7 + 8,0%) зарегистрирован значимый уровень гибридизации: 5-13, , у остальных-нихе В реаишт с дезокси-олигснуклеотидами не выявлено штамиов, полностью гоиологичных прототипному - ни один из взятых в оцыт штаммов не реагировал о дгумя зондами ПЮ и Х2 ( рис.5 ), комшгемен-

Тестируемые штаммы Контроль

Зонды фильтр I | фильтр ?. фильтр 3 а . б

Ио • •3

1114 • • • • • •• • • • •и» • •• е. ©® • »в •

шз • • • О* •« ••• » 4 • • •• ••• •

пю • • ©

Х2 V • •.; « -

■ П31 «<19 ©ФР • • «в • ©<в© « •

П131 • •• о 1 ^^ в • - • 0 • • • ! 1 »

кДНК в ее м* ввСЭ ««« • ©

Рис.5. Гибридизация дезоксиолигонуклестидов и кдНК-зонда с РИС мозга мшей, инфицированных приобскими штаммами. Примечание. Гибридизацию проводили без формамида, с ЩЩК-зон-дом - при 65°С, с дезоксиолигонуклеотидами - при 37°С. а - РНК мозга интакгных мышей, б - РНК мозга мышей,инфицированных штаммом Софьин.

тарными вариабельным участкам генов С и н S1. Две трети штаммов (66,6 + 8,8$) характеризовались генетическим едлаообразяем-их РНК гибридизовались с девятью оди-даковыш дезохслолигонуклеотадами.

Таким образом, согласно нашим данным, приобская популяция вируса КЭ характеризуется .выроненной внутрипопулящюкной генетической гомологией. Сходство всех изученных штаммов по яуклеотид-ным заменам в одних з тех же участках генома (зонды ИГО и Х2), крайне низкая способность гибридизоваться с прототипннм штаммом а жестких условиях свидетельствуют о структурных генетических особенностях штаммов Дриобья. Генетическое расхождение со штаммом Софьин и, следовательно, с дальневосточной популяцией, где доминируют штаммы, генетически близкие штамму СофАйн (Злобин и соавт„ 1992), может быть следствием географической изменчивости, адаптации вируса КЭ к условиям лесостепного Приобья, представляющего участок нозоареала КЭ, естественно-исторический возраст которого существенно меньше дальневосточного (Вершикский, 1984).

Временной изменчивости природных популяций вируса КЭ, в отличие от других компонентов паразитарной системы, уделяется не-одравдано мало внимания. В то же время известно, что многим вирусам свойственна изменчивость во времени, динамический полимор -физм, обусловленный взаимодействием вирусных популяций с популяция»,и хозяев (Цилинсхий, 1988).

Мы проанализировали гемагишгинирующие свойства 365 штаммов приобской популяции, выделенных биопробой на мышах от имаго гаёк-ного клеща, на уровне первого пассаиа через мозг белых мышей. Структуру вирусной популящш по гемагглютинирущей активности (ГАА) иллюстрирует рис.6. Очевидно, что среднемноголетнее распределение штаммов по величине титра гемагглютининов (рис.6,А) близко к нормальному распределению; судя по средним геометрическим титров (СГТ) ГАА вирусной популяции претерпевает циклические изменения (рис.7). Промежутки мезду пиками ГАА составляют 4—5 лет. В годы максимумов (1981, 1987, 1992 гг. распределение изолятов по величине титра гемагглютининов достоверно (р < 0,001) отличается от такового в годы умеренной ГАА (рис.6). Мя не обнаружили корреляционной связи мезду СГТ гемагглютининов, варусофорностью и численностью переносчиков, однако выявили, что межгодовые колебания уровня СГТ в максимальной степени сходны (р < 0,01) с изменениями серопозитиЕности ( г= 0,74 + 0,2, рис.7)

Рпс.6. Распределение изолятов вируса КЭ по величине титров

геыагглютининов:(А—вз-) среднемноголетнее распределение за

все года наблюдешй, (Б—&-) годы с высокой гемагглюгинирую-

щеи активностью (1981,1987,1992 гг, 77 изолятов), (В-в--) _

-годы с умеренной гемагглютинирущей активностью (288 изолятов).

Рис.7. Многолетняя динамика генагглатпнируюцей активности вируса серопозитнвности мелких адетопитадах и заболеваемости людей КЭ. Условные обозначения. (-23—) средняя геометрическая титраЛСГ?) гемагглютининов. (шз 5 - % зверьков,шпкшх к вирусу КЭ, (-□-) - заболеваемость людей КЭ.

