Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Двухэтапный биохимический скрининг с целью раннего выявления мочекаменной болезни

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Двухэтапный биохимический скрининг с целью раннего выявления мочекаменной болезни"

На правах рукописи

005534406

ГОРШКОВА Марина Анатольевна

ДВУХЭТАПНЫЙ БИОХИМИЧЕСКИЙ СКРИНИНГ С ЦЕЛЬЮ РАННЕГО ВЫЯВЛЕНИЯ МОЧЕКАМЕННОЙ

БОЛЕЗНИ

03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о ОКТ 2013

Тверь-2013

005534406

Работа выполнена на кафедре физико-химической экспертизы биоорганических соединений Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверской государственный университет» и на базе клинико-диагностической лаборатории Клиники ГБОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Доктор химических наук, профессор Лапина Галина Петровна ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Рабинович Д.б.н., профессор, зав. отделом биотехнологий

Людмила Юрьевна ГНУ ВНИИМЗ Россельхозакадемии

Годков Д.м.н., руководитель отдела лабораторной

Михаил Андреевич диагностики НИИ скорой помощи имени

Н.В.Склифосовского

Ведущая организация: ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России

Защита диссертации состоится «31 » октября 2013 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.263.08 при Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70/1 Б, корп. 5, ауд. 318.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Тверской государственный университет» по адресу: 170100, Тверь, ул. Володарского, 44а

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ТвГУ http://university.tversu.ru/aspirants/abstracts/

Автореферат разослан «у? 2013 года

Ученый секретарь 11

диссертационного совета ¿іітЛІ^— Петушков М.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Мочекаменная болезнь - биофизический и биохимический феномен, в результате которого в моче, особенно при высокой ее плотности, наблюдается образование кристаллов, их агрегация и рост, что приводит к нарушению структуры и функции органов мочевыделения (Maslamani S., Glenton P.A., Khan S.R., 2000; Аляев Ю.Г., 2003; Эммануэль В.Л., 2006; Саенко B.C., 2007).

Мочекаменная болезнь занимает второе место в мире после воспалительных неспецифических заболеваний почек и мочевых путей и встречается не менее чем у 3 % населения (Вельтищев Ю. В., 1992; Аляев Ю.Г., 2003; Вощула В.И., 2005; Дзеранов Н.К., Лопаткин H.A., 2007). В частности, анализ статистических данных Минздравсоцразвития РФ с 2006 по 2009 годы показал, что имеет место рост заболеваемости на 37,6% впервые выявленной мочекаменной болезни среди взрослого населения Тверской области. Следует отметить, что из 18 субъектов Федерации Центрального Федерального округа в 2009 году Тверская область по количеству впервые выявленных заболевших мочекаменной болезнью занимала 11 место, а по приросту - лидирующее первое место.

В настоящее время диагноз мочекаменной болезни при обращении пациента с острой болью устанавливают, используя стандарт (Приказ МЗСР РФ № 378 от 03.06.2005 года), включающий данные ультразвукового, рентгенологического, а также биохимического исследования крови и мочи. Это позволяет провести диагностику на выявление мочевых камней, но носит случайный характер. Наиболее эффективен скрининг, основанный на применении комплекса биохимических методов для лиц, не имеющих на момент проведения обследования клинических признаков выявляемого заболевания при плановом профилактическом обследовании (диспансеризации). Вопрос о необходимом и достаточном объеме проведения биохимического скринингового обследования среди пациентов с заболеваниями почек для исключения мочекаменной болезни остается открытым и дискуссионным, поскольку критерии диагностики субклинических форм не сформулированы в полной мере (Лисовая H.A., 2001; Дзеранов Н.К., Бешлиев Д.А., 2003, Сулейманов С.И., 2008).

В то же время только скрининговые исследования позволяют не только выявить заболевание на раннем этапе его возникновения, но и улучшить прогноз течения заболевания. Следует отметить, что проведение биохимического скрининга в тех или иных группах риска будет возможно при достаточной экономической оценке эффективности скрининговых программ.

В клинико-диагностических лабораториях в настоящее время используются методы количественного определения концентрации солей, образующих кристаллы (Голованов С.А., Дрожжева В.В., 2010), а также определения веществ, препятствующих кристаллообразованию (Лисовая H.A., 2006). Феномен кристаллизации устанавливается при применении комплекса диагностических тест-карт и белкового реактива - «ЛИТОС-система для определения активности процесса кристаллообразования» (Шатохина С.Н., Шабалин В.Н.,1997, Шатохина С.Н., Шабалин В.Н.,2009).

В связи с этим актуальность разработки и применения новых методических подходов для создания эффективной схемы скрининга определяется тем, что при своевременном использовании биохимических лабораторных методов диагностики, особенно в лабораториях амбулаторно-поликлинических лечебно-профилактических учреждений, куда в первую очередь обращаются пациенты,

3

можно прогнозировать риск появления и развития мочекаменной болезни до клинических проявлений.

