Деструкция цианидов и тиоцианатов ассоциацией гетеротрофных бактерий и ее применение в биотехнологии

Григорьева, Надежда Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Деструкция цианидов и тиоцианатов ассоциацией гетеротрофных бактерий и ее применение в биотехнологии
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Деструкция цианидов и тиоцианатов ассоциацией гетеротрофных бактерий и ее применение в биотехнологии"

На правах рукописи

Григорьева Надежда Викторовна

Деструкция цианидов и тиоцианатов ассоциацией гетеротрофных бактерий и ее применение в биотехнологии.

Специальность 03.00.07 - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный руководитель:

чл.-корр. РАН Карав айко Г.И.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Ивановский Р.Н.

доктор биологических наук Сорокин Д.Ю.

Ведущая организация

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Защита диссертации состоится февраля 2006 года в часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологи РАН по адресу: 117312, г. Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН

Автореферат разослан декабря 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук ЬЩ/ог^Се/гп^^ Никитин Л.Е.

ЯООСА

VtlT

Актуальность проблемы.

Цианиды - это высокотоксичные соединения, которые встречаются в природе, где образуются цианогенными бактериями, грибами, растениями, а также в зонах антропогенного загрязнения. Их применение в промышленности основано на способности растворять в присутствии кислорода золото, серебро, а также цветные металлы Ежегодно в промышленности используется до 3 млн.т. цианидов. Тиоцианаты в природе, в основном, образуются в результате взаимодействия цианида с серными соединениями. В промышленных производствах он также образуется из цианидов при взаимодействии с различными формами серы (полисульфиды, политионаты), а также с сульфидными минералами в золото-извлекательных процессах.

Проблема обезвреживания цианид- и тиоцианат- содержащих стоков промышленных предприятий стоит очень остро. В настоящее время промышленные стоки обезвреживают несколькими способами, основным из них является химический. Наиболее распространенными являются - щелочное хлорирование и окисление сернистым ангидридом в присутствии катализатора (сульфат меди). Оба эти способа имеют свои существенные недостатки, а именно, щелочное хлорирование оставляет после себя высокие концентрации хлора (до 300 мг/л) и хлорорганические соединения. Метод с применением сернистого ангидрида не обеспечивает снижения концентрации цианида до ПДК (0.05 мг/л) и не обезвреживает тиоцианат.

Перспективными экономичными и экологически чистыми являются микробиологические способы детоксикации цианид- и тиоцианат- содержащих стоков Известен целый ряд микроорганизмов, способных к деструкции цианидов — это отдельные представители родов бактерий: Pseudomonas, Escherichia, Alcaligenes, Arthrobacter, Acinetobacter, Klebsiella, Bacillus, Nocardia; а также грибов: Stemphylium, Gliocladium, Trichoderma, Fusarium, Aspergillus, Gloeocercospora, Neurospora, Leptosphaeria Микроорганизмов, способных к деструкции тиоцианата в настоящее время известно значительно меньше - это представители родов: Thiobacillus, Paracoccus, Halomortas, Thtoalkalivibrio, Pseudomonas, Arthrobacter, Methylobacterium, Neisseria. Первая промышленная установка по биодеградации цианидов и тиоцианатов была создана в США (заводв Хоумстейк). Стоки, которые обезвреживали, используя штамм P. paucimobilis, и нитрифицирующие бактерии в составе активного ила, содержали до 11.5 мг/л цианидов и до 110 мг/л тиоцианатов. При попытке использовать данный консорциум бактерий для обезвреживания высоких концентраций CN (100 мг/л) оказалось, что степень обезвреживания цианида была низкой - около 43 %.

Основным ограничительным фактором для микробиологических способе® является концентрация цианида в среде и рН. В диапазоне рН, наиболее благоприятном для роста большинства известных в настоящее время микроорганизмов-деструкторов CN" (рН 7-8), цианид присутствует в форме HCN, и возможны его потери в ходе деструкции (переход в воздушную фазу). Поэтому возникла потребность комбинировать химические и микробиологические способы Данные технологии отражены в виде патентов (Castaldi et al., 1988; Ишмахумедов и др., 1988; Akifiisa et all., 1988). Однако, недостатками этих методов, являются высокая энергоемкость, токсичность и низкая эффективность. Существенным ограничительным фактором детоксикации цианидов и тиоцианатов в больших концентрациях при их совместном присутствии, является отсутствие микроорганизме®, способных к деструкции обоих соединений. Поэтому, актуальным было выделить микроорганизмы, способные деструюироватъ CN" и SCN" при высокой их концентрации, изучить механизмы и кинетику их микробной деструкции, а также разработать способ обезвреживания цианида и тиоцианата с использованием выделенных микроорганизмов.

1'ОС. НАЦИОНАЛЬНА». БИБЛИОТЕКА |

Цель и задачи исследования. Целью работы было исследовать возможность деструкции цианидов и тиоцианатов при их высоких концентрациях и совместном присутствии в различных средах (растворах и плотных пульпах) с применением микроорганизмов.

Задачи исследования включали:

1) выделить и изучить ассоциацию микроорганизмов, способную к деструкции как цианидов, так и тиоцианатов при высоких концентрациях и их совместном присутствии;

2) определить параметры деструкции цианидов и тиоцианатов выделенной ассоциацией микроорганизмов;

3) исследовать механизмы деструкции цианида и тиоцианата выделенными микроорганизмами;

4) разработать способ деструкции цианидов и тиоцианатов при различных их концентрациях с использованием выделенной ассоциацией микоорганизмов.

Научная новизна и практическая значимость. Из зон антропогенного загрязнения почвы и промышленных стоков золото извлекательной фабрики впервые выделена и изучена ассоциация гетеротрофных бактерий, включающая штаммы P.stutzeri шт. 18 и P.putida шт. 21, растущих при концентрациях цианида до 70 мг/л и тиоцианата до 6 г/л Выделенные штаммы обладали цианидремстентным дыханием, использовали CN" в качестве источника азота, a SCN" - в качестве источника азота и серы В составе ассоциации штаммы дополняли друг друга: при росте на цианиде более активным являлся штамм 21 (P.putida), при росте на тиоцианате - штамм 18 (Р. stutzen).

Изучен механизм деструкции цианида и тиоцианата штаммами Р stutzen шт. 18 и Р putida шт 21. Показано, что они мегаболиэируются до аммония и углекислоты Серная часть тиоцианата окисляется до тиосульфата обоими штаммами, в случае Р putida конечными продуктами деструкции также являются тетратионат и тригионат. Были определены активности ферментов, участвующих в метаболизме тиоцианата, таких как цианаза, родо-наза, тиосульфатдегидрогеназа, тиосульфатредуктаза. Более высокая активность цианазы (ключевого фермента метаболизма SCN") обнаружена у P.stutzeri (1 26 мкмоль/мин на мг белка). Активности ферментов серного метаболизма близки у обоих штаммов, за исключением активности тиосульфат окисляющего фермента, которая в 4.5 раза выше у P.putida Различная метаболическая активность аборигенных штаммов P.stutzeri и P.putida обеспечивала высокую эффективность ассоциации этих бактерий в деструкции CN" и SCN" при их совместном присутствии и высоких концентрациях.

Показано отличие выделенных штаммов от типовых штаммов данных видов на физиологическом, биохимическом и генетическом уровнях, что говорит о наличии мутационных изменений у выделенных штаммов, которые могли произойти под воздействием антропогенного загрязнения среды.

Впервые дана оценка химической и микробной деструкции CN". Показано, что при аэрации среды воздухом CN" практически полностью улетает в виде HCN, независимо от pH среды. При механическом перемешивании улетает от 0 до 90% в зависимости от скорости оборотов мешалки и объема среды. Выяснены параметры деструкции CN~ выделенной микробной ассоциацией - pH 9 2-9 4, концентрация CN" - около 30 мг/л

Разработана и испытана схема бактериально-химической деструкции цианида и тиоцианата- 1 стадия - химическая, заключающаяся в обработке метабисульфитом Na в присутствии катализатора (сульфата меди), с целью снижения концентрации CN' до приемлемых для бактериальной деструкции значений; 2 стадия - микробиологическая, заключающаяся в обработке ассоциацией штаммов Р. stutzeri шт. 18 и Р putida шт. 21 в присутствии фосфатов и источника углерода В ходе деструкции CN" и SCN" их концентрация снижается до ПДК (0 05 мг/л) Способ испытан в лабораторных условиях в Институте микробиологии им С Н Виноградскош РАН и на Олимпиадинжой золотоизвлекательной фабрике (ЗИФ) и является пригодным для реализации в ряде промышленных технологий

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конкурсе научно-исследовательских работ ИНМИ РАН 2001г и 2005г, семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2003» (Пущино 2003), 3-м Междугородном Конгрессе «Биотехнология, состояние и перспективы развития» (Москва, 2005).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 3 статьи, 3 тезисов, получено 2 патента, 1 статья сдана в печать.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 159 страницах машинописного текста и включают 51 рисунок и 33 таблицы. Диссертация состоит из разделав: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть» (включающая главы «Материалы и методы исследования» и «Результаты и обсуждение»), «Заключение», «Выводы» и «Список литературы«, который содержит 15 отечественных и 112 иностранных наименований.

Благодарности Автор выражает глубокую признательность к т.н Савари Е.Е., д.т.н. Седелышковой Г В (ЦНИГРИ), д.б.н. Кондратьеве® Т.Ф., к б.н Красильниковой Е Н (МГУ, кафедра микробиологии), к б н. Лысенко А.М., к б.н Туровой Т П за помощь на определенных этапах работы. Работа выполнена при поддержке гранта ГН'Ш №43.073 1.1 2515.

Объекты и методы исследования.

Образцы для выделения микроорганизмов. Образцы почв, загрязненных ксенобиотиками (полихлорбифенилы), обрабатывали 0,01% раствором KCN и инкубировали в течение недели Образцы промышленных сточных вод были взяты из хвостохранилшца золо-тоизвлекательной фабрики в Восточной Сибири, образцы ила - из содового озера Забайкалья.

Штаммы бактерий. Чистые культуры цианрезистентных штаммов, способных использовать цианиды и тиоцианаты в качестве источника азота получали путем рассева накопительных культур на агаризованные синтетические среды, содержащие в качестве источника азота только CN" и SCN" Предварительные исследования позволили отнести их к р Pseudomonas, поэтому для сравнения физиологических, биохимических и генетических особенностей данных штаммов были взяты топовые штаммы P.putida В КМ В-2187 (АТСС 12633), Р stützen - ВКМ В-975 (АТСС 17588), P. Jluorescens ВКМ В-894 (АТСС 13525), Р merJocim ВКМ В-972 (АТСС 25411), полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов

Среды и условия культивирования. Для выделения, адаптации и культивирования бактерий, способных расти в присутствии CN" и SCN" использовали среду №1 (г/л) К4НРО4 ЗН20 - 3 0, MgS04 7Н20- 0 5, Na2HC03 - 0 3, FeCl3 - 0 01, СаС12 6Н20 - 0.01, (NaSCN и KCN вносили дополнительно в различных концентрациях - 0-6 0 г/л и 0-70 мг/л соответственно), pH 9 0-9,2 В качестве источника углерода использовали сахарозу, лактат или этанол в концентрации 1-2% в зависимости от задач эксперимента Для выделения и культивирования апкалофильных бактерий использовали синтетическую среду (Sorokin et al., 2001) (г/л)- Na2C03 • 10Н20 - 21 0, NaHCCb - 9 0, NaCl - 5 0, MgCl2' 6H20 - 0 3, NaSCN -0 5, КгНГО4 »ЗНгО-0 5, KCN-001, лактат калия-2.0, Н2О-1 л,рН 10.2

Метилотрофные бактерии выращивали на модифицированной среде Хирша следующего состава (г/л): КН2Р04 - 1 36; Na2HP04 • 12Н20 - 3 3, NaSCN - 1 О, KCN - 0.01, метанол -1 0%, Н20 дисгилированная - 1л, раствор микроэлементов -1 мл, pH 8 0.

Тионовые бактерии культивировали на среде Баалсруда (г/л) Ыа^гОз • 5Н20 - 5 0, KNO3 -2.0, NH4CI - 0 5, NaHCO, - 1.0, MgCl2 • 6Н2О - 0 5, КЩРО4 - 2 0, FeSO, - 0.01, Н20 -1 л, pH 7.0. Способность тионовых бактерий использовать тиоцианат проверяли на среде того же состава с добавлением NaSCN (0 5 г/л)

Определение промежуточных и конечных продуктов деструкции тиоцианата а также скорости процесса его деструкции проводили на синтетической среде №1, не содержащей сульфатов, следующего состава (г/л) К2НР04 • ЗН20, - 3 0, NaHCOj - 0 5, MgCI2 • 6Н20 - 0 3, FeCI2 - 0 01, СаС12* 6Н20 - 0 01, Н20 дистилированная - 1 л, где к минеральной основе добавляли тиоцианат в различной концентрации: NaSCN- - 0 3 - 6 0 г/л и этанол - 0 5 - 2 %, pH 8.8.

Бактерии культивировали на жидких средах в колбах Эрленмейера объемом 250 мл со 100 мл среды на качалке при 160 об/мин и при температуре 28°С

При исследовании роста бактерий или активности ферментов серного метаболизма у штаммов ассоциации на среде с различными источниками серы, в случае использования элементной серы (S0 - 10 г/л), тиосульфата (0 5 г/л) или сульфата (0 5 г/л), в качестве источника азота использовали NH4CI (1 г/л)

При определении активности ферментов серного метаболизма и активности цианазы у типовых штаммов использовали для роста в качестве источника азота - NH4CI (1 г/л) и MgSC>4 7Н20(0.5 г/л) в качестве источника магния и серы

При изучении активности фермента цианазы у P. putida шт 21 и P. stutzeri шт. 18 культуры выращивали на среде № 1 с SCN" или NH4+ в качестве источника азота до конца экспоненциальной фазы роста и затем биомассу собирали центрифугированием при 8 ООО g при 4°С, разрушали с помощью лизоцима и ультразвука и использовали для определения ферментативной активности Изучение деструкции CN" и SCN" в пульпе и промышленных растворах ассоциацией гетеротрофных бактерий проводили в реакторах объемом 3 л, при деструкции цианида - с механическим перемешиванием (150 об/мин), температуре 25-28°С, pH 9 2-9 4, при деструкции тиоцианата - с механическим перемешиванием (300 об/мин), продуванием воздухом (0,6 л/мин), температуре 30-34°С, pH 8 8-9.0. Деструкция в проточных условиях проходила в цепи соединенных друг с другом каскадом 5 реакторов объемом Зл каждый. Аналитические методы. О росте бактерий судили по величине оптической плотности, которую измеряли на фотокалориметре КФК-3 (Россия) при X - 540 нм, также методом прямого подсчета клеток под микроскопом. ЛОМАМ И-1.

Содержание микробного белка в культуральной жидкости определяли по методу Лоури (Lowry, 1951). CN-резистентносгь дыхания отобранных устойчивых к CN-иояу культур оценивали манометрическим методом в аппарате Варбурга

Концентрацию цианид-иона в пульпе определяли титрованием с азотнокислым серебром (Гамильтон, 1932), а в растворах- с помощью кристаллического ионселективногоалеетро-да КРИТУР, тип 06-27, на иономере И - 130 (Россия) SCN" определяли титрованием с KMnOt (5 N) (Гамильтон, 1932) или анализировали колориметрически как ферроцианат (Sörbo, 1957). Величину pH определяли на иономере И-130.2М.1. Сульфит анализировали колориметрически как сульфит-фуксин комплекс (Denger at al., 2001) Тритионат, тетратионат, тиосульфат определяли методом цианолиза (Kelly, 1969). Сульфат определяли на жидкостном хроматографе Biotronik LC 500. Сульфид определяли после осаждения как ZnS (Trüper & Schlegel, 1964) Содержание NH4 определяли фенол-гипохлоридным колориметрическим методом (Weatíierburn, 1967). Цианат ион определяли как NH4 после подкисления раствора до pH 2-3 6 N HCl Этанол определяли на газожидкостном хроматографе М - 3700. Цианазную активность определяли в бесклеточных экстрактах по скорости образования аммония фенол-гипохлоридным колориметрическим методом (Weatherburn, 1967) с использованием фотокалориметра КФК-3 (Россия). Активности ферментов серного метаболизма определяли спектрофотометрическим или колориметрическим методами на спектрофотометре "Hitachi 200-20" (Япония), как описано ниже.

Сульфитдегидрогеназу (сульфит- цитохром с оксидоредукгаза, КФ 1 8.2 1) и тиосуяьфат-дегидрогеназу (КФ 1 82 2) измеряли по восстановлению феррицианида при 420 нм или цитохрома с при 550 нм в при<утствии сульфита или тиосульфата (Key J.O, Suzuki I,

1977). Аденилсульфатредуктазу (АФС-редукгазу, КФ 1 8 99 2) определяли по восстановлению феррцианида в присутствии сульфита и АМФ (Lyric R.M., Suzuki 1,1970). Роданазу (тиосульфат: цианидсульфо-трансфераза, КФ 1.8.1.1) измеряли по скорости образования тиоцианата из тиосульфата и цианида (Key J.О., Suzuki I., 1977). Серооксигеназу (серо-окисляющий фермент или сера: диоксигеназа, КФ 1.13.11 18) определяли по образованию тиосульфата из серы в присутствии восстановленного глуташона и 2J.- дипиридина (Suzuki I., Silver М, 1966). Активность тиосульфатредуктазы измерял! по образованию сероводорода из тиосульфата в присутствии восстановленного глутатиона и дитиотриэтота ЩетушкогаЮ.П, Ивановский Р.Н., 1976) Структуру хромосомной ДНК выделенных и типовых штаммов изучали методом пульс-электрофореза (ПФ) фрагментов, полученных при расщеплении нативной ДНК эндонуклеазой рестрикции Хва I. Методы выделения на-тивной ДНК, ее расщепления, а также условия ПФ были аналогичны описанным для гра-мотрицательной ацидофильной хемолитоавтотрофной баилерияАсгЛМоЬасШге ferrooxi-dans, содержащей в ДНК как и у Pseudomonas более 50 мол % G + С (Kondratyeva et al, 1995) Электрофорез в денатурирующем геле (SDS-PAGE) препаратов полипептадов из целых клеток проводили с использованием 10% геля (Laemmli, 1970). Морфологию и ультраструктуру клеток изучали методами световой фазово-контрасгпой и электронной (JEOL JEM-100 СХ П) микроскопии.

Дифференцирующие морфологические и физиологические признаки определяли по общепринятым методам (Берджи, 1997).

Анализ ДНК ДНК из клеток экстрагировали и очищали общепринятым методом (Маптщг, 1961). Определение нуклеощдного состава проводили методом комической денатурации, а уровня гомологии в ДНК - методом оптической реассоциации по Де Лею (De Ley etal, 1970) Для проведения ДНК-ДНК-пибрвдгаации в качестве реперных штаммов были взяты типовые пггаммы: Р fluorescent ВКМ В-894 (АТСС13525), P. mendocina ВКМ В-972 (АТСС 25411), P. stutzeri ВКМ В-975 (АТСС 17588), а также штамм P. putida ВКМВ-2187 (АТСС 12633),по-лученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Снквенс нуклеапвдных посвдовягельносгей гена 16S рРНК. Амплификацию и секвениро-вание гена 16S рРНК проводили с использованием универсальных для прокариот праймеров (Edwards etal, 1989). Для амплификации использовали буфер: 1.5 MMMgCl2,50 mMKCI, ЮмМ mpuc-HCl, pH 8 3 и 0.001% желатина Реакционные смеси имели объем 100 мкл и содержали стандартные концентрации dNTP и эквимолярные количества праймеров рА и pH' Проводили 30 циклов амплификации следующего температурного профиля- денатурация ДНК при 94°С 30 с, отжиг праймеров при 40°С 1 мин и элонгация при 72"С 2 мин 30 с. После очистки на легкоплавкой агароэе полученный фрагмент гена 16S рРНК секвенировали на автоматическом секвенаторе DNA Sequencer 373А с помощью набора ("Applied Biosystems", № 402080, Ready Reaction Dye Terminator Sequencing kit with AmpliTaq DNA Poly-merase, FS).

Анализ последовательностей нуклеотидов гена 16S рРНК.

Последовательность нуклеотидов гена 16S рРНК штамма 18 была выровнена вручную с соответствующими последовательностями группы видов рода Pseudomonas, доступными из последней версии базы данных RNA Database Project После исключения из анализа позиций выравнивания сравниваемых последовательностей, доя которых не все нуклеоти-ды были определены, сравнивали 1289 нуклеотидов Построение укорененных филогенетических деревьев исследуемых бактерий с использованием Escherichia coli в качестве внешней группы производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON (Van de Peer & Wächter, 1994)

Результаты и обсуждение.

Скрининг я изучение микроорганизмов, деструктирующих цианиде! и тиоцианаты.

Многочисленными исследователями показано, что широкий спектр аэробных микроорганизмов (автотрофные и гетеротрофные бактерии, микроскопические грибы) проявляют активность в деструкции цианидов и их соединений (Castric, 1975; Dubey a Holmes, 1995; Pereiraetal 1996; Watanabeetal.,1998; Luque-Almagro et al, 2005) Имеются также сведения об анаэробной деструкции CN" (Fallon et al, 1991) Однако роль анаэробов в этом процессе изучена слабо Данных о микроорганизмах, способных к деструкции SCN" мало (Happold et al, 1954; Kim S.J and Y Katayama, 2000; Sorokm, 2001; Sorokin, 2004) Поскольку конечной целью нашей работы было изучить возможности использования микроорганизмов в реальной технологии очистки промышленных стоков от CN" и SCN" при высоких их концентрациях, мы пошли не по пути использования известных штаммов и их адаптации к этим токсикантам, а по пути поиска активных и устойчивых штаммов в природе в зонах антропогенного загрязнения Из образцов почв, загрязненных хлорзамешриными бифенилами, обработанных раствором цианида (0,01%), образцов стоков хвостохранилшца золотеюбогатительной фабрики, ила содового озера на синтетической среде было выделено 100 штамме». Поскольку из литературных источников было известно, что микроорганизмы способны выживать при концентрации 500 мг/л CN" (19 мМ), то скрининг культур, способных к деструкции CN" и SCN" проводили в несколько этапов. Сначала отбирали штаммы, использующие либо цианид (KCN - 100-500 мг/л), либо тиоцианат (NaSCN - 1,0 г/л) в качестве источника азота на агаризованных средах при рН 8,8. Также была сделана попытка выделить микроорганизмы, использующие углерод и азот тиоцианата В результате скрининга на агаризованных средах было отобрано 46 штаммов бактерий, способных использовать CN" и SCN" в качестве источника азота Бактерий, использующих углерод данных соединений, обнаружить не удалось.

Затем была изучена способность у отобранных штаммов к деструкции SCN" (476 мг/л) в жидкой синтетической среде. У 20 штаммов скорость деструкции была в пределах 29.4 -68.0 мг/л/сутки В дальнейшем проводили скрининг штаммов по ингибировакию дыхания цианидом (66 мг/л) с помощью манометрического метода.

В результате этого было отобрано 7 штаммов, обладающих дыханием, резистентным к цианиду (66 мг/л).

В дальнейшем для отбора наиболее активных в деструкции CN" штаммов была использована смешанная культура из отобранных штаммов Адаптацию смешанной культуры начали с концентрации CN" 10 мг/л В последующих опытах концентрацию CN" увеличивали постепенно К каждой концентрации культуру адаптировали в течение 2-х недель (2-3 пересева) Активность деструкции смешанной культуры бактерий с каждым последующим пересевом увеличивалась и достигла 35 мг/л сутки CN" Дальнейшее повышение концентрации цианида не проводили из-за его летучести в условиях эксперимента (рН 9 2-9 4). Одновременное» скринингом и адаптацией ассоциации бактерий к цианиду, проводили изучение роли ассоциации в окислении тиоцигната Следует обратить внимание на то, что деструкцию тиоцианата мы проводили при рН 8 8, т е при более низком, чем с CN", и оптимальном для роста бактерий Количество потребляемого бактериями тиоцианата находилось в прямой зависимости от источника углерода Для исследования параметров деструкции важным было подобрать источник углерода, обеспечивающий максимальную скорость деструкции тиоцианата. Была использована среда № 1 с NaSCN (0,5 г SCN") В качестве источников углерода использовали: 1 - сахарозу; 2 - лактат Na; 3 - глюкозу; 5 - глицерин; 6 - цитрат Na В вариант среды - 4 органические вещества не добавляли. Опыты проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, в которые добавляли по 100 мл питательной среды, содержащей 476,2 мг/л SCN" и источник углерода (2%) Колбы инкубировали на качалке при температуре 28-30°С. Результаты экспериментов предсталены на рисунках 1 и 2

Рис 1. Деструкция тиоцианата ассоциацией гетеротрофных бактерий на синтетической среде №1 с различными источниками углерода: 1 - сахароза; 2 - лактат; 3 — глюкоза; 4 -без источника углерода; 5 - глицерин; 6 - цитрат.

Рис 2 Рост ассоциации гетеротрофных бактерий на синтетической среде №1 с SOT (476 мг/л) и различными источниками углерода' 1 - сахароза; 2 - лактаг; 3 - глюкоза; 5 - глицерин; 6 - цитрат.

Видно, что без органического вещества (вариант 4) бактерии не использовали SCN" (рис 1). Наиболее активно тиоцианат деструктировался в присутствии лакгата (вариагг 2) и цитрата (вариант 6) Полная его деструкция была достигнута за 2 суток В этих вариантах наблюдался и наиболее активный рост бактерий о чем судили по оптической плотности среды (рис. 2)

Таким образом, была выделена ассоциация гетеротрофных бактерий, способная к деструкции CN" и SCN" ионов в концентрациях 70 и 500 мг/л соответственно.

Характеристика штаммов, входящих в состав ассоциации гетеротрофных бактерий, деструктнрующсй цианиды я тиоциаяаты.

Ассоциация гетеротрофных бактерий, полученная в результате адаптации смешанной культуры к возрастающим концентрациям цианида и тиоцианата, состояла из нескольких типов клеток, удельное содержание которых в культуре менялось при переносе со среды с цианидом на среду с тиоцианатом. На среде с цианидом преобладали мелкие подвижные палочки (2-3 х 0 4-0 7 мкм), было много подвижных палочек длиной 3-4 мкм, встречались неподвижные палочки толщиной 1 мкм и длиной 3-4 мкм, а также длинные тонкие палочки (0 5х 5 мкм) На среде с тиоцианатом было меньше мелких палочек, преобладали подвижные и неподвижные палочки, средней величины - толщиной 1 мкм и длиной 4-5 мкм В значительно большем количестве, чем на среде с цианидом, присутствовали толстые короткие палочки, образующие слизистые конгломераты.

При пересеве культуры со среды с тиоцианатом на среду с цианидом количественные соотношения в популяции менялись, но при этом сохранялось постоянство видового состава Постоянство видового состава подтверждали как микроскопически, так и путем высева на агаризованные среда

Таким образом, полученная ассоциация штаммов сохранялась при различных условиях, в том числе и не стерильных, когда деструкция цианида и тиоцианата проходила в реакторах на технологических растворах или пульпах Рассев культуры на агаризованной среде №1 подтвердил микроскопические данные, т.к. было получено 3 типа колоний, которые соответствовали 3 типам культур Выделенным штаммам были присвоены номера 5, 18, 21.

Штаммы, входящие в ассоциацию гетеротрофных бактерий, различались активностью деструкции CN" и SCN~ в чисшх культурах. Штамм 21 активнее десгруктровал CN" (0.8-1.0 мг/л/ч), чем штамм 18 (0 6-0 7 мг/л/ч). Штамм 5 был малоактивен по отношению к CN" и поэтому исключен из дальнейшей работы.

На основании сравнения морфолого-культуральных, физиолого-биохимических и молекулярных признаков штамм 21 отнесен к виду Pseudomonas puhda, а штамм 18 отнесен к виду Pseudomonas stutzen.

В отличие от типового штамма, штамм 21 не образовывал флуоресцирующего пигмента, был не способен к гидролизу желатины, оба штамма (птг.18 и шт 21), в отличие от типовых были способны к деструкции CN- и SCN-ионов.

Также были обнаружены различия между типовыми (Рpulida ВКМ В-2187 и Р stutzen ВКМ В-975) и выделенными штаммами в структуре хромосомной ДНК, они отличались локализацией сайтов Хва I рестрикции хромосомной ДНК (выявлено методом пульсэлектрофоре-за) Различия в наборе и размере фрагментов, образующихся при расщеплении нативной ДНК, свидетельствуют об изменениях в последовательности нуклеотидов в хромосомной ДНК в процессе штаммовой микроэволюции (таблица 1,2; рис.3,4)

Таблица 1 Размеры Хва I фрагментов хромосомной ДНК штаммов Р pulida В-2187 и 21 Длина фрагментов представлена в тысячах пар нуклеотидов (т п н) с точностью до 4 т п.н

Штамм 21 Штамм В-2187

327 327

- 301

265 265

226 -

- 211

- 200

190 190

180 180

- 167

Примечание: «-» - фрагмент отсутствует.