и численности (г = 0,78 + 0,19) зверьков при смещении радов двух последних показателей на один год вперед. Если использовать комбинированный показатель, объединяющий уровень численности мелких млекопитающих и величину их иммунной прослойки - число серопозь-тивннх особей на 100 цалиндросуток, коэффициент корреляции достигает 0,87 + 0,15, р< 0,-01. Следовательно, изменению .(повышению или снижению) ГАА вируса во взрослых клещах предшествуем аналогичное изменение серопозитивности и численности мелких млекопитающих. Выявленная корреляция мезду долей иммунных зверьков и СГТ гемагглютининов вируса указывает на полакигельную связь' между фенотипической изменчивостью патогена и стеиеяы» участия мелких млекопитающих в циркуляции возбудителя. Временной сдвиг на I год соответствует периоду развития' клещей' от напитавшейся на зверьке нимфы до имаго.

При смещении ряда серопозитивности на один год вперед доля иммунных .зверьков полсшггельно коррелирует(г = 0,62 + 0,25, р < 0,05) и с заболеваемостью людей КЭ (см.рис.6). Это дает основание полагать, что и инфекционная активность патогена ( отражающаяся в заболеваемости) зависит от участия мелких млекопитающих в эпизоотическом процессе. Разумеется, связь между за-Золеваемостью и инфекционными свойствами вируса не может быть ¡[веткой, так как заболеваемость людей определяется комплексом природных и социальных факторов. Тем не менее, учитывая обнару-ценную зависимость, полагаем, что серопозитивность зверьков нонет служим важным критерием при прогнозировании эпидемической эпасности очага КЭ. '

ЭПИЗООТИЧЕСКАЯ РШЬ МЕЛКИХ ШЕКОПИТАИфК В ПРИРОДНОМ ОЧАГЕ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА,

Участие мелких млекопитающих в циркуляции возбудителя исследовано нами в многолетних полевых наблюдениях и серии экс-гериментов: изучена серопозитивность зверьков, населяющих очаг, зценена эффективность некоторых видов грызунов в качестве доно-эов вируса для клещей ж способность поддергивать персистенцию возбудителя.

Годовые величины, доли иммунных особей среди всех обследо-занных зверьков изменялись за период наблюдений от 0,G% до Ю,6 + 0,В%, составив в среднем 8,1+0,6$. В ментоловых изменениях серопозитивности прослеживается цикличность с периодом 6—7

лет. Колебания доли серопозитивных особей достоверно коррелируют с численностью мелких ьшекопиташщх ( т=0,58 + 0,25, р 0,05); так как последний показатель отражает общео состояние популяций, изменяющееся под воздействием комплекса биотических и абиотических факторов (Шилов, 1991), выявленная заззгаглость может свидетельствовать о связи между состоянием популяцдй зверьков и степенью участия их в циркуляции возбудителя.

По данным серологического обследования большинство видов зверьков, населяющих очаг, контактирует с вирусом КЭ. Средне-кноголетний процент иммунных особей широко варьирует по видам (от 1,8 + 1,0% у обыкновенной бурозубки до 23,0 + 8,4% у бурувдз^-ка), но не отражает в полной мере степени их участия в прокормлении' клещей.

Количество иммунных зверьков неодинаково в различных местообитаниях. Аналогично численности мелках млекопитающих (Добро-творский, 1992) четко просле&ИЕается постепенное, неуклонное снижение среднемноголетней величины иммунной прослойки по мере ухудшения условий.увлажнения - в направлении от высокотравных лесов в понижениях рельефа к сосновым лесам при шестикратной разнице кезду максимальным (13,9 + 1,7%) и минимальным(2,2 + 2,2%)уров-нями. Согласно результата нашего анализа, в таком же направлении'уменьшается стабильность ж уровень'вирусофорности клещей. Следовательно, среднемноголетняя величина иммунной прослойки зверьков в различных местообитаниях отражает интенсивность протекающего в них эпизоотического процесса КЭ.

По среднемноголеткему проценту серопозгткшостя не выявлено отличай интенсивности контакта с вирусом особей разного пола и возраста. Однако анализ временных, многолетних рядов по критерию Вилкоксона позволил с^нарунить достоверные ( р < 0,05) различия годовых колебаний иммунной прослойки у половозрелых и неполовозрелых зБерьков; как правило среди серопозшкишх превалируют половозрелые особи. Поскольку значительная часть половозрелых зверьков представлена дере зимовавшими кивотньш, причинами сказанного могут служить дополнительная тмунизацея ьх в зимовочных гнездах, активация персистпрующего вируса КЭ к пр. В связи с этим, по нашему мнению, величина иммунной прослойки неполовозрелых зверьков, являющихся сеголетками, наиболее адекватно отражает интенсивность эпизоотического процесса в текущем эшд-сезоне. Оценка связи заболеваемости людей КЭ с каггененняш иммунной прослойки половозрелых к неполовозрелых зверьков показа-

