Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДЫХАТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА HHODOPSEUDGMONAS PALUSTRIS -

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ДЫХАТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА HHODOPSEUDGMONAS PALUSTRIS -"

■ БИОЛОГИЧЕСКИ! • ФАКУЛЬТЕТ.

На правах.рукописи

Наталья Але ксандровна РОДОВА

ДЬІХА ТЕЛЬНАЯ СИС ТША ; ННОВаРвЕТОСИШ АЗ РАШВИСТЭ

; (Микробиология 03.00.07) :':/.;

;■. . А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой-степени кандидата биологических наук 'л ■ .'

ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА » 197«

Работа выполнена яа кафедре микробиологии Биодогического факультета Московского Государственного уяяверситета. : А- ■

■ * -

V''. , Научные руководители. . \ .■ )■■ ;'•.'...

доктор биологических наук, профессор ' - А»Б«РУБКН • V."- :; ■

■■.- кандидат^биологических наук• - ' р.Н.ИВАНОВСКИЙ ■ ■; "Г;; • ■

■V., • Официальные оппоненты; ;>'■' {,О, " -' : \ ■

^доктор биологических наук» профессор . 7 ; Й.С.КУДАКВ. V' • кандидат биологических наук - - В.М.ГОРЛЕНКО " ' - . ;;: V." ■ '

" Ведущее учреждение:; Институт фотосинтеза АН СССР * . 1 ■■ 1 -'■ -

- Автореферат разослан 1; ■'• 1 11975 г,.' ■*;■' " - '} -:/.-'Л Защита диссертация состоится " :, " ' * • '• 1ЭТ5г. г в " " часов на заседании Секционного Ученого Совета .по .■'. ' ■ ботанике физиолого-биохкмпческого* отделения Биологического факультета,МГУ:(Ь10сква,. Деш1исвие;гора(. МГУ; .Биологический ф-т) ' С диссертацией можно ознакомиться в библио теке Биологического факультета^ :.; '■',■ ■ : : г-.; У''','■'■ -'

т" . ' ;' • Ученый секретарь Совете'■■*.:';.,/- ■■

■">"-'• V-.:-'.-, . каяд.бяол.ваук-д. • ^¿.НИКОЛАЕВА '

Многие представители пурпурных бактерий осуществляют не только фотосинтез, но окисление органических субстратов кислородом, что даэт ш возможность растя в темноте в аэробных условиях.

Большое число работ посвящено исследованию процесса формирования у таких микроорганизмов фотосинтезирующего аппарата при,пэре-ходе темновых культур к условиям фотосинтетического развития. Значительно меньше известно о системах, ответственных за взаишдей-стсие клеток с кислородом и об их изменениях, связанных с переходом анаэробных световых культур к аэробному темповому росту.

К числу несервых пурпурных бактерий, способных, быстро расти в темноте в аэробных условиях, относится Мюлораешюшомя Фотосинтез у этого микроорганизма исследован достаточно подробно, I в то хь вреда его дыхательная цепь и особенности теилового метаболизма изучены мало. В связи с этим задачи настоящей работ состояли в следующем;

X. Выяснить как изменяется рост и потребление некоторых субстратов при переносе культур из анаэробных световых в аэробные гемновые условия.

2. Сравнить скорость дыхания клеток, выросших в разных условиях, а также действие ряда ингибиторов на поглощение ими кислорода.

3. Определить ЩДВ-оксидазную активность и активность отдельных компонентов эле ктрон тра не портной цепи у клеток, выросших в разных условиях.

4. Исследовать состав цитохромов клеток, выросших в присутствии света и в темноте в аэробных условиях.

5. Определить способность к фосформировании, сопряженному

с дыхательной в фотосиатетичеслой злектронтрансдортными системами.

/- тз

.. (^.■■>¡-»0,1.}

I. Объект я методы доследований.

Объектом исследований являлся кн. раїиаігіе, штамм Накецура. ї^льтуру выраидавали на среде Ормеруда {огивгой еї 0,5&

палата при 30°С в аэробных условиях" (яа качалке) а темноте, а также в анаэробных я аэробных условиях на свету (освещенность 2000 лк).

Для опытов использовали клетки из культур в экспоненциальной фазе роста. Бактерий отделяли от среды центрифугированием, промывали 0,05 М фосфатным буфером (рН 6,8) и суспендировали в том же буфере или в свежей среде.