Таблица 2 . Размеры Хва I фрагментов хромосомной ДНК штаммов /'.уГийт В-975 и 18. Длина фрагментов представлена в тысячах пар нуклеотидов (т п н.) с точностью до 4 т п.н

Штамм 18 Штамм В-975

310 310

- 276

- 235

208 -

200 200

177 177

167 -

148 148

133 -

I 122

Примечание- «-» - фрагмент отсутствует.

Рис 3. Образцы рестрикции Хва I мосомной ДНК штаммов 21 (дорожка 1), ВКМ В-2187 (дорожки 2 и 3) ВКМ В-458 (дорожка 4).

Рис 4 Образцы рестрикцииЛ'ва / хро-хромосомной ДНК штаммов ВКМ В-458 (дорожка 1), 18(дорожка2иЗ)иВ-975 (дорожка4).

На основании совокупности полученных данных штамм 5 был идентифицирован до рода и отнесен к роду Pseudomonas Поскольку этот штамм не представлял для целей работы большого интереса (был малоактивен в отношении деструкции цианидов), то его идентификацию до вида не проводила

Таким образом, проведенные исследования показали наличие в экотопах, загрязненных цианидами, тиоцианатами и хлорзамещенными бифенилами, бактерий, деструктирую-щих CN" и SCN" при их высоких концентрациях. Наиболее активные деструкторы CN" и SCNT принадлежали к роду Pseudomonas и видам Р pulida и Rstutzeri

Кинетические параметры роста штаммов и деструкции CN' и SCN".

1. Немикробиологичесюе удаление CN' (улетучивание из среды).

Основной сложностью в работе с цианидами являются их высокая летучесть в диапазоне pH, наиболее благоприятном для роста большинства микроорганизмов-деструкторов CN" (pH 7.0-8.0) (рис 5), т к. 96-99% цианидов при данных pH находятся в форме HCN, температура кипения которой составляет 25.7°С (Smitt et al., 1991). Поскольку многие авторы использовали в своих работах по микробной деструкции цианидов аэрацию среды или активное ее перемешивание, а также часто в качестве источника углерода - глюкозу, которая относится к редуцирующим сахарам, то можно утверждать, что большинство авторов имело дело не с исходной концентрацией CN" в среде, а с более низкой, различной в зависимости от условий культивирования Очевидно, эта концентрация не могла превышать 10 мг/л в растворе при pH 7 - 8 даже в статических условиях Однако авторы сообщали об использовании 200 и более мг/л CN" (Babu et al.,1993; White et all ,1988)

7,0 8,0 9,0 9,4 10,0 11,0 РН

ннсм исм

Рис 5 Содержание СЫ" и НСИ зависимости от рН среды (%)

Нами изучена деструкция ОТ в реальных условиях проведения экспериментов с микроорганизмами Определение величины потери СЫ" за счет улетучивания проводили в колбах Эрленмейера объемом 100 мл, содержащих 50 мл раствора в статических условиях, при перемешивании на магнитной мешалке (800 об/мин) или при продувании воздухом (300 мл/мин) при температуре 22-25°С О степени улетучивания цианида судили, анализируя щелочные вытяжки Результаты анализов представлены на рисунке 6

90 80 « 70 * «« " 50 : 40 % 30 20 10 0 1Ш 04 0,6 1,0 3,0 чм 24.0

1ааэр*ФМ1о»ду«ш Кпермеиммм остячки* уелмш)

100

И во * 70 1 I " 8 эо 20 10 О _ ш в * — В 1 * В | | 0,4 0,9 1,0 3.0 24.0 чае

в ■•раит аоадухои ■ трсысшмани* □статичаещм уелми*

б г

Рис 6. Влияние способа перемешивания цианистых растворов на улетучивание цианида из среды С№ а - при 53 мг/л (рН 8.7), б - 64 мг/л (рН 9.0), в - 74 мг/л (рН 9.3), г - 85 мг/л (рН 10 0)

Видно, что цианиды наиболее активно улетучивались из среды при продувании ее воздухом (потери до 95% от исходной концентрации), затем при перемешивании на магнитной мешалке (потери до 57%) и с наименьшей интенсивностью - в статических условиях (потери 56%) при минимальном значении рН - 8.7.

Таким образом, мы выяснили, что проводить бактериальную деструкцию ОТ при аэрации среды барбатированием недопустимо независимо от начальной концентрации СМ" в среде и ее рН. Потери цианида при механическом перемешивании и стационарных условиях эксперимента были сопоставимы, однако дня целей работы предпочтительнее было вести процесс при перемешивании среды. С этой целью в следующем опыте был подобран оптимальный режим перемешивания среды.

Опыты по улетучиванию СТ4* в отсутствие бактерий проводили в реакторе с механическим перемешиванием в условиях, которые в дальнейшем использовались для испытания бактериальной деструкции цианиде» Результаты представлены на рисунке 7

136 200 200(аэрация) 300

IWP«UMUHUHN«, об/мни

[в CN исходный, мг/л ■ убыль CN, % |

Рис. 7. Улетучивание цианидов в реакторе (объемом 2 л) в отсутствие бактерий при различных режимах перемешивания при рН 9.2 и темтературе 28 °С.

Как видно из данных представленных на рис. 7, в зависимости от скорости перемешивания и аэрации среды, процент CN", удаляемый из среды в отсутствии бактерий, может изменяться от 0 до 90%, а остаточный CN" может составлять от 5 до 34 мг/л. Основная часть CN" при этом протонируется и улетучивается в соответствии с известной реакцией:

ОГ + Н* = HCNT

2. Деструкция CK ассоциацией гетеротрофных бактерий, механизм процесса

Изучение микробной деструкции CN" проводили в периодической культуре в реакторе объемом 3 л со свободным доступом атмосферного воздуха, в который вносили 2 л среды, содержащей CN" (30 мг/л) и лактат калия (1.2 г/л). Исходный pH среды - 9.2 Температуру поддерживали 28°С при скорости мешалки 140 об/мин. Инокулят, содержащий ассоциацию гетеротрофных бактерий (Р. putida, Р stutzen), вносили в количестве 10 %. Результаты анализов представлены на рисунке 8. За первые 2 ч после внесения инокулята концентрация CN" снизилась с 30 до 24 мг/л за счет улетучивания HCN. В дальнейшем за 23 ч культивирования CN" был полностью деструктирован. При этом количество бактерий возросло в 10 раз (величина оптической плотности (ОП) шменилась с 0 075 до 0 72) Частично продолжалось, вероятно, и снижение CN" за счет улетучивания HCN, так как в процессе роста бактерий pH был снижен до 8.3.

Рис 8 Деструкция СЫ' ассоциацией гетеротрофных бактерий на синтетической среде с лактатом (максимальная удельная скорость роста - 0.12 ч ")• 1 - мг/л; 2 - клетки, ОП; 3 - над кривой, отражающей динамику рН, отложены значения рН.

Время полной деструкции цианида ассоциацией гетеротрофных бактерий зависело от исходного содержания цианида в растворе. Так полная деструкция цианида в опыте в периодической культуре в колбах Эленмейера произошла за 30 и 40 ч для начальной его концентрации 30 и 40 мг/л, соответственно (рис. 9)

час

Рис. 9 Рост ассоциации гетеротрофных бактерий на синтетической среде с лактатом и деструкция ОТ при его различной концентрации. Концентрации ОТ: 1 - 53 мг/л, 2-40 мг/л, 3 -30 мг/л Биомасса клеток (ОП) 4 - при исходном (Ж - 30 мг/л, 5 - при исходном С№ - 40 мг/л, 6 - при исходном ОТ - 53 мг/л

Максимальная начальная скорость деструкции составляла 2,0 мг/л/час. Также по мере увеличения концентрации цианида в среде снижалась максимальная удельная скорость роста бактерий с 0.07 ч"1 (30 мг/л ОТ) до 0 02 ч"1 (53 мг/л СК). Урожай клеток (конечная ОП) зависел от скорости роста и составлял 0,7 и 0,3 единиц ОП при 0.07 ч'1 и 0.02 ч соответственно

При изучении деструкции ОТ в пульпах оказалось, что существенным фактором является соотношение твердой и жидкой фазы среды (т ж) Оно влияло на скорость микробной деструксии СЫ", которая снижалась в плотной пульпе (т:ж=1:2) в 2 раза по сравнению с менее плотной пульпой (тж= 1:8-1:10) (рис. 10).

Рис 10. Деструкция цианида ассоциацией гетеротрофных бактерий в пульпе при различном соотношении твердой и жидкой фаз: 1 - тж =1' 10; 2 - т ж = 1' 8 (скорость деструкции -15 мг/л /сутки); 3 - т:ж = 1 ■ 2 (скорость деструкции - 8,3 мг/л сутки).

3 Деструкция ассоциацией гетеротрофных бактерий.

Поскольку целью нашей работы было исследовать деструкцию ОТ и ЭОГ в условиях, приближенных к промышленным, то мы исследовали деградацию токсикантов как в проточном режиме в растворах с использованием биореакторов, так и в плотных пульпах (в биореакторе с отливно-доливным режимом).

В непрерывных условиях рост бактерий и деструкция 5СЫ" проходили в последовательно соединенных 5-6 биореакторах объемом 3 л (объем среды 1.5 л). В 1-й реактор среда поступала ю емкости с исходной средой объемом 10 л при температуре 32-34°С, скорости перемешивания среды 300 об'мин, начальюм рН 9 2 и различной скорости протока. Все реакторы до начала эксперимента были заполнены средой, не содержащей источников углерода и азота. В опытах была использована синтетическая среда с МаБСЫ и лакгагом калия, который вносили порциями в каждый реактор в зависимости от скорости протока (один раз по 1 2 г/л при скорости протока 14 л/сут; два раза по 0 6 г при скоростях протока 1.8 или 2.2 л/сут и 4 раза по 0 3 г при скорости протока 3.7 л/сут) Подбирали режимы, которые позволяли проводить деструкцию высоких концентраций тиоциаката до ПДК(0.05 мг/л) при минимальном количестве задействованных биореакторов Опыты проводили в течение 3-х месяцев.

В типичном эксперименте было показано, что скорость деструкции тиоцианата зависит от его исходной концентрации, скорости протока, количества внесенного органического субстрата и биомассы бактерий (таблица 3).

Таблица 3 Режимы работы биореакгоров (время - 24 ч), в которых осуществлялась полная десгрукдая SCN" (на входе - 300 - 1000 мг/л, а на выходе - 0 05 мг/л) ассоциацией гетеротрофных бактерий.

№№ Скорость Концентрация Биомасса, Скорость де- Количество

режимов протока, SCN\ мг/л г/л струкции задействованных

л/сутки мг/л/час реакторов

1 1.4 1088 06 45.8 4

2 1.8 918 0.7 37.5 5

3 22 609 0.4 25.0 4

4 37 604 0.7 25.2 6

5 3.7 290 0.12 12.1 3

Скорость деструкции 8ОТ была максимальной при скорости протока 1.4 л/сутки и концентрации тиоцианата 1088 мг/л. При концентрации БОГ 609 мг/л и 604 мг/л скорость его деструкции была одинаковой при скорости протока 2 2 и 3 7 л/сутки (при большем количестве задействованных реакторов в последнем случае) При концентрации вСК 290 мг/л и скорости протока 3 7 л/сутки прирост биомассы бактерий и скорость деструкции тиоцианата были низкими.

Исследование процесса деструкции тиоцианата в пульпах (гж=12) проводили в отливно-доливном режиме (рис. 11).

час

Рис. 11 Деструкция тиоцианата в пульпе после цианирования золота ассоциацией гетеротрофных бактерий в отливно-доливном режиме (дробное добавление пульпы (100 мл/час) и этанола (2 г/л)) Биомасса-109 клеток/мл рН начальный- 9.0-9 2, рН конечный - 8.3-8 5. Стрелкой показан момент добавления пульпы и этанола. 1 - тиоцианат, г/л; 2 - этанол, г/л.

Как видно из рисунка в пульпе в отливно-доливном режиме скорость деструкгри тиоцианата достигала 240 мг/л/час

Деструкция ОЧ' и 8С!*Г при их совместном присутствии ассоциацией гетеротрофных бактерий.

В промышленных сточных водах цианиды и тиоцианаты присутствуют совместно, причем концентрация вСЫ" зачастую в десятки и сотни раз превышает концентрацию С№. Поэтому важно было получить ассоциацию гетеротрофных бактерий, активно десгруктирующую СЫ~ и вСК при их совместном присутствии

При изучении динамики деструкции ОТ и $ОГ ассоциацией гетеротрофных бактерий в периодической культуре на синтетической среде №1 с лактатом калия (4 г/л) в качестве источника углерода и энергии было показано, что вначале десгруктировался цианид и только после его разрушения начиналась активная деструкция 8СЪГ (рис 12) Аналогичные закономерности наблюдали на средах и пульпах с использованием других источников углерода (рис 13).

чм

Рис. 12. Деструкция ОТ и 5СЬГ ассоциацией гетеротрофных бактерий на синтетической среде с лактатом.

1 - ОТ, мг/л, 2 - БСЪГ мг/л

чае

Рис 13. Деструкция ОТ и ЯСЪГ в пульпе (тж=1:2)ассоциацией гетеротрофных бактерий в реакторе с механическим перемешиванием с использованием этанола (2%) в качестве источника углерода и энергии

Вероятными причинами столь ярко выраженной двухфазное™ процессов бактериальной деструкции ОТ и БОГ является то, что 1 - ОТ является более доступным источником азота, чем

тиоцианат (N^C-S") для бактерий ассоциации; 2 - возможно, что цианид ингибирует первичный фермент гидролиза SCN", который разрушает C-S связь.

Механизм деструкции CN" и SCN" ассоциацией штаммов P.stutzeri и Р putida.

Механизмы деструкции цианида достаточно хорошо известны Для псевдомонад было показано, что данный процесс осуществляется тремя ферментами' цианидоксигеназой (до CNO"), цианидциоксигеназой (до NH3 и С О2) и цианидазой (до NH3 и НСООН) (Dubey S.K. a. Holmes D.S. 1995).

В опытах с отмытой биомасоой как ассоциации, так и отдельных штаммов P. putida ыгг 21 и P.stutzeri шт. 18 было показано образована NH3, образование формиата при этом отсутствовало Таким образом, мы предположили следующий механизм деструкции CN"' CN" —> NH3 + СО2. Полученные нами данные согласовывались с полученными ранее. Механизм деструкции SCN" являлся менее изученным для гетеротрофных бактерий. Поэтому основное внимание в работе было уделено исследованию механизма деструкции именно этого токсиканта

Было показано, что деструкция SCN" не может осуществляться штаммами №21 и №18 в отсутствии органического источника углерода и энергии При культивировании P.stutzeri и Р putida на синтетической среде с тиоцианатом (в качестве источника азота) и этанолом (качестве источника углерода и энергии) в периодических условиях, минимальное молярное соотношение тиоцианаг/этанол было 1/3.4 и 1/5 соответственно. Согласно немногочисленным литературным данным, использование тноцианата гетеротрофными микроорганизмами (Р putida, P.fluorescent) сводится к использованию его как источника азота и идет по пути цианата (SCN" —» CNO" —> NH3) (Stafford J., et al, 1994; Murrell J.C., 1993) О характере окисления серной части SCN" сведения практически отсутствуют. Поэтому в дальнейшем был исследован механизм деструкции тиоцианата выделенными штаммами.

В ходе наших исследований в процессе роста культур не удалось обнаружить образование аммония или цианата В опытах с отмытой биомассой культур без источника углерода при внесении SCN" в буферной среде (рН 8.8) удалось зафиксировать у обоих штамме» образование NH/. Нами было сделано предположение, что в процессе деструкции тиоцианата образуется аммоний, который затем используется данными штаммами, как источник азота. Сам тиоцианат был, безусловно, более труднодоступным субстратом для бактерий, и присутствие в среде других альтернативных источников азота (NH3, NO3") ингиби-ровагго у штаммов процесс деструкции SCN".

Чтобы оценить возможные пути утилизации SCN" как источника азота была изучена циа-назная активность штаммов. Клетки выращивали на среде с тиоцианатом - 8,6 мМ (0,5 г/л) до конца экспоненциальной фазы роста Максимальная активность цианазы у штаммов 18 и 21 была получена при рН 8,1 (фосфатный буфер) - 0 75 и 1.26 мкмоль/ мин мг белка, соответственно, и зависела от концентрации НСО3" (Ks=2 мМ). При выращивании культуры на среде с аммонием в качестве источника азота, цианазная активность отсутствовала, что говорило об индуцибельности данного фермента у исследуемых штаммов. Электрофорез в денатурирующем геле общего белка из клеток, выращенных на среде с различными источниками азота (NlV, CNO", SOT), показал наличие специфических полос на среде с CNO' (26,5 kDa и 25 kDa) и с SCN" (22,2 kDa), которые коррелировали с присутствием цианазной и тиоцианатгидролизующей активностью штамма, что также косвенно может служить подтверждением цианатного пути деструкции SCN" Так, на среде с SCN" присутствовали полоски, соответствующие белкам 26,5 и 25 kDa, которые были характерны для белкового профиля клеток выращенных на среде с цианатом. Следовательно, можно полагать, что при деструкции SCN", в качестве промежуточного продукта образуется цианат (CNO"), который трансформируется до NKt+ и С02 с помощью цианазы.

В отличие от штаммов, выделенных нами в результате селекции, типовые штаммы (Р ¡1иЬег1 ВКМ В-975, Р риЫа ВКМ В-2187) были не способны к росту на среде с тио-цианатом и использованию его в качестве источника азота на синтетических средах с различными источниками углерода (глюкоза, лактат, этанол)

При исследовании деструкции серной части БОГ, сульфат не был обнаружен как возможный конечный продукт окисления тиоцианата. В экспоненциальной фазе роста у штамма 18 (рис 14) и штамма 21 (рис 15) происходило накопление тиосульфата

Рис 14 Деструкция тиоцианата Р хШгеп шт 18 с образованием тиосульфата

1 - вСЫ", мМ, 2 - 320з2', мМ, 3 - число клеток в мл

Рис. 15. Рост Р. риМа шт. 21 на синтетической среде с этанолом и тиоцианатом 10,3 мМ (600 мг/л) с образованием тиосульфата- 1 -БСЫ" мМ; 2 - вгОз . мМ; 3 - число клеток в мл

Тиосульфат, накопленный в экспоненциальной фазе роста Р putida, в стационарной фазе окислялся (рис 15) У Р stützen окисление тиосульфата в условиях эксперимента не происходило В качестве конечных продуктов окисления тиоцианата в конце стационарной фазы роста (48 час) у штамма Р putida в среде были обнаружены тетрагионат и тритионат (рис. 16).

* - 0,1

0,5

Рис. 16 Деструкция тио-цианата Р.рШи1а и накопление тиосульфата, тет-ратионата и тритионаггана синтетической среде с этанолом-

1 - тиоцианат, мМ,

3 -тетратионат, мМ

2 - тиосульфат, мМ;

4 - тритионат, мМ

0 10 20

30 40 50 60

час

В ходе деструкции тиоцианата штаммом Р. Stutzer i тетратионат и тритионат обнаружены не были

У штаммов ассоциациии P.putida шт21 и Р stutzeri шт. 18 была изучена также активность ферментов серного метаболизма, возможно принимающих участие в метаболизме тиоцианата. Ферменты определяли у штаммов, находящихся в конце экспоненциальной фазы роста, выращенных на синтетической среде с этанолом, где в качестве источников серы использовали различные соединения На среде с SO42", S° и без серы в качестве источника азота использовали NH4CI (в количестве, эквивалентом SCN" по азоту). На среде с SCN" никаких дополнительных источников азота и серы использовано не было.

При росте бактерий на среде с сульфатом были выявлены такие ферменты, участвующие в метаболизме неорганических соединений серы, как, сульфитдегидрогеназа, роданаза, тиосульфахдегцдрогеназа и тиосульф атредуктаза. Активность АФС-редуктазы ни в одном из вариантов опытов обнаружить не удалось. Наличие и активность того или иного фермента зависели от состава среды, на которой культивировались исследуемые штаммы На среде с тиоцианатам различия по активности роданазы, сульфитдегидрогеназы, сероокси-геназы между выделенными штаммами выявлены не были (таблица 4) Тиосульфатредук-таза не была обнаружена у обоих штаммов. Различия между Р stutzeri пгг 18 и Р.pulida шт 21 проявились по активности тиосульфатокисляющего фермента, которая была в 4,5 раз выше у P.putida

Тиосульфатредуктазу удалось обнаружить у штамма 18 Р. stutzeri при росте в периодических аэробных условиях на среде с элементной серой в качестве источника серы, где конечными продуктами ее утилизации были как тиосульфат, так и сульфид. Тиосульфато-кислякяций фермент в данных условиях обнаружить не удалось. В отсутствии каких либо источников серы тиосульфатдегидрогеназа и тиосульфатредуктаза у штамма не были обнаружены.

Таблица 4 Активность ферментов серного метаболизма у Р stutzen гат 18 и Р pulida шт 21 на синтетической среде с тиоцианатом и этанолом (pH 8 8)(нмоль/мин мг белка).

Ферменты Шт 18 Шт.21

Роданаза (КФ 1.8.1.1) 8.6 8.7

Тиосульфатдегидрогеназа (КФ 1.8.2.2) 13 60

Сульфитдегидрогеназа (КФ 1.8.2.1) 37.5 37.7

Серооксигеназа (КФ 1.13.11.18) 0.03 0.23

Таким образом, наблюдаются отличия в путях деструкции тиоцианата у выделенных штаммов ассоциации и изученных ранее бактерий. Сульфат в качестве конечного продукта деструкции SCN" штаммами Р stutzen (шт. 18) и Р.,pulida (шт.21) отсутствовал Наблюдались различия в серном метаболизме SCN" у данных штаммов. Тиосульфат был у Р.pulida шт 21 промежуточным продуктом деструкции SCN", а конечными - политионаты (тетратионат и тритионат). У Р stutzen тиосульфат был конечным продуктом деструкции SCN".

Полученные данные позволяют представить путь деструкции SOT изученными штаммами в следующем виде.

цианаза

SCN" + Н20 -» HS' + CNO" — NH3 + СОг (Р.stutzen щт. 18, Рpulida шт 21)

I .

S2O3 (Р.stutzen шт. 18, P.putida шт.21) J, тиосульфатдегидрогеназа S3062" <---S4062" (Р pulida пгт.21)

Таким образом, штаммы Р stutzen (шт 18) и P.putida (шт 21) используют тиопианат в качестве источника азота и серы в анаболических процессах

Разработка комбииированнойтехнологин деструкции CN" и SCN" в промышленных стоках.

Большинство золотоизвлекательных фабрик РФ (Олимпиадинская, Кубакинская, Коч-карская и др.) работают с использованием цианидной технологии извлечения золота Применение высокотоксичного реагента, каким является цианид, требует очистки промышленных стоков - хвостов цианирования. Обширный круг научных разргботок (Castaldi, 1988; Invorsen 1990; Whitlock, 1992; Тимофеева, 1989; Камапов, 1995) в области детокси-кации цианистых растворов свидетельствует о неослабевающем интересе к этой проблеме.

Промышленные цианистые стоки содержат высокие концентрации CN" (сотни мг/л) и в связи с этим для снижения концентраций цианидов до значений, приемлемых для микробиологической обработки, необходимо проводить стадию предварительной обработки пульпы. Разработанный нами комбинированный способ обезвреживания стоков включает стадию предварительной химической подготовки пульпы и стадию бактериальной деструкции остаточных цианидов и тиоцианатов. В качестве химичесюй предобработки выбран процесс «Инко» (Патент США, № 4537686), где в роли детоксикаша CN" используется метабисульфит натрия в присутствии кислорода

воздуха и катализатора (Си24). Происходит окисление цианидов до безопасных цианзгов, которые трансформируются в аммоний-

N838305 + сГ^Ыч^О« + ЭОг

зэршоя, Со

СЫ" + ЭОг + Н2О —> ша + НгЭО«

Предварительно обезвреженные цианистые стоки поступают на микробиологическою обработку, где и происходит деструкция остаточного цианида и тиоцианата до ПДК.(0.05 мг/л).

В качестве модели были взяты хвосты сорбционного цианирования продуктов бактериального окисления золото-мышьякового концентрата ОлимпиадинскоЙ ЗИФ (таблица 5)

Таблица 5 Основной состав жидкой фазы хвостов сорбционного цианирования продуктов бактериального окисления золото-мышьякового концентрата

Определяемые комитенты Содержание, мг/л

РН ед. 9,8-10,7

Магний 0,4

Сульфаты 500-700

Цианид общий 120-200

Тиоцианат 4000-6000

Медь 10-13

Цинк 2-3

Железо 350-500

Никель 2-2,5

Мышьяк 0,8-1,2

Сурьма 0,5-5

Обезвреживание цианистых продуктов ОлимпиадинскоЙ ЗИФ в плотной пульпе с помощью метабисульфига натрия (N828205) проводили в герметичном реакторе при механическом перемешивании (400 об/мин) и расхода воздуха 0,3-0,5 м'/м3 мин с постоянным контролем щелочности пульпы (рН 10 7) Содержание твердой фазы в пульпе составляло 23-33 %.

Установлено, что увеличение расхода метабисульфига натрия (соотношение Ыа28205/СЫ") от 3 до 9 г/г СЫ" приводит к увеличению скорости обезвреживания СЫ" Остаточная концентрация СЫ" при увеличении расхода метабисульфига через 60 минут снижалась с 23,5 до 6,9 мг/л. При этом величина рН не снижалась ниже 10,0 (при исходном рН=10,7), что препятствовало нежелательному протонироваяию цианида и позволяло снизить потери ОТ Было установлено, что добавка Си2+ в качестве катализатора повышает скорость окисления СЬГ и позволяет снизить расход метабисульфига с 9 до 5 г/г СЫ* Так, при 30-ти минутной обработке цианистых стоков содержание СЫ" снижается с 13,8 мг/л до 5,8 мг/л при расходе Си2+ с 0,2 и 0,7 г/г СЫ" соответственно. Щелочность пульпы после предварительной обработки находится на уровне значений рН 9,8 - 10,0.

Был также испытан альтернативный способ химической предобработки пульпы тиосульфатом натрия с целью перевода СЫ" в 8СЫ". Цианистую пульпу, содержащую исходно 80 мг/л СЫ" и 400 мг/л БОГ, обрабатывали тиосульфатом натрия 5 г или 7 г №г82Оэ/г СЫ" в течение 15, 30,45, 60 и 75 мин Оптимальные концентрации СЫ" (30 мг/л) для дальнейшей

бактериальной деструкции получали при обработке 7 г ИагвгОз/г CN" в течение 60 мин. Концентрация SCN" при этом увеличивалась до 740 мг/л

Бактериальную деструкцию CN" и SCN" в плотных пульпах после предварительной химической обработки проводили с помощью ассоциации гетеротрофных бактерий В опытах была использована пульпа после цианирования золота Этанол использовали как источник углерода и энергии, CN" и SCN" - как источник азота. Испытания биотехнологии проводили в реакторе объемом 3 л, в который вносили 1,5-2,0 л пульпы при тж=1:5 с добавлением фосфатов (1 г/л) и этилового спирта (2%), рН 9,2-9,4 устанавливали добавлением 0,1 N раствора NaOH или H2SO4 Опыты проводили при температуре 25-34°С при постоянном перемешивании со скоростью мешалки (150 - 300 об/мин) и подачей воздуха (0,3 - 0,5 м3/м3/час) (кроме деструкции CN") CN" при исходном его содержании 10-20 мг/л полностью окислялся за 3-5 часов со скоростью 3-4 мг/л/час Скорость окисления SCN" менялась в зависимости от исходной его концентрации (рис 17) При концентрации SCN" 4 г/л и количестве клеток бактерий -109 в 1 мл максимальная скорость его деструкции была 500-600 мг/л/час.

Рис. 17. Деструкция тиоциа-ната ассоциацией штаммов P.stutzeri шт. 18, Р pulida шт 21 в пульпе после бактериального окисления концентрата в реакторе при различных его концентрациях-1 - 1.5 г/л SCN" (КОЕ - 107 кл/мл); 2 - 4 1 г/л SCN" (КОЕ -109кл/мл)

Таким образом, микробиологическое окисление циаявдов и тиоцианатов осуществлялось бактериями в течение 24 часов не зависимо от исходной концентрации СИ" и 80Г Концентрация токсичных циансодержащих компонентов (СЫ" и вСЫ-) в сбросных пульпах составляла меньше 0,05 мг/л

Бактериально - химическая технология обезвреживания циансодержащих стоков является экологически безопасной, т к. в результате разрушения токсичных циан- и тиоцианат-ионов образуется аммоний, который утилизировался бактериями полностью.

На основании проведенных испытаний общая технологическая схема предприятия, включающая и блок бактериального обезвреживания могут бьпъ представлены в следующем виде (рис 18).

Цианид содержащие стоки (пульпа)

рН=10,5-11,0; 100-150 мг/л CN" i

Химическая деструкция цианидов

NazSA.Cu^

Частично обезвреженные стоки рН=8,9-9,4; 15-30 мг/лОГ, 4-6 г/л SCN"

Микробиологическая деструкция ОТ и SCV" Ассоциация гетеротрофных бактерий Р. stutzen шт. 18, P.putida шт. 21

Полностью обезвреженные стоки рН=8,0-8,5; <0,05 мг/л CN", <0,05 мг/л SCN"

На сброс

Рис 18 Технологическая схема бактериально-химической деструкции цианвд-содержащих стоков и пульп.

