Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия фрагментов опухоле-ассоциированного гена муцина 1 мышей и изучение иммуногенной активности этих фрагментов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия фрагментов опухоле-ассоциированного гена муцина 1 мышей и изучение иммуногенной активности этих фрагментов"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА РАН

На правах рукописи

МУШЕНКОВА НАТАЛИЯ ВАЛЕНТИНОВНА

ЭКСПРЕССИЯ ФРАГМЕНТОВ ОПУХОЛЕ-АССОЦИИРОВАННОГО ГЕНА МУЦИНА 1 МЫШЕЙ И ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ЭТИХ ФРАГМЕНТОВ

03.00.03 - молекулярная биология 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 НОЯ

Москва, 2009 г.

003483581

Работа выполнена в лаборатории клеточных взаимодействий Учреждения Российской академии наук Институте биоорганической химии РАН (ИБХ РАН)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Елена Викторовна Свирщевская

Официальные оппоненты:

1. Доктор биологических наук,

2. Доктор биологических наук, профессор

Людмила Алексеевна Захарова

Юрий Борисович Лебедев

Ведущая организация

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 25 ноября 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного совета при Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Автореферат разослан 22 октября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного ученого совета:

доктор физико-математических наук

В.А.Олейников

ХАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время активно изучаются возможности иммунотерапии раковых заболеваний. Описано большое количество раковых антигенов; в крови больных обнаруживают антитела к онкобелкам, что говорит о возможности распознавания опухолевых клеток. Иммунизация с использованием раковых антигенов позволяет получить хороший протективный ответ в мышиных моделях неоплазии, однако эффективность ее применения у раковых больных низка и составляет не более 1015%. Низкая противоопухолевая эффективность терапевтической вакцинации раковых больных объясняется формированием механизмов опухолевой устойчивости, а также общей иммуносупрессией, наблюдаемой на поздних стадиях болезни. В этой связи превентивная вакцинация предрасположенных к развитию неоплазии людей представляется более перспективной. Формирование клеточного ответа до начала трансформации дает наибольшие шансы иммунной системе контролировать заболевание.

Превентивная вакцинация показала высокий уровень протекции в трансплантируемых моделях опухолевого роста, однако эти модели физиологически сильно отличаются от реальной ситуации онкогенеза. Модели спонтанного роста опухолей являются более близкими условиям нормального развития неоплазии. Использование именно спонтанной модели развития неоплазии наиболее хорошо имитирует естественную ситуацию развития опухоли - длительное формирования, развитие в результате трансфорации единичных клеток, естественный процесс коэволюции опухоли и иммунных механизмов контроля.

Существующие данные по превентивной противоопухолевой вакцинации получены исключительно в генетически-модифицированных мышах и сильно различаются от модели к модели от полной противоопухолевой протекции до небольшого увеличения латентного периода заболевания. Эти модели также не лишены недостатков, затрудняющих оценку перспективности превентивной вакцинации у человека.

Существует острая необходимость в мышиных моделях спонтанного онкогенеза, соответствующих реальной ситуации развития опухоли, что подразумевает экспрессию аутологичного антигена в нормальном генетическом окружении и длительное формирование опухоли. Анализ противоопухолевого эффекта превентивной вакцинации в таких моделях позволит правильно оценить перспективность иммунизации человека.

В качестве антигена в данной работе использован муцин 1, мембранный гликопротеин, играющий важную роль в физиологии нормальных и трансформированных эпителиальных клеток. Гиперэкспрессия муцина детектируется практически во всех аденокарциномах человека, включая более 90% карцином молочной железы, поджелудочной железы, яичников, легких, желудка. В клетках карциномы молочной железы наблюдается более чем 10-кратное повышения количества мРНК муцина 1. Высокий уровень экспрессии в раковых клетках и непосредственное участие муцина 1 в трансформации, метастазировании, выживании трансформирванных клеток в условиях стресса делают его хорошей мишенью для иммунотерапии. Вакцины на основе Муцина 1 человека широко изучаются в моделях роста опухоли на мышах и считаются перспективными для иммунотерапии злокачественных болезней человека.

Цель работы - разработка ДНК-белковой вакцины на основе мышиного муцина 1 и оценка противоопухолевого эффекта превентивной иммунизации в трансплантируемой и спонтанной моделях рака молочной железы у мышей.

В рамках работы были поставлены следующие задачи:

1. Клонировать фрагменты мышиного гена муцина1 в плазмидный вектор для экспрессии в тканях млекопитающих.

2. Получить рекомбинантные белки на основе клонированных фрагменов муцина!.

3. Разработать протокол индукции ответа на муцин 1 у мышей различных линий и сравнить эффективность активации гуморального и клеточного ответа при иммунизации ДНК и комплексом ДНК-белок.

4. Оценить противоопухолевый эффект ДНК-вакцины на основе муцина 1 в трансплантируемой модели рака молочной железы у мышей.

5. Оценить противоопухолевый эффект превентивной иммунизации ДНК-белок вакциной в спонтанной модели рака молочной железы у мышей.

6. Изучить влияние локального воспаления, вызванного введением бактериальных антигенов в места формирования опухоли, на частоту возникновения опухолей и выживание мышей, иммунизированных ДНК-белок вакциной.

Научная новизна

1. Впервые была создана комбинированная ДНК-белковая вакцина на основе муцина 1.

2. Впервые был изучен противоопухолевый эффект превентивной иммунизации мышей вакциной на основе муцина 1 мыши.

3. Впервые в исследованиях по противоопухолевой вакцинации была использована ВУЯВ линия мышей, для которой характерно спонтанное формирование множественных карцином молочных желез, по многим параметрам воспроизводящих семейных рак молочной железы человека.

4. Впервые изучали совместный эффект индукции локального воспаления и иммунизации вакциной на основе муцина 1 на формирование опухолей в спонтанной модели карциномы молочной железы.

Практическая значимость

Нами показано, что двухкомпонентная вакцина, включающая ДНК и белковые фрагменты муцина 1, оказывается более эффективной в индукции как гуморального, так и клеточного звеньев иммунного ответа по сравнению с иммунизацией ДНК. ДНК-белковая вакцина является перспективной для иммунотерапевтических исследований.

Обнаружено, что индукция иммунного ответа на раковый антиген (муцин 1) на стадии, предшествующей неоплазии, приводит к значительному ускорению формирования опухолей у животных (2-х кратному у мышей, иммунизированных с 2 месяцев), в спонтанной модели карциномы молочной железы. Проканцерогенный

эффект иммунизации значительно возрастает в сочетании с дополнительной индукцией воспаления в месте трансформации клеток. Эти данные свидетельствуют о том, что противоопухолевая вакцинация, как профилактическая, так и терапевтическая, может иметь обратный эффект. Индукция иммунного ответа у предрасположенных к раку пациентов может привести к увеличению риска развития неоплазии.

В работе обнаружено исчезновение популяции антиген-специфичных ИНФ-гамма продуцирующих Т клеток и поляризация гуморального ответа по Тх2 типу по мере развития неоплазии в спонтанной модели канцерогенеза.

Одним из направлений развития современной иммунотерапии рака является поиск механизмов усиления иммунного ответа на раковые антигены. Данная работа показывает, что одной из основных причин описанной низкой эффективности потивоопухолевого иммунного ответа является анергизация опухоль-специфичных CD8 Т-клеток в процессе развития опухоли. Низкий уровень ответа на лечение свидетельствует, скорее всего, о необходимости принципиального изменения подходов в иммунотерапии рака от получения и поддержания пула антиген-специфичных цитотоксических лимфоцитов к стимулированию их миграции в опухолевую среду и обеспечению устойчивости к супрессирующим их активность опухолевым механизмам.

Долгий период наблюдения (15 месяцев) в используемой нами спонтанной модели канцерогенеза позволил оценить влияние индукции иммунного ответа к собственному белку на жизнеспособность мышей. Наблюдалось значительное ухудшение выживания иммунизированных мышей и признаки аутоиммунного процесса (непроходимость кишечника, морфологические изменения печени и почек). Апробация работы и публикации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Отдела иммунологии ИБХ РАН, на Всероссийской конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2003 и 2004, зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2004 и 2005, 7th John Hamphrey advanced summer programme in

immunology, 2005, 16th European Congress of Immunology, Paris, 2006, 2-d European Immunology Congress, 13-16 September, 2009, Berlin.