Поглощение кислорода клетками, их екстрактами и препаратами мембран определяли полярографине с ки. Измерения проводили на само-регистрирувдем полярографвії-бо с применением электрода типа Клерка. Использовали суспензию клеток (.200-300 мкг/мл по белку) в фосфатном буфере. Экстракт клеток я препараты мембран вносила не расчета 300-500 мкг по белку на мл проба.

Ассимиляцию клетками бикарбоната и пярувата определяли ра~ диоизотопным методом. К суспензии клеток (50-100 мкг/мл по белку) добавляли 1<4С-бикарбонат или 2-14С-пнруват (1,5-2,0 мк кюрн/ыл). Радиоактивность проб просчитывали торцовым счетчиком р -частиц (Фирсов и др., 1972).

Содержание пярувата б среде определяли колориметрическим методом в виде 2,4-денитрофенилгидреэоЕа (Раисоя, 1960).

Для получения экстрактов д препаратов мембран клетки отделяли от среды центрифугированием, дважды промывали 0,05 К раствором фосфатного буфера (рН 7,4) и разрушали ультразвуком (22 кщ, Э ион) или на прессе. Неразрушенные клетки и крупные фрагменты

отделяли дантрифутированяем ери 40000g в течение 30 мин. Полученный судернатант использовали в качестве грубого экстракта, для получения мембранной фракции исходный экстракт центрифугировали 30 шя. про 150000 g . Ори определении фосфорилированля метод выделения мембран бал несколько модифицирован (Борисов и др., 1970).

Фермента цикла тринарЗоновых кислот в глкоксилзтного шуята определяли в экстрактах клеток согласно известным методикам iКраен ль аикова и др., 1973), Ферменты дыхательной цепи определяли спекгрофотометрически и полярографически в экстрактах клеток, растворимой и мембранной фракции (klemme и.Schlegel, 1969)Каталазу определяли иодометрическим методом (Clayton, 1960>.

Содержаане флавинов в клетках измеряли флуориметрическим методом (Струговшкова, 1Э63). Определение состава цитохромов проводили на дифференциальном спектрофотометре (Борисов в др., 1970) в целых клетках, грубых экстрактах я в мембранной фракции. Содержание гамев разных типов определяла в лиофилизированных клетках (Peterson, 1970).

Фосфорадирование в мембранной фракции клеток измеряли флюори-метрическам методом во образованию НАДФН 8 присутствии гексокмнаэи и глюко ао-6-фоофа тдегвдрог е на зы (котъегк, 1950).

Количество da к териохлорофилла определяли в sue то н-ме таноло-вых экстрактах (Cohen - вагire et »1., 1957).

Белок измеряли по Лоури (ьоттгу et al,, I95l>.

2. .фзктерий в разных; условиях куяьтд^ировавия

Кривые роста культур (рис.!) в анаэробных условиях на свету и аэробных в темноте близки по своему характеру: продолжительность

Время»часа

Рис.1. Рост га», р*1мв«г!» ва среде с малатом в разных

условиях

Условия росте: I - анаэробйве свет, 2 - аэройнне, темнота.

В момент, указанный стрелкой* анаэробная световая культура перенесена в аэробнав условия: 3 - на свет, 4 - в темноту.

лаг-фазы и экспоненциальной фазы роста одияаковы, хотя урожай клеток в темноте ниже. В то «в вреия перенос культура, находнтей-ся в экспоненциальной фазе роста, яз анаэробных световых в аэробные темновне условия вызывает задержку роста ва 10-13 часов. Эта задержка ае связана с идтябирувщиы действием кислороде, поскольку перенос культуры из анаэробных условий в аэробные прв сохранении освещения не влияет на скорость роста. Перенос анаэробной световой культуры в аэробные условия ведет к резкому сна-женио фиксация клетками ^СО^. Однако, и ато обстоятельство не

являето; 1 причиной задержки роста, так как фиксация СО^ ингиби-руе.ея в аэробных условиях аз только в темноте, но и на свету (составляя соответственно 7 и 133 от уровня фиксации СО^ на свету в анаэробных условиях), Переход от анаэробных световых к аэробный темновыи условиям культивирования мало влияет на скорость потребления дирувата аз среды, но включение его углерода в клетки снижается более значительно. Можно было ожидать» что цри росте в темноте у иъ. увеличатся синтез ферментов цикла тракар-

Сюновых кислот, поскольку в таких условиях он является источником НАДН для дахательнсй цепи и увеличивается его роль в анаболических процессах. Однако оказалось, что активность ферментов этого цикла существенно не меняется при выращивадди культур в разных условиях.