Заключение.

Известен широкий спектр микроорганизмов, способных к деструкции цианидов, что позволяет исследователям рассчитывать в дальнейшем на их практическое использование в целях" детоксикации этих соединений в различных средах Спектр микроорганизмов, использующих тиоцианат как источник энергии или/и как источник азота и серы, также постоянно расширяется Изученные механизмы деструкции данных соединений, с одной стороны, отражают общность ферментных систем, ответственных за осуществление этих процессов у различных представителей микроорганизмов, а с другой, - подчеркивают разнообразие, когда дело касается особенностей каждого конкретного штамма микроорганизма

Очень важным является знание химических свойств данных соединений, особенно в случае цианида, который в растворе может присутствовать в двух формах- СЫ" и НСН соотношение которых зависит от рН раствора.

Большинство известных в настоящее время микроорганизмов-деструкторов ОТ способно к росту в диапазоне рН от 6.5 до 8.5, т.е. когда до 96 % цианида находится в форме летучего соединения (НС14), поэтому очень существенным является определение реальной

концентрации токсиканта, подвергшегося деструкции В имеющихся публикациях зачастую эта цифра является сильно завышенной Нами были определены реальные концентрации С>Г, которые были стабильными в условиях проведения эксперимента (не улетучивались) Также была показана недопустимость принудительной аэрации среды, которая, как правило, имела место в исследованиях других авторов Были подобраны условия, наиболее благоприятные для роста и деструкции цианида и тиоцианата, которые позволили в дальнейшем разработать способ обезвреживания данных соединений в промышленных стоках.

Выделенная из природных источников антропогенного загрязнения ассоциация гетеротрофных бактерий позволила осуществлять деструкцию С>Г и 8С1*Г при их совместном присутствии в различных средах, включая плотные пульпы. Устойчивость данных штаммов к цианиду объяснялась наличием у них цианидрезистентного дыхания, а способность к деструкции как ОТ, так и вСЫ" - использованием этих соединений в качестве источника азота (и серы - в случае тиоцианата) В процессе адаптации к возрастающим концентрациям токсикантов, удалось получить ассоциацию штаммов, осуществляющую деструкцию до 70 мг/л ОТ и 6 г/л вСКГ.

Изучение механизмов деструкции СН и 8С>Г выявило как видовые, так и штаммовые особенности Типовые штаммы видов Р и Р риМа были не способны к деструк-

ции СЬГ и БСЫ", что объяснялось отсутствием или неактивностью соответствующих ферментных систем Различия выделенных и типовых штаммов были подтверждены на генетическом уровне, а именно по структуре хромосомной ДНК, определенной методом пульс-электрофореза

Высокие скорости деструкции СЫ" и вСК, которьв имели место в случае выделенной ассоциации гетеротрофных бактерий, позволили создать комбинированную технологию обезвреживания промышленных стоков и пульп Она включила химическую стадию обезвреживания цианида с использованием метабисульфига щелочного металла в присутствии медного катализатора и бактериальную с использованием выделенной ассоциации, которая осуществляла деструкцию тиоцианата и остаточного цианида до ПДК. Данный способ нашел свое выражение в двух патентах: «Консорциум штаммов гетеротрофных бактерий, деструктирующий цианиды и тиоцианаты» (№ 2226548) и «Способ деструкции цианидов и тиоцианатов» (№ 2245850).

Выводы.

1. Из зон антропогенного загрязнения выделена ассоциация штаммов Pseudomonas stutzen и P. putida, способная к деструкции как цианидов, так и тиоцианатов ори их высокой концентрации (до 30 мг/л и 6 г/л соответственно) в различных средах.

2. Деструкция CIV и SCN' при их совместном присутствии более активно протекает с использованием ассоциации штаммов Р. stutzen и P. putida, что объясняется различной активностью метаболизма этих соединений.

3. CN" и SCN" могут служить единственным источником азота, а тиоцианат - и серы для штаммов P. stutzeri и P. putida, входящих в ассоциацию.

4. Выявлены условия для деструкции CN" выделенной ассоциацией гетеротрофных бактерий, исключающие его потери в виде HCN (pH 9.2-9.4, концентрация до 30 мг/л). Показано, что недопустимо применение аэрации среды воздухом независимо от pH среды.

5. Показан^ что ассоциация гетеротрофньк бактерий Р. stutzen и Р. putida в различных условиях (растворы, плотные пульпы) способна развивать высокую скорость деструкции CN" и SCN" (4 мг/л/час и 600 мг/л/час соответственно), что позволяет использовать ее для очистки промышленных стоков.

6. Изученные штаммы, входящие в состав ассоциации, обладают различными путями деструкции тиоцианата, а именно у Р. stützen деструкция происходит с образованием аммония и тиосульфата, а у Р. putida - с образованием аммония, тиосульфата, тетрятисната и тритионата.

7. Предложен комбинированный бактериально-химический способ деструкции CN" и SCN", включающий их химическую обработку метабнсульфнгтом щелочного металла в присутствии медного катализатора и последующую микробиологическую обработку ассоциацией гетеротрофных бактерий Р. stutzeri и Р. putida в присутствии фосфатов и источника углерода.

Список работ по материалам диссертшии:

1 ГригорьеваНВ,АвакянЗА,ТуроваТ11,КЬнарааеваТФ, Каравайко Г.И 1999.Офижнги изучение микроорганизмов, далрукпфукнвдх цианиды и тиогвинапы Микробиология. Т68 №4.С.45М60

2 Каравайиэ ГИ, Кснлрятьева Т Ф, Савари ЕБ, Григорьева НВ, Авакян ЗА 2000. Микро&ия деструкция иианидаи-шоиианат Микробиология. T.69№2. С209-216

3 N V.Grigoijeva", Т F Kondratjeva", Е Е Savarf, G V Sedel'nikovab, and G. I. Karavaiko 2001 Biotechnological neutralization of cyanides and thiocyanales in cyani-dation tails of gold ores and concentrates Proceedings book of the "International Bio-hidrometallurgy Symposium-2001",September, 16-19, Brazil, Part В VSTCimonelii and O.Garsia Jr. (Editors). P 381-389.

4 ГригорьеваНВ, КондратьеваТФ, СавгртЕ.Е, Оедельникта ГВ, Каравайко Г.И.2003 Бактериально-химическая деструкция шанодов и их цххвводных в промьшиЕнных стоках и пульшх. Тез докл. 7-го Международного оеминара-презетяви инновационных научнотехничесхих проектов воблгюшбиагехнологии23-25ноября. ПущинаИБФМРАН С22

5 Патент № 2226548 20062002 Григорьева НВ, Каравайко ГИ, Конарашва Т Ф, Сгвщм Е Е, ГопищиАЛ Консорциумппаммовб|шерийРдемйт0ПФ£и1^

rm\№21, деегдтстирутощих CN"и SC^T при высоких Ktwiempai ягах 10042004 Бюп№10

6 Пагент№2М5850 31122002КаравайкоГДК(хщшытаТФ,СавариЕЯ,СедельнжшаГВ, Григорьева НВ Способ очистки промлшкнных спхоов ог цианидов и тиоцианатот 10.092004&COI № 4.

7 ГригорьеваНВ, Коцарап^ТФ.Сж^ЕЕ, ОдельнимэваГ.В, Каравайко ГИ2003. Бактериально-химическая деструкции пщывдж и их ¡фогасздныхвфсмьшхшгаыхсжжахипупьпах Тез докп7-го Мэкпународито семинара-презента*™ инноваотонных научнкмпехнических проектов в обласгабиото(жик)гии^25 ноября Пупию.ИБ<1М РАН .С. 22

8 Григорьева НВ, Коцгфатьева Т Ф, Савари Е.Е, Седешлинова ГВ,, Каравайко ГИ 2005. Микробная деструкция цианидов и тиоцинагов. Тездосл. 3-го Мхковсжого Междунфодного Конгресса «Бгогехножгиятахлояние и пфспекгавыршв^^ Часть 2 Москва Россия. 14-18 марта.

9 Григорьева Н.В., Конпргпьева Т.Ф, Красильникова ЕЛ н Каравайко ГИ 2006 Механизм деструкции цианинов и тиоцианаюв ассоциацией гетеротрофных штаммов Pseudomonas Bitzen im}k\.iiiiPseudomonasputidami}<ü\ //Мифобимогая. Сджавпечить.

C233.

Подписано к печати 08.12.2005 г. Формат 60x84.1/16. Объем 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 176.

Московская государственная академия приборостроения и информатики

107996, Москва, ул. Стромынка, 20

'I )

£00 g fi ЪАЗ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Григорьева, Надежда Викторовна

Введение.

Обзор литературы.

Химические свойства цианида и тиоционата.

Использование цианидов и тиоцианатов в промышленности.

Токсичность цианидов и тиоцианатов.

Природные источники цианидов и тиоцианатов: отношение микроорганизмов к цианидам и тиоцианатам: продуценты, деструкторы, резистентность дыхания.

Резистентность дыхания к цианиду у микроорганизмов.

Механизмы деструкции цианидов.

Деструкция CN" грибами.

Деструкция CN" бактериями.

Механизмы деструкции тиоцианатов.

Деструкция SCN" в автотрофных условиях.

Деструкция SCN" в гетеротрофных условиях.

Способы очистки промышленных стоков от цианидов и. тиоцианатов.

Химические.

Микробиологические.

Комбинированные.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Деструкция цианидов и тиоцианатов ассоциацией гетеротрофных бактерий и ее применение в биотехнологии"

Цианиды - это высоко токсичные соединения, которые встречаются в природе (цианогенные бактерии, грибы, растения), а также в зонах антропогенного загрязнения. Их применение в промышленности основано на способности растворять в присутствии кислорода золото и серебро. Ежегодно используется в промышленности до 3 млн.т. цианидов.

Тиоцианаты в основном образуются из цианидов при взаимодействии с различными формами серы (полисульфиды, тиосульфат), а также - с сульфидными минералами в золотоизвлекательных процессах.

Проблема обезвреживания цианид- и тиоцианат- содержащих стоков промышленных предприятий стоит очень остро. В настоящее время промышленные стоки обезвреживают несколькими способами, основным из них является химический. Наиболее распространенными являются - щелочное хлорирование и окисление сернистым ангидридом в присутствии медного катализатора. Оба эти способа имеют свои существенные недостатки, а именно щелочное хлорирование оставляет после себя высокие концентрации хлора (до 300 мг/л) и хлорорганические соединения. Метод с применением сернистого ангидрида не обеспечивает снижения концентрации цианида до ПДК (0.05 мг/л) и совершенно не обезвреживает тиоцианат.

Перспективными, экономичными и экологически чистыми являются микробиологические способы детоксикации цианид- и тиоцианат- содержащих стоков.

Известен целый ряд микроорганизмов, способных к деструкции цианидов - это отдельные представители родов бактерий: Pseudomonas, Escherichia, Alcaligenes, Al throbacter, Acinetobacter, Klebsiella, Bacillus, Nocardia; а также грибов: Stemphylium, Gliocladium, Trichoderma, Fusarium, Aspergillus, Gloeocercospora, Neurospora, Lep-tosphaeria.

Микроорганизмов, способных к деструкции тиоцианата в настоящее время известно значительно меньше - это представители p.p.: Thiobacillus, Paracoccus Thioalkalivibrio, Halomonas, Pseudomonas, Neisseria.

Первая промышленная установка по биодеградации цианидов, тиоцианатов была создана в США (завод в Хоумстейк). Стоки, обезвреживали используя штамм P. paucimobilis и нитрифицирующие бактерии в составе активного ила, содержали до 11.5 мг/л цианидов и до 110 мг/л тиоцианатов. При попытке использовать данный консорциум бактерий для обезвреживания высоких концентраций CN(100 мг/л) оказалось, что степень обезвреживания цианида была низкой - около 43 %. Основным ограничительным фактором для микробиологических способов является концентрация цианида в среде и рН. В диапазоне рН, наиболее благоприятном для роста большинства известных в настоящее время микроорганизмов-деструкторов CN" (рН 7-8), цианид присутствует в форме HCN и возможны его потери в ходе деструкции (переход в воздушную фазу). Поэтому возникла потребность комбинировать химические и микробиологические способы при деструкции стоков, содержащих цианид. Однако, недостатки известных в настоящее время способов, а именно высокая энергоемкость и токсичность химической обработки и низкая эффективность микробиологической, ставит под сомнение их дальнейшее использование.

Существенным ограничительным фактором детоксикации цианидов и тиоцианатов при их совместном присутствии, является узкий список микроорганизмов, известный в настоящее время, способный к деструкции обоих соединений (p. Pseudomonas). Поэтому, с нашей точки зрения актуальным было выделить микроорганизмы, способные решить эти проблемы.

Целью работы было исследовать возможность деструкции цианидов и тиоцианатов при их высоких концентрациях и совместном присутствии в различных средах (растворах и плотных пульпах) с применением микроорганизмов.

Задачи исследования включали:1) выделить и изучить ассоциацию микроорганизмов, способную к деструкции как цианидов, так и тиоцианатов при высоких концентрациях и их совместном присутствии;2) определить параметры деструкции цианидов и тиоцианатов выделенной ассоциацией микроорганизмов;3) исследовать механизмы деструкции цианида и тиоцианата выделенными микроорганизмами;4) разработать способ деструкции цианидов и тиоцианатов при различных их концентрациях с использованием выделенной ассоциацией микоорганизмов.

Обзор литературы.

Химические свойства цианида и тиоционата.

Цианиды могут присутствовать в окружающей среде в различных формах, включающих: свободную кислоту HCN; соли металлов - растворимые, такие как NaCN и KCN, плохо- и нерастворимые соли, например Zn(CN)2 и комплексы с металлами - умеренно и плохо разлагаемые.

Термин «свободные цианиды» включает в себя как ионы цианида (CN"), так и цианистый водород (HCN). Цианистый водород образует в растворе слабую кислоту. Соотношение между HCN и CN" определяется реакцией гидролиза: CN"+ Н20= HCN + ОН"Соотношение этих форм сильно зависит от рН среды (таблица 1) (Smith A. a. MuderT., 1991).

Цианиды разлагаются также редуцирующими сахарами (Andrede et al., 1995 .). Так в присутствии глюкозы (1% вес/об) происходит полное разложение CN" в концентрации 100 мг/л при рН от 7,0 до 9.0 за 50 ч эксперимента до аммония (Andrede et.al.,1995).

Известны и другие химические реакции цианидов, как например, окисление кислородом воздуха с образованием цианатов: HCN+1/202 = HCN0 Цианат водорода и цианаты менее токсичны, чем HCN. Цианиды превращаются в цианаты в присутствии сильных окислителей (например, озона, перекиси водорода, гипохлорита). Под действием ультрафиолета, в присутствии катализаторов, таких как оксид титана, сульфид кадмия, окись цинка, цианид превращается в цианат (Frank a. Bard, 1977).6Цианиды образуют комплексы с ионами металлов. Стабильность анионов металлцианидных комплексов зависит от катиона, с которым он связывается (Smith A. a. Muder Т., 1991) (таблица 2).

Таблица 2. Стабильность металлцианидных комплексов.

Комплексные ионы Константы стабильности комплексовCr(CNy- 10"Cr(CN)64' 10"Fe(CN)64- 10j5'4Co(CN)64' 105UNi(CN)4z" lo"Pd(CN)42" 1042Pt(CN)42" 104UCU(CN)2" 102J'yCu(CN)32" 10^CU(CN)4^" 10^'Ag(CN)2" 102U,4Ag(CN)3z- Au(CN)2" 10"AU(CN)4" 10"Zn(CN)42" 1021Cd(CN)42" 10iyHg(CN)42" 10jyНекоторые комплексы, например, Zn и Cd, являются относительно нестабильными и диссоциируют на катион металла и CN". Другие комплексы, в особенности железа, золота и кобальта, являются стабильными. Однако даже они в некоторых случаях могут диссоциировать с высвобождением иона цианида под действием ультрафиолетовой радиации или в присутствии сильных кислот.

Также цианид способен к образованию двойных металлцианидных нерастворимых комплексов. Способность к такой реакции была успешно использована для удаления свободных цианидов из растворов путем образования ферроцианида трехвалентного железа (Fe4(Fe(CN)6)3) или других сопутствующих металлферроцианидных осадков. Связь металла с цианидом в комплексный ион зависит от рН, окислительно-восстановительного потенциала и концентрации цианида в растворе. Так, с увеличением в растворе доступного цианида, он может образовывать четыре различных цианида меди: CuCN л чнерастворимый; Cu(CN)2\ Cu(CN)3 Cu(CN)4 - растворимые. Известно, что медь в природных системах встречается, как в одновалентном(Си+), так и в двухвалентном(Си ) состоянии, однако, все вышеназванные цианиды, содержат медь в виде Си+.

Знание этих особенностей металлцианидных комплексов необходимо при очистке стоков после цианирования рудных концентратов.

Свободные цианиды способны адсорбироваться карбонатными материалами, адсорбционная активность увеличивается при образовании комплексов цианидов с металлами. Металлы, которые образуют слабые кислотораство-римые комплексы, такие как медь и никель, ускоряют процесс адсорбции. Цианиды могут реагировать с различными формами серы с образованием тиоцианата. Две формы серы наиболее активно реагируют с цианидами: поО Олисульфиды (Sx ") и тиосульфат (S2O3"). Они реагируют по уравнению: Sx2' + CN" = [S(x.i)]2+SCN-S2032" + CN- = S032" + SCN-Были предприняты попытки добиться образования тиоцианата в реакциях с сульфидными минералами при рН 10. Показано, что халькопирит (CuFeS2), халькозин (Cu2S), пирротин (FeS) и свободная сера образуют в реакции с цианидом SCN"(Mc.Gill et al., 1985).

Знание химии цианидов и тиоцианатов необходимо при изучении механизмов их микробной деструкции, а также при оптимизации биотехнологических процессов.

Использование цианидов и тиоцианатов в промышленности.

Цианиды натрия и калия обладают способностью растворять в присутствии кислорода золото и серебро. На этом основано их применение для извлечения благородных металлов из руд (цианирование). Кроме того, они используются для получения синильной кислоты, в органическом синтезе, гальваническом золочении и серебрении, в фотографии.

Также цианиды применяют при насыщении поверхностных слоев стальных изделий углеродом и азотом в расплаве, что повышает поверхностную твердость, износостойкость и усталостной прочности изделий. Ежегодно используется в промышленности до 3 млн.т цианидов (Smith A. a. Muder Т., 1991).

Органические тиоцианаты используются в качестве пестицидов, стабилизаторов эмульгаторов и смазок.

Загрязнение окружающей среды происходит отходами данных производств.

Токсичность цианидов и тиоцианатов.

Ионы цианидов являются мощными ингибиторами роста и клеточного метаболизма, включая дыхание и метаболизм азота и фосфатов (Knowles а. Bunch, 1986). Они ингибируют митохондриальную цитохромоксидазу, и клеточные каталазу, пероксидазу, тирозиназу, оксидазу аскорбиновой кислоты и фосфатазу. Цианиды ингибируют ферментативную активность путем связывания кофакторов, содержащих металлы, в металлоферментах. CN" реагирует с Fe3+, присутствующим в митохондриальных цитохромоксидазе и в крови, предотвращая окислительно-восстановительные реакции. В результате организмы погибают. Предельно допустимые концентрации CN" и их комплексов в России составляют 0,05 мг/л.

Тиоцианат является токсичным ионом, который имеет природные и промышленные источники. Тиоцианат менее токсичен, чем цианид. В большинстве растений и животных он присутствует, как продукт детоксикации цианида или как естественный агент, противостоящий микробной инфекции (Westley, 1981). Тиоцианат- содержащие стоки производятся в огромных количествах (Stratford et al., 1994). Он также мешает обезвреживанию других токсичных веществ в стоках, что наносит ущерб водной флоре и фауне. Предельно допустимые его концентрации составляют 0.05 мг/л.

В 1913 году впервые встал вопрос о возможности образования микроорганизмами цианида (цианогенез). В криминальной практике столкнулись с выделением цианида при разложении белка, в результате были обнаружены бактерии, которые вели этот процесс. Таксономическое исследование циано-генных бактерий провели впервые в 1913 г. Клаусон и Янг, они выделили Bacillus pyocyaneus {Pseudomonas aeruginosa), Basillus violaceus {Chromobac-terium violaseum), Bacillus fluoresceins {Pseudomonas jluoresens). Большинство цианогенных бактерий было отнесено к группе флуоресцирующих псевдомонад. Среди отдельных видов цианогенез прослеживался не у всех штаммов, так например, среди выделенных штаммов Pseudomonas aeruginosa 70 % обладали данной способностью, остальные были негативные по этому признаку (Castric Р.А., 1981).

В настоящее время известны цианогенные организмы различных таксонов (Dubey and Holmes, 1995):бактерии: Ch. violaceum, P. aeruginosa, P. chloraphis, P. fluorescens; водоросли: Chlorella vulgaris, Nostok muscorum, Plectonema boryanum, Anacys-tis nidulans;грибы: Marasmius oreades, Stemphyllium loti, Gloeocercospora sorghii, Snow-moulds-,высшие растения: Almonds, Cassava, Apple, Loquat, Lima Beans.

Метаболические пути образования цианида микроорганизмами различны. В 1948 году Лорк открыл глицин - зависимое образование цианида у Р. aeruginosa, а позднее в 1965 году Михаелс и Корпе проследили аналогичную закономерность у Ch. violaceum. Колинс с соавторами в 1980 году отметили стимуляцию образования HCN, когда Ch. violaceum рос на глютаматной синтетической среде с добавлением L-треонина. Впоследствии на экстрактах было показано, что L-треонин переводится в глицин, который в свою очередь является предшественником HCN. L - фенилаланин в работах Кастрикса (1977) стимулировал цианогенез у P. aeruginosa, была показана его регуля-торная роль и роль метаболита - предшественника глицина (Castric Р.А., 1981).

Физиологические функции цианогенеза у микроорганизмов до конца не выяснены, возможно они имеют регуляторное или экологического значение. В экологическом аспекте это:- увеличение шансов выживания среди других микроорганизмов,- уменьшение вероятности поедания другими организмами,- укрепление шансов паразита в борьбе за выживание.

В качестве примера стратегии выживания можно привести образование Р. aeruginosa синего пигмента пиоциана, в образовании которого участвует цианид. В работах Хасана и Фридович (1980) было показано, что он обладает противомикробным действием. Регуляторная функция цианида, по мнению Кастрикса (Castric Р.А., 1981), может быть связана с вторичным метаболизмом, когда избыток глицина «выводится» из организма через цианогенез, чтобы избежать метаболического стресса. Глицин является центральной молекулой в метаболизме циаиогенных бактерий, как предшественник других аминокислот, белков, пуринов. Высокая концентрация глицина нарушает биосинтез клеточной стенки, оказывает негативное влияние на глютаминсин-тазу (P. fluorescens). Для СИ. violaceum было показано, что цианогенез позволяет включать освобождающийся азот в формы, отличные от аммония (Cas-tricP.A., 1981).

К микрооганизмам, способным к деструкции CN" в настоящее время относят представителей различных родов бактерий, включающий в том числе и цианогенные микроорганизмы (таблица 3).

Таблица 3. Микроорганизмы способные к деструкции цианида.

Виды микроорганизмов Литературный источникPseudomonas sp. Ульберг и др. 1994, Подольская и др., 1994P. fluorescens Garcia et al., 1995; Harris a. Knowles, 1983aP.putidaBabu et al., 1992; Chapatwala et al., 1998P. aeruginosaCastric, 1975P.stutzeriWatanabe etal., 1998P.paucimobilis ATCC 39204Whitlock, 1990P.pseudoalcaligenes CECT5344Luque-Almagro et al., 2005Alcaligenes xylosooxidans denitrificansIngvorsen et al. 1991Arthrobacter sp. JIDubey S.K. a. Holmes D.S. 1995Acinetobacter sp. RFB 1Finnegan et al., 1991Klebsiella ozaenaeDubey S.K. a. Holmes D.S. 1995Bacilluspumilus CI B.stearothermophilus B.megaterium B. subtilis Nocardia sp. Stemphylium /oti, Gliocladium virens, Trichoderma koningii Fusarium oxysporum CCMI876 F.solani F.lateritium Aspergillus niger Gloeocercospora sorghi Neurospora crassaMeyers et al., 1993 Atkinson, 1975 Castric a. Strobel, 1969 Dubey S.K. a. Holmes D.S. 1995 Dubey S.K. a. Holmes D.S. 1995 Fry a. Millar, 1972 Pereira et al. 1996 Pereiraet al. 1996 Pereira etal. 1996 Dumestreet al., 1997a Cluness et al., 1993 Pereira etal. 1996 Fry a. Munch, 1975 Bergquist et al., 1974Резистентность дыхания к цианиду у микроорганизмов.

Цианидрезистентным дыханием (ЦРД) ранее принято было называть потребление кислорода митохондриями, клетками, тканями, полностью или частично толерантное не только к классическим ингибиторам цитохром-с-оксидазы (цитохром а + а3) - цианиду, азиду или окиси углерода, но и к ингибиторам, подавляющим перенос электронов по дыхательной цепи на участке между цитохромами в и с - антимицину А и iV-окиси оксихинолина (Ikuma, 1972).

В 1981 году В.К. Акименко предложил понимать под цианидрезистентным дыханием перенос электронов по дыхательной цепи на кислород полностью или частично не чувствительный к цианиду (Акименко, 1981). При этом подразумевается, что происходит полная замена цианидчувствительной терминальной оксидазы на цианидрезистентную, либо одновременное функционирование двух оксидаз, одна из которых не чувствительна к цианиду. Если проследить историю развития взгляда на природу цианидрезистентной оксидазы, то можно обнаружить, что все возможные компоненты дыхательной цепи (аа3, Ъ, с, d, о, FI, F-S, CoQ, NADH), в свое время претендовали на ее роль. В процессе исследования цитохромов (с, d, Ъ, о) было обнаружено, что константа ингибирования обоих типов цитохромов о близки к аа3 и остается у различных микроорганизмов в пределах 500 мкМ. Эти константы, как правило, ниже констант ингибирования для цианида у цитохрома d (до 2000 мкМ). Для цитохрома d было показано, что он образует спектрально различимый комплекс с CN", тогда как истинные цианидрезистентные оксидазы не реагируют на цианид даже при его концентрации равной 10 мМ. Таким образом, и цитохром d, и цитохромы о,о, по-мнению, Акименко (1989) было бы не целесообразно причислять к цианидрезистентным оксидазам.

Для различных представителей бактерий (Brevibacterium helvorum, Micrococcus luteum, P.aeruginosa, P. desmolytica, P. saccharophila, Rhodococcus globerulus 226A, Xanthomonas campestris), было показано, что появление циа-нидрезистенного дыхания происходит без изменения качественного состава цитохромов дыхательной цепи. Также было отмечено, что резистентность дыхания к цианиду связана и с физиологическим состоянием культуры (появление цианидрезистенного дыхания в стацианарной фазе роста), поэтому целесообразно, по мнению автора, сравнивать состав цитохромов дыхательной цепи бактерий, находящихся в одинаковых физиологических состояниях, но имеющих разную степень торможения цианидом. Было сделано предположение о негемовой природе цианидрезистентных оксидаз (Акименко, 1989).

Локализация и природа цианидрезистентных оксидаз (негемовой природы).

Фракционирование клеток на их субъеденицы показало, что у эукариотных микроорганизмов ЦРД локализовано в митохондриях, а у прокариотных микроорганизмов в цитоплазматической мембране, т.е. в месте расположениядыхательной цепи. Сравнительный анализ компонентов дыхательной цепи (ДЦ) у отдельных эу- и прокариотных микроорганизмов до и после появления у них ЦРД показал существенные различия в концентрации коэнзима QЛ I(CoQ) в митохондриях эукариот и концентрации ионов Си в цитоплазмати-ческой мембране прокариот (ЦПМ). Например, появление ЦРД у P.aeruginosa сопровождалось увеличением содержания ионов Си2+ в 3,7 раза в препаратах ЦПМ.

С помощью ингибиторного анализа было показано, что ЦРД подавляется гидрофобными железохелатирующими агентами у представителей высших и низших растений, простейших, мицелиальных грибов и дрожжей, что свидетельствовало об одинаковой природе цианид резистентной оксидазы (ЦРО) у всех эукариотов и, что ЦРО содержит в своем составе негемовое железо. Результаты анализа частично очищенных препаратов дурохинолооксидазы и ряд косвенных данных позволили предположить, что ЦРО представляет собой флавиновый железосульфопротеид, содержащий ионы меди. В дальнейшем была изучена структура ЦРО у эукариотных организмов: она представляла собой димер, который двумя гидрофобными сг-спиральными участками был погружен во внутреннюю мембрану митохондрий, а С и N-концевые участки выступают на поверхности со стороны матрикса. Четыре спиральные цепи образуют предполагаемый биядерный Fe-центр на С-терминальном гидрофобном участке оксидазы (Меденцев и др., 1999).

Для эукариотных микроорганизмов было показано, что место ответвления цианидрезистентной оксидазы от дыхательной цепи (ДЦ) локализовано на участке между коферментом Q и цитохромом в. ДЦ прокариот локализована в ЦПМ и представляет собой набор дегидрогеназ, коэнзимов, железосерных центров, негемовых преносчиков электронов. Спектры коэнзимов и цито-хромов (а-, в-, с- типов) более разнообразны, соответственно за счет большего количества производных убихинона и метахинона, пирролохинолинхино-ла и широкого набора цитохромов, в том числе и цитохрома d. ДЦ включаети негемовые переносчики электронов: азурин, амицианин, пластоцианин, рустицианин (Акименко, 1989).

