Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика инфицированности природных и экспериментальных популяций Drosophila melanogaster разными генотипами эндосимбионта Wolbachia

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Динамика инфицированности природных и экспериментальных популяций Drosophila melanogaster разными генотипами эндосимбионта Wolbachia"

На правах рукописи

Быков Роман Андреевич

ДИНАМИКА ИНФИЦИРОВАННОСТИ ПРИРОДНЫХ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ Ияозорты меымосазтея РАЗНЫМИ ГЕНОТИПАМИ ЭНДОСИМБИОНТА \VOLBACHIA

(03.02.07) «генетика»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических, наук

Новосибирск 2014

005560186

Работа выполнена в Лаборатории генетики популяций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

Захаров Илья Кузьмич

Официальные оппоненты:

Бугров Александр Геннадьевич

доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории филогении и фауногенеза, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт систематики и экологии животных Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск.

Ведущее учреждение:

Похолкова Галина Витальевна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной цитогенетики, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва.

Защита диссертации состоится » 201&_ года на утреннем

заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

проспект Академика Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090. Тел. (383) 3634906, факс (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН и на сайте Института: www.bionet.nsc.ru.

Автореферат разослан « 6 »CC^-oSj! 201^ г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук ' Т. М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение симбиотических взаимоотношений представляет огромный научный интерес для многих разделов биологии - от молекулярной биологии до эволюции. Например, появление лишайников явилось следствием симбиоза грибов и водорослей. На основании этого была предложена теория симбиогенеза, которая подразумевает симбиогенетическое происхождение клеток зеленых растений (Фаминцын, 1907; Мережковский, 1909; Воронцов, 1999). В настоящее время общепризнано положение о том, что митохондрии, фсггосинтезирующие пластиды и даже ядро эукариотических клеток возникли в результате симбиоза с бактериями (Маргелис, 1983; Margulis, 2010).

Бактерия Wolbachia является широко распространенным эндосимбионтом членистоногих и некоторых видов нематод. Эта бактерия передается строго вертикально по материнской линии и способна индуцировать у вида-хозяина различные репродуктивные аномалии, направленные на увеличение доли самок в популяции.

Одним из видов-хозяев Wolbachia является Drosophila melanogaster -популярный модельный объект биологических исследований. Природные популяции D. melanogaster по всему миру инфицированы Wolbachia, а частоты инфицированности популяций варьируют от 1 до 100% (Solignac et al., 1994; Hoffmann et al., 1994, 1998; Илинский, Захаров, 2007; Илинский, 2008; Vespoor, Haddrill, 2011). У D. melanogaster на основании подробного анализа генома единственного штамма Wolbachia vvMel в настоящее время выделяют 6 различных генотипов бактерии: wMel, wMelCS, wMeICS2, wMel2, wMel3n wMel4 (Riegler et al., 2005, Ilinsky, 2013). Установлено, что наиболее распространенным генотипом Wolbachia в природе является wMel, а остальные либо редко встречаются в популяциях, либо характерны только для определенных регионов (Riegler et al., 2005; Илинский, Захаров, 2007; Nunes et al., 2008). Влияние Wolbachia на репродукцию D. melanogaster заключается в индукции цитоплазматической несовместимости (ЦН), при которой потомство от скрещивания неинфицированной самки с инфицированным самцом частично или полностью гибнет на ранних стадиях эмбрионального развития. В природных популяциях D. melanogaster уровень ЦН либо очень низкий, либо отсутствует (Hoffmann et al., 1998). Таким образом, невозможно объяснить столь широкое распространение бактерии только за счет ЦН. Исследования мутуалистическсго влияния Wolbachia на D. melanogaster также не выявили факторов, которые могли бы дать окончательный ответ на этот вопрос (Starr, Cline, 2002; Fry et al., 2004; Harcombe, Hoffmann, 2004; Clark et al., 2005; Hedges et al., 2008; Teixeira et al., 2008; Ikeya et al., 2009; Вайсман и др., 2009). Также остаются неизвестными причины преобладания в природных популяциях D. melanogaster бактерии Wolbachia генотипа wMel. Было показано, что данный генотип бактерии за несколько лет вытеснил ранее распространенный

генотип \vMelCS (Ше§1ег е/ а/., 2005), но механизм этого процесса до сих пор неизвестен.

Цели и задачи. Цель исследования - охарактеризовать распространенность и генетическое разнообразие эндосимбиотической бактерии \Volbachia в природных популяциях и лабораторных линиях вида-хозяина - ОгояоркИа melanogaster, изучить динамику распространения и возможные механизмы поддержания двух распространенных генотипов И'^ЬасЫа - \vMel и \vMelCS, в экспериментальных популяциях, а также оценить влияние симбионта на репродуктивную функцию хозяина - уровень эмбриональной смертности (вследствие ЦН) и плодовитости. Были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Оценить концентрацию инфицированных бактериями 1¥о1ЬасШа особей в природных популяциях БторИИа melanogaster различных регионов Евразии за 2008-2013 гт.

2. Определить генотипический состав \Volbachia в исследуемых природных популяциях ВгозоркИа melanogaster.

3. Установить концентрацию различных митохондриальных гаплотипов в природных популяциях ОгохорИНа melanogaster Евразии среди свободных от \Volbachia особей.

4. Оценить цитотипическое разнообразие и уровень инфицированное™ бактерией ]Уо1ЬасШа мутантных линий Ого$орЫ1а melanogaster фонда лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН.