Все это говорит о том, что лаг-период при переходе от анаэробных световых к аэробным темновам условиям культивирования обусловлен отсутствием в клетках каких-то систем, необходимых дяя получения энергии за счет окисления органических субстратов кислородом. В связи с этим было проведено изучение дыхательной системы клеток НЪ, ра1иа-Ьг1а, выросших в анаэробных условиях * на свету, а таете ее изменений, связанных с переходом культур к аэробным условиям роста.

3. Доглощднид кис^рро^а целыми кдеткамд

Клетки нь. рв1иа!г1» выросшие в разных условиях, способны Поглощать кислород в отсутствие экзогенных субстратов. В тех случаях, когда уровень эндогенного дыхания был васокш, добавление малата в сукцината увеличивало скорость поглощения 02 клетка-х-тъ

ш в два-три раза» а при вязком уровне зндагевяого дыхания - в девять-десять раз. Дыхание клеток №. ра1и»-Ьг1а как эндогенное, так и в присутствия экзогенных субстратов ингябировалось атебри-ном. цианидом я азидом (табл.1).

Таблица I

Поглощение 0% кле тяамл кь. р*1ов«г1в; выросшими в разных условиях

Условия культивирования Субстрат 02 мкг/ мин X мг белка Ингибитювание. %

Атебрин 10-5 м «С^ 10**%

Анаэробные, свет нет 0,06 0.30 60 70 ео

малат 0,46 60 100 50

__— — _С2Ццинад _ №___ - - .10В- .30-

Аэробные,темнота нет 0,09 0,35 50 80 90

малат 0,80 60 100 80

_ _ 145 . 10О

Анаэробные, свет малат 1,10 65 100 40

аэробные, темнота сукцинат Т,80 50 100 40

(13 час)

Это свидетельствует о том, что поглощение С>2 20 всех случаях связано с функцвонированием э ле кт рон т ранссортной цепи (ЭТИ), в состав которой входят флавопротеиды и оксидазы адтохромной природа.

У клеток, выросших в аэробных условиях в темноте, скорость дыхания как эндогенного, так я в присутствии органических субстратов г полтора-два раза выпи, чем у клеток, выросших в адаэроб-^ ных условиях на свету. У анаэробной световой культуры, перенесенной в экспоненциальной фазе роста в аэробные условия в тешоту

(12 часов), скорость дыхания возрастает, но число клаток не увеличивается. По чувстветельноета к исследованным ингибиторам клетки, выросшие в разных условиях, отличаются незначительно, хотя для клеток из аэробной темновой культуры можно отметать несколько более высокую чувствительность к азиду (табл.!).

4. активность Фешеитов дыхательной пеан

Анаэробная световая культура кь.раЛлшЪг!» обладает НАЛН-ок-шдазной и сукциаатоксвдазноЯ активно с тьв, но значительно меньшей, чем у клеток, выросших в аэробных условиях в темноте (табл.2).

Таблица 2

Активность оксидаз в экстрактах клеток нь, ра1ив-ег!а, выросших г разных условиях

Ферменты Анаэробные, свет Лэробкае, темнота Анаэробные, свет —— аэробные, темнота

НАДН-оксидаза

нмоли субстрата/мин х иг белка 2,2 9,0 10,0

н моли О^/мвн х мг белка 2,0 5,5 1 5,0

НАДФН-оксидаза

н моли субстрата/мин х мг белка 1.0 1.0 1.2

Сукцина токсидаза 7,5

н моля 02/мин х мг белка 2,7

Цитохром-о- ок седа за

н моли субстрата/мин х мг белка 0 3,5 4,0

При инкубации анаэробной фотосинте тиче ской культура в темноте в аэробных условиях (10-12 часов) активное» НАДК-оксидазы и суяци-натоксидазы возрастает, достигая величины, характерной для клеток из аэробной темновой культуры {табл.2). Однако, если клетки инкубируются в среде, не содержащей источников углерода и азота или в присутствии хлорамфеникола, ШДН-оксидазнвн активность не увеличивается (рис.2).

ШЩЬоксидаза н моли/мкн х мг белка

2

10

6

2.