ла наличие полсмдтельной, статистически достоверно-'; связи только для неполовозрелых ;:-а:вот;шх (г =0,75 + 0,23, р СО,05); половозрелых кояфТшщент корреляции оказался статистически недостоверны!'.? (г -С,34 + С,29, р>С,С5); условие сдвига ряда серо-позитивности на один год вперед здесь тайге сохраняется. Ка паи взгляд, это подтвер,дает мнение о наиболее адекватном отражении эпизоотического процесса в текущем эппдеезоне серопозитиЕкостьи неполовозрелых мелких млекопитающих и позволяет считать данный показатель к а д е я н ы ы прогност и ч с с к и ы п а р а и е т р о

1С числу обстоятельств, определяющих эпизоотическое и эпиде-шческое значение позвоночных, принадлежит их способность развевать при цербер-песком заражении влрусешю,. достаточную для заражения членистоногих (Яьвов, 1369), т.е. служить эффективными донорами вируса для клещей. В серии экспериментов ш исследовали донорскую эффективность шести вздор диких грызунов (табл.2).

Таблица 2.

оорыяроваше эпизоотически значимых уровней вирусемии дикими грызунами,зйркленныш шташами вируса КЗ различней вирулентности

Вид ЖИВОТНЫХ Количество грызунов с вирусемией »3,0 1с ^50/0,03

умеренновирулент. штамм Г4ь7 Еысоковирулент. штамм 228 слабовирул. штамм 1525

х/п % % х/п %

Красная полевка 14/36 38,9+ 8,1 13/19 68,4+10,7 0/28 О

Рыжая полевка 4/II 36,4+14,5 7/II 63,6+14,5 3/II 27,2+13,4

Полевая мышь 5/24 20,8+ 8,5 I/I4 7,1+ 7,0 4/12 33,3+14,2

полевка™ 13/16 8I.3+I0.I н.и. н.и. пеструшка I7¿5 68,0+ 9,5 н.и.

Мышь-мшпотка 1У24_0_и. и._я. и.__

Примечание.х/п - количество зверьков с нарусемией.

>3,0 ig ДД50/0,03 (х) из числа взятых в опыт ( п ); н.и. - не исследовали.

Выявлено, что лесные полеЕКИ - красная и рыжая, служат амп-лифайераш высоковирулентных штаммов, но менее успешно подчеркивают циркуляцию умеренновирулентных. По отношению к слабовирулентным штаммам красная полевка выступает полным супрессором, рыжая способна к низкоэффективной передаче вируса клещам. Полевая мшпь - неэффективные донор для штаммов различной вирулентности, но особенно для высоковирулентных, которые она, по сути, элиминирует. Циркуляция умеренновирулентных штаммов, превалирующих в приобской популяции, активно поддерживается узкочерепног полевкой, но такие штаммы элиминируются мышью-малюткой.. Однако, невысокая численность мышей-малюток в очаге снижает их элиминирующее значение. Роль узкочерепной полевки как амшшфайера вируса в северной лесостепи Приобья особенно высока в годы резких подъемов численности, характерных для этого вида (Телегин,Ивлева, 1983). Независимо от степени донорской эффективности, более половины экспериментальных диких грызунов (узкочерепных полевок, мышеи-малюток и степных пеструшек) способны сохранять в организме умеренновирулентнып штаг.от вируса КЭ до 185 суток'после инфицирования (срок наблюдения).

Полученные нами материалы характеризуют ряд важных свойств и особенностей популяции труса КЭ, её взаимосвязи с сочленами паразитарной системы, эволюционно сложившиеся и во многом определяющие эпизоотическое состояние очага в условиях лесостепного Приобья. Выявленные закономерности динамики эпизоотического процесса представляют научный интерес и перспективны в плане использования их для прогнозирования эпизоотической активности и эпидемической опасности очага.

ВЫВОДЫ

1. Спонтанная зараиенность вирусом КЭ имаго таённого клеща в лесостепном Приобье в среднем 13,4 + 0,6$ пулов, амплитуда колебаний годовых значений достигала 9,3. Изменениям вирусофорнос-ти свойственна прямая достоверная связь с колебаниями численности клещей при условии сдвига ряда вирусофорности на один год вперед. Стабильность и уровень зараженности переносчика неодинаковы в различных биотопах.

2. Метод биопробы по чувствительности и надежности превосходит пятенннй иммуноферментный анализ и молекулярную гибридизацию нуклеиновых кислот при тестировании вируса КЭ в голодных, спон-

танно инфицированных клещах.