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ в центральной печати и материалах российских и зарубежных научно-практических конференций и съездов. Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, 5 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на 92 страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков, 4 таблицы. Список литературы включает 147 источников, из которых 143 иностранные.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. В исследовании использовали мышей линий BALB/cJCitMoise (далее В/с), CBRB-Rb(8.17)llem (CBRB), BYRB-Rb(8.17)llem (BYRB), полученных в ИБХ РАН.

Клонирование фрагментов муцина 1. Для синтеза кДНК использовали суммарную РНК, выделенную из опухолевых клеток. РНК транскрибировали М-MuLV ревертазой (Бионем, Москва) с помощью олиго-dT праймера 1 час при 37°С. Полученную кДНК использовали для постановки ПЦР с тисI специфичными праймерами, включающими сайты рестрикции для BamHI и Xhol рестриктаз. Нами было клонировано два участка muri, соответствующих экзонам 2-4 (тис234) и 4-6 (тис456). Оба фрагмента были клонированы по сайтам BamHI и Xhol в вектор pET22b(+) (Novagen). Последовательности были переклонированы в вектор pBK-CMV (Stratagene).

Выделение плазмид. Для выделения плазмид использовали Wizard Plus Minipreps DNA purification System (Promega, Madison, USA).

Экспрессия гена muc234 в E.Coli.

Экспрессию белков MUC234 и MUC456 в штамме Е. Coli BL-21 провели по стандартному протоколу (PET system manual). Рекомбинантные белки очищали на Ni-

агарозе (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя. Полученные белки диализовали против PBS, разливали на аликвоты и хранили на - 20°С.

Гель-электрофорез. Для определения гомогенности выделенных препаратов, а также для определения молекулярной массы белков использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле в соответствие с методикой (Coligan et al., 1994)

Инактивированные бактерии. Грам-положительные бактерии Micrococcus lyzodeikticus (ML) наращивали в LB среде, дополненной 2% глюкозой при 28°С до достижения плотности культуры С)П600=0,6. Инактивировали при 60°С, 30 мин. Отмывали в фосфатном буфере (ФБ), растворяли в прежнем объеме. Мышам вводили 50 мкл такой суспензии подкожно.

Иммуно-ферментный анализ. Определение IgGl и IgG2a, специфичных к MUC1, проводили по стандартной методике (Pharmingen). Смесь MUC234 и MUC456 по 2 мкг/мл каждого в ФБ наносили на планшеты (Costar) на ночь. Все дальнейшие инкубации выполнены в 1% бычьем сывороточном альбумине (БСА) в ФБ при комнатной температуре. Между инкубациями планшеты отмывали в 0.05% растворе Tween 20 в ФБ. Использовали биотинированные изотип-специфичные антитела, конъюгат ExtrAvidin-пероксидаза (Sigma Со, USA). Реакцию проявляли ортофенилендиамином и оценивали на ридере планшетов Multiscan МСС/340. Данные представлены как оптические плотности.

Окраска внутриклеточных цитокинов. Спленоциты после гипотонического шока в 0,83% Ш4С1, инкубировали при 37°С и 5% С02 в течение 18 ч в RPMI-1640 (Sigma Со.) с 10% фетальной телячьей сывороткой (ФС) (BioClot Ltd, Germany), ЗООмкг/мл L-глютамина, 50 мМ меркаптоэтанола и антибиотиками (Sigma Со.) в присутствии смеси MUC234 и MUC456 по 5мкг/мл каждого. В последние 6 ч инкубации добавляли брефелдин A (Sigma) по 50мкг/мл. Клетки отмывали в ФБ, содержащем 4% ФС и 0,1% NaN3 (ФБ-цито), и метили анти-СБ4 or CD8 антителами, конъюгированными с FITC (Caltag, USA), в течение часа. После отмывки свободные FcR блокировали 10% мышиной сывороткой в течение 30 мин, отмывали и фиксировали в 1% параформальдегиде в ФБ-цито в течение 30 мин при 37°С. После

отмывки клетки обрабатывали свежеприготовленным 0.2% сапонином (Sigma Со.) в течение 1 ч. После однократной отмывки клетки метили антителами к ИФН-у мыши, конъюгированными с фикоэритрином в течение 2 ч при 4°С. В качестве изотипического контроля использовали смесь мышиных IgG] и IgG2a антител, меченных FITC и РЕ. После окончания инкубации клетки отмывали в ФБ с 1 тМ EDTA и переносили в пробирки для дальнейшего анализа на цитометре.

Цитофлюорометрия. Анализ субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-клеток, продуцирующих IFN-y оценивали на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson, USA) с использованием программы CELLQuest. В работе использовали антитела: анти-CDS-FITC, -CD220-FITC, -CD4-FITC, -CD8-FITC, -ИФН-у-фикоэритрин (РЕ), и изотипический контроль (Caltag, San Francisco, Calif).

Статистический анализ проводили с использованием пакета MS Office Excell по t-критерию Стъюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Создание ДНК-белковой вакцины на основе мышиного гена муцина 1

Для клонирования фрагментов гена муцина 1 были подобраны две пары праймеров, комплементарных последовательностям экзонов 2, 4, 6 гена муцина мыши. Структура гена и расположение праймеров приведена на рисунке 1. Такой набор праймеров позволяет амплифицировать фрагменты гена, кодирующие как внеклеточные, так и внутриклеточные участки молекулы муцина 1. ДНК, кодирующую MUC1, получили из опухоли мышей линии В/с методом ПЦР-ОТ. muc234-f muc456-f

1 2 3 4 5 6 7

muc234-r muc456-r

Рис.1. Структура гена тис1 и расположение полученных фрагментов тис234 и тис456. Штриховкой выделена область тандемных повторов.

Нами были амплифицированы два участка гена муцина 1, соответствующих экзонам 2-4 (muc234) и 4-6 (muc456). Ожидаемые размеры продуктов реакции ПЦР-амплификации составляли 420 (mucin234) и 370 п.о. (mucin 456). На рисунке 2 представлены результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР-ОТ с использованием подобранных пар праймеров. Видно, что оба продукта соответствуют расчетной длине.

VI mtic2J4 miic456 С

500 bp 400 hp

зоо bp

Рис 2. Разделение продуктов ПЦР-ОТ с парами муцин-специфичных праймеров. Матрица-кДНК, полученная из аденокарцином Ва1Ыс. С-контроль, соответствующей продукту амплификации гена бета-актина.

Полученные фрагменты были клонированы по сайтам ВашН1/ХЬо1 в рЕТ-22(Ь+) вектор. Скрининг плазмид проводили методом ПЦР с соответствующими парами муциновых праймеров, наличие вставки подтверждали рестрикцией с использованием ВатН1, ХМ (Рис.3).

М р! Р- рЗ р4 р5 М рЗ рЗ(г)

Л В

Рис.3 Скрининг плазмидрЕТ22Ъ(+) послелигирования тас234 фрагмента.(А) Разделение продуктов ПЦР рекомбинантных плазмид с тис234-специфичными праймерами. (Б) Электрофоретическое разделения продуктов рестрикции положительной плазмиды (рЗ). В качестве маркера (М) длин нанесен амплифицированный фрагмент тис234. Во второй дорожке нерестрицированная плазмида, в 3 дорожке плазмида, обработанная ВатШ, ХИо1

Соответствующие белки MUC234 и MUC456 были получены в бактериях E.Coli (Рис.4). Ожидаемый размер белков составляет 20 кДа, что соответствует нижней полосе. Верхняя полоса соответствует димеру MUC1 белков. В данной работе использовали пулированные белки, содержащие как 20, так и 40 кДа фракцию. Клонированные в рЕТ-22(Ь+) фрагмены муцина 1 были переклонированы в плазмиду pBK-CMV, содержащую цитомегаловирусный промотор, необходимый для экспрессии этих генов в тканях млекопитающих. Специфичность вставки подтверждали секвенированием. В дальнейшем эти конструкты использовали для ДНК-иммунизации.

Анализ гуморального ответа на иммунизацию ДНК. ДНК/белок

ДНК иммунизация является

высокоэффективным методом индукции иммунного ответа на антигены (Doria-Rose, 2003). Клетки млекопитающих способны фагоцитировать экзогенную ДНК и сохранять высокий уровень экспрессии трансфецированных конструкций в течение нескольких недель.

В исследовании использовали мышей линий BALB/cJCitMoise (далее В/с), CBRB-Rb(8.17) 1 lern (CBRB), BYRB-Rb(8.17)llem (BYRB), полученных в ИБХ РАН. Мыши каждой линии были разделены на 3 группы (по 5 мышей в группе). Эксперименты с В/с мышами повторили 3 раза, с CBRB 2 раза, с BYRB проводили один раз.