• 4

1,3

5

10

Бремя, часы

Рис.2. Изменение НАДВ-оксидазаой активности клеток

ЕЬ. раїивїгіа в разных условиях инкубации

Условия опыта: I - анаэробные, свет, полная среда;

2 - аэробные, темнота, полная среда; 3 - аэробные, темнота + хлорамфеникол (20 мкг/мл), 4 - аэробные, темнота, среда без источников углерода и азота.

Это позволяет заключить, что увеличение активности НАДН-оксида-аа связано с синтезом определенных компонентов (или компонента) дыхательной цепи.

Грубые экстеиктн клеток КЬ. р&1иа«г1я могут окислять н НАИН, но скорость процесса вдвое ниже, чем скорость окисления НАИН и не увеличивается вря инкубация клеток а в»робяых условиях. Крог,-,е того, вся НАДФН-оксидаэная активность связана с растворимой фракцией.

Цитохром-о-оксидаза обнаруживалась только в клетках, выросших или яроинкубированных 10-12 часов в аэробных условиях. Это можно объяснить тем, что цитохром-с-оксидазяая активность анаэробной световой культуры очень низка или цитохром-с-оксидаза таких клеток не реагирует с цатохромом с млекояитаюцих.

В отличие от оксидаз, активности НАДЦ-Дихлорфенолиндофенол (ДК.ФШ) - ре^уктази, НАШ-цитохром-с-редуктазн и суквдшат-цито-хром-с-редуктазн ве зависели от условий выращивания бактерий (табл.3). Отсюда следует, что скорость окисления НАДН и сукцината кислородом в клетках, выросших в анаэробных условиях на свету, лимитируется конечный участком дыхательной цени.

Таблица 3

Активность ферментов дыхательной цеди в экстрактах клеток ЕЪ. ра!ивЪг1в выросших в разных условиях (н моли субстрата / мия х иг белка)

ферменты Анаэробные, свет Аэробные, темнота Анаэробные, свет аэробные, темнотр

Налатдегидрогена за 1000 ИОО ИОО

НАДН-ДКФИФ-редуктаэа 700 650 600

НАДН-цитохром-с-редуктаза 20 25 20

Сукцил ат-цитохром-с-ре- 17 15

дуктаза

Примечание: знак - измерение не проводили

Независимо от условий выращивания культур НАВД-оксидаза pb. palustris чувствительна к аьшталу, атебрину, антимицину А, а также к цианиду, азиду в СО (табл.4).

Таблица 4

Действие ингибиторов на активность НАДН-оисидазы в экстрактах клеток

Сингибирование, %)

Условия культиви- {Аш га л j А те брпн {Антими- ÍKC i рования ¡ » ; , l^M; 10"% 10""% ICT^M üg-a м 4--f !

"Г

I

¿*ии1 kitlfUMiH

^-rt

со

Анаэробные,свет 30 40 20 40 30 40 10 80 10 65 50 100

Аэробные,темнота 45 30 20 30 45 50 80 100 65 50 70' 100

Анаэробные,свет —»- аэробные, 35 50 30 30 55 30 80 100 40 50 70 100

темнота

Примечание: НАДН- оксидаэная активность измерялась по скорости окисления ШИШ (НАДН) и по скорости поглощения Og в присутствии НАДН (02).

Интересно, однако отметить, что в экстраягах клеток из анаэробной световой культуры Rh. paluatris окисление НАДН менее чувствительно v цианиду, азиду и СО, чем поглощение 0-, в дрисут-ствии НДДН, НАДН-оксидаэа. не чувствительная к этим ингибиторам, связана с растворимой фравдией, а чувствительная - с мембранной. Видимо, в экстрактах клеток НАДН может окисляться не только на кислород, но и на какие-то эндогенные субстраты, однако неясно, существует ли такая возможность i» vivo.

Сравнение чувствительно с ти ЩЩН-оксидазы бактерий, выросши! в разных условиях,« ингибиторам (та5л.4) показывает, что в клерках из аэробной темповой культуры, а таяже после аэробной темяо-вой инкубации клеток, выросших в анаэробных условиях па свету, возрастает активность, чувствительная к цианиду, азиду и СО. В то *е время чувствительность ШЩН-оксидаэы к амиталу, атебрику и аятШАйЦину А практически не меняется. Эти данные также указывают на го, что перестройка дыхательной цепи происходит в ко-аечном, оксидазнои участке.