Условия появления цианидрезистентного дыхания.

Эти условия были условно разделены на 4 группы:1. Старение культуры. Данный феномен (появление частичной или полной резистентности дыхания к цианиду у стареющих культур), вплоть до активации ингибитором, наблюдался у мицелиальных грибов (Carpinus psychromorbidus, Mirothecium verrucaria, Schizophillum commune); дрожжей (Ambrosiazyma cicatrica, Bullera alba, Candida albicans и др.); бактерий (Brevibacterium helvorum, Corynebacterium ammoni-agenes, Mycobacterium luteum, Pseudomonas aeruginosa, P.desmolytica, P.saccharophila, Xanthomonas campestris и др.); 2xrwioimu^TOb{Streptomyces citreofluorescens, Streptomyces badius и др.)2. Индукция ЦРД под действием ингибиторов митохондриального белкового синтеза (эритромицин, хлорамфеникол, тетрациклин, акрифлавин и др.) или ингибиторов переноса электронов по дыхательной цепи (ан-тимицин А, цианид, азид). Это также наблюдали у представителей грибов (Aphanomyces astaci, Aspergillus oryzae, F. lini, Mucor geneven-sis,Neurospora crassa и др.); дрожжей (С. albicans,С. curvata,С. guillermondii, Endomyces magnusii и др.); бактерий (В. cereus, Ch. violaceum, E. coli, Paracoccus denitrificans, P. fluorescens).

3. Мутации, в результате которых происходит утрата способности синтезировать цитохромы аа3 и (или) цитохром в, а также отдельные компоненты мембраны. К этой группе также относятся случаи индукции ЦРД при лимитировании роста микроорганизмов источниками ионов железа, меди или серы, т.к. последствия такого лимитирования то же, что и при мутации - подавление биосинтеза цитохромных компонентов дыхательной цепи. Однако замечено что лимитирование роста культурмикроорганизмов ионами железа или серы не всегда вызывает появление цианидрезистенной оксидазы.

4. Индукция ЦРД при культивировании микроорганизмов на низших спиртах (n-пропанол). Цианидрезистентная оксидаза синтезируется в этом случае в дополнение к нормально фунционирующей дыхательной цепи.

При этом было показано, что для индукции ЦРО необходимо торможение активности ДЦ на ее цитохромном участке, торможение не полное, а до контролируемого состояния (Акименко, 1989).

Механизмы деструкции цианидов.

Многие микроорганизмы имеют спецефические ферментативные системы и пути деградации цианидов. Dubey S.K. и Holmes D.S. (1995) впервые систе-матицизовали их (таблица 4).

Дальнейшие разделы посвящены более детальному рассмотрению этих ферментативных процессов и микроорганизмам их осуществляющих.

Таблица 4. Биохимия деградации цианидов и микроорганизмы, осуществляющие эти процессы.

Известно, что 800 различных видов растений, образующих цианид, подвергаются воздействию фитопатогенных грибов (Mansfield, 1983). Они фермен-тативно преобразуют цианид в менее токсичный формамид при помощи цианид гидратазы (формамид гидролиаза): HCN + Н20 -> HCONH2Впервые цианид гидратаза была выделена из St. loti (грибы-патогены для Lutus corniculatus) (Fry& Millar, 1972). Также данный фермент был обнаружен у некоторых других грибов, включая штаммы: F.solani (Dumestre et al., 1997a; Barclay, Tett & Knowles, 1998a), F. oxisporum CCMI 876 (Pereira, Arra-baca & Amaral-Collaco, 1996), F. lateritium (Cluness et al., 1993), Gl. sorghi (Wang& Van Etten, 1992).

Также было отмечено, что помимо детоксикации цианида ряд грибов осуществляет реакцию превращения цианида в формамид с целью использования цианида как источника азота. Перейра с соавторами (Pereira et al.,1996) выделил три гриба из промышленных стоков, которые росли на цианиде (1мМ), как единственном источнике азота: F. oxisporum, Trichoderma koningii и Gliocladium virens. Исследования с F. oxisporum подтвердили, что превращение цианида в формамид происходит под действием цианидГидраДррагвры. Dumestre (1997а) выделил штамм F. solani IHEM 8026 из загрязненных щелочных стоков, который был способен к деструкции цианида при рН 9.2-10.7. Радиоизотопный анализ показал, что цианид ферментативно превращался в формамид, который затем переходил в формиат и аммоний. Аммоний использовался в качестве источника азота, формиат превращался, по мнению авторов, в СО2 под действием формиатдегидрогеназы (рис 1):Н20 Н20I 4CN- —► HCONH2—> NH4+ + HCOO" Цианид- амидаза | формиат- | гидратаза | дегидро- | <—NAD+I геназа | использование | —>NADH для роста С02Рис.1. Путь утилизации цианида F. solani (Barclay et al., 1998a; Dumestre et al.,1997a).

Штамм F. solani, изолированный Барклаем с соавторами (Barclay et al., 1998в) из загрязненных цианидами почв обладал способностью деградировать и утилизировать в качестве единственного источника азота, как свободный цианид, так и в комплексе с металлом. Путь для утилизации цианида данным штаммом, растущим в нейтральных и кислых (рН 4) условиях средьг, оказался идентичный F. solani ГНЕМ 8026, растущему в щелочных условиях (Barclay et al., 1998а).

Другой штамм F. oxisporum, изолированный в составе консорциума Scy-talidium thermophilium и Penicillium miczynski из аналогичных условий, как и предыдущий штамм Fusarium был способен к использованию никель- и железо-цианидов в качестве источника азота. Рост на металл-цианидном комплексе зависел от относительной стабильности комплекса. Так при росте на среде, в состав которой входил комплекс K4Fe(CN)6 с высокой стабильностью, полное удаление цианида из среды при рН 4 происходило через 28 дней, тогда как при рН 7 никакой деградации цианида и роста не было. Для сравнения, рост на среде с комплексом цианида с никелем (K2Ni(CN)4) и полное удаление цианида заканчивалось после 3-5 дней при нейтральном значении рН (Barclay et а1.,1998в).

Цианидгидратаза, была изолирована из различных грибов (таблица 5).

Таблица 5. Свойства цианидгидратазы, выделеной из различных грибов.

Виды pH оптим. Общая молек. масса Масса субъ-еденииц (кДа) Кт (мМ/л) ЛитератураF. solani 7.5 >300 45 4.7 Barclay et al., 1998аF. lateritium 8.5 >300 43 4.7 Cluness et al., 1993Gl. sorghi 7-8 >300 45 12 Wang& Van Et-ten, 1992F. solani IHEM 8026 7-8 Dumestre et al. 1997bF. oxisporum Pereira et al., 1996St. loti 7-9 >600 - - В начале исследований было не известно как действует фермент - на комплекс целиком или свободный цианид (CN7HCN), который образуется при диссоциации данного комплекса. Существовали отдельные доказательства, подтверждающие, что воздействию фермента подвергается именно свободный цианид. Первое - это то, что амино-терминальная последовательность фермента, выделенного из F. solani, выращенного на K2Ni(CN)4, строго гомологична амино-терминальной последовательности цианидгидратазы из обоих видов Fusarium lateritium и Gloeocercospora sorghi (Barclay et al., 1998a). Второе - это то, что скорость роста и F. solani, и F. oxisporum на металлцианиде связана с относительной стабильностью этого комплекса. Также авторы не исключали, что взаимосвязь между скоростью роста и стабильностью комплекса может быть связана и с не-способностью энзима воздействовать на это устойчивое соединение, а лимитация роста зависит от способности комплекса диссоциировать. Более поздние исследования с обратной транскрип-тазполимеразой показали, что один и тот же ген индуцируется как никель- и железо-цианидом, так и KCN. Тот факт, что различные формы цианида индуцируют один ген подтвердило, по мнению авторов то, что субстратом для энзима является свободный цианид (Barclay et а1.,1998в). Думестре с соавторами (Dumestre et al., 1997а) на основании данных анализа рН оптимального для цианидгидратазной активности отмечают, что действительным субстратом для фермента является HCN, а не свободный CN-ион, что видно из таблицы 5. При рН выше 9.36 цианид находится в основном в ионной форме (CN") (табл.1). Оптимальным рН для большинства цианидде-градирующих грибов является рН 7-9, т.е. оптимальный для цианидгидратазной активности. Авторы указывают, что снижение энзиматической активности при рН 10.1 связано с недоступностью субстрата, который находится в форме CN".

По аналогии с бактериальными цианид-деградирующими ферментами, авторы предположили, что грибная цианидгидратаза также может связываться с цианогидринами (Kunz et al., 1998).

В дальнейшем авторы сравнивают рост иммобилизованных на различных носителях и свободных клеток. Сравнивали рост по увеличению общего углерода, азота и утилизированного цианида. В случае свободных клеток деструкция цианида составила 79,8%, прирост азота 71%, а иммобилизованных клеток - 98.0% (CN") и 96,4% (N). Порядок концентраций CN", которые выдерживали иммобилизованные клетки, был тот же. На полноту деструкции цианида иммобилизованными клетками влияла аэрация среды, при этом авторы отмечают, что улетучивание HCN в контрольном реакторе было незначительным. Максимум изменения в концентрации цианида (мМ/л), также как и в образовании NH3 и С02 отмечался при скорости аэрации 200 мл/мин - CN" :0,11;NH3:3,17; С02: 11,8.

Использование Na[I4C]-CN показало, что 70 % углерода из цианида превращалось в 14 С02, только 10 % было ассоциировано с биомассой и 12 % не использовано клетками P.putida. Иммобилизованные клетки были способны также к деструкции цианата и тиоцианата до NH3 и С02.

Утверждение авторов об использовании CN" в качестве источника углерода вызывает сомнение, поскольку всего 10% 14С было связано с биомассой, данная цифра вполне соответствует гетеротрофной фиксации С02, которая могла иметь место. Стабильность высоких концентраций цианида, используемых в опыте при указанном авторами рН среды (7.0-7.5) также вызывает сомнение. Вероятно, в опытах имели дело с меньшими концентрациями цианида, учитывая длительность эксперимента (144 суток), рН и аэрацию среды (200 мл/мин), т.к. могла иметь место химическая деструкция, помимо улетучивания.

Для исследования деструкции комплексов цианида авторы использовали следующие металлы: Na, К, Fe, Си, Ag, Zn. За 120 часов 70-80 % углерода было образовано из комплексов CN" с Na, К в виде СОг, 26 % углерода из -CN" с Си. Также было показано, что 60 - 90 % азота было использовано в ходе деградации цианида.

Псевдомонады - метилотрофы.Harris и Knowles (1983) выделили из почвы несколько штаммов цианидде-структирующих псевдомонад, использующих в качестве источника углерода и энергии метанол. Бактерии осуществляли превращение цианида в аммоний и С02, в качестве промежуточного продукта был обнаружен формиат. J.M. White с соавторами (1988) исследовали использование цианида в качестве источника углерода и азота выделенными из очистных сооружений промышленных стоков (актив.-:ный ил) культур псевдомонад - метилотро-фов. Изоляты оказались факультативными метилотрофами, способными расти на метаноле и метиламине. Для выделения циандеградирующих культур использовали сточные воды, содержащие 200 мг/л фенола и 5-10 мг/л CN". Как указывают авторы, использование хемостатной культуры позволило адаптировать культуры к 200 мг/л цианида. Однако, как видно из данных представленных авторами ниже, это скорее ошибочные результаты. рН среды поддерживали при помощи фосфатного буфера на уровне 7.2, при котором CN" на 99% представлен в форме летучего HCN. В качестве источника углерода культура использовала фенол, цианид использовался в качестве источника азота. Адаптацию к высоким концентрациям цианида проводили в несколько этапов, токсикант добавляли в экспоненциальной фазе роста. Устойчивость культуры оценивали по величине лаг-фазы. На первом этапе вносили 5, 10 и 20 мг/л цианида, при этом величина лаг-фазы была соответственно 50, 72 и 120 часов. При втором пассаже на тех же концентрациях цианида лаг-фаза составила 48, 62 и 75 часов соответственно. При третьем пассаже лаг-период при концентрации 10-20 мг/л не превышал 4-5 часов, а при 50 мг/л CN" - 38 часов. При четвертом пассаже лаг-период при исходных концентрациях цианида 50 и 100 мг/л составил 18 и 40 часов соответственно. При этом « утечка» цианида, зафиксированная в газовых ловушках, в обоих случаях была порядка 50%. Поэтому реально авторы имели дело с концентрациями в 2 раза меньшими, т.е. 25-50 мг/л. В процессе адаптации, авторы наблюдали много клеток с нетипичной формой. Вызывает сомнение и тот факт, что культуры были адаптированы к 200 мг/л, поскольку при рН 7,2, как уже отмечалось выше, HCN улетучивается и в растворе остается не более 1% (таблица 1), т.е. 2 мг/л CN'.

В процессе деструкции бактерии превращали цианид в формиат и аммоний, аммоний в дальнейшем утилизировался, а к использованию формиата бактерии были не способны. Бесклеточный экстракт бактерий стехиометрически превращал CN" в формиат и аммоний в реакции, которая не требовала кислорода. Соотношение цианид/белок было порядка 0.22-0,41.

В дальнейших работах для Al. xylosooxidans subsp. denitrificans было показано, что данную реакцию осуществляет фермент цианидаза (Ingvorsen et al., 1991).Pseudomonas fluorescens. Харрис и Кноулес (Harris and Knowles., 1983) выделили циандеградирующий штамм P. fluorescens NCIB 11764 из образца речного ила, с которым в дальнейшем была проведена основная часть работ по изучению механизма использования CN" в качестве источника азота гетеротрофными бактериями. Ими впервые было показано, что при деструкции CN" происходит образование аммония. При добавлении 1мМ KCN к культуре с оптической плотностью 1.0 (Абоо) образовывалось 1-0.5 мМ аммония в течение 220 мин. Сравнение культуры, выращенной на среде с аммонием, и культуры, выращенной на среде с цианидом показало, что в первом случае при добавлении CN" рост культуры прекращался, а снижение концентрации цианида было сравнимо с его химической деструкцией. Во втором случае рост замедлялся до появления аммония в среде, после чего рост возобновлялся, и происходило потребление аммония. Деструкция цианида проходила только в аэробных условиях. Превращение CN" в аммоний стехио-метрически проходило только в замкнутой системе и лимитировалось количеством добавленного кислорода. Скорость потребления кислорода в присутствии цианида была сопоставима со скоростью эндогенного дыхания и была порядка 30-55 нг-атом кислорода в мин. Количество потребленного кислорода было пропорционально количеству добавленного KCN (1.99 +/- 0.16 г-атом кислорода потреблялось на моль KCN). Концентрация цианида более 1 мМ была ингибиторной и вела к снижению интенсивности дыхания. В ряде последующих работ по утилизации CN" микроорганизмами аммоний везде регистрировался как конечный продукт (Ingvorsen, et al.,1991; White, et al., 1988), природа углерод - содержащего промежуточного продукта и других интермедиатов была изучена недостаточно.

В дальнейшем были получены доказательства того, что у P.fluorescens NCIMB 11764 имеется более чем один путь деструкции CN". Kunz с соавторами (1992) исследовали рост P.fluorescens NCIMB 11764 на цианиде, как единственном источнике азота при периодическом культивировании. Ресус-пен-дированные в Na-K-фосфатном буфере (рН 7.0) клетки (40 мг/л сырого веса) метаболизировали CN" в концентрациях далеко превосходящих ранееописанные. Так, 85% 50 мМ (1300 мг/л) KCN было деструктировано за 6 ча1 ^сов. В инкубационной смеси методом ядерно-магнитного резонанса с С, а также другими методами было обнаружено два Ci метаболита, которые были идентифицированы как формамид и формиат. Авторы показали, что относительное количество всех четырех метаболитов (СО2, формамид, формиат и аммоний) зависит от концентрации KCN и наличия кислорода. Также была показана зависимость механизма деструкции CN" культурой P.fluorescens NCIMB 11764 от концентрации цианида. При 0.5-10 мМ субстрата основным Ci продуктом оказывался СО2.

Клеточный экстракт из P. fluorescens NCIMB 11764 превращал более чем 70% K14CN и [14С]-формиата в 14С02. Полное окисление цианида в СО2 и NH3 с помощью очищенной CN-оксигеназы и FDH-содержащей фракции фермента (формиат дегидрогеназа), являлось строгим доказательством того, что эти два энзима необходимы для ассимиляции цианида, как источника азота для P. fluorescens NCIMB 11764.

Таким образом, на примере P. fluorescens NCIMB 11764 была показана возможность существования нескольких альтернативных механизмов деструкции CN" у одного штамма:2Н20 02i 4НС02Н + NH3 <-<- HCN ->-> NH3+CO2J, J, 4ассимиляция I<— H20 ассимиляция4hconh2Рис.2. Альтернативные пути деструкции цианида штаммом P. fluoresceins NCIMB11764.

При изучении механизма деструкции цианида штаммом P.fluorescens NCIMB 11764 было обнаружено накопление а-кето-кислот ( пуривата и а-кетоглутората) в условиях лимитации роста клеток по аммонию или цианиду ( Kunz, et al., 1998), что могло быть связано с неэнзиматическим способом деструкции цианида. Накопление кето-кислот в среде происходило параллельно увеличению цианиддеструкционной активности культуры с максимумом - 760 цмоль СЫ^мин'Мл)культуральной жидкости через 72 часа инкубации, при этом концентрация кето-кистот достигала 23 мМ. Вещество, которое образовывалось при взаимодействии CN" и кето-кислот было идентифицировано как цианогидрин. Дальнейшее превращение цианогидрина происходило под действием цианидоксигеназы, участвующей в утилизации CN" штаммом NCIMB 11764, как ранее описывали данные авторы. Данный субстрат культура использовала как источник азота, что было показано в опытах с чистым цианогидрином. При ферментативной конверсии цианогидрина образовывался NH3 и С02 при этом кето-кислоты регенерировались. Превращение зависело от кислорода и восстановленного пиридин нуклеотида (NADH). Мутантный штамм, не имеющий цианидоксигеназы не мог расти в присутствии циангидрина в качестве ростового субстрата.

Таким образом, использование цианида в качестве источника азота штаммом P.fluorescens NCIMB 11764 проходила в 2 этапа:1 - детоксикация при помощи кето-кислот, позволяющая цианиду в виде комплекса (цианогидрина) проникать в клетку.

Характер роста культуры говорил о деструкции цианида в лаг-период (50%), когда в среде накапливался аммоний, необходимый для дальнейшего активного роста (6 час). В последующие 9 часов происходила полная деструкция 1мМ KCN, при этом рост культуры продолжался еще 13 часов после этого.

При исследовании деструкции KCN (1мМ) биомассой целых клеток, отмытых от среды в 50мМ буфере (рН 7.6), процесс проходил за 10 час, независимо была культура предварительно выращена на CN" или нет (в контроле концентрация KCN был без изменений).

Также авторы изучали влияние металлов: К, Na, Fe3+, Са2+, Mg2"1", Zn2+, Mn2+,Л 1 Л 1 Л I Л INr,CrJ Co Hg на активность очищенного фермента. Наибольшим ингибирующим действием обладал Hg при концентрации 0.1 мМ, активность составляла от исходной 3-6%, что возможно, объяснялось наличием тиоло-вых групп в активном сайте фермента. На цианидазу выделенную из В.

Д Lpumilus С1 ингибирующее действие оказывал Сг (5-500 цМ), который был не токсичен для цианидазы P.stutzeri АК 61 (100 цМ). Что, по-видимому, также объяснялось различиями в структуре ферментов. Сиквенс Нетерминальной аминокислоты показал ее гомологию с аналогичной в циани-дазе из Al. xylosoxidans subsp. denitrificans. Также было показано, что циани-даза, из P.stutzeri АК 61 состоит из одного вида полипептида, тогда как у В. pumilus С1 и Al. xylosoxidans subsp. denitrificans DF3 - из 2-3 полипептидов.

Процесс превращения цианида в аммоний энзиматический. Одним из этих ферментов является нитрилаза, также известный, как цианид гидрОтаза или цианидаза (CNN). Он катализирует превращение цианида в аммоний и муравьиную кислоту (формиат) в реакции:HCN + 2Н20 НСООН + NH3 Данный фермент был найден у некоторых бактерий и грибов, как было отмечено выше.

Однако способность расти на цианиде не всегда корреллирует с способностью образовывать фермент. Что могло быть связано с тем, что при высокой концентрации субстрата, приемлемой для фермента (Кт порядка 1.5 - ЮмМ, как было опубликовано (Raybuck, 1992) рост ингибируется.

Второй способ превращения цианида - это путь включающий оксигеноли-тическое преобразование в диоксид углерода и аммоний.:HCN + 02+ NADH + ¥?-> C02 + NH3 + NAD+ В этом случае превращение субстрата осуществляется под действием фермента цианидоксигеназы (ЦОГ), которая была найдена только у P. fluores-cens NCIMB 11764. По сравнению с цианидазой, ЦОГ способна использовать цианид при гораздо большей концентрации (определяемая Кт = 3.5 мМ) (Fernandez, 2004).

Это объясняет, способность данного штамма расти на цианиде при низкой (нетоксичной) концентрации, такой, которую обеспечивают периодические условия с подпиткой. Это помогает понять как различные компоненты, содержащие CN-диссоциант (например, металл-циано-комплекс, цианогидрин) могут обеспечивать рост, т.к. свободный цианид (преобладает HCN - рКа для HCN/ CN - 9.2) может быть ферментативно разрушен.

Последующие исследования показали, что ЦОГ имеет свойства птерин-зависимой гидроксилазы, поскольку растворимый кофактор в клеточном экстракте, необходимый для активности фермента мог быть восстановлен при помощи восстановления птеринов (тетрагидробиоптерин, 6-метилтетрагидроптерин (Fernandez, 2004).

В клеточном экстракте культуры HPLC-анализом было обнаружено 2 наиболее выраженных пика, которые были идентифицированны, как Н2-моноптерин и Нг-би-птерин, еще 2 менее выраженных пика соответсвовали Нг-неоптерину (изомер моно-птерина) и трео-Нг-биптерину. При изучении их свойств, как кофакторов оба были отнесены к кофакторам ЦОГ.P.pseudoalcaligenes. Luque-Almagro с соавторами (2005) изучали использование цианида, цианата, Р-цианоаланина и металлоцианидных комплесов в качестве источника азота штаммом P.pseudoalcaligenes СЕСТ 5344, который был выделен из реки Гуадалкувер. Бактерии культивировали на минимальной среде (М-9) в присутствии 2мМ NaCN и ацетата натрия в качестве источника углерода и энергии. Штамм также был способен выживать в условиях при рН 11,5 и 30 мМ NaCN. Был изучен механизм использования штаммом металлцианидных комплексов, в котором участвуют сидерофоры. Образование сидерофоров наблюдали на агаризованной среде с комплексом Fe-CAS (хром азурол S). При росте культуры, вокруг колонии образовывался ореол, т.к. сидерофоры связывались с железом и оно выходило из комплекса, окрашенного в голубой цвет. Данный процесс был описан для грибов и бактерий, но авторы отмечают, что его никогда не связывали с деградацией цианида (данное утверждение не верно, т.к. процесс деструкции цианида с участием внеклеточных сидерофоров ранее был обнаружен для P. fluorescens NCIMB 11764 (Kunz, 1998)). В сточной воде содержащей, цианид и тяжелые металлы, такие как Fe, Си, Аи и V с ним в комплексе, бактерии начинали развиваться после 6 дневного периода. Авторы предполагают, что за это время происходило образование сидерофоров, которые связывали металлы и освобождали CN", необходимый в качестве источника азота для роста штамма Р. pseudoalcaligenes СЕСТ 5344. В процессе деструкции цианида образовывался аммоний, который регистрировали в бесклеточном экстракте. Также было показано, что потребление CN" имело место при отсутствии у штамма циа-назной активности, что по мнению авторов, свидетельствовало о том, что цианат не является промежуточным продуктом деструкции.Acinetobacter sp. RFB1. Штамм RFB1 был изолирован из стоков золото-обогатительной фабрики Южной Африки (Finnegan et al., 1991) на минимальной среде (MSS), которая содержала 0.25 |ig/ml дицианоаурата калия при рН 6.5. В результате селекции бактерии были способны к росту на среде с цианидом, его комплексами, которые использовали, как источник азота и углерода (таблица 6).

Таблица 6. Рост Acinetobacter sp. RFB1 в присутствии неорганических солейцианида.

Отличие данного белково-жирнокислотного комплекса от, например, ферментов (нитрилаза, нитрилгидротаза), по мнению авторов, заключалось в его неспецефичности и внеклеточном воздействии на субстрат.

Таким образом, в детоксикации цианидов микроорганизмами можно выделить два основных направления - реакции деструкции, осуществляемые ферментами, которые приводят к разрушению цианида и переводу его в доступные соединения азота (NH/, Р-цианоаланин). И реакции, которые осуществляются с целью перевода цианида в нетоксичные соединения - комплексы с кето-кислотами, с белком и жирными кислотами, сидерофоры.

Механизмы деструкции тиоцианатов.

Деструкция SCN" в автотрофных условиях.

Тиоцианат может быть использован в качестве источника энергии и/или азота, серы некоторыми автотрофными бактериями.

Бактерий, автотрофно растущих на тиоцианате и способных использовать его как источник энергии, в настоящее время известно не так много. Помимо нескольких штаммов Т. thioparus, это - Paracoccus thiocyanatus и Thioalka-livibrio paradoxus (ARH 1), Thioalkalivibrio tiocyanoxidans (ARH 2, ARH 4), Thioalcalivibrio tiocyanodenitrificam (ARhDl, ARhDl).

Впервые деструкция SCN' была открыта у тиобацилл (Happold et al., 1954; Wood, 1975). Было сделано предположение, что окисление тиоцианата происходит следующим образом. Вначале, тиоцианат гидролизуется до цианата (CNO") и сульфида (HS), затем происходит гидролиз цианата до аммония и бикарбоната, а сульфид - окисляется до сульфата (Chung a. Wood, 1970). Данный путь описан для автотрофной бактерии Т. thioparus (Katayama Y. а. Kuraishi Н., 1978). Известен фермент, осуществляющий процесс превращения цианата в аммоний и С02 - цианаза (ЕС 4.3.99.1). Фермент, разрушающий С-S связь при деструкции тиоцианата с образованием цианата в качестве промежуточного продукта, в настоящее время не выделен.

Другой путь деструкции тиоцианата известен в настоящее время только для автотрофных бактерий Т. thioparus ТШ 115, Paracoccus sp, P. thiocyanatus (Katayama et al., 1995; Kim a Katayama, 2000). Тиоцианат гидролизуется до кар-бонилсульфида 0=C=S при помощи специального фермента -тиоцианатгидролазы, а карбонилсульфид (COS) - до сульфида и С02 сульфид окисляется до сульфата.

Г. thioparus ТШ 115. Путь через образование COS был детально изучен с использованием штамма Т. thioparus THI 115, который деструктировал тиоцианат до сульфата и аммония (Katayama et.all., 1993). В ходе деструкции авторами не были обнаружены в среде сульфид, тиосульфат, тритионат, тетра-тионат, сульфит или сера в качестве промежуточных или конечных продуктов. Отмечалась зависимость скорости деструкции COS от рН среды. В опыте было показано, что в диапазоне рН от 5.8 до 8.3 максимальная активность деградации COS наблюдалась при рН 7.1. При этом 500 цмоль COS было деградировано за 20 час. В неинокульрованном контроле деструкция отсутствовала.

На деструкцию тиоцианата и эмиссию COS оказывала влияние также начальная концентрация SCN". В опытах с начальной конценрацией тиоцианата 10-20 мМ, его деструкция проходила полностью за 50 и 100 часов соответственно. При увеличении концентрации тиоцианата до 60 мМ, деструкция прекращалась при 25мМ SCN" через 75 часов. При этом начинала снижаться и эмиссия карбонил сульфида, которая была максимальной через 100 часов (3.2 цмоль).

При изучении влияния концентрации COS (дополнительно внесенного) на скорость деструкции тиоцианата, авторами было показано, что в диапазоне исследуемых значений (30-60 цмоль) ингибиторного действия не наблюдали. Однако снижение рН раствора при добавлении карбонилсульфида оказывало негативное воздействие.

При изучении механизма деструкции SCN" культурой Т. thioparus THI 115, было показано, что COS образуется в клетке, выходит из нее, а затем снова входит в клетку и метаболизируется с образованием конечного продукта окисления серы - сульфата (Kim a. Katayama, 2000). Спецефический фермент, выделенный из Т. thioparus THI 115, был назван тиоцианатгидролазой (Katayama et.al., 1992). Он состоял из трех различных субъедениц: а (19 кДа), Р (23 кДа), у (32 кДа).

Алкалофильные изоляты отличались друг от друга скоростью роста на среде с SCN". Штаммы, выделенные из Кенийских содовых озер, деструктировали SCN" в концентрации 11 мМ за 10 дней, а штаммы, выделенные из Сибирских озер - 10 мМ SCN"3a 18 дней.

