Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биоспецифические взаимодействия на металлических наночастицах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биоспецифические взаимодействия на металлических наночастицах"

На правах рукописи

БОГАТЫРЕВ Владимир Александрович

БИОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НА МЕТАЛЛИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦАХ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

I

Саратов - 2005 г.

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН), г Саратов

Научный консультант: доктор физико-математических наук, профессор

Ведущая организация: Тихоокеанский институт биоорганической химии

Защита состоится 23 ноября 2005 г. в 1300 час. на заседании Диссертационного совета Д 002 146 01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13). Тел./факс (8452)970383

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат разослан " октября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Н.Г. Хлебцов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.Ф. Топунов доктор биологических наук C.B. Тучин доктор химических наук А.А. Камнев

Дальневосточное отделение РАН

доктор биологических наук

В.Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В диссертационной работе поставлена актуальная научная задача, состоящая в изучении оптических изменений в системах взаимодействующих биомакромолекул, иммобилизованных наночастицами (НЧ) благородных металлов. В общем случае, такие взаимодействия могут приводить к двум принципиально различным сюжетам, образованию агрегатов частиц, имеющих упорядоченную или случайную организацию, или изменению параметров полимерного слоя (плотности, толщины, коэффициента преломления) К сожалению, зачастую такие структурные перестройки в системе могут приводить к сходным изменениям ее оптических характеристик. Тем не менее, сопоставление данных спектрофотометрии, спектронефелометрии и динамического светорассеяния позволяет охарактеризовать структуру образующихся комплексов и динамику их формирования. Это, в свою очередь, в сопоставлении с данными независимых физико-химических методов исследования (твердофазного анализа, световой и электронной микроскопии), позволяет судить о характере межмолекулярных биоспецифических взаимодействий.

Актуальность темы. Диссертационная работа затрагивает вопросы нанотехнологии, признанной приоритетным направлением развития мировой и отечественной науки. Современные методы биоаналитической химии развиваются в сторону миниатюризации и сверхминиатюризации устройств, автоматизации процессов регистрации и алгоритмизации обработки экспериментальных данных. В этом контексте нанонаука представляет собой принципиально новую ступень Замена только метки с флюоресцентной на коллоидно-металлическую, серебряную или золотую, позволяет во много раз (до 500000) увеличить чувствительность диагностических систем (Yguerabide and Yguerabide, 2001) При этом возможно использование коммерчески доступных иммуно- и генодиагностических наборов реактивов и стандартного лабораторного оборудования Детектирование сигнала от одной частицы, в частности спектрального сдвига резонансного светорассеяния, позволяет определить сверхнизкие концентрации биомолекул и константы аффинности взаимодействий (Raschke et al, 2003; McFarland and Van Duyne, 2003).

Рассматриваемая работа посвящена разработке новых методов исследования структуры различных компонентов живых организмов: поверхностных структур бактериальных клеток, белков системы цитоскелета, полинуклеиновых кислот системы посттранскрипционной регуляции генома с использованием биоспецифических взаимодействий, регистрируемых посредством металлических НЧ с плазмонным резонансом. В область исследований входило также изучение свойств и функционирования молекул и надмолекулярных структур, образующих биоспецифические комплексы (антиген-антитело, пектин-полисахарид, фермент-субстрат, авидин-биотин и др) на частицах коллоидных металлов.

Целью диссертационной работы было теоретическое и экспериментальное развитие методологии синтеза, биоспецифической функционализации и применения золотых НЧ с плазмонным резонансом, преобразующих молекулярное взаимодействие «зонд-мии т оптический

сигнал для решения биоаналитических зар

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи исследования:

1 Оптимизация технологии получения золотых наносфер и наностержней с заданными геометрическими параметрами методами одностадийной и многостадийной (зародышевый метод) реакции 2. Развитие и практическая реализация нековалентной функционализации золотых наночастиц биомакромолекулами (белками, лектинами, полисахаридами).

3 Разработка методологии контроля морфометрических параметров наночастиц и биомаркеров на основе комбинированного использования спектроскопии поглощения, дифференциальной спектроскопии статического рассеяния света, динамического светорассеяния, седиментационного и электронно-микроскопического анализа

4. Теоретическое и экспериментальное исследование зависимости спектров поглощения и дифференциального статического рассеяния света металлическими частицами в условиях изменения общего и локального диэлектрического окружения.

5. Развитие технологии синтеза и оптического контроля геометрических и молекулярных (количество молекул-зондов) параметров ДНК-маркеров, получаемых ковалентной пришивкой олигонуклеотидов к поверхности золотых наночастиц. Исследование спектров поглощения и дифференциального рассеяния света при гибридизации ДНК-маркеров с комплементарными полинуклеотидами

6. Развитие методологии твердофазного анализа (дот-блот тест) растворимых и корпускулярных (целых бактериальных клеток и их фрагментов) антигенов (мишеней).

7. Развитие метода визуализации биомаркеров методом световой микроскопии темного поля.

Методы исследований, обоснованность и достоверность результатов. Основными экспериментальными методами исследования были спектроскопия поглощения в их/ЛЛв области, принципиально новый, защищаемый в данной работе, метод спектронефелометрии (спектроскопии рассеяния под углом 90°), названный нами спектроскопией дифференциального статического светорассеяния (ДССР) и метод динамического светорассеяния (ДСР) в гомодинном варианте приборного исполнения (оригинальная установка) В работе использованы данные электронной просвечивающей и сканирующей, а также световой просвечивающей и темнопольной микроскопии.

Для получения гидрозолей металлов и их конъюгирования с биомакромолекулами использованы стандартные химические методы. В качестве биоспецифической части маркеров (иммуноглобулины, пектины, стрептавидин, ферменты и т п.) использовались, чаще всего, коммерческие препараты Выбор методов обоснован, главным образом, учетом возможности воспроизведения в широком круге неспециализированных лабораторий без использования уникального оборудования.

Достоверность результатов обусловлена их воспроизводимостью, в том числе в других лабораториях, сопоставлением данных независимых физико-химических методов анализа и литературных данных, проведением в необходимых случаях статистической обработки, анализом ошибок и погрешностей, а так же, сопоставлением экспериментальных данных с

результатами численного моделирования

На защиту выносятся следующие результаты и положения:

1 Применение комбинированного восстановителя (ЭДТА + борогидрид натрия) позволяет получать золи золота с узким распределением по размерам в диапазоне средних диаметров частиц 3-6 нм Положение максимума экстинкции определяет средний размер частиц с точностью около 2 нм в диапазоне от 15 до 90 нм Применение центрифугирования в градиенте концентрации глицерина позволяет получить фракцию золотых наностержней с минимальным количеством наносфер

2. Разработка технологии нековалентной функционализации золотых наночастиц биомакромолекулами адсорбционным способом, включающая оптимизацию буфера, контроль минимального защитного количества биополимера и оптимизацию конечного продукта.

3. Метод дифференциальной спектроскопии статического рассеяния света является чувствительным тестом для определения среднего размера частиц, а также для оценки полидисперсности частиц и параметров их формы.

4. При формировании адсорбированного полимерного слоя на поверхности золотых наночастиц пик плазмонных резонансов экстинкции и дифференциального рассеяния смещается в красную область на 2-4 нм, а сами резонансы увеличиваются не более чем на 15-20% Большее красное смещение пиков или изменение характера спектров указывают на агрегацию частиц.

5 Развитая технология синтеза позволяет получать маркеры с количеством однонитевых олиготимидинов Тгя примерно 150 шт. на одну золотую частицу с диаметром 15 нм. Ковалентная функционализация золотых наночастиц олигонуклеотидами приводит к неаддитивному сложению поглощения биополимера и золотого ядра в области 260 нм Использование нитрата серебра в технологии синтеза приводит к нетипичному увеличению пика плазмонного резонанса до 40%.

6. Биоспецифическое окрашивание молекул, бактериальных клеток или их фрагментов, нанесенных на нитроцеллюлозную мембрану, является эффективным способом быстрой качественной идентификации биологической «мишени» с помощью конъюгатов золотых наночастиц с молекулами-зондами.

7. Микроскопия темного поля позволяет эффективно различать частицы разного размера и формы в статическом и динамическом режимах анализа.

Личный вклад соискателя.

Результаты, представленные в диссертации получены лично автором в процессе совместной работы, главным образом, с с.н с , к б.н Дыкманом Л.А. На защиту выносятся только те положения и результаты экспериментов, основная идея которых принадлежит автору, и в получении которых роль автора была определяющей. Результаты теоретических расчетов оптических спектров получены совместно с зав. лаб , д.ф.-м н. Хлебцовым Н.Г. и с.н.е., к.ф.-м.н Мельниковым А Г, вклад автора в этой части работы заключается в экспериментальной проверке выявленных закономерностей Работы по использованию ДСР проведены совместно с м н с , к ф.-м н Хлебцовым Б.Н. В иммунохимических экспериментах использовали антитела, полученные к.х.н. Шварцбурдом Б.И. и д б н Матора Л Ю. Исследования белков системы

цитоскелета проведены совместно с сотрудниками Лаборатории физиологии растительной клетки (зав. лаб , д б н Соколов О И.) В разделы, посвященные исследованию поверхностных структур почвенных микроорганизмов, включены работы, выполненные совместно с сотрудниками группы агробактериальной трансформации (в.н с, д.б.н. Чумаков М.И) и Лаборатории микробиологии (зав. лаб., д.б н. Никитина В.Е.). Работа с фаговым дисплеем антител стала возможной благодаря с.н.с., к.м н Сумарока М.В В работах по приготовлению и использованию ДНК-функционализированных частиц коллоидного золота принимал участие рук лаб КНИИСХ РАСХН (Краснодар), д б.н Плотников В.К

Научная новизна работы:

1 На основании предложенной концепции совместного действия полидентатного лиганда и активного восстановителя, разработан оригинальный метод синтеза ультрадисперсных золей золота с диаметром частиц 3 - 6 нм, защищенный патентом РФ Метод синтеза золотых наностержней на «мягких» матрицах цетилтриметиламмония бромида (ЦТАБ) оптимизирован введением оригинального этапа центрифугирования в градиенте концентрации глицерина и применением спектроскопии рассеяния для характеристики фракций препарата.

2. В рамках единого подхода разработана эффективная технология нековалентной функционализации золотых наносфер и наностержней, позволяющая получать коллоидно-золотые маркеры для широкого класса биополимерных зондов (белки, пектины, полисахариды).

3. Разработан новый метод дифференциальной спектроскопии статического рассеяния для характеристики дисперсных частиц с плазмонно-резонансным поглощением и рассеянием. Экспериментально метод реализован в виде приставки к серийному спектрофотометру «Спекорд М-40». Впервые показано, что дифференциальные спектры рассеяния обладают большей чувствительностью к полидисперсности и форме золотых наночастиц.

4. Показано, что золотые наночастицы, функционализированные олиготимидиновым зондом, не способны к агрегации при взаимодействии с комплементарными полинуклеотидами поли(А) в обычных гибридизационных условиях. Установлено, что агрегация, инициируемая замораживанием/оттаиванием подобных систем, является биоспецифической. Предложена модель агрегации, отличная от модели перекрестных сшивок Миркина и соавт. (1996).

5. Впервые показано, что продольный плазмонный резонанс золотых наностержней обладает большей чувствительностью к диэлектрическому окружению, по сравнению с золотыми наносферами, что может быть использовано для создания нового типа биосенсоров.

6. Разработан новый способ идентификации бактерий с помощью окрашивания биоспецифическими маркерами образца, иммобилизованного на нитроцеллюлозной мембране.

7. Впервые показана возможность определения белка по изменению спектров поглощения и рассеяния, обусловленному неспецифической агрегацией частиц. Предложен новый вариант определения некоторых белков с использованием конъюгатов золотых наночастиц с протеазами

8. Резонансное рассеяние света в микроскопии темного поля впервые применено для сравнительного анализа трансляционной диффузии

сферических частиц (90 нм) и вращательной диффузии золотых наностержней (толщина порядка 15 нм, длина около 40 нм)

Практическая полезность работы заключается в том, что разработанные методы синтеза металлических гидрозолей с частицами заданных размеров и формы и их функционализации с применением широкого спектра белковых и нуклеотидных зондов могут быть использованы (и уже реально используются) для создания разнообразных биохимических и молекулярно-генетических диагностических и биосенсорных систем нового поколения.

Результаты работы были представлены на Международной выставке "Достижения Российской биотехнологии" (ФРГ, 1996 г), 3-м Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Россия, ВВЦ, 2003 г.), ряде российских и региональных выставок.

Представленные в диссертации разработки используются в учебном процессе в Саратовском госуниверситете, Саратовском аграрном университете и др., включены в методическое пособие (Карпунина J1 В , Мельникова У Ю , Богатырев В.А. Методические рекомендации по исследованию взаимодействия лектинов почвенных азотфиксирующих бактерий с фракциями корней растений. - Саратов: СГУ, 2000. - 8 е.). Кроме того, материалы диссертационной работы включены в программы спецпрактикумов и спецсеминаров "Физико-химические методы исследования" и "Биофизические методы исследования", руководимые автором на Факультете нелинейных процессов СГУ.

Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур (ЛФХКС) и Лаборатории биосенсоров на основе наноразмерных структур (ЛБНС) ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: "Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений" научный руководитель темы д х н., профессор С.Ю. Щеголев, № гас регистрации 01890017743; "Развитие методов светорассеяния и электрооптики применительно к анализу природных и синтетических дисперсных систем", научный руководитель темы д.ф.-м.н., профессор Н.Г Хлебцов, № гос. регистрации 01912022281

Частично данная работа получила финансовую поддержку Министерства науки и технической политики РФ (распоряжение № 1508ф), Российского фонда фундаментальных исследований (№№ проектов 94-03-09286, 96-03-32504, 9803-32664, 01-03-33130, 01-04-48736, 04-04-48224, 05-02-16776), Международного научного фонда (фонда Сороса) (№ RNR300), фонда INCAS-S (№ 99-4-04), фонда CRDF (№ REC-006), NATO Collaborative Linkage Grant (LST.CLG 975040), NATO Expert Visit Grant (LST.EV 979788)

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлялись, докладывались и обсуждались на: 5-th Int. Symp. "Nitrogen Fixation with Non-Legumes", Florence, Italy, Sept. 10-14, 1990, 15-th Int. Congr. of Biochemistry, Jerusalem, Israel, Aug. 4-8, 1991; 8-th Eastern Eur. Symp. on Biological Nitrogen Fixation, Saratov, Russia, Sept. 22-26, 1992; 1-st Int. Conf. on Polysaccharide Engineering, Trondheim, Norway, June 6-8, 1994; 1-st Eur. Nitrogen Fixation Conf., Szeged, Hungary, Aug. 28 - Sept. 2, 1994; NATO Advanced Research Workshop on Azospirillum and Related Microorganisms, Sarvar, Hungary, Sept. 4-6, 1994; Int. Workshop on Associative Interactions of Nitrogen-Fixing Bacteria with Plants, Saratov, Russia, June 5-8, 1995, Int Symp. on Biomedical Optics, Barcelona, Spain, Sept. 12-16, 1995; Beijerinck Centennial Conf. "Microbial

Physiology and Gene Regulation: Emergings Principles and Applications", Hague, The Netherlands, Dec 16-21, 1995; 4-th World Congr. on Biosensors, Bangkok, Thailand, May 29-31, 1996; 9-th, 10-th and 11-th Int. Conf. of Surface and Colloid Science, Sofia, Bulgaria, July 6-12, 1997, Bristol, UK, July 23-28, 2000, Iguassu Falls, Brazil, Sept 15-19, 2003; 12-th Int. Congr. on Nitrogen Fixation, Parana, Brazil, Sept. 12-17, 1999; школе-конф. "Горизонты физико-химической биологии", Пущино, Россия, 28 мая - 2 июня 2000; 5-th and 6-th John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology, Pushchino, Russia, Sept. 15-21, 2000, Sept. 15-22, 2002; 5-ой и 7-ой Пущинской школе-конф. молодых ученых "Биология - наука 21-го века", Пущино, Россия, 16-20 апреля 2001, 1418 апреля 2003; Int Symp. "Biological motility New trends in research", Pushchino, Russia, Aug. 20-26, 2001; межд. научн. конф. "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий", Саранск, Россия, 12-15 сент., 2001; 1-ой per. конф. молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, Россия, 26-27 марта, 2002; 1-ом межд. конгр. "Биотехнология -состояние и перспективы развития", Москва, Россия, 14-18 октября, 2002; Donostia Int. Physics Center Workshop "Optical Properties of Complex Materials over Different Length Scales", San Sebastian, Spain, July 7-11, 2003; VIII Int. Conf. "The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology", Saratov, Russia, Sept. 9-13, 2003; V съезде физиологов растений России, Пенза, Россия, 15-21 сентября 2003; NATO Advanced Study Institute on Photopolarimetry in Remote Sensing, Yalta, Ukraine, Sept. 20 - Oct. 3, 2003; Saratov Fall Meeting, Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine, Saratov, Russia. 2000; 2001; 2003; 2004; Conference on Electrodynamics and Light Scattering by Nonspherical Particles: New York, 1998; Vigo, 1999; Halifax, 2000; Gainesville, 2002; Bremen 2003; а также на научных конференциях и семинарах ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 58 печатных работ, в том числе 2 патента и 48 статей, список которых приведен в конце автореферата (включая 20 статей в журналах из списка ВАК, 10 статей в иностранных рецензируемых журнапах, 18 статей в отечественных и зарубежных сборниках научных трудов и 1 главу в книге).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей четыре главы, заключения, списка использованных литературных источников. Работа изложена на 343 страницах, иллюстрирована 90 рисунками и включает 9 таблиц. Список использованных литературных источников содержит 494 наименований.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность проблемы детектирование биоспецифических взаимодействий, основанное на изменении оптических свойств системы наночастиц носителей, можно отнести к сравнительно новой отрасли науки - биосенсорике. Причем биосенсором является сама система, либо частица-маркер (элементарный сенсор). Коллоидное золото (КЗ) в ряду оптических биосенсоров занимает особое место, поскольку может выступать и в роли метки в наносенсорном устройстве, и как инструмент в молекулярно-биологических исследованиях, используемый in vitro, in situ и in vivo.

» ' Глава 1. Физико-химические свойства металлических гидрозолей

Приведен аналитический обзор экспериментальных и обобщающих работ по способам получения гидрозолей благородных металлов, изучению их физико-химических свойств. Показано особое место наноразмерных структур как объектов коллоидной химии (Ролдугин, 2000) и уникальная роль коллоидного золота (Согйе, 2004) В частности приводятся обобщенные данные, показывающие изменение кристаллической структуры и температуры плавления как функции размера наночастиц. Приводятся собственные экспериментальные данные в общем контексте обсуждаемой проблематики. Цель этой части работы выявить параметры, управляющие размерами, формой, дисперсностью (распределением по размерам) частиц металлических гидрозолей, образующихся при синтезе по конденсационно-химическому механизму, определить химические и физико-химические свойства металлических наночастиц, обусловливающие специфику их взаимодействия с биологическими макромолекулами

В главе 1 рассматриваются- химия золота и его соединений, окислительно-восстановительные потенциалы, хлориды золота и методы синтеза металлических коллоидов. Результаты собственных исследований приведены в трех подразделах

Цитратное восстановление по Френсу

Суммарную реакцию цитратного восстановления можно записать как:

Миркин (2000) предполагает несколько иную схему окисления цитрат- и дикарбоксилат-ионов.

Стандартно препараты получали добавлением необходимого количества стокового водного раствора цитрата натрия (в подавляющем большинстве случаев это 1 % (38 8 мМ)) к определенному объему рабочего раствора золотохлористоводородной кислоты (ЗХВК), предварительно нагретому до кипения на магнитной мешалке с тефлонпокрытым пропеллером в колбе, снабженной обратным водяным холодильником Восстановление в кювете спектрофотометра с постепенным нагревом и без перемешивания приводят к результатам, сходным с получаемыми в стандартных условиях. Сопоставление результатов спектрофотометрического контроля восстановления ЗХВК и растворения КЗ в соляной кислоте позволяет сделать вывод об обратимости процесса восстановления золота и управлении таким образом дисперсностью гидрозоля золота. Стратегию получения золей КЗ в диапазоне 15 - 90 нм основывали на том, что при цитратном восстановлении соотношение окислитель/восстановитель играет определяющую роль Так, для получения золей (50 мл) со средним диаметром частиц 15, 30, 45, 60, 75 и 90 нм

2АиС1з+ЗЫазСбН507-»2Аи+ЗЫа2С5Н405+ЗС02+ЗМаС1+ЗНС1.

С02"

нсо2н

Au particles

СГ

добавляемый объем 1% водного раствора цитрата натрия составлял 1.5, 0.72, 0.46, 0.34,0.27 и 0.22 мл соответственно.

Восстановление в присутствии ВМС

Одним из факторов, способствующих получению изодисперсных золей, является введение в реакционную среду высокомолекулярных соединений. Этот метод редко использовался для получения биоспецифических маркеров адсорбционным способом. Тем не менее, в модельных экспериментах стабилизация КЗ ВМС позволяет получать практически монодисперсные золи в очень широком диапазоне размеров.

Для получения коллоидного золота восстановлением ЗХВК в качестве восстановителей нами были использованы высокомолекулярные реагенты, полиэтипенимин, полиэтиленгликоль и поливинилпирролидон. Методом спектрофотометрии в ближнем ультрафиолетовом, видимом и ближнем инфракрасном диапазонах были получены данные по кинетике процесса восстановления. Отмечены существенные различия в кинетике восстановления ЗХВК при использовании низко- (цитрат натрия) и высокомолекулярных восстановителей. Разработана процедура одностадийного получения биоспецифического маркера - конъюгата коллоидного золота с иммуноглобулином при совместном использовании в реакции восстановления ЗХВК белка и низкомолекулярного восстановителя (борогидрида натрия). Обсуждены возможные особенности механизма синтеза ЗХВК в случае применения в качестве восстановителей высокомолекулярных реагентов.