В отличие от ШЩЬоксидазы, сук це наток сила за менее чувствительна к атебрину и а ми гаду. Вероятно, это обусловлено разным характером флавопрогеидов, участвующих в окислении даншх субстратов. Сукшшагокеидаза почти не ивгибируется антимицином А, но чувствительна к цианиду, азиду я СО. В аэробных условиях культивирования клеток чувствительность сукцянатоксидазы, как и НАДН-ок-сидаэы к этим ингибиторам возрастает (табл.5).

1 Таблица 5

Действие ингибиторов на активность сукцанагоксидаза в экстрактах клеток кь, ра1иэ-Ьг1в (ингибирование,^).

Условия культивирования

Анаэробные, свет

Аэробные, темнота

Аяаэробвне, свет -аэробные, темнота

Амитал 1СГ%

10 10

15

Атебрин

Антими-ЦИН А,

Ю-5«

20 20

15

20 10

10

10"%

75

90

95

10"^

15

55

55

СО

100 100

100

Активность цитоірои-о- оксидазы я ее чувствительность к цианиду, азиду в СО одинаковы в клетках, выросших в аэробных условиях в темноте я в анаэробной световой культуре после инкубации в темноте в аэробных условиях (10-12 часов), что указывает на одинаковую природу этих ферментных систем.

Итак, в аэробных условиях в клетках й». р»іивїгіе Не изменяется ни активность двгидрогеваэ, ни чувствительность ЕШН--оасидаэы в сукцинатоксидазы к ингибиторам флаванового участка ЗЩ. Содержание в клетках флавинов и соотношение ФАД/ШІ также не зависят от условий роста бактерий. В то же время возрастай НАДН-оксидазная и сукдиаат-окслдазная активности, чувствительные я цианиду и аэидг, а также дитохром-с-оксида зная активность. Кроме того, переход мираіив^ів от фото синтетических к аэробным темновым условиям роста сопровождается значительным увеличение» каталазной активности клеток (18 а 42 мк моля Н^О^/ мин х мг белка соответственно).

Все это говорит о том, что при переходе ЕЬ. раЫвЪПв от анаэробных световых в аэробным темношм условиям роста происходит перестройка систем, ответственных за взаимодействие клеток с кислородом. Дыхательная цепь модифицируется в конечном участке, на уровне цитохромоксидазы. Поэтому быдо проведено изучение состава в концентрации цитохромов в клетках БИ. р*1ивЪг1* выросших в разных условиях.

5. Состав и концентрация татохромо^,

Из дифференциальных спектров (рис.3,5) видно, что клетки яь. раїизїгів выросшие как в анаэробных условиях на свету,

так в в аэробных в темноте, содержат значительное количество цигохромов типа с, которыми обусловлен максимум при 552 нм. Плечо при 560 нм говорит о присутствия ци то хромо в типа с' или & . В экстрактах клеток цитохромы типа вис восстанавливаются в аэробных условиях в присутствии сукдияата и НАДН; это' свидетельствует о том, что данные цитохромы входят в состав дыхательной цепи клеток. В отличке от анаэробной световой культуры, при росте ЕЬ,р41д1Я*г1в в темноте в аэробных условиях (рис.5) или при аэробной темновой инкубации клеток, выросших в анаэробных условиях на свету (рис.4), в дифференциальном спектре обнаруживается максимум при 603 нм, характерный для цитохрома типа а. Поскольку этот цитохром локализован в мембранах, использование мембранной фракция клеток позволяет выявить его более отчетливо.

Уменьшение содержания цитохромов типа с в мембранах по сравнению с грубым экстрактом связано с тем, что при разрушении клеток часть их переходит в растворимую фракции (рис.6).

Наличие цитохрома а в клетках дь. ра1ив-<;г1е, выросших в темноте в аэробных условия*, подтверждается анализом СО-производных в экстрактах. В дифференциальном спектре (рис.7 А,Б) ¡экстракта клеток, выросших в аэробных условиях в темноте, автохромом а обус-ловлев максимум при 430 нм я минимум при 443 нм, Второй СО-свя-зываодий пигмент, который реагирует с СО более медленно, обнаруживается как в клетках, выросши в аэробных условиях в. темноте, так и в клетках, выросших в анаэробных условиях на свету (рис. 7 Б, %>., где является единственным СО-евязыватажм компонентом. Он имеет спектр, типичный для цитохрома 4 нь.ра1чв1г!в (Вах^асЬ, 1963) с дифференциальными максимумами при 417, 534 и 592 нм я

Рис. 3

Дифференциальный свенгр / дитионит - 02 / экстракта клеток кь райиз^пг выросших на оъвту в анаэробных условиях.