При росте этих бактерий на тиосульфате и тиоцианате образовывалась элементная сера в виде глобул, окруженных мембраной (как у пурпурных серных бактерий). Накопление элементной серы происходило в период активного роста культуры, а в стационарной фазе роста она на 90% окислялась долсульфата. Константа сродства к SCN", S2O3HS" и CS2, измеренная по дыханию клеток при рН 10.0, была соответственно 25, 7, 5, 350 jiM. У штамма растущего на тиоцианате в качестве источника азота и энергии (ARh 1) оптимум рН был между 9 и 10. Оптимум рН для окисления тиосульфата был ниже, чем для других субстратов. Дыхательная активность со всеми серными субстратами была ниже при рН < 7,5 и рН > 11,5. Присутствие 0,4 - 0,5 М общего Na+ было необходимо для достижения максимальной дыхательной активности клеток, однако, 1М NaCl ингибировал активность окисления тио-цианата на 50%, а 2 М - ингибировали полностью. NH3 в концентрации до 10 мМ, не влиял на скорость тиоцианат- зависимого потребления кислорода при рН 10. CN" полностью блокировал окисление SCN" при концентрации 100 цМ. Данные бактерии были способны расти при 30 мМ тиоцианата, а утилизировать могли не более 10-15 мМ. рН профиль для окисления тиоцианата был самый узкий по сравнению с другими серными соединениями - 9-10 (7.5 -11.5- для других серных соединений).

Штаммы алкалофильных бактерий, использующие тиоцианат в качестве источника азота (ALRh) не выделяли в среду никаких промежуточных азотных соединений, что свидетельствовало о том, что весь азот ассимилировался. Штаммы, которые помимо источника азота использовали SCN" как источник энергии, ассимилировали его не полностью. Максимально 20 % NH3 из деструктированного тиоцианата использовалось для ассимиляции и выделения в среду (Sorokin et al., 2001). Часть аммония при щелочном значении рН 10 улетучивалось. В этом случае образование промежуточных продуктов имело место и наиболее вероятным, по мнению автора, промежуточным продуктом был цианат, поскольку он был стабилен в щелочных условиях (в отличие от COS). Цианат удалось обнаружить при подкислении среды в форме аммония. Цианазная активность была обнаружена только у штаммов, использующих SCN" в качестве источника азота.

Для вида алкалофильных сероокисляющих бактерий Thioalkailivibrio tio-cyanodenitrificans Сорокиным Д.Ю. была показана возможность окисления тиоцианата за счет денитификации нитрата в анаэробных условиях (Sorokin et al., 2004). Промежуточным продуктом деструкции тиоцианата был цианат, который также как и в аэробных условиях транформировался в аммоний исо2.

Деструкция SCN" в гетеротрофных условиях.

В настоящее время известно не так много гетеротрофные микроорганизмов, способных к деструкции тиоцианата. Они, как правило, выделены из образцов загрязненных промышленных стоков (Betts et al., 1979; Hung a. Pav-lostathis, 1997) или активного ила, используемого для очистки стоков коксохимической промышленности (Pandey et al., 1991).

При гетеротрофной ассимиляции тиоцианата, он используется в качестве источника азота и/или серы. Известен ряд штаммов, ассимилирующих тиоцианат: P.stutzeri (Stafford, Callely, 1969; Baneijee G. 1996), Arthrobacter sp. (Betts et al., 1979), Nocardia sp. (Baneijee G. 1996), Halomonas sp. (Sorokin et al., 2001), как источник азота. Штамм Neisseria meningitides был способен использовать тиоцианат только как источник серы (Port et al., 1984).

Наиболее детально исследован путь деструкции тиоцианата у гетеротрофных бактерий на примере почвенного штамма 26В, предварительно отнесенного к P. fluorescens (Stratford et al., 1994). Штамм был способен к росту на синтетической среде с глюкозой (9мМ) и 3 мМ KSCN в качестве источника азота. 3 мМтиоцианта утилизировались за 12 часов. Культура была способна к деструкции до 100 мМ SCN. При этом в культуральной жидкости не было зафиксировано образование аммония, нитрата, нитрита, цианида или цианата, по-мнению авторов, азотная составляющая тиоцианата полностью утилизировалась, но при этом не сообщается ничего о количестве потребленного источника углерода.

Также в среде не были обнаружены серосодержащие газы, присущие авто-трофной ассимиляции тиоцианата, включая карбонил сульфид. В присутствии ЗмМ аммония культура была способна использовать тиоцианат только в качестве источника серы.

В опыте с целыми клетками штамма 26В, отобранными в экспоненциальной фазе роста и ресуспендированными в фосфатном буфере (50мМ, рН 7.4) при добавлении тиоцианата (ЗмМ) удалось обнаружить аммоний (2мМ). При этом если культура предварительно была выращена на среде, содержащей аммоний, то никакой утилизации тиоцианата не происходило и аммоний не образовывался.

Также было подтверждено с KS14CN образование С02 в качестве конечного продукта деструкции. При этом 14С не был связан с биомассой.

В качестве серосодержащих продуктов деструкции тиоцианата в среде были обнаружены тетратионат и тиосульфат. Бактерии были способны образовывать из тиосульфата (3.8 мМ) тетратионат (2.0 мМ). Тетратионат бактерии были не способны потреблять. При концентрации 5мМ тетратионат не ингибировал потребление тиоцианата (ЗмМ).

Физиологическая функция образования тетратионата штаммом 26В в работе не была выяснена. Возможно, по мнению авторов, он был лишен фермента, осуществляющего превращение тетратионата в сульфат. Также авторы предположили о возможном ингибировании тиоцианатом окисления тетратионата, как в случае Т. tepidarius посредством рассеивания трансмембранного потенциала, которое наблюдали Ли и Келли в 1988 (Stratford et al., 1994). Stratford (1992), Сорокин Д.Ю. (2002) с соавторами отмечают связь деградации тиоцианата с активностью цианазы в микроорганизмах, что указывает на то, что процесс идет через образование цианата, который до сих пор не удается зафиксировать при гетеротрофной ассимиляции тиоцианата.! росс!!!1С;;ЛЯ("О С Д VC"-'.;:;;,Для штамма 26В (?. fluorescent) модель пути деструкции тиоцианата в гетеротрофных условиях была представлена следующим образом (Stratford et al.,1994):Н20 н2о1 1 4HSCN -► 4HOCN->4C02 + 4NH3I14 S2"I12 S2032' 1S4062'Способы очистаи промышленных стоков от цианидов и тиоцианатов.

Циан- и тиоцианат содержащие промышленные стоки в основном образуются при работе коксохимических производств и золотоизвлекательных фабрик, перерабатывающих сырье по цианидной технологии. При цианировании золотосодержащего сырья в растворе помимо простых ионов цианида могут присутствовать, в зависимости от минерального состава концентратов, ряд комплексных соединений, характеристика которых приведена в таблице 7.

Таблица 7. Цианистые соединения в стоках золотоизвлекательных фабрик.

Свободные и простые ионы Слабые комплексы Средние комплексы Прочные комплексыCN" Zn(CN)/' Cu(CN)32" Au(CN)2"HCN Pb(CNy* Cu(CN)42" Fe(CNVCNO' Ni(CN)42" Fe(CNV"SCN" Ag(CN)2" Co(CNy Hg(CN)/"Химические.

Разработано около 20 различных методов очистки промышленных цианид содержащих стоков. В настоящее время применяются в основном химические методы, которые имеют существенные недостатки, связанные с высокими затратами на реагенты и образованием в свою очередь других токсичных соединений.

Щелочное хлорирование самый дешевый распространенный из химических способов. Он заключается в окисление цианидов и тиоцианатов в щелочной среде (рН 11.5) хлором или гипохлоритом до цианата, а затем до С02 и N2:1. CN" + СЮ" —> CNO" + СГ2. CNO" + ЗСЮ" + Н20 N2 + 2С02 + ЗС1" + 20Н"Способ позволяет достичь при очистке предельно допустимых значений по цианиду и тиоцианату - 0.05 мг/л. Недостатками данного способа является то, что остаточное содержание хлора после обезвреживания составляет 15 -300 мг/л и превышает ПДК (0.5 мг/л). Также к недостаткам способа можно отнести высокую стоимость реагента, его агрессивность и образование токсичных хлорорганических соединений в процессе обезвреживания.

Вторым способом по частоте применения является диоксид - воздушное окисление в присутствии ионов меди (метод «Инко») (патент США, №424537686). Он заключается в окисление цианидов и металлцианидных комплексов сернистым газом (SO2) или растворенным сульфитом соли (например, метабисульфит натрия) в присутствии воздуха и ионов меди (C11SO4) до цианата в щелочной среде (рН 10.4):аэрацияNa2S205 + 02-> Na2S04 + S022+аэрация, СиCN- + S02 + Н20 CNO" + H2S04Степень обезвреживания составляет 97 - 99%, однако ПДК по цианиду не достигается (остаточная концентрация цианида - 1-5 мг/л) и тиоцианаты не безвреживаются.

Также известны другие способы деструкции CN" такие как: высокотемпературный гидролиз цианида, кислотная обработка (возгонка цианидов), адсорбционный способ и осаждение водонерастворимых цианидных комплексов. Все эти способы также имели свои недостатки (таблица 8).

Таблица 8. Химические способы обезвреживания циансодержащих стоков.

Название способа Описание НедостаткиЩелочное хлорирование Окисление цианидов и тиоцианатов в щелочной среде (рН 11.5) хлором или гипохлоритом до цианата, а затем до С02 и N2. Позволяет достичь предельно допустимых значений по цианиду и тиоцианату - 0.05 мг/л. Остаточное содержание хлора 15-300 мг/л превышает ПДК (0.5 мг/л). Высокая стоимость реагента, его токсичность. Образование токсичных х: ческих соединений.

Диоксид-воздушное окисление (S02) в присутствии Окисление цианидов и металлциа-нистых комплексов сернистым газом или растворенным сульфитом соли (например, метабисульфит натрия) Не позволяет достичь ПДК по цианиду. Тиоцианаты не обезвреживаются.ионов меди, (метод «Ин-ко») в присутствии воздуха и ионов меди до цианата в щелочной среде (рН 10.4) Степень обезвреживания 97- 99%.

Осаждение водонераство-римых циа-нидных комплексов Осаждение комплексов цианидов железа сульфитами, бисульфитами, тио-сульфитами щелочных металлов с введением ионов цинка, осаждение с введением ионов меди, соединений марганца. Низкая эффективность обезвреживания.

Кислотная обработка (возгонка цианидов) Разложение цианидов в концентрированной серной кислоте или обработка циансодержащих стоков фосфорной кислотой в присутствии перекиси водорода. Высокая стоимость реагентов и агрессивность среды.

Адсорбционный Очистка растворов от циан-иона на сильноосновном анионите АВ-17 в ОН-форме, предварительно на 15л 40% переведенном в SO4 ' форму. Загрязнение смолы цианистыми комплексами.

Микробиологические.

Сообщество микроорганизмов было иммобилизовано на пластиковых вращающихся дисках на 40% погруженных в воду в бетонных желобах. Установка состояла из двух частей, включающих 24 контактора для деструкции CN" и SCN" и 24 контактора для последующего окисления аммиака. Результаты по биоочистке стоков приведены в таблице 9.

Таблица 9. Сравнение параметров промышленных стоков рудника в Home-stake (Whitlock & Smitt, 1989).

Растворы SCN", мг/л Общий CN", мг/л Слабо диссоциированные в кистоте CN", мг/лВходящий раствор 62,0 4,1 2,3Выходящий раствор <0,05 0,07 0,02ПДК* (США) 1,0 0,1 0,13Примечание. * - предельно допустимые концентрацииВидно, что очистка сточных вод от цианидов и тиоцианатов происходит до концентраций, которые ниже допустимых в США норм.

Из активного ила данных очистных сооружений был выделен штамм P. paucimobilis mudlock АТСС 39204, который был способен к деструкции концентраций цианидов (5-15 мг/л), металлцианидных комплексов и тиоцианата (20- 100 мг/л) в составе смешанной культуры до нитратов и сульфатов (Whitlock, 1992 - патент). В среду добавляли фосфаты кальция, необходимые для роста, растворенной в стоках органики было достаточно для снабжения культуры источником углерода и энергии.I IДругим примером биоочистки стоков коксохимического завода может служить работа Wong-Chong (1989). Он проводил биодеградацию цианидов и тиоцианатов в сложных промышленных сточных водах в реакторах в периодической и непрерывной культуре с подачей воздуха и с перемешиванием. Цианиды и тиоцианаты были деградированы до концентрации менее чем 0,1 мг/л. Однако, уже в первом реакторе рН снижался с 9.5-10.5 (исходный) до 6,8 - 7,1, а содержание цианида - с 182 до 0,1 мг/л. Это могло произойти вследствие улетучивания цианида (рН около 7,0) (таблица 1), т.к. процесс проводился с аэрацией воздухом.

Подтверждением негативного влиянии аэрации среды и использования при детоксикации искусственных сточных вод глюкозы (в качестве источника углерода и энергии для микроорганизмов), может служить единственная работа, проведенная Gaudy с соавторами (1982)(Gaudy, etal., 1982), однако они использовали низкие концентрации цианида (около 10 мг/л), и не рассматривали влияние рН на уд аление цианида из среды.Gomez et al. (1995) использовал для деструкции цианидов грибы Aspergillus niger в растворах золотодобывающей фабрики. Исходное содержание цианида составляло 181.62 мг/л, в раствор добавляли 1 % глюкозы, 0,5 % пептона и ряд солей, результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10. Деструкция цианидов и удаление металлов при ростq Aspergillus niger в промышленных стоках.

Изучаются возможности детоксикации цианидов и тиоцианатов с использованием не растущих бактериальных культур и их биомассы, а - очищенных ферментов, ответственных за деструкцию этих соединений. К таким примерам можно отнести деструкцию цианида препаратом на основе цианидазы (гранулированная форма - частицы > ЮООцм; 0,8г), предложенный Basheer S. с соавторами (1991). Данный фермент характеризуется высоким сродством и стабильностью при высоких концентрациях цианида. Цианид может быть удален до очень низких концентраций (< 0,02 при исходной -11,53 ммоль/л. Деструкция цианида проходила до формиата и аммония в одну реакцию. Авторы отмечают, что формамид при этом не образовывался, что было показано при помощи спектрофотометрических и газ-хроматографических методов.

Способ, заслуживающий внимания, описан Oudjehani К., Zagury G.J. и Deschenes L.(2002). Авторы исследовали потенциал автохтонной микрофлоры из хвостохранилищ (старых -6-9 лет и свежих - 3 месяца) по деградации цианида. В работе определяли общее содержание гетеротрофных цианид-резистентных бактерий в образцах хвостов (твердые). В старых образцах оно достигало 105 КОЕ/г. В свежих образцах рост бактерий отсутствовал. Однако, когда в исследуемые образцы вносили K14CN (5-10 мг/кг) и определяли его деградацию, то она имела место и в старых образцах (85-100% за 65 дней), и в свежих (83% за 170 дней). Помимо этого наблюдали за естественной убылью общего цианида в старых образцах, которую оценивали по образованию формамида, формиата и аммония в течение 111 дней. Существенных изменений в концентрации общего цианида не наблюдали, что могло объясняться тем, что цианид в них присутствовал в основном в виде комплексов с металлами. Однако по сравнению со стерильными образцами можно было сказать, что биодеградация имела место (таблица 11).

Таблица 11. Концентрация общего цианида (мг/кг) в свежих (BF) и старых хвостах (т:ж=1:2) (АО) в процессе естественной биодеградации. в - стерильный образец.

Время (сутки) 0 4 12 61 96 111Образец АО 2Д 5,6 3,5 4,2 3,8 AOd 2,3 5,4 4,5 4,2 2,9 BF 8,2 7,2 9,3 4,4 2,9 3,8BF" 8,7 8,6 9,2 6,1 8,1 7,3Таким образом, нельзя исключать вклад естественной микрофлоры в процессах обезвреживания циан содержащих стоков. А по возможности находить способы для их активизации.

Авторами было отмечено, что биологическая деструкция цианида, предложенная ими, рентабельна по сравнению с химической в том случае, если не приходится дополнительно обогревать стоки и если они не содержат высоких концентраций цианида (Akcil a. Mudder, 2003).

Комбинированные.

Одним из наиболее интересных подходов в решении проблемы очистки сточных вод от цианидов является перевод их в менее токсичные тиоцианаты или другие менее токсичные соединения с последующим микробным разложением. Некоторые наиболее типичные примеры этих способов представлены в таблице 12.

Таблица 12. Комбинированные бактериально-химические способы деструкции CN" и SCN" в сточных водах и их недостатки.

Проведенный анализ литературных данных о известных в настоящее время микроорганизм ax-деструкторов CN' и SCN' и способах обезвреживания стоков, содержащих цианиды и тиоцианаты позволяет заключить следующее. Имеется достаточно много сведений о микроорганизмах, способных к деструкции цианида. Изучены механизмы его деструкции и ферментные системы, осуществляющие эти процессы. Однако появляются сведения о присутствии различных механизмов деструкции цианида у одного штамма (Kunz et al., 1992). Все это позволяет говорить о том, что в каждом конкретном случае выделения нового штамма микроорганизма мы можем столкнуться с чем-то новым и уникальным. Поэтому для использования микроорганизмов в биотехнологии приобретает огромное значение изучение каждого конкретного штамма, используемого в ней и его изменчивости.

Сведений о микроорганизмах-деструкторах SCN" в настоящее время чрезвычайно мало. Как правило, это представители автотрофов - окислителей других неорганических соединений серы {Т. thioparus, Thv. paradoxus, Thv. tiocyanoxidans), для которых более детально изучены механизмы деструкции тиоцианата, а также ферменты его осуществяющие (Katayama et.all., 1993; Sorokin et al., 2001).

Окисление неорганических соединений серы гетеротрофными микроорганизмами также является хорошо изученным фактом (Сорокин 1991, Сорокин, 2003), однако среди этих соединений, тиоцианат отсутствовал. Имеются единичные работы, которые касаются гетеротрофной деструкции тиоцианата (Sorokin et al., 2001) и ее механизма (Stafford, 1994).

В настоящее время проблема обезвреживания цианид- и тиоцианат содержащих стоков достаточна актуальна, поскольку известные в настоящее время химические способы обезвреживания позволяют решать технологические, но не экологические задачи. Технические и технологические аспекты биологической очистки сточных вод золотоизвлекательной, коксохимической промышленности находятся в стадии разработки или не решены в настоящее время на должном экологическом уровне.

При изучении имеющейся в нашем распоряжении литературы мы столкнулись со сведениями, которые не всегда были достоверны. Многие авторы не учитывали химических свойств цианидов при их микробиологической деструкции, а именно его летучесть при кислых и нейтральных значениях рН, при которых велась подавляющая часть исследований в этой области. Также авторы в своих работах использовали редуцирующие сахара (глюкоза) или вещества их содержащие (например, меласса), которые занижали показатели вклада микроорганизмов в процесс детоксикации CN".

И, конечно, часть исследователей, использующих принудительную аэрацию воздухом, сообщая о способности к деструкции высоких концентрацийцианида микроорганизмами (около 10-30 мМ), при этом отмечали, что потери составляли в условиях эксперимента -50%.

Таким образом, перед нашим исследованием стояли задачи исследовать поведение цианида в конкретных условия наших экспериментов, чтобы решить вопрос о «максимальных концентрациях». Далее учитывая актуальность проблемы экологически безопасного обезвреживания цианид- и тиоцианатсо-держащих стоков, необходимо было выделить микроорганизмы, которые позволяли решить эту проблему в максимально короткие сроки. Такими микроорганизмами, с нашей точки зрения могли быть гетеротрофные бактерии, которые следовало искать в зонах антропогенного загрязнения. Для создания реальной технологии, которая могла бы быть использована при обезвреживании промышленных стоков, необходимо было изучить возможные комбинации химических способов обезвреживания CN- и SCN- с микробиологическими.

Экспериментальная часть. Материалы и методы исследований. Образцы для выделения микроорганизмов.

Штаммы бактерий.

Чистые культуры цианрезистентных штаммов, способных использовать цианиды и тиоцианаты в качестве источника азота получали путем рассева накопительных культур на агаризованные синтетические среды, содержащие в качестве источника азота только CN" или SCN". Из выделенных 100 штаммов бактерий путем селекции на жидкой синтетической среде, содержащей как SCN", так и CN" в качестве источника азота было выделено 3 штамма псевдомонад {Pseudomonas putida шт. 21, Pseudomonas stutzeri шт. 18, Pseudomonas sp. шт. 5), которые были способны как отдельно, так и в составе ассоциации к деструкции цианида и тиоцианата. Для сравнения физиологических, биохимических, и генетических особенностей данных штаммов были взяты типовые штаммы P.putida ВКМ В-2187 (АТСС 12633) и P.stutzeri ВКМ В-975 (АТСС 17588).

В работе по селективному отбору цианид- и тиоцианат-резистентных штаммов были использованы культуры из Российской Коллекции Микроорганизмов: P. aeroginoza, Arthrobacter sp., P.putida, B.polymyxa, B.subtilis и др. (всего 20 штаммов). В работе были использованы следующие штаммы метило-трофных бактерий из коллекционного фонда ИНМИ РАН: Methylobacterium ozganophilum NP-220,Blastobacter viscosusld.

Среды и условия культивирования.

Для выделения, адаптации и культивирования бактерий, способных расти в присутствии CN" и SCN" использовали модифицированную среду №1 (Подольская и др., 1994)(г/л): К2НР04 ЗН20 - 3.0, MgS04 ' 7Н20- 0.5, Na2HC03 -0.3, FeCl3 - 0.01, СаС12 6Н20- 0.01, (NaSCN и KCN вносили дополнительно в различных концентрациях - О-б.Ог/л и 0-70 мг/л соответственно), рН 9.0. В качестве источника углерода использовали сахарозу, лактат или этанол вконцентрации 0.2-2% в зависимости от задач эксперимента. Цианид добавляли в среду после стерилизации. В агаризованной среде использовали 2% агара. Указанную среду применяли для выделения микроорганизмов из образцов с рН 6-8.

Для выделения и культивирования алкалофилов использовали синтетическую среду (г/л) (Sorokin et al, 2001): Na2C03 • ЮН20 - 21.0, NaHC03 - 9.0, NaCl -5.0; MgS04 • 7H20 - 0.3, NaSCN -0.5, K2HP04 • 3H20 - 1.0, KCN - 0.01, лактат калия -2.0, Н20-1л, рН 10.2.

Метилотрофные бактерии выращивали на модифицированной среде Хирша следующего состава (г/л): КН2Р04 - 1.36; Na2HP04 • 12Н20 - 3.3, NaSCN - 1.0, KCN - 0.01, метанол -1.0%, Н20 дистилированная - 1л, раствор микроэлементов - 1 мл, рН 8.0.

Тионовые бактерии культивировали на среде Баалсруда (г/л): Na2S203 • 5Н20 -5.0, KN03 - 2.0, NH4C1 - 0.5, NaHC03 - 1.0, MgCl2 • 6Н20 - 0.5, КН2Р04 - 2.0, FeS04 - 0.01, Н20 - 1 л, рН 7.0. Способность тионовых бактерий использовать тиоцианат проверяли на среде того же состава с добавлением NaSCN (0.5 г/л).

Выделенную ассоциацию гетеротрофных бактерий ([Pseudomonas putida шт. 21, Pseudomonas stutzeri шт. 18), поддерживали на жидкой синтетической среде №1 с ежемесячным пересевом и проверкой CN" и SCN" - деструктирующей активности. Чистые культуры бактерий хранили на картофельном агаре с добавлением тиоцианата (1 г/л).

Определение резистентности к цианидам, тиоцианатам.

Резистентность к цианидам и тиоцианатам чистых культур микроорганизмов определяли методом реплик при культивировании на агаризованных синтетических средах и МПА, а накопительных культур - при культивировании на жидких синтетических средах с концентрацией CN" 10-70 мг/л, a SCN" - 1 г/л. Контролем служили те же среды без CN" и SCN" с добавлением NH4CI (0.5 г/л). CN-резистентность дыхания отобранных устойчивых к CN-иону культур оценивали манометрическим методом в аппарате Варбурга. Использовали клетки в экспоненциальной фазе роста, которые ресуспендировали в среде №1 с сахарозой (1г/л) и CN* 66 мг/л, рН 9.2 до оптической плотности (ОП) = 1.5.

Аналитические методы.

О росте бактерий судили по величине оптической плотности, которую измеряли на фотометре КФК-3 (Россия) при 540 нм (кювета № 3), также методом прямого подсчета под микроскопом. При прямом подсчете брали суспензию клеток (2 мкл), наносили на предметное стекло, накрывали покровным стеклом (1x1 см), заливали края парафином. Клетки подсчитывали в 20 полях зрения под микроскопом ЛЮМАМИ-1 с увеличением (х 90х 2.5х 10). Количество клеток в 1 мл»7суспензии рассчитывали по формуле: Х= 1.22' а' 10 где а - среднее количество клеток в 20 полях зрения.

Содержание микробного бежа в культуральной жидкости определяли по методу Лоури (Lowry, 1951).

Концентрацию цианид-иона в пульпе определяли титрованием с азотнокислым серебром (Гамильтон, 1932), а в растворах - с помощью кристаллического ионселективного электрода КРИТУР (Чехословакия), тип 06-27, на ионо-мере И - 130 (Россия) с использованием калибровочного графика зависимости ЭДС в мВ от концентрации CN". Электрод чувствителен в диапазоне концентраций CN" от 260 до 0.13 мг/л (10"2-5 х 10"6 моль/л). SCN" определяли титрованием с КМГ1О4 (5N) (Гамильтон, 1932) или анализировали колориметрически как ферроцианат (Sorbo, 1957).

Содержание NH4 определяли фенол-гипохлоридным колориметрическим методом (Weatherburn, 1967) или с помощью пленочного ионоселективного электрода Эком-^Ш/ на приборе Анион-41 ОД. Чувствительность электрода находится в диапазоне концентраций NH/ от 1800 до 0.3 мг/л (101-5 х 10 "5 моль/л). Величину рН определяли на иономере И-130.2М.1.

Сульфит анализировали колориметрически как сульфит-фуксин комплекс (Denger at al., 2001). Тритионат, тетратионат, тиосульфат определяли методом цианолиза (Kelly, 1969). Сульфат определяли на жидкостном хроматографе Biotronik LC 500. Сульфид определяли после осаждения как ZnS (Truper & Schlegel, 1964). Этанол определяли на газожидкостном хромото-графе М -3700.

Для определения активности ферментов серного метаболизма использовали бактерии конца экспоненциальной фазы роста. Клетки отделяли от среды центрифугированием в течение 10 мин при 10 000g дважды отмывали свежей средой, не содержащей источника энергии, затем отмывали 0.05 М трис-НС1 буфером, рН 7.4. Разрушали клетки с помощью ультразвука при 22 кГц в буфере в течение 3 мин, по 1 мин с перерывами для охлаждения. Гомогенат центрифугировали 25 мин при 40 ООО g и супернатант использовали для определения ферментов спектрофотометрическим или колориметрическим методами на спектрофотометре "Hitachi 200-20" (Япония).

Сульфитдегидрогеназу (сульфит: цитохром с оксидоредуктаза, КФ 1.8.2.1) и тиосульфатдегидрогеназу (КФ 1.8.2.2) измеряли по восстановлению фер-рицианида при 420 нм или цитохрома с при 550 нм в присутствии сульфита или тиосульфата (Key J.O., Suzuki I., 1977). Аденилсульфатредуктазу (АФС-редуктазу, КФ 1.8.99.2) определяли по восстановлению феррцианида в присутствии сульфита и АМФ (Lyric R.M., Suzuki I.,1970). Роданазу (тиосульфат: цианидсульфо-трансфераза, КФ 1.8.1.1.) измеряли по скорости образования тиоцианата из тиосульфата и цианида (Key J.O., Suzuki I., 1977). Серооксиге-назу (сероокисляющий фермент или сера: диоксигеназа, КФ 1.13.11.18) определяли по образованию тиосульфата из серы в присутствии восстановленного глутатиона и 2,2- дипиридина (Suzuki I., Silver М., 1966). Активность тио-сульфатредуктазы измеряли по образованию сероводорода из тиосульфата в присутствии восстановленного глутатиона и дитиотриэтола (Петушкова Ю.П., Ивановский Р.Н., 1976). Сероводород улавливали фильтровальной бумагой, смоченной 60%-ным раствором КОН, и определяли с диметил-пара-фенилендиамином.

Структуру хромосомной ДНК выделенных и типовых штаммов изучали методом пульс-электрофореза (ПФ) фрагментов, полученных при расщеплении нативной ДНК эндонуклеазой рестрикции Хва I. Методы выделения натив-ной ДНК, ее расщепления, а также условия ПФ были аналогичны описанным для грамотрицательной ацидофильной хемолитоавтотрофной бактерии Acidi-thiobacillus ferroxidans, содержащей в ДНК, как и у Pseudomonas более 50 мол. % G + С (Kondratyeva et al., 1995).

Опыты по электрофорезу в денатуирующем геле (SDS-PAGE) препаратов полипептидов из целых клеток были выполнены с использованием 10% геля (Laemmli, 1970).

Фенотипический анализ.

Анализ ДНК.