5. В экспериментально созданных популяциях Ого$орЫ1а melanogaster изучить динамику изменения концентраций двух широко распространенных генотипов Шо1ЬасЫа - \vMel и \vMelCS.

6. На основании данных, полученных в эксперименте, оценить значения уровня цитоплазматической несовместимости и относительной плодовитости вида-хозяина. Определить характер влияния \vMel- и \уМе1С5-генотипов \Volbachia на репродуктивную функцию БгозоркИа melanogaster.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе работы был проведен анализ инфицированности бактерией Иго1ЬасЫа природных популяций йго5орИИа melanogaster различных регионов за 2008-2013 гг. Был обнаружен новый генотип Иго1ЬасШа - \vMel4. Впервые дана оценка генотипического разнообразия симбиотической бактерии \Volbachia и митотипического разнообразия О. melanogaster в природных популяциях.

Впервые-проведен подробный скрининг большой коллекции мутантных линий £>. melanogaster фонда лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН на инфицированность бактерией \Volbachia и митотип.

Для наиболее часто встречающихся в природных популяциях Э. melanogaster по всему миру генотипов 1Уо1ЬасЫа - \vMel и \vMeICS, было проведено подробное исследование их динамики в условиях экспериментальных ящичных популяций. Исследование проводилось в популяциях, где Шо1ЬасЫа была представлена как

двумя генотипами, так и каждым генотипом по отдельности. Показано, что в экспериментальных популяциях влияние Wolbachia на динамику инфицированности крайне слабое, а изменение частот инфицированности происходит за счет действия случайных факторов. Впервые был проведен анализ динамики митотипов D. melanogaster в экспериментальных популяциях. Обнаружено, что соотношение митотипов в течение 20 поколений не изменилось.

Полученные в ходе работы данные, в совокупности с ранее известными, существенно дополняют картину распространенности бактерии Wolbachia на евразийском континенте. Внесен существенный вклад в общую картину генетического разнообразия внутриклеточного симбионта Wolbachia в природных популяциях D. melanogaster. Определение митотипа совместно с генотипированием Wolbachia может стать надежным способом проверки происхождения лабораторных линий. Обнаруженное отсутствие изменений частот генотипов Wolbachia в экспериментальных популяциях D. melanogaster можег говорить о том, что причиной широкого распространения бактерии в природе являются условия среды и генетические факторы. Полученные в данной работе данные позволят лучше понять механизм взаимоотношений внутри симбиотической системы Wolbachia-Drosophila melanogaster.

Положения, выносимые на защиту:

1. Генотипическое разнообразие Wolbachia в природных популяциях Drosophila melanogaster Евразии представлено 4 генотипами со значительным преобладанием генотипа wMel - 97 %.

2. Разнообразие гаплотипов мтДНК D. melanogaster в природных популяциях Евразии представлено двумя кладами с преобладанием М-клады - 99 %.

3. Плодовитость инфицированных бактерией Wolbachia особей D. melanogaster не зависит от генотипа бактерии.

4. Генетический дрейф и цигоплазматическая несовместимость являются факторами, обеспечивающими изменения частот генотипов Wolbachia в экспериментальных популяциях D. melanogaster.

Апробация работы. Результаты работы были представлены: на 47 и 48-й Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", секция Биология. Новосибирск, НГУ, 2009 г. и 2010 г.; на 16-й Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов - 2009", секция "Биология". Москва. 2009 г.; на съезде генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина и 5-м съезде ВОГиС, Москва, 2009 г.; на Crimean Meeting: Third International Conférence, Dedicated N.V. Timofeeff-Ressovsky "Modem Problems of Genetics, Radiobiology,' Radioecology and Evolution" & Third Readings after V.I. Korogodin and V.A. Shevchenko; NATO Advanced Research Workshop "Radiobiological Issues Pertaining to Environmental Security and Ecoterrorism", Alushta, 2010; на Международной конференции "Проблемы популяционной и общей генетики" и Международной

з

молодежной конференции "Популяционная генетика: современное состояние и перспективы", посвященных 75-летию Ю.П. Алтухова, Москва, 2011 г.; на Всероссийской конференции молодых ученых «Экология: традиции и инновации», Екатеринбург, 2012 г.; на 6-м съезде ВОГиС и ассоциированных генетических симпозиумах, Ростов-на-Дону, 2014 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на __П5_страницах, включает 18 рисунков и 10 таблиц. Список цитируемой литературы включает 201 наименований.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них 3 статьи в журналах, входящих в список ВАК.

Личный вклад автора. Результаты эксперимента по изучению динамики цитотипов D. melanogaster в экспериментальных популяциях и основная часть данных по инфицированности природных популяций D. melanogaster, разнообразию генотипов Wolbachia и мтДНК D. melanogaster получены автором самостоятельно. Разработка схемы эксперимента и анализ цитотипического разнообразия линий D. melanogaster фонда лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН проведены совместно с Ю.Ю. Илинским (ИЦиГ СО РАН).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сборы из природных популяций

Для анализа распространенности зндосимбионта Wolbachia в природных популяциях Drosophila melanogaster были использованы изосамочьи линии, полученные от оплодотворенных в природе самок из популяций 8 регионов Евразии за период с 2008 по 2013 гг. (табл. 1). Всего было создано и проанализировано 836 изосамочьих линий/), melanogaster.

Из мух каждой линии выделяли ДНК, методом ПЦР определялся статус инфицированности линии и митотип (гаплотип митохондриальной ДНК) D. melanogaster. Для (Го/басй/а-положительных образцов проводилось определение генотипа бактерии.