66 '

31

2u;

i

Рис.4 Электрофореграмма белков М11С234 (вторая дорожка) и М11С456 (третья дорожка) в 15% полиакриламидном геле. М- маркеры молекулярного веса (кДа) сверху вниз: бычий сывороточный альбумин, овальбумин, щелочная ангидраза и ингибитор трипсина.

3 1 г

10 100 1000 Разведение сыворотки

10 100 1000 Разведение сыворотки

Рис.5. Продукция /£(7; (а и в) или 1%С2а (б и г), специфичных к муцину 1, мышами линий В/с, БУКВ и СВИВ, иммунизированных ДНК (тис234 и тис45б) (а и б) или ДНК+белок (М1/С234 и М11С456) (в и г). Сыворотку получали через неделю после второй иммунизации.

Мышей 1-ой группы иммунизировали дважды с интервалом в одну неделю подкожно в основание хвоста смесью плазмид тис234 и тис45б по 5мкг каждой в адъюванте ветЬи Ь<3. Вторую группу иммунизировали смесью плазмид и белков М11С234 и МиС456 также по 5мкг каждого компонента в адъюванте. Контрольную группу иммунизировали ФБ с адъювантом. Кровь забирали через неделю после второй иммунизации. Иммунизация ДНК привела к появлению антител как так и субклассов только у мышей В/с (Рис.5).

Переключение класса иммуноглобулинов зависит от взаимодействия В клеток и Т-хелперов и контекста цитокинов и связано с поляризацией иммунного ответа по типу Тх1 либо Тх2. Наличие антител и 1§02а соответствует формированию

смешанного типа ответа Тх1/Тх2. Иммунизация ДНК+белок вызывала формирование исключительно IgG2a субкласса антител, специфичных к MUC1, у мышей CBRB и BYRB и IgGi/IgG2a ответ у В/с. Таким образом, иммунизация смесью ДНК и белка вызывала выраженный ответ по типу Тх1 у мышей CBRB и BYRB и смешанный ответ у В/с. При этом титры IgG2a антител у В/с также возрасли при комбинированной вакцинации по сравнению с иммунизацией ДНК.

Индукция клеточного иммунного ответа на иммунизацию ДНК. ДНК/белок

Для характеристики клеточного ответа на муциновые антигены мы проводили определение внутриклеточной продукции ИФН-у в CD4+ и CD8+ спленоцитах иммунизированных мышей.

Клеточный ответ на MUC1 оценивали в линиях мышей В/с и CBRB. Индукцию специфичной к MUC1 продукции ИФН-у проводили in vitro стимуляцией спленоцитов, полученных от иммунизированных мышей, смесью MUC1 белков. В таблице представлены усредненные результаты трех экспериментов (в сумме от 9 до 12 мышей на каждую точку). Наибольший уровень экспрессии ИФН-у наблюдался в группах, иммунизированных ДНК+белок. Среди CD8+ Т-клеток от 4,3 (В/с) до 4,8% (CBRB) (от 0,8% до 1,3 от общего числа клеток) отвечали повышенной продукцией ИФН-у на стимуляцию in vitro MUC1 (Рис.6 и Таблица 1).

Таблица 1. Спонтанная и антиген индуцированная внутриклеточная продукция ИФН-у CD4+ u CD8+ Т-клетками из селезенок мышей В/с и CBRB, иммунизированных ДНК (тис234 и тис 456) или ДНК+белок (MUC234 и MUC456)

Иммунизация CD4+ Т-клетки CD8+ Т-клетки

Спонтанная | MUC1 Спонтанная | MUC1

В/с % среди CD4+ Т-клеток % среди CD8+ Т-клеток

Контроль 1,81±0,80 1,62+0,17 3,80±1,31 3,47+1,02

ДНК 1,73±0,15 2,56±0,82 (+0,8)* 5,91±2,84 7,73±2,37 (+1,8)

ДНК+белок 3,05±1,25 4,62±1,15 (+1,6) 10,6+2,5 14,9±3,4 (+4,3)

CBRB

Контроль 2,73±1,15 2,97±0,95 4,43±2,19 480+2,85

ДНК 10,9+3,7 5,67+2,57 11,6±4,15 12,3+3,74

ДНК+белок 7,72+2,25 6,63±3,15 9,32+3,33 14,2±4,15 (+4,8)

Спонтанная продукция ИФН-у была также выше у иммунизированных мышей по сравнению с контрольной группой. У мышей В/с, но не CBRB, выявлялись CD4+ Т-клетки, секретирующие ИФН-у после стимуляции MUC1 in vitro.

Таким образом, двухкомпонентная вакцина, включающая ДНК и белковые фрагменты муцина 1, оказывается более эффективной в индукции как гуморального, так и клеточного звеньев иммунного ответа по сравнению с иммунизацией ДНК.

0.50% 0.57%

flj^:'' ' 13.6%

0,05% 2,7% ■ м

т

Рис. 6 Анализ внутриклеточной MUC1 специфичной продукции ИФН-у CD8+ Т-клетками мышей линий CBRB (верхняя панель) and В/с (внизу), иммунизированных плазмидами (тис234 и тис456) и соответствующими белками (MUC234 и MUC456), стимулированных (справа) либо нестимулированных (слева) ) in vitro ночной инкубацией со смесью белков MUC234 и MUC456

Оценка противоопухолевого эффекта иммунизаиии муцином 1 в трансплантируемой модели аденокарииномы молочной железы мышей

Трансплантируемые модели обладают целым рядом недостатков, однако широко используются для первичной оценки эффективности противоопухолевых вакцин. В эксперименте использовали спонтанные опухоли СВИВ и ВУЯВ самок и

пассируемую in vitro аденокарциному В/с. Аденокарцииомы переносили сингенным иммунизированным мышам. Суспензии клеток в количестве 10б клеток на мышь вводили подкожно в правый бок и еженедельно оценивали размер опухоли и выживание мышей. Опухоли развивались на 14 день после перевивки у мышей В/с, на 28 день у мышей остальных линий, что согласуется с гистологической характеристикой опухоли В/с как агрессивной и быстрорастущей.

Не были обнаружены статистически значимые различия в размере опухолей CBRB и BYRB иммунизированных и контрольных мышей, в то время как у мышей В/с опухоли росли немного быстрее в обоих иммунизированных группах (Рис.7). Динамика роста опухолей отличается у мышей выбранных линий, что отражается на скорости гибели животных. Так быстрое развитие опухоли у мышей В/с сопровождалось гибелью 100% животных к 60 дню после введения опухоли. У мышей линии CBRB скорость роста опухолей была ниже, животные погибали к 84 дню. Мыши линии BYRB отличались промежуточной динамикой роста опухолей.

зо

¡5 !0 -[5 -10 5 0

-группа I (ДНК)

- группа II (ДНК+белок)

- контроль

0 20 40 60

День после инъекции суспензии опухолевых клеток

0 20 40 60 День после инъекции суспензии опухолевых клеток

опухолевых клеток

Рис.7 Рост опухоли у мышей линий BALB/c (A), CBRB (Б), and BYRB (В) , шшунизированных плазмидами (тис234 and тис45б), либо плазмидами и рекомбинантньши белками (MUC234 and MUC456).

Мыши В/с и ВУЯВ линий, иммунизированные комбинированной (ДНК+белок) вакциной, показали тенденцию к лучшему выживанию по сравнению с контрольными

группами. В/с и СВЯВ мыши, иммунизированные только ДНК, погибли раньше контрольных, этот эффект не был обнаружен у ВУШЗ мышей.

Таким образом, было показано, что превентивная иммунизация вакциной, созданной на основе белка муцин 1 и его кодирующей ДНК, вызывает клеточный иммунный ответ, но незначительно влияет на формирование опухолей молочных желез и выживание мышей трех линий в трансплантируемой модели.