3, Штаммы Приобья в значительной степени генетически однородны, вместе с тем в их геномах обнарукены структурные отличия от дальневосточной популяции. По вирулентности структура приобской популяции сходна с другими западносибирскими популяциями • и достоверно отличается от дальневосточных.

4. На примере многолетней динамики гемагглютишгрующей активности установлено, что природной популяции вируса КЭ свойственна временная фенотипическдя изменчивость, положительно коррелирующая с долей иммунных мелких гиекоплташцих при смещении ряда серопозитивности иа один год вперед.

Е. Серопозиттвност'ь зверьков з очаге колеблется с периодом б—7 лет; варьирование серопозитивности значимо связано с измене-» ниями численности яивотных; достоверно различаются межгодовые изменения иммунной прослойки половозрелых и неполовозрелых особей.

6. По данным серологического обследования большинство видое зверьков, населяющих очаг, контактирует с вирусом КЭ; интенсивность контакта полоаительно коррелирует с уровнем экологического оптимума дом животных в различных местообитаниях.

7. Экспериментально выявлена неодинаковая роль диких грызунов в эпизоотическом процессе КЭ - от активного амплнфайера до полного супрессора вируса в зависимости от вида :швотного и вирулентности штамма. При любой донорской эффективности зверьки способны успешно поддерживать персистеннию возоудителя до 185 суток (срок наблюдения).''

На обследованной территории не обнаружено четкой связи заболеваемости людей КЭ с вирусофорностыо и численностью переносчика. В то не Еремя заболеваемость пололштельно коррелирует с динамикой серопозитивности мелких шшко'аитяющих, особенно неполовозрелых, при сдвиге ряда серопозитивности на один гсд вперед. Следовательно, серопозитпвность зверьков может быть использована в качестве критерия при прогнозировании эпидемической опасности очага КЭ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

I. Бахвалова В.Н..Матвеев Л.Э..Коробова С.А.,Добротворскии Л.К. Индикация вируса клещевого энцефалита в иксодовых клещах при параллельном исследовании материала в биопробе и иммунофер-чентном анализе.//Микробиологические исследования в Западной

Сибири. Сб.игучк.трудов.-Новосибирск: Наука, 1059,- С.95-99.

2. Па'-р.нин В. А., БахвглоЕа З.Н., Здобин 3.П. .Плетнев Л.Г. ■"'бчарукунне и дифференциация штаммов вируса клещевого зццефали-тс. методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот.//Компоненты нуклеиновых кислот. Тез.докл.УШ 3cec.cm.in.по целенаправл. изыск.лог.арстЕ. Ееществ.- Рига, I9C3 .- 3.IC2.

3. Бахрэлова В.П., Каманин В.А., Патвеев Л.Э., Ефремова Л.В. ыетоды выявления вируса клещевого энцефалита в переносчиках: сравнительная, оценка.//Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита. Тез.докл.Всес. cin.cn.- Иркутск, 1990.- С.91-92.

4. Добротворский А.К.,, БахвалоЕа В.Е., Ткачев A.B., Сапеги-ка В.у., Харитонова U.K. Характеристика очагов клещевого энцефалита в лесопарковой зоне Новосибирского Академгородка //Там яе,-- С.34-35.

5. ДобротЕорский А.К., Бахвалова В.Н. .Сапегина В.Ф. ,Дкнаш-ка численности таёжного клеща и других компонентов очэгов клещевого энцефалита в северной лесостепи Приобья //71 Всес.совещание по проблемам теоретической и прикладной акарологии. Тез.докл.-vT. 1990.- С. 52-53.

6. Lachvalova V.IT. ,Ch£u;:ani:n V.,Dobrotvorsky A.K. Variabi-liti of tha i'BE virus isolate! iron ticke in West Siberia/'/l-Et Int.Conf.on 2i'ok-Bors:3 Pathogens at the Host-Vector Interface:¿с Agenda for Research.Ггос.and Vd3tr. 3ept. 15-18,19ЭГ.-St."aul,

; üime s о ta, USA.. - Г. 87.

7. Baciivalova V.U. ,Dcbrotvorsky A.K. .Experimental infectior of зоглг Clat'r.rior.ornys voles with different streins of. the TBE

■ irus//Tpja .-P. 1.

G. БахЕалова З.Н., Добротворский А.К. !.!екгодонхе колебания г.эпагглгтагаярущей активности вируса клещевого знцефатита в пригодной полулязда //Доклада Российской Академии Наук.- 1994.--Y.337, iS 2.~ С.271-272.