Коллекция лабораторных линий Drosophila melanogaster Для изучения распространенности и генотипического разнообразия Wolbachia среди лабораторных линий была использована коллекция мутантных линий D. melanogaster из фонда лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН. Всего было проанализировано 353 мутантные линии из 8 групп, определенных либо по локализации мутации либо по типу мутации: «хромосома 1» (118 линий), «yellow» (22), «хромосома 2» (77), «lethal giant larvae» (17), «хромосома 3» (82), «хромосома 4» (6), «транслокации» (8), «мультихромосомная» (23).

Выделение ДНК

Выделение ДНК проводилось по стандартной методике с модификациями (Marmur, 1961). В пробирку, объемом 1,5 мл, помещались несколько самок Drosophila melanogaster и добавлялось 200 мкл экстрагирующего буфера (10 шМ Трис-HCl (pH 8.0), 25 тМ ЭДТА, 0,5% SDS, 0,1 M NaCl). Каждый образец гомогенизировали индивидуальным пестиком, после чего проводили инкубацию при 56°С в течение часа. Осаждение белков проводили 100 мкл буферного раствора ацетата калия (2М уксусной кислоты, ЗМ ацетата калия) в течение 30 мин. при температуре 4°С. ДНК осаждали добавлением 400 мкл 96 % этилового спирта и затем отмывали 90 мкл 70% этилового спирта. Растворяли ДНК в 50 мкл бидистиллированой воды. Полученные образцы хранились в морозилке при -20°С.

Полнмеразная цепная реакция

Для определения статуса инфицированное™ использовались праймеры, специфичные к бактериальным генам 16SrRNA и wsp. Определение генотипа бактерии для инфицированных образцов проводили с использованием праймеров, специфичных к пяти маркерам генома Wolbachia: двум локусам встройки инсерционной последовательности IS5, двум минисателлитным повторам VNTR и инверсии в локусе WD0394-WD0541.

Дтя определения митотипа D. melanogaster использовался полиморфизм по однонуклеотидной замене в позиции 2187 в гене первой субъединицы цитохромоксидазы относительно аннотированной ранее последовательности полного генома мтДНК линии Oregon-R, номер GenBank NC001709. Были использованы аллель-специфичные праймеры: 2187 snp-mel для варианта «2187-Т» (сонаследование с wMel и подобными ему генотипами Wolbachia); и 2187 snp-cs/cs2 для варианта «2187-С» (сонаследование с генотипами wMelCS/wMelCS2) (Илинский, 2008). В качестве обратного праймера использовался CÖIR1.

Все ПЦР-продукты разделяли в 1-1,5 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, в буфере 1*ТВЕ (TRIS 0,089М, кислота борная 0,089М, ЭДТА 0,002М) при напряженности поля 3-4 В/см.

Постановка эксперимента по анализу динамики инфицированности

ящичных популяций Drosophila melanogaster

Для эксперимента по анализу динамики инфицированности экспериментальных популяций D. melanogaster были выбраны 4 линии мух из фонда лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН: В ¡90 (Бишкек, 2004 г., инфицирована Wolbachia генотипа wMel, митотип «Л/»), vvl53 (Ташкент, 1989 г., инфицирована Wolbachia генотипа wMelCS, митотип «S»), BÍ90T (неинфицирована, митотип «Л/») и wl53T (неинфицирована, митотип «5»). Неинфицированные линии были получены из инфицированных путем содержания мух на корме с 0,03 % тетрациклина в течение двух поколений (Илинский, Захаров, 2009). Для того чтобы получить выровненный генетический фон, были проведены реципрокные скрещивания между линиями Bi90 и wl53, и линиями BÍ90T и wl53T

по следующей схеме: (1) $ Bi90 х в wl53, (2) ? wl53 х в Bi90, (3) $ Bi90T х 3 wl53T и (4) $ W153T х S Bi90T.

Потомки данных скрещиваний были идентичны по генетическому фону и отличались только по цитотипу (митотип D. melanogaster и наличие (генотип)/отсутствие Wolbachia): (1) Л/-Ме1, (2) S-CS, (3) M-w\ (4) S-\v~, где Л/и S-митотипы D. melanogaster, Mel и CS — генотипы Wolbachia wMel и wMelCS, соответственно, w' - отсутствие Wolbachia. Из потомства от каждого скрещивания проводился отбор самцов и девственных самок, которых, до закладки эксперимента, содержали раздельно при 16°С не более 3 суток. В дальнейшем они были использованы для создания четырех экспериментальных ящичных популяций, контрастных по цитоплазмапгческому фону.

Каждая популяция изначально состояла из 300 самок и 200 самцов (150 самок и 100 самцов от линии-основательницы). В первом ящике половина особей была инфицирована Wolbachia генотипа wMel, а вторая половина - wMelCS. Во втором и третьем ящиках половина особей была неинфицирована, а другая половина инфицирована Wolbachia генотипа wMel или wMelCS соответственно. Неинфицированные особи отличались от инфицированных по митотипу, что позволяло отследить возможную утрату бактерии. В четвертом ящике все особи были неинфицированными и отличались между собой только митотипом: одна половина имела митотип М, а другая - S. Данная популяция использовалась в качестве контрольной без влияния Wolbachia.

В каждый популяционный ящик с периодичностью в 2-3 дня в течение недели помещалось по 15 пробирок со свежим стандартным кормом. Мухи откладывали яйца при постоянной температуре 25°С. Эксперимент продолжатся в течение 20 поколений, при этом первые 11 поколений не перекрывались между собой. Сбор мух из популяционных ящиков осуществлялся при помощи энтомологического эксгаустера, особи разделялись по полу, подсчитывались, фиксировались в 96 % этиловом спирте и помещались на хранение при -20°С.