Цель и задачи исследования. Разработка, апробация и оценка экономической эффективности новой схемы, основанной на применении двухэтапного скрининга, включающей комплекс физико-химических и биохимических методов исследования мочи с целью раннего выявления изменений состава мочи, приводящих к появлению и дальнейшему развитию мочекаменной болезни: на первом отсеивающем этапе скрининга на основе использования реакций определения кристаллообразующей способности и уреазной активности оценивается интенсивность кристаллообразования; на втором уточняющем этапе, который включает определение активности ряда ферментов (ЛДГ, ЩФ и ГГТ), анализируются данные, несущие информацию о степени патологического процесса в мочевыводящих путях.

Для достижения поставленной цели необходимо выполнение следующих задач:

• Разработать экспресс-методику для одновременного параллельного определения кристаллообразующей способности (тест на кальцифилаксию) и уреазной активности мочи и определить аналитические характеристики этой методики для использования на первом этапе скрининга;

• Отобрать необходимый и достаточный перечень реакций для второго этапа скрининга и определить биологические референтные величины методик первого и второго этапов скрининга для практического использования в клинико-диагностических лабораториях первичного звена здравоохранения;

• Разработать алгоритм принятия решений;

• Апробировать разработанную схему двухэтапного скрининга в условиях профилактического осмотра студентов, оценить диагностическую чувствительность и специфичность предлагаемого скрининга;

• Рассчитать стоимость затрат на проведение двухэтапного биохимического скрининга и провести оценку экономической эффективности для раннего выявления мочекаменной болезни.

Научная новизна результатов исследования.

Впервые сформулирована приоритетная система двухэтапного биохимического скринингового обследования с использованием комплекса современных эффективных физико-химических и биохимических методов с целью раннего выявления изменений состава мочи. Разработан алгоритм принятия решений при плановом профилактическом обследовании, направленный на раннее выявление изменений в моче, приводящих к появлению и развитию мочекаменной болезни.

Модифицированы и адаптированы лабораторные методы для использования в клинико-диагностических лабораториях первичного звена здравоохранения.

Теоретическое значение и внедрение результатов в практику.

Результаты выполненных исследований способствуют более глубокому пониманию молекулярно-биохимических механизмов кристаллообразования в моче и его регуляции и могут быть использованы для раннего прогноза, а также последующего развития этого процесса, возникающего как при метаболических нарушениях, так и при бактериальной инфекции, и приводящего к появлению мочекаменной болезни. Разработанная схема биохимического скрининга эффективна при использовании для наблюдения

динамики хода изменений состава мочи и выбора способов назначения водного и пищевого режима, а также проведения лекарственной терапии мочекаменной болезни.

По материалам исследований разработаны и опубликованы методические рекомендации для врачей клинико-диагностических лабораторий (КДЛ), которые внедрены в практическую деятельность КДЛ Поликлиники ГБОУ ВПО Тверская ГМА МЗ РФ, КДЛ Детских городских клинических больниц № 1 и № 2 города Твери, что подтверждено актами внедрения.

Практическая значимость выполненных исследований.

Применение двухэтапного скрининга, включающего использование современных физико-химических и биохимических методик, дает реальную возможность выявлять ранние формы, планировать и своевременно реализовывать мероприятия по профилактике и совершенствованию амбулаторно-поликлинической помощи при заболеваниях органов выделительной системы.

Разработанный в данной работе алгоритм принятия решений дает возможность своевременно выделять группы высокого риска по формированию данной патологии и эффективно проводить комплекс профилактических мероприятий, а также отслеживать динамику хода заболевания в процессе лечения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная и опробованная двухэтапная система скрининга, основанная на применении комплекса лабораторных физико-химических и биохимических методов, часть из которых разработаны и предложены автором как экспресс-методики, позволяют выявить ранние изменения состава мочи, приводящих к возникновению мочекаменной болезни.

2. Модифицированные физико-химические и биохимические методы первого этапа скрининга, включающие количественное определение кристаллообразующей способности и уреазной активности мочи, оценены с позиции аналитических характеристик: воспроизводимости, точности и чувствительности.

3. Созданные схемы двухэтапного биохимического скрининга позволили определить биологические референтные значения методик, используемых в работе, а также сформировать алгоритм принятия решений.

4. Двухэтапный биохимический скрининг позволяет достоверно выявить на раннем этапе возникновение мочекаменной болезни и улучшить прогноз её течения.

5. Расчеты диагностической специфичности и диагностической чувствительности доказывают клиническую значимость проведения двухэтапного биохимического скрининга.

6. Расчетами себестоимости затрат подтверждена экономическая обоснованность и показана экономическая эффективность проведения двухэтапного биохимического скрининга.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Полученные результаты соответствуют пунктам 10, 12 паспорта специальности 03.01.04 «Биохимия (биологические науки)».

