Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Частота анеуплоидии в культурах мезенхимных стволовых клеток человека

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Частота анеуплоидии в культурах мезенхимных стволовых клеток человека"

На правах рукописи

БУЯНОВСКАЯ ОЛЬГА АНАТОЛЬЕВНА

ЧАСТОТА АНЕУПЛОИДИИ В КУЛЬТУРАХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

03.02.07-Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2010

004604738

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН

Научный руководитель: Академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Бочков Николай Павлович Официальные оппоненты: Профессор, доктор медицинских наук

Журков Вячеслав Серафимович

Профессор, доктор медицинских наук, член - корреспондент РАМН Дурнев Андрей Дмитриевич

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава

Защита состоится «07» июня 2010г. в 12

,00

часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко P.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Мезенхимные стволовые клети (МСК) в последнее время стали объектом пристального внимания многих исследователей. Наибольший интерес связан с возможностью применения стволовых клеток в медицинских целях. Они по своим характеристикам являются перспективным типом «материала» для клеточной и генно-инженерной терапии (Бочков Н.П. с соавт., 2006; Пальцев М.А. с соавт. 2006; Романов Ю.А., Смирнов В.Н., 2008). При культивировании стволовые клетки способны к продолжительной пролиферации, что дает возможность получать их в необходимом количестве, а также легко индуцировать дифференцировку в остео-, хондро-, мио-, адипогенном и др. направлениях (Егоров В.В. с соавт. 2003; Пальцев М.А. с соавт. 2006; Bruder S. et al. 1997,1998; Zuk P.A. et al., 2001,2002; Baksh D. et al. 2004). Для получения стволовых клеток с лечебными целями используются аспираты и образцы жировой ткани и костного мозга.

Однако, взятых из организма стволовых клеток для эффективной терапии недостаточно. Перед клеточной трансплантацией необходимо культивировать клетки.

Культивирование стволовых клеток сопряжено с воздействием на них различных факторов питательных сред и ферментной обработки при пересевах. Описанные в литературе случаи показывают, что длительное культивирование стволовых клеток может вести к серьезным изменениям генома, как на молекулярном, так и хромосомном уровнях его организации: описаны структурные и численные аномалии хромосомного набора клеток (Бочков Н.П. с соавт., 2007; Draper J. et al., 2004; Rubio D. et al., 2005; Imreh M.P. et al., 2006; Krause D., Van Etten R., 2007; Spits С. et al., 2008), амплификация некоторых участков ДНК, метилирование промоторов, эрозия теломер с нарушением активности фермента теломеразы (Егоров Е.Е. с соавт., 2008; Sen S., 2000; Pathak S. et al., 2002; Rubio D. et al., 2005).

Генетические изменения и связанные с ними нарушения экспрессии генов могут вызывать селективную пролиферацию генетически аномальных клеток. Это может привести к манифестации стволовых клеток с онкогенетическими свойствами и, как следствие этого, к малигнизации после их трансплантации.

Вопрос об онкогенной безопасности и генетической изменчивости стволовых клеток остается мало изученным, но крайне важным и, по сути дела, определяющим дальнейшее развитие клеточной терапии.

На этом основании многие исследователи полагают, что практическое применение МСК в терапевтических целях пока преждевременно, и ему должно предшествовать более детальное изучение биологии стволовых клеток (Бочков Н.П. с соавт., 2007; Rubio D. et al., 2005). Применение клеток вообще, и в частности МСК, для терапевтических целей должно определяться данными по их безопасности для пациента, в том числе онкогенной (Бочков Н.П. с соавт., 2008; Duersberg Р., Li R., 2003; Rublo D. et al., 2005). Многие вопросы размножения взрослых МСК хорошо изучены. Стали более понятными механизмы дифференцировки стволовых клеток, представления о генетической стабильности МСК в ходе культивирования. Однако, имеющиеся в литературе данные противоречивы, что объясняется разрозненностью методов изучения генетической изменчивости культивируемых МСК, незначительными выборками исследованных культур. Например, о хромосомной изменчивости, структурных нарушениях, численных аномалиях хромосом, являющиеся постоянным спутником злокачественного роста, недостаточно судить на основе кариотипического анализа небольшого числа клеток, который выявляет структурные нарушения хромосом, но не позволяет оценивать численные отклонения в хромосомном наборе клеток.

Для оценки генетической изменчивости МСК, должны применяться не только стандартное кариотипирование, но и другие современные

информативные методы молекулярной цигогенетики, в частности, исследование анеуплоидии в интерфазных клетках с помощью FISH анализа.

Цель н задачи исследования

Цель работы: Изучить численные нарушения хромосомного набора МСК, выделенных из жировой ткани и костного мозга на разных сроках культивирования с применением FISH-анализа интерфазных ядер.

В соответствии с целью исследования поставлены следующие задачи:

1. Изучить частоту анеуплоидных клеток в МСК из жировой ткани, культивируемых на ранних (2-5) пассажах (9-15) и поздних пассажах.

2. Изучить частоту численных нарушений хромосомного набора МСК из костного мозга на разных сроках культивирования (2-12 пассажи).

3. На основании полученных экспериментальных данных оценить параметры изменчивости по отдельным хромосомам и оценить механизмы, лежащие в основе происхождения разных вариантов анеуплоидии.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые данные, полученные по 4-м хромосомам (6, 8, 11 и X), позволили оценить частоту анеуплоидии на 1 хромосому и рассчитать её в целом на хромосомный набор в культивируемых МСК из жировой ткани и костного мозга.

Показано, что в культурах МСК из разных источников происхождения на ранних и поздних пассажах общая частота спонтанной анеуплоидии существенно не различается, что свидетельствует о достигнутом равновесии между частотой возникновения анеуплоидных клеток и их элиминацией.

В результате проведенного исследования установлено, что на фоне высокой спонтанной частоты анеуплоидии в некоторых культурах может происходить селективное формирование клеточной популяции с однотипной хромосомной аномалией, обладающей преимуществом в размножении, что имеет определенное значение в оценке возможной онкогенности клонообразующих культур МСК.

Положения, выносимые на защиту

1) Для культивируемых МСК как из жировой ткани, так из костного мозга характерна высокая частота спонтанной анеуплоидии, находящаяся в пределах 1-1,5% на одну хромосому. Этот показатель спонтанной частоты моносомии и трисомии характерен для культур МСК на ранних и поздних сроках культивирования.

2) На поздних сроках культивирования обнаруживается формирование клеточных популяций с однотипной хромосомной аномалией, имеющих селективное преимущество в размножении.

3) В большинстве культур МСК частота моносомии значимо выше трисомии, следовательно, кроме механизма нерасхождения хромосом, являющегося общим для обоих типов анеуплоидии, в происхождении моносомии дополнительно существенную роль играет механизм отставания хромосом в митозе.

4) Полученные результаты демонстрируют значение молекулярно-цитогенетического метода в объективной оценке геномной изменчивости МСК и в выявлении культур с клонообразующими клеточными популяциями.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008 год); Стендовый доклад на пятом съезде ВОГИС (Москва, 2009); Основные положения доложены на заседании кафедры медицинской генетики ММА им. И.М. Сеченова (Москва, 2009); Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании Ученого совета МГНЦ РАМН 3 марта 2010 года.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации

Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Все эксперименты и непосредственный их анализ выполнен ей лично. Разработка протоколов исследования проведена

при активном участии автора. Описание собственных исследований, обработка и обсуждение результатов, формулировка выводов и подготовка статей к публикации выполнены автором самостоятельно.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 8-ми печатных работах: статях и ^-зцтезисах. Две статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям учёной степени кандидата медицинских наук.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст изложен на 96 стр. машинописного текста, иллюстрирован 19 таблицами и 2 рисунками. Библиографический указатель включает 131 источник отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Пробы жировой ткани и костного мозга были получены из лаборатории ЗАО «Реметэкс» и ГУЗ «Банка стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы».

Пробы жировой ткани получены от 13-ти доноров (12 женщин, 1 мужчины). Забор проб проводился в стационарных условиях, в ходе косметической липосакции или абдоминопластики.

Пробы костного мозга получены от 16-ти доноров (3-х женщин 13-ти мужчин). Забор проб проводился в операционных условиях путем пункции гребня подвздошной кости.

Методики культивирования Культивирование клеток из жировой ткани. Источником получения стромально-васкулярной фракции жировой ткани служил липоаспират. В лаборатории липоаспират разводили средой Хенкса в 2 раза и интенсивно встряхивали в течение нескольких минут, центрифугировали 5 минут при 1000 об/мин при комнатной температуре. Пробы ткани отмывали 3-4 раза

фосфатно-солевым буфером (рН=7,4) и суспендировали в равном объеме того же буфера с добавлением 1% бычьей сыворотки и 0,1% коллагеназы 1-го типа ("Worthington Biochemical Corp."). Дезагрегацию ткани проводили на магнитной мешалке при температуре 37°С в течение 1 часа, затем центрифугировали 5 мин. при 300-500xG. Супернатант, содержащий зрелые адипоциты, удаляли. Клеточный осадок, представляющий собой фракцию клеток стромы и сосудов (фибробласты, перициты, эндотелий и др.), культивировали. Клетки высевали на пластиковые чашки Петри ("Corning") диаметром 90 мм в ростовой среде DMEM/F12 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой ("Hyclone") и 1% инсулин-трансферрин-селенитом ("Панэко"). Клетки высевали на культуральные вентилируемые флаконы, помещали в С02-инкубатор (37° С02, 5% С02). После 3-х дневной инкубации не прикрепившиеся клетки удаляли, ростовую среду полностью заменяли.

Далее культуры инкубировали при 37°С в атмосфере 5% С02 до достижения 70%-90% конфлюентности, затем клетки снимали раствором трипсина и рассевали в новую посуду с плотностью 1500-2000 клеток\см2.

По мере роста клеток отбирали чашки с культурами, в которых, при фазовоконтрастном микроскопировании, отмечали преимущественный рост мелких мезенхимных клеток.