Для анализа инфицированности D. melanogaster бактерией Wolbachia методом ПЦР брались выборки, объемом не менее 60 самок. Для первого, второго и третьего популяционных ящиков в случае, если особь оказывалась неинфицированной, проводился анализ митотипа в целях, во-первых, установить пригодность выделенной ДНК для анализа и, во-вторых, для выявления особей, утративших бактерию.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Инфицнрованность природных популяций D. melanogaster Евразии симбиотической бактерией Wolbachia

Из 836 проанализированных изосамочьих линий D. melanogaster для 540 был установлен положительный статус инфицированности симбиотической бактерией Wolbachia, что составляет 65 % (табл. 1). Ни в одной из исследованных популяций не было обнаружено полного отсутствия бактерии. Согласно данным более ранних исследований, частота встречаемости Wolbachia в евразийских природных популяциях D. melanogaster находится на уровне около 60 % (Илинский, Захаров, 2007а, б; Илинский 2008). В целом, для природных популяций D. melanogaster мира средний уровень инфицированности Wolbachia оценивается на уровне около 45% (Solignac et al., 1994; Hoffmann et al„ 1994, 1998; Vesprool, Haddrill, 2011). Таким образом, результаты проведенного исследования согласуются с данными, полученными другими исследователями, и дополняют общую картину распространенности Wolbachia в популяциях D. melanogaster.

Генотипическое разнообразие Wolbachia в природных популяциях D. melanogaster Евразии

Анализ генотипического разнообразия Wolbachia среди инфицированных линий выявил существенное преобладание генотипа wMel (в среднем 97,2 %), который, с разной частотой, был обнаружен во всех проанализированных популяциях (табл. 1). В популяции с Алтая нами была обнаружена Wolbachia генотипа wMelCS. Этот генотип бактерии также был обнаружен в популяциях Узбекистана.

В более ранних исследованиях для популяций D. melanogaster Алтая и Узбекистана отмечены случаи инфицированности мух Wolbachia генотипа wMelCS2 (Илинский, Захаров, 2007; Илинский, 2008), однако в ходе проведенного исследования это генотип бактерии не был обнаружен.

В четырех линиях из популяции D. melanogaster Украины и в двух линиях из популяции Кабардино-Балкарии, была обнаружена Wolbachia генотипа wMelCS2. Если ранее в популяциях Украины отмечалось наличие данного генотипа, то для Кабардино-Балкарии присутствие Wolbachia генотипа wMelCS2 показано впервые, Также, в популяции с полуострова Синай в ходе исследования был обнаружен новый, ранее не описанный генотип Wolbachia, обозначенный как wMel4 (Ilinsky, 2013).

В целом, суммируя наши и литературные данные, можно утверждать, что из всех генотипов Wolbachia самым распространенным в природных популяциях D. melanogaster по всему миру является генотип wMel. Также в мире распространен генотип Wolbachia wMelCS, однако, частота его встречаемости в популяциях крайне низкая. Остальные описанные генотипы Wolbachia встречаются в природных популяциях D. melanogaster только отдельных регионов.

7

Таблица 1. Инфицированность природных популяций £>. melanogaster

Евразии бактерией }Уо1ЬасЫа.

Регион, год сбора Число линий Инфицировано, генотип \Volbachia Неинфициро-вано, митотип

\vMel \vMslCS \vMeICS2 ууМе14 М 6'

Западная Сибирь (Новосибирск), 2008 57 38 0 0 0 19 0

Западная Сибирь (Томск), 2011 17 17 0 0 0 0 0

Алтай (Бийск, Россия), 2008 29 21 0 0 0 8 0

Алтай (с. Черта и с. Иогач), 2008 45 21 1 0 0 23 0

Украина (Умань), 2008 16 12 0 0 0 4 0

Украина (Алушта, Крым), 2010 55 26 0 1 0 28 0

Украина (Изобильное, Крым), 2010 223 127 0 3 0 93 0

Украина (Умань), 2012 12 5 0 0 0 7 0

Украина (Киев), 2012 13 11 0 0 0 2 0

Кабардино-Балкария (Нальчик), 2010 85 61 0 0 0 23 1

Кабардино-Балкария (Нальчик), 2012 103 60 0 1 0 39 3

Кабардино-Балкария (Нальчик), 2013 66 43 0 1 0 22 0

Узбекистан (Ташкент), 2008 16 13 1 0 0 2 0

п-ов Синай (Египет), 2010 24 14 0 0 7 3 0

Франция (Монпелье), 2010* 18 6 0 0 0 12 0

Швеция (Гётеборг), 2012 57 50 0 0 0 7 0

ВСЕГО: 836 525 2 6 7 292 4

*- линии предоставлены Р. К. НасИгШ.