I 552

^шс. 4 Дифференциальный спектр / дятионит - 0г / экстракта клеток кл ра1ив«г1е, выросших на свету в анаэробных условиях о последуе-Чей инкубацией в аэробных условиях в темноте / 12 часов/.

OD 553

0,005 | 560

Гис. 5 Дилерадпдальвнй спектр / дитионит - 02 / мембран клеток Rh palustris» выросших в аэровных условиях в темноте.

500 550 600 нм

Рис. 6 Дифференциальный спектр / дитионит - 02 / растворимой фракции клеток Rh paloatrie, выросших в аэробных условиях в темноте»

шзнлмуками ори 438, 555 и 592 нм. Количество этого пигмеята при изменении условий роста клеток меняется незначительно (табл.6).

Таблица 6

Содержание цнтохромов, способных к связыванию СО, у ЕЬ.ра1и8^г1в в зависимости от условий роста культур

Условия культивирования Количество цитохромоз (х 10~%олд/мг белка)

Анаэробные, свет 7,7

Аэробные, темнота 11,0

Анаэробные, свет —» аэроб-

ные, темнота С <2 ta О 7,0

Его спектр неотличим к от спектра штохрома о (сьапее, БвіїЬ, 1955). На основании имеющихся данных сделать выбор между этими дптохромамн не представляется возможным.

Наконец, присутствие цитохрома а в клетках ЕЪ. раїиаігів подтверждается анализом пиридиновых производных. В спектре ге-ыохромов в экстракте кислого ацетона из клеток, выросших в темноте в аэробных условиях, обнаруживается характерный для цитохро-ма а максимум при 537 ш. В катках язанаэробиой световой культуры он отсутствует (рис. |0,9).' Сравнение оодержания цитохромов разных типов в клетках йь. роіц»^ів в зависимости от условий роста культур показывает, что ара росте в темноте я аэробных условиях наряду с появлением цитохрома а в них несколько снижается содержание одтохромов тепа с, по-видимому, за счет одтохромов, участвующих в фотосинтетической ЭТИ (табл.7).

09 ( 417

Ріс. 7 Дифференциальный спектр / С0+ днздояиг - дитнояит / экстракта клеток КЬ р«о.ивігів, выросаих в аэробных условиях в темноте. А - после 60 сек. продувания 00; Б - после 3 кип. продувания СО.

Ряо. 8 Дифференциалы^ спектр / С0+ дктжоаит - димонит / экстракта клеток вь Р»1ивЬгів» выросиих в анаэробных условиях на свату.

пиридине/ кислого ацетонового экстракта клеток раїчзігіа, выросв ах на свету в анаэробвых условиях.

Рис. Э Дифференциальный спектр / дитиояит - феррвцианид в целочаои пиридине/ кислого ацетонового экстракта клеток нъ рві^гів, выросших в темноте в аэробных условиях.

Таблица 7

Содержание генов автохромов разных типов (х1СГ"мол^ мг белка) 7 Rh- pelustrl« в зависимости от условий роста культур

Условия культивирования Гем (а) Про т^ гем Ы^з^гем

Анаэробные, свет 0 6,6 60,5

Аэробяые, темнота 0,55 7,5 50,5

Анаэробные, свет —»•

аэробные, темнота 0,36 2,4 46,4

6. Форфосилвроваяие в мембранах клеток

Мембранная фракция из клеток Eh. palustris выросших в анаэробннх условиях на свету, способна осуществлять в темноте окислительное фосфорилированне в присутствии таких субстратов как ВАЛН и сукцинат, однако его скорость (в пересчете; на мг бедка) значительно ниже, чем скорость фотофосфорилирования (табл.в). В мембранах клеток, выросших в темноте в аэробных условиях, скорость фосфорилирования в присутствии НАІЩ и сукци-ната существеано возрастает, фоме того, фосфорилирование идет в присутствии аскорбата + феназинметасульфат (ФМС), что говорит о появлении пункта сопряжения между цитохромами с и а.

Т&блица 8.