Эффективность ДНК вакиины на основе муиина 1 в спонтанной модели рака молочных желез у мышей

В работе использовали мышей линии ВУЯВ, являющихся носителями робертсоновской транслокации ЯЬ(8. ] 7)1ет. Хромосомные перестройки и инсерционный мутаганез, связанный с ММТУ инфекций, приводят к высокой частоте развития неоплазий молочных желез, яичников, ЖКТ, лимфом. У 75% самок БУКВ, не вступавших в размножение, формируются пальпируемые опухоли молочной железы, при этом первые признаки гиперплазии появляются уже к 6 месячному возрасту. У размножавшихся самок частота формирования КМ достигает 95%, при этом частота метастазирования в легкие составляет 100%. Мышей ВУШЗ иммунизировали в холку раз в месяц, начиная с возраста 2-6 месяцев ДНК-белок вакциной в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) в объеме 100 мкл. Группа контроля получала иммунизацию фосфатным буфером (ФБ) в ПАФ в те же сроки. ДНК-белок вакцина состояла из смеси плазмид тис234 и тис456 по 10 мкг каждой, белков МиС234 и МиС456 по 5мкг каждого компонента в ПАФ. Наблюдение проводили в течение 15 месяцев по достижении мышами возраста 17-21 месяцев. Всего провели 10 иммунизаций.

Известно, что уже с 6 месяцев у этих мышей начинают накапливаться гистологические изменения в тканях молочной железы, свидетельствующие о начале процесса трансформации. Таким образом, было интересно проследить зависимость превентивного эффекта иммунизации от того, формировался ли иммунный ответ до трансформации или на ранних стадиях неоплазии. Например, известно, что ИНФ-у способен предотвращать рост опухоли только на самых ранних стадиях ее

формирования. Поэтому можно было ожидать, что превентивный эффект окажется более выражен в группе молодых животных.

В данном исследовании мы пытались также ответить на вопрос, каким образом индукция воспаления в потенциальном месте формирования опухоли влияет на формирование опухоли у иммунизированных животных. Для этого проводили инъекции инактивированных бактерий Micrococcus Lyzodeikticus (ML) в четыре точки в область подмышечных и паховых лимфоузлов (наиболее частые места роста опухоли). Инъекции начинали с 5-ой иммунизации, всего провели 5 инъекций.

Анализ результатов показал проканцерогенный эффект введения бактерий, который был наиболее выражен у мышей младшей группы (Рис.8).

Рис.8. Влияние активации врожденного иммунитета и иммунизации муциновой ДНК-белок вакциной на выживание мышей ВУЯВ и формирование спонтанных опухолей к концу 15 месяца после начала иммунизации. Представлены данные для двух возрастных групп: 17- (левая диарашю) и 21-месячных мышей (правая).

При этом количество опухолей значительно возрастало при введении бактерий иммунизированным мышам. Так, инъекции МЬ приводили к 2,5 кратному повышению количества опухолей в контрольной группе, 4-х кратному - в группе иммунизированных (1,3 и 1,25, соответственно, у мышей, иммунизированных с б месяцев).

Был обнаружен также проканцерогенных эффект иммунизации мышей вакциной на основе муцина 1. Так, в группе иммунизированных животных опухоли формировались у 25% мышей (10% в контроле) через 15 месяцев после начала

15

иммунизации (Рис.8). Опухоль-стимулирующий эффект активации иммунного ответа к муцину 1 отсутствовал у животных, иммунизированных с 6 месяцев. Отрицательный эффект иммунизации муцином 1 на выживание мышей также оказался сильнее выражен в более молодой группе. Выживание иммунизированных мышей было снижено в 2 раза, иммунизированных мышей, получавших бактерии, в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой (аналогичные показатели для старшей группы составляют 1,7 и 1,3, соответственно). Таким образом, оба протокола лечения мышей не только не оказывали противоопухолевого эффекта, но и вызывали стимуляцию возникновения и роста опухоли, сильнее выраженную в более молодой группе .

Влияние иммунизации на экспрессию муцина 1

Поскольку иммунизация индуцирует клеточный и гуморальный ответа на муцин 1, то, возможно, что в процессе роста элиминируются клетки, экспрессирующие муцин 1, и замещаются неэкспрессирующей популяцией. Для проверки данного предположения провели оценку экспрессии муцина 1 в контрольной и иммунизированной муцином 1 группах после восьмой иммунизации, когда у части мышей уже сформировались опухоли размером 5x5 мм. Анализ экспрессии муцина 1 проводили методом ПЦР-ОТ, анализируя появление продуктов реакции начиная с 10 цикла. Оказалось, что в результате иммунизации не наблюдалось снижения экспрессии муцина в опухолевой ткани по сравнению с контролем (Рис.9). Как в контрольной, так и в иммунизированной группах специфичный продукт амплификации муцина появлялся, начиная с 13 цикла, и был экспрессирован на уровне сопоставимом с экспрессией бета-актина (Рис.9).

СснПг тис23-| тис456 Сошг тис234 тис456 Рис 9. Анализ ЭКСПрвССии МуЦИНа I в

[ " ' " " 1 "" ..........опухолевой ткани контрольных (левая

3 дорожки) и иммунизированных мышах БУКВ (правые 3 дорожки) с помощью метода ПЦР-ОТ. Использованы пары праймеров I тис234, тис45б. Контроль—-■-----------—.—--амплификация бета-актина мыши.

Интактные Вакцинированные Агароза 1.5 %.

Анализ гуморального ответа на муцин I

Поскольку иммунизация муцином не привела к противоопухолевому ответу, то необходимо было понять, с чем это связано. Ранее мы показали, что двухкратная иммунизация ДНК-белок вакциной приводила к появлению преимущественно ^02а в титре 1:1000 у трех линий мышей. Увеличение количества иммунизаций не привело к повышению титра антител 1§02а класса. Так, после 10 иммунизаций титр по-прежнему был равен 1:1000 (Рис.10). При этом появлялись антитела субкласса, ассоциированные с активацией Т-хелперов 2 типа. Титр антител достигал 20002500. В контрольной группе наблюдалась достоверная продукция антител к муцину 1 (титр 450), а в группе, получившей МЬ, наоборот, наблюдали стимуляцию продукции (титр 620). В целом, низкий титр антител к муцину свидетельствует о наличии негативной регуляции данного процесса. Таким образом, в процессе формирования опухоли происходит поляризация иммунного ответа по Тх2. Этот тип ответа ассоциирован с активацией преимущественно гуморального ответа, неэффективного в плане противоопухолевой протекции, и подавлением активности цитотоксических лимфоцитов. Из клинических данных известна связь между возрастанием титров опухоль-специфичных антител и плохим прогнозом развития болезни. Данные, полученные в этой работе, подтверждают этот факт, поскольку мы видим возрастание суммарного титра муцин-специфичных антител у иммунизированных и контрольных животных в процессе опухолевой прогрессии.

4000

01еС1 а 1ВС2а

| 3000

Е

* 2000

Контроль МЬ МиС1 М1ТС1/МЬ НМС Группы

Рис. 10 Продукция антител /£(?/ и /£(72а субклассов к муцину 1 после 10-ти ежемесячных иммунизаций. На рисунке приведены усредненные титры антител для 5 мышей и стандартные отклонения. НМС- нормальная сыворотка мыши.

Анализ клеточного ответа на муцин 1

Однако известно, что антитела не являются протективными при ответе на опухолевые антигены. Поэтому далее анализировали продукцию ИФН-у цитотоксическими лимфоцитами в ответ на стимуляцию муцином 1 in vitro. Ранее мы показали, что в результате двухкратной иммунизации данной вакциной наблюдается продукция ИФН-у CD8+ Т-лимфоцитами, стимулированными in vitro муцином 1.

10° 10' 10z 103 CD8-FITC

А (среднее 0.16%)

0,26%

10° 10' 102 юа ю'

CD8-FITC

Б (среднее 0,24%)

р=0,011

. ОД 7%

10° 10

CD8-FITC

В (среднее 0,16%)

10'

■ 0,10%

■

'щШщ

CD8-FITC

Г (среднее 0,09%)

р>0,05

Рис.11. Анализ внутриклеточной MUC1 специфичной продукции ИФН-у CD8+ Т-клетками мышей линий BLRB, иммунизированных ДНК+белок после 2-х (А и Б) и после 8-ми (В и Г) иммунизации. Спленоциты мышей стимулировали (Б и Г) или нет (А и В) in vitro MUC1. Представлены репрезентативные данные. Процент ИФН-продуцирующих CD8+ Т клеток указан в квадрантах. Средние значения по трем мышам приведены под гистограммами. Вероятность различий между стимулированной продукцией и контролем (t-test) указана справа.

экспериментальных группах можно считать негативным последствием иммунизации мышей.