Разнообразие митотипов Д, melanogaster в природных популяциях

Обнаружение ассоциации митотипов £>. melanogaster с генотипами Шо1ЬасЫа (ШпБку, гакЬагоу, 2006; Илинский, Захаров, 2007) дало возможность проведения анализа миготипического разнообразия £). melanogaster в природных популяциях (табл. 1). В этом случае стоит учесть, что митотипы необходимо рассматривать как

среди неинфицированных, так и среди инфицированных особей. Таким образом, можно оценить распространенность митотипа во всей популяции. По результата^ -проведенного исследования частота митотипа 5 в природных популяциях О. melanogaster Евразии с учетом инфицированных и неинфицированных особей составляет около 1 %, в то время как доля митотипа М достигает 99 %. Вообще, ассоциация генотипа 1Уо1ЬасЫа и митотипа О. melanogaster определяется термином «цитотип». С учетом статуса инфицированное™ и генотипа ¡Уо1ЬасЫа, выделяют четыре цитотипа й. melanogaster. Л/-МЕЬ, М-\\~, 5-С8 и З-и'" (Шпэку, 2013). Таким образом, доля митотипа М в природных популяциях Б. melanogaster с учетом частот цитотипов Л/-МЕЬ и М-\у' составит более 90 %. Соответственно, цитотип 5 будет встречаться в популяциях с частотами менее 10 %. Эти данные согласуются с результатами проведенного исследования разнообразия митотипов Э. melanogaster в природных популяциях.

Цитотипическое разнообразие лабораторных линий Л теЫпо^скШ При анализе распространенности \Volbachia среди мутантных линий фонда лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН было обнаружено, что 39% из них являются носителями \Volbachia (Илинский и др., 2013).

Таблица 2. Цитолты мутантных линий ОгозорИНа melanogaster фонда

Лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН (г. Новосибирск)

Группа Число линий Цитотип

M-MEL M-W S-CS S-W

Хромосома 1 117 6 12 28 70

Хромосома 2 77 18 14 23 22

Хромосома 3 82 18 26 6 32

Хромосома 4 6 1 1 2 2

Транслокации 8 2 2 1 3

Мультихромосомная 24 1 5 7 11

yellow 22 13 6 2 1

lethal giant larva* 17 1 5 9 1

ВСЕГО 353 60 71 78 142

для двух линий митотип не определен, поскольку они погибли до

проведения анализа.

Исследование показало наличие среди линий фонда четырех цитотипов: М-МЕЬ, М-\\', Б-СБ, (табл. 2), что согласуется с данными исследований

природных популяций (Шпгку, 2013). Наибольшее число линий - 40%, представлено цитотипом Частота встречаемости оставшихся трех цитотипов варьирует от 17 до 22%. Несоответствие между данными по представленности цитотипов в природе и среди лабораторных, а также между разными группами линий объясняется историей ведения линий в лаборатории. Так, преобладание

линий с цитотипом S-w" связано с тем, что при их создании за основу была взята линия, обладающая этим цитотипом.

Динамика цитотипов Drosophila melanogaster в экспериментальных популяциях

В ходе эксперимента по изучению динамики разных генотипов Wolbachia в экспериментальных популяциях D. melanogaster было собрано, разделено по полу, подсчитано и зафиксировано в 96 % этиловом спирте 11 неперекрывающихся между собой поколений мух из каждого популяционного ящика. Также было собрано 20-е поколение, полученное после 11-го свободным скрещиванием дрозофил.

Условиями эксперимента были исключены известные факторы, способные инициировать мутуалистическое влияние Wolbachia на D. melanogaster (Harcombe, Hoffmann, 2004; Вайсман и др., 2009; Hedges et al, 2008; Teixeira et al., 2008; Ikeya et al., 2009; Clark et al., 2005; Starr, Cline, 2002), а также влияние генетического фона, поскольку использованные для постановки эксперимента линии имели выровненный ядерный фон.

Однако такие факторы, как индуцируемая Wolbachia ЦН, неполная материнская передача бактерии, а также возможное различие в плодовитости самок не могли быть исключены нами из эксперимента. Таким образом, данные факторы могли бы влиять на динамику исследуемых цитотипов. Исходя из этого, было возможно использовать для анализа экспериментальных данных ранее предложенную в литературе математическую модель (Hoffmann et al., 1990; Turelly

et al., 1992):

____

~ 1 -r-.a-n--n>-

В данной модели учтены уровень ЦН (S),), относительная плодовитость инфицированных самок по сравнению с неинфицированными (F) и уровень неполной материнской передачи (р), ар, и рп1 - частота цитотипа в текущий и последующий моменты времени, соответственно.

В контрольной популяции, неинфицированной Wolbachia, было обнаружено увеличение уже ко второму поколению доли мух с митотипом «М» до 90 % (рис. 1). Можно было бы предположить, что данный митотип дает преимущество несущим его особям, по сравнению с митотипом «S». Однако при анализе динамики произошедших изменений было обнаружено, что в последующих поколениях достоверных изменений частоты митотипа «М» не произошло и в 20-м поколении доля данного митотипа составила 92%. При повторной постановке данной популяции при тех же условиях мы не обнаружили достоверных изменений частот миготипов, однако в первом поколении незначительно увеличилась доля особей с митотипом «А/» до 67%. Таким образом, на основании полученных

данных мы предполагаем отсутствие влияния митотипа на динамику экспериментальных популяций D. melanogaster.

Во второй и третьей популяциях, где Wolbachia представлена только одним из двух генотипов (wMel и wMelCS, соответственно), было обнаружено увеличение доли инфицированных мух до 83 и 78 % соответственно (рис. 1). Полученные значения согласуются с наблюдаемыми частотами инфицированности в природных популяциях D. melanogaster.