Апробация и реализация результатов диссертации Основные положения и выводы диссертации апробированы в выступлениях на научных конференциях. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете

5

концепции развития здравоохранения России до 2020 года», Москва, 2009; научно-практическая конференция «Лабораторная наука - практике: первое десятилетие 21 века», Москва, 2010; научно-практической конференции «Обеспечение доступности современных клинических лабораторных исследований: аналитические возможности, клинические потребности, организационно-экономические условия», Москва, 2011; Научно-практической конференции «Реальные клинико-диагностические лабораторные услуги: качество, себестоимость и цена, степень соответствия современным стандартам лабораторной медицины», Москва, 2012; на XIX Региональных Каргинских чтениях «Физика, химия и новые технологии» (Тверской государственный университет, Тверь, 2012), на Девятых Курдюмовских чтениях «Синергетика в общественных и естественных науках (Тверской государственный университет, Тверь, 2013), получена серебряная медаль на конкурсе «Инновационный потенциал молодежи - «Архимед-2013» за разработку «Способ прогнозирования патологии почек у детей в возрасте 3-7 лет, часто болеющих острыми респираторными заболеваниями».

Полученные результаты используются в исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре физико-химической экспертизы биоорганической соединений ТвГУ; в лекциях по клинической лабораторной диагностике курса клинической лабораторной диагностики ФПДО при кафедре биохимии Тверской государственной медицинской академии.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ в журналах и сборниках, в которых отражены основные положения диссертационной работы, из них 7 - в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ; получен патент RU № 2447442 от 29.07.2010, получены приоритетные справки: «Способ раннего выявления возможности инфекции мочевыводящих путей у детей 3-7 лет» № 2013114453 и «Способ раннего выявления дисметаболической нефропатии у детей 3-7 лет» № 2013114456.

Личный вклад. Все основные результаты диссертации получены автором самостоятельно или в соавторстве при его непосредственном участии.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 178 источника, из которых 50 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 13 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во «ВВЕДЕНИИ» обоснована актуальность диссертационной работы, дана постановка проблемы, определены цель и задачи исследования.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава содержит обзор источников научной литературы за 1989 - 2013 годы по основным физико-химическим теориям образования кристаллов в моче, подробно обсуждены вопросы состава и структуры органической матрицы мочевых камней и факторы, влияющие на образование камней в мочевыводящих путях, рассмотрены научные основы современных физико-химических и биохимических методов лабораторной диагностики для определения наличия солей, кристаллов, камней.

Дана характеристика заболеваемости мочекаменной болезнью в структуре почечной патологии в Российской Федерации, Центральном

6

Федеральном округе и Тверской области; подчеркнуты особенности проведения скрининговых обследований, описаны принципы и клинико-экономический анализ применительно к скрининговому обследованию.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом исследования служили образцы мочи 304 пациентов и 206 студентов ГБОУ ВПО Тверская ГМА МЗ РФ, из них 205 проб пациентов мужского пола и 305 проб пациентов женского пола в возрасте от 3 до 76 лет.

Образцы мочи подвергались общепринятому клиническому исследованию мочи «Общий анализ мочи», включающему в себя физико-химические и биохимические параметры (количество, цвет, прозрачность, относительная плотность, определение белка, глюкозы, кетоновых тел, билирубина, аскорбиновой кислоты, лейкоцитов и гемоглобина), а также исследование осадка мочи с использованием бинокулярного оптического микроскопа Olympus СН 30/СР 40.

Кроме того, дополнительно пробы мочи исследовали по двухэтапному предлагаемому в работе алгоритму (по программе «Скрининг мочекаменной болезни»), состоящему из модифицированного автором экспресс-метода количественного определения кристаллообразующей способности и уреазной активности мочи на первом этапе скрининга, с использованием термостата ТС-80 (Россия) и микропланшетного мультидетектора Zenyth 1100 (Австрия).

В комплекс биохимических методов исследования мочи на втором этапе включены следующие методы определения активности: гамма -глутамилтрансферазы (у-ГГТ, КФ 2.3.2.2.); щелочной фосфатазы (ЩФ, КФ 3.1.3.1); лактатдегидрогеназы (ЛДГ; КФ 1.1.1.27); концентрации: кальция, фосфора, креатинина по методу Яффе. Все методики второго этапа скрининга выполняли с использованием коммерческих наборов реактивов фирмы BIOCON (Analyticon) (Германия) на автоматическом биохимическом анализаторе FLEXOR Е (Нидерланды).

Для расчета диагностической специфичности и чувствительности модифицированного автором экспресс-метода количественного определения уреазной активности мочи использовали классический бактериологический метод (посев мочи на среды с использованием DipStreak).

Статистический анализ полученных результатов осуществляли с помощью компьютерной программы SPSS 12.0 (фирмы SPSS Inc., США). Для определения достоверности различий средних значений в исследуемых группах применялся двухсторонний t-критерий Стьюдента, как для зависимых, так и для независимых выборок. В случаях, когда данные имели отклонения от нормального распределения, использовались непараметрические статистические критерии, в частности U-критерий Манна-Уитни. Также использовали пакет программ Excel версия 7.0., раздел программ «Анализ данных». Различия между сравниваемыми величинами признавались статистически достоверными при уровне значимости р<0,05 по критерию Стьюдента.