Фоофорилирсзаше з мембранах клеток нь, peiastri«^ выросших в разных условиях

АТФ шоли/ I Поглощение |

Условия культивирования

Субстрат

МНЯ X мг

белка

02 в иоли/шя Р/0 х мг белка

Анаэробные, свет

Аэробные, темнота

свет

НШ

сукцинат

асяорбат + ®ЙС

НАДН сукцинат аскорбат +

1.8

0,25 0,70

6,0 15,0

100

1.6 1.6

15,0 17,0

800

0.08 0,2

CS.25 0,40

0,06

Примечание: в пересчете на мг бактериохлорофадла фотофосфо-рилировавие в мембранах клеток, выросших в анаэробных условиях на свату составляет 45 а молей/мяв-

Полученные данвве позволяют представить дыхательную цепь клеток №. palustrisf выросших в анаэробных условиях на свету, в виде следующей схемы:

НАДН -> в -*цит с —пито—02

сукцинат —г- ФЕ^

Окислеяде НАДН л сукцината в этой целя сопряжено с фосфорилирова-нием, хотя уровень образования АТЪ, видимо, недостаточно высок, чтоби обеспечить рост клеток в темноте в аэробных условиях. Однако, возможность функционирования дыхательной цепж, имеющей пуактн энергетического сопряжения, очевидно важна для перестройки метаболизма клеток в синтеза недостающих компонентов более эффективной дыхательной системы. Лимитирующим звеном этой дыхательной дапи является ее конечный, оксидазный участок. При переходе анаэробной световой культуры к аэробным темновнм условиям роста в клетках синтезируется цитохром а, занимающий место терминальной оксида за, В результате перестройки значительно увеличивается НАДН-оксидаэ-ная и сукцинатоксидазная активность клеток, скорость поглощения 02 в образования АТФ,

Дыхательная цепь клеток приобретает следующий вид:

ВДН -* вдт в —* щт о —» гдат а —* О,

сукцинат -► ФП2

7. Свет и ^ислоррд ка^ р^ггляторы,меуаболиэыд,.

Представляет интерес вопрос, чем обусловлена перестройка дыхательной цеди клеток: связана ли она с необходимостью перехода к другому пути долучения энергии или кндуулруется только ариоутстви-ем Од в среде. В связи с этим было проведено сравнение синтеза ЕАДН-оксидазы в анаэробной световой культуре после переноса ее в аэробные условия на свет и в темноту.

Если в темноте основным источником энергии для меток является дыхание, то при переходе из анаэробных в аэробвае условия при

сохранения освещения бактерии сначала ародолкают расти за счет фотосинтеза. Это следует из того, что во-первых, дыхательная цепь "анаэробных" клеток не может обеспечить рост культуры (об этом говорит наличие лаг-фазы при переносе бактерий из анаэробных световых в аэробные темвовые условия) и, во-вторых, дыхание на 60-7(Й иагябируется светом. Однако, на свету в аэробных условиях увеличение НАДН-ок скда з ной активности идет с такой же скоростью, как и в темноте (рис.II) а в клетках синтезируется аито-хром а (рис.12).

Таким образом, перестройка дыхательной цепи клеток Hb.palustris обусловлена только присутствием кислорода в среде я не зависит от наличия света. С другой стороны,известно, что синтез бактеряо-хлорофилла и образование хроиатофоров в клетках яесернах пурпурных бактерий, в ток. числе и ВЬ,palustris (іа,зй«11ев, i960), контролируется р 02 и не зависит от освещения. Можно предположить, что формирование духа теяьной цепи я фотосинтезаруицего аппарата у Eh. palustris регулируется какш*-то обоим механизмом и направление процесса зависит от концентрации 02 в среде.

В результате "разбавления" содержания бактериохлорофилла в клетках, в присутствии даже при наличии освещения они переходят на получение энергии s результате дыхания. Это видно из того, что клетки, перенесенные из аэробных световых в аэробные темновне условия, продолжают расти без какой-либо лаг-фазы.(рис.II). Следовательно, они имеют дыхательную систему, необходиму для роста в темноте в аэробных условиях.

20 30 40 Время, часы

Ряс, II Влияние свеса к кислорода на формирование дыхательной цеди

к фотосиятеэирующего аппарата йь ра1иаЬг1е.

Условия опыта: А - культура перенесена из анаэробных световыг в аэробные световые условия, £ - культура перенесена ив аэробных световых условий в аэробные условия в темноту. I - белок, ыхг/ыж; 2 - Бхл, шсг/ыд; 3 - Бхл/бежок, мкг/иг; * - ШЛИ - оксидаэа, ямоли/ыни х мг белка.

552

Ржа. 12 Дифференциальный сиектр / дитионит - 02 / экстракта клеток ггц выросших я аэробных условиях на свету.

ВЫВОДЫ

1. Несерше пурпурные бактерии я jwliutriit штамм Бакамура, выросшие в анааробних условиях при освещения, способны поглощать кислород, но скорость этого процесса в полтора-два раза ниже,-. чем у клеток, выросших в аэробных условиях

i

в темноте.

2. Дыхание тютек, выросших ва свету в в темноте, связано о функционированием электронтранспортвой цепи, о чем свадательстау-ет его ингибярование атебридон, цианидом и азидом*

3. Клетки, выросшие в аэробных условиях в темноте, обладав! более высокой активность» ЯАДО-оксвдаза я сукпдшноксидаэа, чем клетки из анаэробных световых культур. В отличие от »того, активность дегидрогеваз не зависит от условий роста бактерий.

4. Перенесение клеток яъ. p^luetrle жэ аяаэрсбнях световых в аэробные условия мало влияет ва потребление дирувата, активность ферментов цикла трикарбоновых кислот также не завесит от условий роста культур. В то же время фиксация клетками COg резяо ингибируется кислородом как в темноте, тан и ва свету.

5. Перенесение клеток, выросших в знаэробннх условиях на свету, в аэробные условия на свет не отражается на росте культур* тогда как в темноте в аэробных условиях имеет место яаг-аериод

в 10-12 часов. За это время в клетках значительно увеличиваются Шф-оксидазная и сукцинатоксвдазная активности, что связано с новообразованием компонентов дахатедьяой цедя.

6. Клетки еь. p&iu»tri» из анаэробных световых культур содержат значительное количество автохромов типа с. а также цатохроми типа С. Dpa выращивании культур в аэробных условиях как в темноте, так и ва свету, клетки синтезируют цитсхроф.

7. Мембранные структуры клеток, .выросших в анаэробных уо- ' ^ловияК; на свету а^в аэробных в тешюте. осуществлявд фосфорилиро-' -вение,'. сопряженное с действием дыхательной цепи: Более Эффективен ; • этот процесс у клеток,"ввр^сжих а темноте,при'аэрация.^ / ■ ' Подученнае^результатн :докаэывают,;что;в.услошях аэрашп|1 '

происходит перестройка дыхэтелыюй цепа Мь ра1из*г1в ..'- • ■': ^ в'конечном5 ее участке,--выражающаясяв синтез ецитохромаа,' и!\~ увеличивается ?эффедтавяосгь: дыхательной г слсгеыы в обесяеадяий клеток энергией':' вре зул ьта т ео ки слите льн ого фосфорилировакия.. > .... './"- Э. ШреСгрояКО 3лектронгрансооргной 'сясгешК И1ра1ия£г1« : ' на получение энергии в результате дыхания опрделяется-наличгем'; ■ ■. ■ кислорода в ерзле и-происходит как в темноте, так и на.свету.• •• "'■ ■

■ ■ ; " ■ ' По теме диссертации опубликовены СДеДУ*НЕИв . :\ V; • ;

'.''. ■■ V.-'*; г - - • работ»: '-"''V-Л

I. Успенская В.Э.,. Родова Н. А., Кондратьева Е.Н., 1971. ■-' *1

. ^разоваше^кагалазяфогосяягезяруш

Д" Микробиология, 40, 3,. 455. /.г ';- '--■"■'■"■ -у-.-' . 2» Родова Н.А., Красйльшжова Е.Н. ,, 1974 . ., ■ \' ' ■-■.'-',":/ .' Рост в темноте а НАШ-оксидазная активность мюЛорвеиаошопаа ^

' -ра1ив*г1а. • ;/:*.;/ ' ■.'.'■■' ■'■■■■'.■■

:• . Млкробпологяя,-43,.'2, 20в. : "': ' ■/-''."Х ;■"-"'.- \ ■

.',;',-■■ . Пот. к ио»™ " ^ (\. . • Ф • ы> ¿М-,. у ■*"

■ , ' ФкЭ П. Л. 1,5' ". Уч.-Иэд. Л.' О. Зямз ..'"'.'

и:).1-ии *мт'к<ик;кого университета,' москва. к-9,' v "' : - ' уд' Герцена, 5/7. .

'Твпш'рафия Шд-аа МГУ.- Москва, .'^пиг.ч.! ■. .г

). !

''..-.■■■■г,..-''.;