Культивирование клеток костного мозга. Костный мозг в количестве 10-15 мл., разбавляли в 4 раза физраствором, забуферным фосфатами (ФСБ) с Li-гепарином, и выделяли фракцию моноядерных клеток центрифугированием в течение 25 мин. при 650g. в градиенте Фиколла по методу Strauer В. et al. (2001).

Основной средой для культивирования была среда DMEM с низким содержанием глюкозы, эмбриональной телячьей сыворотки, аминокислот и антибиотиков. Концентрация моноядерных клеток для посева составляла около 1 млнУсм2.

Клетки инкубировали в течение 34-48 часов в СО2 инкубаторе при 37°С, после чего производили смену среды. Оставшиеся прикрепленные клетки оставляли для доращивания, до достижения 75-85% конфлюентности.

В дальнейшем смену среды проводили каждые 2-3 суток, в зависимости от результатов ежедневных осмотров состояния культур. При образовании колоний анализировали динамику их роста, клеточную морфологию.

Как и в жировой ткани, выявлялись три типа клеток: первый -маленькие веретенообразные клетки, второй - округлые и большего размера, чем первый, третий - клетки крупных размеров, фибробластоподобные.

Иммуноцитохимическое исследование культур МСК жировой ткани и костного мозга проведено в ЗАО «Реметэкс» и ГУЗ «Банком стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы».

Приготовление цитогенетических препаратов. Все методические приемы: снятие клеток с флаконов, гипотонизация, фиксация для приготовления цитогенетических препаратов были щадящими.

Клетки снимали со стенки флакона с помощью раствора версена (1 мин), а затем - 0,25% раствора трипсина (3-7 мин. при 37°С). Далее добавляли среду БМЕМ (5 мл.), переливали полученную суспензию клеток в центрифужные пробирки. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали. Гипотонизацию проводили 0,55% раствором КС1 (10 мин. при 37°С), перед центрифугированием добавляли 3-5 капель фиксатора для остановки гипотонизации. Фиксацию проводили смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (в соотношении 3:1) стандартным способом, с использованием 3-х смен фиксатора.

Перед раскапыванием клеточной суспензии на предметные стекла фиксатор меняли еще раз. На охлажденное стекло наносили 3-5 капель клеточной суспензии, а затем 2-3 капли фиксатора или ледяной уксусной кислоты, помещали стекло в подогретую влажную камеру или держали над водяной баней (60-70°С) 10-20 секунд, затем подсушивали над пламенем

горелки или на твердотельной плитке при температуре 55-65°С, что улудшало качество препарата, необходимое для проведения FISH-анализа. Качества препарата оценивали с помощью метода фазового контрастного микроскопирования.

Анализ частоты анеуплоидии. В анализ включались интерфазные, хорошо распластанные с неповрежденной мембраной ядра, без наложений.

Для проведения интерфазного FISH-анализа использовали зонды фирмы "Vysis, Inc." (СЕР6 (D6Z1), СЕР8 (D8Z1) альфа-сателлитной ДНК для хромосом 6, 8, 11 и X (рис. 1). Денатурацию препаратов проводили с 70% формамидом при 73 °С в течение трех минут, гибридизацию - в течение ночи при 37°С. На следующий день препараты отмывали в растворе 0,4><SSC при температуре 70°С в водяной бане. Для контрастной окраски ядер использовали краситель DAPI.

FISH-препараты анализировали под микроскопом Axiolmager с комплектом интерференционных фильтров ("Zeiss") с помощью программного обеспечения для FISH-анализа ("Fish View System, Applied Spectral Imaging GmbH").

От каждой культуры после реакции гибридизации исследовали в среднем по 1000 интерфазных ядер. Всего от каждой культуры клеток разных индивидов было исследовано более 97 тысяч ядер.

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием программы Exel Microsoft Office ("Microsoft"), Statistica 6, Statictica 8. Уровень значимости p>0,05 был принят достаточным для признания различий достоверными.

а) Дисомия по хромосомам 6 и 8 б) Моносомия по 8 хромосоме

Рисунок 1. Варианты интерфазных ядер, после реакции гибридизации РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На ранних (2-5) пассажах изучены численные нарушения хромосомного набора культивируемых МСК жировой ткани по хромосомам 6, 8, 11 и X в 13 культурах.

Обобщенные данные FISH анализа культур МСК жировой ткани на ранних пассажах, представлены в табл. 1.

По табл. 1 видно, что колебание общего показателя доли анеуплоидных (моносомных и трисомных) клеток по 4 хромосомам находятся в пределах от 1,0% до 2,5%.

Таблица 1.

Геномная изменчивость в МСК жировой ткани на ранних пассажах

Хромосома Тип анеуплоидии Частота, % Стандартное отклонение 95% доверительный интервал

6 моносомия 1,5 1,2 0,8-1,9

трисомия 0,4 0,4 0,3-0,7

8 моносомия 2Д 1,3 0,9-2,2

трисомия 0,4 0,5 0,3-0,8

11 моносомия 1,0 0,8 0,6-1,4

трисомия 0,1 0,2 0,1+0,3

X моносомия 0,8 0,5 0,4-0,9

трисомия 0,2 0,2 0,2-Ю,4

Хотя разница показателей частоты анеуплоидии между изученными культурами значительна, статистически достоверных различий средних частот между хромосомами не выявлено (р>0,05).

Показатель частоты тетрасомии по изученным хромосомам оказался одинаковым - 0,6%. При этом, во всех культурах имело место полное совпадение на одном и том же препарате показателей частоты по двум изучаемым хромосомам. На основании этих данных правомочно говорить не о тетрасомии, а о полиплоидном состоянии хромосомного набора.

Результаты исследования численных аномалий хромосомного набора на ранних сроках культивирования МСК (2-ой-5-ый пассажи) показали, что в клетках имеет место геномная нестабильность, приводящая к появлению анеуплоидных и полиплоидных клеток. Результаты анализа культур МСК жировой ткани на ранних пассажах по четырем хромосомам позволяют подойти к оценке общей частоты анеуплоидии, включающей моносомию и трисомию. В настоящем исследовании тестировались 4 хромосомы, по которым суммарная частота анеуплоидии составила 6,5%. Соответственно,

на одну хромосому частота моносомии и трисомии составила 1,6%, а на геном в целом - 37,4%.

На поздних пассажах (9-15 пассажи) исследовано 8 культур. Все эти культуры были исследованы на ранних пассажах.

Данные изучения анеуплоидии в МСК жировой ткани на поздних пассажах представлены в табл. 2.

Таблица 2.

Геномная изменчивость в МСК жировой ткани на поздних пассажах

Хромосома Тип анеуплоидии Частота, % Стандартное отклонение 95% доверительный интервал

6 моносомия 1Д 0,8 0,5-2,3

трисомия 0,3 0,3 0,2-1,0

8 моносомия 1,5 1,2 0,9-1,1

трисомия 0,8 0,9 0,6-1,7

11 моносомия 0,4 0,5 0,3-1,1

трисомия 0,2 0,4 0,2-Ю,8

X моносомия 0,6 0,7 0,4-1,5

трисомия 0,2 0,3 0,1+0,6

Из представленных в табл. 2 данных видно, что показатели общей частоты анеуплоидии по 4-м хромосомам подвержены существенным колебаниям - от 0,6% (хромосома 11) до 2,3% (хромосома 8).

По хромосоме 11 и X частота анеуплоидных клеток была более низкой, чем по хромосомам б и 8, а в большинстве культур имела место тенденция к понижению по сравнению с ранними пассажами.

Хотя колебания показателей частоты анеуплоидии между изученными культурами значительны, статистических достоверных различий средних частот между хромосомами не выявлено (р>0,05).

Расчеты показали, что суммарная частота моносомии и трисомии на одну хромосому составила 1,3%, а на весь геном - 29,3%.

Частота тетрасомии по изученным хромосомам находилась в пределах от 0,2% до 0,9%, и её средний показатель на геном составил 0,5%. Результаты 2-х-цветного Р1БН-анализа по всем препаратам позволяют говорить не о тетрасомном, а о полиплоидном состоянии хромосомного набора.

Анализ данных, представленных в табл. 1 и 2, показывает, что при сравнении ранних и поздних пассажей показатели уровня анеуплоидий на весь геном 37,4% и 29,3%, соответственно, находятся в статистически незначимых различиях. Сходство частоты анеуплоидии на ранних и поздних пассажах МСК из жировой ткани свидетельствует о том, что в ходе культивирования с высокой интенсивностью, кроме появления анеуплоидных клеток, происходит их элиминация в ряду клеточных делений. Так как большинство культур исследовано на 3-ем и 5-ом пассажах, можно предположить, что интенсивность анеугенеза и давление отбора против анеуплоидных клеток уравнивается уже на ранних пассажах, сохраняя эти показатели и на более поздних сроках культивирования - на 9-14 пассажах.

Аналогичное исследование проведено при анализе МСК костного мозга на ранних и на поздних пассажах, с использованием ДНК-зондов на хромосомы 6, 8,11 и X.

Результаты геномной изменчивости МСК костного мозга на ранних (35) и поздних (10-12) пассажах представлены в табл. 3 и 4.

Из табл. 3 видно, что показатель общей частоты анеуплоидных клеток на ранних пассажах по изученным аутосомам находился в пределах 1,2% -1,3%. Анеуплоидия по Х-хромосоме изучена в 13 культурах МСК мужского пола и в 7 культурах женского пола. В МСК мужского пола учитывали нулисомные, дисомные и трисомные клетки. Общий показатель нарушений по Х-хромосоме составил 1%, в подавляющей части за счет дисомии (т.е. ХХУ кариотипа).

Таблица 3.

Геномная изменчивость в МСК костного мозга на ранних пассажах

Хромосома Тип анеуплоидных клеток, %

Моносомия Трисомия Тетрасомия

6 0,8±0,2 0,4±0,1 0,4±0,1

8 1,0±0,2 0,2±0,1 0,4±0,2

11 1,0±0,2 0,3±0,1 0,3±0,1

С учетом полученных данных оценено, что показатель анеуплоидии на одну хромосому составил 1,3%, а на весь геном - 27,6%.