3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для проведения предлагаемого в работе двухэтапного скрининга в структуру первого этапа была включена модифицированная методика определения кристаллообразующей способности мочи (тест на кальцифилаксию), традиционно используемая в педиатрии как качественная методика, рекомендованная в качестве скрининг-теста МосОМКЗ НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РСФСР в 1985 году (Юрьева Э.А., Казанская И.В., Азизов Н.В. и др, 1985). Определение уреазной активности мочи вели с

7

применением базовой методики, разработанной в 1995 г. на базе клинико-биохимической лаборатории Научного Центра Урологии им. Б.У.Джарбусынова (Меркушева, Н. В, 1997).

Модификация вышеуказанных методик была направлена на то, чтобы использовать их в профилактических осмотрах в качестве экспресс-методики. Предложенная автором модификация методов состояла в следующем :

1. Использование 96-луночного планшета, что позволило сократить время и одновременно выполнять две методики (кристаллообразующую способность и уреазную активность мочи) в одном микропланшете.

2. Сформулированная модификация выполнения методов изучения кристаллообразующей способности и уреазной активности мочи сделала возможным переход от качественных методик к количественным с использованием калибровочных графиков.

3. Кроме того, осуществление методик не в традиционных пробирках, а в 96-луночном микропланшете, позволило восьмикратно сократить расход химических реактивов и, таким образом, снизить себестоимость проведения анализа.

Метод, используемый для выполнения первого этапа скрининга, основан на том, что при добавлении к пробе мочи 10%-ного водного раствора СаС12 образуется стабильная суспензия — нерастворимый осадок солей, присутствующих в моче пациентов с высоким риском развития почечной патологии. Известно, что в норме помутнения не наблюдается (Юрьева Э.А., Казанская И.В., Азизов Н.В. и др., 1985). Разная интенсивность мутности суспензии свидетельствует не только о патологии, но и степени активности процесса кристаллообразования, которую можно выразить в численном эквиваленте. Для проведения первого этапа скрининговых исследований взаимодействие мочи с 10 %-ным водным раствором хлорида кальция выполняли в 96-луночном микропланшете по следующей схеме, приведенной в табл. 1.

Таблица 1 - Схема постановки реакции в 96-луночном планшете

№ Лунок Контрольные пробы № лунок Опытные пробы

Al Бланк 0,275 мл Н20 А2 Бланк 0,25 мл Н20 + 0,025 мл 10% СаС12

В1 Стандарт 0,25 мл оксалата натрия + 0,025 мл Н20 В2 Стандарт 0,25 мл оксалата натрия + 0,025 мл 10% СаС12

С1 0,25 мл мочи + 0,025 мл Н20 С2 0,25 мл мочи + 0,025 мл 10% СаС12

Таким образом, на одном микропланшеге можно одновременно исследовать до 46 проб мочи пациентов. Содержимое лунок микропланшета осторожно перемешивали, после чего измеряли значения оптических плотностей фотометрически на микропланшетном ридере при длине волны 620 нм. Для определения уреазной активности мочи содержимое лунок микропланшета термостатировали в течение 1 час при температуре 37° С. После чего снова перемешивали содержимое лунок и измеряли значения оптических плотностей на микропланшетном ридере при длине волны 620 нм. Для количественной оценки интенсивности помутнения содержимого лунок использовали единицы по

ЗЬапк-Ноа£1апс1 (единицы Б-Н), которые определяли по калибровочному графику, построенному по водному раствору бария хлористого (0,0481 моль/л) и раствора серной кислоты (2,5 моль/л).

Значения концентраций стандартных растворов и полученных оптических плотностей для построения калибровочной кривой приведены на рис. 1

Рис.1 Калибровочный график для расчета кристаллообразующей способности мочи в единицах Э-Н

Для количественного определения уреазной активности мочи использовали международные единицы активности ферментов - Е/дл. Формула расчета уреазной активности (У А) в Е/дл представляет собой УАМ

(Е/дл)=ДБх 1165,954, где ДБ - изменение оптической плотности до термостатирования и после термостатирования, 1165,954 - коэффициент пересчета на уреазную активность мочи (получен опытным путем).

Были определены и оценены аналитические функциональные характеристики модифицированного метода, составляющего первый этап биохимического скринингового обследования. В полном соответствии с ГОСТ Р 51352-99 «Наборы реагентов для клинической лабораторной диагностики. Методы испытаний» провели следующие виды оценок:

1. Разброс результатов при параллельных определениях одной пробы в соседних лунках (разность (Д Б) оптической плотности отличалась до термостатирования на 0,004 ± 0,001 и после термостатирования на 0,005 ±0,001.

2. Чувствительность метода, то есть минимальное количество вещества, которое может быть обнаружено при помощи данного метода анализа в данных условиях, составила: для кристаллообразующей способности мочи - 0,097 единиц Б-Н , для уреазной активности мочи - 7,730 Е/дл.

3. Точность разработанного метода определяли по отклонению от стандартной величины. Для этого брали стандартный раствор оксалата натрия с известным значением концентрации и вычисляли погрешность отклонения от стандартной величины. Стандартная ошибка при проведении исследования составила 2,29%, точность методики — 97,52 %.