Популяция 1 (ЦИТОТИПЫ AÍ-MEL и S-CS)

i

а

FO F1 F2 F2 F4 F5 FS F7 F8 F9 FIO F11 FÏ0 Поколение

^Численность псгтульции - — частота /Mel -•*■■ частота wMelCS

Популяция 2 (ЦИТОТИПЫ М-МEL И S-W)

H

Ml

ff

2500 2250 !_

1750 é 1030 i

F5 Fî F7 F8 F3 Пок&лмп»

zi Численность популяции — частота wMel •■

Популяция 3 (цитотипы S-CS и M-vr)

|s .-+.¡ ¡ i ¿ti1

ш

fil

rfjl f 71

Популяция 4 (цитотипы ftî-w и S-W)

-i--4 I

4 FI F! fi

Ч-[Численность псгуляции

X

з wMelCS ■■■*■■■ частота w-

3Численность популяции — частота M-w- --■»■

Рис. 1. Динамика цитотипов в четырех экспериментальных популяциях

D. melanogaster

При дальнейшем анализе было обнаружено, что во второй популяции, инфицированной Wolbachia генотипа wMel, изначально произошло уменьшение уровня инфицированности к третьему поколению до 27 %, после чего доля инфицированных мух резко возросла до 58 % в четвертом поколении и не изменилась до пятого поколения. В шестом поколении уровень инфицированности увеличился до 68 %. К 20-му поколению не наблюдалось фиксации инфицированности, а доля инфицированных мух составила 65 %. В третьей популяции, инфицированной Wolbachia генотипа wMelCS, на протяжении пяти поколений соотношение инфицированных и неинфицированных мух достоверно не изменялось. В шестом поколении произошло резкое увеличение доли инфицированных особей до 78 % и в дальнейшем до 20-го поколения она достоверно не изменялась. В двух рассматриваемых популяциях могла проявляться индуцированная Wolbachia ЦН. По литературным данным, эта аномалия в популяциях D. melanogaster выражена слабо и находится на уровне 10-20 %, т.е. 0,1<$,<0,2 (Hoffmann et al., 1994; Илинский, 2008; Илинский, Захаров, 2009). Используя описанную выше математическую модель и учитывая, что в ходе исследования мы не обнаружили фактов неполной материнской передачи

il

Жо1ЬасЫа, а также предполагая одинаковую плодовитость инфицированных и неинфицированных особей, мы провели сравнение экспериментальных данных с теоретическими для значений = 0, 1 и = 0,2 (рис. 2). Около половины полученных в эксперименте значений частот инфипированности не укладьшается в промежуток между графиками, построенными на основании литературных данных о максимальном и минимальном уровнях ЦН в популяциях О. melanogaster.

1 1 С.9 0,8 С, 7 .......»........... • ♦

о о С, 4 аз -

гг 6,1 •

0 12 3 4 5 е 7 5 10 11 12 13 Поколение 14 15 13 17 13 19 20

ЭЬ = 0,1 —- 0 2 Попупщия 2 — Популяция 3

Рис. 2. Сравнение теоретической и наблюдаемой динамики цитотипов М-МЕЪ и 5-С8 Г), тектс^анег во второй и третьей экспериментальных популяциях, соответственно, в течение 20 поколений при разных значениях уровня ЦН.

Начиная с седьмого поколения полученные в эксперименте значения попадают в этот промежуток. Мы предполагаем, что наблюдаемые изменения частот инфипированности на протяжении с 7-го по 11-е могут быть результатом проявления ЦН на уровне около 15% или меньше. Остальные изменения, по нашим предположениям, обусловлены влиянием генетического дрейфа.

В первой популяции, где представлены два генотипа IУо1ЪасЫа \vMel и \vMelCS мы обнаружили, что к 11-му поколению доля особей, инфицированных бактерией \*Ме1-генотипа, увеличилась до 83 % (рис. 1). Наблюдаемое изменение соответствует данным из природных популяций, в которых преобладает И'о/Ьаскш генотипа \vMel (а!её1ег е/ а.1, 2005; Илинский, Захаров, 2007а, б; Илинский 2008; ¿акЬагоу е1 а!., 2010; Шпеку, 2013). При дальнейшем анализе было обнаружено, что резкие изменения произошли в третьем и четвертом поколениях, когда доля О. melanogaster с щгготипом М-МЕЬ увеличилась с 53 до 77 %. Начиная с четвертого поколения соотношение цитотипов достоверно не изменялось и в 20-м поколении вернулось к уровню 76%. Подобная динамика наблюдалась в контрольной популяции, где в первых поколениях произошло резкое увеличение доли особей с митотипом «М».

Мы не рассматриваем в данной популяции влияние ЦН, поскольку исследования несовместимости между генотипами Ц'оШасШа \vMel и \vMelCS не проводились. Следовательно из возможных факторов в данном случае может существовать различие в плодовитости особей, несущих \Volbachia разных генотипов. Рассмотрим, как соотносятся экспериментальные данные с |

теоретическими для случая, когда особи с одним генотипом бактерии более плодовиты, чем особи, несущие бактерию другого генотипа (рис. 3).