Таблица 4.

Геномная изменчивость в МСК костного мозга на поздних пассажах

Хромосома Тип анеуплоидных клеток, %

Моносомия Трисомия Тетрасомия

6 0,б±0,3 0,5±0,2 0,7±0,3

8 0,7±0,2 0,3±0,1 0,6±0,3

11 1,0±0,2 0,2±0,1 1,1±0,2

Средняя суммарная частота анеуплоидии МСК костного мозга на поздних пассажах изученных аутосом находилась в статистически неразличающихся пределах - от 0,9% до 1,2%.

По Х-хромосоме данные получены по 6 культурам МСК мужского пола, среди которых выявлены клетки с дисомией с частотой 1,6%.

Соответственно приведенным данным видно, что общий показатель анеуплоидии на поздних пассажах составил на одну хромосому - 1,2%, а на геном - 27,6%.

Показателя частоты тетрасомии (полиплоидии) по изучаемым хромосомам в МСК костного мозга на ранних и поздних пассажах были в пределах 0,3%-0,4% - на ранних пассажах и 0,6%-1,1% на поздних.

Из представленных данных видно, что геномная изменчивость в МСК костного мозга оказалась одинаковой на ранних и поздних пассажах.

Эти данные совпадают с результатами изучения МСК из жировой ткани, что подтверждает сходство происходящих процессов в культивируемых МСК разных тканей.

Таким образом, значения показателей анеуплоидии в МСК жировой ткани и МСК костного мозга находятся в одних и тех же пределах. Из этого можно сделать вывод, что источник (жировая ткань или костный мозг) стволовых клеток с точки зрения интенсивности геномной изменчивости значения не имеет.

О структуре геномной изменчивости можно судить по данным, представленным в табл. 5.

Таблица 5.

Структура геномной изменчивости МСК

Жировая ткань Костный мозг

Ранний пассаж

Хромосома Доля моносомии, % Доля трисомии, % Доля моносомии, % Доля трисомии, %

6 1,5 0,4 0,8 0,4

8 2,1 0,4 1,0 0,3

11 1,0 0,1 1,0 0,3

X 0,8 0,2 0,1 0,9

Поздний пассаж

6 1,1 0,3 0,6 0,5

8 1,5 0,8 0,7 0,2

11 0,4 0,2 1,0 0,3

X 0,6 0,2

Исходя из представленных в табл. 5 данных по структуре геномной изменчивости в МСК изученных тканей, видно, что доля моносомных клеток во всех культурах существенно превосходит долю трисомных клеток.

Разница средних частот моносомии и трисомии по отдельным хромосомам статистически не достоверна (р>0,05).

Однако, сравнение частот двух типов анеуплоидных клеток -моносомных и трисомных - показало, что имеются достоверные различия между ними (р<0,01)Ластота моносомных клеток выше трисомных.

Это ожидаемый результат, так как кроме механизма нерасхождения хромосом, общего для обоих видов анеуплоидии, в происхождении моносомии дополнительно лежит механизм отставания хромосом при клеточном делении, который, судя по представленным данным, занимает весьма существенное значение.

В изученных нами культурах МСК из жировой ткани не наблюдалось существенных различий между частотой числовых нарушений по отдельным хромосомам. Этот факт не дает оснований полагать, что определенные хромосомы, различающиеся по длине и расположению центромеры, предпочтительнее вовлекаются в процессы анеугенеза. Следовательно, выявляемая в культивируемых клетках анеуплоидия является результатом случайного вовлечения хромосом в механизмы процесса нерасхождения или отставания.

Это положение имеет и теоретическое обоснование, так как, исходя из механики движения хромосом в анафазе, их распределение по дочерним клеткам не зависит от длины, а связано с взаимодействием микротрубочек веретена с кинетохором (^УиИке К. е1 а1.1997).

Полученные результаты по изучению культур МСК разных тканей выявили большой «объём» геномной изменчивости, что можно трактовать как свойство культивируемых стволовых клеток.

На поздних пассажах, наряду с выявлением спонтанной анеуплоидии, обнаружен и другой, более существенный факт генетической изменчивости

МСК: на фоне высокой спонтанной нестабильности генома может происходить селективная пролиферация клеток с однотипной хромосомной аномалией.

В табл. 6 и 7 обобщены данные по четырем культурам МСК из жировой ткани, в которых частота анеуплоидии значительно превышала 95% доверительный интервал.

Таблица 6.

Частота анеуплоидных клеток в отдельных культурах МСК на поздних пассажах, в которых наблюдается высокий уровень мозаицизма, который можно принять за клонообразование

Тип аномалии 6-ая хромосома 8-ая хромосома 11-ая хромосома X хромосома

Культура №1

моносомия 19,9 0,8 0 0,6

трисомия 0 0,7 0 0

тетрасомия 0 0,4 0 0

Культура №2

моносомия 2,3 4,4 0,1 1,6

трисомия 0,5 0,7 0,1 0,1

тетрасомия 0 0 0 0

Культура №3

моносомия 21,2 0,6 0,4 0,1

трисомия 1 1,4 0 0,4

тетрасомия 1,4 2,6 0 0

Культура №4

моносомия 5,6 3,0 0 0,6

трисомия 2,7 2,5 0 0

тетрасомия 3,3 2,7 0 0

Статистически доказано, что моносомия по хромосоме 6 в культуре №1 (19,9%), №3 (21,2%) и №4 (5,6%) является неслучайным событием. Высокие показатели анеуплоидии в этих трех культурах свидетельствуют о том, что в

культурах №1 и №3 уже на ранних пассажах, видимо, произошло селективное размножение клеток с моиосомиен по хромосоме 6, с образованием колоний, имевших в несколько раз большую скорость клеточного деления.

Что касается культуры №2 (табл.6), в которой частота моносомии по хромосоме 8 составила 4,4,%, статистически обосновать клонообразование не удалось (р=0,07%), вероятно, из-за недостаточной выборки проанализированных клеток и сравнительно высокой частоты моносомии на ранних пассажах. Так или иначе, данные по этой культуре должны скорее настораживать и относить такие культуры с потенциальными свойствами к клонообразованию.

Если вопрос о мозаичности (клональном характере) культур № 1, № 3 и №4 не вызывает сомнений, то возникает вопрос - при какой частоте анеуплоидных клеток культуры можно относить к мозаичным с наличием клонов? Сложность ответа на этот вопрос заключается в пока неизученных закономерностях динамики клеточных популяций, в которых появляются аномальные клетки, а также в технических особенностях пересева культур. Вполне очевидно, в решении этих вопросов требуются соответствующие статистические обоснования, а так же разработка методического подхода к анализу клонообразования, аналогичному мозаицизму в клинической цитогенетике (Кулешов Н.П., 1978).

Таблица 7.

Характеристика клонов в культурах МСК

№ культур Характеристика клонов Доля анеуплоидных клеток, % Культура Срок фиксации

1 Моносомия Хромосомы 6 19,9 Жировая ткань поздний пассаж 14-ый пассаж

3 Моносомия Хромосомы 6 21,2 Жировая ткань поздний пассаж 9-ый пассаж

4 Моносомия Хромосомы 6 5,6 Жировая ткань поздний пассаж 10-ый пассаж

При изучении МСК костного мозга одна культура обратила на себя внимание. Это культура исследовалась трижды: на 2-ом, 6-ом и 12-ом пассажах. Результаты представлены на рис. 2.

34,3%

23,4%

16,1%

2 пассаж 6 пассаж 12 пассаж

Рисунок 2. Показатели трисомии хромосомы 8 в МСК костного мозга на разных пассажах.

На 2-м пассаже частота трисомных клеток хромосомы 8 составила 23,4% , на 6-ом пассаже - 34,3%, а на 12-ом пассаже - 16,1%. То, что к 6-му пассажу частота трисомии возросла вполне объяснимо: трисомная популяция клеток имела преимущественную селективную пролиферацию, возможно, за счет ускоренного деления клеток. Возникает вопрос при анализе культуры на 12-м пассаже, почему в ней обнаружено лишь 16,1% трисомных клеток. Вместо ожидаемого увеличения трисомных клеток (если это клонообразование) имеет место существенное снижение их частоты. Объяснение этому факту однозначно дать трудно, так как это может быть связано с каким-то отклонением в пересеве клеток, в методических отклонениях при отборе клеток для НвН-анализа, или же это редкий случай, когда под действием каких-то факторов (культуральиых, клеточных и др.) подавляется пролиферация аномальных клеток, достигших предельной частоты.

Безусловно, данная культура требует дальнейшего изучения с привлечением разных клеточно - культуральных технологий.

Пример трисомии хромосомы 8 демонстрирует, что динамика доли анеуплоидных клеток может идти в сторону увеличения и понижения и зависит от количества пассажей.

Таким образом, из характеристики клонов видно, что они могут возникать на ранних и на поздних пассажах, но сравнить их из-за недостаточного количества данных не представляется возможным.

Наличие клонов на ранних пассажах, может говорить о том, что они могли быть внесены в культуру из организма.

Выводы

1. Частота анеуплоидии в МСК из жировой ткани по разным хромосомам (б, 8, 11 и X) на ранних и поздних пассажах одинаковая (37,7%, 29,3%, соответственно). Общий показатель частоты анеуплоидии на одну хромосому составляет 1,2%.

2. Частота анеуплоидных клеток в МСК из костного мозга по разным хромосомам (6, 8, 11, X) на ранних и на поздних пассажах не различается. Общий показатель частоты анеуплоидии на одну хромосому составляет на ранних пассажах 1,6%, на поздних пассажах 1,3%.

3. Расчетная частота анеуплоидии МСК жировой ткани на весь геном составляет на ранних пассажах 37,4%, на поздних пассажах 29,3%, в МСК костного мозга 27,6% на ранних и поздних пассажах.

4. Полученные данные о сходных величинах анеуплоидии на ранних и поздних пассажах свидетельствует о равновесии между частотой возникновения de novo анеуплоидных клеток и их элиминацией.

5. Доля моносомных клеток во всех культурах существенно превышает долю трисомных клеток. Следовательно, кроме механизма нерасхождения хромосом, общего для обоих типов анеуплоидии, в происхождении моносомии дополнительно лежит механизм отставания хромосом при клеточном делении.

6. В изученных культурах МСК выявлено формирование клеточных популяций с однотипным аномальным кариотипом, обладающих селективным преимуществом в размножении.

7. Полученные данные о высоком уровне анеуплоидии и о возможном клонообразовании при культивировании МСК указывают на необходимость проведения тщательного генетического мониторинга МСК в случае использования их для целей клеточной терапии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Бочков Н.П., Гольштейн Д.В., Ржанинова A.A., Никитина В.А., Воронина Е.С., Буяновская O.A. / Оценка генетической безопасности клеточной терапии // Сборник тезисов Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» - г. Москва. - 2007г. - С. 89-90.

2. Nikitina V.A., Buyanovskaya O.A., Voronina E.S., Kosyakova N.V. /The frequency of aneuploidy in human multipotent mesenhimal stromal cells II Materials of the 37th Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society. - Basel, Switzerland, September 9-13. - 2007r. - P. 147.

3. Никитина B.A., Косякова H.B., Буяновская O.A., Бочков Н.П. Анеуплоидия в стволовых клетках человека // Генетика человека и патология - г. Томск: Из-во: «Печатная мануфактура». - 2007г. - вып.8. -С. 246.

4. Буяновская O.A., Никитина В.А. / Характеристика анеуплоидии в стволовых клетках человека // Сборник тезисов V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» Вестн. РАМН, приложение - г. Москва. -2008г.-№6.-С. 77-78.

5. Бочков Н.П., Кулешов Н.П., Никитина В.А., Буяновская O.A., Катосова Л.Д. / Анеуплоидия в стволовых клетках, выделенных из жировой ткани человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - г. Москва. - 2008г. - Т. 146, №9. - С. 320-323.

6. Буяновская O.A., Кулешов Н.П., Никитина В.А., Воронина Е.С., Катосова Л.Д., Бочков Н.П. / Спонтанная анеуплоидия и клонообразование в стволовых клетках человека при разных сроках культивирования. // Клеточные технологии в биологии и медицине - г. Москва. - 2009г., № З.-С. 123-127.

7. Бочков Н.П., Никитина В.А., Буяновская O.A., Кулешов Н.П. Спонтанная анеуплоидия и клонообразование при культивировании стволовых клеток / Сборник тезисов. Пятый съезд ВОГИС II часть - г. Москва - 2009г. - С. 257.

8. Буяновская O.A., Никитина В.А. / Тезисы к 40-летию МГНЦ РАМН Медико-генетический научный центр РАМН «Численные аномалии хромосомного набора в культивируемых МСК». // Медицинская генетика - г. Москва - 2010г., №12 - С. 34.

Подписано в печать:

21.04.2010

Заказ № 3599 Тираж -110 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Буяновская, Ольга Анатольевна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Общая характеристика МСК

1.2. Выделение и культивирование

1.3. МСК как терапевтический препарат. Необходимость оценки на безопасность

1.4. Генетическая характеристика МСК

1.5. Частота анеуплоидии МСК

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Общая характеристика доноров биопсийного материала из жировой ткани и костного мозга

2.2. Культивирование клеток из жировой ткани и приготовление препаратов для анализа.

2.3. Культивирование клеток костного мозга и приготовление препаратов для анализа

2.4. Проведение интерфазного ИЗН-анализа

2.5. Статистический анализ результатов исследования

Глава 3. Анеуплоидия в культурах МСК жировой ткани

3.1. Частота анеуплоидии клеток в культурах МСК жировой ткани на ранних пассажах

3.2. Частота анеуплоидии в культурах МСК жировой ткани на поздних пассажах

3.3. Сравнение частоты анеуплоидии на ранних и поздних пассажа

Глава 4. Анеуплоидия в культурах МСК костного мозга

4.1. Частота анеуплоидных клеток в культурах МСК костного мозга на ранних пассажах

4.2. Частота анеуплоидных клеток в культурах МСК костного мозга на поздних пассажах

4.3. Сравнение частоты анеуплоидии на ранних и поздних пассажах

МСК из костного мозга

Глава 5. Общее заключение

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Частота анеуплоидии в культурах мезенхимных стволовых клеток человека"

Актуальность проблемы

Мезенхимные стволовые клети (МСК) в последнее время стали объектом пристального внимания многих исследователей. Наибольший интерес связан с возможностью применения стволовых клеток в медицинских целях, предполагается, что они по своим характеристикам являются самым перспективным типом «материала» для клеточной и генно-инженерной терапии (Бочков Н.П. с соавт., 2006; Пальцев М.А. с соавт., 2006; Романов Ю.А., Смирнов В.Н., 2008). При длительном культивировании стволовые клетки способны к длительной пролиферации, что дает возможность получать их в необходимом количестве, а также легко индуцировать дифференцировку в остео-, хондро-, мио-, адипоген-ном и др. направлениях (Егоров В.В. с соавт., 2003; Пальцев М.А. с соавт., 2006; Bruder S. et al., 1997, 1998; Zuk P.A. et al., 2001, 2002; Baksh D. et al., 2004). Стволовые клетки обнаружены практически во всех органах и тканях взрослого организма, однако чаще из-за преобладания их исходного количества используется костный мозг и жировая ткань (Мусина P.A. с соав., 2005; Романов Ю.А., Смирнов В.Н., 2009; Zuk P.A. et al., 2001).

Применение клеток вообще и МСК в частности для терапевтических целей должно определяться данными по их безопасности для пациента, в том числе онкогенной (Бочков Н.П. с соав., 2008; Duersberg Р., Li R., 2003; Rubio D. et al., 2005). Вопрос об онкогенной безопасности стволовых клеток остается мало изученным, но крайне важным, по сути дела определяющим развитие клеточной терапии.

Описанные в литературе отдельные случаи показывают, что длительное культивирование стволовых клеток сопряжено с серьезными изменениями генома как на молекулярном, так и хромосомном уровнях его организации.

В литературе есть данные исследований, в которых отмечено о возникновении к нормальным двум хромосомам ещё дополнительной хромосомы 12, 17, X при культивировании ЭСК (Maitra А. et al., 2005; Josephson R. et al., 2006; Josephson R., 2007; Baker D. E. et al., 2007). Maitra А. с соавторами выявили хромосомные перестройки при продолжительном культивировании почти в 50% исследованных линий (Maitra A. et al., 2005).

Исследовательская группа Spits С. охарактеризовала 17 линий ЭСК человека на разных пассажах (Nature Biotechnology 26, 2008). В культивированных линиях выявлены хромосомные аномалии: трисомии и/или моносомии по хромосомам 22, 18 и 17, субмикроскопические дупликации, «гибридную» хромосому, состоящую из короткого плеча хромосомы 18, её центромерного участка и длинного плеча хромосомы 5 либо 7. Описаны также случаи дупликации области 20ql 1.2 (Lefort N., 2008).

Итак, в литературе описаны структурные и численные аномалии хромосомного набора клеток (Бочков Н.П. с соавт., 2007; Draper J. et al., 2004; Rubio D. et al., 2005; Imreh M.P. et al., 2006; Krause D., Van Etten R., 2007; Spits С. et al., 2008), амплификация нек оторых участков ДНК, метилирование пр омоторов, эрозия теломер с нарушением активности фермента теломеразы (Егоров Е.Е. с соавт., 2008; Sen S., 2000; Pathak S. et al., 2002; Rubio D. et al., 2005). Вполне очевидно, что такие генетические изменения и связанные с ними нарушения экспрессии генов вполне могут вызвать селективную пролиферацию (клонооб-разование) генетически аномальных клеток и сказаться на потенциале диффе-ренцировки клеток соответствующих линий, а также могут привести к манифестации стволовых клеток с онкогенетическими свойствами, как следствие этого - к малигнизации после их трансплантации.

На этом основании многие исследователи полагают, что практическое применение МСК в терапевтических целях пока преждевременно и ему должно предшествовать более детальное изучение биологии стволовых клеток (Бочков Н.П. 2006; Бочков Н.П. с соавт., 2007; Rubio D. et al., 2005).

Ряд авторов придерживается иной точки зрения. Bernardo М. et al. (2007) продемонстрировали, что длительное культивирование МСК из костного мозга не приводит к имммортализации клеток и не вызывает каких либо хромосомных нарушений, которые могли бы указывать на потенциальный онкогенный риск стволовых клеток.

Lange С. et al. (2007), исходя из собственных данных, рекомендуют применять стволовые клетки, полученные на ранних пассажах, не позднее 6-го пассажа.

По данным Zhang Z. et al. (2007), 20-ти дневное культивирование МСК не вызывает генетических изменений, следовательно, клетки не несут в себе онко-генного риска.

Противоречивость имеющихся литературных данных, как показывает анализ, объясняется разрозненностью методов изучения генетической изменчивости культивируемых МСК, незначительными выборками исследованных культур. Например, о хромосомной изменчивости (структурные нарушения и численные аномалии хромосом, являются постоянным спутником злокачественного роста) недостаточно судить на основе кариотипического анализа небольшого числа клеток, который выявляет структурные нарушения хромосом, но не позволяет оценивать численные отклонения в хромосомном наборе клеток.

Для оценки генетической изменчивости МСК, должны применяться не только стандартное кариотипирование, оценка уровня хромосомных аберраций, но и другие современные информативные методы молекулярной цитогенетики, исследование анеуплоидии в интерфазных клетках с помощью FISH анализа, а также оценка экспрессии онкогенов и теломеразы (Бочков Н.П., 2006; Бочков Н.П. с соавт., 2007).

Цель работы

Изучить численные нарушения хромосомного набора МСК, выделенных из жировой ткани и костного мозга на разных сроках культивирования с применением FISH-анализа интерфазных ядер.

Задачи исследования

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Изучить частоту анеуплоидных клеток в МСК выделенных из жировой ткани, культивируемых на ранних пассажах (3-5 пассажи) по аутосомам 6, 8, 11 и хромосоме X;

2. Изучить частоту анеуплоидных клеток в МСК из жировой ткани на поздних сроках культивирования (10-15 пассажи) по аутосомам 6, 8, 11 и хромосоме X;

3. Изучить частоту численных нарушений хромосомного набора МСК из костного мозга на разных сроках культивирования (2-12 пассажи) по хромосомам 6, 8 ,11 и X;

4. На основании полученных экспериментальных данных оценить параметры изменчивости по отдельным хромосомам и значение механизмов, лежащих в основе происхождения разных вариантов анеуплоидии.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые проведено фундаментальное исследование одной из важных характеристик биологии стволовых клеток человека - генетической изменчивости - на основе оценки молекулярно-цитогенетическим методом стабильности хромосомного набора на разных сроках культивирования.

Впервые данные, полученные по 3 аутосомам и хромосоме X, позволили оценить частоту анеуплоидии на одну хромосому и рассчитать её в целом на хромосомный набор в культивируемых МСК из жировой ткани и костного мозга.

Показано, что в культурах МСК из разных источников происхождения на ранних и поздних пассажах общая частота спонтанной анеуплоидии существенно не различается, что свидетельствует о достигнутом равновесии между частотой возникновения анеуплоидных клеток и их элиминацией. Установлено, что на фоне высокой спонтанной частоты анеуплоидии в некоторых культуpax может происходить селективное формирование клеточной популяции с однотипной хромосомной аномалией, обладающей преимуществом в размножении, это имеет определенное значение в оценке возможной онкогеннности кло-нообразующих культур МСК.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Для культивируемых МСК как из жировой ткани, так и костного мозга характерна высокая частота спонтанной анеуплоидии, находящаяся в пределах 1-1,5% на одну хромосому. Этот показатель спонтанной частоты моносо-мии и трисомии характерен для культур МСК на ранних и поздних сроках культивирования;

2. На поздних сроках культивирования обнаруживается формирование клеточных популяций с однотипной хромосомной аномалией, имеющих селективное преимущество в размножении;

3. В большинстве культур МСК из жировой ткани частота моносомии значимо выше трисомии, указывающая, что кроме механизма нерасхождения хромосом, являющегося общим для обоих типов анеуплоидии, в происхождении моносомии дополнительно существенную роль играет механизм отставания хромосом в митозе;

4. Полученные результаты демонстрируют значение молекулярно-цитогенетического метода в исследовании хромосомной изменчивости МСК и в выявлении культур с клонообразующими клеточными популяциями.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Буяновская, Ольга Анатольевна

Выводы

1. Частота анеуплоидии в МСК из жировой ткани по разным хромосомам (6, 8, 11 и X) на ранних и поздних пассажах одинаковая 37,7%, 29,3%, соответственно. Общий показатель частоты анеуплоидии на одну хромосому составляет на ранних пассажах 1,6%, на поздних пассажах 1,3%.

2. Частота анеуплоидных клеток в МСК из костного мозга по разным хромосомам (6, 8, 11, X) на ранних и на поздних пассажах не различается. Общий показатель частоты анеуплоидии на одну хромосому составляет 1,2%.

3. Расчетная частота анеуплоидии МСК жировой ткани на весь геном составляет на ранних пассажах 37,4%, на поздних пассажах 29,3%, в МСК костного мозга 27,6% на ранних и поздних пассажах.

4. Полученные данные о сходных величинах анеуплоидии на ранних и поздних пассажах свидетельствует о равновесии между частотой возникновения de novo анеуплоидных клеток и их элиминацией.

5. Доля моносомных клеток во всех культурах существенно превышает долю трисомных клеток. Следовательно, кроме механизма нерасхождения хромосом, общего для обоих типов анеуплоидии, в происхождении моносомии дополнительно лежит механизм отставания хромосом при клеточном делении.

6. В изученных культурах МСК выявлено формирование клеточных популяций с однотипным аномальным кариотипом, обладающих селективным преимуществом в размножении.

7. Полученные данные о высоком уровне анеуплоидии и о возможном клонообразовании при культивировании МСК указывают на необходимость проведения тщательного генетического мониторинга МСК в случае использования их для целей клеточной терапии.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные результаты по изучению анеуплоидии в культурах МСК жировой ткани и костного мозга показывают, что в культивируемых стволовых клетках происходят значительные генетические изменения. Как в МСК жировой ткани, так и костного мозга уже на ранних пассажах обнаруживаются численные нарушения хромосом, приводящие к утрате или увеличению количества отдельных хромосом (табл. 5.1.).

В МСК жировой ткани на ранних пассажах общая частота численных нарушений составляет по хромосоме 6 - 2,5%, хромосоме 8 - 3,1%, хромосоме 111,7%, а в МСК костного мозга, соответственно: 1,6%, 1,7% и 1,6%. При этом частота анеуплоидии моносомия + трисомия в МСК жировой ткани и костного мозга составляет, соответственно, по хромосоме 6-1,9% и 1,2%, по хромосоме 8 — 2,5% и 1,3% и по хромосоме 11 — 1,1% и 1,3%. Видно, что значения средней частоты анеуплоидии, включая моносомию и трисомию, очень сходны и статистических различий между разными хромосомами и МСК разных тканей не об9 наруживается.

Если объединить по 4 хромосомам показатель частоты моносомии и три-сомии, то оказывается, что общая частота анеуплоидии в МСК жировой ткани на ранних пассажах составляет на одну хромосому 1,6%, а в МСК костного мозга — 1,3%. Следовательно, общая частота анеуплоидии по хромосомам на ранних пассажах МСК жировой ткани составляет - 37,4%, костного мозга -27,6%.

Сравнение среднего показателя частоты анеуплоидных клеток в МСК жировой ткани (ЖТ) и костного мозга (КМ) на разных пассажах по аутосомам 6, 8 и 11 и хромосомы X

Хромосома, тип аномалии Ранний пассаж Поздний пассаж

ЖТ КМ ЖТ КМ

Хромосома 6

Моносомия 1,5 0,8 1,1 0,6

Трисомия 0,4 0,4 0,3 0,5

Тетрасомия 0,6 0,4 0,3 0,7

Все типы 2,5 1,6 1,7 1,8

Хромосома 8

Моносомия 2,1 1,0 1,5 0,7

Трисомия 0,4 0,3 0,8 0,2

Тетрасомия 0,6 0,4 0,9 0,3

Все типы 3,1 1,7 3,2 1,2

Хромосома 11

Моносомия 1,0 1,0 0,4 1,0

Трисомия 0,1 0,3 0,2 0,2

Тетрасомия 0,6 0,3 0,2 1,1

Все типы 1,7 1,6 0,8 2,4

Хромосома X (женский пол):

Моносомия 0,8 0,6

Трисомия 0,2 0,3

Тетрасомия 0,6 0,4

Все типы 1,6 1,3 1

Хромосома X (мужской пол):

Нулисомия 0,05 0

Дисомия 0,9 2,3

Все типы 0,9 2,3

На поздних пассажах общий показатель частоты анеуплоидии, оцениваемой по 4 изученным хромосомам, составил в МСК жировой ткани 1,3%, костного мозга - 1,2%. Можно констатировать, что общая частота анеуплоидии в МСК двух изученных тканей на ранних, и на поздних пассажах оказалась близкой.

Такое равновесие спонтанной частоты анеуплоидных клеток в МСК на 3-ем, на 5-ом пассажах и на 10-ом и на 12-ом пассажах представляется интересным и важным фактом биологии культивируемых клеток.

Теоретически анеуплоидные клетки, возникшие в ходе митотического деления, казалось бы, должны накапливаться по мере прохождения очередных циклов деления.

Однако это было бы справедливым в том случае, если бы моносомные и трисомные клетки имели одинаковый показатель жизнеспособности, как и здоровые (то есть с нормальным хромосомным набором).

Следовательно, можно констатировать, что в изученных нами культурах МСК возникновению анеуплоидных клеток противостоит отбор этих клеток.

Сходство общей частоты анеуплоидии на разных пассажах является, скорее всего, результатом наступившего равновесия между частотой возникновения анеуплоидных клеток и давлением отбора против них в ряду клеточных делений.

Подобного рода работы в литературе отсутствуют. Имеется несколько исследований, посвященных вопросу генетической стабильности культивируемых МСК. Однако в этих исследованиях использовали кариотипический анализ, сравнительную геномную гибридизацию и FISH-анализ теломерных участков некоторых хромосом (Bernardo М. et al., 2007; Mareschi К. et al., 2006; Soukup Т. et al., 2006). Авторами этих работ констатировано, что культивирование МСК, даже длительное, не приводит к нестабильности генома.

Полученные нами данные по анеуплоидии с помощью FISH- анализа противоречат приведенной выше точке зрения.

Подтверждают это и другие авторы. Изучение анеуплоидии, используя метод FISH-анализ, в культуре лимфоцитов человека показало, что с увеличением продолжительности инкубации клеток крови повышается частота анеуп-лоидных клеток (Назаренко С.А., Тимошевский В.А., 2004; Sgura A. et al., 1997). Авторы заключают, что в ходе пролиферации клеток в культуре возрастает вероятность ошибок сегрегации хромосом.

Вообще ошибки сегрегации возможны только в делящихся клетках. Это убедительно показано в работе Anastasi J. et al. (1992), изучавших индукцию анеуплоидии у грызунов как in vitro, так in vivo. Этой точки зрения придерживается и другие авторы (Назаренко С.А. с соавт., 1997; Eastmond D. et al., 1990; Surralles J. et al., 1996; Zhang L. et al., 2000). Факт увеличения частоты анеуплоидии в соматических клетках в ходе их культивирования может отражать параллелизм процессов репликативного старения клеток in vitro и естественного старения организма (Guttenbach M. et al., 1995). В нашем исследовании пробы жировой ткани и костного мозга получены в основном от доноров, возраст большинства которых составляет 50 лет и выше.

О генетической нестабильности в культивируемых МСК свидетельствует и другой, более существенный, факт. Из 3-х культур МСК жировой ткани и в одной культуре МСК костного мозга выявлено клонообразование, когда наряду с нормальными клетками происходит селективное размножение клеток с одной и той же хромосомной аномалией. Расчеты показывают, что аномальный клон по скорости размножения клеток значительно превышает популяцию клеток с нормальным кариотипом.

Клонообразующая популяция клеток часто приобретает характеристики опухолевых клеток (Rubio D. et al., 2005; Wang Y. et al., 2005).

Введение спонтанно трансформированных при культивировании клеток лабораторным мышам, как показано в работе Rubio D. et al. (2005), формируют многочисленные опухоли.

Таким образом, спонтанная трансформация и клонообразующие популяции клеток являются фактором риска развития опухоли в случае применения их в терапевтических целях.

Возможность клонообразования при культивировании МСК показана в работе Бочкова Н.П. и Никитиной В.А. (2008). Авторами в 5-ти культурах из 26 проанализированных на разных пассажах выявлены клоны клеток с аномальными кариотипами. Клеточные клоны были представлены моносомией хромосомы 6 и транслокацией 21/22, моносомией и трисомией по хромосоме 18. Возможность клонообразования отмечена и при культивировании эмбриональных стволовых клеток. Ряд авторов отмечает, что при длительном культивировании ЭСК человека наблюдается образование специфических клонов, чаще всего с избытком материала хромосом X, 12 и 17 (Buzzard J. et al., 2004; Baker D. et al., 2007; Harrison N. et al., 2007). N. Heins et al. (2004) в 2-х линиях ЭКС из 6 выявили клон с трисомией по хромосоме 13. Возможность клонообразование в ЭСК подтверждена и другими авторами (Рубцов Н.Б. с соавт. 2007; Mitalipova М. et al, 2005; Maitra A.et al., 2005).

Таким образом, результаты нашего исследования и данные литературы показывают разнообразие происходящих в культуре взрослых МСК хромосомных нарушений, опровергая мнения некоторых исследователей о стабильности генома этих клеток и их полной безопасности (Buzzard J.J. et al., 2004; Bernardo M. et al., 2007 и др.).

Buzzard J.J. с соавт. полностью не отвергает факта возможной нестабильности генома МСК, однако полагает, что клетки с хромосомными изменениями не опасны при трансплантации, т.к. их доля незначительна.

Всё больше появляется данных, свидетельствующих, что генетическая изменчивость МСК связана не только с нарушениями хромосомного набора при культивировании, но и с другими нарушениями - амплификацией определенных районов хромосом, метилированием промоторов протоонкогенов, потерей повторов теломер с последующим изменением активности теломеразы (Sen S.,

2000; Pathak S. et al., 2002; Draper J. et al., 2004; Rubio D. et al., 2005). Эти и другие авторы полагают, что регистрируемая в культивируемых МСК хромосомная нестабильность может быть связана с молекулярно-генетическими изменениями.

Они считают, что возникающие хромосомные аномалии являются частью генетической изменчивости стволовых клеток при культивировании, которая связана с теломеразной активностью из-за эрозии теломерного участка и несут онкогенный риск.

Противоречивость имеющихся данных показывает, что в генетике взрослых МСК имеется ещё много вопросов, ответы на которые можно получить в дальнейших исследованиях. Полученные нами данные о геномной изменчивости позволяют сделать вывод, что взрослые МСК при длительном культивировании подвержены генетической нестабильности. При этом нестабильность генома на геномном уровне его организации выражена, с одной стороны, появлением хромосомных аномалий (в нашей работе - численными нарушениями хромосомного набора), характерных как для лимфоцитов, так и для МСК и связанных с процессом их культивирования и старения.

Условно этот вид изменчивости можно определить как спонтанный, и её можно оценить уровнем, той частотой хромосомных аберраций и анеуплоидии, выявляемой в большинстве культур МСК разными методами цитогенетическо-го анализа.

С другой стороны, обнаруживается и другой вид генетической изменчивости, когда на фоне спонтанных хромосомных аномалий обнаруживается клеточная популяция с однотипным аномальным кариотипом, обладающая селективным преимуществом в размножении, тем "самым, неся в себе определенный онкогенный риск, в случаях применения таких клеток в терапевтических целях. Исходя из этого, определенно можно сказать, что все культуры МСК, которые могут использоваться в клинике должны быть, как минимум, кариотипированы на предмет исключения хромосомных структурных аберраций и исследованы с помощью FISH—анализа на предмет численных нарушений хромосомного набора, как наиболее частого вида нестабильности генома. 4

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Буяновская, Ольга Анатольевна, Москва

1. Бочков Н.П. Наследственность человека и мутагены внешней среды / Н.П. Бочков, А.Н. Чеботарев М: Медицина. 1989. - С. 272.

2. Бочков Н.П. Хромосомная изменчивость мультипотентных мезенхималь-ных стромальных клеток человека/ Н.П. Бочков, Е.С. Воронина, Н.В. Кося-кова // Клеточные технологии в биологии и медицине.-2007. №1- С. IIIS.

3. Бочков Н.П. Клеточная терапия в свете доказательной медицины/ Н.П. Бочков// Клиническая медицина, №10, 2006. С. 4-10.

4. Бочков Н.П. Клеточная терапия наследственных болезней/ Н.П. Бочков, В.А. Никитина, Т.А. Рослова, И.Н. Чаушев, И.И. Якушина// Вестник Российской РАМН, № ю, 2008. С. 20-27.

5. Бочков Н.П. Цитогенетика стволовых клеток человека /Н.П. Бочков, В.А. Никитина // Молекулярная медицина, №3, 2008. С.40-47.

6. Гетерохроматиновые районы хромосом человека: клинико-биологические аспекты / С.Г. Ворсанова и др. М.:ИД «МЕДПРАК-ТИКА-М», 2008. - С. 300.

7. Гринчук Т.М. Характеристика культуры мезенхимных стволовых клеток мыши, экспрессирующих GFP/ Т.М. Гринук, K.M. Иванцов, JI.JL Алексеен-ко, И.В. Кожухарова, А.М.Зайчик, Н.С. Петров, В.М. Михайлов, Б.В. Попов//Цитология. 2008. Том 50, №12. - С. 1030-1035.

8. Егоров Е.Е. Стволовые клетки человека / Е.Е. Егоров, A.A. Иванов, М.А. Пальцев// Молекулярная медицина №2, 2003. С. 3-14.

9. Егоров Е.Е. Теломеры, теломераза и стволовые клетки в мезенхимах патологии человека/ Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Том 1 /под ред. Пальцева М.А. М.: ОАО «Издательство «Медицина», издательс-во «Шико», 2009.- С. 233-264.

10. Иванов A.A. Перспективы примененная стволовых клеток в медицине/ Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Том 1/ под ред. Паль-цева М.А. М.: ОАО «Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009.-С.31-43.

11. Кулешов Н.П. Диссер. доктор., 1978, М., ИМГ АМН.

12. Кулешов Н.П. Методические подходы к диагностике мозаицизма в интерфазных клетках FISH-анализом/ Н.П. Кулешов, М.С. Манвелян, И.В. Симо-нян, P.M. Арутюнян, О.Б. Барцева// Пренатальная диагностика 2007. - №3 -С. 198-201.

13. Мусина P.A. Сравнительная характеристика мезенхимальных стволовых клеток, полученных из разных тканей человека/ P.A. Мусина, Е.С. Бекчано-ва, Г.Т. Сухих// Клеточные технологии в биологии и медицине 2005.- №2-С. 89-94.

14. Назаренко С.А. Анализ частоты спонтанной анеуплоидии в соматических клетках человека с помощью технологии интерфазной цитогенетики/ С.А. Назаренко, В.А. Тимошевский // Генетика. 2004.- Том 40, №2 С.195-204.

15. Назарнко С.А. Интерфазный анализ Х-анеуплопдии методом флуоресцентной гибридизации in situ в разных тканях здоровых лиц / С.А Назарнко., B.JI. Тимошевский, Н.В. Островерхова// Генетика. 1997.- Т. 33. №10.- С. 14261430.

16. Никольский H.H. Эмбриональные стволовые клетки человека проблемы и перспективы/ H.H. Никольский, И.А. Габай, Н.В. Сомова // Цитология. Том 49. №7.- 2007.- С. 529-537.

17. Пальцев М.А. Стволовые клетки в современной медицине: настоящее и будущее/ М.А. Пальцев, A.A. Иванов, В.Н. Смирнов, Ю.А. Романов// Молекулярная медицина, 2006 №2. - С.5-9.

18. Пальцев М.А. Что есть стволовая клетка/ М.А. Пальцев, В.В. Терских, A.B. Васильев// Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Том 1 /под ред. Пальцева М.А. — М.: ОАО «Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009.-С. 13-24.

19. Попов Б.В. Спонтанная трансформация и иммортализация мезенхимных стволовых клеток в культуре in vitro/ Б.В.Попов, Н.С. Петров, В.М. Михайлов, А.Н. Томилин, JI.JI. Алексеенко, Т.М. Гринчук, A.M. Зайчик// Цитология. 2009. Том 51, №2. С. 91-100.

20. Ржанинова A.A. Получение и фенотипическая характеристика мезенхимных стволовых клеток из тимуса плодов человека/ A.A. Ржанинова, С.Н. Горностаева, Д.В. Гольдштейн/ Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005.-№1-С. 34-40.

21. Романов Ю.А. Мезенхимальные стволовые клетки: биология и перспективы клинического применения/ Романов Ю.А., В.Н. Смирнов // Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Том 1 / под ред. Пальцева М.А.

22. M.: ОАО «Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009. С. 193201.

23. Рубцов Н.Б./ Рубцов Н.Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих, Новосибирск, 2006.

24. Рубцов Н.Б. Цитогенетика стабильных линий эмбриональных стволовых клеток человека hESM 01-04/ Н.Б. Рубцов, М.А. Прохорович, М.А. Лагарькова// Медицинская генетика. 2007.- Т.6, №10 (64) - С. 11-16.

25. Фриденштеин А .Я. Клеточные основы иммунитета/ Фриденштеин А.Я., Чертков И. Л. // 1969. М. С. 256.

26. Фриденштейн А.Я. Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предшественники/ А.Я. Фриденштейн, К.С. Лалыкина // 1973. М: Медицина. С. 222.

27. Шварцбурд П.М./ Стволовые клетки в развитии рака и предракового микроокружения/ П. М. Шварцбурд // Молекулярная медицина №4, 2007. С. 39.

28. Anastasi J. Detection of trisomy 12 in chronic lymphocytic leukemia by fluorescence in situ hybridization to interphase cells: a simple and sensitive method /J. Anastasi, M. Misbelle, L. Beau// Blood.- 1992.Y.79. P. 1796-1801.

29. Baker D.E. Adaptation LO culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo/ D.E. Baker, N. J. Herrison, E. Maltby// Nat. Biotechnol 2007. 25(3). P.207-215.

30. Baksh D. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy /D. Baksh, L. Song, R.S. Tuan// J. Cell Mol Med. 2004. Vol. 8 - P. 301-316.

31. Bennett J. H. Adipocytic cells cultured from marrow have osteogenic potential Joyner C J., Triffitt J. T. /J. H. Bennett, Owen M. E., Joyner C J., Triffitt J. T.// Journal of Cell Science. 1991.-Vol. 99.—P. 131- 139.

32. Bianco P. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications/ P. Bianco, M. Riminucci, S. Gronthos, P.G. Robe y// Stem Cells.— 2001.—Vol. 19.—P. 180-192.

33. Bruder S. Mesenchymal stem cells in osteobiology and applied bone regeneration/ N. Jaiswal, N.S. Ricalton, J.D. Mosca, K.H. Kraus, S. Kadiyala// Clinical ortophopaedics and releted research.- 1998. P. 247-256.

34. Buzzard J.J. Karyotype of human ES cells during extended culture. /J.J. Buzzard, N.M. Gough, J.M. Crook, A. Colman//Nat Biotechnol. 2004 Apr.;22(4).P. 381-2

35. Campagnoli C. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. /C. Campagnoli, I.A. Roberts, S. Kumar, P.R. Bennett, I. Bellantuono, N.M. Fisk// Blood. 2001 Oct 15; 98(8). P. 2396-402.

36. Caplan A. I. Mesenchymal stem cells/ A. I. Caplan// J. Orthop. Res.- 1991.- Vol. 9.-P. 641 —650.

37. Colter D. C. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow /D.C. Colter, R. Class, C.M. DiGirola-mo, D.J. Prockop// Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-2000.- Vol. 97. P. 3213-3218.

38. Conget P.A. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells /P.A. Conget, J.J. Minguell// J. Cell. Physiol.— 1999.—Vol. 181.—P. 67-73.

39. Dennis J.E. Origin and differentiation of human and murine stroma. /J.E. Dennis, P. Charbord// Stem Cells. 2002. Vol. 20(3). P. 205-14.

40. Dominici M.D. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement/ M.D.

41. Dominici, Blanc K Le, I. Mueller, I. Slaper-Cortenbach, F. Marini, D.S. Krause,

42. R. Deans, A. Keating, Dj. Prockop and Em. Horwitz // Cytotherapy. 2006, Vol. 8, No. 4-P. 315-317.

43. Duesberg P. Aneuploidy, the somatic mutation that makes cancer a species of its own/ P. Duesberg, D. Rasnick //Cell Motility and Cytoskeleton. 2000. Vol. 47.-P. 81-107.

44. Duesberg P. Multistep carcinogenesis a chainreaction of aneuploizations / Duesberg, R. Li. // Cell Cycle. 2003. Vol. 2. № 3. P. 202-210.

45. Eastmond D.A. Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in situ hybridization with chromosome-specific DNA probes/ D.A. East mond, D. Pinkel// Mutation Research 1990. Vol. 234. - P. 303-318.

46. Gronthos S. Molecular and cellular characterization of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow/ Gronthos S., A. C. W. Zannettino, J. Hay S.// J. Cell Sci.-2003.-Vol. 116.-P. 1827-1835.

47. Gronthos S. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells./ S. Gronthos, D.M. Franklin, H.A. Leddy, P.G. Robey, R.W. Storms, J.M. Gimble // J Cell Physiol. 2001 Oct; 189(1) P. 54-63.

48. Guo Z. Biological features of mesenchymal stem cells from human bone marrow /Z. Guo, J. Yang, X. Liu// Chinese Medical Journal.-2001.— Vol. 114.—P. 950—953. 35.

49. Guttenbach M. Sex chromosome loss and aging: in situ hybridization studies on human interphase nuclei /M. Guttenbach, B. Koschorz, U. Bernthalcr // The American Journal of Human Genetics 1995. Vol. -57. P. 1143-1150.

50. Harrison NJ. Culture adaptation of embryonic stem cells echoes germ cell malignancy / N.J. Harrison, D. Baker, P.W. Andrews // Int. J. Androl. 2007 Aug; Vol. 30(4)-P. 275-81.

51. Heim S. Cancer Cytogenetic. /S.Heim, F. Mitelman// Cancer Cytogenetic. 1995. Wiley-Liss, New York.

52. Heins N. Derivation, characterization, and differentiation of human embryonic stem cells // N. Heins, M.C. Englund, C. Sjoblom, U. Dahl, A. Tonning, C. Bergh, A. Lindahl, C. Hanson, H. Semb // Stem Cells. 2004; Vol. 22(3) P. 36776.

53. Horwitz E. Clarification of the nomenclature for MSC: the International Society for Cellular Therapy position statement / Horwitz E., Le Blanc K., Dominici M // Cytotherapy.-2005.-Vol. 7.- P. 393-395.

54. Horwitz E.M. Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell therapy of bone. / E.M. Horwitz, P.L. Gordon. //PNAS; Vol.99. N3. 2002 - P. 8932-8937.

55. Hu Y. Isolation and identification of mesenchymal stem Vcells from human fetal pancreas / Hu Y., Liao L., Wang Q.// J. Lab. Clin. Med.- 2003.-Vol. 141.- P. 342-349.

56. Hurst C.D. High-resolution analysis of genomic copy number alterations in bladder cancer by microarray-based comparative genomic hybridization/ C.D. Hurst, H. Fiegler, P. Carr // Oncogene. 2004, Vol. 23(12). P. 2250-63.

57. Igura K. Isolation and characterization of mesenchymal progenitor cells from chorionic villi of human placenta / K. Igura, X. Zhang, K. Takahashi, A. Mitsuru, S. Yamaguchi, T.A. Takashi // Cytotherapy 2004; Vol. 6(6) P. 543-53.

58. Im G. Do adipose tissue-derived mesenchymal stem cells have the same osteogenic and chondrogenic potential as bone marrow-derived cells? /G. Im, Y. Shin, K. Lee // Osteoarthritis Cartilage.-2005. Vol. 13.- P. 845853.

59. Imreh M.P. In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells / M.P.Imreh, K. Gertow, J. Cedervall, C. Unger,

60. K. Holmberg, K. Szôke, L. Csôregh, G. Fried, S. Dilber, E. Blennow, L. Ah-rlund-Richter// J Cell Biochem. 2006 Oct 1: Vol. 99(2). P. 508-16.

61. Josephson R. A molecular scheme for improved characterization of human embryonic stem cell lines. /R. Josephson, G. Sykes, Y. Liu // BMC Biology 2006.4. P. 28.

62. Josephson R. Molecular cytogenetics making it sale for human embryonic stem cells to enter the clinic /Josephson R.// Eipert Rev Mol Diayn. Jul 2007, Vol. 7, No. 4.- P. 395-406.

63. Kassem M. Adult stem cells and cancer. /M. Kassem, J.S. Burns, J. Garcia Castro, D. Rubio Munoz// Cancer Res. 2005 Oct 15; Vol. 65(20)-P. 9601

64. Kassem M. Mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential clinical applications. M. Kassem// Cloning Stem Cells. 2004; Vol. 6(4)- P.369-74.

65. Kato A. Numerical aberrations of chromosome 16, 17, and 18 in hepatocellular carcinoma a FISH and FCM analysis of 20 cases /A. Kato, K. Kubo, F. Kurokava // Digestive Diseases and Sciences. 1998. V. 43.- P. 1-7.

66. Koynova D.K. Gene-specific fluorescence in-situ hybridization analysis on tissue microarray to refine the region of chromosome 20q amplification in melanoma/ D.K. Koynova, E.S. Jordanova, A.D. Milev II Melanoma Res. 200.- Vol. 17(1)-P. 37-41.

67. Krause D. Right on target: eradicating leukemic stem cells/ D. Krause, R.Van Et-ten// TRENDS in Molecular Medicine 2007. Vol. 13(11)-P. 470-81.

68. Le Blanc K. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidetitical mesenchymal stem cells/ K. Le Blanc, I. Rasmusson, B. Sundberg, C. Goihersnom, M. Hassan, M. Uzunel, O. Ringden// Lancet. 2004. 363: 1439—1441.

69. Lefort N. Human embryonic stem cells reveal recurrent genomic instability at 20qll.21/N. Lefort, M. Feyeuxl, C. Bas, O. Feraud, Bennaceur- A. Griscelli, G. Tachdjian, M. Peschanskil, A. Perrier //Nature Biotechnology 26 -2008, 1364 -1366.

70. Lin J. R. In vitro culture of human bone marrow mesenchymal stem cell clones and induced differentiation into neuron-like cells /J. R. lin, K. Y. Guo, J. Q. Li, D. A. YanII Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao.- 2003.- Vol. 23.-P. 251-253, 264.

71. Lomax B.L. The utilization of interphase cytogenetic analysis for the detection of mosaicism./ B.L. Lomax ,D.K. Kalousek, B.D. Kuchinka, I.J. Barrett, K.J. Harrison, H. Safavi// Hum Genet. 1994 Mar; 93(3):243-7.

72. Lugasse E. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo./ E. Lugasse, H. Connors, M. AI-Dhalimy, M. Reitsma, M. Dohise, L. Osborne, X. Wong, M. Finegold, I. L. Weissman, M. Grompe// Nat. Med. 2000. 6: 1229—1234.

73. Mateizel I. Derivation of human embryonic seem cell lines from embryos obtained after IVF and after- PGD for monogenic disorders/ I. Mateizel, N. DETemmerman, U. Ullmann// Human Reproduction 2006. 21. 503-11.

74. Mairta A. Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells./ A. Mairta, D.E. Arking, N. Shivapurkar//Nature Genetics 2005; 37: 1099-103.

75. Mareschi K. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow./ K. Mareschi, I. Ferrero, D. Rustichelli, S. Aschero, L. Gammaitoni, M. Aglietta, E. Madon, F. Fagioli // J. Cell Biochem. 2006 Mar 1; 97(4):744-54.

76. Minguell J. Biology and clinical utilization of mesenchymal progenitor cells/ J. J. Minguell, P. Conget, A. Erices// Brazilian J. Med. Biol. Res.- 2000.- Vol. 33,- P. 881-887.'

77. Mitalipova M.M. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells / M.M. Mitalipova, R.R. Rao, D.M. Hoyer, J.A. Johnson, L.F. Meisner, K.L. Jones, S. Dalton, S.L.Stice//Nat Biotechnol. 2005 Jan;23(l): 19-20

78. Pathak S. Aneuploidy, stem cells and cancer./ Pathak S., Multani A.S.// EXS. 2006; (96):49-64.

79. Pathak S. Telomere dynamics, aneuploidy, stem cells, and cancer (review)/ Pathak S., Multani A.S., Furlong C.L., Sohn S.H. // Int. J Oncol. 2002 Mar; 20(3):637-41.

80. Phinney D.G. Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice; variations in yield, growth, and differentiation/ D.G. Phinney, G. Kopen, R. L. Isaacson., D. J. Proekop //J. Cell. Biochem. 1999. 72: 570—585.

81. Pittenger M. F. Mesenchymal Stem cells and their potential as cardiac therapeutics / M. F. Pittenger, B. J. Martin // Circ. Res. 2004. 95.: 9—20.

82. Pittenger M.F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells./ M.F. Pittenger, A.M. Mackay, S.C. Beck, R. K. Jaiswal, R. Douglas, J. D. Mosca, M. A. Moorman, D. W. Simonetti, S. Craig, D.R. Marshak// Science. 1999. 284: 143—147.

83. Popov B.V. Lung epithelial cells A549 induce epithelial differentiation in mouse mesenchymal BM stem cells by paracrine mechanism./ B.V. Popov, V.B. Seri-kov, N.S. Petrov, T. Izusova, N. Gupta, A. Matthay // Tissue Engineering. 2007. 13: 2445—2450.

84. Proekop D. Isolation and characterization of rapidly selfrenewing stem cells from cultures of human marrow stromal cells/ Proekop D. J., Sekiya I., Colter D.C.// Cytotherapy.-2001.-Vol. 3.-P. 393-396.

85. Proekop D. J. Marrow stromal cells as stem for nonhematopoietic tissues. Science. 1997. 276: 71—74.

86. Quarto R. Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells/ Quarto R., Mastrogiacomo M., Cancedda R.// England Journal of Medicine — 2001.—Vol. 344.—P. 385-386.

87. Ramalho-Santos M. «Sternness»: transcriptional profilining of embryonic and adult stem cells/ M. Ramalho-Santos, S. Yoon, Y. Matsuzaki. //Science.- 2002.—Vol. 298,- P. 597-600.

88. Reyes M. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells/ M. Reyes, T. Lund, T. Lenvik ., D. Aguiar, L. Koodie , C. Verfaillie // Blood. 2001 Nov 1; 98 (9):P 2615-2625.

89. Rojaset M. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung./ M. Rojaset, J. Xu, C. R. Woods., A.L. Mora, W. Spears, J. Roman, K. L. Brigham.// Amer. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2005. 33: 145—152.

90. Roonev D. E. / D.E. Roonev, B.N. Czepulkowski// Human Cytogenetics: A Practical Approach. N.Y.: Oxford Univ. Press. 1992. V. 1. P. 274.

91. Rubio D. Spontaneous human adult stem cell transformation./ D. Rubio, J. Garcia-Castro, M.C. Martin, de la Fuente R, J.C. Cigudosa, A.C. Lloyd, A. Bernad// Cancer Res. 2005 Apr. 15;65(8): 3035-9.

92. Sen S. Aneuploidy and cancer./ S. Sen// Curr Opin Oncol. 2000 Jan; 12(l):82-8.

93. Serakinci N. Adult human mesenchymal stem cell as a target for neoplastic transformation./ N. Serakinci, P. Guldberg, J.S. Burns, B. Abdallah, H. Schradder, T. Jensen, M. Kassem // Oncogene. 2004 Jun 24; 23(29):5095-8.

94. Serikov V. B. Evidence of temporary epithelial repopulation and rare clonal formation by BM-derived cells following naphthalene injury in mice./ V. B. Serikov, B. V. Popov, V. M. Mikhaylov, N. Gupta, M. A. Matthay.// Anat. Rec. 2007. 290: 1033—1046.

95. Shi Q. Aneuploidy in human spermatozoa: FISH analysis in men with constitutional chromosomal abnormalities, and in infertile men/ Q. Shi, R.H. Martin// Reproduction. 2001 May; 121(5):655-66.

96. Shu S. N. Hepatic differentiation capability of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells/ S. N. Shu, L. Wei, J. H. Wang, Y. T. Zhan, H. S. Chen, Y. Wang.// World J. Gastroenterology. 2004. 10: 2818—2822.

97. Sotiropoulou P.A. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research/ Sotiropoulou P. A., Perez S. A., Salagianni MM Stem Cells.—2006.- Vol. 24.- P. 462-471.

98. Soukur T. Mesenchymal stem cells isolated from the human bone marrow: cultivation, phenotypic analysis and changer in proliferation kinetics/ T. Soukur, J. Mokry, J. Karbanova, R. Pytlik, L. Kucerova //Oridginal article . 2006. 49 (1). P. 27-33.

99. Spits C. Recurrent chromosomal abnormalities in human embryonic stem cells./ C. Spits, I. Mateizel, M. Geens, A. Mertzanidou, C. Staessen, Y. Vandeskelde, J. Van der Elst, Liebaers I., K. Sermon// Nat. Biotechnol. 2008 Dec., 26(12):1361-3.

100. Strauer B.E. Myocardial regeneration after intracoronary transplantation of human autologous stem cells following acute myocardial infarction / Strauer B.E., Brehm M., Zeus T.//Dtsch. Med. Wochenschr. 2001. Vol.126. P. 932-938.

101. Surralles J. In vivo cytogenetic damage revealed by FISH analysis of micronuclei in uncultured human T lymphocytes/ J. Surralles, G. Falck, H. Norppa // Cyto-gen. Cell. Gone. 1996. V. 75. P. 151-154.

102. Tanner M. M. Independent amplification and frequent co-amplification of three nonsyntemc regions or the long arm of chromosome 50 in human breast cancer/ M. M. Tanner, M. Tirkkonen, A. Kailicimemi // Cancer Res. 1996. 56(151) 3441-5.

103. Tonon G. Wong K.K . Mauhk G.High-resolution genomic profiles of human lung cancer./ G. Tonon, K.K. Wong, G. Mauhk// PNAS 2005. 102(27) 9625-30.

104. Tropel P. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from adult mouse bone marrow/ Tropel P., Noel D., Platet N.// Exp. Cell Res.— 2004.— Vol. 295.-P. 395— 406.

105. Tsai M.S. Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second-trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. /M.S. Tsai, J.L. Lee, Y.J. Chang, S.M. Hwang// Hum Reprod. 2004 Jun; 19(6): 1450-6. Epub 2004 Apr 22.

106. Wang Y. Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture./ Y. Wang, D.L. Huso, J. Harrington, J. Kellner, D.K. Jeong, J. Turney, I.K. McNiece II Cytotherapy. 2005; 7(6): 509-19.

107. Wuttke K. Detection of chromosome 2 and chromosome 7 within X-ray- or col-chicine-induced micronuclei by fluorescence in situ hybridization / K. Wuttke, C. Streffer, W.U. Muller//Mutagenesis.- 1997. V. 12. P. 55-59.

108. Zhang L. Loss of chromosome 13 in cultured human vascular endothelial cells /

109. Zhang, H. Aviv, J.P. Gardner et al.// Experimental cell research.- 2000. V. 260. P. 357-364.

110. Zhang Z.X. Cytogenetic analysis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged in vitro./ Z.X. Zhang, L.X. Guan, K. Zhang, S. Wang, P.C. Cao, Y.H. Wang, Z. Wang, L.J. Dai// Cell Biol Int. 2007.-Vol.31, №6. P. 645648.

111. Zuk P.A. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells /P.A. Zuk, M. Zhu, P. Ashjian, De Ugarte D.A., J.I. Huang, H. Mizuno, Z.C. Alfonso, J.K. Fräser, P. Benhaim, M.H. Hedrick// Mol Biol Cell. 2002. Dec., 13(12):4279-4295.

112. Zuk P.A. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies./ P.A. Zuk, M. Zhu, H. Mizuno, J. Huang, J.W. Futrell, A.J. Katz, P. Benhaim, H.P. Lorenz, M.H. Hedrick // Tissue Eng. 2001. Vol.13, №12, P. 4279-4295.