ДНК из клеток экстрагировали и очищали общепринятым методом (Marmur, 1961). Определение нуклеотидного состава проводили методом термической денатурации, а уровня гомологии в ДНК - методом оптической реассоциации по Де Лею ре Ley et.al., 1970).

Для проведения ДНК-ДНК-гибридизации в качестве реперных штаммов были взяты типовые штаммы: Pseudomonas jluorescens ВКМ В-894 (АТСС 13525), Pseudomonas mendocina ВКМ В-972 (АТСС 25411), Pseudomonas stutzeri ВКМ В-975 (АТСС 17588), полученные из Всероссийской Коллекции Микроорганизмов,Сиквенс нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК.

Результаты секвенирования полной последовательности 16S рРНК штамма 18 были депонированы в GenBank под номером HAF152596.

Анализ последовательностей гена 16S рРНК.

Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК штамма 18 была выровнена вручную с соответствующими последовательностями группы видов рода Pseudomonas, доступными из последней версии базы данных RNA Database Project. После исключения из анализа позиций выравнивания сравниваемых последовательностей, для которых не все нуклеотиды были определены, сравнивали 1289 нуклеотидов. Построение укорененных филогенетических деревьев исследуемых бактерий с использованием Escherichia coli в качестве внешней группы производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON (Van de Peer & Wachter, 1994).

Результаты и обсуждение.

Скрининг и изучение микроорганизмов, деструктирующих цианиды и тиоцианаты.

Многочисленными исследователями показано, что широкий спектр аэробных микроорганизмов (автотрофные и гетеротрофные бактерии, микрогрибы) проявляют активность в деструкции цианидов и их соединений (Castric, 1975; Dubey a. Holmes, 1995; Pereira et.al., 1996; Watanabe et.al., 1998; Luque-Almagro et.al., 2005). Имеются также сведения об анаэробной деструкции CN" (Fallon et.al., 1991). Однако роль анаэробов в этом процессе изучена слабо. Данных о микроорганизмах, способных к деструкции SCN" мало (Happold et al., 1954; Kim S.J. and Y.Katayama, 2000; Sorokin et al., 2001). Поскольку, конечной целью нашей работы было изучить возможности использования микроорганизмов в реальной технологии очистки промышленных стоков от CN" и SCN" при высоких их концентрациях, то мы пошли не по пути использования известных штаммов и их адаптации к этим токсикантам, а по пути поиска активных и устойчивых штаммов в природе, в зонах антропогенного загрязнения.

Из образцов почв, загрязненных хлорзамещенными бифенилами, обработанных раствором цианида (0.01%); образцов стоков хвостохранилища золо-тообогатительной фабрики; ила содового озера Забайкалья на синтетической среде №1 было выделено 100 штаммов.

Поскольку известно, что микроорганизмы способны выживать даже при концентрации 30 мМ (1300 мг/л) CN" (Luque-Almagro VM, 2005), то скрининг культур, способных к деструкции CNT и SCN" проводили в несколько этапов. Сначала отбирали штаммы, использующие либо цианид (KCN - 100-500 мг/л), либо тиоцианат (NaSCN - 1,0 г/л) в качестве источника азота на агари-зованных средах при рН 8,8. В случае тестирования на МПА, CN" и SCN" добавляли в среду только в качестве ингибиторов (таблицы 13, 14).

Таблица 13. Скрининг штаммов (выделенных и коллекционных) на синтетической среде с цианидом и сахарозой.

Штаммов способных к автотрофному росту на синтетической среде с KCN не было выявлено.

В дальнейшем скрининг был продолжен на агаризованной среде с тиоциа-натом Na и аммония. МПА использовали как контроль среды без токсиканта.

В результате скрининга на агаризованных средах было отобрано 46 штаммов бактерий (48 %), устойчивых к заданным концентрациям цианида и тиоцианата (таблица 15).

Таблица 15. Количество резистентных к цианиду и тиоцианату штаммов бактерий на агаризованных средах.KCN мг/л Количество резистентных штаммов, % МПА Синтетическая среда100 80.0 79.5200 54.0 35.0500 44.0 48.0KSCN мг/л 1000 94.0 79.0В дальнейшем была изучена способность у отобранных штаммов к деструкции SCN (476 мг/л) в жидкой синтетической среде №1 с сахарозой. Опыт проводили в течение 7 суток. У 20 штаммов скорость деструкции была в пределах 29.4 - 68.0 мг/л/сутки (таблица 16). Данные штаммы использовали для дальнейшего скрининга по ингибированию их дыхания цианидом при концентрации 66 мг/л (2.5 мМ/л) с помощью манометрического метода (таблица 17).

В дальнейшем для отбора наиболее активных в деструкции CN* штаммов была использована смешанная культура (штаммы 14 - 20). Адаптацию смешанной культуры начали с концентрации CN" 10 мг/л на синтетической среде №1 с лактатом (1.5 г/л) при рН 9,0. В последующих опытах концентрацию CN' увеличивали постепенно. К каждой концентрации культуру адаптировали в течение 2-х недель (2-3 пересева). Если в начале адаптации культура вырастала и деструктировала 10 мг/л CN" за 4 суток, то адаптированная культура была способна к росту и деструкции 70 мг/л CN" за 2 суток. Видно, что активность деструкции смешанной культуры бактерий с каждым последующим пересевом увеличивалась и достигла 35-36 мг/л сутки. Дальнейшее повышение концентрации цианида не проводили из-за его летучести в условиях эксперимента. Результаты адаптации приведены на рисунке 3.CN, мг/лРис.3. Зависимость скорости деструкции CN" от адаптации смешанной культуры гетеротрофных бактерий к различным его концентрациям в среде.

Адаптированная к CN" культура бактерий была испытана на способность к деградации цианида в образце промышленной сточной воды следующего состава (мг/л): SCN"- 500, CN" - 23, As^ - 60, Реобщ -11.9, Sbo6n< - 0.06, рН 9.0. В качестве органического субстрата был добавлен лактат (1.5 г/л) (таблица 18). Используемый рН раствора и концентрации CN' были достаточны, чтобы цианид находился в ионной форме и не улетучивался. Присутствующие в стоке тяжелые металлы, по-видимому, подавляли бактериальное окисление CN" (по сравнению с синтетической средой скорость окисления уменьшалась в 2 раза (рис. 3).

Таблица 18. Деградация CN" в образце промышленного стока смешаннойкультурой бактерий в присутствии лактата калия, рН 9.0.

Видно, что без органического вещества (вариант 4) бактерии практически не деструктировали SCN" (рис. 4). Наиболее активно тиоцианат деструктировал-ся в присутствии лактата Na (вариант 2) и цитрата Na (вариант 6), полная его деструкция была достигнута за 2 суток. В этих вариантах наблюдался и наиболее активный рост бактерий о чем судили по оптической плотности среды (рис. 5). Лучшие результаты для ассоциации гетеротрофных бактерий были получены на среде с лактатом Na и цитратом Na (476,2 мг/л SCN" за 2 суток).

Таким образом, принятая стратегия скрининга позволила выделить ассоциацию гетеротрофных бактерий, способную к деструкции CN" и SCN" при высоких их концентрациях. Ассоциация гетеротрофных бактерий использует CN" и SCN", как источник азота и не использует, как источник углерода. Поэтому для деструкции CN' и SCN' необходимо было добавлять в среду органические вещества. Следующий раздел нашей работы посвящен изучению бактерий ассоциации.

Характеристика штаммов, входящих в состав ассоциации, деструкти-рующей цианиды и тиоцианаты.

Ассоциация гетеротрофных бактерий, полученная в результате адаптации смешанной культуры к возрастающим концентрациям цианида и тиоцианата, а также к присутствию тяжелых металлов, состояла из нескольких типов клеток, удельное содержание которых в культуре изменялось при переключении с деградации цианида на тиоцианат. На среде с цианидом преобладали мелкие подвижные палочки (1.5-2.0 х 0.4-0.5 мкм), было много подвижных палочек длиной 3-4 мкм, встречались неподвижные палочки толщиной 1 мкм и длиной 5 мкм, а также длинные тонкие палочки (0.5х 5 мкм) (рис. 6).

Рис.6. Ассоциация гетеротрофных бактерий на синтетической среде с цианидом и лактатом.

На среде с тиоцианатом было меньше мелких палочек, преобладали подвижные и неподвижные палочки, средней величины - толщиной 0,5 -1 мкм и длиной 3-5 мкм. В значительно большем количестве, чем на среде с цианидом, присутствовали толстые короткие палочки, образующие конгломераты в слизи (рис. 7).

Рис. 7. Ассоциация гетеротрофных бактерий на синтетической среде с лактатом и тиоцианатом.

При пересеве культуры со среды с тиоциаиатом на среду с цианидом количественные соотношения в популяции менялись, но при этом сохранялось постоянство видового состава. Постоянство видового состава подтверждали как микроскопически, так и путем высева на агаризованные среды, содержащие тиоцианат (цианид не использовали вследствие его летучести на агаризованных средах).

Таким образом, полученная ассоциация штаммов сохранялась при различных условиях, в том числе и не стерильных, когда деструкция цианида и тиоцианата проходила в реакторах на технологических растворах или пульпах. Рассев культуры на агаризованной среде №1 подтвердил микроскопические данные, т.к. было получено 3 типа колоний, которые соответствовали 3 типам культур. Выделенным штаммам были присвоены номера 5, 18, 21.

Штаммы, входящие в ассоциацию различались активностью деструкции CN" и SCN" в чистых культурах. Штамм 21 активнее деструктировал CNT (0.8-1.0 мг/л/ч), чем штамм 18 (0.6-0.7 мг/л/ч). Шт. 5 был малоактивен по отношению к CNT. Активность отдельных штаммов ассоциации по отношению к цианиду представлена в таблице 19.

Таблица 19. Деструкция ОТ штаммами, входящими в состав ассоциации гетеротрофных бактерий, активной в деструкции цианида и его производных на синтетической среде № 1 с лактатом.

Штаммы Концентрация CNT (мг/л) Исходная Конечная Время инкубации, час5 20 15 2430 20 4818 20 4 2430 0 4821 20 1 2430 0 305,18,21 20 0 2430 0 30Из таблицы 20 видно, что наиболее активно деструктировали SCN" штаммы 18 и 21. Они определяли и активность этого процесса в смешанной популяции.

Таблица 20. Деструкция SCN на среде с этанолом чистыми штаммами и смешанной культурой бактерий (время - 1 сутки).

Варианты Содержание SCN", мг/л Количество клеток, ОП рН Исходное Конечное Исходная Конечная Исходный КонечныйШт.5 326,5 272,1 0,02 0,5 8,4 7,9Шг.18 326,5 0 0.04 0,9 8,4 8,0Шт.21 326,5 0 0,05 0,85 8,4 8,2Смешанная культура 326,5 0 0,09 0,92 8,4 8,2Данные, позволяющие охарактеризовать таксономическое положение этих штаммов, приведены ниже (таблица 21).

Таблица 21. Дифференцирующие признаки штаммов 21,18,5 и типовых штаммовP.stutzeri uP.putida.

Признаки P. putida В-2187 т 21 P. stutzeri В-975т 18 Pseudo-monas sp. 5Тип клеточной стенки Гр"-" Гр"-" Гр"-" Гр"-" Гр"-"Размер клеток, мкм 0.5x1.5 0.4x1.5 0.6x3.5 0.5x3.8 0.5x4.0Число жгутиков >1 1 1 1 Флуоресцирующие диффундирующие пигменты + - - - Не флуоресцирующие не диффундирующие пигменты беж. желт. желт.

Морфологические и культуральные признаки. Клетки палочковидные, подвижные, правильной формы (0.4-0.6x1.5-1.8) мкм, с закругленными концами. Окраска по Граму отрицательная, тип клеточной стенки также соответствует грамотрицательному, что было показано в электронно-микроскопических исследованиях (рис.8а). Спор и капсул не образует, монотрих (рис. 86).

Рис. 8. Ультратонкий срез клетки штамма 21 P. putida выращенной на синтетической среде с глюкозой (а) и сканированное изображение клетки (б) (увеличение х 10 ООО). Отрезком показан размер 1 мкм.

На мясопептонном агаре и синтетической агаризованной среде №1 образует светло-серые, матовые колонии диаметром 2-3 мм, с гладкой поверхностью и ровным краем (рис. 9). Флуоресцирующих пигментов не образует.

Рис.9. Колонии штамма 21 P. putida на синтетической среде № 1.

На основании вышеперечисленных признаков штамм 21 был предварительно идентифицирован как штамм вида Pseudomonas putida.

ДНК-ДНК-гибридизация.

Для подтверждения предварительной идентификации штамма 21 в качестве ре-перного штамма использовали типовой P.putida ВКМ В-2187 (АТСС 12633).

Обнаружен высокий уровень сходства ДНК (92% гомологии) этих штаммов, соответствующий внутривидовому уровню.

Отличительные признаки. В отличие от типового штамма, штамм 21 не образовывал флуоресцирующего пигмента, был не способен к гидролизу желатины и проявлял более высокую активность в биодеградации CN" и SCN" ионов.

Также были обнаружены различия между штаммами по структуре хромосомной ДНК. Штамм 21 отличался от типового штамма P.putida ВКМ В-2187 (таблица 22) (рис. 12) сайтом рестрикции Хва I хромосомной ДНК проанализированного методом пульс-электрофореза (ПФ). Различия в наборе и размере фрагментов, образующихся при расщеплении нативной ДНК, свидетельствуют об изменениях в последовательности нуклеотидов в хромосомной ДНК в процессе штаммовой изменчивости.

Таблица 22. Размеры Хва I фрагментов хромосомной ДНК штаммов P.putida В-2187 и 21. Длина фрагментов представлена в тысячах пар нуклеотидов (т п н) с точностью до 4 т п н.

Штамм 21 Штамм В-2187327 327- 301265 265226 - 211- 200190 190180 180- 167Примечание: «-» - фрагмент отсутствует.

Рис. 10. Образцы Хва I рестрикции хромосомной ДНК штаммов P.putida: 21 (дорожка 1), ВКМ В-2187 (дорожки 2 и 3) и реперного ВКМ В-458 (дорожка 4).

Диагноз штамма. На основании сравнения морфолого-культуральных, физиоло-го-биохимических и молекулярных признаков штамм 21 отнесен к виду Pseudomonas putida.

Штамм 18.

Морфолого-культуральные признаки. Клетки палочковидные, подвижные, правильной формы (0.5-0.7x3.8-4.0) мкм, с закругленными концами. Окраска по Граму отрицательная, тип клеточной стенки соответствует также грамотрица-тельному типу. Образует капсолу, спор не образует (рис 11а). Монотрих (рис. 116).а)б)Рис. 11. Ультратонкий срез клетки штамма 18 P.stetzeri, выращенной на синтетической среде с глюкозой (а), сканировано изображение клетки (б) (увеличение х 10 ООО). Отрезком показан размер 1 мкм.

На мясопептонном агаре и синтетических средах образует тем но-желтые колонии, складчатые, с неровным краем, диаметром 5-8 мм (рис. 12).

Рис. J 2. Колонии клеток штамма 18 P. stetzeri, выращенной на синтетической среде № 1.

Флуоресцирующих пигментов не образует. Образует желтый внутриклеточный пигмент.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотроф, микроаэрофил, каталазо- и оксидазоположительный. Желатину не гидролизует. Крахмал гидро-лизует. Проявляет аргинингидролазную активность. Активный денитрифи-катор. Способность к азотфиксации отсутствует.

Полученные данные указывают на принадлежность штамма 18 к родуPseudomonas, однако, не позволяют провести идентификацию до вида, т.к. данный штамм был близок к 2-м видам рода Pseudomonas (P.stutzeri и P.mendocina). Для уточнения диагноза был секвенирован ген 16S рРНК, и на этой основе проведено филогенетическое маркирование выделенного штамма. Для штаммов 5 и 21 не было необходимости в проведении этого анализа.

Анализ гена 16S рРНК. Была определена почти полная последовательность гена 16S рРНК штамма 18 (1493 нуклеотида), что соответствовало позициям с 15 по 1512 по номенклатуре E.coli. Филогенетический анализ свидетельствовал о том, что изучаемый штамм относится к g-подклассу протеобакгерий, а более точно — к филогенетической группе, объединяющей большинство видов рода Pseudomonas, обнаруживая с представителями этой группы уровень сходства последовательностей 16S рРНК в пределах 94.6— 99.6%. Внутри группы штамм 18 был наиболее близок к представителям вида P.stutzeri (96.8—99.6% сходства последовательностей). На филогенетическом дереве (рис. 13) штаммы вида P. stutzeri составляли несколько кластеров, что подтверждало данные о генетической гетерогенности этого вида (Bennasar et.all.,1996). Изучаемый штамм 18 входил в филогенетический кластер, содержащий типовой штамм P.stutzeri (геномовар I). Уровень сходства последовательностей штамма 18 и типового штамма P. stutzeri (99.6%) был достаточно высок, чтобы отнести его к этому виду (Stackebrant a. Goebel, 1994).

0.05V4UKlP. stutzeri ATCC 17589- Штамм 18P. stutzeri ATCC 17588 (T)- P. fragi I AM 12402 if P. stutzeri DSM 6082- P. stutzeri I AM 12668- P. stutzeri ATCC 17832100P. balearica DSM 6083<001001 P. Stutzeri str. LS40I P. stutzeri str. AN 10 Г. stutzeri ATCC 11607 P. stutzeri str. AN 11 P. stutzeri str. ST27MN3 P. stutzeri DSM 6084 P. stutzeri ATCC 14405 P. stutzeri ATCC 17587 P. stutzeri ATCC 17591— P. oleo varans IAM 1508P. mendocina ATCC 254U (T) — P. putida 1AM 1236P. fla vt'sccns NCPPB 3063 — P. aeruginosa ATCC 10145 (T)• P. nitroreducens IAM 1439УЧ: P. tyriagae ATCC 19310 (T)— P. aweofaciens IAM 12353— P wfaasii ATCC 33618r— P.fluorescens ATCC 13525 (T)Escherichia eo/iРис. 13. Филогенетическое дерево, показывающее положение штамма 18 среди представителей рода Pseudomonas. Корень определен включением последовательности Е. coli в качестве внешней группы. Масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов (эволюционным расстояниям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap''-анализа 100 альтернативных деревьев; значения менее 90% не указаны.

Согласно общепринятым требованиям в настоящее время для видовой идентификации необходимо подтверждение родства на основании определения гомологии ДНК (Wayne et.all.,1987). На основании данных анализа последовательностей гена 16S рРНК в качестве реперных штаммов для проведения гибридизации ДНК-ДНК нами были выбраны наиболее близкие филогенетически и исследуемому штамму типовой штамм P.stutzeri (АТСС 17588), типовой штамм представителя нефлуоресцирующей подгруппы псевдомонад P.mendocina (АТСС 25411), а также типовой штамм представителя другой подгруппы флуоресцирующих псевдомонад - P. jluorescens (АТСС 13525).

ДНК-ДНК-гибридизация. Результаты ДНК-ДНК-гибридизации штамма 18 и реперных штаммов показали 35% гомологии с P.mendocina (АТСС 25411), 42% гомологии с Р.Jluorescens (АТСС 13525) и 95% гомологии с ДНКP.stutzeri (АТСС 17588).

Уровень сходства тотальных последовательностей ДНК штамма 18 с ДНК типового штамма P. stutzeri был достаточно высоким, чтобы считать их представителями одного вида (Wayne et.all.,1987), а уровень сходства ДНК с ре-перными штаммами видов P.mendocina и P.jluorescens соответствовал межвидовому.

Диагноз штамма. На основании сравнения морфолого-культуральных, физио-лого-биохимических признаков, а также данных молекулярного анализа штамм 18 отнесен к виду P. stutzeri.

Отличительные признаки. В отличие от типового штамма P.stutzeri штамм 18 образовывал желтый пигмент неидентифицированной природы, обладал ар-гинингидролазной активностью, в качестве источника углерода использовал также трегалозу. В отличие от типового штамма активно рос на среде с тиоцианатом в качестве единственного источника азота.

Штаммовые различия были также обнаружены при изучении структуры хромосомной ДНК у штамма 18 и типового штамма В-975 (АТСС 17588)(таблица 23)(рис. 14) методом пульс-электрофореза. Отличия, как и в случае отселектированного шт.21 были в наборе и размере фрагментов ДНК.

Таблица 23. Размеры Хва I фрагментов хромосомной ДНК штаммов P.stutzeri В-975 и 18. Длина фрагментов представлена в тысячах пар нуклеотидов (т п н) с точностью до 4 т п н.

Штамм 18 Штамм В-975310 310- 276- 235208 200 200177 177167 148 148133 - 122Примечание: «-» - фрагмент отсутствует.

Рис. 14. Образцы Хва I рестрикции хромосомной ДНК реперного штамма ВКМ В-458 (дорожка 1) и штаммов P.stutzeri 18 (дорожка 2) и ВКМ В-975 (дорожка 4).

На основании совокупности полученных данных штамм 5 был идентифицирован до рода и отнесен к роду Pseudomonas. Поскольку этот штамм не представлял для целей работы большого интереса (был малоактивен в отношении деструкции цианидов), то его идентификации до вида не проводили.

Таким образом, проведенные исследования показали наличие в экотопах, загрязненных цианидами, тиоцианатами и хлорзамещенными бифенилами, бактерий, деструктирующих CN" и SCN" при высоких их концентрациях. Наиболее активные деструкторы CN" и SCN* принадлежали к роду Pseudomonas.

Кинетические параметры роста и деструкции CN" и SCN" ассоциацией гетеротрофных бактерий.

Немикробиологическое удаление CN" (улетучивание из средыУИз данных, приведенных в литературном обзоре, трудно понять вклад микроорганизмов в деструкцию CN" из-за отсутствия достоверных контролей, т.е. оценки улетучивания CN" в его протонированной форме HCN при рН<9.0 Основной сложностью в работе с цианидами являются их высокая летучесть в диапазоне рН, наиболее благоприятном для роста большинства микроорганизмов-деструкторов CN" (рН 7.0-8.0). Тем более что различные авторы в своей работе использовали аэрацию среды и/или ее перемешивание. Кроме этого, цианиды способны к взаимодействию с редуцирующими сахарами, часто используемыми как источник углерода (глюкоза). Можно утверждать, что большинство авторов имело дело не с исходной концентрацией CN" в среде, а с более низкой, различной в зависимости от условий культивирования. Очевидно, эта концентрация не могла превышать 10 мг/л в растворе при рН 7-8 даже в статических условиях. Различные же авторы сообщали об использовании 100 и даже более мг/л CN" (Babu et. al.,1993; White et.all.,1988). Все это артефакты.

Поэтому мы выяснили поведение CN" в реальных условиях проведения опытов при изучении роли ассоциации гетеротрофных бактерий в деструкции CN\С целью определения величин возможных потерь CN", опыты проводили в колбах Эрленмейера объемом 100 мл, содержащих 50 мл раствора, в статических условиях или при перемешивании на магнитной мешалке (800 об/мин), или при продувании воздухом (300 мл/мин) при комнатной температуре. О степени улетучивания цианида судили, анализируя щелочные вытяжки. Результаты анализов представлены в таблице 24. Из таблицы видно, что наиболее активно улетучивание цианида протекало при продувании среды воздухом, затем при перемешивании на магнитной мешалке и с наименьшей интенсивностью - в статических условиях. Различия в исходном содержании CN" в растворах связаны с различными начальными значениями рН среды. Оно максимально при рН 10.6, а минимально при рН 8.7.

Опыты по определению возможных потерь CN' в условиях, которые в дальнейшем предполагалось использовать для испытания бактериальной деструкции цианидов, проводили в реакторе с механическим перемешиванием в отсутствии бактерий. Результаты представлены в таблице 25.

Таблица 25. Химическая деструкция CN" в реакторе в отсутствии бактерий при различных режимах перемешивания.

2.0 9.2 28-30 136 34 0 200 40 25 300 50 501.3 9.3 28-30 300 54 66.72.0 9.3 28-30 200 + аэрация 50 90Как видно из таблицы 25, в зависимости от скорости перемешивания и аэрации среды, количество CN" удаляемого из среды в отсутствии бактерий, может изменяться от 0 до 90%, а остаточный CN" в опыте, может составлять в зависимости от рН среды от 5 до 34 мг/л. Основная часть CN" при этом про-тонируется и улетучивается в соответствии с известными реакциями:CN" + tT = HCN tСледующие контрольные опыты без бактерий были поставлены в реакторе с механическим перемешиванием при искусственном снижении рН среды до значений, которые получали в ходе экспериментов с бактериальной деструкцией CN".

Опыты проводили в реакторе объемом 3.0 л, в который вносили 2 л среды и перемешивали со скоростью 200 об/мин при температуре 28-30 0 С. Исходное значение рН было 9.2, содержание CN" - 34 мг/л (рис. 15).

Рис. 15. Улетучивание цианида из реактора при принудительном снижении рН среды с 9.2 до 8.8. Стрелкой показан момент снижения рН.

Как видно из рисунка 15, при рН 9.2 за первые 1.5 ч концентрация CN" в среде снизилась до 25 мг/л, затем при искусственном снижении рН до 8.8 содержание CN" упало за последующие 2 ч до 18 мг/л, и в этих условиях концентрация цианида стабилизировалась.

Деструкция CN" ассоциацией гетеротрофных бактерий.

Инокулят, содержащий ассоциацию бактерий P. putida, P. stutzeri, вносили в количестве 10 %. Результаты анализов представлены на рис. 9. За первые 2 ч после внесения инокулята концентрация CN" снизилась до 24 мг/л за счет улетучивания HCN. В дальнейшем за 23 ч культивирования CN" был полностью деструктирован. При этом количество бактерий возросло в 10 раз (ОП изменилась с 0.075 до 0.72). Частично продолжалось, вероятно, и снижение CN" за счет улетучивания HCN, так как в процессе роста бактерий рН был снижен до 8.3.

Рис. 16. Деструкция CN* ассоциацией гетеротрофных бактерий на синтетической среде с лактатом (максимальная удельная скорость роста - 0.12 ч1'). Над кривой, отражающей динамику рН отложены значения рН.

1 - CN", мг/л; 2 - клетки, ОП; 3 - рН.

При сравнении скорости деструкции цианида в синтетической среде ассоциацией бактерий с использованием сахарозы в качестве источника углерода (1 г/л) с синтетической средой с лактатом в качестве источника углерода, оказалось, что эти скорости были близки, и составляли порядка 0.42 мг/л/час. Культивирование проводили в колбах Эленмейера, результаты представлены на рисунке 17.часРис. 17. Деструкция цианида ассоциацией гетеротрофных бактерий на минеральной среде с различными источниками углерода (лактат -1.4 г/л, сахароза -1 г/л):1 - контроль, среда с лактатом; 2 - контроль, среда с сахарозой; 3 - среда с лактатом; 4 - среда с сахарозой.

При использовании концентраций цианида выше 30 мг/л наблюдали снижение скорости роста культуры. Так, максимальная удельная скорость роста бактерий снижалась с 0.07 ч"1 (30 мг/л CN") до 0.02 ч"1 (53 мг/л CN") по мере увеличения концентрации цианида в среде (рис. 19).

При изучении деструкции CN" в пульпах оказалось, что существенным является соотношение твердой и жидкой фазы среды (рис. 20). Как видно из рисунка скорость микробной деструкции CN" снижалась в плотной пульпе (т:ж=1:2) в 2 раза.суткиРис. 20. Деструкция цианида ассоциацией гетеротрофных бактерий в пульпе при различном соотношении твердой и жидкой фаз:1 -т:ж= 1: 10; 2 - т:ж = 1: 8; 3 -т:ж= 1: 2.

Деструкция SCN" ассоциацией гетеротрофных бактерий.

Тиоцианаты как в окружающей среде, так и в технологических процессах образуются при взаимодействии CN" с восстановленными соединениями серы. Две формы серы наиболее активно реагируют с цианидами - полисульфиды и тиосульфат:S х2" + CN" - [S (х.1)]2- + SCN" CN" + S2O32" = SCN" + S032"В стоках золотоизвлекательных фабрик, использующих цианирование, концентрация тиоцианатов может быть достаточно высокой, вплоть до нескольких граммов в литре.

Поскольку целью нашей работы было исследовать деструкцию CN" и SCN' в условиях, приближенных к промышленным, то мы исследовали деградацию токсикантов в стоках как в проточном режиме с использованием биореакторов, так и в плотных пульпах (в биореакторе с отливно-доливным режимом).

Рис.21. Лабораторная установка для бактериальной деструкции CN" и SCN" в непрерывных условиях.

В опытах была использована среда № 1 с лактатом калия (1.2 г/л) и NaSCN(290-1000 мг/л). Источник углерода вносили дробно в каждый реактор в зависимости от скорости протока (один раз при скорости протока 1.4 л/сут; два раза при скоростях протока 1.8 или 2.2 л/сут и 4 раза при скорости протока 3.7 л/сут). Тиоцианат добавляли только в исходную ёмкость. Это позволяло вести процесс до полной деструкции SCN" в непрерывном режиме без лимитации роста сообщества бактерий по углероду во всех реакторах. Без источника углерода бактериальная деструкция SCN" не происходила.