2 0,4

£ о.з

Я 0.2

О 1 2 3 4 5 6 7 9 9 10 11 12 13 14 15 1А 17 18 19 20 Поколение

» Р = 1.1 ~«~Р=1.2 --»--Популяция 1

Рис. 3. Сравнение теоретической и наблюдаемой динамики О. те1апо%а$1ег, инфицированных УУо/ЬасМа генотипа \vMel, в первой экспериментальной популяции в течение 20 поколений при разных значениях относительной плодовитости

Почти все полученные в эксперименте значения попадают в область между графиками, соответствующими предполагаемым верхней и нижней границам для значений относительной плодовитости В данном случае значение относительной плодовитости Г будет показывать, во сколько раз самки, инфицированные Ц'о1ЬасЫа генотипа \vMel, более или менее плодовиты, по сравнению с самками, несущими \Уо1ЬасЫа генотипа \vMelCS. Таким образом, можно предположить, что №о1ЬасМа генотипа \vMel может давать репродуктивное преимущество инфицированным самкам, по сравнению с генотипом \уМе1С8. На основании сравнения графиков, приведенных на рис. 3, можно предположить, что значение Р для рассматриваемой экспериментальной популяции находится на уровне около 1,15, т.е. самки, инфицированные \Volbachia генотипа \vMeI на 15% более плодовиты, чем инфицированные бактерией генотипа \vMelCS. Однако к 20-му поколению в эксперименте мы наблюдаем уменьшение частоты циготипа М-МЕЬ, что не соответствует теоретическим предположениям. Следовательно предположение о различии в плодовитости особей, отличающихся генотипом бактерии \Volbachia не верно. Таким образом, мы предполагаем, что генотипы 1¥о/ЬасМа \уМе1 и \vMelCS не отличаются между собой по влиянию на й. melanogaster, а наблюдаемые изменения частот цитотипов в первой экспериментальной популяции обусловлены генетическим дрейфом.

На основании полученных данных предполагается, что на распространение 1¥о1ЬасЫа в природных популяциях О. melanogaster влияют в большей степени условия среды и генетический фон хозяина, которые могут приводить к мутуалистическому взаимодействию бактерии с хозяином. Однако обнаруженные нами в ходе исследования факты возможного проявления ЦН на уровне 15 % нельзя исключать из рассмотрения, поскольку при данном значении

1В

репродуктивной аномалии бактерия может успешно распространяться в популяции и в отсутствие прочих факторов.

ВЫВОДЫ

1. Все исследованные популяции ОгояорИИа те1апо§а$1ег Евразии инфицированы эндосимбиотической бактерией \Volbachia: концентрация носителей бактерии варьирует от 33 % до 88 %.

2. Генотипическое разнообразие 1Уо1ЬасЫа в природных популяциях Я melanogaster Евразии представлено генотипами и-Ме1, луМеЮБ, \vMclCS2 и \vMel4. Наиболее распространенным генотипом является vvMel - концентрация среди инфицированных особей 97 %. Генотипы \Volbachia \vMeiCS, \vMeiCS2 и \vMeI4 встречаются с частотами не более 1 %. В популяции Б. те1апо%а$1ег полуострова Синай обнаружен новый генотип \¥о1ЬасЫа - \vMel4.

3. Для природных популяций О. те1апо%а$1ег Евразии, среди свободных от \¥о1ЬасЫа дрозофил, установлено наличие митотипического разнообразия. Доминирующим митотипом, частота которого достигает 99 %, выступает ассоциированный с наиболее распространенным \уМе1-генотипом \Valbachict митотип «М», тогда как концентрация митотипа «8» не превышает I %.

4. В фонде лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН доля инфицированных \Уо1ЬасЫа линий О те1апо^ая1ег составляет 39 %. Бактерия представлена тремя генотипами: \vMel, \vMelCS и \vMelCS2 с частотами 17, 4 и 18 %, соответственно. Митотипическое разнообразие среди лабораторных мутантных линий также представлено двумя митотипами с частотой 20 % для М-митотипа и 40 % - для 5-митотипа. Средние частоты цитотипов среди линий фонда сильно отличаются от частот цитотипов в природе. Также частоты цитотипов отличаются и внутри отдельных групп мутантных лини. Наблюдаемые отличия объясняются историей ведения линий в лаборатории.

5. Для экспериментальных популяций ВгоэорЪИа те1апо2аМег прослежена динамика изменений частот цитотипов. Показано, во-первых, отсутствие влияния митотипа Л melanogaster на динамику цитотипов; во-вторых, сохранение 1Уо1ЪасЫа в ряду 20 поколений размножения хозяина во всех инфицированных популяциях; в-третьих, увеличение в течение 20 поколений доли особей, несущих 1Уо1ЬасЫа, для популяций, инфицированных бактерией генотипов \vMel и \vMelCS, с первоначально заданных 50 % до 83 и 78 %, соответственно; в-четвертых, вытеснение особями, несущими \уМе1-генотип особей, несущих \уМе1С8-генотиц \¥о1Ьас1иа. Наблюдаемые конечные частоты генотипов в экспериментальных популяциях, а также соотношение разных генотипов, сопоставимы с частотами инфицированное™ и соотношениями генотипов в природе.

\ 6. Предполагается, что наблюдаемые изменения частот цитотипов в экспериментальных популяциях О. melanogaster обусловлены влиянием генетического дрейфа и ЦН. Индуцированная НЫЬасШа цигоплазматическая

несовместимость в экспериментальных популяциях D. melanogaster, по приблизительным оценкам, может достигать уровня 15 %. Показано, что самки D. melanogaster, инфицированные Wolbachia генотипа wMel, имеют такую же плодовитость, что и самки, инфицированные бактерией wMelCS-генотипа. На основании анализа полученных данных есть основания полагать, что бактерия не оказывает существенного влияния на репродуктивную функцию D. melanogaster в экспериментальных популяциях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Быков Р.А., Курильщиков A.M. Оценка инфицировашюсти Wolbachia сборов из природных популяций Drosophila melanogaster 2008 года // В кн.: Материалы 47 Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", Биология. Новосибирск, 11-15 апреля 2009 г. -Новосибирск, НГУ. 2009. С. 155-156.

2. Курильщиков A.M., Быков Р.А. Анализ представленности Wolbachia и гаплотипов митохондриальной ДНК Drosophila melanogaster в природных популяциях // В кн.: 16 Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов - 2009", Секция "Биология". Москва. 13-18 апреля 2009 г. Тезисы докладов. - Москва: Макс-Пресс 2009. С. 93-94.

3. Быков Р.А., Курильщиков A.M., Илинский Ю.Ю., Захаров И.К. Генотипическое разнообразие эндосимбионта Wolbachia в популяциях Drosophila melanogaster // Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина. 5 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 21-28 июня 2009 г. Часть 2. - Москва. 2009. С. 205.

4. Быков Р.А. Динамика инфицированности природных и экспериментальных популяций Drosophila melanogaster разными генотипами эндосимбионта Wolbachia // В кн.: Материалы 48 Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", Биология. Новосибирск, 10-14 апреля 2010 г. - Новосибирск, НГУ. 2010. С. 218.

5. Ilinsky Yu.Yu., Bykov R.A., Zakharov I.K. The symbiotic association of Wolbachia-Drosophila melanogaster, biology and genetics // Crimean Meeting: Third International Conference, Dedicated N.V. Timofeeff-Ressovsky "Modern Problems of Genetics, Radiobiology, Radioecology and Evolution"; Third Readings after V.l. Korogodin and V.A. Shevchenko; NATO Advanced Research Workshop "Radiobiological Issues Pertaining to Environmental Security and Ecoterrorism": Abstracts, Papers by Young Scientists. Alushta, 9-14 October 2010. - Dubna: JINR. 2010. P. 142

6. Илинский Ю.Ю., Быков P.A., Захаров И.К. Генетическое разнообразие митохондриальной ДНК Drosophila melanogaster зависит от сонаследования Wolbachia // Программа фундаментальных исследований Президиума РАН. №11. "Биологическое разнообразие". Подпрограмма "Генофонды и генетическое разнообразие". Сборник материалов. - Москва: ИОГен. 2011. С. 39-40.

7. Быков Р.А., Струнов А.А., Жукова М.В., Калмыкова Е.А., Илинский Ю.Ю., Киселева Е.В., Захаров И.К. Полиморфизм природных популяций - влияние факторов внешней среды и взаимодействие генов и геномов в симбиотической системе «Wolbachia-Drosophila melanogaster» // Программа фундаментальных исследований Президиума РАН. "Биологическое разнообразие". Подпрограмма

15

"Генофонды и генетическое разнообразие". Материалы отчетной конференции. -Москва: ИОГен. 2011. С. 54-56.

8. Захаров И.К., Ваулин О.В., Илинский Ю.Ю., Быков Р.А. и др. Генетика природных и экспериментальных популяций дрозофил // Международная конференция "Проблемы популяционной и общей генетики", Москва. 14-16 ноября 2011 г. Международная молодежная конференция "Популяционная генетика: современное состояние и перспективы", Москва. 17-18 ноября 2011 г. Сборник тезисов. -М.: "Цифровичок". 2011. С. 68.

9. Быков Р.А., Илинский Ю.Ю. Динамика инфицированности экспериментальных популяций Drosophila melanogaster двумя генотипами эндосимбионта Wolbachia // Экология: традиции и инновации. Материалы конференции молодых ученых, 9-13 апреля 2012, г. Екатеринбург, ИЭРиЖ УрО РАН / Екатеринбург: Гощицкий. 2012. С. 16-19.

10. Илинский Ю.Ю., Юдина М.А., Калмыкова Е.А., Быков Р.А., Высочина Н.П., Винарская Н.П., Захаров И.К. Инфицированность эндосимбиотической бактерией Wolbachia видов блох (Siphonoptera: Insecta) Свердловской области и Хабаровского края // Экологическая генетика. 2013. Т. 11. - С. 32-35.

11. Илинский Ю. Ю., Быков Р. А., Захаров И. К. ЦитотипЫ мутантных линий Drosophila melanogaster фонда лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН: генотипы эндосимбионта Wolbachia и митотипы вида-хозяина. // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2013. Т. 17. №3. - С. 404-423.

12. Илинский Ю.Ю., Быков Р.А., Захаров И.К. Эволюция и генетика симбиотической системы Drosophila melanogaster-Wolbachia // VI съезд ВОГиС и ассоциированные генетические симпозиумы, Ростов-на-Дону, 15-20 июня 2014 г. Тезисы докладов. - Новосибирск. ФГУП «Издательство СО РАН». 2014. С. 5.

13. Быков Р.А., Илинский Ю.Ю. Динамика факторов материнской наследственности в экспериментальных популяциях Drosophila melanogaster // VI съезд ВОГиС и ассоциированные генетические симпозиумы, Ростов-на-Дону, 15 -20 июня 2014 г. Тезисы докладов. - Новосибирск. ФГУП «Издательство СО РАН» 2014. С. 189.

14. Ilinsky Y., Bykov R., Yudina M., Weisman N., Zakharenko L., Ignatenko O., Gruntenko N., Karpova E., Zakharov I. Maternal inheritance of long-established laboratory Drosophila melanogaster stocks // 8th International Wolbachia Conference 6 -11 June 2014 Igls, Innsruck, Austria.

15. Быков P.A., ИлиНский Ю.Ю., Волошина M.A., Захаров И.К. Распространенность й генотипическое разнообразие симбиотической бактерии Wolbachia в популяции Drosophila melanogaster г. Нальчик. // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2014. Т. 18. №2. - С. 315-318.

Подписано к печати 05.11.2014 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 151

Отпечатано на полиграфической базе ИЦиГ СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10