Таблица 2. Изменение состава лимфоцитов (%), инфилътрующих

сэз СЭ4 СБ8 СБ4/8 Ж1.1 ЫКТ С019 СБПЬ СБ4411а

контроль 48° 38 13 2,9 10 3,0 38 3,0 17

МЬ 44 35 11 3,2 9 3,3 44 2,9 15

мисп 36 21 13 1,6 И 3,6 47 3,1 11

мисл/мь 42 32 и 2,9 11 4,1 49 3,0 13

0 Данные приведены в процентах от обгцего числа лимфоцитов.

Признаки аутоиммунных процессов

Как было показано выше, в группах мышей, иммунизированных муцином 1, наблюдали в два раза большую летальность, чем в контрольных группах. При этом часть мышей иммунных групп погибала без опухолей. Анализ прироста веса мышей в процессе эксперимента также показал, что иммунизированные мыши хуже набирали вес (Рис.12).

Группы

Рис. 12. Вес мышей различных групп до иммунизации (5 месяцев) и после 8-ой иммунизации (13,месяцев)

часть мышей иммунных групп погибала без опухолей. Анализ прироста веса мышей в процессе эксперимента также показал, что иммунизированные мыши хуже набирали вес (Рис.12).

26

и

«в а» 24 -

э

3

и 22 -

м

20

□ 5 месяцев В13 месяцев

"Ь

Контроль

МЬ М11С1

Группы

мис1/мь

Рис.12. Вес мышей различных групп до иммунизации (5 месяцев) и после 8-ой иммунизации (13 месяг/ев)

Кроме этого, у 30% мышей иммунизированных групп наблюдали признаки непроходимости кишечника, у одной мыши наблюдали патологию почки и желудка. Поскольку муцин экспрессируется эпителиальными клетками этих органов, то, с определенной вероятностью, ранняя летальность, снижение веса, а также признаки заболеваний внутренних органов свидетельствуют о наличии аутоиммунных процессов. Данные проявления отсутствовали в контрольных группах.

ВЫВОДЫ:

1. Клонированы фрагменты мышиного гена муцина1, соответствующие экзонам 234 и 456, и получены соответствующие рекомбинантные белки.

2. Разработана вакцина на основе комплекса ДНК-белок и липосомального адъюванта, способная вызывать у мышей формирование ответа на Муцин 1 по типу Тх1.

3. В модели перевиваемой аденокарциномы молочной железы показано отсутствие противоопухолевого эффекта ДНК-белок вакцины.

4. Развитие опухоли в спонтанной модели аденокарциномы молочной железы сопровождалось формированием анэргии муцин-специфичных СБ8+ Т клеток и продукцией ^СП антител, ассоциированных с активацией Тх2.

5. Иммунизации ДНК-белок вакциной на стадии, предшествующей малигнизации, значительно ускоряет формирование спонтанных опухолей молочных желез у мышей и ухудшает их выживание.

6. Локальное воспаление достоверно стимулирует рост спонтанных опухолей молочной железы, но не влияет на выживание мышей. Проканцерогенный эффект воспаления наиболее выражен у молодых мышей.

7. Сочетание иммунизации и стимуляции врожденного иммунитета вызывает суммирование и усиление эффектов, приводя как к снижению выживания мышей, так и ускорению формирования опухолей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации: Статьи:

1. Мушенкова Н.В., Моисеева Е.В., Чаадаева А.В., Свирщевская Е.В. Индукция гуморального и клеточного ответа на муцин 1 с использованием ДНК иммунизации. Иммунология, 2006,27, №4, 216-221.

2. Мушенкова Н.В., Моисеева Е.В., Чаадаева А.В., Вискова Н.Ю., Свирщевская Е.В. Эффективность ДНК вакцины на основе муцина 1 в спонтанной модели рака молочных желез у мышей. Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. 2006, №2, 16-23.

3. Мушенкова Н.В. Возможности иммунного контроля опухолей. Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. 2006, №2, 2-15

4. Mushenkova N., E.Moiseeva, A.Chaadaeva, W. Den Otter, E.Svirshchevskaya. Antitumor effect of double immunization of mice with mucin 1 and its coding DNA. Anticancer research, 2005, 25, 3893-3898.

Тезисы:

1. Svirshchevskaya E.V., Mushenkova N.V. Tumor growth in vivo depends directly on soluble factors. Eur J Immunol, Supplement 1/09, 2009, 39, SI, PD10/29.

2. Mushenkova N., E.Moiseeva, A.Chaadaeva, E.Svirshchevskaya. Effect of preventive mucin I vaccination on spontaneous breast cancer in BLRB mice. 16th European Congress of Immunology, Paris, 2005, PD-3808

3. Мушенкова Н.В, Свирщевская Е.В,., Моисеева Е.В., Чаадаева А.В. Исследование противоопухолевого эффекта вакцинации мышей ДНК и белком муцина I. Тезисы докладов и стендовых сообщений XVII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2005.

4. Mushenkova N., E.Moiseeva, A.Chaadaeva, E.Svirshchevskaya. Local activation of innate immunity at the site of tumor growth enhances protective effect of anti-mucin 1 immunization in the transplantable model of mouse breast carcinoma.

7th John Hamphrey advanced summer programme in immunology, 2005.

5. Свирщевская ЕВ, Моисеева ЕВ, Чаадаева A.B., Мушенкова HB, Коцарева ОД. Противоопухолевый эффект иммунизации мышей неассоциированным с опухолью белком десмоглеином 3. Медицинская иммунология. 2004, 6, 3-5, 251.

6. Мушенкова HB, Моисеева Е.В., Чаадаева A.B., Свирщевская Е.В. Противоопухолевый эффект иммунизации мышей ДНК и белком муцином I. Медицинская иммунология. 2004, 6, 3-5, 245.

7. Лысенко АА, Коцарева ОД, Мушенкова Н.В., Дзуцева И.Р., Матушевская, Свирщевская. Создание модели пузырчатки на мышах. Медицинская иммунология. 2004, 6, 3-5, 238.

8. Лысенко АА, Коцарева ОД, Мушенкова Н.В, Свирщевская Е.В. Создание модели пузырчатки на мышах. Тезисы докладов и стендовых сообщений XVI зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2004

9. Масленникова H.A., Мушенкова Н.В., Свирщевская Е.В. Упрощенный метод получения дендритных клеток мышей. Медицинская иммунология. 2003, 5, 3-4, 206.

Заказ № 108-а/10/09 Подписано в печать 20.10.2009 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таН:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мушенкова, Наталия Валентиновна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВСТУПЛЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Распознавание опухоли.

1.2. Система иммунного контроля роста опухоли.

1.3. Индукция толерантности к опухоль-ассоциированным антигенам.

1.4. Стратегии иммунотерапии рака.

1.5. Мышиные модели для изучения противоопухолевого иммунитета.

1.6. Превентивные противоопухолевые вакцины.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ MUC1 АНТИГЕНОВ.

3.1. Клонирования тис234 и тис456 амплифицированных фрагментов муцина 1.

3.2 Экспрессия фрагментов муцина 1 в E.coli.

ГЛАВА 4. ИНДУКЦИЯ ГУМОРАЛЬНОГО И КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА НА МУЦИН 1 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК

ИММУНИЗАЦИИ.

4.1. Анализ экспрессии гена MUC1 в эпителии молочных желез и аденокарциномах молочных желез мышей.

4.2. Анализ гуморального ответа на иммунизацию ДНК, ДНК/белок.

4.3. Индукция клеточного иммунного ответа на MUC1.

ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЭФФЕКТА ИММУНИЗАЦИИ МУЦИНОМ 1 В ТРАНСПЛАНТИРУЕМОЙ

МОДЕЛИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ МЫШЕЙ

5.1. Модели рака молочных желез.

5.2. Влияние иммунизации вакцинами на основе муцина на рост опухолей и выживание мышей.

ГЛАВА 6. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДНК ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ МУЦИНА 1 В СПОНТАННОЙ МОДЕЛИ РАКА МОЛОЧНЫХ

ЖЕЛЕЗ У МЫШЕЙ.

6.1. Спонтанная модель аденокарциномы молочных желез.

6.2. Влияние иммунизации муцином на рост опухолей и выживание мышей в спонтанной модели.

6.3. Влияние иммунизации на экспрессию муцина 1.

6.4. Анализ гуморального ответа на муцин 1.

6.5. Анализ клеточного ответа на муцин 1.

6.6. Инфильтрация опухолей лимфоцитами.