На рисунке 22 представлены результаты опыта типичного эксперимента, из серии опытов, проводимых в течение 3-х месяцев. Как видно из рисунка, при скорости протока 1.4 л/сут за 24 ч в четырех реакторах было деструктировано 1088 мг/л SCN. При увеличении скорости протока до 1.8 л/сут, деструкция полностью была завершена в 5-м реакторе (концентрация сухой биомассы - 0.7 г/л) и исходной концентрации SCN' в среде 918 мг/л. Снижение исходной концентрации SCN" до 609 мг/л, позволило завершить деструкцию за то же время уже в 4-м реакторе (концентрация сухой биомассы - 0.4 г/л) при более высокой скорости протока -2.2 л/сут. При скорости протока 3.7 л/сут полная деструкция SCN" при концентрации 604 мг/л была достигнута за то же время только в 6-м реакторе при 0.7 г/л сухой биомассы в последнем реакторе. Увеличение количества биомассы (0.7 г/л) при более высокой скорости протока (3.7 л/сут) по сравнению с биомассой (0.4 г/л), накопленной при той же исходной концентрации SCN", но при более низкой скорости протока (2.2 л/сут) можно объяснить дробностью внесения лак-тата. При скорости протока 2.2 л/сут и двукратном внесении лактата бактерии испытывали недостаток по углероду по сравнению с четырехкратным его внесением при скорости протока 3.7 л/сут. Ясно, что увеличение концентрации SCN" при скорости протока 3.7 л/сут или дальнейшее повышение скорости протока при данной концентрации потребовало бы удлинения цепи реакторов. При концентрации SCN" 290 мг/л и скорости протока 3.7 л/сут тиоцианат был полностью деструктирован за 24 часа уже в 3-м реакторе при сравнительно низкой биомассе бактерий (0.12 г/л).

Очевидно, что полнота деструкции SCN" в среде в условиях протока в цепи, состоящей из нескольких реакторов, зависела от его концентрации, скорости протока и обеспечения бактерий источником углерода.

Таким образом, максимальной скорость деструкции была при скорости протока 1.4 л/сутки и концентрации тиоцианата 1088 мг/л.

Скорость деструкции тиоцианата в пульпе изучали в периодических условиях и в отливном-доливном режиме в реакторе. В пульпу вносили дополнительно фосфаты (1 г/л) и этанол (4 г/г SCN"). Адаптацию ассоциации начинали при соотношении твердой фазы к жидкой - 1:10. Как и в случае деструкции цианида на плотных пульпах в начале адаптации ассоциации гетеротрофных бактерий не удалось получить высоких скоростей деструкции тиоцианата (5-7 мг/л/час) (рис. 23).

Постепенно уплотняя пульпу удалось получить высокую скорость деструкции в периодических условиях при т:ж = 1:5 - 500 мг/л час (таблица 26). Более высокие т:ж (1:2) культура выдерживала, однако скорость деструкции тиоцианата была не высокой (до 40 мг/л/час).

При использовании отливно-доливного режима была получена максимальная скорость деструкции тиоцианата в пульпе при соотношении твердой и жидкой фазы - 1:2. Опыты проводили в объеме пульпы 1.5 л с перемешиванием (300 об/мин) и аэрацией (600 мл/мин), каждый час заменяли 50 мл (1-ый вариант) или 100 мл (2-ой вариант) пульпы, дополнительно вносили источник углерода (этанол). Количество клеток бактерий ассоциации поддерживао qли на уровне 10 -10. Результаты представлены на рисунках 24, 25.

Рис.24. Деструкция тиоцианата в пульпе после цианирования золота ассоциацией гетеротрофных бактерий в отливно-доливном режиме, скорость смены объемов - 50 мл/час. Биомасса - 108кл/мл, начальный рН 9.1-9.2, конечный рН 8.3-8.5. Стрелкой показан момент добавления пульпы и этанола. 1 - тиоцианат, г/л; 2 - этанол, г/л.

Рис.25. Деструкция тиоцианата в пульпе после цианирования золота ассоциацией гетеротрофных бактерий в отливно-доливном режиме (дробное добавление пульпы (100 мл/час) и этанола(2 г/л)). Биомасса -109 клеток/мл. Начальный рН 9.0-9.2, конечный рН 8.3-8.5. Стрелкой показан момент добавления пульпы и этанола. 1 - тиоцианат, г/л; 2 - этанол, г/л.часПроведенные исследования с использованием различных промышленных стоков и пульп показали высокие возможности для технологического использования выделенной ассоциацией гетеротрофных бактерий (таблица 26).

Таблица 26. Скорость деструкции SCN" ассоциацией гетеротрофных бактерий в периодических, непрерывных условиях и в отливно-доливном режиме.

Периодические условияСреда Исходное содержание Скорость деструкцииSCN-, г/л SCN-, мг/л/часЖидкая 6.0 246синтетическая среда * 1.8 2250.9 554.1 500Пульпа* т:ж=1:5 3.6 4501.6 143т:ж=1:2 0.8 40Непрерывные условия Среда Скорость протока, Скорость деструкциил/сутки мг/л/часЖидкая синтетическая 1.4 45.8среда* 1.8 37.52.2 25.0Отливно-доливной режим Среда Скорость разбавления, Средняя скорость дестл/сутки рукции; мг/л/часПульпа* т:ж=1:2; SCN": 0.3-0.5 г/л 1.2 128.0SCN": 0.8-1.1 г/л 2.4 238,0* - в качестве источника углерода и энергии добавляли этанол.

Была исследована возможность использования альтернативных источников углерода и энергии для деструкции SCN" ассоциацией гетеротрофных бактерий. С этой целью были испытаны: углеводороды, гидролизат древесины, суль-фоэтилцеллюлоза и этанол. Опыт проводили в колбах Эленмейера в периодических условиях на качалке (160 об/мин). Результаты представлены в таблице 27.

Поэтому, при исследовании кинетических, технологических параметров деструкции SCN" в качестве источника органического вещества для бактерий кроме лактата был использован этиловый спирт.

Часть экспериментов по динамике деструкции SCN" проводилось в колбах Эленмейера (250 мл), скорость деструкции в которых была существенно ниже, чем в реакторах, однако, при изучении ряда закономерностей использование их объяснялось удобством эксперимента.

Видно, что при высоких концентрациях SCN" процесс деструкции шел не до конца, лимитирующим фактором был этанол. Подтверждением тому служат данные таблицы 28. Как видно из этой таблицы скорость деструкции SCN" возрастала с увеличением концентрации этанола в среде (с 2.5 до 20 г/л) и достигала 810 мг/л/суг.

Таблица 28. Определение скорости деструкции SCN" ассоциацией гетеротрофных бактерий на синтетической среде № 1 с различным содержанием этанола. Исходное содержание SCN", было одинаковым (820 мг/л).

Содержание Скорость дестэтанола, г/л рукции SCN",мг/л СУТКИ2,5 202,55 202,510 424,015 584,220 810,0Таким образом, для выделенной ассоциации гетеротрофных бактерий, де-структирующей CN" и SCN", наиболее эффективным источником углерода и энергии, является лактат, сахароза и этанол. Важным является оптимальное соотношение источника углерода к тиоцианату для достижения полноты деструкции.

Деструкция CN" и SCN" при их совместном присутствии ассоциацией гетеротрофных бактерий.

В промышленных сточных водах и в пульпах после цианирования золота наряду с цианидами присутствуют также тиоцианаты, причем в концентрациях, в десятки и сотни раз превышающих концентрацию CN". Поэтому важно было изучить закономерности деструкции CN" и SCN" при совместном их присутствии. В опытах была использована ассоциация бактерий, включающая P. putida шт. 21, P.stutzeri шт. 18.

В качестве источника углерода использовали сахарозу, лактат и этанол. При изучении динамики деструкции CN" и SCN" микробной ассоциацией было замечено отсутствие деструкции SCN" в процессе утилизации цианида бактериями. При росте на среде с сахарозой в течение первых 30 ч развития культуры (максимальная удельная скорость роста - 0,21 ч"1) наблюдали потребление цианида при неизменной концентрации тиоцианата. Начиная с 30 ч (после деструкции цианида) концентрация тиоцианата начинала снижаться (рис. 27).

Рис. 27. Деструкция CN" и SCN" на синтетической среде с сахарозой (1%) ассоциацией гетеротрофных бактерий: 1 - CN", мг/л; 2 - SCN", мг/л; 3 - биомасса, мг/л.

Деструкция CIST и SCN" протекала быстрее, если в качестве источника углерод а и энергии использовали лактат. В периодической культуре на синтетической среде №1 с лактатом калия (4 г/л) также было показано, что вначале деструктировался цианид, и только после его утилизации начиналась деструкция SCN" (рис. 28), аналогично тому, как это наблюдали на среде с сахарозой.

Рис.28. Деструкция CN" и SCN" ассоциацией гетеротрофных бактерий на синтетической среде с лактатом: 1 - CN", мг/л; 2 - SCN'Mr/л.

Количество утилизированного SCN" находилось в прямой зависимости от концентрации источника углерода (лактат - рис. 29).SCN, мг/лРис. 29. Зависимость деструктированного ассоциацией гетеротрофных бактерий SCN" от начальной концентрации лакгата.

Расчеты показали, что на деструкцию 1 г/л SCN" требуется около 6.7 г/л лак-тата.

Аналогичные закономерности деструкции CN" и SCN" наблюдали в пульпе (при отношение твёрдой фазы к жидкой т:ж= 1:2- рис. 30, при т:ж=1: 4 - рис. 31). В качестве источника углерода был использован этанол.

Рис.30. Деструкция ОТ и SCN" в пульпе (т:ж=1:2) с добавлением фосфатов (3 г/л) и этанола (2%) ассоциацией гетеротрофных бактерий в реакторе с механическим перемешиванием.

Рис.31. Деструкция CN* и SCN" в пульпе (т:ж=1:4) с добавлением фосфатов (3 г/л) и этанола (2%) ассоциацией гетеротрофных бактерий в реакторе с механическим перемешиванием.

Вероятными причинами столь ярко выраженной двухфазности процессов бактериальной деструкции CN" и SCN" является то, что: 1 - CN" является более доступным источником азота, чем тиоцианат (NNC-S") для бактерий ассоциации; 2 -возможно, что цианид ингибирует первичный фермент гидролиза SCN", который разрушает C-S связь.

Рис. 32. Рост ассоциацией гетеротрофных бактерий на синтетической среде с SCN" и этанолом в реакторе при механическом перемешивании (150 об/мин). 1 - этанол, %; 2 - тиоцианат, г/л; 3 - количество клеток, ОП.

Таким образом, на деструкцию цианида и тиоцианата при их совместном присутствии оказывали влияние концентрация и вид источника углерода и энергии, режим аэрации. Полученные результаты были использованы в дальнейшей работе по созданию технологии обезвреживания промышленных стоков от цианидов и тиоцианатов.

Механизм деструкции CN' и SCN" штаммами ассоциации гетеротрофных бактерий.

Механизмы деструкции цианида достаточно хорошо известны. Для псевдомонад было показано, что данный процесс осуществляется тремя ферментами: цианидмонооксигеназой (до CNO"), цианиддиоксигеназой (до NH3 и С02) и цианидазой (до NH3 и НСООН) (Dubey S.K. a. Holmes D.S. 1995).

В опытах с отмытой биомассой как для ассоциации, так и для отдельных штаммов P. putida шт.21 и P.stutzeri шт. 18 было показано образование NH3,образование формиата при этом отсутствовало. Таким образом, мы предположили следующий механизм деструкции CN": CN" + II20-> NH3 + С02.

Полученные нами данные согласовывались с полученными ранее (данная реакция осуществляется под действием фермента цианиддиоксигеназы) (Harris a. Knowles, 1983а).

Механизм деструкции SCN" являлся менее изученным для гетеротрофных бактерий. Поэтому основное внимание в работе было уделено исследованию механизма деструкции именно этого токсиканта.

Согласно литературным данным, использование тиоцианата гетеротрофными микроорганизмами сводится к использованию его как источника азота и некоторые исследователи предполагают, что идет по пути цианата (SCN" —> CNO" —> NH3) (Stafford J., et al., 1994). Серная часть SCN" окисляется либо доЛтетратионата (Stafford J., et al., 1994), либо до SO4 " через HS" ион (Murrell J.С., 1993). Однако в ходе наших исследований в качестве конечного продукта окисления тиоцианата сульфат не был обнаружен.

В процессе деструкции SCN" в культуральной жидкости не были обнаружены NH3, NH,+ и CNO", независимо от фазы роста у обоих штаммов. В опытах с отмытой биомассой без источника углерода при внесении SCN" в буферной среде (рН 8.8) при аэрации (перемешивание) удалось зафиксировать образование NR,+.

Рис. 34. Деструкция SCN" шт. 18 P.stutzeri в процессе роста на синтетической среде с этанолом в присутствии альтернативных источников азота (NH4CI -18,5 мМ (1 г/л); NaN03 - 5,9 мМ (0,5 г/л)): 1 - SCN, мМ; 2 - SCN + N03\ мМ; З-SCN + NH/, мМ.

В анаэробных и микроаэрофильных условиях деструкция SCN' отсутствовала.

Чтобы оценить возможные пути утилизации SCN" как источника азота была изучена цианазная активность штаммов. Фермент цианаза (ЕС 4.3.99.1) разрушает цианат до NH4+ и СО2.

Клетки выращивали на среде с тиоцианатом - 8,6 мМ (0,5 г/л) до конца экспоненциальной фазы роста. Активность цианазы определяли в бесклеточном экстракте в буфере (фосфатный, карбонатный) при различных рН (7,0; 8,1; 9,1). Максимальная активность цианазы у штаммов 18 и 21 была получена при рН 8,1 (фосфатный буфер) - 1.26 и 0.75 мкмоль/ мин мг белка соответственно и зависела от концентрации НСО3 (Ks=2 мМ). При рН 7 фермент был не активен, при рН 9,1 активность фермента составляла 15,8 % от максимальной. При выращивании культуры на среде с аммонием в качестве источника азота, цианазная активность отсутствовала, что говорило о индуцибель-ности данного фермента у штаммов ассоциации.

Электрофорез в денатурирующем геле общего белка из клеток, выращенных на среде с различными источниками азота (NH/, CNO", SCN"), показал наличие специфических полос на среде CNO" (26,5 kDa и 25 kDa) и SCN" (22,2 kDa), которые коррелировали с присутствием цианазной и тиоцианат-гидролизующей активностью штамма (рис. 35). Что также косвенно может служить подтверждением цианатного пути деструкции SCN". Так на среде с SCN" также присутствовали полоски, соответствующие белкам 26,5 и 25 kDa, которые были характерны для белкового профиля на среде с циана-том.

Рис. 35. Электрофорез в денатуирующем геле общего белка P.stutzeri на среде с различными источниками азота (NH4C1, KCNO, KSCN).

Следовательно, можно допустить, что, как и при деструкции SCN", как источника азота другими бактериями, в качестве промежуточного продукта образуется цианат (CNCT), который трансформируется до NH^ и С02 с помощью цианазы:SCN" CNO" + HS" | цианаза NH4+ + С02Как уже отмечалось выше, NH4+ не был обнаружен в среде при росте бактерий. Возможно, что он метаболизировался бактериями полностью. Улетучивание NH3 при рН 9.0 могло составить не более 20 %.(Smith а. Mudder, 1991).

При использовании среды с тиосульфатом (в качестве источника серы и субстрата для окисления) и аммония (в качестве источника азота), убыль тиосульфата была сравнима с его потреблением штаммом P.stutzeri в качестве источника и прекращалась после фазы активного роста культуры (рис. 38). Дальнейшего окисления тиосульфата P.stutzeri не происходило.

0,0—I— 1020—i— 304050часРис. 38. Рост P.stutzeri на среде с тиосульфатом - 4 мМ (450 мг/л) и NH4 С1 -18,5 мМ (1 г/л): 1 - тиосульфат, мМ; 2 - клетки, IgN. В качестве источника углерода использовали этанол (0,43 М, 20 г/л).

Штамм P.putida был способен к окислению тиосульфа в ходе роста на аналогичной среде (рис. 39).часРис. 39. Рост P.putida на синтетической среде с тиосульфатом (4 мМ) и NH4CI (18,5 мМ), в качестве источника углерода использовали этанол (0,43 М).

При переходе роста в стационарную фазу у 21 штамма (P.putida) были обнаружены конечные продукты деструкции SCN" - тетратионат, тритионат (образовывался при гидролизе тетратионата в щелочных условиях), (рис. 40).

Рис. 40. Деструкция тиоцианата P.putida шт.21 на синтетической среде с этанолом с образованием политионатов, рН 8.8:1 - тиоцианат (SCN'), мМ; 3 - тетратионат (S4O6'), мМо о2 - тиосульфат (S2O3"), мМ; 4 - тритионат (S3O6 '), мМТиосульфат (внесенный дополнительно) (4 мМ) не влияли на скорость деструкции тиоцианата (7 мМ) и рост культуры (константа удельной скорости роста - 0,77 ч"1) (рис. 41). В качестве конечных продуктов окисления тиоцианата штаммом P.stutzeri тетратионат и тритионат в среде не были обнаружены.

Рис. 42. Деструкция тиоцианата в присутствии тиосульфата P.stutzeri: 1 - SCN" мМ; 2 - S2032\ мМ; 3 - число клеток в мл (lg N). Этанол - 1%. рН 8.8.

У штаммов ассоциации P.putida шт.21 и P.stutzeri шт. 18. была изучена активность ферментов серного метаболизма.

Ферменты определяли у штаммов, находящихся в конце экспоненциальной фазы роста, выращенных на синтетической среде с этанолом, где в качестве источников серы использовали различные соединения. На среде с SO42", S0 и без серы в качестве источника азота использовали NH4CI (в эквивалентном по азоту SCN" количестве). На среде с SCN" никаких дополнительных источников азота и серы использовано не было.

При росте бактерий на средах с тиоцианатом, серой и сульфатом были выявлены такие ферменты, участвующие в метаболизме неорганических соединений серы, как серооксигеназа, сульфитдегидрогеназа, роданаза, тиосульфат-дегидрогеназа и тиосульфатредуктаза. Активность АФС-редуктазы ни в одном из вариантов опытов обнаружить не удалось. Наличие и активность того или иного фермента зависели от состава среды, на которой культивировались исследуемые штаммы. (Рис. 43, 44).

70 60 50 40 30л2 2010 0шшш4МШМ Шжш.шЩ шOML, ■* >жлр;*4t i - * 1 2 среда (1 - с тиоцианатом 2 - с сульфатом)И сульфитдегидрогеназа ЕЭтиосульфатдегидрогеназаароданазаЕЗтиосульфатредуктазаРис. 43. Активность ферментов серного метаболизма шт.21 P.putida.

605040с.Щюж 302S 20101 2среда (1 - без серы, 2-е тиоцианатом, 3-е сульфатом)I сульфитдегидрогеназа Н роданаза ЕЭтиосульфатдегидрогеназа 0 тиосульфатредектазаРис. 44. Активность ферментов серного метаболизма шт. 18 P.stutzeri.

Таким образом, наблюдаются отличия в путях деструкции тиоцианата у выделенных штаммов ассоциации от изученных ранее. Сульфат в качестве конечного продукта деструкции SCN" штаммами P.stutzeri шт.18 и P.putida шт.21 в среде отсутствовал. Наблюдались различия в метаболизме SCN" у штаммов ассоциации. Тиосульфат являлся у P.putida шт.21 промежуточным продуктом деструкции SCN", а конечными - тетратионат и тритионат. У P.stutzeri шт.18 тиосульфат был конечным продуктом деструкции SCN".

Полученные данные позволяют представить путь деструкции SCN' изученными штаммами в следующем виде:цианазаSCN' + Н20 IIS + CNO" NH3 + С02 {P.stutzeri шт.18, P.putida шт.21)IS2032-" {P.stutzeri шт.18, P.putida шт.21)^ тиосульфатдегидрогеназаS3062- <---S4062- {P.putida шт.21)Тритионат образовывался в результате гидролиза тетратионата в щелочных условиях.

Таким образом, из полученных результатов можно заключить, что тиоцианат штаммы P.stutzeri шт. 18 и P.putida шт.21 используют в качестве источника азота и серы в анаболических процессах. В качестве источника энергии использование тиоцианата и продуктов его деструкции мало вероятно, о чем можно косвенно судить по величине активностей сульфитдегидрогеназы, се-рооксигеназы, а также отсутствии активности АФС-редуктазы. Серу, образованную при деструкции тиоцианата, штаммы ассоциации «запасают» в виде недоокисленных политионатов и тиосульфата.

В отличие от штаммов, выделенных нами в результате скрининга, типовые штаммы (P.stutzeri В-975, P.putida В-2187) были не способны к росту на среде с тиоцианатом и использованию его в качестве источника азота на синтетических средах с различными источниками углерода (глюкоза, лактат, этанол). В опытах с биомассой типовых штаммов при внесении SCN" в буферной среде (фосфатный буфер, рН 8.1) без источника углерода, также не удалось зафиксировать образование аммония.

Изучение цианазной активности в бесклеточном экстракте культур, выращенных на среде с аммонием в качестве источника азота, показало отсутствие ее у обоих штаммов. Однако на аналогичных средах цианазная активность отсутствовала и у штаммов ассоциации.

При изучении ферментов серного метаболизма типовых штаммов оказалось, что их активности близки к активностям выделенных штаммов ассоциации на среде с сульфатом и аммонием (Рис. 45).

1 2 штаммы (1 - В-976, 2 - В-2187)в сульфитдегидрогеназа 0 роданаза ЕЭ тиосульфатдегидрогеназа □ тиосульфатредуктазаРис. 45. Активность ферментов серного метаболизма типовых штаммов P.putida В-2187 и P.stutzeri В-975.

Таким образом, отсутствие активности у типовых штаммов по отношению к тиоцианату, по-видимому, связана с отсутствием первичных гидролаз.

Разработка комбинированной технологии деструкции CN" и SCN" в промышленных стоках с использованием ассоциации гетеротрофных бактерий.

Большинство золотоизвлекательных фабрик РФ (Олимпиадинская, Куба-кинская, Кочкарская и др.) работают с использованием цианистой технологии извлечения золота, как из продуктов бактериального окисления сульфидных минералов (кек), так и из окисленных руд. Применение высокотоксичного реагента, каким является цианид, требует очистки промышленных стоков -хвостов цианирования.

Обширный круг научных разработок (Castaldi, 1988; Ишмухамедов РД 1988;Ingvorsen, 1990; Whitlock, 1992; Розвага и др., 1995; Akcil a. Mudder, 2003) вобласти детоксикации цианистых расстворов свидетельствует о неослабевающем интересе к этой проблеме.

На отечественных золотоизвлекательных фабриках, перерабатывающих различные типы руд по цианистой схеме, очистка промышленных стоков в основном проводится с использованием гипохлорита (табл. 29). Гипохло-ритный способ обезвреживания применяется на Олимпиадинской, Самар-тинской, Кочкарской и др. фабриках. Процесс «Инко» используется только на руднике «Кубака».

Таблица 29. Способы обезвреживания циансодержащих стоков золотоизвлекательных фабрик РФ.

Наименование рудника, фабрики Тип руд Технология переработки Способ обезвреживания циаКубака золото-сеоебояный цианирование - «уголь в пульпе» ИнкоСамартинская золото-сульфидный гравитция-флотация-цианирование концентрата «уголь в пульпе» гипохлорит-ныйОлимпиадин-ская окисленный, коры выветривания сорбционное цианирование гипохлорит-ныйКочкарская золото- кварцево- сульфидный сорбционное цианирование гипохлорит-ныйим. Матросова золото-сульфидный грав итция-фл отация-сорбционное цианирование гипохлорит-ныйМноговершинная золото-сульфидная сорбционное цианирование гипохлорит-ныйМетод хлорирования заключается в окислении токсичных соединений хлорсодержащим окислителем, в качестве которого используется, как правило, гипохлорит или хлорная известь. Разрушение цианистых соединений «активнымхлором» протекает через реакцию образования активного хлорциана, который, гидролизуясь, переходит в нетоксичные цианаты, а затем в углекислоту и элементарный азот. Гидролиз хлорциана наиболее быстро протекает в щелочной среде, поэтому хлорирование проводится в известковой среде при рН=11-11.5. Метод хлорирования позволяет обезвредить промышленные стоки от комплекса токсичных цианистых соединений до значений ПДК (0.05 мг/л по CN"). Однако этот метод имеет ряд существенных недостатков и, прежде всего, отличается токсичностью хлора, главным образом его органических соединений. Некоторые соединения органо-хлоридов биологически не разрушаемы и токсичны. Остаточная концентрация активного хлора в стоках сама превышает ПДК (<15 мг/л) и достигает 300 мг/л.

В настоящее время в зарубежной практике очистки сточных вод широко используется метод «Инко» (Akcil, 2002). В отечественной промышленности этот способ пока не получил широкого распространения. Процесс «Инко» технологически эффективен для окисления цианидов и металлцианидных комплексов. Метод заключается в детоксикации промышленных сточных вод с использованием сернистого газа или растворенного сульфита соли (например, метабисуль-фита натрия) в присутствии воздуха и катализатора (Си2+):аэрацияNa2S205 + 02 -> Na2S04 + S022+аэрация, СиCN" + S02 + Н20 CNO" + H2S04В этом случае цианиды, как свободные, так и связанные, окисляются до безопасного цианата, достигается высокая степень обезвреживания - 97-99%, однако, снизить остаточные содержания цианида до значений ПДК, в соответствии с российскими требованиями к охране окружающей среды, не удается. Процесс «Инко» также не обеспечивает деструкцию тиоцианатов, являясь слабым окислителем для данных соединений.

Разработанный комбинированный способ обезвреживания стоков включает стадию предварительной химической подготовки пульпы и стадию бактериальной деструкции остаточных цианидов и тиоцианатов.

В качестве химической предобработки выбран процесс «Инко», где в роли окислителя используется метабисульфит натрия. Происходящее окисление цианидов до безопасных цианатов позволяет получить нужную концентрацию остаточного CN" в стоках.

Предварительно обезвреженные цианистые стоки поступают на микробиологическую обработку, где и происходит полная деструкция цианистых соединений до ПДК.

В качестве модели были взяты промышленные стоки (хвосты сорбционного цианирования продуктов бактериального окисления золото-мышьякового концентрата) Олимпиадинской ЗИФ (таблица 30).

Таблица 30. Основной состав жидкой фазы хвостов сорбционного цианирования продуктов бактериального окисления золото-мышьякового концентрата.

Определяемые компоненты Содержание, мг/лРН ед. 9,8-10,7Магний 0,4Сульфаты 500-700Цианид общий 120-200Тиоцианат 4000-6000Медь 10-13Цинк 2-3Железо 350-500Никель 2-2,5Мышьяк 0,8-1,2Сурьма 0,5-5Обезвреживание цианистых стоков Олимпиадинской ЗИФ с помощью метабисульфита натрия (Na2S20s) проводили в герметичном реакторе при механическом перемешивании (400 об/мин) и расходе воздуха 0.3-0.5 м3/м3 мин с постоянным контролем щелочности пульпы. Содержание твердой фазы в пульпе составляло 23-33 %.

Установлено, что увеличение расхода метабисульфита натрия (соотношение NaiSiCVCN") от 3 до 9 г/г CN" приводит к увеличению скорости обезвреживания. Остаточная концентрация CN" при увеличении расхода метабисульфита через 60 минут снижалась с 23.5 до 6.9 мг/л (таблица 31). При этом величина рН не снижалась ниже 10.0 (при исходном рН=10.7), что препятствовало нежелательному гидролизу цианида, и позволяло снизить потери CN*.

Таблица 31. Зависимость скорости деструкции CN" при различном расходе метабисульфита натрия в пульпах (исходное содержание CN" в пульпе 50.9 мг/л, рН=10.7)Расход Na2S205 Время, мин рН Содержание цианr/rCN" иона, мг/л3.0 0 10.7 50.915 10.65 29.230 10.7 26.560 10.7 23.590 10.7 19.15.0 0 10.7 50.915 10.5 26.530 10.65 15.960 10.6 15.990 10.55 1337.0 0 10.7 50.915 10.5 22.330 10.0 13.360 10.0 6.990 10.0 6.99.0 0 11.2 53.615 11.05 19.130 10.95 9.660 11.0 7.290 10.8 6.5Было установлено, что добавка Си2+ в качестве катализатора повышает скорость окисления CN' и позволяет снизить расход метабисульфита с 9 до 5 г/г CN" (таблица 32). Так, при 30-ти минутной обработке цианистых стоков содержание CN" снижается с 13.8 мг/л до 5.8 мг/л при расходе с 0.2 и 0.7 Си2+ г/г CN" соответственно. Щелочность пульпы после предварительной обработки находится на уровне значений 9.8 - 10.0. Цианистые стоки содержали большое количество железа (350-500 мг/л), аЛ Iзначит и ферроцианиды. При использования ОТ в качестве катализатора, происходило также связывание его в комплексные соединения с железом и цианидом и удаление в виде нерастворимой соли - Cii2Fe(CN)6.

Бактериальную деструкцию CN" и SCN' в плотных пульпах после предварительной химической обработки проводили с помощью ассоциации гетеротрофных бактерий (P.putida шт.21 и P.stutzeri шт. 18). В опытах была использована пульпа после цианирования кека бактериального окисления, в которую вносили фосфаты и этанол. Этанол использовался штаммами ассоциации как источник углерода и энергии, CN" и SCN" как источник азота.

Рис. 47. Реактор для бактериальной деструкции CN" и SCN" в плотной пульпе.