4. Воспроизводимость метода рассчитывали с помощью коэффициента вариации (СУ). Для нахождения воспроизводимости брали 10 повторных проб одного образца мочи, выполняли опыты по вышеуказанной методике и расчитывали среднее значение, затем определяли коэффициент вариации, который составил 1,6 %.

Таким образом, определены аналитические характеристики для выполнения экспресс-метода 1-го этапа скрининга. Определение «Биологическихреферентных интервалов» предлагаемых модифицированных методов, используемых на первом этапе скринингового

обследования

Согласно ГОСТ Р 51352-99 для количественных методик исследования должны быть приведены биологические референтные интервалы. Опыты по количественному определению кристаллообразующей способности и уреазной активности мочи провели на пробах мочи с профилактических осмотров.

Использовали 179 образцов мочи женщин и 125 образцов мочи мужчин, доставленных в лабораторию (случайный выбор). Таким образом, если распределение признака отвечает закону Гаусса, то нормальные лабораторные показатели определяют как среднее значение показателя для здоровой популяции плюс два стандартных отклонения (+280). По полученным данным достоверных различий между полученным значениями у мужчин и женщин не было выявлено. В табл.3 и рис.2 и рис.3 приведены усредненные данные (для мужчин и женщин) значений кристаллообразующей способности и уреазной активности мочи.

Таблица 3. Полученные данные кристаллообразующей способности (КОСМ) и

уреазной активности мочи (УАМ) обследованных (п=304)

Параметры описательной статистики Кристаллообразующая способность мочи, в ед 8-11 (КОСМ) Уреазная активность мочи, в Е/дл (УАМ)

Среднее 9,366 141,403

Стандартная ошибка 0,911 10,555

Медиана 0,803 42,557

Стандартное отклонение 15,879 184,035

Уровень надежности (95,0%) 1,792 20,771

менее 0 0-11,2 11,2-41,1 более 41,1

Рис. 2 Распределение значений полученных данных кристаллообразующей способности мочи (КОСМ) В проведенном исследовании у 83 пациентов, что составляет 27,3% всех обследованных, значения кристаллообразующей способности мочи оказались выше верхней границы, то есть больше 11,158 ед Б-Н, причем у 17 пациентов из этого количества (5,59%) значения кристаллообразующей способности мочи были выше 41,124 ед 8-Н, что означает о достоверных изменениях в составе мочи, которые могут с большой вероятностью привести к возникновению скрытых форм заболеваний мочевыводящей системы.

Одним из факторов, способствующих образованию кристаллов, является наличие уреазообразующей микрофлоры в моче (Меркушева Н. В., Юшина Л. В., Махонина И. А., 1997). Микробы в процессе своей жизнедеятельности выделяют в мочу фермент уреазу (К.Ф. 3,5.1.5) - карбамидамидогидролазу, которая представляет собой белок и имеет различную активность в зависимости от вида микроорганизма. Под действием фермента уреазы повышается рН мочи, уровень аммония, что все уропатогенные штаммы, выделенные из почечных камней, способны к уреазопродукции и биопленкообразованию, что может служить центром кристаллизации камня и резервуаром хронической инфекции в организме. При цистиновых, уратных и оксалатных камнях моча чаще мало инфицирована или стерильная (Эгамбердиев Д.К., 2013).

.......

1 1

I

менее О 0-162,2 162,2-509,5 более 509,5

Рис. 3 Распределение значений полученных данных уреазной активности мочи

(УАМ)

В проведенном исследовании у 100 пациентов (32,89%), значения уреазной активности мочи оказались выше верхней границы, то есть больше 162,173 Ед/дл. У 13 пациентов (4,28% всех обследованных) из этого количества значения уреазной активности мочи оказались больше 509,5 Ед/дл.

Таким образом, были определены значения для определения биологических референтных интервалов для женщин и для мужчин, причем достоверных различий между показателями у мужчин и женщин не выявлено.

Определение «Биологическихреферентных интервалов» биохимических методов, используемых на втором этапе скринингового

обследования

Гиперферментурия является универсальной ответной реакцией на повреждение почечной ткани (Константинова О.В., 1999). По спектру ферментурии можно судить о локализации поражения канальцевого эпителия. В связи с этим на 2-м этапе были выбраны методы определения активности некоторых ферментов в пробах мочи. Известно, что при поражении проксимальных канальцев в моче повышается активность щелочной фосфатазы и активность гаммаглутамилтрансферазы, а при поражении дистальных отделов (некрозы эпителиальных клеток) — повышается активность лактатдегидрогеназы (Куликова Н.Ю., 2010). Причем, у каждого пациента активность ферментов и концентрация солей индивидуальны.

Определение концентрации кальция и фосфора в моче необходимо для подтверждения их увеличенной концентрации для формирования кристаллических структур (конкрементов). Кроме того, увеличение активности камнеобразования сопровождается снижением экскреции с мочой

камнеобразующих солей, что обусловлено включением их в формирующийся конкремент (^исЫ М. е1 а1., 1990). Следовательно, «метаболический статус» пациента с МКБ может быть адекватно оценен только при отсутствии растущего камня в мочевых путях. Уровень креатинина был выбран как универсальный маркер, используемый для расчета клиренса выведения веществ. Так как второй этап более дорогостоящий по затратам и достоверных различий в результатах между мужчинами и женщинами на первом этапе не было выявлено, было изучено 60 проб мочи пациентов обоего пола для расчета биологических референтных интервалов. Полученные биохимические данные мочи (активности ферментов (щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы и гаммаглутамилтрансферазы) и концентрации креатинина, кальция и фосфора) представлены в табл.5.

Таблица 5. Полученные биохимические данные мочи (п=60)

Параметры описательной статистики ЩФ, Е/л ДЦГ, Е/л ггтп, Е/л Креатинин, ммоль/л Са, ммоль/л Р, ммоль/л

Среднее значение 8,301 28,561 53,210 10,905 4,623 17,369

Стандартная ошибка 1,367 5,240 5,173 0,823 1,154 1,474

Медиана 5,25 14,615 44,215 9,445 2,795 16,010

Стандартное отклонение 10,592 40,587 40,067 6,372 8,940 11,417

Уровень надежности (95,0%) 2,736 10,485 10,351 1,646 2,309 2,949

Биологические референтные интервалы 5,564 11,037 18,076 39,046 42,860 63,561 9,259 12,551 2,314 6,933 14,420 20,319

Каждый из анализируемых параметров вносит свой вклад в диагностику процесса изменений состава мочи, приводящих к появлению и развитию мочекаменной болезни. В результате проведенного исследования 13 проб мочи (21,7%) имели повышенную активность щелочной фосфатазы и лактатдегидрогеназы, 14 проб мочи (23,3%) — повышенную активность гаммаглутамилтранферазы, 4 пробы мочи (6,7%) - повышенный уровень кальция и 23 пробы (38,3%) — повышенный уровень фосфора в моче. На этой основе был построен алгоритм лабораторного исследования мочи и принятия решений для диагностики активности камнеобразования (литогенности) (мочекаменной болезни), который представлен на рисунке 4. Для проверки работы алгоритма была сформирована группа студентов добровольцев, которые считали себя здоровыми на момент исследования в количестве 206 человек. После проведенного исследования были выявлены молодые люди с изменениями в составе мочи по двухэтапному скринингу, которым было предложено пройти ультразвуковое обследование почек.

Рисунок 4. Алгоритм двухэтапного скрининга

Таким образом, полученные данные дают возможность проводить дифференциально-диагностические, профилактические и лечебно-реабилитационные мероприятия в программе диспансерного наблюдения в соответствии с нозологической формой.

Определение диагностической чувствительности, диагностической специфичности для метода количественного определения уреазной активности мочи

По мнению специалистов Европейской конфедерации лабораторной медицины, диагностический титр первичных возбудителей инфекцию мочевых путей, обнаруженных в собранной при естественном мочеиспускании пробе

мочи, должен быть не более 103 КОЕ/мл, а других бактерий - больше или равным 104 КОЕ/мл (для женщин) и 103 КОЕ/мл (для мужчин) (Б.Ф. Шуляк Б.Ф., Белокрыеенко С.С., 2010). Нами было проведено сравнительное исследование бактериурии у 58 пациентов различными методами: классическим бактериологическим (посев на среды с использованием В1р81геак - устройства для количественного бактериологического экспресс анализа мочи) и предлагаемый нами модифицированный метод определения уреазной активности мочи. В группу № 1 (п = 28, женщин - 12, мужчин - 16; средний возраст 43,50 + 3,86 лет) включены пробы пациентов, давшие отрицательные результаты классическим бактериологическим методом. Группу № 2 (п = 30, женщин - 22, мужчин - 8; средний возраст 47,00 ±4,17 лет) составили пробы пациентов, давшие положительные результаты классическим бактериологическим методом (то есть рост колоний в титре более 103 КОЕ/мл). Проведенное исследование показало, что повышенный уровень уреазной активности в моче определялся у 25 (43%) обследованных лиц и составил в среднем 289,8±29,6 Ед/дл. Из них у 16 человек была определена диагностически значимая бактериурия, у 9 - таковая отсутствовала. При этом выявлено статистическои значимое различие в значениях уреазной активности мочи в этих группах, которые составили 351,9±36,4 Ед/дл и 179,3±22,3 Ед/дл соответственно (р<0,005). Сопоставление результатов определения уровня уреазной активности мочи и результатов бактериологического исследования образцов позволило оценить надежность и прогностическую ценность данного биохимического показателя в качестве скринингового теста бактериурии. Расчет показателей надежности показал следующие уровни: чувствительность теста - 53% и специфичность - 68%. Прогностическая значимость положительного и отрицательного результата на уреазу в моче для выявления бактериурии составила соответственно 64% и 57%.

Предлагаемый в качестве скринингового теста для выявления бактериурии биохимический анализ мочи имеет определенные ограничения, которые основаны на том, что не все уропатогены обладают уреазной активностью. Учитывая частоту выявления конкрементов различного химического состава, а именно уратных, фосфатных, оксалатных и смешанного состава примерно 30 %, 25 %, 20 % и 25 % соответственно, предлагаемый тест позволит оценить риск развития оксалатных, фосфатных и смешанных камней, то есть до 70 % случаев заболевания.

Из всего вышесказанного можно заключить, что показатели кристаллобразующей способности и уреазной активности мочи являются перспективными в прогнозировании процесса камнеобразования и отражает наличие активной уреазообразующей микрофлоры в моче, которая способствует образованию кристаллов и увеличивает выявляемость срытых форм патологии на 18,4%.

Экономическая обоснованность разработанного двух этапного скрининга на основе с расчетов себестоимости затрат. Экономическая эффективность проведения двухэтапного скрининга.

На заключительном этапе работы был проведен расчет затрат на осуществление скринингового обследования по общепринятым методикам, рекомендованным в здравоохранении (Шипова В.М.,2008).

Расчеты составлены на основе реальных фактических затрат в клинико-диагностической лаборатории поликлиники ГБОУ ВПО ТГМА при проведении скринингового обследования. Сводная таблица плановой калькуляции

себестоимости одного лабораторного исследования для скринингового обследования на 1-ом и 2-ом этапах приведены в табл.№ 7.

Таблица 7. Плановая калькуляция затрат на проведение скринингового ___обследования, приведенная в данной работе_

Услуга Трудо затраты (мин) ФОТ (руб) Стоимо сть матери алов (РУ6) Износ обор. (РУб) Комм расх. (РУб) Прочие расходы (РУб) Себестоимость (РУб)

1 этап 7 20,2 1,88 0,35 1,01 4,8 28,25

2 этап 9,4 30,16 67,19 3,68 1,96 6,45 109,44

Затраты 1 этапа лабораторного скринингового исследования 206 человек составили 5819,5 рублей. Положительная реакция была получена у 70 образцов мочи, которые были проанализированы на 2 этапе. Это увеличило затраты на сумму 7660,80 рублей. Таким образом, общая стоимость затрат на проведение лабораторного диагностического скринингового обследования 206 студентов составила 13480,30 рублей. Таким образом, затраты на 1 случай выявления заболевания мочекаменной болезни лабораторным скринингом составил 192,58 рублей, а УЗИ диагностикой (УЗИ органов брюшной полости) - 14591,67 рублей. Причем, необходимо учесть, что пропускная способность лаборатории составляет 220 человек за 1 рабочую смену. Врач УЗИ диагностики на 1 приборе может посмотреть 30 человек в рабочую смену. Проведение лабораторного скрининга убедительно доказывает свою целесообразность по сравнению с традиционной диагностикой.

Проведение двухэтапного скрининга для профилактических обследований имеет большую практическую значимость. Полученные данные дают возможность учреждениям здравоохранения планировать и своевременно реализовывать мероприятия по профилактике и совершенствованию амбулаторно-поликлинической помощи. Кроме того, клинико-лабораторные данные позволят дифференцировать профилактические и лечебно-реабилитационные мероприятия в программе диспансерного наблюдения в соответствии с нозологической формой. Рассчитанные затраты могут служить основой при проведении региональных программ скринингового биохимического контроля.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработана экспресс-методика для одновременного параллельного определения кристаллообразующей способности (тест на кальцифилаксию) и уреазной активности мочи. Определены аналитические характеристики этой методики для использования на первом отсеивающем этапе скрининга.

2. Рассчитаны значения биологических референтных интервалов: не более 11,2 ед S-H для кристаллообразующей способности мочи и не более 162,2 Ед/дл для уреазной активности мочи.

3. Разработаны предсказательные критерии отбора для второго уточняющего этапа скрининга по активности щелочной фосфатазы (не более 11,0 Е/л), лактатдегидрогеназы (не более 39,0 Е/л) и гаммаглутамилтрансферазы (не более 63,6 Е/л) мочи, концентрации кальция (не более 6,9 ммоль/л), фосфора (менее 20,3 ммоль/л) и уровня

креатинина (менее 12,6 ммоль/л) мочи для выявления степени патологического процесса в мочевыводящих путях.

4. Создан алгоритм принятия решений, апробированный в условиях профилактического осмотра студентов. Расчет показателей надежности показал следующие уровни: чувствительность теста на уреазную активность мочи — 53% и специфичность - 68%. Прогностическая значимость положительного и отрицательного результата на уреазную активность мочи для выявления бактериурии составила соответственно 64% и 57%.

5. Рассчитана себестоимость затрат проведения скринингового обследования 206 студентов с целью раннего выявления мочекаменной болезни, свидетельствующая об уменьшении затрат на 1 случай выявления заболевания мочекаменной болезни лабораторным скринингом, который составил 192,58 рублей, в сравнении с традиционным УЗИ органов брюшной полости (14591,67 рублей).

Автор выражает глубокую и сердечную благодарность д.б.н., профессору А.Н.Панкрушиной, внесшей ценные замечания на стадии формирования и выполнения экспериментальной программы и обсуждения полученных результатов.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Горшкова, М.А. Новый подход к диагностике мочекаменной болезни у кошек./ М.А.Горшкова, Н.В. Зеленец, Н.О. Горшкова// Материалы X Московского международного ветеринарного конгресса 11-13.04.2002. -М„ С.200-201

2. Горшкова, М.А. Коэффициент нефротоксичности мочи как ранний критерий выявления патологии почек. / М.А. Горшкова, М.А., Федотова Т.А., Подгорный Г.Н. //Научные основы формирования здоровья детей и подростков.» Сб. науч.трудов/ Под ред. С.Ф.Гнусаева, В.М.Брянцевой -Тверь: ООО «Изд-во Гере», 2006 - С. 201

3. Горшкова, М.А. Оптимизация методов количественного определения концентрации ингибирующей способности мочи (антикристаллообразующей) к оксалатам, фосфатам, и трипельфосфатам у детей / М.А. Горшкова, А.Н. Панкрушина // Сб. «Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 г.» - Труды науч.-практ. конференции. - М.: Изд-во «Лабора», 2009. -С.357-358

4. Горшкова, М.А. Оптимизация методов количественного определения концентрации ингибирующей способности мочи (антикристаллообразующей) к оксалатам, фосфатам, и трипельфосфатам у детей / М.А. Горшкова, O.A. Котельникова // «Союз опыта и молодости в неуке и практике здравоохранения» - Сб. научных трудов, посвящ.70-летию проф. А.Ф. Виноградова / под ред. О. В. Ивановой: ТГМА. -Тверь; РИД ТГМА - 2009. - С.36-38

5. Горшкова, М.А. Разработка и проведение клинико- экономического обоснования алгоритма использования биохимических методов исследования мочи /М.А. Горшкова // XIX Региональные Каргинские чтения: тезисы докладов. Облает. Науч-технич.конференция молодых ученых «Физика, химия и новые технологии»- Тверь, ТГУ, 2012 - с.24

6. Горшкова, М.А. О возможном первоначальном механизме кристаллообразования мочи и возникновения мочекаменной болезни //

Девятые Курдюмовские чтения «Синергетика в общественных и естественных науках»: материалы международной междисплинарной научной конференции с элементами научной школы для молодежи (1721 апреля 2013 г) - Тверь, ТвГУ, 2013 - С. 166-167 Рецензируемые научные журналы, включенные в перечень ВАК:

1. Польщина Е.К., Панкрушина А.Н., Горшкова М.А., «Идентификация фракционного состава белков мочи для дифференциальной диагностики болезней почек» Вестник ТвГУ, Серия «биология и экология», Вып. 10,

2008.-С.86-77

2. Панкрушина А.Н., Польщина Е.К., Горшкова М.А. Электрофоретическое исследование фракционного состава белков мочи для дифференциальной диагностики болезней почек Вестник ТвГУ, Серия «биология и экология», Вып. 10, № 37, 2009. - С.45-50

3. Горшкова М.А., Панкрушина А.Н., Котельникова O.A. Экспресс-метод количественного определения суммарной кристаллообразующей активности мочи к солям кальция с целью диагностики мочекаменной болезни - Вестник ТвГУ, Серия «биология и экология», Вып. 15, № 34,

2009.-С.99-104

4. Горшкова М.А., Панкрушина А.Н. Использование модифицированного экспресс-метода определения кристаллообразующей способности мочи в скрининговых профилактических осмотрах» // Клиническая лабораторная диагностика - № 9, 2010, с.57

5. Горшкова М.А. Клинико-экономический анализ эффективности скринингового лабораторного обследования с целью выявления пациентов с мочекаменной болезнью по двухэтапному исследованию мочи. // Клиническая лабораторная диагностика» - № 10, 2011, - с. 14

6. Польщина Е.К., Панкрушина А.Н., Горшкова М.А. Модифицированная методика электрофореза для дифференциальной диагностики протеинурии// Клиническая лабораторная диагностика» - № 10, 2011, -с.15

7. Горшкова М.А., Лапина Г.П., Панкрушина А.Н. Экспресс-метод количественного определения суммарной кристаллообразующей и уреазной активности мочи с целью применения в скрининговых обследованиях для выявления мочекаменной болезни.// Клиническая лабораторная диагностика, № 9, 2012, с-23-24

8. Горшкова М.А., Лапина Г.П., Панкрушина А.Н. Одновременное определение кристаллообразующей способности и уреазной активности мочи для выявления процессов в мочевыводящей системе.// Вестник ТвГУ, Серия «биология и экология», Вып. 28, № 25, 2012. - С.133-140

Список основных сокращений:

КДЛ — клинико-диагностическая лаборатория

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЩФ - щелочная фосфатаза

ГГТП - гаммаглутамилтранспептидаза

Ca — кальций

Р - фосфор неорганический

КОСМ - кристаллообразующая способность мочи

УАМ - уреазная активность мочи

УПФ -условно-патогенная флора

Подписано в печать 19.09.2013. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 150 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором в Центре инженерной печати МИП ООО «Наукоемкие технологии» при ГБОУ ВПО «ТвГТУ» 170023, Тверская область, г. Тверь, ул. Маршала Конева, 12, к. 435