6.7. Признаки аутоиммунных процессов.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия фрагментов опухоле-ассоциированного гена муцина 1 мышей и изучение иммуногенной активности этих фрагментов"

бактериальных антигенов в места формирования опухоли на частоту возникновения опухолей и выживание мышей, иммунизированных ДНКбелок вакциной.ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Мушенкова, Наталия Валентиновна

выводы

1. Клонированы фрагменты мышиного гена муцина 1, соответствующие экзонам 234 и 456, и получены соответствующие рекомбинантные белки.

2. Разработана вакцина на основе комплекса ДНК-белок и липосомального адьюванта, способная вызывать у мышей формирование ответа на Муцин 1 по типу Txl.

3. В модели перевиваемой аденокарциномы молочной железы показано отсутствие противоопухолевого эффекта ДНК-белок вакцины.

4. Развитие опухоли в спонтанной модели аденокарциномы молочной железы сопровождалось формированием анэргии муцин-специфичных CD8+ Т клеток и продукцией IgGl антител, ассоциированных с активацией Тх2.

5. Иммунизации ДНК-белок вакциной на стадии, предшествующей малигнизации, значительно ускоряет формирование спонтанных опухолей молочных желез у мышей и ухудшает их выживание.

6. Локальное воспаление достоверно стимулирует рост спонтанных опухолей молочной железы, но не влияет на выживание мышей. Проканцерогенный эффект воспаления наиболее выражен у молодых мышей.

7. Сочетание иммунизации и стимуляции врожденного иммунитета вызывает суммирование и усиление эффектов, приводя как к снижению выживания мышей, так и ускорению формирования опухолей.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю благодарность своему научному руководителю Свирщевской Елене Викторовне, без ее помощи и руководства работа была бы невозможна, Моисеевой Екатерине Викторовне и Чаадаевой Александре за участие в экспериментах, всем сотрудникам лаборатории клеточных взаимодействий за советы и поддержку, моим родителям и членам семьи за помощь и возможность заниматься работой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мушенкова, Наталия Валентиновна, Москва

1. Шварцбурд П.М. Хроническое воспаление повышает риск развития эпителиальных новообразований. Вопросы онкологии . 2006. Т52 (2): 137144.

2. Шварцбурд П.М. Стволовые клетки и развитие рака и предракового окружения. Молекулярная медицина. 2007(4):3-9.

3. ЛужниковаА.А. MMTV и канцерогенез молочных желез у человека. Молекулярная медицина. 2007(4):9-19

4. Недоспасов С.А., Купраш Д.В. Мол. Биол. Т41 (2):355-368

5. Pardoll D. Does the immune system see tumors as foreign or self? Annu Rev Immunol. 2003;21:807-39

6. Hanahan D, Weinberg R. The hallmarks of cancer. Cell. 2000 Jan 7;100(1):57-70.

7. Khong H, Restifo N. Natural selection of tumor variants in the generation of "tumor escape" phenotypes. Nat Immunol. 2002 Nov;3(l 1):999-1005

8. Janeway C, Travers P, Walport M. Immunobiology. Garland Publishing 2001

9. Van den Eynde В J, van der Bruggen P. T cell defined tumor antigens. Curr Opin Immunol. 1997 Oct;9(5):684-93.

10. Adjei AA. Blocking oncogenic Ras signaling for cancer therapy. J Natl Cancer Inst. 2001 Jul 18;93(14): 1062-74.

11. Diamantis ID, McGandy C, Chen TJ, Liaw YF, Gudat F, Bianchi L. A new mutational hot-spot in the p53 gene in human hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 1994 Apr;20(4):553-6

12. Nahari D, McDaniel LD, Task LB, Daniel RL, Velasco-Miguel S, Friedberg EC. Mutations in the Trp53 gene of UV-irradiated Xpc mutant mice suggest a novel Xpc-dependent DNA repair process. DNA Repair (Amst). 2004 Apr l;3(4):379-86.

13. Maclean J, Rybicki EP, Williamson AL. Vaccination strategies for the prevention of cervical cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 2005 Feb;5(l):97-107.

14. Peng S, Tomson TT, Trimble C, He L, Hung CF, Wu TC. A combination of DNA vaccines targeting human papillomavirus type 16 E6 and E7 generates potent antitumor effects. Gene Ther. 2006 Feb;13(3):257-65.

15. Choudhury A, Kiessling R. Her-2/neu as a paradigm of a tumor-specific target for therapy. Breast Dis. 2004;20:25-31.

16. Gendler SJ. MUC1, the renaissance molecule. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2001 Jul;6(3):339-53.

17. Hollingsworth MA, Swanson BJ. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat Rev Cancer. 2004 Jan;4(l):45-60.

18. Moore A, Medarova Z, Potthast A, Dai G. In vivo targeting of underglycosylated MUC-1 tumor antigen using a multimodal imaging probe. Cancer Res. 2004 Mar l;64(5):1821-7.

19. Gaemers 1С, Vos HL, Volders HH, van der Valk SW, Hilkens J. A stat-responsive element in the promoter of the episialin/MUCl gene is involved in its overexpression in carcinoma cells. J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6191-9.

20. Bieche I, Lidereau R. A gene dosage effect is responsible for high overexpression of the MUC1 gene observed in human breast tumors. Cancer Genet Cytogenet. 1997 Oct l;98(l):75-80.

21. Mukherjee P, Tinder TL, Basu GD, Gendler SJ. MUC1 (CD227) interacts with lck tyrosine kinase in Jurkat lymphoma cells and normal T cells. J Leukoc Biol. 2005 Jan;77(l):90-9.

22. Wykes M, MacDonald KP, Tran M, Quin RJ, Xing PX, Gendler SJ, Hart DN, McGuckin MA. MUC1 epithelial mucin (CD227) is expressed by activated dendritic cells. J Leukoc Biol. 2002 0ct;72(4):692-701.

23. Wesseling J, van der Valk SW, Vos HL, Sonnenberg A, Hilkens J. Episialin (MUC1) overexpression inhibits integrin-mediated cell adhesion to extracellular matrix components. J Cell Biol. 1995 Apr;129(l):255-65.

24. Wesseling J, van der Valk SW, Hilkens J. A mechanism for inhibition of E-cadherin-mediated cell-cell adhesion by the membrane-associated mucin episialin/MUCl. Mol Biol Cell. 1996 Apr;7(4):565-77.

25. Regimbald LH, Pilarski LM, Longenecker BM, Reddish MA, Zimmermann G, Hugh JC. The breast mucin MUCI as a novel adhesion ligand for endothelial intercellular adhesion molecule 1 in breast cancer. Cancer Res. 1996 Sep 15;56(18):4244-9.

26. Rahn JJ, Shen Q, Mah BK, Hugh JC. MUCI initiates a calcium signal after ligation by intercellular adhesion molecule-1. J Biol Chem. 2004 Jul 9;279(28):29386-90.

27. Wen Y, Caffrey TC, Wheelock MJ, Johnson KR, Hollingsworth MA. Nuclear association of the cytoplasmic tail of MUCI and beta-catenin. J Biol Chem. 2003 Sep 26;278(39):38029-39.

28. Beachy PA, Karhadkar SS, Berman DM. Tissue repair and stem cell renewal in carcinogenesis. Nature. 2004 Nov 18;432(7015):324-31.

29. Huang L, Ren J, Chen D, Li Y, Kharbanda S, Kufe D. MUCI cytoplasmic domain coactivates Wnt target gene transcription and confers transformation. Cancer Biol Ther. 2003 Nov-Dec;2(6):702-6.

30. Schroeder JA, Masri AA, Adriance MC, Tessier JC, Kotlarczyk KL, Thompson MC, Gendler SJ. MUCI overexpression results in mammary gland tumorigenesis and prolonged alveolar differentiation. Oncogene. 2004 Jul 29;23(34):5739-47.

31. Spicer AP, Rowse GJ, Lidner TK, Gendler SJ. Delayed mammary tumor progression in Muc-1 null mice. J Biol Chem. 1995 Dec 15;270(50):30093-101.

32. Yin L, Li Y, Ren J, Kuwahara H, Kufe D. Human MUCI carcinoma antigen regulates intracellular oxidant levels and the apoptotic response to oxidative stress. J Biol Chem. 2003 Sep 12;278(37):35458-64.

33. Wei X, Xu H, Kufe D. Human MUCI oncoprotein regulates p53-responsive gene transcription in the genotoxic stress response. Cancer Cell. 2005 Feb;7(2): 167-78.

34. Lotze MT, Tracey KJ. High-mobility group box 1 protein (HMGB1): nuclear weapon in the immune arsenal. Nat Rev Immunol. 2005 Apr;5(4):331-42.

35. Seong SY, Matzinger P. Hydrophobicity: an ancient damage-associated molecular pattern that initiates innate immune responses. Nat Rev Immunol. 2004 Jun;4(6):469-78.

36. Hussein MR. Tumour-HHOiltrating lymphocytes and melanoma tumorigenesis: an insight. Br J Dermatol. 2005 Jul; 153(1): 18-21.

37. Dunn GP, Bruce AT, Ikeda H, Old LJ, Schreiber RD. Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 2002 Nov;3(ll):991-8.

38. Stockert E, Jager E, Chen YT, Scanlan MJ, Gout I, Karbach J, Arand M, Knuth A, Old LJ. A survey of the humoral immune response of cancer patients to a panel of human tumor antigens. J Exp Med. 1998 Apr 20; 187(8): 1349-54.

39. Kaplan DH, Shankaran V, Dighe AS, Stockert E, Aguet M, Old LJ, Schreiber RD. Demonstration of an interferon gamma-dependent tumor surveillance system in immunocompetent mice. Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Jun 23;95(13):7556-61.

40. Shankaran V, Ikeda H, Bruce AT, White JM, Swanson PE, Old LJ, Schreiber RD. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature. 2001 Apr 26;410(6832):1107-11.

41. Street SE, Cretney E, Smyth MJ Perforin and interferon-gamma activities independently control tumor initiation, growth, and metastasis. Blood. 2001 Jan l;97(l):192-7.

42. Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting. Immunity. 2004 Aug;21(2): 137-48

43. Gao Y, Yang W, Pan M, Scully E, Girardi M, Augenlicht LH, Craft J, Yin Z. Gamma delta T cells provide an early source of interferon gamma in tumor immunity. J Exp Med. 2003 Aug 4;198(3):433-42.

44. Taniguchi T, Takaoka A A weak signal for strong responses: interferon-alpha/beta revisited. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001 May;2(5):378-86.

45. Dunn GP, Bruce AT, Sheehan КС, Shankaran V, Uppaluri R, Bui JD, Diamond MS, Koebel CM, Arthur C, White JM, Schreiber RD. A critical function for type I interferons in cancer immunoediting. Nat Immunol. 2005 Jul;6(7):722-9.

46. Girardi M, Oppenheim DE, Steele CR, Lewis JM, Glusac E, Filler R, Hobby P, Sutton B, Tigelaar RE, Hay day AC. Regulation of cutaneous malignancy by gammadelta T cells. Science. 2001 Oct 19;294(5542):605-9.

47. Winter H, Ни HM, Urba WJ, Fox BA. Tumor regression after adoptive transfer of effector T cells is independent of perforin or Fas ligand (APO-1L/CD95L). J Immunol. 1999 Oct 15;163(8):4462-72.

48. Barth RJ Jr, Mule JJ, Spiess PJ, Rosenberg SA. Interferon gamma and tumor necrosis factor have a role in tumor regressions mediated by murine CD8+ tumor-HHOiltrating lymphocytes. J Exp Med. 1991 Mar l;173(3):647-58.

49. Schuler T, Blankenstein T. Cutting edge: CD8+ effector T cells reject tumors by direct antigen recognition but indirect action on host cells. J Immunol. 2003 May 1;170(9):4427-31.

50. Mumberg D, Monach PA, Wanderling S, Philip M, Toledano AY, Schreiber RD, Schreiber H. CD4(+) T cells eliminate MHC class II-negative cancer cells in vivo by indirect effects of IFN-gamma. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Jul 20;96(15):8633-8.

51. Rohn ТА, Schadendorf D, Sun Y, Nguyen XD, Roeder D, Langen H, Vogt AB, Kropshofer H. Melanoma cell necrosis facilitates transfer of specific sets of antigens onto MHC class II molecules of dendritic cells. Eur J Immunol. 2005 Oct;35(10):2826-39.

52. Qin Z, Blankenstein T. CD4+ T cell—mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 2000 Jun;12(6):677-86

53. Pardoll D. Does the immune system see tumors as foreign or self? Annu Rev Immunol. 2003;21:807-39

54. Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting. Immunity. 2004 Aug;21(2): 137-48.

55. Smyth MJ, Crowe NY, Godfrey DI. NK cells and NKT cells collaborate in host protection from methylcholanthrene-induced fibrosarcoma. Int Immunol. 2001 Apr;13(4):459-63

56. Hayakawa Y, Rovero S, Forni G, Smyth MJ. Alpha-galactosylceramide (KRN7000) suppression of chemical- and oncogene-dependent carcinogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Aug 5;100(16):9464-9. Epub 2003 Jul 16.

57. Qin Z, Blankenstein T. A cancer immunosurveillance controversy. Nat Immunol. 2004 Jan;5(l):3-4;

58. Qin Z, Kim HJ, Hemme J, Blankenstein T. Inhibition of methylcholanthrene-induced carcinogenesis by an interferon gamma receptor-dependent foreign body reaction. J Exp Med. 2002 Jun 3;19^v -):1479-90

59. Enzler T, Gillessen S, Manis JP, Ferguson D, Fleming J, Alt FW, Mihm M, Dranoff G. Deficiencies of GM-CSF and interferon gamma link HHOlammation and cancer. J Exp Med. 2003 May 5; 197(9): 1213-9.

60. Erdman SE, Poutahidis T, Tomczak M, Rogers AB, Cormier K, Plank B, Horwitz BH, Fox JG. CD4+ CD25+ regulatory T lymphocytes inhibit microbially induced colon cancer in Rag2-deficient mice. Am J Pathol. 2003 Feb; 162(2): 691 -702.

61. Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. Macrophage polarization: tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends Immunol. 2002 Nov;23(l l):549-55.

62. Nakamoto Y, Guidotti LG, Kuhlen CV, Fowler P, Chisari FV. Immune pathogenesis of hepatocellular carcinoma. J Exp Med. 1998 Jul 20;188(2):341-50.

63. Zou W. Immunosuppressive networks in the tumour environment and their therapeutic relevance. Nat Rev Cancer. 2005 Apr;5(4):263-74

64. Marincola FM, Jaffee EM, Hicklin DJ, Ferrone S. Escape of human solid tumors from T-cell recognition: molecular mechanisms and functional significance. Adv Immunol. 2000;74:181-273.

65. Karre K, Ljunggren HG, Piontek G, Kiessling R. Selective rejection of H-2-deficient lymphoma variants suggests alternative immune defence strategy. Nature. 1986 Feb 20-26;319(6055):675-8.

66. Seino K, Kayagaki N, Okumura K, Yagita H. Antitumor effect of locally produced CD95 ligand. Nat Med. 1997 Feb;3(2): 165-70.

67. Bogen B. Peripheral T cell tolerance as a tumor escape mechanism: deletion of CD4+ T cells specific for a monoclonal immunoglobulin idiotype secreted by a plasmacytoma. Eur J Immunol. 1996 Nov;26(l l):2671-9.

68. Lauritzsen GF, Hofgaard PO, Schenck K, Bogen B. Clonal deletion of thymocytes as a tumor escape mechanism. Int J Cancer. 1998 Oct 5;78(2):216-22.

69. Nguyen LT, Elford AR, Murakami K, Garza KM, Schoenberger SP, Odermatt B, Speiser DE, Ohashi PS. Tumor growth enhances cross-presentation leading to limited T cell activation without tolerance. J Exp Med. 2002 Feb 18;195(4):423-35.

70. Drake CG, Doody AD, Mihalyo MA, Huang CT, Kelleher E, Ravi S, Hipkiss EL, Flies DB, Kennedy EP, Long M, McGary PW, Coryell L, Nelson WG,

71. Pardoll DM, Adler AJ Androgen ablation mitigates tolerance to a prostate/prostate cancer-restricted antigen. Cancer Cell. 2005 Mar;7(3):239-49.

72. Willimsky G, Blankenstein T. Sporadic immunogenic tumours avoid destruction by inducing T-cell tolerance. Nature. 2005 Sep l;437(7055):141-6.

73. Yu P, Lee Y, Liu W, Krausz T, Chong A, Schreiber H, Fu YX. Intratumor depletion of CD4+ cells unmasks tumor immunogenicity leading to the rejection of late-stage tumors. J Exp Med. 2005 Mar 7;201(5):779-91.

74. Pardoll DM. Spinning molecular immunology into successful immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2002 Apr;2(4):227-38.

75. Hartmann G, Weiner GJ, Krieg AM. CpG DNA: a potent signal for growth, activation, and maturation of human dendritic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Aug 3;96(16):9305-10

76. Hurwitz АА, Foster В A, Kwon ED, Truong T, Choi EM, Greenberg NM, Burg MB, Allison JP. Combination immunotherapy of primary prostate cancer in a transgenic mouse model using CTLA-4 blockade. Cancer Res. 2000 May l;60(9):2444-8.

77. Nanda NK, Sercarz EE. Induction of anti-self-immunity to cure cancer. Cell. 1995 Jul 14;82(l):13-7

78. Slingluff CL Jr, Hunt DF, Engelhard VH. Direct analysis of tumor-associated peptide antigens. Curr Opin Immunol. 1994 0ct;6(5):733-40.

79. Gervois N, Guilloux Y, Diez E, Jotereau F. Suboptimal activation of melanoma HHOiltrating lymphocytes (TIL) due to low avidity of TCR/MHC-tumor peptide interactions. J Exp Med. 1996 May l;183(5):2403-7.

80. Slansky JE, Rattis FM, Boyd LF, Fahmy T, Jaffee EM, Schneck JP, Margulies DH, Pardoll DM. Enhanced antigen-specific antitumor immunity with altered peptide ligands that stabilize the MHC-peptide-TCR complex. Immunity. 2000 Oct;13(4):529-38.

81. Li Y, Bohlen P, Hicklin DJ. Vaccination against angiogenesis-associated antigens: a novel cancer immunotherapy strategy. Curr Mol Med. 2003 Dec;3(8):773-9.

82. Lake RA, Robinson BW. Immunotherapy and chemotherapy—a practical partnership. Nat Rev Cancer. 2005 May;5(5):397-405.

83. Sasaki S, Amara RR, Oran AE, Smith JM, Robinson HL. Apoptosis-mediated enhancement of DNA-raised immune responses by mutant caspases. Nat Biotechnol. 2001 Jun;19(6):543-7.

84. Leitner WW, Hwang LN, Bergmann-Leitner ES, Finkelstein SE, Frank S, Restifo MP. Apoptosis is essential for the increased efficacy of alphaviral replicase-based DNA vaccines. Vaccine. 2004 Mar 29;22(11-12):1537-44.

85. Ostrand-Rosenberg S. Animal models of tumor immunity, immunotherapy and cancer vaccines. Curr Opin Immunol. 2004 Apr; 16(2): 143-50.

86. Provinciali M, Smorlesi A, Donnini A, Bartozzi B, Amici A. Low effectiveness of DNA vaccination against HER-2/neu in ageing. Vaccine. 2003 Feb 14;21(9-10):843-8.

87. Guy CT, Cardiff RD, Muller WJ. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 1992 Mar;12(3):954-61.

88. Callahan R. MMTV-induced mutations in mouse mammary tumors: their potential relevance to human breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 1996;39(l):33-44.

89. Czarneski J, Rassa JC, Ross SR. Mouse mammary tumor virus and the immune system. Immunol Res. 2003;27(2-3):469-80.

90. Wang Y, Jiang JD, Xu D, Li Y, Qu C, Holland JF, Pogo BG. A mouse mammary tumor virus-like long terminal repeat superantigen in human breast cancer. Cancer Res. 2004 Jun 15;64(12):4105-11

91. Mant C, Cason J. A human murine mammary tumour virus-like agent is an unconvincing aetiological agent for human breast cancer. Rev Med Virol. 2004 May-Jun; 14(3): 169-77.

92. Katz E, Lareef MH, Rassa JC, Grande SM, King LB, Russo J, Ross SR, Monroe JG. MMTV Env encodes an ITAM responsible for transformation of mammary epithelial cells in three-dimensional culture. J Exp Med. 2005 Feb 7;201(3):431-9.

93. Blishchenko EY, Sazonova OV, Kalinina OA, Moiseeva EV, Vass AA, Karelin AA, Ivanov VT. Antitumor effect of valorphin in vitro and in vivo: combined action with cytostatic drugs. Cancer Biol Ther. 2005 Jan;4(l):l 18-24.

94. Moiseeva EV, Chaadaeva AV,Semushina SG, Demidova YV, Tan J, Dijk J, Otter W. Mouse mammary carcinoma associated with multifocal epithelial lesions as models for multiple cancer cases in familial breast cancer (в печати)

95. Muller WJ, Sinn E, Pattengale PK, Wallace R, Leder P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 1988 Jul 1;54(1):105-15.

96. Hakim FT, Flomerfelt FA, Boyiadzis M, Gress RE . Aging, immunity and cancer. Curr Opin Immunol. 2004 Apr;16(2):151-6.

97. Curigliano G, Spitaleri G, Pietri E, Rescigno M, de Braud F, Cardillo A, Munzone E, Rocca A, Bonizzi G, Brichard V, Orlando L, Goldhirsch A. Breast cancer vaccines: a clinical reality or fairy tale? Ann Oncol. 2006 May;17(5):750-62.

98. Lollini PL, Cavallo F, Nanni P, Forni G. Vaccines for tumour prevention. Nat Rev Cancer. 2006 Mar;6(3):204-16.

99. Doria-Rose N., Haigwood N DNA vaccine strategies: candidates for immune modulation and immunization regimens. Methods 2003 Nov;31(3):207-16

100. Gajewski TF, Meng Y, Blank C, Brown T, Immune resistance orchestrated by the tumor microenviroment. Immunological Reviews. 2006 Vol. 213, 131145

101. Bo Huang, Jie Zhao, Hongxing Li, Kai-Li He, Yibang Chen, Lloyd Mayer, Jay C. Unkeless, and Huabao Xiong Toll-Like Receptors on Tumor Cells Facilitate Evasion of Immune Surveillance. Cancer Res. 2005 65: 5009-5014

102. Wolff JA, Ludtke JJ, Acsadi G, Williams P, Jani A. Long-term persistence of plasmid DNA and foreign gene expression in mouse muscle. Hum Mol Genet. 1:363-369, 1992

103. Haupt К, Roggendorf M, Mann К. The potential of DNA vaccination against tumor-associated antigens for antitumor therapy. Exp Biol Med (Maywood). 2002 Apr;227(4):227-37

104. Sparwasser T, Koch ES, Vabulas RM, Heeg K, Lipford GB, Ellwart JW, Wagner H. Bacterial DNA and immunostimulatory CpG oligonucleotides trigger maturation and activation of murine dendritic cells. Eur J Immunol 28:2045-2054, 1998

105. Kamperschroer C, Quinn DG. Quantification of epitope-specific MHC class-II-restricted T cells following lymphocytic choriomeningitis virus infection-Cell Immunol. 1999. 193(2). 134-46.

106. Kelly M, Alvero A, Chen R, Silasi D, Abrahams V, Cha S, Visintin I, Rutherford T, Мог G,TLR-4 Signaling Promotes Tumor Growth and Paclitaxel Chemoresistance in Ovarian Cancer.Cancer Res. 2006 66: 3859-3868.

107. Huang B, Zhao J, Li H, He L, Chen Y, Mayer L,. Unkeless J, Xiong H. TollLike Receptors on Tumor Cells Facilitate Evasion of Immune Surveillance. Cancer Res. 2005 65: 5009-5014.

108. Chen D, Xia J, Tanaka Y, Chen H, Koido S, Wernet O, Mukherjee P, Gendler SJ, Kufe D, Gong J. Immunotherapy of spontaneous mammary carcinoma with fusions of dendritic cells and mucin 1-positive carcinoma cells. Immunology. 2003. 109(2): 300-307.

109. Chung MA, Luo Y, O'Donnell M, Rodriguez C, Heber W, Sharma S, Chang HR: Development and preclinical evaluation of a Bacillus Calmette-Guerin-MUCl-based novel breast cancer vaccine. Cancer Res. 2003. 63(6): 12801287.

110. Mukherjee P, Madsen CS, Ginardi AR, Tinder TL, Jacobs F, Parker J, Agrawal B, Longenecker BM, Gendler SJ.: Mucin 1-specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J Immunother. 2003. 26(1): 4762.

111. Morgan R, Dudley M, Wunderlich J, Rosenberg S, Cancer regression in patients after transfer of genetically enginered lymphocytes. Science 2006 314 (5796): 126 129

112. PET system manual, 10th edition. P. 42, 48.URL: http://www.takara-bio.co.jp/goods/catalog/pdf/petsys.pdf