4,5 -J 4,0 1 3,53,00 5 10 15 20 25 30 35часРис. 48. Деструкция тиоцианата в пульпе (т:ж=1:5) ассоциацией гетеротрофных бактерий в ферментере (механическое перемешивание - 300 об/мин, фосфаты - 1 г/л, этанол - 5 г/г SCN") при различных концентрациях:1-1.5 г/л SCN" (КОЕ -107 кл/мл);2-4.1 г/л SCN" (КОЕ - 109 кл/мл).

При проведении деструкции в аналогичных условиях в более плотной пульпе (т:ж=1:2) скорость деструкции снижалась в 6 раз и достигала 74 мг/л/час (рис. 49).

Таким образом, микробиологическая деструкция цианидов и тиоцианатов может осуществляется ассоциацией гетеротрофных бактерий в течение 24 часов при исходной концентрации CN" (до 30 мг/л) и SCN" (до 4 г/л). Концентрация токсичных компонентов (CN" и SCN") в сбросных пульпах после бактериальной обработки составляет меньше 0,05 мг/л.

На основании проведенных испытаний общая технологическая схема обезвреживания цианид- и тиоцианат- содержащих стоков, может быть представлена в следующем виде (рис. 51).

Циансодержащие стоки (пульпа)рН=10,5-11,0; 100-150 мг/л CN*

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Григорьева, Надежда Викторовна

Выводы.

1. Из зон антропогенного загрязнения выделена ассоциация штаммов Pseu-domonas stutzeri и P. putida, способная к деструкции как цианидов, так и тиоцианатов при их высокой концентрации (до 30 мг/л и 6 г/л соответственно) в различных средах.

2. Деструкция CN" и SCN" при их совместном присутствии более активно протекает с использованием ассоциации штаммов P. stutzeri и P. putida, что объясняется различной активностью метаболизма этих соединений.

3. CN" и SCN" могут служить единственным источником азота, а тиоцианат -и серы для штаммов P. stutzeri и P. putida, входящих в ассоциацию.

4. Выявлены условия для деструкции CN" выделенной ассоциацией гетеротрофных бактерий, исключающие его потери в виде HCN (рН 9.2-9.4, концентрация до 30 мг/л). Показано, что недопустимо применение аэрации среды воздухом независимо от рН среды.

5. Показано, что ассоциация гетеротрофных бактерий P. stutzeri и P. putida в различных условиях (растворы, плотные пульпы) способна развивать высокую скорость деструкции CN" и SCN" (4 мг/л/час и 600 мг/л/час соответственно), что позволяет использовать ее для очистки промышленных стоков.

6. Изученные штаммы, входящие в состав ассоциации, обладают различными путями деструкции тиоцианата, а именно у P. stutzeri деструкция происходит с образованием аммония и тиосульфата, а у P. putida - с образованием аммония, тиосульфата, тетратионата и тритионата.

7. Предложен комбинированный бактериально-химический способ деструкции CN" и SCN", включающий их химическую обработку метабисульфитом щелочного металла в присутствии медного катализатора и последующую микробиологическую обработку ассоциацией гетеротрофных бактерий

P.stutzeri и P.putida в присутствии фосфатов и источника углерода.

Заключение

Из зон антропогенного загрязнения впервые выделена и изучена ассоциация гетеротрофных бактерий, обладающая цианидрезистентным дыханием, способная к росту при концентрациях цианидов (до 70 мг/л) и тиоцианатов (до 6 г/л) при их совместном присутствии, и использующая CN" в качестве источника азота, a SCN" - в качестве источника азота и серы. В состав ассоциации входят штаммы P.stutzeri шт. 18 и P.putida шт. 21. Штаммы дополняют друг друга: при росте на цианиде преобладает штамм 21 {P.putida), при росте на тиоцианате - штамм 18 {P.stutzeri).

Работа проводилась с учетом химических свойств цианида, подбором оптимальных условий для его деструкции в условиях эксперимента. Было показано, что в процессе микробной деструкции цианида недопустимо использование принудительной аэрации среды воздухом, независимо от исходной концентрации цианида и рН среды. При проведении микробной деструкции с использованием перемешивания среды необходим индивидуальный подбор режима с учетом рН, температуры, исходной концентрации цианида. В проведенной работе такие условия были подобраны для реактора с объемом Зл. Было показано, что максимальная концентрация цианида, которая может быть деструктирована без потерь ассоциацией штаммов P.putida и P.stutzeri при объеме среды в реакторе 1.5 л, скорости преремешивания механической мешалкой 150 об/мин, температуре 25-28°С, рН 9.2-9.4 составляет 30 мг/л. Параметры деструкции тиоцианата для данного объема среды в реакторе были следующие: рН 8.8-9.0, скорость перемешивания 300 об/мин, аэрация среды воздухом 0.3-0.6 л/мин, температура 30-34°С, концентрация SCN" до 6 г/л. Изучены механизмы деструкции цианида и тиоцианата штаммами P.stutzeri шт. 18 и P.putida шт. 21. Показано, что они метаболизируются до аммония и углекислоты. Серная часть тиоцианата окисляется до тиосульфата обоими штаммами, в случае P.putida конечными продуктами деструкции также являются тетратионат и тритионат (образуется в результате гидролиза тетратионата в щелочных условиях). Определены активности ферментов, участвующих в метаболизме тиоцианата - цианазы, родоназы, тиосульфатдегидро-геназы, тиосульфатредуктазы. Более высокая активность цианазы обнаружена у P.stutzeri (1.26 мкмоль/мин на мг белка). Активности ферментов серного метаболизма близки у обоих штаммов, за исключением активности тиосульфат окисляющего фермента, которая в 4.5 раза выше у P.putida. Различная метаболическая активность аборигенных штаммов P.stutzeri и P.putida обеспечивала высокую эффективность ассоциации этих бактерий в деструкции CN" и SCN" при их совместном присутствии и высоких концентрациях.

Показано отличие выделенных штаммов от типовых данных видов на физиологическом, биохимическом и генетическом уровнях, что говорит о наличии мутационных изменений, которые могли произойти под воздействием антропогенного загрязнения среды у выделенных штаммов.

Разработана и испытана технологическая схема бактериально-химической деструкции цианидов и тиоцианатов, включающая химическую обработку метабисульфитом щелочного металла в присутствии катализатора, сульфата меди, и микробиологическую обработку ассоциацией штаммов P. stutzeri шт. 18 и P.putida шт. 21 в присутствии фосфатов и источника углерода. Способ испытан в лабораторных условиях в Институте микробиологии им. С.Н. Ви-ноградского РАН и на Олимпиадинской золотоизвлекательной фабрике (ЗИФ) и является пригодным для реализации в ряде промышленных технологий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Григорьева, Надежда Викторовна, Москва

1. Akcil A. and Mudder Т. Microbial destruction of cyanide wastes in gold mining: prosess review //Biotecnology Letters. 2003. -V. 25. -P. 445-450.

2. Akcil A., Karahan A.G., Ciftci H., Sagdic. Biological treatment of cyanide by natural isolated bacteria {Pseudomonas sp.) II Mineral Engineering. 2003. -V. 16. -P. 643-649.

3. Akcil A. First application of cyanidation process in Turkish gold mining and its environmental impacts // Mineral Engineering. -2002. -V. 15. -P. 695699.

4. Akcil A. Destruction of cyanide in gold mill effluents: biological versus chemical treatments // Biotechnology Advances. -2002. -V. 21. -P. 501-511.

5. Akifiisa O., Hario N., Masahiko M. Method for treating a cyanocontaining waste liquid. Patent EP 0325720 Al. Int. 1988.

6. Baneijee G. Phenol- and thiocyanate-based wastewater treatment in RBS reactor//Journal of Envirinmental Engineering. -1996. -October. -P. 941-948.

7. Barclay M., Hart A., Knowles C.J., Meeussen Y.C.L., Tett V. A. Biodegrada-tion of metal cyanides by mixed and pure cultures of fungi // Enzyme and microbial technology. -1998.-V.22.-Iss.4. -P.223-231.

8. Basheer S., Kut O.M., Prenosil J.E., Bourne J.R. Kinetics of enzymatic degradation of cyanide//Biotechnol.a. Bioeng. -1992. -V.39. -P.629 -634.

9. Bergquist A., Eakin E.A., Eakin R.T. and Wagner R.P. Growth, respiratory and cytochrome characteristics of certain of the isoleucine valine mutants of Neurospora crassa/l Biochemical Genetics. -1974.1. V.12. -Р.39-49.

10. Betts РМ, Rinder D J, and Fleeker JJl. Thiocyanate utilization by an Artrobacter //Canadial Journal of Microbiology. -1979.-V. 25. -P. 1277 -1282.

11. Boucabeille C, Bories A and Olliver P. Degradation of thiocyanate by a bacterial co-culture//Biotechnol Letter. -1994.-V.16. -P. 425430.

12. Buczowska Z. and Jamuszkiewicz L The biochemical activity of mixed bacterial culture acclimaited to thiocyanate // Bull. Institute Mer. Med Gdansk. -1968. -V. 19. -P. 201-210.

13. Castaldi F. J., Trofe T. W., Page G. C. a. Adams К. M. 1988. Process for wastewater treatment. US Patent № 4,737,289.

14. Castaldi F. J, Trofe T. W., Page G. C. a. Adams К. M . Process for wastewater treatment. 1988. US Patent № 4,79,940.

15. Castric P.A. Hydrogen cyanide, a secondary metabolite of Pseudomonas aeruginos //. Canadian Journal of Microbiology. -1975. -V.21. -P.613-618.

16. Castric P. A. The metabolism of hydrogen cyanide by bacteria / In ""Cyanide in biology". Vennesland В., Conn E.E., Knowles C.J., Westley and Wissing F., eds. Acad. Press, London and New York. -1981. -P. 233-257.

17. Chung J., Wood J.L. 1970. Oxidation of thiocyanate to cyanide and sulfide by the lactoperoxidase-hydrogen peroxide system // Arch. Bio-chem.Biophys. -1970.-V.141. -P.73-78.

18. Cluness M.J., Turner P.D., Clements E., Brown D.T. and O'Reilly C. Purification and properties of cyanide hydratase from Fusarium lateritium and analysis of the corresponding chy 1 gene. Journal of General Microbiology. -1993.-V.139.-P. 1807-1815.

19. De KruyfF CD., van der Walt J.L and Schwartz HM. The utilization of thiocyanate and nitrate by thiobacilli //Ant. Van Leeuwenhoek. -1957.-V. 23. -P. 305-316.

20. De Ley J., Cattoir H., Reynaerts A. The quantitative measurement of DMA hybridisation from renaturation rates // Eur.J.Biochem. -1970.-V. 12.-P. 143.

21. Denger K., Ruff J., Rein U. and Cook A. 2001. Sulphoacetaldehyde sulpho-luase (EC 4.4.1.12) from Desulfonispora thiosulfatigenes: purification, properties and primary sequence // Biochem. J. -2001.-P. 581-586.

22. Devuyst E., Robbins G., Vergunst R., Tandi В., Jamarino P. Inco SCVAir. Inco's cyanide removal technology//Mining Eng. (USA). -1991.-V.43.-№ 2. -P. 205-207.

23. Dictor M.-C., Battaglia-Brunet F., Morin D., Bories A. and Clarens M. 1997. Biological treatment of gold ore cyanidation wastewater in fixed bed reactor// Environmental pollution. -1997.-V. 97(3). -P. 287-294.

24. Dorr P.K. and Knowles C.J. Cianide oxygenase and cyanase activities of P.fluorescens NCIMB 11764 // FEMS Microbiol. Lett. -1989.-V.60. -P.289-294.

25. Dubey S.K. a. Holmes D.S. 1995. Biological cyanide destruction by microorganisms. World Journal of Micrbiology & Biotechnology. V. 11. P.257-265.

26. Edwards U., Rogall Т., Bloeker H., Ende M.D., Boeettge E.G. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucl. Acids Res. -1989.-V.17.-P. 7843-7853.

27. Fallon R.D., Cooper D.A., Spees R., Henson M. Anaerobic biodegrada-tion of cyanide under metanogenic conditions // Appl.Environ.Microbiol. -1991.-V.57. -№6. P. 1656 -1662.

28. Fernandez R.F., Dolghih E. and Kunz D.A Enzymatic assimilation of cyanide via pterin-dependent oxygenolytic cleavage to ammonia and formate in Pseudomonas fluorescens NCIMB 11764 // Appl. En-vir.Microbiology. 2004. -V.70. -P.121-128.

29. Fry W.E. and Miller R.L. Cyanide degradation by enzyme from Stemphylium /ой//Arch. Biochem. Biophys. -1972. -V.151. P. 468-474.

30. Fry W.E. and Myers D.F. In "Cyanide in biology". Vennesland В., Conn E.E., Knowles C.J., Westley and Wissing F eds / Acad. Press, London and New York. 1981.P.322-334.

31. Fry W.E. and Munch D.C. Hydrogen cyanide detoxification by Gloeocerco-sporasorghi//Physiology and Plant Patology. -1975. -V.7. P.23-33.

32. Happold F.C., Johnstone K.L, Roger HS. and Youatt J.B. The isolation and characteristics of an organism oxidizing thiocyanate // J. Gen. Microbiology. -1954.-V.10.-P. 261-266.

33. Happold F.C., Jones G.L. and Pratt D.B. Utilization of thiocyanate by ThiobaciUus thioparus and T. thiocyanooxidans. Nature. -1958.- V. 182. P. 266 - 267.

34. Harris R.E. and Knowles C.J. Isolation and growth of Pseudomonas fluorecsens that utilizes cyanide as a source of nitrogen // J. Gen. Microbiol. -1983.-V.129. P. 1005-1011.

35. Harris R.E. and Knowles C.J. The conversion of cyanide to ammonia by extracts of a strain of Pseudomonas fluorecsens that utilizes cyanide as a source of nitrogen for growth // FEMS Microbiol. Lett. -1983. -V.20. -P.337-341.

36. Hasuike Y., Nakanishi Т., Moriguchi R, Otaki Y., Nanami M, Hama Y, Naka M, Miyagawa K, Izumi M, Takamitsu Y. Accumulation of cyanide and thiocyanate in haemodialysis patients //NephroDial.Transplant -2004.- V.19 (6). -P.1474-1479.

37. Hung Ch.-H., Pavlostathis S.G. Kinetics and modeling of autotrophic thiocyanate biodegradation//Biotechnology and Bioengineering. -1999.-V. 62 (1). -P. 1-11.

38. Hung C.-H. and Pavlostathis S.G. Aerobic biodegradation of thiocyanate //

39. War. Res. -1997.-31(11). -P. 2761-2770.42.1kuma H. Eectron transport in plant respiration // Annu. Rev. Plant Physiol. -1972.-V. 23.- P. 4.19-436.

40. Ingvorsen K., Hojer-Pedersen B. a. Godtfredsen S.E. Novel cyanide-hidrolysing enzyme from Alcaligenes xylosoxidans subsp. denitrificans // Appl. Envir. Microbiology. -1991.-V. 57. P. 1783-1789.

41. Gaudy A.F., Gaudy E.T., Feng YJ., Brueggemann. Treatment of cyanide waste by the extended aeration process. //Journal WPCF. -1982.-V. 54(2). P. 153-164.

42. Gomez N.CM, Camardos E.RS., Dras J.C.T., Figureira MM, Linardi УЛ. Preliminary studies on metal and cyanide removal by Aspergillus «/ger//Biohydrometallurgi-cal Processing/Eds. Jerez CA et al. Chile, 1995. -V. 2. P. 401405.

43. Gurbuz F., Ciflci H, Akcil A. and Karahan A.G. Microbial detoxification of cyanide solutions: a new biotechnological approach using algae. Hydrometallurgy. 2004.-V. 72.-P. 167-176.

44. Youatt I.B. Studies on the metabolism of Thiobacillus thiocyanoxi-dcins H J.Gen.Microbiol. -1954. -V.l 1. P.139-149.

45. Katayama, Y., Kanagawa Т., and Kuraishi, H. Emission of carbonyl sulfide by Thiobacillus thioparus grown with thiocyanate in pure and mixed cultures // FEMS Microbiol.Lett. -1993.-V.114. P. 223-228.

46. Katayama, Y., and Kuraishi, H. Characteristics of Thiobacillus thioparns and its thiocyanate assimilation // Can. J. Microbiol. -1978.-V. 24. P. 804-810.

47. Katayama Y., Matsushita Y., Kaneco M, Kondo M, Mizuno T. and Nyunoya H.

48. Cloning of genes coding for the three submits of thiocyanate hydrolase of Thiobacillus thioparus ТШ 115 and their evolutionary relationships to nitrile hydratase //Journal of Bacteriology. -1998.-May. -P. 2583-2589.

49. Kelly, D. P., and Baker, S. C. The organosulfur cycle: aerobic and anaerobic processes leading to turnover of Ci-sulfur compounds // FEMS Microbiol. Rev. -1990. -V. 87.- P. 241-246.

50. Kelly D. P., Chambers, T. A., and Trudinger P. A Cyanolysis and spectropho-tometric estimation of trithionate in mixture with thiosulfate and tetrathionate// Anal.Chem. -1969.-V. 41. P. 898-902.

51. Kelly P.D., Shergill J.K., Lu W.-P. and Wood A.P. Oxidative metabolism of inorganic sulfur compounds by bacteria// Ann.van Leev. -1997.-V. 71. -P. 95107.

52. Key J.O., Suzuki, I. Isolation and characterization of membrane-associated thiosulphate-oxidizing system of Thiobacillus novellus// J. Gen. Microbiol. -1977. -V. 99. P. 397-412.

53. Kim S.-J. and Katayama Y. Effect of growth conditions on thiocyanate degradation and emission ofcarbonil sulfide by Thiobacillus thioparus ТШ 115// Wat. Res. -2000.-V. 34 (11). P. 2887-2894.

54. Kondratyeva T.F., Muntyan L.N., Karavaiko G.I. Zinc and arsenic-resistens strains of Thiobacillus ferrooxidans have increased copy numbers of chromosomal resistanse genes // Microbiology -1995. -V.141, P.l 1571162.

55. Kozliak E.I., Fuchs J.A., Guilloton M.B. and Anderson P.M. Role of bicarbonate/C02 in the ingibition of Esherichia coli growth by cyanate// Journal of

56. Bacteriology. -1995.- June. P. 3213-3219.

57. Kunz D.A., Chen J.-L. and Pan G. Accumulation of a-keto acids as essential components in cyanide assimilation by Pseudomonas fluorescens NCIMB11764// Appl. and Env. Microbiology. -1998.-Nov. P. 4452-4459.

58. Kunz D., Wang C.S., Chen J.-L. Alternative routes of enzimic cyanide metabolism in Pseudomonas fluorescens NCIMB 11764 // Microbiology. -1994.-V.140. P. 1705-1712.

59. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature. V.227.P.680-685.

60. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall R.I. Protein meas urement with the Folin-phenol reagent // J.Biol.Chem. -1951.-V. 193.-P.265-275.

61. Mansfield J.W. Antimicrobial compounds / In Biochemical Plant Patology, ed. J.A Callow, 1983.-P. 337-365. London: Wiley & Sons.

62. Marmure J. A procedure for the isolation DMA from microorganisms //J. of Molecular Biology. -1961.-V.3.- P.208.

63. Mason, F., Harped, D., and Larkin, M. The microbial degradation of thiocyanate //Bioehem. Soc. Trans. -1994.-V. 22. P. 4238.

64. Mason J., Kelly D.P. Thiosulfate oxidation by obligately heterotrophic bacteria // Microbiol. Ecol. -1988.-V. 15. -P. 123.

65. McGill S.L., Hendrix L., and Nelson L. "Cyanide/thiocyanate reactions in tailings" / Cyanide and the Environment. Colorado State Universitu. Fort Collins, Colorado. -1985. V.l.-P. 143-159.

66. Meyers PR, Rawlings DE., Woods D.R. and Lindsey G.G. Isolation and characterization of a cyanide dihydratase from Bacillus pumilus CI // Journal of Bacteriology. -1993. -V.175. -P. 6105-6112.

67. Miller A. G., Espie G.S. Photosynthetic metabolism of cyanate by the cyano-bacterium Synechococcus UTEX 625 // Arch. Microbiol. -1994. -V. 162. -P. 151-157.

68. Mooney R.B. & Quin J.P. In Encyclopaedia of chemical technology. 2-nd edn., Kirk, R.E. & Othmer, D.F., eds. New York: John Wiler and Sons. -1965. -V.6. P. 585-601.

69. Mudder T.I, Whitlock J.L. Method for the biological removal of free and complex cyanides and thiocyanates from water. US Patent 4,440,644, 1984.

70. Murrell J.C. Microbial growth on Ci compounds / Eds. Murrell J.C., Kelly D.P. England: Intercept Ltd. 1993. P. 520.

71. Neufeld RJD., Mattson MA and Lubon. Thiocyanate bio-oxidation kinetics //Journal Enviromental Enginering. -1981 -V. 108. P. 1035-1049.

72. Pandey R.A., Parhard N.M. and Kumaran P. Biological treatment of low temperature carbonization wastewater by activated sludge process a case study // Wat. Res. -1991. -V. 25 (12). -P. 1555-1564.

73. Paruchurl, Y. L., Shivaraman, N., and Kumaran, P. Microbial transformation of thiocyanate//Environ. Pollution. -1990.-V. 68. P.15-28.

74. Patil Y.B. and Paknikar KM Biologikal detoxification of nickel-cyanide from industrial effluents / Biohudrometallurgy: Fundamental, Technology and Sustainabl Development. Part B. Eds.: Ciminelli V.S.T. and Garcia O. -2001. P. 391-416.

75. Pereira P.T., Arrabaca J.D. and Amaral-Collaco. Isolation, selection and characterization of a cyanide-degrading fungys from an industrial effluent

76. International Biodeterioration & Boidegradation. -1996.-P. 45-52.

77. Port J.L., DeVoe I.W. and Archibald F.S. Sulfur acquisition by Netsieria men-ingitide//C an. J. Microbiol. -1984.-V.30. P.1453-1457.

78. Raybuck S. Microbes and microbial enzymes for cyanide degradation // Bio-degradation. -1992.-V.3. P. 3-18.

79. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque in electron microscopy //J.Cull. Biol. -1963. -V.17. -P.208-213.

80. Roy A.B. and Trudinger. The biochemistry of inorganic compounds of sulphur// Cambridge at the University press. -1970.-P.400.

81. Silva-Avales J., Richmond M.G // App. and Enviromental Microbiology. -1990.-V.56. -N.12. -P. 3664-3670.

82. Smith A. a. Muder T. Chemistry and treatment of cyanidation wastes / Mining J. Books Ltd. London. -1991. P. 345 .

83. Smith, N. A., and Kelly, D. P. Oxidation of carbon disulfide as the sole source of energy for the autotrophic growth of Thiobacillus thioparus strain TK-m // J. Gen. Microbiol. -1988. -V. 134. P. 3041-3048.

84. Sorbo, B. A colorimetric determination of thiosulfate/ Bioehem. Biophys. Acta. -1957.-V. 23. -P. 412-416.

85. Sorokin D.Yu., Tourova T.P., Lysenko A.M. and Kuenen J.G. Microbial thiocyanate utilization under highly alkaline conditions. Appl. and Environ. Microbiol. -2001.-V.67. -P. 528-538.

86. Stafford, J., Dias, A. E. X. O., and Knowles, C. J. The utilization of thiocyanate asa nitrogen source by a heterotrophic bacterium: the degradative pathway involves formation of ammonium and tetrathionate // Microbiology. -1994.-V. 140. -P. 2657-2662.

87. Stafford, D. A, and Galley, A. G. The utilization of thiocyanate by a heterotrophic bacteria//J. Gen. Microbiol. -1969.-V.95. -P. 285-289.

88. Trudinger P.A Metabolism thiosulfate and tetrathionate by heterotrophic bacteria // J. Bacteriol.-1967.-V.93. -P.550

89. Triiper RG.and Schlegel KG. Sulphur metabolism in Thioriiodaceae. 1. Quantitative measurements on growing cells of Chromatium okenii //Ant.van Leev. -1964. -V. 30. -P. 225-238.

90. Vanderleyden J., Hanssens L., Verachtert H. Induction of cyanide-insensitive respiration inMoniliella tomentosa by the use of n-propanol. // J. Gen. Microbiol. -1978-V. 105. -P. 63-68,

91. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows enviroment // Comput. Applic. Biosci. -1994.-V.10. -P.569-570.

92. Wang P. and Van Etten H.D. Cloning and properties of a cyanide hydratase gene from the phytopathogenic fungus Gloeocercospora sor-ghi //Biochemical and Biophysical Research Communications. -1992,-V.187. -P.1048-1054.

93. Watanabe A., Yano K., Ikebukuro K. and Karube I. Cyanide hydrolysis in a cyanide-degrading bacterium, Pseudomonas stutzeri AK61, by cyanidase //Microbiology. -1998.-V. 144. -P. 1677-1682.

94. Weatherburn, M.V. Phenol-hypochlorite reaction for determination of ammonia // Anal. Chem. -1967.-V.39, -P. 971-974.

95. Westley J. Cyanide and sulfane sulfur/ In "Cyanide in biology". Ven-nesland В., Conn E.E., Knowles C.J., Westley and Wissing F., eds. Acad. Press, London and New York. -1981. -P.61-75.

96. White J.M., Jones D.D., Huang D. and Gauthier J.J. Conversion of cyanide to formate and ammonia by a pseudomonad obtained from industrial wastewater //Journal of Industrial Microbiology. -1988.-V.3.-P.263 -272.

97. Whitlock J.L. Biological detoxification of precious metal processing wastewater//Geomicrobiology Journal. -1990.-V. 8. -P. 241-249.

98. Whitlock J.L. Method for biological removal of cyanides, thiocyanate and toxic heavy metals from highly alkaline environments. US Patent 5,169,532. 1992.

99. Wong-Chong G.M. Biological degradation of cyanide in complex industrial wastewaters // Biohydrometallurgy-89/Eds. Salley J. et al. CANMET8p89-10. -1989. -P.289-300.

100. Wood J.L. Biochemictry / In "Chemictry and biochemictry of thio-cyanic acid and its derivatives". Newman A.A., eds. London: Academic Press.-1975.-P.156-221.

101. ИЗ. Акименко В.К. Цианидрезистентое дыхание микроорганизмов // Успехи микробиологии. -1981.-Т. 16. -С. 3-30.

102. Акименко В.К. Альтернативные оксидазы микроорганизмов. Москва. Из-во «Наука», 1989.-263с.

103. Гамильтон Э.М. Руководство по цианированию золотых и се-ребрянных руд. M.-JI. Из-во "Цветметиздат", 1932.-С.40-41.

104. Григорьева КВ., Авакян З.А, Турова TIL, Кондратьева Т.Ф., Каравайко Г.И. Скрининг и изучение микроорганизмов, деструкгирующих цианиды и тио-цианаты //Микробиология. -1999.-Т.68. -№4. -С.453460.

105. Ишмухамедов РН, Мелкумян Bill и Коган В. A-JL. Способ биологической очистки циансодержащих сточных вод Патент SU1366480 Бюл№2.1988.

106. Каравайко ГД, Кондратьева Т.Ф., СавариЕЕ, Григорьева Н.В., Авакян З.А. Микробная деструкция цианида и тиоцианата Микробиология. -2000.-Т.69.-№2.-С.209-216.

107. Определитель бактерий Берджи. Пер. с англУ Под ред Дж. Хоулта, Н. Крита, П Снига, ДжСтейли и С.Уилльямса. М: Мир, 1997. -Т.1. -426с

108. Петушкова Ю.П., Ивановский Р.Н. Ферменты, участвующие в метаболизме тиосульфата у Thiocapsa roseopersicina при росте в разных условиях//Микробиология. -1976.-Т.45. -№ 6. -С. 960-965.

109. Подольская В.И., Ульберг З.П., Шпак В.Э., Грищенко Н.И., Яку-бенко JI.H. Прикладная биохимия и микробиология. -1994. -Т.30. -В.1.-С. 73-77.

110. Розвага Р.И. Биотехнология очистки промышленных сточных вод предприятий Уральского региона // Цв. Металлургия. -1994.-Т. 45. -С. 39-41.

111. Розвага Р.И., Толмачева Е.В., Абрамова О.В. Комбинированная биотехнология очистки цианистой пульпы Карамкенского горнометаллургического комбината // Цв. Металлургия. -1995.-Т. 7-8. -С. 47-50.

112. Романенко В.И., Кузнецов С.И. 1974. Экология микроорганизмов пресных водоемов. JI. Из-во "Наука", 1974. -194 с.

113. Сорокин Д.Ю. Окисление соединений азота гетеротрофными организмами // Успехи микробиологии. М «Наука». -1990. -Т.24. -С. 100-126.

114. Сорокин Д.Ю. 1991. Окисление соединений серы гетеротрофными микроорганизмами. Известия АНСССР сер. биол. № 4. С. 558 570.

115. Сорокин. ДЮ. Окисление неорганических серных соединений облигатно хемогетеропгрофными бактериями // Микробиология. -2003.-Т.72. -№ 6. -С.725-740.1. Благодарности.

116. Автор благодарен В.И. Дееву за помощь в модернизации и техническом оснащении биореакторов.

Информация о работе

Григорьева, Надежда Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Деструкция цианидов и тиоцианатов ассоциацией гетеротрофных бактерий и ее применение в биотехнологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы