Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференцировка клеток в эмбриогенезе, личиночном развитии и метаморфозе офиуры Amphipholis kochii и морского ежа Scaphechinus mirabilis

ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Дифференцировка клеток в эмбриогенезе, личиночном развитии и метаморфозе офиуры Amphipholis kochii и морского ежа Scaphechinus mirabilis"

На правах рукописи

ГЛИЗНУЦА Любовь Александровна

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА КЛЕТОК В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ,

ЛИЧИНОЧНОМ РАЗВИТИИ И МЕТАМОРФОЗЕ ОФИУТЫ AMPHIPHOLIS KOCHIŒ МОРСКОГО ЕЖА SCAPHECHINUS MIRABILIS

03.00.30-биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2004

Работа выполнена в Институте биологии моря ДВО РАН Научный руководитель

Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории эмбриологии ИБМДВО РАН Салим Шакирович Даутов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией сравнительной цитологии ИБМДВО РАН Игорь Юрьевич Долматов Кандидат биологических наук, доцент кафедры клеточной биологии АЭМББТ ДВГУНаталья Павловна Токмакова

Ведущая организация:

Московский Государственныйуниверситет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «28» декабря 2004г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.008.01 при Институте биологии моря ДВО РАН по адресу: 690041, Владивосток, ул. Пальчевского, 17. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря ДВО РАН (690041, Владивосток, ул. Пальчевского, 17). Автореферат разослан «25 » ноября 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кашш„ биологических „аук ¿НиирКнеО М. А. Ваш.ико

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Типы циклов развития и метаморфоза у разных животных сильно варьируют, но, по современным представлениям, в их основе должны лежать общие принципы (Nielsen, 2000). Морские беспозвоночные с широким спектром онтогенезов являются хорошими объектами для выявления этих закономерностей. Огромный вклад в изучение эволюции жизни и жизненных циклов был сделан благодаря исследованиям, проводимым на иглокожих (тип Echinodermata). Эмбрионы и личинки иглокожих не только удобные модельные объекты, они вызывают интерес исследователей в связи с проблемой происхождения хордовых.

Иглокожие (тип Echinodermata) и полухордовые (тип Hemichordata) являются группами филогенетически близкими к хордовым (тип Chordata). И именно сходство эмбрионального и личиночного развития легли в основу представления о близком родстве этих трех типов, что подтверждают данные молекулярного анализа (Adoutte et al., 2000 цит. по: Nielsen, 2002). В современной эмбриологии иглокожих с полухордовыми объединяют в группу вторичноротых животных с личинкой типа диплеврула (Иванова-Казас, 1995). Предполагается, что и предки хордовых когда-то имели аналогичную личинку.

В эволюционной эмбриологии иглокожих существует несколько основных спорных моментов. Во-первых, это вопрос происхождения личинок у иглокожих и полухордовых. Общепринято мнение о гомологии личинок, но высказывается предположение о конвергентном сходстве личинок. В этой связи с каждым годом увеличивается количество работ, посвященных внутреннему строению и особенно нервной системе личинок иглокожих и полухордовых (Даутов, Незлин, 1991; Lacally, 1996; Nezlin, 2000; Byrne and Cisternas, 2002; Cisternas and Byrne, 2003 Nakajima et al., 2004a, b; Nezlin and Yushin, 2004).

Другая проблема иглокожих связана с возникновением личиночного скелета в двух классах иглокожих: у офиур (Кл. Ophiuroidea) и морских ежей (Кл. Echinoidea). Только эти два класса иглокожих имеют очень схожих личинок - плутеусов со сложным скелетом, при этом метаморфоз у данных личинок проходит с существенными отличиями. Остается непонятным, как возникли эти личинки, и чем

обусловлено их сходство: конвергенцией илщ ФуюЯЦИВЮЦИнШ

БИБЛИОТЕКА

С О»

Э02).

гаш> I

В последнее время большое внимание привлекает еще одна «загадка» иглокожих - феномен клонирования (почкования) у личинок. Исследования в этом направлении находятся на начальном этапе, и ничего не известно о механизмах, обеспечивающих цитодифференцировку и морфогенез при развитии клонов. Чтобы ответить на вопрос, насколько процесс нормального развития из зиготы сходен с клонированием, необходимо сначала подробно изучить обычное развитие (Balser, 1998).

Ультраструктурное изучение ранних онтогенетических стадий иглокожих, совместно с молекулярными и гистохимическими исследованиями, может дать необходимые факты для последующего сравнительного эволюционно-эмбриологического анализа, который, возможно, ответит на выше указанные вопросы (Hart, 2002). Электронно-микроскопическое исследование офиур особенно актуально, так как их онтогенез наименее изучен и содержит много пробелов. Большинство работ по развитию этих самых многочисленных в видовом отношении иглокожих выполнено с применением только светооптических методов. Необходимы ультраструктурные работы, которые расширят границы понимания происходящих во время онтогенеза процессов.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы было провести сравнительный ультраструктурный анализ дифференцировки клеток во время эмбриогенеза, личиночного развития и метаморфоза представителей двух классов иглокожих - офиуры Amphipholis kochii и морского ежа Scaphechinus mirabilis. Выявить клеточные механизмы морфогенеза и дегенерации клеток во время катастрофического метаморфоза иглокожих. Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Провести электронно-микроскопическое изучение личиночного развития двух видов иглокожих: офиуры Amphipholis kochii и морского ежа Scaphechinus mirabilis - от момента оплодотворения до стадии компетентного к оседанию плутеуса.

2. На ультраструктурном уровне выявить клеточные механизмы, обеспечивающие дегенерацию провизорных органов при метаморфозе плутеусов обоих видов.

3. Исследовать в сравнительном аспекте преемственность личиночных органов в ходе метаморфоза двух видов.

4. Провести сравнительный анализ развития офиур и морских ежей, имеющих

планктотрофных плутеусов, с развитием других животных с личинками типа диплеврула.

Научная новизна.

Впервые на ультраструктурном уровне изучено эмбриональное, личиночное развитие и метаморфоз офиур. Прослежено формирование таких личиночных органов, как желудочно-кишечный тракт, ресничный шнур у офиуры Amphipholis kochii и морского ежа Scaphechinus mirabilis. Прослежена дифференцировка клеток эктодермального, энтодермального и мезенхимного рядов. Проведено сравнительное исследование двух личинок со сложным скелетом, которое показало, что, несмотря на отличия в последовательности закладки и пространственном положении личиночных рук, личинки очень похожи на всех этапах развития.

Получены дополнительные данные по личиночному развитию и метаморфозу морских ежей на ультраструктурном уровне. Установлены клеточные механизмы, обеспечивающие перестройки во время метаморфоза офиур и морских ежей. Обнаружены морфологические свидетельства апоптоза в клетках личиночного эпидермиса и задней кишки плутеусов, свидетельства автофагии и фагоцитоза в клетках желудка и амебоцитах личинок.

Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные данные расширяют наше понимание процессов эмбриогенеза, личиночного развития и метаморфоза иглокожих, дают дополнительные сведения о клеточных механизмах, обеспечивающих морфогенез в этот период. Сравнение личиночного развития офиур и морских ежей с развитием других иглокожих подтверждает гомологию личинок иглокожих, а возникновение провизорного скелета только в двух классах иглокожих: у офиур и морских ежей - вероятно, обусловлено параллелизмом, а не конвергенцией. Ранняя закладка скелета у личинок двух классов возникла, по-видимому, в результате гетерохронии в развитии с ранней дифференцировкой скелетогенных клеток. Полученные данные могут быть включены в программу общих и специализированных курсов по биологии развития для высших учебных заведений.

Апробация работы.

Результаты исследований и основные положения диссертации докладывались на 2 и 3-й Региональных конференциях по актуальным проблемам морской биологии и экологии (Владивосток, 1999, 2000); 5-ой Международной конференции по

личиночной биологии (Испания, Виго, 2002); конференции студентов, аспирантов и молодых ученых НОЦ ДВГУ "Фундаментальные исследования морской биоты" (Владивосток, 2002); Региональной конференции молодых ученых ДВО РАН (Владивосток, 2002); ежегодных научных конференциях института биологии моря ДВО РАН (Владивосток, 2002,2003).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 работ и 1 находится в печати.

Структура и объем диссертации.

Диссертация включает в себя следующие главы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Список литературы состоит из 98 источников. Диссертация изложена на 100 страницах, содержит 1 таблицу и 33 рисунка и схемы.

Благодарности.

Автор благодарит своего научного руководителя к. б. н. С. Ш. Даутова, за помощь, поддержку и терпение на всех этапах выполнения работы. Огромное спасибо сотрудникам лаборатории эмбриологии ИБМ ДВО РАН за советы и неравнодушное участие; особенная благодарность заведующему лабораторией д. б. н. В. В. Юшину и вед. н. с, д. б. н. В. В. Исаевой. Спасибо к. б. н. С. Д. Кашенко за ценные советы по культивированию личинок и Д. В. Фомину за помощь при работе на электронных микроскопах. Спасибо коллективу кафедры цитологии ДВГУ во главе с д. б. н. А. П. Анисимовым за их благородный и плодотворный труд. Особенная признательность всем моим близким и родным.

Работа поддержана грантами ДВО РАН (2002 и 2003 гг., рук. Л. А. Кунгурцева); грантами ведущих научных школ РФФИ № 00-15-97938 и Минпромнауки НШ № 1219.2003.4 (рук. академик В. Л. Касьянов).

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование личинок.

Работу проводили на МБС "Восток" ИБМ ДВО РАН в 2001 и 2003гг. Половозрелых, готовых к нересту офиур AmphiphoUs Ы^и (Ьшкеп, 1872) (Кл. ОрЫшшёеа, отр. ОрЫшпёа, сем. АшрЫипёае) собирали в корнях морской травы Phyllospadix ivatensis на литорали зал. Восток Японского моря, плоских морских ежей

Scaphechinus mirabilis (Agassiz, 1863) (Кл. Echinoidea, отр. Clypeasteroida, сем. Dendrasteridae) - на песчаном грунте бух. Прибойная. Животных содержали в проточной морской воде в аквариальной.

Для получения необходимых онтогенетических стадий было проведено искусственное оплодотворение и поставлена личиночная культура. Для стимуляции нереста у офиур A. kochii приготовленный на морской воде опалесцирующий раствор сперматозоидов, полученный при разрезании семенников, добавляли в стаканы с самками, оральная сторона диска которых была предварительно освещена. Это стимулировало вымет ооцитов, и происходило их оплодотворение.

Нерест у морских ежей Scaphechinus mirabilis стимулировали электрическим током. Оплодотворение производили, смешивая гаметы, полученные от мужских и женских особей.

Полученные личиночные культуры содержали при температуре 19-20°С и 21°С в 5-литровых емкостях с морской водой по методике, описанной С. Д. Кашенко (Кашенко, 1992). С наступлением планктотрофной стадии личинок кормили один раз в сутки смесью одноклеточных водорослей Phaeodactylum tricornutum, Dunaliella salina (4 мл концентрированной смеси водорослей на емкость с личинками). В ходе работы использовали фильтрованную и стерилизованную морскую воду.

Электронная микроскопия.

Для проведения электронно-микроскопических исследований полученные эмбриональные, личиночные и ювенильные стадии фиксировали в 2,5% глутаральдегиде на 0,05М какодилатном буфере с добавлением 21,4 мг/мл NaCl в течение 1,5 часов (эмбриональные, богатые желтком стадии до 6 часов) с последующей полуторачасовой постфиксацией в 1% OsO4 на том же буфере с добавлением 27,25 мг/мл NaCl. Материал контрастировали в 4% водном растворе уранилацетата в течение 1 часа, а затем обезвоживали в серии спиртов и заливали в смолу Аралдит. Всего произведено в 2001г.: по 13 фиксаций различных стадий развития A. kochii и S. mirabilis, начиная со стадии бластулы и заканчивая ювенильной стадией; в 2003 г.-по 19 и 10 фиксаций, соответственно.

Полу- и ультратонкие срезы получали на микротоме Ultracut-E. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим и фотографировали под световым микроскопом Polyvar (Reichert). Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по методу Рейнольдса (Уикли, 1975) и

просматривали и фотографировали под электронными микроскопами JEM-100B и JEM-100S.

Для сканирующей электронной микроскопии личинок фиксировали 2,5% глютаральдегидом на какодилатном буфере в течение 1 часа, и после отмывки в буфере обезвоживали в серии спиртов до абсолютного спирта. Далее материал высушивали в вакуумной сушке, наклеивали на столики, напыляли углеродом и изучали под сканирующим микроскопом ZeissLeo-430.

Световая микроскопия.

Личинок, фиксированных глютаральдегидом и смонтированных на тотальных препаратах, и полутонкие срезы изучали и фотографировали под микроскопом Polyvar на цифровую камеру Leica (Canon PowerShot 40S).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

По нашим результатам, в условиях лабораторного культивирования при температуре 19-20°С весь цикл развития A. kochii от момента оплодотворения до оседания ювенильного организма занимает 35 суток. При температуре 21°С продолжительность составляет 20 суток (собственные данные), а при температуре 23°С составляет 12 суток (Yamashita, 1985). Различия можно объяснить зависимостью цикла развития A. kochii от температуры. Развитие S. mirabilis при 21°С длится около 30 суток. Разница в сроках развития двух исследованных видов, связана, во-первых, с удлинением срока развития морских ежей, по сравнению с другими иглокожими за счет формирования внутреннего зачатка ежа, что позволяет удлинить продолжительность планктотрофной стадии и увеличить радиус расселения. Так у некоторых глубоководных тропических морских ежей формируется «телеокеаническая» личинка, развивающаяся в течение 5 месяцев (Young and George, 2000). Во-вторых, яйца A. kochii содержат больше желтка, что сокращает время накопления необходимых энергетических запасов для морфогенетических перестроек во время метаморфоза.

Цитодифференцировки в эмбриогенезе ираннем личиночномразвитии.

Неоплодотворенные яйца иглокожих покрыты желточной и студенистой оболочками. Студенистая оболочка у яиц A. kochii прозрачная, плохо различима без окрашивания. Оболочка S. mirabilis, напротив, толстая, с гранулами красного пигмента в верхнем слое, что характерно для некоторых других видов из того же

семейства. После оплодотворения студенистая оболочка отслаивается, и на поверхности яйца появляются оболочка оплодотворения и гиалиновая оболочка. У офиур образуется очень толстая, многослойная гиалиновая оболочка. У A. kochii она толщиной 7 мкм, но у других офиур может достигать 10 мкм и более, как, например, у эмбрионов Gorgonocephalus cary (Patent, 1970). У S. mirabilis она гораздо тоньше, что свойственно морским ежам и морским звездам. В момент оплодотворения происходит экзоцитоз расположенных в примембранной цитоплазме кортикальных гранул. У A. kochii гиалиновая оболочка образуется из центрального плотного компонента гранул, а периферический фибриллярный компонент встраивается в желточную оболочку с образованием оболочки оплодотворения (Yamashita, 1984). На протяжении всего эмбриогенеза гиалиновая оболочка тесно связана с клетками бластодермы (позже эктодермы). Она является интегрирующим фактором для бластомеров (Иванова-Казас, 1995). Ранее на эмбрионах морских ежей было показано, что после искусственного удаления гиалинового слоя, клетки бластодермы способны его восстанавливать (Исаева, 1994). Это происходит за счет сохранения некоторого запаса не вступивших в кортикальную реакцию гранул, которые обнаружены в апикальной цитоплазме бластоцитов S. mirabilis и не найдены у А. kochii. Кортикальный слой недавно был описан в яйцах кишечнодышащих (тип Hemichordata), но у этих животных формируется только оболочка оплодотворения и нет гиалинового слоя (Nakajima et al., 2004).

У исследованных видов происходит радиальное, синхронное, голобластическое дробление. Но у небольшого числа эмбрионов A. kochii дробление иногда несет черты тетраэдрического. Это свидетельствует об отсутствии жесткой детерминации в пространственной организации раннего дробления у данного вида, что вообще свойственно многим офиурам, морским звездам и морским лилиям (Исаева, 1994; Иванова-Казас, 1995). У S. mirabilis, как у большинства морских ежей, наблюдается инвариантная форма радиального дробления с образованием макро-, мезо- и микромеров на стадии 16-32 бластомеров.

S. mirabilis и A. kochii имеют короткий эмбриональный период и покидают яйцевую оболочку на стадии ресничной бластулы. Это первая личиночная стадия, аналогичная плануле книдарий. У полухордовых эмбриональный период затягивается до формирования диплеврулы (Nakajima et al., 2004a).

Целобластулы A. kochii содержат много желтка и липидных капель, что делает их непрозрачными и существенно влияет на характер всех морфогенетических процессов. Несмотря на одинаковые размеры яйцеклеток,' эмбрионы S. mirabilis содержат намного меньше желточных гранул и не содержат липидных включений по сравнению с A. kochii. Наличие большого количества желточных гранул свойственно иглокожим с лецитотрофными личинками: морским лилиям и голотуриям с долиоляриями (Chia et a!., 1986; Dolmatov and Yushin, 1993) и офиурам с лецитотрофным плутеусом и вителлярией (Selvakumarasvamy and Byrne, 2000). Вероятно, из-за обилия желточных гранул, ядра клеток бластодермы у A. kochii, как и у офиуры Gorgonocephalus сагу, занимают апикальное (рис. 1А), а не базальное положение, как у морских ежей и голотурий (Gustafson and Wolpert, 1967 цит. по: Иванова-Казас, 1978; Patent, 1970; Юшин и др., 1993).

Важным моментом в эмбриогенезе и раннем личиночном развитии является утилизация желтка и липидов. Процесс утилизации основного компонента желтка -вителлогена - во всех клетках эмбрионов иглокожих протекает посредством ограниченного протеолиза (Yokota et. al., 1993; Иванова-Казас, 1995). При кислотном рН происходит активизация гидролитических ферментов самой желточной гранулы, желток становится более рыхлым и электронно-светлым. Далее происходит внутриклеточное переваривание при участии лизосом с образованием структурированных вторичных лизосом (Юшин и др., 1993; Yokota et. al., 1993). На эмбрионах морских ежей было показано, что в процессе утилизации желтка происходит избирательный экзоцитоз так называемых топосом - молекул клеточной адгезии, которые затем встраиваются в гиалиновую оболочку и являются носителями позиционной информации (Yokota, Sappington, 2001). Обнаруженные нами у эмбрионов A. kochii везикулы с электронно-плотными частицами, по-нашему мнению, являются вакуолями с топосомами, которые экзоцитируются в перигиалиновое пространство.

Из-за обилия желточных гранул у A. kochii образуется высокий бластодермальный эпителий и небольшой бластоцель. Отличительной особенностью бластодермального, впоследствии эктодермального эпителия A. kochii является наличие обширных межклеточных полостей, особенно в эпителии апикального гребня на стадии поздней гаструлы (рис. 1А, Б). Прежде их описывали как внутриклеточные вакуоли, характерные только для эмбрионов офиур. (McBride, 1907,

Касьянов и др., 1983; Yamashita, 1985). Функцию этих полостей определить трудно. Они могут играть роль "поплавков", заполненных матриксом с низкой плотностью, или могут быть своеобразным резервом пространства, так как, личинки развиваются иногда в условиях пониженной солености, что может приводить к обводнению и набуханию клеток. У личинок S. mirabilis образуется тонкая плотная бластодерма, и все морфогенетические процессы визуализируются четко.

У изученных нами офиуры и морского ежа процессы выселения и специализации клеток первичной мезенхимы проходят одинаково. Эти клетки дифференцируются в склеренхиму и образуют личиночный скелет. Формирование спикулы начинается внутриклеточно, по мере роста она выходит за пределы клетки и окружается группой склероцитов, которые, сливаясь отростками, образуют синцитий. Снаружи синцития эти клетки со временем выделяют базальную мембрану. На рибосомах ШЭР синтезируется аморфный белковый компонент матрикса спикул, который в везикулах по цитоплазматическим отросткам доставляется в синцитиальную вакуоль (рис. 3). Органический матрикс спикул, имеющий концентрическую организацию, служит каркасом для последующего отложения кальция, которое происходит в центробежном направлении (Исаева, 1994; Ameye et al., 1998). Мелкие электронно-прозрачные вакуоли, вероятно, содержат минеральный компонент, растворяющийся в ходе подготовки материала для ТЭМ. Склероциты содержат скопления желточных гранул, что, по-видимому, связано с большими энергетическими затратами в процессе биоминерализации. За счет своих запасов эти клетки хорошо живут и реализуют свою генетическую программу не только in vivo, но и в культуре (Керкис, Исаева, 1984; Исаева, 1994).

Архентерон образуется путем инвагинации; по мере роста с его кончика выселяется вторичная мезенхима, что сопровождается клеточными делениями в эпителии кончика. Впоследствии клетки вторичной мезенхимы у иглокожих дифференцируются в амебоциты, пигментные клетки и клетки мышечной обкладки пищевода (СЫа, 1977; Rybeig, 1980; Burke and Alvarez, 1988; Tukuoka et al., 2002). У ранних личинок S. mirabilis и A. kochii мы не обнаружили пигментных клеток. Пигментные клетки у S. mirabilis появляются на стадии метаморфизирующего плутеуса, а у A. kochii вообще не были обнаружены. Эти клетки характеризуются хорошо развитым аппаратом Гольджи, содержат крупные пигментные гранулы и отличаются электронно-плотной цитоплазмой (рис. 3). По литературным данным они

приурочены, как правило, к местам интенсивного морфогенеза, вероятно,

Рис. 1. Схематическое изображение сагиттального среза бластулы (А) и гаструлы (Б) A. kochii. ВМ— вторичная мезенхима, РЕС - реснички, ГО - гиалиновая оболочка, МЕЗ - первичная мезенхима, МП— межклеточные пространства, CKJI- склеренхима, АМБ - амебоцит.

поэтому они многочисленны именно в период метаморфоза у S. mirabilis. Японскими авторами показано, что клетки вторичной мезенхимы изначально не детерминированы, и процентное соотношение амебоцитов, миобластов и пигментных клеток можно изменить с помощью обработки эмбрионов ацетатом натрия и хлоридом никеля (Tukuoka et al., 2002). Это отличает клетки вторичной мезенхимы от клеток первичной, последние детерминированы на скелетогенную функцию изначально.

Гаструляция у S. mirabilis и A. kochii завершается энтероцельным образованием мезодермы. Далее порывается рот и формируется диплеврула с околоротовым ресничным шнуром. Эктодермальные клетки в процессе раннего личиночного развития S. mirabilis и A. kochii дифференцируются в уплощенные клетки стенки тела и высокие ресничные клетки ресничного шнура (рис. 3). У A. kochii над эктодермой сохраняется гиалиновая оболочка. Клетки энтодермы аккумулируют в своей цитоплазме большую часть желточных гранул и активно их утилизируют, что можно рассматривать как начало специализации этих клеток на процессе переваривания.

Цитодифференцировки в период личиночного развития.

С появлением сквозного желудочно-кишечного тракта личинки начинают питаться, происходит развитие пищеварительной системы и ресничного шнура (рис. 2А, Б). В ресничных шнурах появляются слизистые клетки, секрет которых обволакивает поверхность шнура и, как предполагают, облегчает личинкам плавание и сбор одноклеточных водорослей (Юшин, Незлин, 1990; Strathmann, 1971). В зарубежной литературе часто примембранный слой ресничного шнура называют гиалиновым (hyaline layer) (Byrne et al, 2001; Nakajima et al., 2004a), что, по-нашему мнению, не отражает действительности.

Пищевод образуется из стомодеального впячивания эктодермы (Иванова-Казас, 1978; Abed, Crawford, 1986). Снаружи у него формируется мышечная обкладка, которую образуют мышечные клетки, потомки вторичной мезенхимы, сливающиеся в симпласт (рис. 3). Клетки пищевода имеют эктодермальное происхождение, что отражается на их цитоморфологии, делая их похожими на клетки ресничного шнура, а не эпителия желудка или задней кишки (рис. 3). Все производные эктодермы на личиночной стадии, как правило, имеют ресничку с воротничком микроворсинок и длинным поперечно-исчерченным корешком, они синтезируют примембранный слой; интеграция клеток осуществляется за счет апикальных десмосом и септированных контактов (рис. 3). Такая морфология эктодемальных клеток характерна и для личинок других иглокожих (Spiegel and Howard, 1983; Lacalli et al., 1990; Byrne, 1994; Lacalli and Kelly, 2002).

Нервные клетки также имеют эктодермальное происхождение. С помощью иммунохимического окрашивания было обнаружено, что первые нейробласты у личинок морских ежей и звезд появляются на стадии поздней гаструлы (Nakajima et al., 2004b). Они вступают в контакт с презумптивными ресничными шнурами и уже на стадии плутеусов дифференцируются в биполярные нейроны, отростки которых формируют базальные аксональные тракты. Кроме этого, нервная система личинок иглокожих включает 2 подглоточных ганглия, апикальный ганглий и у эхиноплутеусов еще пару латеральных ганглиев. Отдельные нейриты располагаются в стенке пищевода, задней кишки и ануса. В целом она имеет много общего в строении с нервной системой торнарии (Nakajima et al., 2004a), отличается медиаторная специфичность нейронов (Nezlin, 2000; Nezlin and Yushin, 2004).

Рис. 2. СМ. Развитие A. kochii (А, В, Д) и S mirabilis (Б, Г, Е) А. Офиоплутеус. Стрелки указывают на постеродорсальные руки. Б. Эхиноплутеус. В. Метаморфизирующий плутеус. Г. Метаморфизирующий плутеус. Д. Ювенильная особь после оседания. Е. Молодой морской еж 0,5 суток после оседания. Стрелки на рис. 2Г, Е указывают на амбулакральные ножки. АМ - амбулакральные ножки, АРФ - Аристотелев фонарь, Ж - желудок, ИГ - игла, АЛ -антеролатеральная рука, ПЛ - постеролатеральная, ПО - посторальная рука.

мышечная клетка обкладки пищевода

пнгментиая клетка*

амебоцит

ЭНТОДЕРМА

ВТОРИЧНАЯ МЕЗЕНХИМА

пищевод

ресничный шнур

стенка тела

ЦЕЛОМИЧЕСКАЯ МЕЗОДЕРМА

ЭКТОДЕРМА ПЕРВИЧНАЯ МЕЗЕНХИМА

Рис. 3. Схема клеточных дифференцировок в процессе личиночного развития офиуры A kochu и морского ежа S mirabilis МЖ-миоэпителиальная клетка РКП - ресничная клетка, СЛК - слизистая клетка, НЕР - нейрон Кл1, кл2, клЗ - клетки 1-го, 2-го и 3-го типов. * - пигментные клетки у A kochu не обнаружены.

У личинок иглокожих, в отличие от торнарии, нет оформленного апикального органа, есть только апикальный одиночный или спаренный (у аурикулярии голотурий) нервный ганглий (Lacalli and Kelly, 2002; Nakajima et al., 2004b). Как показало гистохимическое исследование австралийских авторов и наше ультраструктурное исследование, у офиоплутеусов апикальный ганглий отсутствует (Cisternas, Byrne, 2003; данная работа). В тоже время плутеусы ежей имеют апикальный ганглий (Nakajima et al., 2004b). Этот ганглий играет важную роль в контроле метаморфоза и оседания личинок морских ежей и звезд, и его отсутствие у офиоплутеуса, возможно, связано с тем, что к моменту оседания из личиночных структур у офиур остаются только 3 руки (рис. 2В).

Клетки кишечных эпителиев плутеусов A. kochii и S. mirabilis дифференцируются с образованием 3-х морфологических типов (рис. 3). Электронно-плотные клетки 1-го типа и клетки 2-го типа со светлой цитоплазмой составляют основу эпителия желудка и, по-видимому, участвуют в поглощении и усвоении питательных веществ, о чем свидетельствуют многочисленные пиноцитозные пузырьки. Эти клетки также способны фагоцитировать крупные фрагменты пищи. Разница в электронной плотности цитоплазмы клеток, возможно, связана с их возрастом: молодые клетки имеют более темную цитоплазму (Kungurtzeva, Dautov, 2001).

Клетки 3-го типа с развитым ШЭР, как мы предполагаем, участвуют в синтезе ферментов полостного пищеварения. Все три типа клеток описаны в составе желудка плутеусов Dendraster excentricus, Echinocardium cordatum, Ophiura sarsi (Burke, 1981; Nezlin, Yushin, 1994; Kungurtzeva, Dautov, 2001). Но Бэрк считает, что клетки 3-го типа специализируются на фагоцитозе пищевых частиц (Burke, 1981).

В кубическом эпителии задней кишки плутеусов A. kochii и Ophiura sarsi присутствуют 2 типа клеток - электронно-светлые и темные, морфологически они похожи на клетки 1и 2 типов желудка, что свидетельствует о продолжении в задней кишке офиоплутеусов процесса всасывания питательных веществ, начатого в желудке (Kungurtzeva, Dautov, 2001). Интересно, что у эхиноплутеуса Scaphechinus mirabilis, как и у вышеупомянутых видов морских ежей, эпителий задней кишки весь представлен чешуйчатыми слизистыми клетками, которые несут на себе отпечаток эктодермальной дифференцировки. Скорее всего, они принадлежат линии

эктодермальных клеток, а степень представленности чешуйчатого эпителия в выстилке задней кишки у личинки зависит от того, насколько сильно архентерон увлек за собой соседние клетки эктодермы во время гаструляции.

Сокращение кардиального и пилорического сфинктеров у плутеусов S. mirabilis и A. kochii обеспечивают миоэпителиальные клетки, в базальной области которых располагаются миофибриллы (рис. 3). Такие клетки описаны и у других плутеусов (Burke, 1981; Nezlin and Yushin, 1994; Kungurtzeva and Dautov, 2001). А вот у личинок морских звезд и голотурий пилорический сфинктер отсутствует.

Показателем активного процесса цитодифференцировки в период личиночного развития может служить увеличение количества гетерохроматина в ядрах дифференцирующихся клеток, что связано с подавлением транскрипции генов, работавших во время эмбриогенеза.

Склеренхимные клетки на стадии сформированного плутеуса у исследованных видов не активны, т.к. личиночный скелет уже построен. Спикулы сохраняют цитоплазматическую обкладку, образованную отростками склеренхимных клеток. С началом метаморфоза у плутеусов A. kochii в обкладке появляются мелкие гранулы красного пигмента. У эхиноплутеусов S. mirabilis в эпидермисе и стенке амниотической полости появляются красные пигментные клетки с плотной цитоплазмой и крупными пигментными гранулами (рис. 3).

Другие мезенхимные клетки - амебоциты - выполняютл S. mirabilis и A. kochii экскреторную функцию. По-видимому, они способны проникать через эпидермис и экзоцитировать часть продуктов обмена во внешнюю среду. Это подвижные клетки, отчего их ядро принимает сегментированную форму. Попадаются 2-х ядерные амебоциты, которые, вероятно, возникли в результате слияния в синцитий двух амебоцитов при утилизации крупного чужеродного тела (рис. 3). Мультиядерные амебоциты встречаются при метаморфозе морского ежа (Chia, Burke, 1978). Итоговая схема клеточных дифференцировок личиночного развития приведена на рис. 3.

Клеточные процессы метаморфоза.

Процесс развития сопряжен с делениями и дифференцировкой клеток. Митотическая активность клеток отличается в разные периоды развития. В личиночном развитии иглокожих - два таких периода: эмбриогенез и метаморфоз. Подсчитано, что к концу эмбриогенеза зародыши Strongylocentrotus purpuratus состоят из 1500 клеток, следующий этап митотической активности наступает перед

метаморфозом, и компетентная личинка состоит уже из 150 000 клеток, при этом 90% ее клеток войдет в состав ювенильного организма. Таким образом, весь основной объем делений приходится на конец личиночного развития (Davidson, 1998). Наши данные полностью согласуются с этим: частота встречаемости клеток в митозе на ультратонких срезах резко возрастает на стадиях предшествующих метаморфозу.

Несмотря на то, что морфологически метаморфоз у офиур и ежей существенно различается (рис. 2В, Г, ЗА, В), в этот период включаются сходные клеточные механизмы, обеспечивающие смену билатерально-симметричной личиночной формы на радиально-симметричный взрослый организм.

У эхиноплутеуса формируется амниотическая полость. Возникновение амниона в развитии морских ежей, несомненно, является важным, но весьма поздним эволюционным приобретением, что подтверждается его отсутствием у личинок вида Eucidaris thouarsi, принадлежащего к наиболее древнему на сегодняшний день семейству морских ежей Cidaridae (Emlet, 1988). Амниотическая полость с зачатком ежа является по сути имагинальным диском, аналогичным имагинальным дискам насекомых с полным превращением. Роль недифференцированных клеток -гистиобластов - у ежей выполняют клетки целомов, которые в нужный момент делятся и дифференцируются в дефинитивные ткани с последующим выворачиванием наружу.

Главном индуктором метаморфоза у иглокожих является левый гидроцель. Его растущие лопасти индуцируют деления и рост клеток прилегающего личиночного эпидермиса у офиоплутеуса (рис. 4В) и эпидермиса амниотической полости у эхиноплутеуса. Так формируются первичные амбулакральные ножки плутеусов ежей и первичные терминальные щупальца офиоплутеусов, вслед за которыми попарно возникают вторичные амбулакральные ножки (рис. 4А, Б, В).

У обеих личинок эпиневральная нервная система формируется из клеток эктодермы эпиневральных складок (рис. 4Б), при замыкании которых образуется эпиневральный канал (Hyman, 1955). У личинок иглокожих из личиночной нервной системы во взрослую встраиваются только аборальный и оральные ганглии, а аксональные тракты личиночного ресничного шнура резорбируются. Дефинитивная радиально-симметричная нервная система формируется путем дифференцировки новых нейронов, что характерно и для морских звезд, и для других иглокожих, у которых происходит смена симметрии (Byrne and Cisternas 2002).

Личиночные эпидермисы плутеусов морских ежей и офиур имеют совершенно разную судьбу. Клетки эпидермиса тела офиоплутеуса трансформируются в дефинитивный эпидермис. В основном это клетки, формирующие кутикулу. Клетки двух других типов - слизистые и гранулярно-секреторные - также участвуют в образовании примембранных слоев. У ювенильных офиур каждая секреторно-гранулярная клетка вместе с соседней ресничной клеткой формирует сенсорно-секреторный комплекс. Подобные комплексы описаны и у взрослых офиур (Byrne, 1994). Клетки личиночного эпидермиса, по-видимому, потенциально способны дифференцироваться во все дефинитивные эпидермальные клеточные типы, так как во время личиночного развития у них частично уже реализуются секреторная и сенсорная программы.

Еще на стадии метаморфизирующего офиоплутеуса субкутикулярное пространство ювенильного диска заселяют симбиотические бактерии, они встречаются и в удаленных от эпидермиса тканях - внутри вакуолей кишечного эпителия. Возможно, бактерии могут служить для офиур дополнительным источником аминокислот и белков (Byrne, 1994). Крепление кутикулы к эпидермису и к дерме осуществляют специализированные контакты, состоящие из комплекса полудесмосом и разнообразного фибриллярного материала (Byrne, 1994; данная работа). Участие дермальных клеток не случайно, ведь у некоторых офиур эпидермальные клетки исчезают после формирования кутикулы.

Еще до наступления метаморфоза у офиур и морских ежей начинается строительство дефинитивного скелета (Крючкова, 1976, 1977, 1979, 1988). Скелетные пластинки, как и в эмбриональный период, формируются внутри синцития, образованного склероцитами. Эти клетки по ультраструктурным характеристикам не отличаются от склеренхимных клеток, работавших в эмбриональном периоде, и, вероятно, являются потомками той же клеточной линии. У эхиноплутеуса часть скелетогенных клеток дифференцируется в одонтобласты, формирующие первичные пластинки пирамидок и зубов Аристотелева фонаря (рис. 4Б, Г). Формирование Аристотелева фонаря начинается еще в амниотической полости, где из дентальных выростов, формируются зубные конусы (рис. 4Г). Подробно развитием дефинитивного скелета у S. mirabilis и занималась Г. А. Крючкова. Она показала, что только мадрепоровая пластинка ювенильной особи возникает на основе дорзальной

арки личинки, а остальные рудименты личиночного скелета исчезают в течение 1-2 суток после оседания (Крючкова, 1979).

Впервые ультраструктурное исследование метаморфоза морского ежа провели Чи и Берк (Chia, Burke, 1978). По их данным во время метаморфоза происходит дезинтеграция кишечного и эпидермального эпителиев личинки. Далее идет деструкция, резорбция эпидермальных клеток и фагоцитоз их остатков кишечными клетками. Наше исследование показало, что у S. mirabilis во время метаморфоза эпителиальное строение кишечника сохраняется (рис. 4А, Д, Е), в остальном, мы наблюдаем сходные процессы. Но на современном этапе мы можем смело сказать, что у эхиноплутеуса клетки личиночного эпидермиса подвергаются апоптозу (рис. 4 Е). Морфологическими свидетельствами апоптоза являются: округление клеток, втягивание ресничек, фрагментация ядра и цитоплазмы с последующим фагоцитозом фрагментов соседними клетками (Ченцов, 2004). В процессе переваривания формируются характерные электронно-плотные апоптические тела, описанные при метаморфозе других животных (Majno, Joris, 1995; Ishizuya-Oka, Ueda, 1996). При метаморфозе A. kochii также наблюдается апоптоз клеток покровов личиночных рук и задней кишки (рис.4 А, В).

Наши результаты находят подкрепление в литературе. Опубликованы данные биохимического исследования об апоптозе личиночных тканей морского ежа. С помощью ДНК электрофореза и TUNEL метода (TdT-mediated dUTP Nick-End Labelling) было показано, что при обработке ранних личиночных стадий морского ежа химическими реагентами при одновременном нагреве происходит индукция апоптоза в клетках рук и задней кишки личинки. Показано, что клетки этих органов подвергаются запрограммированной смерти даже без индуцирования (Roccheri et al.,1997). Позднее при изучении личинок на разных стадиях развития было показано, что около 20% клеток личинки морского ежа подвергаются апоптозу. Это в основном клетки антеролатеральных, посторальных рук, задней кишки и ресничного шнура. На стадиях, близких к метаморфозу, количество клеток, склонных к суициду, возрастает (Roccheri et al., 2002).

Клетки кишечного эпителия плутеусов A. kochii и 5. mirabilis (в основном это эпителий желудка) наследуются ювенильным организмом. Проводя сравнение ультраструктуры желудочно-кишечного тракта личиночной и взрослой стадий офиур, мы отметили сходство функциональных типов клеток. Так, энтероциты взрослых

офиур аналогичны клеткам типов 1 и 2, а гранулярные клетки - клеткам 3-го типа (Филимонова, 1979; Jangoux, 1982; Byrne, 1994).

Во время метаморфоза A. kochii происходит резорбция оставшихся рук. Но в чашках с осевшими ювенильными офиурами мы наблюдали плавающие комплексы личиночных рук, которые, по-видимому, подверглись автотомии. Это явление получает особое значение в свете последних работ по клонированию личинок и требует дальнейшего исследования. В литературе есть данные об автотомии пары постеролатеральных рук у метаморфизирующих личинок офиур, при этом у некоторых видов описана последующая регенерация личиночного тела (Mladenov, 1979; Belser, 1998).

Рис. 4. СМ. А. Фронтальный срез метаморфизирующего плутеуса A. kochii. Стрелки указывают на амбулакральные ножки. Ж - желудок, ЗК — дегенерирующая задняя кишка. Б. Срез, прошедший в плоскости ювенильного зачатка S. mirabilis. ЭСК - эпиневральная складка, АРФ-Аристотелев фонарь, AM- перезезанные поперек амбулакральные ножки. В. Формирование амбулакральных ножек (AM) и терминального щупальца (ТЩ). Г. Формирование зубного конуса Аристотелева фонаря. ППЛ -первичные пластинки. Д. Клетки кишечного эпителия фагоцитируют апоптические тела (АПТ). Е. Кишечный эпителий и апоптозные клетки (АКЛ) личиночного эпидермиса.

ВЫВОДЫ

1. Плутеусы офиуры Amphipholis kochii и морского ежа Scaphechinus mirabilis имеют много общего, как на внешнем морфологическом, так и на ультраструктурном уровнях:

- эктодерма личинок формирует ресничные шнуры, состоящие из ресничных, слизистых клеток и аксонального тракта, и уплощенные клетки стенки тела;

- пищеварительная система плутеусов состоит из трех отделов: пищевода со слизистыми клетками и с мышечной обкладкой, желудка с тремя типами клеток и задней кишки, отделы разделяют кардиальный и пилорический сфинктеры.

- скелетогенные клетки у данных видов формируют синцитий и имеют много общего в строении.

2. Плутеусы отличаются от планктотрофных личинок других иглокожих наличием пилорического сфинктера и развитого личиночного скелета, сформированного скелетогенной первичной мезенхимой.

3. Возникновение личиночного скелета можно рассматривать как гетерохронию в развитии с эволюционно закрепленной ранней дифференцировкой скелетогенных клеток на стадии ранней личинки.

4. Дегенерационные процессы во время метаморфоза у морских ежей более выражены, чем у офиур. У офиур они происходят на стадии плавающего метаморфизирующего плутеуса, тогда как у ежей - после оседания. Цитологические механизмы обеспечения катастрофического метаморфоза у исследованных видов аналогичны: апоптоз, автофагия и фагоцитоз.

5. Степень преемственности провизорных тканей и органов не одинакова:

- эпидермис офиоплутеуса (кроме покровов рук) становится дефинитивным, у эхиноплутеуса - подвергается дегенерации;

- эпителий желудка у обеих личинок переходит к ювенильным организмам, при этом он сохраняет эпителиальное строение и фагоцитирует апоптозные клетки эпидермиса и задней кишки, в фагоцитозе также участвуют амебоциты;

- скелетогенные клетки наследуются ювенильными организмами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Кунгурцева* Л. А., Даутов С. Ш. Морфология и клеточный состав желудочно-кишечного тракта офиоплутеуса Ophiura sarsi II Региональная конференция по актуальным проблемам морской биологии, экологии и биотехнологии. -Владивосток: Изд-во ДВГУ. 1999. С. 85-87.

2. Кунгурцева Л. А., Даутов С. Ш.Ультраструктура дифференцирующихся клеток на ранних стадиях онтогенеза офиуры Amphipholis kochii II Региональная конференция по актуальным проблемам морской биологии, экологии и биотехнологии. - Владивосток: Изд-во ДВГУ. 2000. С. 56-57.

3. Kungurtzeva L. A., Dautov S. S. Ultrastructure of digestive tract in the ophiopluteus of Ophiura sarsi II Invertebrate Reproduction and Development. 2001. V. 39, № 3. P. 209-220.

4. Kungurtzeva L. A., Dautov S. S. From blastula to ophiopluteus: an ultrastructural study of cell fate during larval development of ophiuroid Amphipholis kochii II V International Larval Biology Meeting - Vigo, Spain: Universidade de Vigo. 2002. P. 37.

5. Кунгурцева Л. А., Даутов С. Ш. Электронно-микроскопическое исследование личиночного развития офиуры Amphipholis kochii II Конференция НОЦ ДВГУ "Фундаментальные исследования морской биоты". - Владивосток: Изд-во ДВГУ. 2002. С. 40.

* Кунгурцева - девичья фамилия автора.

ГЛИЗНУЦА Любовь Александровна

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА КЛЕТОК В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ, ЛИЧИНОЧНОМ РАЗВИТИИ И МЕТАМОРФОЗЕ ОФИУТЫАМРШРНОЬККОСНПИ МОРСКОГО ЕЖА SCAPHECHINUS MIRABILIS Автореферат

Лицензия ПЛД № 63-19 от 02.12.1999г. Зак. №1173 Формат 60x84 1/16. Усл. п. л. 1,0 Тираж 100 экз. Подписано в печать 23.11.2004г. Печать офсетная с оригинала заказчика.

Отпечатано в типографии ОАО «Дальприбор». 690105, г. Владивосток, ул. Бородинская, 46/50, тел. 32-70-49 (32-44)

«2474 3