"Катионное золото", представляющее собой конъюгат КЗ с катионным зондом, широко используется, в частности, для маркирования отрицательно заряженных участков биомембран. В качестве катионного зонда широкое распространение получил поли-Ытизин. Однако, препарат КЗ + лоли-1_-лизин сложен в приготовлении и недостаточно устойчив при хранении. В качестве катионного маркера нами был предложен конъюгат КЗ с полиэтиленимином (ПЭИ) Для получения данного маркера была разработана оригинальная одностадийная процедура, основанная на том, что ПЭИ является одновременно и восстановителем ЗХВК и веществом, стабилизирующим КЗ.

Маркер - конъюгат КЗ с иммуноглобулином в, полученный восстановлением ЗХВК боргидридом натрия в присутствии белка, проверяли на работоспособность методом дот-блот анализа. Выявление проводили маркерами, полученными традиционным способом и по оригинальной одностадийной методике. Обнаружено, что чувствительность данных маркеров к протеину А была примерно одинаковой.

Экспериментальное получение золотых несферических наночастиц

Экспериментальные протоколы получения наностержней (НСт) включали использование следующих реагентов. ЗХВК, ЦТАБ, ЫаВНЦ, Ад1ЧОз, аскорбиновой кислоты, глицерина, воды тридистиллированной. Аи-Ад НСт были синтезированы согласно методу зародышевого роста (МкооЬаШ, Е1-Эауес), 2003) с незначительными модификациями, касающимися концентраций некоторых реагентов и условий реакции. На этапе формирования зародышей ультрадисперсные золотые золи с частицами несколько нанометров в диаметре были синтезированы в присутствии ЦТАБ. На втором этапе эти, блокированные ПАВ, частицы были использованы в качестве зародышей ростового раствора для получения НСт. Альтернативно в качестве зародышей

использовали золи золота, получаемые по оригинальной процедуре восстановления ЗХВК одновременно натриевой солью ЭДТА и борогидридом натрия при комнатной температуре и интенсивном перемешивании (Богатырев В.А и др., патент РФ 1994). Полученные таким образом золи (3-6 нм) отличались высокой стабильностью и по данным ТЭМ были практически монодислерсны.

На рис 1 показана кинетика развития оптических изменений в процессе созревания золотосеребряных НСт, а на рис 2 электронно-микроскопическое изображение НСт с продольным плазмонным резонансом на длине волны 700 нм.

Для разделения наностержней и наносфер использовали градиентное центрифугирование (центрифугирование в градиенте концентрации глицерина). При этом фактор разделения был выше, чем при стандартном препаративном центрифугировании в угловом роторе.

Заключение к 1 главе

Необходимость написания этой главы с подробным обсуждением процессов образования золей благородных металлов обусловлена необходимостью выяснения геометрических и физико-химических параметров образующихся частиц, поскольку морфометрические параметры металлических НЧ и их агрегатов влияют на оптические свойства образуемых ими систем, а состав поверхностного слоя обуславливает специфику взаимодействия с биомакромолекулами.

Приведенный в данной главе анализ собственных экспериментальных и

1

400

600

Длина волны, нм

800

оптических созревания спектр

Рис. 1. Кинетика развития изменений в процессе золотосеребряных НСт 1 поглощения ростового раствора сразу же после внесения зародышей, 2 - через две минуты, 3 - 7 последовательные регистрации спектров с интервалами 15 мин

Рис. 2.

микроскопическое золотосеребряных продольным

Электронно-изображение НСт с плазмонным

резонансом на X 700 нм

литературных данных относительно механизмов формирования золей коллоидных благородных металлов, основанных на химическом восстановлении соответствующих солей, позволили сделать следующие заключения.

Основным параметром, управляющим дисперсностью образующихся золей, является соотношение окислитель/восстановитель

• Изодисперсность образующихся золей обусловлена обратимостью процессов нуклеации и роста частиц

• Промежуточными продуктами процесса нуклеации являются металл-лигандные полимерные комплексы (кластеры), состав которых связан с активностью восстановителя, дентатностью лигандов и устойчивостью комплексов.

• Поверхность металлических наночастиц гидрозоля включает в состав коионного слоя лиганды восстановителя и анионы исходной соли.

• Металлические гидрозоли, получаемые без использования ПАВ и высокомолекулярных соединений, являются электростатически стабилизированными.

• Для получения золотых наносфер в диапазоне 10 - 40 нм наиболее подходящим является метод Френса (цитратного восстановления ЗХВК). Наиболее устойчивые ультрадисперсные (3-6 нм) золи золота образуются при боргидрид-цитратном и боргидрид-ЭДТА восстановлении ЗХВК. Для получения изоморфных и изодисперсных золей с размерами частиц более 40 нм целесообразно использовать методики зародышевого роста.

• Формирование несферических стержневых наночастиц происходит в условиях фазовой анизотропности среды, обеспеченной наличием жестких или мягких матриц. Химическая анизотропия НСт усиливается при изменении состава металлического ядра частицы, добавлении легирующих металлов.

Наиболее удобным способом контроля процессов образования металлоколлоидов являются методы спектроскопии поглощения и рассеяния света, поэтому следующая глава посвящена исследованию оптических свойств золей коллоидных металлов, главным образом, золота.

Глава 2. Оптические свойства металлических гидрозолей

Изучение оптических свойств золей золота и других металлов, начатые пионерскими работами Фарадея (1857), Жигмонди (1898) и Ми (1908), ведется уже более 150 лет. Обзор многочисленных работ по оптическим свойствам золотых частиц, суспендированных в воде, стеклянных матрицах, хлористом калии, желатине, полиметилметакрилате и других средах, а также напыленных на различные подложки, можно найти в книге Борена и Хафмена (1983). Повышение интереса к золотым ультрадисперсным золям, отмечаемое в последние два десятилетия, связано с многочисленными применениями КЗ в медико-биологических исследованиях.

Глава 2 включает 4 раздела, описывающих такие оптические эффекты как плазмонный резонанс (ПР), флюоресценцию, резонансное светорассеяние, динамическое светорассеяние Обсуждение результатов оригинальных исследований приведено в 10 подразделах.

Оптические константы золота и золотых частиц

Показатель преломления малых частиц с диаметром d = 2а < 20 нм может заметно отличаться от объемных значений вследствие ограничения длины свободного пробега электронов Собственно говоря, это единственное изменение, которое следует внести в схему классической электродинамики (уравнения Максвелла плюс модифицированные оптические константы). Современный уровень развития оптики металлических частиц позволяет считать, что классические подходы являются вполне адекватным аппаратом, а

квантовые поправки несущественны в большинстве практически важных ситуаций (Лушников, Максименко, 1993)

Экспериментальные методики

Спектры ослабления золей измеряли на стандартном приборе "Спекорд М-40". Для контроля отсутствия малоугловых искажений значений экстинкции, связанных с рассеянием в апертурный угол фотоприемника от наиболее крупных (40 нм) частиц золей, использовали специальную приставку для измерений экстинкции рассеивающих образцов с регулируемым апертурным углом от 2 до 0.1°. Величина и положение максимума экстинкции определялись с точностью ±0.002 и ±0.5 нм соответственно.

В специальных экспериментах оценивались функции распределения частиц по размерам и факторам формы. Значения дисперсии а варьировали от 0.1 до 0.2, причем для золей с меньшими размерами частиц попидисперсность была выше. В первом приближении мы аппроксимировали разброс по отношениям осей равномерным распределением с верхней границей. Среднее осевое отношение даже для самых крупных образцов (2а = 40 нм) не превышало 1.4.

Зависимость положения и величины максимума ослабления от размера частиц

КЗ

Для расчета спектров КЗ мы использовали показатель преломления объемных образцов, модифицированный с учетом ограничения длины свободного пробега электронов Единственными варьируемыми параметрами в наших расчетах были степени полидисперсности по размерам и осевому отношению, однако эти параметры подбирались на основе электронно-микроскопических измерений. Таким образом, учитывая минимальное количество подгоночных параметров, можно признать, что использованные теоретические модели позволяют достаточно точно описать спектральное положение максимума, его зависимость от размера частиц и общий вид спектров ослабления в диапазоне 350 - 800 нм.

Зависимость экстинкции и рассеяния от размера и концентрации частиц

Проведено сравнение двух методов определения среднего размера наночастиц золота, основанных на измерении длин волн максимумов Х^а* бокового рассеяния и экстинкции в области 400-700 нм Экспериментально исследованы 4 золя со средними диаметрами частиц (ф около 15,20,25 и 30 нм, измеренными методом динамического светорассеяния. Угловой наклон размерной зависимости К^Ф спектрального положения максимума рассеяния в 2.4 раза превышает таковой для экстинкции, что обеспечивает существенно большую точность первого метода. Для моделирования полидисперсности использованы смеси трех коллоидов с диаметром частиц 20, 25 и 30 нм: образец Э1, близкий к нормальному распределению около 25 нм, и образец 82 с одинаковым количеством частиц каедого компонента в единице объема. Спектры экстинкции смесей Э1, Б2 и исходного 25-нанометрового золя (Б0) практически не отличались один от другого, в то время как спектры рассеяния имеют четкое различие с ростом максимума в ряду Э0, Э1, Б2. Эти результаты согласуются с расчетами по теории Ми. Таким образом, спектры рассеяния имеют преимущество перед спектрами экстинкции не только в определении среднего размера наночастиц золота, но и в оценке их полидисперсности.

Для измерений спектров рассеяния использовали стандартную приставку для флюоресцентных измерений к спектрофотометру «Спекорд М40».

Приставка позволяет освещать кювету с измеряемым образцом под прямым углом по отношению к фотоприемнику, который регистрирует флюоресценцию в некотором телесном угле, ориентированном перпендикулярно падающему свету. В принципе, эта схема пригодна и для измерений спектров рассеяния.

Модификация приставки заключалась в замене стандартного эталонного флуоресцентного излучателя на спектрально нейтральный рассеиватель (диффузор). Диффузоры вставляли в направляющие кюветодержателя приставки под углом 45°С к фотоприемнику и световому пучку. Калибровку прибора осуществляли по стандартным программам при установленной приставке с диффузорами.

На рис. 3 изображена схема работы двухлучевого спектрофотометра в режимах регистрации поглощения и/или рассеяния. Свет от источника после прохождения монохроматора (1) разделяется на опытный и референтный

Рис. 3. Схема измерения спектров эксгинкции и рассеяния с помощью приставки к спектрофотометру "Бресок! М40" 2 и 3 — эталонный и измерительный пучки, формируемые монохромагором /, 4 и 5 - зеркала, 6 и 7 - диффузные отражатели, 8 - фотоприемник. Для измерения эксганкиии кюветы с образцом и буфером устанавливаются в положения 9а и 96 соответственно, для измерения рассеяния одна из кювет с образцом 10 ставится на место отражателя 7, а вторая - в положение 96.

пучки (2, 3) и через систему зеркал (4, 5) и диффузоров (6, 7) попадает на катод фотоэлектронного умножителя (8). В режиме регистрации поглощения в опытный канал (2) устанавливали кювету (9а) с образцом, а в референтный канал (3) - с растворителем (96). В случае измерения параметров бокового светорассеяния кювету с образцом (10) устанавливали в опытный канал вместо эталонного диффузора (7). Для компенсации искажающего действия поглощения на спектр светорассеяния кювету с образцом (96) устанавливали в канал сравнения. Измеренный таким способом спектр мы назвали дифференциальным спектром светорассеяния (ДССР).

Если не устанавливать кювету с образцом в канал сравнения, то измеряемый недифференциальный спектр определяется соотношением

г, (Я)

где р - постоянный коэффициент, зависящий от геометрии рассеяния и фотоприема, гх(Л)- коэффициент отражения диффузора, постоянный в используемом спектральном интервале, Е(А) - спектр ослабления золя, /^(А) - теоретический спектр однократного рассеяния. Понятно, что из-за

сильного поглощения вблизи ппазмонного резонанса вид спектров (2) на рис 4 будет существенно отличаться от спектров /90 (Я)

На рис 4 приведены графики спектральных зависимостей экстинкции (1), некомпенсированного светорассеяния (2) и дифференциального светорассеяния (3) для КЗ 15 (а) и КЗ 30 нм (б) На этих же графиках приведены кривые (4) спектральных зависимостей дифференциального светорассеяния, вычисленные из экспериментальных спектров. Заметное

Е (а) '■»>'отн ед /• (б) • ед

Длина волны, нм Длина волны, нм

Рис. 4. Графики спектральных зависимостей ослабления Е (кривые /), некомпенсированного (2) и дифференциального (5) светорассеяния 190 для 15 (а) и 30 нм (б) золей золота Пункт ирные кривые 4 получены пересчетом кривых / и 2 по соответствующему уравнению

расхождение экспериментальных и вычисленных кривых для 15 нм золя можно объяснить очень слабым сигналом от рассеивающего образца, сопоставимого по величине с нулевой линией (сигналом от кювет, заполненных чистым растворителем) В целом, по нашему мнению, можно говорить о вполне корректной компенсации поглощения.

На рис. 5 представлены графики спектральных положений пиков экстинкции и светорассеяния (а) и величин пиков (б) от размеров частиц. Зависимость спектрального сдвига максимумов хорошо аппроксимируется линейной функцией с угловыми коэффициентами 0 7 для экстинкции и 1.68 для светорассеяния Это означает, что при прочих равных условиях спектральный сдвиг максимума рассеяния в 2.4 раза больше такового для экстинкции. Зависимости величин максимумов экстинкции и светорассеяния различаются между собой более радикально. При изменении размера в 2 раза Ет

изменяется на 10%, в то время как ¡„^ ~с127 Показатель степени, близкий к

3, объясняется известными закономерностями дипольного рэлеевского рассеяния. Существенные различия в зависимостях положений и величин максимумов экстинкции и светорассеяния от среднего размера частиц

X, нм

(а)

560

20 30 10 20 30

Диаметр, нм Диаметр, нм

Рис. 5. Экспериментальные зависимости спектральных положений (а) и величин (б) максимумов ослабления (сплошные линии) и рассеяния (штриховые линии) от размера золотых частиц.

позволяют предположить, что полидисперсность золей должна по разному проявляться в этих спектрах.

Экспериментально измеренные спектры экстинкции и рассеяния смесей и Э2 в сравнении со спектрами золя КЗ 25 (в0) показаны на рис. 6а. Похожие по виду кривые, представленные на рис. 66, соответствуют теоретическим расчетам спектров по теории Ми для монодисперсных золей золота и их смесей в тех же соотношениях, что и в эксперименте.

Обращает на себя внимание то, что теоретические (рис. 6а) и экспериментальные (рис. 66) спектры экстинкции для всех трех образцов практически не отличаются. В то же время теоретические и экспериментальные спектры светорассеяния для этих же образцов отличаются вполне заметно.

Более сильная экспериментальная размерная зависимость спектрального сдвига связана не столько с полидисперсностью реальных частиц золотого

• ВД г '<„,. ед

500 600

Длина волны, нм

700

500 й00

Длина вспны, нм

700

Рис. 6. Экспериментальные (а) и теоретические (б) спектры экстинкции (сплошные кривые) и дифференциального рассеяния /М(А) (штриховые кривые) Цифрами обозначены образцы 1 - исходный золь КЗ 25 нм, 2 - смесь 81,3- 82.

коллоида, сколько с их лолиморфностью В связи с этим можно отметить еще одно преимущество метода спектроскопии дифференциального светорассеяния. Это возможность фиксировать проявление эффекта деполяризации рассеянного излучения, характерного для несферических рассеивателей.

Поскольку спектральный максимум экстинкции слабо зависит от размера частиц, а максимум светорассеяния пропорционален кубу размера частиц золота при их постоянной весовой концентрации, то одновременное определение обеих спектральных зависимостей дает информацию, по крайней мере качественную, о среднем размере и степени полидисперсности образцов Мы предполагаем, что выявленные нами закономерности могут быть использованы при разработке методов исследования дисперсности не только коллоидных металлов, но и других систем, например, оптически мягких частиц при наличии в них поглощающих веществ.

Измерение размеров золотых наночастиц методом ДРС

На рис. 7 изображена схема установки измерения динамического светорассеяния.

Для измерения размеров частиц методом динамического рассеяния света (ДРС) использовали установку, собранную из стандартных компонентов.

Источником света служит гелий-неоновый лазер ГН-5П (ОАО "Плазма", Россия).

Четырехсторонняя кварцевая

кювета помещается в

термостатируемый держатель, установленный на гониометре ГО-5 (Россия). С помощью водяного ультратермостата 117 (М1.\Л/,

Германия) и контрольного термистора температура в кювете устанавливается с точностью ±0.1°С. Рассеянный световой сигнал принимается оптическим блоком, собранным на базе микролюминисцентной приставки ФМЭЛ-1М (ЛОМО, Россия). Этот блок содержит фокусирующую оптику, две апертурные диафрагмы (1 мм и 0.1 мм), фотоумножитель ФЭУ-79 и предварительный усилитель. Сигнал с выхода усилителя через АЦП 1.-783 (1_-Сагс1, Россия) записывается в файл на компьютере и затем обрабатывается Программа обработки вычисляет автокорреляционную функцию флуктуаций фототока gг{т) = <<(/)/(/ + г)) , интерпретируемую в терминах монодисперсного приближения 22{т) = А +< для определения среднего гидродинамического размера по измеренной постоянной Г = 2д7й(1{к), где д = 2к$\п{в!2)- модуль вектора рассеяния, £>- коэффициент трансляционной диффузии.

Рис. 7. Схема установки для реализации метода динамического светорассеяния в режиме записи аналогового сигнала.

Заключение к 2 главе

Уникальные оптические свойства коллоидных металлов, интенсивное резонансное поглощение и рассеяние света связаны с явлением поверхностного плазмонного резонанса (ППР). При этом, величины и спектральные положения пиков зависят от оптических констант (комплексного показателя преломления) дисперсной фазы, дисперсного состава металлозолей и показателя преломления дисперсионной среды.

• Широкая полоса поглощения и рассеяния в видимой области, связанная с ппазмонным резонансом, возникает из-за коллективных колебаний электронного газа на поверхности наночастиц (6э электроны полосы проводимости для Аи, Ад, Си), индуцируемых электромагнитным полем облучающего света.

• ППР отсутствует для Аи НЧ с диаметром меньше чем 2 нм, так же как для компактного золота. При малых значениях размеров частиц (<40 нм) основной вклад в ослабление света вносит поглощение, а влиянием рассеяния можно пренебречь.

• В случае рассеяния света на золотых частицах большего размера (К > X / 20) представление коэффициентов поглощения и рассеяния в рэлеевском (дипольном) приближении неверно и требуется расчет по теории Ми. Зависимость спектральных максимумов поглощения и рассеяния от размера золотых частиц обусловлена двумя эффектами: (1) размерной зависимостью высших (недипольных) мод возбуждения, (2) размерной зависимостью показателя преломления наночастиц. Эта зависимость позволяет построить калибровочные кривые для оперативного определения размера частиц золя по положению спектрального максимума эксгинкции или рассеяния под углом 90°.

• Зависимость спектрального сдвига максимумов хорошо аппроксимируется линейной функцией с угловыми коэффициентами 0.7 для экстинкции и 1.68 для светорассеяния. Это означает, что при прочих равных условиях спектральный сдвиг максимума рассеяния в 2.4 раза больше такового для экстинкции.

• Поскольку спектральный максимум экстинкции слабо зависит от размера частиц, а максимум светорассеяния пропорционален кубу размера частиц золота при их постоянной весовой концентрации, то одновременное определение обеих спектральных зависимостей дает информацию, по крайней мере качественную, о среднем размере и степени полидисперсности образцов.

Поскольку поглощение и рассеяние света зависят не только от размеров и формы плазмонно-резонансных частиц (ПРЧ), но и в большой степени от показателя преломления локального окружения, то при установленных геометрических параметрах частиц контроль оптических характеристик является эффективным способом проверки качества функционализации металлических наночастиц биомакромолекулами. Этому вопросу посвящена следующая глава диссертации.

Глава 3. Функционализация металлических наночастиц

В поверхностной химии ПРЧ следует выделить два аспекта: соединение металлической частицы с зондом - биомакромолекулой и собственно

биоспецифическое взаимодействие маркера с мишенями. Как правило, эти два явления рассматриваются независимо друг от друга.

Дэвид Шульц (2003), рассматривая поверхностные химические процессы ПРЧ, отмечает роль биомолекулярного стабилизирующего слоя не только в обеспечении агрегационной стабильности, но и химическом пассивировании, а также предотвращении изменения формы частиц. Тем не менее, основным требованием, предъявляемым к маркерам, используемым в биоаналитических целях, является сохранение агрегационной стабильности в широком интервале температур, рН и ионной силы среды. Обеспечение этого требования осуществляется введением в систему меток - ПРЧ молекулярных стабилизаторов - ПАВ, ВМС. Очень часто роль стабилизаторов играют сами биоспецифические макромолекулы.

Среди способов "посадки" зондов на метки выделяют два основных: адсорбционный и хемосорбционный, каждый из которых имеет свои особенности в плане приготовления и использования. К преимуществам простой (физической) адсорбции относят минимальное воздействие на структуру макромолекулы и, как следствие, сохранение ее функциональных свойств. Традиционный метод - пассивная адсорбция биомолекул на коллоидной металлической частице - обусловлен электростатическими и гидрофобными взаимодействиями. В связи с этим при его использовании всегда следует учитывать возможную десорбцию и конкурирование с местами связывания на молекулах мишенях. Преимущества химического прикрепления наиболее ярко проявляются для линейных молекул, подобных ДНК, и связаны с терминальной иммобилизацией, обеспечивающей строгую пространственную ориентацию зондов.

Значительный прогресс в создании маркеров нового поколения был достигнут введением в практику биоактивации золотых частиц пришивки олигонуклеотидов через тиольные группировки (М(гк!П е! а!., 1996, А1мза1оз е1 а1., 1996).

Для достижения высокой чувствительности и избирательности зондов, основанных на ДНК-гибридизации, существенно, чтобы коллоидный раствор маркеров был агрегативно устойчив. Недавно было показано (¿и^оА1 е1 а1., 2002), что конструкция основы олигонуклеотида (спейсер плюс зонд) имеет значительное влияние на коллоидную стабильность и на биохимическую активность (доступность) олигонуклеотида.

Для присоединения белковых молекул альтернативно пассивной адсорбции могут быть использованы бифункциональные алканы. Например, меркаптоундекановая кислота была использована как линкер/спейсер для функциализирования золотых и серебряных наностержней нейтравидином. При этом связь с металлической поверхностью осуществляется через тиольные группировки, а белковые аминогруппы перекрестно сшиваются с карбоксилами линкеров, активированными карбодиимидными или сукциниминными реагентами

Глава 3 состоит из трех разделов, посвященных адсорбционному, хемосорбционному способам функционализации и исследованию активности биомакромолекул, иммобилизованных на металлических наночастицах. Она содержит 7 подразделов, содержащих результаты собственных исследований и их обсуждение.

Конъюгирование КЗ с олигопептидами и низкомолекулярными зондами

Биотин является одной из наиболее часто и успешно применяемых молекулярных меток. Биотин (витамин Н), водорастворимый витамин, кофермент, участвующий в реакциях переноса СОг к органическим соединениям, например при биосинтезе жирных кислот. Его особенностью как молекулярной метки является селективное и прочное связывание с авидинами различного происхождения: авидином яичного белка, стрептавидином, нейтравидином. Эмпирическая формула биотина: СюН^Оз^Э, М.В. 244 Да. Наличие в структуре биотина диссоциирующих и полярных группировок обеспечивает его достаточно прочное взаимодействие с поверхностью металлических коллоидных частиц Однако сравнительно небольшой молекулярный вес не позволяет полностью стабилизировать металлоколлоиды против солевой агрегации.

В табл. 1 суммированы некоторые примеры стабилизации КЗ различными биомолекулами, использованными нами для получения антисывороток. В колонке "золотое число" (34) указано минимальное защитное количество вещества для стандартного золя золота (15 нм, 57 мкг/мл (1.6*1012 мл"1, ~3 нМч )), использовавшегося во всех этих экспериментах. Прочерк в этой колонке означает, что полностью защитное действие адсорбата не было достигнуто ни при каких реально мыслимых концентрациях.

Таблица 1. Характеристика гаптенов, использованных в комплексе с КЗ при иммунизации животных

Антиген МВ.Да Р1 РН 34, мкг/мл

Биотин 244 9.0 -

Пептид 1 бактериородопсина 1583 3.14 10 -

Пептид 2 бактериородопсина 1583 3.14 6 -

Пептид 3 бактериородопсина 5.5 10

Ивермектин 10 15

Тилмикозин 11 8

С-тус пептид 1307 3.69 6 5

Пептид 1 тропонина 5349 10.56 10 6

Пептид 2 тропонина 4687 7.46 8 3

Значения рН в соответствующей колонке указывает, что в этой точке при равном количестве вносимого адсорбата агрегативные цветовые изменения были минимальными. Цитратное КЗ - анионное, поэтому вполне очевидно, что высокое сродство к нему будут иметь макромолекулы, имеющие поверхностные катионные группировки. Однако большое количество положительных коионов и их равномерное распределение, как, например, в попи-/_-пизине, приводит к флоккулирующему действию, особенно при низких относительных концентрациях. Для предотвращения этого явления необходимо минимизировать на первых этапах адсорбции наиболее дальнодействующие из электростатических взаимодействий, заряд-зарядовые, что достигается

' Согласно определению, в молях выражается концентрация веществ, имеющих молекулярное строение, поэтому нижний индекс "ч" указывает, что концентрация приведена к количеству частиц.

соответствующим подбором кислотности среды Поскольку основной вклад в стабильность незащищенных металлозолей вносит электростатическая составляющая расклинивающего давления ДЛФО, значение ионной силы раствора выбирают минимальным, обеспечивающим растворение зонда.

Первичная структура пептида 1 бактериородопсина соответствует сиквенсу 62-76-1_СУС1_ТМ\/РРССЕОМ, где цифрами указаны номера N1- и С-концевых аминокислот, соответственно. Несмотря на значительно большую, чем у биотина молекулярную массу этот пептид не стабилизирует КЗ, что неудивительно, поскольку в его составе нет ни одной аминокислоты с основными группами в боковой цепи.

Пептид 2 имеет структуру:

191-206-Ю8ЕСАС1\/Р1_М1Е"П_.

Так же как и в пептиде 1, в нем нет основных радикалов. Два карбоксила глютаминовых кислот (192 и 195) придают молекуле отрицательный заряд при нейтральных рН.

Значения изоэлектрических точек (р!) пептидов, приведенные в четвертой колонке, рассчитаны по программе, находящейся на сайте www.molbiol.ru, учитывающей только диссоциацию боковых групп лизина (К), аргинина (Я), гистидина (Н), аспарагиновой (й) и глютаминовой (Е) кислот. В то же время известно, что константы диссоциации этих групп, так же как и сульфгидрильной группы цистеина (С) или фенольной гидроксильной группы тирозина (У) и др., зависят от их электростатического окружения. В связи с этим мы использовали расчетные значения р1, как приближенно-оценочные.

Большой интерес с точки зрения адсорбции на КЗ и защитного действия имеет С-шус пептид (табл. 1. № 7). В состав этого пептида

СЕСЖивЕЕОи

входят пять остатков с диссоциирующими фуппами в боковых цепях: лизина, глютаминовой и аспарагиновый кислот. Кроме того, на 1М-конце пептида имеется цистеиновый остаток (отсутствующий в оригинальной последовательности) с трет-бутильной защитой тиольной группы. Несмотря на меньшую длину последовательности и, соответственно, молекулярный вес, С-тус пептид полностью стабилизировал КЗ, в отличие от пептидов 1 и 2 бактериородопсина.

Пептид 1 тропонина:

УАТЕРНАКККЗК15А8РКЬ01КТШ_01АК<ЭЕ1_ЕНЕАЕЕР*НСЕКСР и пептид 2 тропонина:

КСРА1-8Т?ЗС(ЭР1-Е1_АС1.СРАЕ1_СЮ1_СНОШАР\/ОК\ЮЕЕЯУ (МесНх ВюсИепгиса, Финляндия) значительно больше по массе предыдущих, кроме того, в составе обоих этих пептидов большой процент заряженных группировок, что требовало тщательного подбора условий конъюгирования по РН.

Антигены, дающие с КЗ прочные стабильные комплексы, использовались нами для иммунизации с целью получения антисывороток с высокими титрами, а также для детекции антител, получаемых этим, либо любым другим способом, включая селекцию миниантител из фаговых библиотек (Дыкман и ДР.. 2004).

Для селекции фаговых частиц, несущих специфические фрагменты антител (мини АТ), мы использовали комплексы КЗ с адсорбированными АГ (Сумарока и др., 2000) Диссоциацию комплекса АГ-АТ осуществляли триэтиламином

Другим примером стабилизации КЗ биополимером с небольшой молекулярной массой является создание маркера КЗ-фаллоидин. Фаллоидин, один из токсинов бледной поганки Amanita phalloides, - это бициклический гептапептид с молекулярной массой ~850 Да. Фаллоидин широко используется в цито- и гистохимии цитоскелета, поскольку способен высокоспецифично связываться с F-актином. Связываясь с "минус" концом актиновой нити, фаллоидин препятствует деполимеризации актина, стабилизируя таким образом эту составляющую цитоскелета. Трудность получения конъюгата фаллоидина с КЗ заключается в том, что молекулярная масса этого пептида мала и недостаточна для создания стабилизирующего адсорбционного слоя на поверхности золотой частицы. Тем не менее, нам удалось получить достаточно стабильный конъюгат фаллоидина с КЗ (d 10 им), используя в качестве вторичного стабилизатора полиэтиленгликоль (ПЭГ 20000).

Конъюгирование КЗ с высокомолекулярными зондами

Для защитного действия на КЗ важен, помимо молекулярного веса полимера, заряд его функциональных групп. Полимеры, содержащие как кислотные, так и основные группы, то есть полиамфолиты или спабоосновные поликатионные макромолекулы с рН-зависимым защитным действием, являются наиболее эффективным средством стабилизации анионных гидрозолей золота.

Протокол получения конъюгатов КЗ с биоспецифическими макромолекулами включает подготовку и очистку водного раствора зонда, определение 34, прикрепление зонда к метке, добавление вторичного стабилизатора, концентрирование маркера и оптимизацию конечного продукта. Поскольку стабилизация полимерными макромолекулами осуществляется, как правило, благодаря электростатическим и гидрофобным взаимодействиям, существенно, чтобы частицы КЗ и зонда имели одинаковый по знаку заряд для предотвращения нежелательной агрегации конъюгатов. Оптимальные для стабилизации условия обычно достигаются при возможно более низкой ионной силе и при значениях рН на -0.5 ед. выше изоэлектрической точки стабилизирующего вещества. Заметим, что рН исходного золя золота находится в интервале 5.3-3.2, в зависимости от размеров частиц или, точнее говоря, в зависимости от количества цитрата натрия, добавляемого при синтезе. Кислотность раствора КЗ доводят до требуемого значения добавлением разбавленного раствора щелочи или кислоты. Для каждой новой пары зонд-метка условия стабилизации маркера обычно подбираются эмпирически.

Минимальное защитное количество стабилизирующего вещества (34) и значение рН определяли в U-образных иммунологических планшетах с лунками объемом 200 мкл. Для этой цели делали серию последовательных разведений зонда соответствующим буфером или тридистиллированной водой. Золи золота (отдельно для каждого размера) предварительно титровали 0.2 М фосфорной кислотой или 0.2 М КгСОз, строили кривые, которые затем использовали как калибровочные.

В тех лунках, где условия инкубационной среды не были оптимальными по кислотности или золотому числу, происходила агрегация после добавления NaCI до 1%. Агрегация сопровождалась изменением цвета золя с красного на голубой или серый.

Для более точного определения 34 можно проводить построение калибровочной кривой, основанное на спектрофотометрических измерениях, варьируя концентрацию вносимого стабилизатора с шагом 10%. При этом можно измерять спектральный сдвиг максимума, либо изменение оптической плотности на одной из характерных длин волн, например, А520 или Aseo для КЗ-15, либо первую производную спектра в области правого крыла, или, что почти эквивалентно, А520 - Aseo Однако, поскольку процесс спектральных изменений при агрегации КЗ носит выраженный кинетический характер, необходимо стандартизировать время инкубации, либо пользоваться ИФА-ридером с соответствующими светофильтрами. Тем не менее, в большинстве случаев приготовления цитохимических КЗ-маркеров точного определения 34 не требуется, поскольку от избытка несвязавшегося зонда легко избавиться центрифугированием или гельфильтрацией.

Построение калибровочных кривых и точное определение 34 имеет скорее прогностический характер- насколько стабильным будет маркер при хранении и использовании. Трудно ожидать хороших потребительских качеств от маркера, на калибровочной кривой которого нет резкого излома, и значение 34 явно превышает необходимое для образования мономолекулярного слоя. Если значения оптимума рН сильно отличаются от значений pl для данного белка, следует усомниться в чистоте препарата. Исключение составляют иммуноглобулины, различные клоны которых проявляют значительную дисперсию по этому параметру.

В некоторых случаях флокуляция может происходить до этапа повышения ионной силы инкубационной среды. Это явление свойственно сильно заряженным полимерам, таким как полиэтиленимин, поли-/_-лизин, хитозан, при инкубации с анионным (цитратным) КЗ, или анионным полимерам - пектинам, полиакриловой кислоте, взаимодействующим с катионным (полиэтилениминным) КЗ.

В случае глобулярных белков, имеющих амфифильную природу (метилальбумин), агрегация при постоянном рН, в зависимости от концентрации полимера, может быть зонной, т.е проявляться при низких и высоких относительных концентрациях. Сохраняя стабильность при повышении ионной силы, такие золи, тем не менее, склонны к стесненной коагуляции при центрифугировании.

Получение маркеров с некоторыми белками адсорбционным способом может быть затруднено из-за плохой растворимости этих белков в водных растворах с низкой ионной силой. Это относится, в частности, к миозинам различной природы, имеющим протяженный гидрофобный участок (хвост) и образующим в условиях низкой ионной силы филаментные агрегаты. Для получения цитохимических КЗ-маркеров миозинов можно использовать водорастворимый фрагмент молекулы - тяжелый меромиозин (ТММ), представляющий собой головки миозина с актинсвязывающими и АТФ-азными сайтами и шарнирную область.

В наших экспериментах миозин из спинных мышц кролика выделяли по методу Поглазова и соавт. (1976) и использовали для последующего получения ТММ. Получение конъюгатов КЗ с ТММ, также как и с актином, особых трудностей не вызывало. Необходимо отметить лишь, что при изготовлении конъюгата КЗ с актином для иммунизации животных и селекции фаговых библиотек вторичный стабилизатор не использовали.

Тщательный подбор условий конъюгирования позволил разработать технологию получения биомаркеров с широким кругом зондов, включающих белки, лектины, полисахариды. Каталог маркеров (138 наименований) можно найти на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.saratov.ru/katalog.html.

Оптическая модель биоконъюгатов: теоретический анализ

В качестве оптической модели биоконъюгата КЗ мы использовали двухслойную сферическую частицу с диаметрами ядра <1 = 28. и оболочки й, = 2Я, = с1 + 25 (« - толщина оболочки) и соответствующими показателями преломления и и л, соответственно. Реальный конъюгат отличается от этой

модели в двух отношениях: (1) золотая частица не имеет строго сферической формы и (2) адсорбированный биополимерный слой не является однородной диэлектрической средой с четкой сферической границей.

Возможны два варианта адсорбционного взаимодействия биополимеров с наночастицами. В первом варианте исходной системой является взвесь золотых частиц, к которой добавляется полимер (например, желатин или бычий сывороточный альбумин (БСА) (Эи^сЬек, 1987)- В этом случае изменение оптических свойств определяется по отношению к свойствам частиц без полимерного слоя. Во втором варианте конъюгат коллоидного золота, как элементарный биосенсор, уже включает предварительно сформированный полимерный слой, состоящий из «узнающих» молекул, например иммуноглобулинов. Поэтому изменение оптических свойств, соответствующее биоспецифическому взаимодействию, следует, строго говоря, определять по отношению к оптическим свойствам конъюгатов до добавления молекул-мишеней В случае конъюгатов, получаемые оценки сдвигов положения и максимума поверхностного плазмонного резонанса имеют смысл верхних границ для всего двухстадийного процесса (приготовление маркера и тестирование образца с комплементарными молекулами).

На рис. 8 сплошными кривыми представлены теоретические спектры экстинкции и рассеяния для золей с постоянной весовой концентрацией частиц золота сг = 57 мкг/мл в диапазоне диаметров ¿ = 40-120нм, а штриховые

кривые показывают изменение спектров при адсорбции однородного полимерного слоя с толщиной у = 5 нм и показателем преломления и4 =1.5.

Адсорбция полимера приводит к увеличению максимумов плазмонных резонансов экстинкции и рассеяния, а также к неоднородному уширению спектров в фасную область. Отметим, что для малых частиц с диаметром 5.2 нм аналогичные расчеты предсказывают практически однородное уширение спектров в диапазоне толщин ¿ = 0.5-2 нм, а расчеты спектров поглощения серебряных 30-нм частиц в вакууме с диэлектрическим покрытием (5 = 0-3 нм, п„ = 1.42) качественно отличаются от данных рис. 8а. Спектры бокового

рассеяния золотых частиц (рис. 8Ь) качественно похожи на спектры интегрального рассеяния, а влияние полимерной оболочки аналогично для спектров экстинкции и рассеяния. Максимумы спектров рассеяния сдвинуты по отношению к максимумам спектров экстинкции на 10-20 нм в красную область.

Рис. 8. Спектры экстинкции А(Х) (а) и рассеяния /90(1) (Ь), рассчитанные для золотых

частиц различного диаметра (сплошные кривые, цифры у кривых - значения </ в им) и для тех же частиц с полимерным покрытием (штриховые кривые). Показатель преломления и толщина оболочки равны п. = 1.5, « = 5 нм.

Оптическая модель биоконыогатов: экспериментальные исследования

Адсорбция полимеров на коллоидных частицах представляет значительный интерес для различных областей химической индустрии (фармацевтика, производство фотоматериалов, красок и т.д.), а также для физической химии дисперсных систем в связи с фундаментальной проблемой стабилизации коллоидов полимерными добавками, которая обсуждалась еще в пионерских исследованиях Фарадея по стабилизации золей золота желатином. Особый интерес представляет адсорбция биополимеров на поверхности металлических наночастиц благородных металлов, обладающих четко выраженным локализованным ППР.

Адсорбция полимера приводит к изменению геометрических и диэлектрических параметров вблизи поверхности коллоидных частиц и, соответственно, к изменению их оптических свойств. В частности, для золотых или серебряных наночастиц полимерная адсорбция сдвигает величину и спектральное положение пика ППР. Несмотря на относительную малость подобных эффектов, их удалось использовать для исследовательских целей (изучение кинетики адсорбции желатина на золотых наночастицах (Еск е1 а1. , 2001), аналитическая химия белков (СПезюПга е* а1., 1988)) и для важных прикладных задач (высокопроизводительные клинические анализы (Епд)еЫепле е1 а1., 2001».

В данном разделе представлены результаты исследования адсорбции двух типов полимеров (желатин и иммуноглобулин С человека - Ыдв) на золотых частицах с диаметром 15 и 34 нм тремя методами - спектроскопия поглощения, ДССР и ДРС. Для интерпретации данных предложена новая модель биоконъюгата с золотым ядром и многослойным неоднородным полимерным покрытием. В этой модели взаимодействие конъюгата с молекулами-мишенями естественным образом моделируется в терминах формирования нового неоднородного слоя.

Длина волны, нм Длина волны, нм

Рис. 9. Спектры экстинкции (сплошные кривые) и рассеяния (штриховые кривые) для исходного 34 нм золя (/) и после добавления желатина в концентрации 0 1 мг/мл (2) и 0 25 мг/мл (5)

Рис. 10. Спектры экстинкции (сплошные кривые) и рассеяния (шгриховые кривые)дпя исходного 34 нм золя (/), после добавления К2СО3 (1 2 шМ) (2) и Ь^О в концентрации 8 мкг/мл (5).

изменение спектров (кривые 2),

&(т) 1.0

Рис. 9 показывает изменения спектров экстинкции и рассеяния 34-нм золя при добавлении желатина. Отметим, что меньшая концентрация добавленного желатина (0.1 мг/мл в расчете на весь объем золя) вызывает более сильное

чем более высокая концентрация полимера (0.25 мг/мл, спектры 3). Эти различия связаны, очевидно, с недостаточной стабилизацией золя при более низкой концентрации полимера и незначительными эффектами агрегации в момент смешения. На это указывает, прежде всего, временная зависимость спектров рассеяния, а также характер изменения автокорреляционной функции. В дальнейшем мы обсуждаем только данные для концентрации желатина 0.25 мг/мл. Сопоставление спектров рис. 9 и рис. 10 обнаруживает большое сходство в изменениях величины и спектрального положения максимумов поглощения и рассеяния. Отсюда напрашивается естественный вывод, что в обоих случаях формируется адсорбционный слой похожей толщины и структуры. Однако это предположение является ошибочным, в чем можно убедиться на основе данных ДРС (рис. 11).

Из наклона графиков корреляционных функций мы находим, что после адсорбции

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Время т, мсек Рис. 11. Автокорреляционные функции фототока, измеренные для исходного золя (/), после добавления К2СО3 (2) и последующего добавления И^Сг (3) 4 - измерения для конъюгатов КЗ с желатином

желатина гидродинамический диаметр частиц увеличился с </ = 35 нм до г/, = 70±3нм, откуда средняя эффективная толщина адсорбированного слоя равна .5 = 18 + 1 нм. Это значение более чем в 3(!) раза превышает значение 1«5 нм для Мдв, так что даже с учетом неизбежных ошибок измерений мы считаем это различие совершенно достоверным. Кроме того, примерно такое же значение (19 нм) получено в работе (Шов е! а!., 2000) и использовалось для оценки изменений спектров 15-нм частиц Чтобы убедиться в том, что более чем трехкратное отличие в толщинах слоя не связано с какими-либо особенностями 34-нм частиц, мы повторили эксперименты с частицами 15-нм размера. Измерения методом ДРС для этой системы дают значение среднего гидродинамического диаметра золотых частиц ^ я 18 нм, диаметр конъюгатов

г/, = 47 ± 3 нм и среднюю толщину адсорбированного слоя ¿*15±2нм. Это

значение близко к средней толщине 18 нм, полученной для 34 нм частиц, и в три раза больше, чем толщина слоя Ыдб, адсорбированного на частицах диаметром 34 и 15 нм.

Таким образом, за внешней похожестью спектральных изменений при адсорбции Ыдв и желатина скрывается, на самом деле, совершенно различная структура адсорбированного слоя, выявляемая по данным ДРС. Это означает, что мы столкнулись с проблемой объяснения поразительного сходства спектров экстинкции и рассеяния для конъюгатов с толщиной оболочки, отличающейся более чем в три раза. Для разрешения этого противоречия нами была использована оптическая модель биоконъюгата, состоящего из золотого ядра, первичной полимерной оболочки, формирующейся при синтезе конъюгатов, и вторичной оболочки, образующейся при взаимодействии с молекулами-мишенями. Каждая из неоднородных оболочек моделируется произвольным числом дискретных слоев.

Адсорбционная модель взаимодействия конъюгата с молекулами-мишенями имеет важный биологический прототип: выявление антигенов конъюгатами, мечеными моноклональными антителами, или связывание обычных или "биспецифических" моноклональных антител с антигеном, иммобилизованным на поверхности сенсора. В настоящее время для исследования аффинности (степени сродства отдельных сайтов антител к конкретному эпитопу антигена) и общей эффективности связывания антител (авидности) применяются сенсоры на основе нарушенного полного отражения. Результаты нашей работы позволяют предположить, что метод ДССР также имеет хорошую перспективу в качестве альтернативы дорогим сенсорам, основанным на изменении отражающих свойств призм или зеркал при адсорбции биологических макромолекул.

Функционализация КЗ 5'-тиоолиготимидином

В рамках данной работы нами был синтезирован маркер КЗ-15-Тгв -комплекс наночастиц коллоидного золота (средний диаметр 15 нм) с тиол-модифицированными олиготимидиновыми молекулами длиной 28 нуклеотидов (зондами). Описан принцип спектрофотометрического контроля всех этапов приготовления маркера и применения 11\/-\/18 спектров поглощения для выявления реакции гибридизации /л у//го. В частности было показано, что величины поглощений нуклеиновых кислот и наночастиц золота в составе маркера складываются неаддитивно как в области поглощения нуклеотидов

(260 нм), так и плазмонного резонанса коллоидного золота (520 нм) Число олигонуклеотидов, химически связанных с одной наночастицей золота (-150), было оценено по данным спектрального анализа маркера и супернатанта промежуточного продукта Синтезированный маркер специфически окрашивал молекулы-мишени полиадениловой кислоты (поли(А)) в дот-гибридизации на мембранном фильтре, но не окрашивал молекулы контроля (поли(1))). При гибридизации маркера с контролем и молекулами-мишенями в растворе спектральные изменения не зарегистрированы Применение циклов замораживания/оттаивания показало наличие изменений в плазмонном резонансе маркера с добавленными поли(А) молекулами и отсутствие изменений в случае поли(1)). Эти эффекты объяснены в рамках агрегационной модели, отличной от модели перекрестных сшивок.

Спектрофотометрический контроль конъюгирования КЗ с олигонуклеиновыии кислотами

На рис 12 приведены спектры поглощения исходного золя КЗ (1), смеси КЗ с зондом (2) и той же смеси после добавления буфера и повышения концентрации NaCI до 0.3 М (3) Все эти кривые приведены с учетом изменения концентрации при разведениях, обусловленных внесением в систему растворов зонда, буфера и соли, те приведены к концентрации исходного золя КЗ Цифрой 4 обозначен спектр супернатанта, полученный после

центрифугирования маркера (15000 д, 20 мин). Дифференциальный спектр 5 получен вычитанием значений спектральной функции супернатанта А(Л)4 из спектра маркера А{Х\ в буфере с 0.3 М NaCI. Здесь нижними индексами обозначены номера

соответствующих кривых. Реальный спектр маркера КЗ-15-Тгв, полученного после

ресуспендирования осадка в том же объеме гибридизационного буфера, показан кривой 6. Можно видеть, что реальный спектр маркера Кз-15-Тг8 (б) значительно ниже виртуального спектра (5), тем не менее, в области ПР он превосходит спектр исходного золя (1).

Устойчивость маркеров КЗ-15-Т28 сохраняется высокой в широком диапазоне температур (-70° - +80° С) и при многократном замораживании-оттаивании. Основным отличием полученного нами препарата от описанного в патенте (Mirkin et al, 2002) является то, что нами использованы зонды

А

200 400 600 800

X, нм

Рис. 12. Эволюция спектров поглощения КЗ в процессе приготовления маркера КЗ-15-Т28. / - исходный золь КЗ-15,2- спектр смеси КЗ-15+128, 3 - спекгр системы после добавления фосфатного буфера (ФБ) и ЫаС1 до 0.3 М, 4 - супернатант, 5 -расчетный спектр маркера, 6 - реальный спектр маркера КЗ-15-Т28 после ресуспензирования в буфере (ФБ+0.1М ЫаС1) Спектр 3 получен через 48 часов после начала процедуры синтеза, включающей 24 часа инкубации смеси КЗ-15+Т28 и 24 часа инкубации системы после добавления ФБ и 0 1М №С1

Тге, тиолированные непосредственно по 5'тимидину без использования алканового спейсера. Подобный подход совсем недавно был использован авторами (Sumaoka et al„ 2004) для прямой «пришивки» двухцепочечных ДНК к золотым поверхностям.

Экспериментальные исследования активности ферментов, иммобилизованных на наночастицах КЗ

В наших работах мы исследовали различные ферментные конъюгаты коллоидного золота. Это были гликолитические ферменты: целлюлаза из Trichoderma viride (Boehringer Mannheim, Германия) и пектиназа из Aspergillus niger ЕС 3 2.1.15, а также протеолитический фермент - трипсин (Sen/a, Г ермания).

Конъюгат коллоидного золота с трипсином в данной работе мы применили для количественного определения белка в растворе. Трипсин -панкреатическая сериновая протеиназа, которая секретируется в кишечник и расщепляет белки пищи. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей белков, содержащих основные аминокислоты, такие как лизин или аргинин. Таким образом, используя в качестве выявляющего агента трипсин, мы гарантированно имели возможность обнаруживать в растворе только белковые молекулы. В качестве молекул-мишеней в наших экспериментах мы использовали IgG человека.

Оказалось, что при взаимодействии конъюгата

трипсин-КЗ с IgG происходят количественно детерминированные агрегационные процессы.

Минимальное выявляемое

количество IgG при

использовании конъюгата трипсин - коллоидное золото составило -0.2 мкг.

На рис. 13 приведен график зависимости изменения

оптической плотности суспензии маркера КЗ-трипсин на длине волны 620 нм от количества внесенного IgG.

Заключение к 3 главе

Среди способов "посадки" зондов на метки выделяют два основных: адсорбционный и хемосорбционный, каждый из которых имеет свои особенности в плане приготовления и использования. К преимуществам простой (физической) адсорбции относят минимальное воздействие на структуру макромолекулы и, как следствие, сохранение ее функциональных свойств. Величина адсорбции, а также структура адсорбционного полимерного слоя в значительной мере определяются характером взаимодействия макромолекул с поверхностью, т.е. типом адсорбционной связи. • Оптимальное соотношение компонентов определяется способом

флокулятивного исследования. Добавление электролитов в гидрозоль

0 60

Ё о

0 40

О 20

001 0 10 100 Концентрация IgG, иг/мл

Рис. 13. Зависимость оптической плотности раствора трипсин - КЗ при А = 620 нм от количества внесенного

золотых или серебряных наночастиц вызывает их флокуляцию как результат экранирования заряда двойного электрического слоя, в норме (в водной среде) выполняющего стабилизирующую функцию

• Полимеры, содержащие как кислотные, так и основные группы, то есть полиамфолиты или слабоосновные поликатионные макромолекулы с рН-зависимым защитным действием, являются наиболее эффективным средством стабилизации анионных гидрозолей золота

• Оптимальные для стабилизации условия обычно достигаются при возможно более низкой ионной силе и при значениях рН на -0.5 ед. выше изоэлектрической точки стабилизирующего вещества.

■ Адсорбция полимера приводит к изменению геометрических и диэлектрических параметров вблизи поверхности коллоидных частиц и, соответственно, к изменению их оптических свойств.

• Формирование вторичной неоднородной оболочки практически незаметно по изменениям спектров экстинкции, но становится вполне детектируемым

по изменениям спектров упругого рассеяния. Это подтверждает и *

теоретически обосновывает наши заключения о потенциально большей чувствительности метода ДССР по сравнению с обычной спектроскопией поглощения. Результаты нашей работы позволяют предположить, что метод ДССР также имеет хорошую перспективу в качестве альтернативы дорогим сенсорам, основанным на изменении отражающих свойств призм или зеркал при адсорбции биологических макромолекул.

Другой подход к функционализации НЧ основан на использовании тиольных или дисульфидных и фосфиновых лигандов, содержащих терминальную карбокси-, амино-, или малеимидо- группы. Такой подход позволяет связывать биологические компоненты карбодиимид опосредованной этерификацией и амидированием или реакцией с тиольной группой. Преимущества химического прикрепления наиболее ярко проявляются для линейных молекул, подобных ДНК, и связаны с терминальной иммобилизацией, обеспечивающей строгую пространственную ориентацию зондов.

• Использование описанной процедуры приготовления олигонуклеотид-функционализированного КЗ позволяет получать агрегационно стабильные в водно-солевых растворах препараты КЗ-маркеров. Устойчивость маркеров КЗ-15-Т2в сохраняется высокой в широком диапазоне температур (-70° -+80° С) и при многократном замораживании-оттаивании.

• Спектрофотометрические исследования позволили установить, что величины поглощения нуклеиновых кислот иммобилизованных на частицах КЗ и самого КЗ складываются не аддитивно и в зоне поглощения НК (260 нм) и в области ПР коллоидного золота (520 нм). Определенное спектрофотометрическим способом количество иммобилизованных на частицах КЗ молекул олигонуклеотидов по порядку величины совпадает с ч данными других авторов.

Поскольку ферментативная активность пептолитических и гликолитических ферментов в составе комплекса с КЗ не только не снижается, но и увеличивается стабильность белков, использование маркеров - ПРЧ, функционализированных биомакромолекулами, создает хорошие предпосылки для создания различных диагностических систем, трансформирующих биоспецифические взаимодействия на поверхности наночастиц в оптически регистрируемый сигнал, чему посвящена следующая глава диссертации.

Глава 4. Детектирование биоспецифических взаимодействий посредством коллоидно-металлических маркеров

Коллоидное золото в медико-биологических исследованиях в основном используется как цитохимическая метка для изучения макромолекул в электронно-микроскопических (просвечивающих и сканирующих), светомикроскопических методах, абсорбционной, поверхностно усиленной рамановской спектроскопии (гигантское комбинационное рассеяние) Таким образом, в основе детектирования биоспецифических взаимодействий лежат уникальные оптические свойства наноразмерных металлических структур, а именно: большая электронная плотность, способность рассеивать и отражать электроны, излучать вторичные электроны, изменять амплитуду и частоту плазмонных колебаний в зависимости от условий ближайшего окружения и коррелированных расстояний между частицами в агрегатах, создавать нелинейные локальные электромагнитные поля вокруг частиц и их агрегатов, усиливая (гигантски) или ослабляя тем самым рамановское или упругое рассеяние света и флуоресценцию. Из последних достижений в области нанотехнологии к вышеперечисленным свойствам следует добавить способность образовывать дву- и трехмерные суперкристаллические структуры.

Основным методом детектирования биоспецифических взаимодействий посредством коллоидно-золотых частиц долгое время оставалась электронная микроскопия, преимущественно в просвечивающем варианте. Способность золотых наночастиц интенсивно рассеивать и излучать вторичные электроны, необходимая в сканирующей электронной микроскопии, нашли значительно меньшее применение. Одной из первых работ по иммунозолотому мечению для электронной микроскопии была работа (Faulk, Taylor, 1972). В дальнейшем этой проблеме было посвящено большое количество обзоров и монографий (Polak, Van Noorden, 1983; Hayat, 1989).

Метки разных размеров и зонды в широком ассортименте - вот основная особенность коллоидно-золотых маркеров в применении к цито- и гистохимии как традиционной, так и электронно-микроскопической, которую называли просто электронной до эры всеобщей компьютеризации. Вообще, использование термина метка (label) и производных от него (labeling etc.) в отношении золотой наночастицы это прерогатива гисто- и цитологии. Среди общих для маркеров требований: чувствительности, селективности, стабильности - такая особенность ПРЧ, как сравнимые с биомакромолекулами размеры, накладывает ограничения в плане проницаемости в ткани. В настоящее время эта проблема решена применением золотоорганического комплекса, содержащего 11 атомов металла в кластере, которые так и называют - undecagold clusters (Heinfeld, 1987). Диаметр таких меток около 1 нм Однако визуализировать их удобно только с помощью просвечивающего электронного микроскопа В технике микроскопических заливок проблему проницаемости решают применением водорастворимых метилмстакрилатных смол, полимеризующихся при низких температурах под действием УФ света, или криоультратомии (Tokuyasu,1984).

В световой микроскопии применение ПРЧ обеспечивается их высокой цветовой контрастностью, обусловленной интенсивным и добротным поглощением и рассеянием в видимой области спектра, а также способностью значительно усиливать амплитудный контраст изображения за счет

селективной адсорбции на ПРЧ ионов серебра и золота. Возможность достаточно легко визуализировать металлические НЧ позволяет использовать их в таких препаративных методах анализа как, например, проточная цитометрия.

Детектированию биоспецифических взаимодействий посредством ПРЧ, используемых как биосенсоры, также посвящено большое количество обзоров (Schuk, 1997; Schalkhammer, 1998; Haes et al., 2004; Stuart et. al., 2005). Собственно, наиболее простыми "наносенсорными" методами являются различные варианты твердофазного анализа, позволяющие визуально определять акты биоспецифических реакций (Moeremans et al, 1988)

4 глава включает 7 разделов, содержащих результаты собственных исследований и их обсуждение.

Электронно-микроскопические исследования поверхностных структур бактерий и белков цитоскелета

При изучении поверхностных структур бактериальных клеток родов Azospirillum и Agrobacterium приготовление препаратов проводилось по протоколу с вариантами мечения непосредственно на сетке, тогда после этапа нанесения препарата включали дополнительные этапы блокировки мест неспецифической адсорбции 0.1% раствором БСА и инкубации на капле КЗ-маркера.

На рис. 14 приведена одна из первых наших электронных микрофотографий бактерии А. brasilense Sp 245, меченной конъюгатом КЗ-15 со штаммоспецифическими AT.

В нашей работе (Чумаков и др., 2001) с помощью различных КЗ-маркеров было показано, что агробактерии продуцируют прямые фибриллы как при взаимодействии с корнями пшеницы, так и в чистой культуре. Длинные прямые экстраклеточные нити непатогенных агробактерий, образующиеся как при выращивании бактерий в чистой культуре, так и при контакте агробактерий с поверхностью корня пшеницы, являются чувствительными к обработке целлюлазой. Была проведена иммуноцитохимическая идентификация поверхностных структур агробактерий с помощью меченых коллоидным

золотом целлюлазы, антител к О-слецифическим

липополисахаридам и

антител к V/г-зависимым белкам. Показано, что специфические к W/62-белку антитела взаимодействуют с тонкими фибриллами,

расположенными в виде пучка на одном из полюсов агробактериальной клетки с индуцированными wr-генами, Рис. 14. Электронно-микроскопическая фотография н0 не взаимодействуют СО бактериальной клетки A brasilense Sp 245; структурами, соединяющими взаимодействие с антителами, меченными коллоидным агробактерии В агрегатах золотом клеток.

исследования локализации актиновой

Свето-микроскопические составляющей цитоскелета

В результате исследований, проведенных на полутонких срезах заключенных в ПЭГ каллусных тканей табака выяснилось, что маркеры на основе конъюгатов

биоспецифических молекул с КЗ можно успешно применять и для изучения цитоскелета с помощью световой микроскопии. С помощью маркера фаллоидин-КЗ и последующего усиления солями серебра можно локализовать актин-содержащие структуры клеток (рис. 15). На данном рисунке стрелками показаны зоны локализации актиновой

составляющей цитоскелета

растительной клетки, локализованной в субкортикальной и околоядерной областях, выявленных маркером фаллоидин-КЗ и усиленных серебром.

Темнопольная свето-микроскопическая визуализация ПРЧ

В наших экспериментах мы использовали систему темнопольного освещения сверху (объектив х40 с опак-иллюминатором), реализованную на базе микроскопа "Биолам М" (ЛОМО, Россия). Регистрацию изображения проводили с помощью цифровой фотокамеры "Olympus С 765 Ultra Zoom, 4.0 megapixel" в режиме скоростной съемки (15 кадров/сек).

На рис. 16 приведен ряд последовательных кадров с одного участка изображения препарата золотых НСф с размерами частиц 90 нм в 50% растворе глицерина. Для лучшей наглядности перемещения частиц приведены каждый второй кадры, т.е. рисунок отображает картинку временного интервала около 6 сек.

Рис. 15. Свето-микроскопическое выявление актин-содержащих структур на полутонком срезе каллусной ткани табака маркером фаллоидин-КЗ с последующим усилением солями серебра (масштабная линейка 10 мкм)

Рис. 16. Серия последовательных кадров участка изображения препарата частиц золотых НСф диаметром 90 нм в 50 % глицерине Временной интервал с 1 по 48 кадр - 6.4 сек Световая микроскопия темного поля (объектив

1ЬНАЯ БИБЛИОТЕКА ! С.Петср*ург < М МО акт

......J

Аналогичный препарат золотосеребряных НСт с размерами -15*40 нм показан на рис. 17 В данном случае мы наблюдаем совершенно иную динамику видео изображения Наряду с перемещением объекта в поле зрения, отчетливо видно изменение интенсивности его свечения, обусловленное вращательной диффузией частиц.

Рис. 17. Серия последовательных кадров участка изображения препарата частиц золотосеребряных НСт с размерами -15*40 нм в 50 % глицерине Временной интервал с 1 по 48 кадр - 6 4 сек Световая микроскопия темного поля (объектив с опак-иллюминатором *40).

Совсем недавно была опубликована статья под названием "Золотые наностержни как новые невыцветающие плазмон-ориентационные сенсоры для поляризационной микроскопии единичных частиц" (ЭбппюЬзеп, АЫБакэБ, 2005). В работе этих авторов золотые НСт рассматриваются как несовершенные поляризаторы. Однако, по нашему мнению, апериодическое вспыхивание плазмонно-резонансных НСт, обусловленное вращательным броуновским движением, связано в большей степени с ориентацией частиц относительно облучающего светового потока, и может быть зарегистрировано без использования дорогостоящей поляризационной оптики.

Как отмечалось ранее, НСт получают в концентрированных растворах ионных ПАВ Отмыть двойной слой ПАВ с поверхности частиц практически невозможно, его можно только заместить на лиганды, имеющие большую, чем четвертичные амины, афинность к поверхности золотой или серебряной частицы, например, содержащие меркапто-группы. Однако эта особенность металлических мицеллярных структур, по всей видимости, может облегчить адсорбцию биомакромолекул, плохо растворимых в условиях низкой ионной силы, таких как миозины, мембранные амфифильные белки и липопротеины, по аналогии с обращенно-фазовой хроматографией белков. Сведений о такого рода функционализации пока нет, однако нам удалось получить некоторые обнадеживающие экспериментальные результаты.

Так, препарат НСт-640 (мы обозначаем их по длине волны поглощения второго пика) после аккуратной отмывки в цикле сединаментационного осаждения был напрямую конъюгирован с протеином А. После освобождения от избытка белка центрифугированием препарат показал специфическое связывание с 1дв человека, выявляемое в дот-блот тесте. Однако интенсивность окрашивания пятен была низкой (бледно-голубой).

После пропитки иммерсионным маслом нитроцеллюлозная мембрана была помещена под объектив микроскопа "Виолам М" и просмотрена в режиме опак-иллюминации. Изображение края шестого пятна было четко различимо в виде

интенсивного красного свечения связаного с тем, что сечение рассеяния НСт во много раз превышает таковое НСф эквивалентного объема. Положение пика светорассеяния практически совпадает со спектральным положением максимума поглощения.

Экспериментальное исследование биоспецифических взаимодействий методом твердофазного анализа

Одним из самых простых и доступных методов биоспецифического анализа с использованием ПРЧ является твердофазный анализ: стрип-, слот-, дот- или блот-тесты. В качестве основного методического приема используется перенос частиц исследуемого вещества на твердый носитель, чаще всего нитроцеллюлозную мембрану, с их иммобилизацией и последующим специфического выявления исследуемых компонентов с помощью иммунохимической реакции. Этот метод имеет высокую чувствительность и точность анализа, а также быстроту, надежность и простоту выполнения. Белковому иммуноблоту и иммунодоту в биохимических исследованиях посвящен обзор Стародуба с соавт. (1987).

Схема проведения твердофазного иммуноанапиза включает выполнение следующих операций:

- нанесение исследуемого материала на сорбент,

- блокирование фона,

- иммунохимическое выявление антигенов с помощью зондов, меченных коллоидным золотом.

Вариант твердофазного иммуноанализа для целых бактериальных клеток был назван нами "cell-gold immunoblotting".

Нам представлялось также важным проанализировать влияние размера частиц золотой метки на чувствительность маркера. Рис. 18, на котором приведены результаты дот-блот определения кроличьих IgG протеином А, меченным КЗ, иллюстрирует зависимость чувствительности метки от размера частиц золота. Объяснение увеличения чувствительности с размером частиц КЗ может быть следующим. При постоянном числе сайтов связывания количество адсорбированных частиц маркеров будет примерно одинаковым. Отсюда ясно, что крупные частицы обеспечивают большую окраску пятна, поскольку в области d ~ 10 - 40 нм сечение поглощения примерно пропорционально объему частиц

Спектры экстинкции и рассеяния при специфической и неспецифической агрегации коллоидного золота

Начальные стадии агрегации частиц и изменение структуры адсорбционного слоя при биоспецифических взаимодействиях на поверхности частиц КЗ, будучи принципиально разными по своей природе, могут приводить к сходным и часто весьма слабым спектральным изменениям. Сечение поглощения золотых частиц с диаметром 5-10 нм существенно превышает интегральное

в

• • • Н

Рис. 18. Дот-блот определение последовательных двойных разведений кроличьих протеином А, меченным коллоидным золотом с частицами диаметром 5 (а), 10 (б) и 30 (в) нм.

рассеяние, но для частиц с диаметром 30 нм и более вклад рассеяния в полную экстинкцию становится сравним с поглощением и может даже превышать его (диаметр более 60 нм). Для агрегатов наночастиц золота относительный вклад рассеяния становится еще больше.

Рис 19 показывает изменения спектров экстинкции и светорассеяния как

500 600 700 Длина волны, нм

800

450

550 650 750 Длина волны, нм

Рис. 19 а. Изменение спектров экстинкции (сплошные линии) и светорассеяния (штриховые линии) конъюгата КЗ-15+Т\уееп 20 после добавления к 4 мл золя 80 мкл 0 001% ЧСА Цифры на кривых соответствуют исходному золю (0) и временным интервалам в 2 (/), 30 (2) и 90 (3) минут, б то же, что и на а для золя с диаметром частиц 30 нм

функции времени для КЗ 15 (а) и 30 (б) нм, соответственно, стабилизированных Т\«ееп-20 (Р1ика, Швейцария) при рН 3 (такие золи называют "золотым красителем"

("аигос1уе"). Агрегация обоих золей была инициирована добавлением человечьего сывороточного альбумина (ЧСА, Реапа!, Венгрия) до конечной концентрации 0.2 мкг/мл (приблизительно 100 молекул на одну частичку диаметром 30 нм). О кинетике образования агрегатов

наночастиц судили по изменениям в спектрах экстинкции и светорассеяния как функции времени. Поскольку такой тип агрегации инициируется взаимодействием

400 500 600 700 800 Длина волны, нм

Рис. 20. Изменение спектров экстинкции (сплошные линии) и светорассеяния (штриховые линии) конъюгата КЗ-15+PrA (объем 4 мл, золотое число РгА равно 5 мкг/мл) после добавления 150 мкл IgG в концентрации 1 мг/мл. Цифры на кривых соответствуют исходному золю (0) и временным интервалам в 2 (/), 7 (2), 30 (3) и 90 (О минут

стабилизирующего полимера с добавляемым белком за счет гидрофобных и/или электростатических сил, мы называем его неспецифическим, в отличие от взаимодействия типа антиген-антитело, которое мы называем биоспецифическим.

На рис. 20 приведен пример кинетических изменений спектров экстинкции и рассеяния в процессе биоспецифической агрегации. В качестве модельной системы был взят конъюгат частиц КЗ диаметром 15 нм с белком A (Sigma, США) (КЗ-15+PrA) и иммуноглобулин G (IgG, Serva, Германия). Молекула белка А имеет два или более сайтов для специфического взаимодействия с молекулами иммуноглобулина IgG Данные рис. 20 соответствуют примерно эквимолярному соотношению реагентов по сайтам связывания (конечная концентрация добавленного IgG 36 мкг/мл, концентрация РгА 5 мкг/мл примерно соответствовала золотому числу). О биоспецифическом взаимодействии молекул IgG с конъюгатами КЗ-15+РгА судили по кинетическим изменениям спектров поглощения и рассеяния. Сравнивая изменения спектров экстинкции с аналогичными спектрами для случая неспецифической агрегации конъюгатов того же размера (рис. 19а), легко заметить два основных отличия. Во-первых, отсутствует заметное смещение максимумов экстинкции в красную область. Во-вторых, величина максимума не убывает сразу после смешения компонентов, а сначала возрастает, затем постепенно возвращается к исходному значению и только после примерно 30 мин начинает заметно убывать. Но самое главное, если интенсивность поглощения на первом этапе изменяется примерно на 15 - 20 %, то интенсивность светорассеяния изменяется в десятки раз, в случае как специфической, так и неспецифической агрегации. Таким образом, измерения светорассеяния оказываются гораздо более чувствительными к биоспецифическим взаимодействиям на поверхности металлических НЧ по сравнению со стандартными спектрофотометрическими измерениями в случае агрегационных процессов.

ДНК-функционализированные КЗ маркеры в анализе РНК последовательностей

Сравнительно недавно в сотрудничестве с группой исследователей под руководством В.К. Плотникова из Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко нами начаты работы по проекту, направленному на изучение механизма посттранскрипционной регуляции экспрессии генов злаковых растений на уровне модуляции стабильности цитоплазматических мРНК. Конкретная задача проекта заключалась в оперативном и высокочувствительном количественном определении специфических мРНК растений с использованием маркеров КЗ, конъюгированных с олигонуклеотидными зондами (КЗ-ОНК).

Известно, что на стабильность молекул мРНК в клетке оказывают существенное воздействие эндогенные (РНКазы, дцРНК, гормоны и др.), а также экзогенные факторы (биологически активные вещества, стрессы и т.п.). Во многих случаях природа взаимодействий мРНК (цис-фактор) и эндо- и экзогенных факторов (транс-фактор) неизвестна Изучение этих взаимодействий необходимо для понимания глубинных механизмов регуляции экспрессии генов в ходе онтогенеза и при реакции организмов на стрессовые условия среды.

Для получения КЗ-ОНК маркеров мы использовали золи с диаметром частиц 15 нм и три различных 20-звенных тиолированных олигонуклеотидных

зонда (Syntol, Россия), специфичных к определенным участкам зеиновых матричных РНК кукурузы. Последовательности этих олигонуклеотидов в направлении 5' - 3' выглядят следующим образом' (Z22-1) Tr-SH-Tio-GTA GGT AGG CGG CAG GGT T, (Z22-2) Tr-SH-Tio-TAG GTA CGC AAC AGA GTT CGA, (Z22-3) Tr-SH-Tio-CAA GTA GGC AAC AGG GTT TG.

Для проведения теста гибридизации с КЗ-ОНК маркерами использовали очищенные препараты РНК кукурузы из сортов с различным содержанием зеиновых мРНК Отметим, что синтез данных маркеров связан с началом исследований по применению спектральных методов для исследования стабильности мРНК пшеницы и кукурузы в качестве селекционного признака стрессо-устойчивости растений (Плотников с соавт , 1997).

Для примера на рис. 21 приведена зависимость экстинкции на длине волны 530 нм от количества мРНК,

добавленной к взвеси КЗ-ОНК конъюгатов. Как видно из графика, величина экстинкции возрастает примерно на 40%. Согласно теории возрастание экстинкции без заметного красного сдвига максимума можно интерпретировать как результат образования компактных агрегатов с небольшим числом

золотых частиц. Однако теоретическое увеличение экстинкции существенно меньше, чем на рис. 21.

0.16

25 50 75 100 Количество мРНК, мкг

Рис. 21. Зависимость экстинкции на длине волны 530 нм от количества добавляемой мРНК к взвеси олигонуклеотидных маркеров на основе КЗ-15. Время гибридизации 30 мин, толщина кюветы 2 мм, объем смеси 0 4 мл.

Агрегация КЗ-ОНК маркеров, индуцированная гибридизацией с комплементарными последовательностями.

Следующим этапом работы было выяснение особенностей взаимодействия КЗ-15-Т2в маркера с поли(А) в растворе. Селективное взаимодействие маркера с поли(А) было подтверждено результатами твердофазного анализа: дот-блот »

теста, на основании которого можно сделать вывод, что КЗ-15-Тге специфически взаимодействует с поли(А) при комнатной температуре. При проведении тестов не выявлено взаимодействия КЗ-15-Тгв с поли(11).

После внесения мишеней (поли(А) или поли(1))) в раствор маркеров никаких визуально регистрируемых изменений в системе не происходило. Изменения спектров, регистрируемых на приборе «Спекорд М-40», находились в пределах стандартных ошибок измерения Изменения интенсивности окраски, вплоть до исчезновения, становились заметными в пробирках с добавленной поли(А) только после замораживания. Однако окраска быстро восстанавливалась еще

до полного оттаивания препарата. Тем не менее, эти изменения не являются полностью обратимыми даже при нагреве до температуры свыше 60°С. Более того, в препарате, содержащем поли(А) с концентрацией 510"7 М было зарегистрировано незначительное уменьшение оптической плотности при нагреве от 20° до 80°С, с возвратом к прежнему значению при охлаждении до комнатной температуры. Следует отметить также, что отношение величин поглощения УФ и ПР пиков во всех экспериментах по гибридизации в растворе оставалось примерно равным 1.

Концентрационные зависимости оптической плотности суспензий после третьего цикла замораживания-оттаивания приведены на графиках рис. 22. Здесь по оси абсцисс с логарифмической шкалой отложена конечная молярная (в молях нуклеотидов) концентрация полинуклеотидов.

Из приведенных на рис. 22 данных, видно, что в отсутствие специфического

взаимодействия оптическая плотность в пробах практически не изменяется.

То же происходит при попытке вызвать реакцию нагреванием-охлаждением, причем как в опытных, так и контрольных образцах. Кроме того, обращает на себя внимание незначительное красное смещение ПР пика в опытном образце даже после трех циклов замораживания-оттаивания. Все это, по нашему мнению, свидетельствует о механизме агрегации, отличном от описываемого в работах группы Миркина механизма перекрестных сшивок.

Заключение к 4 главе

В основе детектирования биоспецифических взаимодействий лежат уникальные оптические свойства наноразмерных металлических структур, а именно: большая электронная плотность, способность рассеивать и отражать электроны, излучать вторичные электроны, изменять амплитуду и частоту плазмонных колебаний в зависимости от условий ближайшего окружения и расстояний между частицами в агрегатах, создавать нелинейные локальные электромагнитные поля вокруг частиц и их агрегатов.

Описанные в данной главе способы регистрации биоспецифических взаимодействий посредством плазмонно-резонансных частиц можно условно подразделить на две группы, это пленарные решения (твердофазный анализ) и решения in vitro (в растворе).

В первой группе методов мишени либо маркеры иммобилизованы на твердом носителе. При этом регистрируется либо акт связывания маркера,

Д А/А

0.2

0.0

-0.2

-0.4

O-poiy(U) □ - poly(A)

0 1 10 100 Концентрация мишеней, М*10-9 Рис. 22. Зависимость изменения поглощения ДА/А растворов маркера КЗ-15-Т28 для трех циклов замораживания отгаивания (номера кривых 1,2 и 3) от концентрации добавленных молекул-мишеней поли(А) и контроля поли(1Г)

либо изменение оптических характеристик сенсора в результате взаимодействия маркеров с мишенями. Наиболее простым решением такого типа являются различные варианты дот-блот анализа на мембранных фильтрах.

Биоспецифические взаимодействия, происходящие на металлических частицах в растворе, могут приводить к двум принципиально разным сюжетам развития оптических изменений, обусловленных образованием агрегированных структур, либо формированием нового полимерного слоя на поверхности ПРЧ-маркера и изменения тем самым параметров диэлектрического окружения.

• Разработанная и апробированная на примере почвенных микроорганизмов оригинальная процедура твердофазного иммуноанализа целых клеток с использованием их прямого и непрямого мечения иммуноцитохимическими маркерами, содержащими частицы КЗ, в сочетании с известным способом выявления иммунных комплексов протеином А (непрямое мечение) весьма упрощает методику и целесообразна при серологических исследованиях большого числа штаммов микроорганизмов.

• Наностержневые золотосеребряные частицы имеют ббльшие возможности в плане детектирования биоспецифических взаимодействий на уровне отдельных молекул по сравнению с металлическими наносферами и могут быть эффективно использованы в изучении цитоскелета и контрактильных систем.

• Взаимодействия, опосредованные ДНК-ДНК, ДНК-РНК гибридизацией, мо(ут приводить к образованию агрегированных структур по механизму отличному от модели перекрестных сшивок. Причину выведения системы из состояния агрегационной стабильности, нам думается, можно объяснить локальными изменениями структуры слоя полимера на поверхности частицы.

В заключении к диссертации отмечается, что на основании анализа обширного литературного материала и результатов собственных теоретических и экспериментальных исследований по управляемому синтезу металлических наночастиц различных размеров (в диапазоне 3-100 нм) и форм (сферических и стержневых), функционализации их биоспецифическими макромолекулами (иммуноглобулинами, пектинами, ферментами, пептидами, олигонуклеотидами и др.) и изучению оптических свойств ПРЧ-маркеров в процессе взаимодействия с молекулами-мишенями методами спектроскопии поглощения и рассеяния, динамического светорассеяния, электронной и световой микроскопии можно сформулировать общий вывод: металлические наночастицы с плазмонным резонансом являются эффективным преобразователем молекулярных взаимодействий в оптически регистрируемый сигнал. Учитывая соизмеримые размеры меток и зондов, а также незначительное влияние наночастиц благородных металлов на биохимическую активность адсорбированных макромолекул, можно заключить, что ПРЧ-маркеры весьма перспективны в создании наносенсорных устройств и диагностических систем, позволяющих изучать биохимические процессы на уровнях вплоть до субклеточного и молекулярного, в том числе и в реальном времени.

В данной работе предложена новая модель биоконъюгатов металлических наночастиц, которая позволяет естественным образом моделировать формирование первичной полимерной оболочки при синтезе конъюгатов и образование вторичной оболочки при взаимодействии с молекулами-

мишенями Разработанная программа позволяет вычислять спектры экстинкции и углового рассеяния, моделируя степень неоднородности адсорбированного слоя с любой степенью детализации в терминах совокупности тонких слоев с постоянными показателями преломления. Мы показали, что основные спектральные изменения происходят при формировании первичной 5-нм оболочки, в то время как последующее присоединение молекул-мишеней приводит лишь к малым изменениям спектров экстинкции и рассеяния. В этой связи особый интерес представляет предложенный нами метод ДССР, поскольку при прочих равных условиях изменения в спектрах рассеяния более чувствительны к адсорбции вторичного слоя, чем спектры экстинкции

Выводы:

1. Разработан оригинальный метод синтеза ультрадисперсных золей золота с диаметром частиц 3 - 6 нм, защищенный патентом РФ, и модифицированный метод синтеза золотых наностержней на «мягких» матрицах ЦТАБ.

2. Разработана эффективная технология функционализации золотых наносфер и наностержней, основанная на использовании неспецифических (адсорбционных) взаимодействиях молекулярного зонда и золотой наночастицы. Каталог маркеров (138 наименований), созданных по разработанной технологии, включает различные биополимерные зонды (белки, лектины, полисахариды).

3. Разработан новый метод дифференциальной спектроскопии статического рассеяния для оптического мониторинга различных стадий синтеза биомаркеров на основе металлических наночастиц частиц с плазмонно-резонансным поглощением и рассеянием. Показано, что метод позволяет также идентифицировать тип биоспецифического взаимодействия маркера с мишенью на начальных стадиях процесса (биоспецифическая адсорбция или агрегация).

4 Показано, что неспецифическая адсорбция глобулярных белков на золотых наночастицах приводит к образованию биополимерного слоя порядка 4-6 нм и сопровождается красным смещением плазмонных пиков экстинкции и рассеяния на 2-4 нм и их увеличением на 15-20%.

5 Синтезирован маркер, представляющий собой 15-нм золотую наночастицу с ковалентно пришитыми тиол-модифицированными олиготимидинами длиной 28 Т-оснований (около 150 зондов на частицу). Показано, что эти маркеры не способны к агрегации при взаимодействии с комплементарными полинуклеотидами поли(А) в обычных гибридизационных условиях. Установлено, что агрегация, инициируемая замораживанием/оттаиванием подобных систем, является биоспецифической. Предложена модель агрегации, отличная от модели перекрестных сшивок Миркина и соавт

6. Синтезированы золотые наностержни с продольным плазмонным резонансом в области 650-900 нм (осевое отношение от 2 до 4). Показано, что эти частицы представляют собой перспективную платформу для создания нового типа биосенсоров, поскольку их резонанс легко настраивается в нужную область и обладает большей чувствительностью к изменению локального диэлектрического окружения.

7. Разработан твердофазный способ идентификации бактерий, основанный на биоспецифическом окрашивании капли образца, иммобилизованного на

нитроцеоллюлозной мембране, коллоидно-золотыми маркерами Показано, что оптимальный размер наночастиц для этого метода составляет около 30 нм.

8 Показана возможность определения белка по изменению спектров поглощения и рассеяния в случае неспецифической агрегацией частиц. Предложен новый вариант определения некоторых белков с помощью конъюгатов золотых наночастиц с трипсином, реализованный на стандартном спектрофотометре и на планшетном ИФА-ридере

9. Методом резонансного рассеяния в темном поле микроскопа показаны различия в динамическом изменении рассеянной интенсивности для золотых наносфер (90 нм) и наностержней (15x40 нм).

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Соколов О.И., Туркина М.В., Богатырев В.А. Миозиноподобный белок из высшего растения Heracleum sosnowskyi II ДАН СССР. - 1985, - Т 282. - С. 1513-1516

2. Соколов О И., Туркина М В., Куликова А Л , Богатырев В.А. Белки типа мышечных актина и миозина в тканях высших растений // V Биохим съезд, Киев, 1985. сб. симп. докл. - М: Наука, - С. 295-296.

3. Курсанов А.Л., Туркина М.В , Куликова А.Л., Соколов О И , Богатырев В.А. Выделение и изучение свойств актина и миозина в высших растениях // Отчет за 1984 - 1985 по прогр. сотр. стран-членов СЭВ и СФРЮ "Исследования в обл биол.физ." Пущино. -1986 - С. 105-106.

4. Kursanov A.L., Thurkina M.V., Sokolov O.I,. Khulikova A.L., Bogatirev V A. Actin and myosin filaments from conducting tissues of Heracleum sosnowskyi // Plant Physiol. Biochem. - 1987. - V. 25(6). - P. 689-696

5. Курсанов А.Л., Туркина M.B., Куликова А.Л., Соколов О И., Богатырев В.А Изучение агрегационных свойств растительных актина и миозина // Отчет по прогр. стан-чл. СЭВ и СФРЮ "Исследования в обл. биол. физ " Пущино. -1988. - С. 79-80.

6. Позднякова Л.И., Каневская С.В., Леванова ГФ., Барышева Н.Н., Пилипенко Т.Ю., Богатырев В.А., Федорова Л.С. Таксономическое изучение азоспирилл, выделенных из злаков Саратовской области // Микробиология -1988.-Т. 27. - С. 275-278

7. Sokolov O.I., Bogatyrev V.A., Khlebtsov N.G Spectroturbidimetric studies of myosin solution // Molecular Organization of Biological Structures Abs. Book II, June 19-24, -1989 Moskow. - P. 193.

8. Karpunina L.V., Trikhacheva U.Yu , Nikitina V E , Bogatyrev V.A. Investigation of interaction of Bacillus polimyxa lectins with wheat root fraction // Book of abstr 12 Int Lectin Conf., USA, Calif. 9-14 Sept. -1990. - P. 66.

9 Italianskaya J.V , Nikitina V E., Ponomariova E G., Bogatyrev V.A. Azospirillum lectins in the integration of bacteria-plants interaction // Lectin: Biol, Boichem and Clin. Biochem V.8. Sigma Chem. Сотр. S.-Luis -1990.

10. Богатырев В А., Дыкман Л.А , Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И. Твердофазный иммуноанализ с использованием коллоидного золота в серотипировании азоспирилл//Микробиология. -1991. - Т 60 - С 524-529.

11 Матвеев В Ю , Богатырев В А , Дыкман Л А , Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И Физико-химические свойства клеточной поверхности R- и ¿-вариантов штамма Azospirillum brasilense II Микробиология - 1992. - Т 61. - С. 645-651.

12 Bogatyrev V.A , Dykman L А , Matora L Yu , Schwartsburd В I. The serotyping of Azospirillum Spp by cell gold immunoblotting II FEMS Microbiol Lett - 1992. - V. 96. - P. 115-118

13 Dykman L A , Bogatyrev V.A., Shchyogolev S Yu , Ignatov V V Estimation of cell surface hydrophobicity of soil bacteria using cation probes labelled with colloidal gold // In- Proc 1-st Eur Nitrogen Fixation Conf / Eds. Kiss G В , Endre G. -Szeged. Officina Press, 1994. - P. 348.

14 Хлебцов H.Г., Богатырев В.А., Дыкман Л А., Мельников А.Г. Оптические свойства коллоидного золота и его конъюгатов с биоспецифическими макромолекулами // Коллоидный журнал. -1995. - Т. 57. - С. 412-423.

15 Chumakov M.I., Solovova G.K., Velikov V.A, Gorban V.V., Krivopalov Yu.V., Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Kennedy C. Associative interactions Agrobacterium radiobacter 5D-1 with mono- and dicotyledonous plants II In: "Nitrogen Fixation: Fundamentals and Application" / Eds. Tikhonovich I.A., Provorov N.A., Romanov V.I., Newton W.E. - Dordrecht, Boston, London: Kluwer Academic Publishers, 1995. - P. 254.

16. Карпунина Л.В., Вишневецкая О.А., Богатырев В.А., Никитина В.Е., Итальянская Ю.В. Определение локализации лектинов, агглютининов почвенных азотфиксирующих бактерий // Микробиология. - 1995. - Т 64. - С. 453-457.

17.Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман Л.А, Мельников А.Г. Спектральные свойства коллоидного золота // Оптика и спектроскопия. - 1996. - Т 80. - С. 128-137.

18. Dykman L.A., Matora L.Yu., Bogatyrev V.A. Use of colloidal gold to obtain antibiotin antibodies // J. Microbiol. Meth. -1996 - V. 24. - P. 247-248.

19. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L A., Melnikov A.G. Spectral extinction of colloidal gold and its biospecific conjugates II J. Colloid Interface Sci. -1996. -V. 180.-P. 436-445.

20. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Melnikov A.G. Spectral properties of colloidal gold and its conjugates with biospecific macromolecules // In: "Biomedical Optoelectronics in Clinical Chemistry and Biotechnology", Proc. SPIE, V. 2629 I Eds. Andersen-Engels S., Corti M., Weber HP., King T.A., Pratesi R„ Seeger S. - Bellingham, Washington- SPIE Press, 1996. - P. 35-45.

21. Дыкман Л.А., Богатырев В.А. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа // Биохимия. - 1997. - Т. 62. - С. 411-418.

22. Дыкман Л.А., Ляхов А.А., Богатырев В.А., Щеголев С.Ю. Синтез коллоидного золота с применением высокомолекулярных органических восстановителей // В сб. научн. тр.: "Новые достижения в органической химии" - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1997. - С. 61.

23. Дыкман Л.А., Ляхов А.А., Богатырев В.А , Щеголев С.Ю. Синтез коллоидного золота с применением высокомолекулярных восстановителей // Коллоидный журнал. -1998. - Т. 60. - С. 757-762.

24.Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Краснов ЯМ., Пискунов В.А, Щеголев С.Ю. Использование коллоидного золота для диагностики острых кишечных инфекций // В сб. научн. тр.: "Химия для медицины и ветеринарии". -Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1998. - С. 54-57.

25 Дыкман Л А, Богатырев В А Применение дот-анализа и иммунозолотых маркеров для экспресс-диагностики острых кишечных инфекций // ЖМЭИ. -

1999. -№ 4. - С. 93-94.

26. Карпунина Л В, Мельникова У.Ю, Богатырев В.А., Методические рекомендации по исследованию взаимодействия лектинов почвенных азотфиксирующих бактерий с фракциями корней растений - Саратов: СГУ,

2000. - 8 с.

27. Dykman L.A., Bogatyrev V.A. Use of the dot-immunogold assay for the rapid diagnosis of acute enteric infections // FEMS Immunol. Med Microbiol. - 2000. -V. 27.-P. 135-137.

28. Sumaroka M.V., Dykman L.A., Bogatyrev V.A, Evseeva N V., Zaitseva I.S., Shchyogolev S.Yu , Volodarsky A.D. Use of the dot-blot immunogold assay to : identify a proliferative antigen in the initial cells of a wheat stem menstem // J. Immunoassay. - 2000. - V. 21. - P. 401-410.

29 Сумарока M.B , Дыкман Л А., Богатырев В А., Зайцева И.С., Соколов О И , Щеголев С Ю., Харрис У Получение, селекция и иммунодетекция антител к гаптенам с использованием конъюгатов коллоидного золота и комбинаторных фаговых библиотек // Аллергология и иммунология. - 2000. -Т. 1. - С 134-135.

30.Khlebtsov N.G., Dykman LA., Bogatyrev V.A., Krasnov Ya.M., Medvedev B.A. Extinction and scattering of light by gold nanoparticle clusters resulting from salt and biospecific aggregation // In: "Light Scattering by Nonspherical Particles. Theory, Measurements, and Applications" / Eds Videen G., Fu Q., Chylek P., -Adelphy: Army Research Lab., 2000. - P. 245-248

31 Чумаков М.И., Дыкман Л А., Богатырев B.A , Курбанова И.В Изучение внеклеточных структур агробактерий, участвующих в контактах с бактериальными и растительными клетками // Микробиология. - 2001. - Т 70 - С. 275-282.

32. Dykman L.A, Krasnov Ya.M , Bogatyrev V.A, Khlebtsov N.G. Quantitative immunoassay method based on extinction spectra of colloidal gold bioconjugates // In. "Optical Technologies in Biophysics and Medicine II", Proc. SPIE, V. 4241 / Ed Tuchin V.V. - Bellingham, Washington SPIE Press, 2001. - P. 37-41.

33. Bogatyrev V.A., Medvedev B.A., Dykman L.A., Khlebtsov N.G. Light scattering spectra of colloidal gold aggregates: experimental measurements and theoretical simulations // Ibid. - P. 42-48.

34. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Krasnov Ya.M., Melnikov A.G. Optical properties of colloidal-gold bioconjugates // Известия ВУЗов Прикладная нелинейная динамика. - 2002. - Т. 10. - С. 172-187.

35. Дыкман Л А., Богатырев В.А., Зайцева И.С , Соколова М.К., Иванов В.В , Соколов О.И. Использование конъюгатов коллоидного золота для идентификации актинов различного происхождения // Биофизика. - 2002 - Т. * 47. - С. 632-640.

36. Богатырев В.А , Дыкман Л А., Краснов Я М , Плотников В К , Хлебцов Н.Г Метод дифференциальной спектроскопии рассеянного света для исследования биоспецифических реакций в системах конъюгатов золотых наночастиц с белками или олигонуклеотидами // Коллоидный журнал -2002. - Т. 64. - С. 745-755.

37 Bogatyrev V А, Dykman L.A., Krasnov Ya.M., Plotnikov V.K , Khlebtsov NG Biospecific assembling of gold nanoparticles with protein or oligonucleotide linkers as studied by light scattering and extinction spectra II In' "Optical

Technologies in Biophysics and Medicine III", Proc SPIE, V 4707 / Ed Tuchin V.V - Bellingham, Washington- SPIE Press, 2002 - P. 266-274.

38 Хпебцов H Г , Дыкман Л A , Богатырев В А , Хлебцов Б Н Двухслойная модель биоконъюгатов коллоидного золота и её применение для оптимизации наносенсоров // Коллоидный журнал - 2003 - Т. 65 - С 552562

39 Хлебцов Н Г , Богатырев В А , Хлебцов Б Н , Дыкман Л A., Englebienne Р Многослойная модель биоконъюгатов золотых наночастиц: исследование адсорбции желатина и иммуноглобулина человека с использованием спектров статического рассеяния и поглощения света и метода динамического светорассеяния // Коллоидный журнал - 2003 - Т 65 - С. 679-693.

40. Дыкман Л А, Богатырев В А, Хлебцов Н.Г., Щеголев СЮ. Применение золотых наночастиц в биотехнологии и медицине // В сб научн. тр.: "Высокие технологии - путь к прогрессу" - Саратов- Изд-во "Научная книга",

2003.-С 53-58.

41. Khlebtsov N.G., Bogatyrev VA., Melnikov A.G., Dykman L.A , Khlebtsov B.N., Krasnov Ya M Static light scattering spectroscopy A new approach to studies of colloidal gold nanosensors // In: Proc 7-th Conference on Electromagnetic and Light Scattering by Nonspherical Particles- Theory, Measurements, and Applications / Ed Wriedt Th. - Bremen. Universität Bremen, 2003 -P 135-138.

42.Khlebtsov N.G , Bogatyrev V.A., Dykman LA, Khlebtsov B.N Adsorption of biopolymers on gold nanoparticles- Experimental study and theoretical modeling //Ibid.-P 139-142.

43. Khlebtsov N G , Bogatyrev V A , Dykman L A , Khlebtsov B.N. Optical models for colloidal gold bioconjugates // Ibid. - P. 152-155.

44. Дыкман Л A , Сумарока M В , Староверов С А , Зайцева И.С , Богатырев В А. Иммуногенные свойства коллоидного золота // Известия АН, Сер. биол. -

2004.-Т. 31.-С. 86-91.

45 Богатырев В.А, Дыкман Л.А., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г. Определение среднего размера и оценка полидисперсности наночастиц золота по спектрам поглощения и рассеяния света // Оптика и спектроскопия. - 2004. -Т. 96.-С 139-147.

46 Khlebtsov N G , Bogatyrev V.A, Melnikov A.G., Dykman L.A., Khlebtsov B.N., Krasnov Ya.M. Differential light-scattering spectroscopy: A new approach to studying of colloidal gold nanosensors // J Quant. Spectrosc. Radiat. Transfer. -2004.-V. 89.-P. 133-142.

47. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Khlebtsov B.N., Alekseyeva A.V., Polyakov A.A., Khlebtsov N.G Gold nanoparticle sizing based on differential static light scattering spectroscopy, absorption spectroscopy, and dynamic light scattering // In: "Coherent Optics of Ordered and Random Media IV", Proc. SPIE, V. 5475 / Ed. Zimnyakov D.A. - Bellingham, Washington: SPIE Press, 2004 - P. 38-47.

48. Khlebtsov N.G., Melnikov A.G., Dykman L.A., Bogatyrev V.A. Optical properties and biomedical applications of nanostructures based on gold and silver bioconjugates // In: "Photopolarimetry in Remote Sensing" / Eds. Videen G., Yatskiv Y, Mishchenko M. - Dordrecht. Kluwer Academic Publishers, 2004. - P. 265-308.

49. Селиванов H Ю , Шкодина О.Г., Галицкая A.A., Богатырев В.А., Игнатов B.B. Проточный ферментолиз пектиновых полисахаридов / Химия и технология растительных веществ. Ill Всероссийская конференция. Тез. докл. Саратов,

изд Саратовской губернской торгово-промышленной палаты 2004, - С 3334.

50. Алексеева А В., Трачук Л.А., Богатырев В А., Хлебцов Н Г. Синтез золотых, серебряных и композитных наностержней и их применение в качестве биосенсоров // В сб «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии», Тез. докл V Всероссийской конф молодых ученых, Саратов, Изд-во Научная книга, 2005, -С.117

51.Dykman LA, Bogatyrev V.A., Khlebtsov B.N., and Khlebtsov N.G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin // Anal Biochem 2005, V. 341. P. 16-21.

52 Alekseeva AV„ Bogatyrev V.A., Trachuk L.A., Khlebtsov NG Synthesis, fractionation and optical characterization of Au-Ag composite nanorods // Proc. SPIE, - 2005 - V. 5772 - P. 18-32.

53.Bogatyrev VA, Vrublevsky S.A., Trachuk L.A., Khlebtsov NG, UV-VIS extinction spectra of gold particles coated by nucleotide shell // Proc SPIE, 2005. - V. 5772 - P 11-17

54. Богатырев В A , Дыкман Jl.A , Хлебцов Б.Н., Плотников В.К , Хлебцов Н.Г. Оптические свойства конъюгатов коллоидного золота с олиготимидином и их изменение при реакции гибридизации с полиадениловой кислотой // Коллоид журн -2005.-Т 67 №4 - С. 413-421

55. Khlebtsov N G , Mel'nikov A G , Bogatyrev V А , Dykman L А , Alekseeva А V , Trachuk L.A , Khlebtsov В N Can the light scattering depolarization ratio of small particles be greater than 1/3*? // J. Phys Chem B. 2005. - V 109 - P 1357813584.

56.Alekseeva AV, Bogatyrev V.A., Dykman LA., Khlebtsov B.N , Trachuk L.A., Melnikov A G , Khlebtsov N G Preparation and optical scattering characterization of au nanorods, and their application to a dot-immunogold assay // Appl Opt. 2005. - V 44, - P. 6285-6295.

57. Богатырев B.A, Дыкман Л.А, Щеголев С Ю. Способ получения биоспецифических маркеров - конъюгатов коллоидного золота // Патент РФ № 2013374 (Бюл изобр № 10 от 30 05.94, приоритет от 26 06 1992)

58 Дыкман Л А., Богатырев В А , Староверов С.А., Семенов С В Адъювант И Патент РФ № 2218937 (Бюл изобр № 35 от 20.12 03, приоритет от 13.12 2001).

Подписано к печати 4 07 05. Гарнитура Arial 9, Формат 60x84 1/16 Объем 2 уел печ. л Тираж 100 экз

Отпечатано в ИБФРМ РАН 410049 Саратов, пр Энтузиастов 13

1 i

i81 8 б fi 5

РНБ Русский фонд

2006-4 16892

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Богатырев, Владимир Александрович

Аббревиатура, тезаурус.

Введение.

Глава 1. Физико-химические свойства металлических гидрозолей.

1.1. Химия золота и его соединений.

1.1.1. Степень окисления I.

1.1.2. Степень окисления II.

1.1.3. Степень окисления III.

1.1.4. Степень окисления V.

1.2. Окислительно-восстановительные потенциалы.

1.3. Хлориды золота.

1.4. Методы синтеза металлических коллоидов.

1.4.1. Восстановление Аи(Ш) органическими восстановителями.

1.4.2. Механизмы формирования однородных металлических наночастиц в гомогенных растворах.

1.4.3. Методы цитратного восстановления.

1.4.3.1. Цитратное восстановление по Френсу.

1.4.3.2. Восстановление в присутствии ВМС.

1.4.4. Зародышевые методы.

1.4.5. Синтез на матрицах.

1.4.5.1. Экспериментальное получение золотых несферических наночастиц.

1.4.6. Микроэмульсионный метод.

1.4.7. Дигестивное созревание.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биоспецифические взаимодействия на металлических наночастицах"

Золото - один из первых открытых человеком металлов, и история его изучения насчитывает как минимум несколько тысяч лет. Начало научного исследования свойств коллоидных благородных металлов традиционно связывают с именем Майкла Фарадея [1] . Тем не менее, растворы коллоидного золота были хорошо знакомы алхимикам (3 - 16 вв. н.э.), и, возможно, удивительные цветовые превращения, сопровождающие конденсацию металлов при восстановлении из растворов солей, приводили к мысли о превращении элементов - трансмутации, а свойства панацеи приписывались коллоидному золоту [2] . Во всяком случае, Филипп Ауреол Теофраст Бомбаст фон Гогенгейм, известный как Парацельс, использовал препараты питьевого (коллоидного) золота, полученного восстановлением спиртовыми настоями целебных трав, как лекарственное средство в своей врачебной практике.

В настоящее время на сайтах интернета [3] можно найти рекламу лекарственного средства от кандидоза кишечника, глистных инвазий, наркомании и алкоголизма, сахарного диабета, гипотиреоза, хронических вирусных и бактериальных инфекций и др., представляющего собой коллоидный раствор золота, серебра и меди.

В последние годы наночастицы коллоидного золота, серебра и их композиты широко используются как эффективные оптические преобразователи биоспецифических взаимодействий. В частности, резонансные оптические свойства нанометровых металлических частиц успешно применяются для разработки так называемых биочипов и биосенсоров. Подобные устройства представляют большой интерес для биологии (определение нуклеиновых кислот, белков и метаболитов), медицины (скрининг лекарственных веществ, выявление антител и антигенов, диагностика инфекций) и химии (экспресс-мониторинг окружающей среды, количественный анализ растворов и .дисперсных систем). Особый интерес представляет обнаружение определенных последовательностей нуклеиновых кислот (генов) и конструирование новых материалов, основанное на образовании трехмерных упорядоченных структур при гибридизации в растворах с комплементарными олигонуклеотидами, ковалентно связанными с металлическими наночастицами [4,5].

Помимо ДНК-ДНК и ДНК-РНК гибридизации, под биоспецифическими взаимодействиями в данной работе будут рассмотрены межмолекулярные взаимодействия типа антиген-антитело, фермент-субстрат, лектин-полисахарид, белок А-иммуноглобулин, авидин-биотин и т.п. В качестве детектирующего агента в данных реакциях используются наноразмерные металлические частицы (метки), главным образом, коллоидного золота (КЗ), входящие в состав маркеров -конъюгатов наночастиц (НЧ) с биоспецифическими макромолекулами - зондами. Кроме классического коллоидного золота со сферическими частицами - наносферами (НСф) - в качестве носителей биомолекул рассматриваются частицы коллоидного серебра (КС) и частицы несферической цилиндрической формы ; - наностержни (НСт), объединенные термином плазмонно-резонансные частицы (ПРЧ).

О протекании реакции судят по изменению оптических свойств системы: поглощения или рассеяния света (статического или динамического). Спектры поглощения и рассеяния света коллоидным золотом в оптическом диапазоне хорошо определяются в рамках теории Ми [6] и зависят от размера и формы частиц, диэлектрических параметров (световой рефракции) их локального и интегрального окружения и расстояний между частицами. Данные динамического светорассеяния (ДСР) дают характеристику размерам частиц и супрамолекулярных комплексов (агрегатов) как функции их броуновского движения.

Таким образом, в данной работе биоспецифические взаимодействия на металлических наночастицах рассматриваются в рамках модели металлического ядра в биополимерной оболочке. В общем случае, взаимодействия между маркерами и мишенями могут приводить к двум принципиально различным сюжетам: образованию агрегатов частиц, имеющих псевдокристаллическую или аморфную структуру или изменению параметров полимерного слоя (плотности, толщины, коэффициента преломления или экстинкции). К сожалению, зачастую такие структурные перестройки в системе могут приводить к сходным изменениям ее оптических характеристик. Тем не менее, сопоставление данных каждого из рассматриваемых оптических методов: спектрофотометрии, спектронефелометрии и динамического светорассеяния - позволяет охарактеризовать структуру образующихся комплексов и динамику их формирования. Это, в свою очередь, в сопоставлении с данными независимых физико-химических методов исследования (твердофазного анализа, световой и электронной микроскопии) позволяет судить о характере межмолекулярных биоспецифических взаимодействий.

Детектирование биоспецифических взаимодействий, основанное на изменении оптических свойств системы наночастиц-носителей, можно отнести к области сравнительно новой отрасли науки - биосенсорике. Причем биосенсором является сама система либо частица-маркер (элементарный сенсор). Коллоидное золото в ряду оптических биосенсоров занимает особое место, поскольку может выступать и в роли метки в наносенсорном устройстве, и как инструмент в молекулярно-биологических исследованиях, используемый in vitro, in situ и in vivo.

Большинство из рассматриваемых в данной работе вопросов можно также отнести к области сравнительно новой и бурно развивающейся науки нанотехнологии, точнее, биохимии и биофизике наноразмерных структур. То, что классические объекты коллоидной химии выделяют в отдельную область наноразмерных структур, аргументировано представлено в недавних обзорах В.И. Ролдугина [7] и М. Кортье [8]. Основным принципиальным отличием нанотехнологического описания высокодисперсных систем является определение свойств отдельных наноструктурных объектов и манипулирование отдельными наночастицами. В молекулярной биологии это означает создание устройств, позволяющих распознавать отдельные молекулы. По образному выражению Кортье: «Если кремний - "камень" наномира, а ДНК - бумага, на которой записана информация, то, быть может, золото - это те "ножницы", тот инструмент, который заставляет все это работать вместе».

Актуальность

Диссертационная работа затрагивает вопросы нанотехнологии, признанной приоритетным направлением развития мировой и отечественной науки. Современные методы биоаналитической химии развиваются в сторону миниатюризации и сверхминиатюризации устройств, автоматизации процессов регистрации и алгоритмизации обработки экспериментальных данных. В этом контексте нанонаука представляет собой принципиально новую ступень. Замена только метки с флюоресцентной на коллоидно-металлическую, серебряную или золотую позволяет во много раз (до 500000) увеличить чувствительность диагностических систем [9]. При этом возможно использование коммерчески доступных иммуно- и генодиагностических наборов реактивов и стандартного лабораторного оборудования. В ряде случаев детектирование сигнала от одной частицы, в частности, спектрального сдвига резонансного светорассеяния, позволяет определить такие важные характеристики молекулярного специфического взаимодействия, как концентрации молекул и константы аффинности [10].

Работа посвящена разработке новых методов исследования структуры различных компонентов живых организмов: поверхностных структур бактериальных клеток, белков системы цитоскелета, полинуклеиновых кислот системы посттранскрипционной регуляции генома с использованием биоспецифических взаимодействий, регистрируемых посредством металлических наночастиц с плазмонным резонансом. В область исследований входило также изучение строения, свойств и функционирования молекул и надмолекулярных структур, образующих биоспецифические комплексы (антиген-антитело, лектин-полисахарид, фермент-субстрат, авидин-биотин и др.) на частицах коллоидных металлов.

Целью диссертационной работы было теоретическое и экспериментальное развитие методологии синтеза, биоспецифической функционализации и применения золотых наночастиц с плазмонным резонансом, преобразующих молекулярное взаимодействие «зонд-мишень» в регистрируемый оптический сигнал.

Направление исследований заключалось в разработке новых и усовершенствовании известных аналитико-биохимических методик, позволяющих максимально использовать общедоступное лабораторное оборудование без применения высокотехнологических процедур для определения физиологически активных веществ на уровне единичных межмолекулярных взаимодействий. Ход работы заключался в решении следующих конкретных задач:

1. Оптимизация технологии получения золотых наносфер и наностержней с заданными геометрическими параметрами методами одностадийной и многостадийной (зародышевый метод) реакции.

2. Развитие и практическая реализация нековалентной функционализации золотых наночастиц биомакромолекулами (белками, лектинами, полисахаридами).

3. Разработка методологии контроля морфометрических параметров наночастиц и биомаркеров на основе комбинированного использования спектроскопии поглощения, дифференциальной спектроскопии статического рассеяния света, динамического светорассеяния, седиментационного и электронно-микроскопического анализа

4. Теоретическое и экспериментальное исследование зависимости спектров поглощения и дифференциального статического рассеяния света металлическими частицами в условиях изменения общего и локального диэлектрического окружения.

5. Развитие технологии синтеза и оптического контроля геометрических и молекулярных (количество молекул-зондов) параметров ДНК-маркеров, получаемых ковалентной пришивкой олигонуклеотидов к поверхности золотых наночастиц. Исследование спектров поглощения и дифференциального рассеяния света при гибридизации ДНК-маркеров с комплементарными полинуклеотидами.

6. Развитие методологии твердофазного анализа (дот-болт тест) растворимых и корпускулярных (целых бактериальных клеток и их фрагментов) антигенов (мишеней).

7. Развитие метода визуализации биомаркеров методом световой микроскопии темного поля.

Положения, выносимые на защиту

1. Применение комбинированного восстановителя

ЭДТА+борогидрид натрия) позволяет получать золи золота с узким распределением по размерам в диапазоне средних диаметров частиц З-б нм. Положение максимума экстинкции определяет средний размер частиц с точностью около 2 нм в диапазоне от 15 до 90 нм. Применение центрифугирования в градиенте концентрации глицерина позволяет получить фракцию золотых наностержней с минимальным количеством наносфер.

2. Разработка технологии нековалентной функционализации золотых наночастиц биомакромолекулами адсорбционным способом, включающая оптимизацию буфера, контроль минимального защитного количества биополимера и оптимизацию конечного продукта.

3. Метод дифференциальной спектроскопии статического рассеяния света является чувствительным тестом для определения среднего размера частиц, а также для оценки полидисперсности частиц и параметров их формы.

4. При формировании адсорбированного полимерного слоя на поверхности золотых наночастиц пик плазмонных резонансов экстинкции и дифференциального рассеяния смещается в красную область на 2-4 нм, а сами резонансы увеличиваются не более чем на 15-20%. Большее красное смещение пиков или изменение характера спектров указывают на агрегацию частиц.

5. Развитая технология синтеза позволяет получать маркеры с количеством однонитевых олиготимидинов Т28 примерно 150 шт. на одну золотую частицу с диаметром 15 нм. Ковалентная функционализация золотых наночастиц олигонуклеотидами приводит к неаддитивному сложению поглощения биополимера и золотого ядра в области 260 нм. Использование нитрата серебра в технологии синтеза приводит к нетипичному увеличению пика плазмонного резонанса до 4 0%.

6. Биоспецифическое окрашивание молекул, бактериальных клеток или их фрагментов, нанесенных на нитроцеллюлозную мембрану, является эффективным способом быстрой качественной идентификации биологической «мишени» с помощью конъюгатов золотых наночастиц с молекулами-зондами.

7. Микроскопия темного поля позволяет эффективно различать частицы разного размера и формы в статическом и динамическом режимах анализа.

Научная новизна

1. На основании предложенной концепции совместного действия полидентатного лиганда и активного восстановителя разработан оригинальный метод синтеза ультрадисперсных золей золота с диаметром частиц 3-6 нм, защищенный патентом РФ. Метод синтеза золотых наностержней на «мягких» матрицах ЦТАБ оптимизирован введением оригинального этапа центрифугирования в градиенте концентрации глицерина и применением спектроскопии рассеяния для характеристики фракций препарата.

2. В рамках единого подхода разработана эффективная технология нековалентной функционализации золотых наносфер и наностержней, позволяющая получать коллоидно-золотые маркеры для широкого класса биополимерных зондов (белки, лектины, полисахариды).

3. Разработан новый метод дифференциальной спектроскопии статического рассеяния для характеристики дисперсных частиц с плазмонно-резонансным поглощением и рассеянием. Экспериментально метод реализован в виде приставки к серийному спектрофотометру «Спекорд М-40». Впервые показано, что дифференциальные спектры рассеяния обладают большей чувствительностью к полидисперсности и форме золотых наночастиц.

4. Показано, что золотые наночастицы, функционализированные олиготимидиновым зондом, не способны к агрегации при взаимодействии с комплементарными полинуклеотидами поли(А) в обычных гибридизационных условиях. Установлено, что агрегация, инициируемая замораживанием/оттаиванием подобных систем, является биоспецифической. Предложена модель агрегации, отличная от модели перекрестных сшивок Миркина и соавт.

5. Впервые показано, что продольный плазмонный резонанс золотых наностержней обладает большей чувствительностью к диэлектрическому окружению, по сравнению с золотыми наносферами, что может быть использовано для создания нового типа биосенсоров.

6. Разработан новый способ идентификации бактерий с помощью окрашивания биоспецифическими маркерами образца, иммобилизованного на нитроцеллюлозной мембране.

7. Впервые показана возможность определения белка по изменению спектров поглощения и рассеяния, обусловленному неспецифической агрегацией частиц. Предложен новый вариант определения некоторых белков с использованием конъюгатов золотых наночастиц с протеазами.

8. Резонансное рассеяние света в микроскопии темного поля впервые применено для сравнительного анализа трансляционной диффузии сферических частиц (90 нм) и вращательной диффузии золотых наностержней (толщина порядка 15 нм, длина около 4 0 нм).

Научная и практическая значимость

Разработанные методы синтеза металлических гидрозолей с частицами заданных размеров и формы и их функционализации с применением широкого спектра белковых и нуклеотидных зондов могут быть использованы для создания разнообразных биохимических и молекулярно-генетических диагностических и биосенсорных систем нового поколения.

Результаты работы были представлены на Международной выставке "Достижения Российской биотехнологии" (Германия, 1996 г.), 3-м Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Россия, ВВЦ, 2003 г.), ряде российских и региональных выставок.

Представленные в диссертации разработки используются в учебном процессе в Саратовском госуниверситете, Саратовском аграрном университете, включены в методическое пособие (Карпунина JI.B., Мельникова У.Ю., Богатырев В.А., Методические рекомендации по исследованию взаимодействия лектинов почвенных азотфиксирующих бактерий с фракциями корней растений. - Саратов: СГУ, 2000. - 8 е.). Кроме того, материалы диссертационной работы включены в программы спецпрактикумов и спецсеминаров "Физико-химические методы исследования" и "Биофизические методы исследования", руководимые автором на ФНП СГУ.

Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур (ЛФХКС) и Лаборатории биосенсоров на основе наноразмерных структур (ЛБНС) ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: "Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений", научный руководитель темы д.х.н., профессор С.Ю. Щеголев, № гос. регистрации 01890017743; "Развитие методов светорассеяния и электрооптики применительно к анализу природных и синтетических дисперсных систем", научный руководитель темы д.ф.-м.н., профессор Н.Г. Хлебцов, № гос. регистрации 01912022281.

Частично данная работа получила финансовую поддержку Министерства науки и технической политики РФ (распоряжение № 1508ф), Российского фонда фундаментальных исследований (№№ проектов 94-03-09286, 96-03-32504, 98-03-32664, 01-03-33130, 01-04-48736, 04-04-48224), Международного научного фонда (фонда Сороса) (№ RNR300), фонда INCAS-S (№ 99-4-04), фонда CRDF (№ REC-006), NATO Collaborative Linkage Grant (LST.CLG 975040), NATO Expert Visit Grant (LST.EV.979788). Реализация результатов отражена в ежегодных и заключительных отчетах ИБФРМ РАН.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Богатырев, Владимир Александрович

Выводы работы можно сформулировать следующим образом:

1. Разработан оригинальный метод синтеза ультрадисперсных золей золота с диаметром частиц 3 - б нм, защищенный патентом РФ, и модифицированный метод синтеза золотых наностержней на «мягких» матрицах ЦТАБ.

2. Разработана эффективная технология функционализации золотых наносфер и наностержней, основанная на использовании неспецифических (адсорбционных) взаимодействий молекулярного зонда и золотой наночастицы. Каталог маркеров (138 наименований) , созданных по разработанной технологии, включает различные биополимерные зонды (белки, лектины, полисахариды).

3. Разработан новый метод дифференциальной спектроскопии статического рассеяния для оптического мониторинга различных стадий синтеза биомаркеров на основе металлических наночастиц частиц с плазмонно-резонансным поглощением и рассеянием. Показано, что метод позволяет также идентифицировать тип биоспецифического взаимодействия маркера с мишенью на начальных стадиях процесса (биоспецифическая адсорбция или агрегация).

4 . Показано, что неспецифическая адсорбция глобулярных белков на золотых наночастицах приводит к образованию биополимерного слоя порядка 4-6 нм и сопровождается красным смещением плазмонных пиков экстинкции и рассеяния на 2-4 нм и их увеличением на 15-20%.

5. Синтезирован маркер, представляющий собой 15-нм золотую наночастицу с ковалентно пришитыми тиол-модифицированными олиготимидинами длиной 28 Т-оснований (около 150 зондов на частицу). Показано, что эти маркеры не способны к агрегации при взаимодействии с комплементарными полинуклеотидами поли(А) в обычных гибридизационных условиях. Установлено, что агрегация, инициируемая замораживанием/оттаиванием подобных систем, является биоспецифической. Предложена модель агрегации, отличная от модели перекрестных сшивок Миркина и соавт.

6. Синтезированы золотые наностержни с продольным плазмонным резонансом в области 650-900 нм (осевое отношение от 2 до 4). Показано, что эти частицы представляют собой перспективную платформу для создания нового типа биосенсоров, поскольку их резонанс легко настраивается в нужную область и обладает большей чувствительностью к изменению локального диэлектрического окружения.

7. Разработан твердофазный способ идентификации бактерий, основанный на биоспецифическом окрашивании капли образца, иммобилизованного на нитроцеоллюлозной мембране, коллоидно-золотыми маркерами. Показано, что оптимальный размер наночастиц для этого метода составляет около 30 нм.

8. Показана возможность определения белка по изменению спектров поглощения ' и рассеяния в случае неспецифической агрегации частиц. Предложен новый вариант определения некоторых белков с помощью конъюгатов золотых наночастиц с трипсином, реализованный на стандартном спектрофотометре и на планшетном ИФА-ридере.

9. Методом резонансного рассеяния в темном поле микроскопа показаны различия в динамическом изменении рассеянной интенсивности для золотых наносфер (90 нм) и наностержней (15x40 нм).

Заключение

На основании анализа обширного литературного материала и результатов собственных теоретических и экспериментальных исследований по управляемому синтезу металлических наночастиц различных размеров (в диапазоне 3 - 100 нм) и форм (сферических и стержневых), функционализации их биоспецифическими макромолекулами (иммуноглобулинами, лектинами, ферментами, пептидами, олигонуклеотидами и др.) и изучению оптических свойств ПРЧ-маркеров в процессе взаимодействия с молекулами-мишенями методами спектроскопии поглощения и рассеяния, динамического светорассеяния, электронной и световой микроскопии можно сформулировать общий вывод: металлические наночастицы с плазмонным резонансом являются эффективным преобразователем молекулярных взаимодействий в оптически регистрируемый сигнал. Учитывая соизмеримые размеры меток и зондов, а также незначительное влияние наночастиц благородных металлов на биохимическую активность адсорбированных макромолекул, можно заключить, что ПРЧ-маркеры весьма перспективны в создании наносенсорных устройств и диагностических систем, позволяющих изучать биохимические процессы на уровнях вплоть до субклеточного и молекулярного, в том числе, в реальном времени.

В данной работе предложена новая модель биоконъюгатов металлических наночастиц, которая позволяет естественным образом моделировать формирование первичной полимерной оболочки при синтезе конъюгатов и образование вторичной оболочки при взаимодействии с молекулами-мишенями. Разработанная программа позволяет вычислять спектры экстинкции и углового рассеяния, моделируя степень неоднородности адсорбированного слоя с любой степенью детализации в терминах совокупности тонких слоев с постоянными показателями преломления. Мы показали, что основные спектральные изменения происходят при формировании первичной 5-нм оболочки, в то время как последующее присоединение молекул-мишеней приводит лишь к малым изменениям спектров экстинкции и рассеяния. В этой связи особый интерес представляет предложенный нами метод ДССР, поскольку при прочих равных условиях изменения в спектрах рассеяния более чувствительны к адсорбции вторичного слоя, чем спектры экстинкции. Исследуя чувствительность наносенсоров к присоединению молекул-мишеней, мы рассчитали зависимость изменений плазмонных резонансов рассеяния и экстинкции до и после формирования вторичного слоя (ДЛ21,Д/21) и обнаружили два оптимальных размера: 4 0 нм для экстинкции и около 80 нм для рассеяния. Этот результат может иметь принципиальное значение для оптимизации свойств планарных биосенсоров.

В соответствии с Госзаказом, полученным от Министерства науки и технической политики Российской Федерации на выполнение работ по Научно-техническому проекту "Разработка технологии получения и методик использования биоспецифических маркеров - конъюгатов коллоидного золота" (Распоряжения по Миннауки РФ Ыо.1508ф от 11.05.93г. и последующие, научный руководитель зав. лаб. ИБФРМ РАН д.х.н. Щеголев С.Ю., срок действия с 01.01.93 г. по 31.12.94 г.), нами был разработан Лабораторный технологический регламент для производсва данных биомаркеров в широкой номенклатуре. Каталог предлагаемых препаратов включает набор золей золота (даметр частиц 2-4 0 нм) и большой набор иммуноглобулиновых, лектиновых, ферментных и иных зондов, меченых КЗ с диаметром частиц в диапазоне 5-20 нм (всего 138 наименований) [494]. Эти препараты предназначены к использованию и (согласно выполняемым заявкам) пользуются спросом в различных областях биохимии, микробиологии, медицины, ветеринарии и сельского хозяйства для аналитического определения разнообразных биологически активных веществ. В частности, для диагностики заболеваний человека и животных, включая диагностику вирусов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Богатырев, Владимир Александрович, Саратов

1. Faraday М. Experimental relations of gold (and others metals) to light // Phil. Trans. Royal. Soc. (Lond.). 1857. V. 147. P. 145-181.

2. Жак Саду. Алхимики и золото. -Киев: София. 1995. 320 с.3 URL: www.ortho.ru.

3. Mirkin С.A., Letsinger R.L., Mucic R.C., Storhoff J.J. A DNA-based method for rationally assambling nanoparticles into macroscopic materials // Nature. 1996. V. 382. P. 607609.

4. Alivisatos A.P., Johnsson K.P., Peng X., Wislon Т.Е., Loweth C.J., Bruchez M.P., Jr., Schultz P.G. Organization of Nanocrystal Molecules Using DNA // Nature. 1996. V. 382. P. 609-611.

5. Mie G. Beiträge zur Optik Trüber Medien, Speziell

6. Kolloidaler Metallösungen // Ann. Phys. 1908. V 25. P. 377-445.

7. Ролдугин В.И. Квантоворазмерные металлические коллоидные системы // Успехи химии. 2000. Т. 69, С. 899-923.

8. Cortie М. The Weird World of Nanoscale Gold // Gold Bulletin. 2004. V. 37. P. 12-19.

9. Yguerabide J., Yguerabide E. Resonance Light Scattering Particles as Ultrasensitive Labels for Detection of Analytes in a Wide Range of Applications //J. Cell. Biochem. Suppl. 2001. V. 37. P. 71-81.

10. Raschke G., Kowarik S., Franzi Т., Sonnichsen С., Klar Т.A., Feldmann J., Nichtl A., Kurzinger К. Biomolecular Recognition Based on Single Gold Nanoparticle Light Scattering // Nano Lött. 2003. V. 3. P. 935-938.

11. Акципетров O.A. Гигантские нелинейно-оптические явления на поверхности металлов // СОЖ 2001. Т. 7. № 7. С. 109-116.

12. Pal Т. Nucleophile-induced dissolution of gold and silver in micelle // Res. Comm. Current Sei. 2002. V. 83. P. 627628 .

13. Паддефет P. Химия золота. Пер. с англ. -М.: Мир. 1982. 264 с.

14. Paddephatt R.J. The Chemistry of Gold / -Amsterdam: Elsevier. 1978.

15. Бусев А.И., Иванов B.M. Аналитическая химия золота. —М.: Наука. 1973. 263 с.

16. Гринберг A.A. Введение в химию комплексных соединений. -М. -JT. : Химия. 1966.

17. Rich R.L., Taube Н., The Uncatalyzed Exchange of Cl~ and AuCl4" // J. Phys. Chem. 1954. V. 58. P. 1-5.

18. Goia D,. Matijevic E. Tailoring the particle size of monodispersed colloidal gold // Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 1999. V. 146. P. 139-152.

19. Zsigmondy R. Ueber wassrige Losungen metallischen Goldes // Ann. Chem. 1898. Bd. 301. S. 29-54.

20. Сведберг Т. Образование коллоидов. -JT.: Науч. хим.-техн. изд-во. 1927. 111 с.2 0 Кройт Г.Р. Наука о коллоидах. Т. 1. Необратимые системы. -М.: Изд-во иностранной литературы. 1955. 540 с.

21. Heller W., Pugh T.L. "Steric" stabilization of colloidal solutions by adsorbtion of flexible macromolecules // J. Polimer Sei. 1960. V. 48. P. 203-217.

22. Fabrikanos A., Athanassiou S., Lieser K.H. Darstellung stabiler Hydrosole von Gold und Silber durch Reduktion mit Athylendiamintetraessigsaure // Z. Naturforschg. 1963. Bd. 18. S. 612-617.

23. Frens G. Controlled nucleation for the particle size in monodisperse gold suspensions // Nature Phys. Sei. 1973. V. 241. P. 20-22.

24. Ершов Б.Г. Наночастицы металлов в водных растворах: электронные, оптические и каталитические свойства // Рос. хим. ж. 2001. Т. 45. №3. С. 20-30.

25. Brown K.R., Natan M.J. Hydroxylamine Seeding of Colloidal Au Nanoparticles in Solution and on Surfaces // Langmuir. 1998. V. 14. P. 726-728.

26. Brown K.R., Walter D.G., Natan M.J. Seeding of Colloidal Au Nanoparticle Solutions. 2. Improved Control of Particle Size and Shape // Chem. Mater. 2000. V. 12 P. 306-313.

27. Goia D. Preparation and formation mechanisms of uniform metallic particles in homogeneous solutions //J. Mater. Chem. 2004. V. 14. P. 451-458.

28. Henglein A., Physicochemical Properties of Small Metal Particles and the Atom-to-Metal Transition // J. Phys. Chem. 1993. V. 97. P. 5457-5471.

29. Belloni J. Metal Nanocolloids // Curr. Opin. Colloid1.terface Sci. 1996. V. 1. P. 184-196.

30. Gachard E., Remita H., Khatouri J., Keita В., Nadjo L., Belloni J., Radiation-Induced and Chemical Formation of Gold Clusters // N. J. Chem. 1998. P. 1257-1265.

31. Remita S., Archirel P., Mostafavi M. Evaluation of theredox potential of Ag-l(I)(CN)(2)-/Ag-l(0)(CN)(2)(2-) in aqueous solution // J. Phys. Chem. 1995. V. 99. P. 1319813202.

32. Texier I., Remita S., Archirel P., Mostafavi M., Reductionof AgIi(NH3)2+ to Ag0;. (NH3)2 in solution redox potential and spectral study // J. Phys. Chem. 1996. V. 100. P. 12472-12476.

33. Mallick K., Wang Z.L., Pal T. Seed-mediated successivegrowth of gold particles accomplished by UV irradiation: a photochemical approach for size-controlled synthesis // Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 2001. V. 140. P. 75-80.

34. Belloni J., Mostafavi M., Remita H., Margnier J.-L., Delcourt M.-O. Radiation-induced synthesis of mono- and multi-metallic clusters and nanocolloids //N. J. Chem. 1998. P. 1239-1255.

35. La Mer V., Dinegar R., Theory, production and mechanism offormation of monodispersed hydrosols // J. Am. Chem. Soc.1950. V. 72. P. 4847-4854.

36. Chow M.K., Zukoski C.F. Gold sols formation mechanisms: Role of colloidal stability // J. Coll. and Interf. Sci. 1994. V. 165. P. 97-109.

37. Van Hyning D.L., Zukoski C.F. Dynamic Wetting and

38. Dewetting of a Low-Energy Surface by Pure Liquids // Langmuir. 1998. V. 14. P. 7043-7047.

39. Overbeek J.Th. Monodisperse colloidal systems, fascinating and useful // Adv. Colloid Interface Sci. 1982. V. 15. P. 251-277.

40. Verwey E.J.W., Overbeek J.Th.G., Theory of the stability of lyophopic colloids. Elsevier. New York. 1948.

41. Park J., Privman V.,-' Matijevic E. Model of Formation of Monodispersed Colloids // J. Phys. Chem. B. 2001. V. 105. P. 11630-11635.

42. Murillo L.E., Viera O., Vicuña E., Briano J.G., Castro M., Ishikawa Y., Irizarry R., Solá L. Growth Kinetics of Gold Nanopartides // Nanotech 2002. V. 2. P. 435-438.

43. Turkevich J., Stevenson P.C., Hillier J. A Study of the Nucleation and Growth Process in the Synthesis of Colloidal Gold // Discussion of the Faraday Society.1951. V. 11. P. 55-75.

44. Saraiva S.M., de Oliveira J.F. Control of Particle Size in the Preparation of Colloidal Gold // J. Dispertion Sci. and Tchnol. 2002. V. 23. P. 837-844.

45. Paciotti G., Myer L., Weinreich D., Goia D., Pavel N., McLaughlin R., Tamarkin L. Colloidal Gold: A Novel Nanoparticle Vector for Tumor Directed Drug Delivery // Drug Delivery. 2004. V. 11. P. 169-183.

46. De Mey J., Moeremans M. The preparation of colloidal gold probes and their use as marker in electron microscopy // In: Advansed techniques in biological electron microscopy / Ed. Koehler J. K. -Berlin: Springer-Verlag. 1986. V. 3. P. 229-271.

47. Grabar K.C., Freeman R.G., Hommer M.B., Natan M.J. Preparation and Characterization of Au Colloid Monolayers // Anal. Chem. 1995. V. 67. P. 735-743.

48. Turkevich J. Colloidal Gold. Part I. Historical and

49. Preparative Aspects. Morphology and Structure // Gold Bull. 1985. V. 18(3). P. 86-91.

50. Dimensional Architectures with DNA and Nanoscale Inorganic Building Blocks // Inorg. Chem. 2000. V. 39. P. 2258-2272.

51. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман Jl.А., Мельников А.Г.

52. Оптические свойства коллоидного золота и его конъюгатов с биоспецифическими макромолекулами // Коллоид, журн. 1995. Т. 57. № 3. С. 412-423 (попр. 1996. Т. 58. № 1. С. 144).

53. Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г. Определение среднего размера и оценка полидисперсности наночастиц золота по спектрам поглощения и рассеяния света // Оптика и спектроскопия. 2004. Т. 94. № 1. С. 139-147.

54. Nakamura К., Kawabata Т., Mori Ya. Size distribution analysis of colloidal gold by small angle X-ray scattering and light absorbance // Powder Technology. 2003. V. 131.1. P. 120- 128.

55. Shulepov S.Yu., Frens G. Surface roughness and particle size effect on the rate of perikinetic coagulation: experimental // J. colloid and interface sci. 1996. V. 182 P. 388-394.

56. McFarland A.D., Haynes C.L., Mirkin C.A., Van Duyne R.P.,

57. Godwin H.A. Color My Nanoworld // Journal of Chemical Education. 2004. V. 81. P. 544 А,В.

58. Weiser H.B. Inorganic Colloid Chemistry. -N.Y.: Wiley,1933. P. 21-57.

59. Zhou Y., Itoh H., Uemura Т., Naka K., Chujo Y. // Preparation of p-conjugated polymer-protected gold nanoparticles in stable colloidal form. // Chem. Commun. 2001. P. 613-614.

60. Синтез коллоидного золота с применением высокомолекулярных восстановителей // Коллоидный журнал. 1998. Т. 60. No 6. С. 757-762.

61. Tan Y., Dai X., Li Y., Zhua D. Preparation of gold, platinum, palladium and silver nanoparticles by the reduction of their salts with a weak reductant-potassium bitartrate // J. Mater. Chem. 2003. V. 13. P. 1069-1075.

62. Esumi К., Takei N., Yoshimura T. Antioxidant-potentiality of gold chitosan nanocomposites // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2003. V. 32 P. 117-123.

63. Otsuka H., Akiyama Y., Nagasaki Yu., Kataoka K. Quantitative and Reversible Lectin-Induced Association of Gold Nanoparticles Modified with a-Lactosyl-iy-mercapto-poly(ethyleneglycol) // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 8226-8230

64. Жигмонди P. Коллоидная химия. -Харьков, Киев: Изд-во НКСнаба УССР. 1933. 452 с.

65. Jana N. R., Gearheart L., Murphy C.J. Seeding growth for size control of 5-40 nm diameter gold nanoparticles // Langmuir. 2001. V. 17. P. 6782 -6786.

66. Jana N. R. , Gearheart L., Murphy C. J. Evidence for seed-mediated nucleation in the chemical reduction of gold salts to gold nanoparticles // Chem. Mater. 2001. V. 13. P. 2313-2322.

67. Sau Т., Pal A., Jana N.R., Wang Z.L. Pal T. Size controlled synthesis of gold nanoparticles using photochemically prepared seed particles // Journal of Nanoparticle Research. 2001. V. 3 P. 257-261.

68. Schmid G., 1992. Clusters and colloids metals in the embryonic state. Chem. Rev. 92, 1709-1727.

69. Daniel M. Astruc D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and

70. Nanotechnology // Chem. Rev. 2004. V. 104. P. 293-346.

71. Chen W., Cai W., Zhang L., Wang G., Zhang L. Sonochemical Processes and Formation of Gold Nanoparticles within Pores of Mesoporous Silica // J. 2001. Coll. and Interface Sci. V. 238. P. 291-295.

72. Zhivkov A., van der Zande B.M.I., Stoylov S. Electro-optics of metal particles: electric birefringence of gold rods // Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 2002. V. 209. P. 299-303.

73. Русанов И. А. Мицеллообразование в растворах поверхностно-активных веществ. -С.-Пб.: Химия. 1990.

74. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. Пер. с англ. -М.: Мир. 1991.

75. Jana N., Gearheart L., Murphy С. Wet Chemical Synthesis of High Aspect Ratio Cylindrical Gold Nanorods // J. Phys. Chem. B. 2001. V. 105. P. 4065-4067.

76. Патент РФ No2013374, МКИ С 01 G 7/00, В 01 J 13/00. Способ получения биоспецифических маркеров конъюгатов коллоидного золота / Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Щеголев С.Ю. (Россия). 6 с. (БИ No 10. 30.05.94).

77. Kang S.K., Chah S., Yun С.Ye. Yi J. Aspect Ratio Controlled Synthesis of Gold Nanorods // Korean J. Chem. Eng. 2003. V. 20(6). P. 1145-1148.

78. Nikoobakht В., El-Sayed M.A. Preparation and Growth Mechanism of Gold Nanorods (NRs) Using Seed-Mediated Growth Method // Chem. Mater. 2003. V. 15(10). P. 19571962.

79. Jana N.R., Gearheart L., Obare S. O., Murphy C.J. Anisotropic Chemical Reactivity of Gold Spheroids and Nanorods // Langmuir 2002. V. 18. P. 922-927.

80. Sawaguchi Т., Yamada Т., Okinaka Y., Itaya K. Electrochemical scanning tunneling microscopy and ultrahigh-vacuum investigation of gold cyanide adlayers on Au(III) formed in aqueous solution // J. Phys.Chem. 1995. V. 99. P. 14149-14155.

81. Jeffrey M.I., Ritchie I.M. The leaching of gold in cyanide solutions in the presence of impurities II. The effect of silver // J. Electrochem. Soc. 2000. V. 147. P. 3272-3276.

82. Jeffrey M.I., Ritchie I.M. The leaching and electrochemistry of-gold in high purity cyanide solutions // J. Electrochem. Soc. 2001. V. 148, P. D29-D36

83. Deschenes G., Lastra R., Brown J.R., Jin S., May O., Ghali E. Effect of Lead Nitrate on Cyanidation of Gold Ores: Progress on the Study of the Mechanisms // Miner. Eng. 2000. V. 13. P. 1263-1279.

84. Tshilombo A.F., Sandenbergh R.F. An electrochemical study of the effect of lead and sulphide ions on the dissolution rate of gold in alkaline cyanide solutions // Hydrometallurgy. 2001. V. 60. P. 55-67.

85. Linnert T., Mulvaney P., Henglein A. Surface chemistry of colloidal silver: surface plasmon damping by chemisorbed iodide, hydrosulfide (SH-), and phenylthiolate // J. Phys. Chem. 1993. V. 97. P. 679-682.

86. Pal T., Sau T.K., Jana N.R. Reversible formation and dissolution of silver nanoparticles in aqueous surfactant media // Langmuir. 1997. V. 13. P. 1481-1485.

87. Alekseeva A.V., Bogatyrev V.A., Trachuk L.A., Khlebtsov N.G. Synthesis, fractionation and optical characterization of Au-Ag composite nanorods // Proc. SPIE. 2005. V. 5772. P. 18-32.

88. Link S., El-Sayed M.A. Optical properties and ultrafast dynamics of metallic nanocrystals // Ann. Rev. Phys. Chem. 2003. V. 54.P. 331-346.

89. Kim F., Song J.H., Yang P. Photochemical synthesis of gold nanorods // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 1431614317.

90. Hsieh S., Meitzer S., Wang C.R.C., Requicha A.A.G., Thompson M.E., Koel B.E. Imaging and manipulation of gold nanorods with an atomic force microscope // J. Phys. Chem. B. 2002. V. 106. P.'231-234.

91. Chen F., Xu G.Q., Hor T.S.A. Preparation and assembly of colloidal gold nanoparticles in CTAB-stabilized reverse microemulsion // Materials Lett. 2003. v. 4325. P. 1-5.

92. Obare S.O., Jana N.R., Murphy C.J. Preparation of polystyrene- and silica-coated gold nanorods and their use as templates for the synthesis of hollow nanotubes // Nano Letters. 2001. V. 1. P. 601-603.

93. Jana N.R., Gearheart L., Murphy C.J., Seed-mediated growth approach for shape-controlled synthesis of spheroidal and rodlike gold nanoparticles using a surfactant template // Adv. Mater. 2001. V. 13. P. 13891393.

94. Giersig M., Mulvaney P. Preparation of ordered colloid monolayers by electrophoretic deposition // Langmuir. 1993. V. 9. P. 3408-3413.

95. Brust M., Walker M., BethellD., SchiffrinD.J., Whyman R.J. Synthesis of Thiol-Derivatized Gold Nanoparticles in a Twophase Liquid-Liquid System // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1994. P. 801-802.

96. Brust M., Fink J., Bethell D., Schiffrin D.J., Kiely C.J. Synthesis and Reactions of Functionalised Gold Nanoparticles // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1995. P. 1655-1656.

97. Chen S. 4-Hydroxythiophenol-Protected Gold Nanoclusters in Aqueous Media // Langmuir 1999. V. 15. P. 7551-7557.

98. Chen S., Murray R.W. Arenethiolate Monolayer-Protected Gold Clusters // Langmuir. 1999. V. 15. P. 682-689.

99. Hostetler M.J., Green S.J., Stokes J.J., Murray R.W. Monolayers in Three Dimensions: Synthesis and Electrochemistry of ¿y-Functionalized Alkanethiolate-Stabilized Gold Cluster Compounds // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 4212-4213.

100. Ingram R.S., Hostetier M.J., Murray R.W. Poly-hetero-£y-functionalized Alkanethiolate-Stabilized Gold Cluster Compounds // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 9175-9178.

101. Templeton A.C., Wuelfing W.P., Murray R.W. Monolayer-Protected Cluster Molecules // Acc. Chem. Res. 2000. V. 33. P. 27-36.

102. Templeton A.C., Hostetier M.J., Kraft C.T., Murray R.W. Reactivity of Monolayer-Protected Gold Cluster Molecules: Steric Effects // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 19061911.

103. Hostetier M.J., Templeton A.C., Murray R.W. Dynamics of Place-Exchange Reactions on Monolayer-Protected Gold Cluster Molecules // Langmuir. 1999. V. 15. P. 3782-3789.

104. Porter L.A., Jr., Ji D., Westcott S.L., Graupe M., Czernuszewicz R.S., Halas N.J., Lee T.R. Gold and Silver Nanoparticles Functionalized by the Adsorption of Dialkyl Disulfides // Langmuir. 1998. V. 14. P. 7378-7386.

105. Suzuki M., Miyazaki T., Hisamitsu H., Kadoma Y., Morioka Y. Study on chemical reaction of methylthiirane on gold colloid by surface-enhanced raman scattering // Langmuir. 1999. V. 15. P. 7409-7410.

106. Cliffel D.E., Zamborini F.P., Gross S.M., Murray R.W. Mercaptoammonium-monolayer-protected, water-soluble gold, silver, and palladium clusters // Langmuir. 2000. V. 16. P. 9699-9702.

107. Shon Y.S., Gross S.M., Dawson B., Porter M., Murray R.W. Alkanethiolate-protected gold clusters generated from sodium S-dodecylthiosulfate (Bunte salts) // Langmuir. 2000. V. 16. P. 6555-6561.

108. Tzhayik 0., Sawant P., Efrima S., Kovalev E., Klug J.T.

109. Xanthate Capping of Silver, Copper, and Gold Colloids // Langmuir. 2002. V. 18. P. 3364-3369.

110. Jiang X., Xie Y., Lu J., Zhu L., He W., Qian Y.

111. Preparation, characterization, and catalytic effect of CS2-stabilized silver nanoparticles in aqueous solution Langmuir. 2001. V. 17. P. 3795 -3799.

112. Tan Yi, Li Yo., Zhu D. Fabrication of Gold Nanoparticles

113. Using a Trithiol (Thiocyanuric Acid) as the Capping Agent Langmuir. 2002. V. 18. P. 3392-3395.

114. Waters C.A., Mills A.J., Johnson K.A., Schiffrin D.J.

115. Purification of Dodecanethiol Derivatized Gold Nanoparticles // Chem. Commun. 2003. P. 540-541.

116. Asian K., Pérez-Luna V.H. Surface Modification of

117. Colloidal Gold by Chemisorption of Alkanethiols in the Presence of a Nonionic Surfactant // Langmuir. 2002. V. 18. P. 6059-6065.

118. Andres R.P., Bielefeld J.D., Henderson J.I., Janes D.B.,

119. Kolagunta V.R., Kubiak C.P., Mahoney W. J., Osifchin. R.G. Self-Ass.embly of a Two-Dimensional Superlattice of Molecularly Linked Metal Clusters // Science. 1996. V. 273. P. 1690-1693.

120. Lin X.M., Sorensen C.M. Ligand-Induced Gold Nanocrystal

121. Superlattice Formation in Colloidal Solution // Chem. Mater. 1999. V. 11. P. 198-202.

122. Yee C.K., Jordan R.;, Ulman A., White H., King A.,

123. Rafailovich M., Sokolov J. Novel One-Phase Synthesis of Thiol-Functionalized Gold, Palladium, and Iridium

124. Nanoparticles Using Superhydride // Langmuir. 1999. V. 15. P. 3486-3491.

125. Selvakannan P.R., Mandal S., Pasricha R., Adyanthaya

126. S.D., Sastry M. One-Step Synthesis of Hydrophobized Gold Nanoparticles of Controllable Size by the Reduction of Aqueous Chloroaurate Ions by Hexedecylaniline at the Liquid-Liquid Interface // Chem. Commun. 2002. P. 13341335.

127. Wei G.-T., Liu F.-K., Wang C.R.C. Shape Separation of

128. Nanometer Gold Particles by Size-Exclusion Chromatography // Anal. Chem. 1999. V. 71. P. 2085-2091.

129. Prasad B.L.V., Stoeva S.I., Sorensen C.M., Klabunde K.J.

130. Digestive Ripening of Thiolated Gold Nanoparticles: The Effect of Alkyl Chain Length // Langmuir. 2002. V. 18. P. 7515-7520.

131. Prasad B.L.V., Stoeva S.I., Sorensen C.M., Klabunde K.J.

132. Digestive-Ripening Agents for Gold Nanoparticles: Alternatives to Thiols // Chem. Mater. 2003. V. 15. P. 935-942.

133. Lin X.M., Sorensen C.M. Ligand-Induced Gold Nanocrystal

134. Superlattice Formation in Colloidal Solution // Chem. Mater. 1999. 11. 198-202.

135. Brown L.O., Hutchison J.E. Formation and Electron

136. Diffraction Studies of Ordered 2-D and 3-D Superlattices of Amine-Stabilized Gold Nanocrystals // J. Phys. Chem. B. 2001. V. 105. P. 8911-8916.

137. Stoeva S.I., Prasad B.L.V., Uma S., Stoimenov P.K.,

138. Zaikovsky V., Sorensen C.M., Klabunde K.J. Face-Centered Cubic and Hexagonal Closed-Packed Nanocrystal Superlattice of Gold Nanoparticles Prepared by Different Methods // J. Phys. Chem. B. V. 2003. P. 107. 7441-7448.

139. Li W., Huo L., Wang D., Zeng G., Xi S., Zhao B., Zhu J., Wang J., Shen Y., Lu Z. Self-Assembled Multilayers of

140. Alternating Gold Nanoparticles and Dithiols: Approaching to Superlattice // Colloids Surf. 2000. V. 175. P. 217223.

141. Wang T., Zhang D., Xu W., Zhu D. Self-Organization of

142. Gold Nanoparticles into 2D Superlattice through .pi.-.pi. Interaction // Synth. Met. 2003. V. 135-136. P. 835-836.

143. Kanehara M., Oumi Y., Sano T., Teranishi T. Formation of1.w-Symmetric 2D Superlattices of Gold Nanoparticles through Surface Modification by Acid-Base Interaction // J. Am. Chem. Soc. 2003. V.125. P. 8708-8709.

144. Teranishi T. Fabrication and Electronic Properties of

145. Gold Nanoparticle superlattices // Compte-Rendus Chimie. 2003. V. 6. P. 979-987.

146. Dieluweit S., Pum D., Sleytr U.B. Formation of a Gold

147. Superlattice on an S-Layer with Square Lattice Symmetry // Supramol. Sci. 1998. V. 5. P. 15-19.

148. Sarathy K.V., Kulkarni G.U., Rao C.N.R. A Novel Method of

149. Preparing Thiol-Derivatised Nanoparticles of Gold, Platinum and Silver Forming Superstructures // Chem. Commun. 1997. P. 537-538.

150. Ascencio J.A., Pérez M., José-Yacamán M. A Truncated1.osahedral Structure Observed in Gold Nanoparticles // Surf. Sci. 2000. V. 447. P. 73-80.

151. Chushak Y., Bartell L.S. Molecular Dynamics Simulationsof the Freezing of Gold Nanoparticles // Eur. Phys. J. D. 2001. V. 16. P. 43-46.

152. Stoeva S., Klabunde K.J., Sorensen C.M., Dragieva I.

153. Gram-Scale Synthesis of Monodisperse Gold Colloids by the Solvated Metal Atom Dispersion Method and Digestive Ripening and Their Organization into Two- and Three-Dimensional Structures // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 2305-2311.

154. Bohren С.F., Huffman D.R. Absorption of Light by Small

155. Particles. -N.-Y.: Wiley. 1983.

156. Борен К., Хафмен Д. Поглощение и рассеяние света малыми частицами. -М.: Мир. 1983.

157. Granqvist C.G., Hindery О. Optical properties ofultrafine gold particles // Phys. Rev. B. 1977. V. 16. P. 3513-3554.

158. Colloidal Gold: Principles, Methods and Applications /

159. Ed. Hayat M.A. -San Diego: Academic Press. 1989. V. 1. 538 p.; V. 2. 484 p.; 1990. V. 3. 421 p.

160. Kelly K., Coronado E., Zhao L., Schatz G. The Optical

161. Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment // J. Phys. Chem. B. 2003. V. 107. P. 668-677.

162. Mulvaney P. Surface Plasmon Spectroscopy of Nanosized

163. Metal Particles // Langmuir 1996. V. 12. P. 788-800.

164. Mulvaney P. In Semiconductor Nanoclusters: Physical,

165. Chemical and Catalytic Aspects / Kamat P. V., Meisel D., Eds. Elsevier: Amsterdam. 1997. P. 99-123.

166. Van der Hülst H. С. Light Scattering by Small Metal

167. Particles, N.Y.: Wiley. 1957.

168. Ван дер Хюлст Г. Рассеяние света малыми частицами. М.: ИЛ, 1961.

169. The Theory of the Photographic Process, 4th ed, James

170. Т.Н., Ed., -N.Y.: Mac Millan Press. 1977.

171. Kerker M. The Scattering of Light and Other

172. Electromagnetic Radiation, -N.Y.: Academic Press, 1969.

173. Alvarez M.M., Khoury J.Т., Schaaff T.G., Shafigullin

174. M.N., Vezmar I., Whetten R.L. Optical Absorption Spectra of Nanocrystal Gold Molecules // J. Phys. Chem. B. 1997. V. 101. P. 3706-3712.

175. Freibig U., Vollmer M., Eds. Optical Properties of Metal

176. Clusters, -N.Y.: Springer-Verlag. 1995.

177. Logunov S.L., Ahmadi T.S., El-Sayed M.A., Khoury J.Т.,

178. Whetten R.L. Electron Dynamics of Passivated Gold Nanocrystals Probed by Subpicosecond Transient Absorption Spectroscopy // J. Phys. Chem. B. 1997. V. 101. P. 37133719.

179. Schaaf T.G., Shafigullen M.N., Khoury J.Т., Vezmar I.,

180. Whetten R.L., Cullen W.G., First P.N., Guttierrez-Wing C., Ascencio J., Jose-Yacamun M.J. Isolation of Smaller Nanocrystal Au Molecules: Robust Quantum Effects in Optical Spectra //-J. Phys. Chem. B. 1997. V. 101. P. 7885-7891.

181. Zaitoun M.A., Mason W.R., Lin C.T. Magnetic Circular

182. Dichroism Spectra for Colloidal Gold Nanoparticles in Xerogels at 5.5 К // J. Phys. Chem. B. 2001. V. 105. P. 6780-6784.

183. Melinger J.S., Kleiman V.D., McMorrow D., Grohn F., Bauer

184. B.J., Amis E. Ultrafast Dynamics of Gold-Based Nanocomposite Materials // J. Phys. Chem. A. 2003. V. 107. P. 3424-3431. 14 6 Кленин В.И., Щеголев С.Ю., Лаврушин В.И.

185. Характеристические функции светорассеяния дисперсных систем. -Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1977. 14 7 Хлебцов Н.Г., Дыкман JT.A., Богатырев В.А., Хлебцов Б.Н.

186. Двухслойная модель биоконъюгатов коллоидного золота и её применение для оптимизации наносенсоров // Коллоид, журн. 2003. Т. 65. № 4. С. 552-562.

187. Templeton А.С., Pietron J.J., Murray R.W., Mulvaney P.

188. Solvent Refractive Index and Core Charge Influences on the Nanoparticle solutions // J. Appl. Phys. 2002. V. 92. P. 7486-7490.

189. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Melnikov A.G. Spectral extinction of colloidal gold and itsbiospecific conjugates // J. Colloid Interface Sci. 1996. V. 180. P. 436-445.

190. Schultz D.A. Plasmon resonat particles for biologicaldetection // Curr. Opin. Biotechnol. 2003. V. 14. P. 1322 .

191. Taton T.A., Lu C. Mirkin C.A. Two-color labeling ofoligonucleotide arrays via size-selective scattering of nanoparticle probes //J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 5164-5165.

192. Malinsky M.D., Kelly K.L., Schatz G.C., Van Duyne R.P.

193. Chain length dependence and sensing capabilities of the localized surface plasmon resonance of silver nanoparticles chemically modified with alkanethiol self-assembled monolayers // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 1471-1482.

194. Underwood S., Mulvaney P. Effect of the solutionrefractive index on the color of gold colloids // Langmuir. 1994. V. 10. P. 3427-3430.

195. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Хлебцов Б.Н., Дыкман Jl.А.,

196. Papavassiliou G.C. Optical Properties of Small Inorganicand Organic Metal Particles // Prog. Solid State Chem. 1979. V. 12. P. 185-271.

197. Templeton A.C., Pietron J.J., Murray R.W., Mulvaney P.

198. Solvent Refractive Index and Core Charge Influences on the Nanoparticle solutions // J. Appl. Phys. 2002. V. 92. P. 7486-7490.

199. Link S., El-Sayed, M.A. Size and Temperature Dependenceof the Plasmon Absorption of Colloidal Gold Nanoparticles // J. Phys. Chem. B. 1999. V. 103. P. 4212-4217.

200. Itoh T., Asahi T., Masuhara H. Femtosecond Light

201. Scattering Spectroscopy of Single Gold Nanoparticles // Appl. Phys. Lett. 2001. V. 79. P. 1667-1669.

202. Su K.-H., Wei Q.-H., Zhang X., Mock J.J., Smith D.R.,

203. Schulz S. Interparticle Coupling Effects on Plasmon Resonance of Nanogold Particles // Nano Lett. 2003. V. 3. P. 1087-1090.

204. Rechberger W., Hohenau A., Leitner A., Krenn J.R.,1.mprecht B., Aussenegg F.R. Optical Properties of Two Interacting Gold Nanoparticles // Opt. Commun. 2003. V. 220. P. 137-141.

205. Link S., Mohamed M.B., El-Sayed M.A. Simulation of the

206. Optical Absorption Spectra of Gold Nanorods as a Function of their Aspect Ratio and the Effect of the Medium Dielectric Constant // J. Phys. Chem. B. 1999. V. 103. P. 3073-3077.

207. Yan B., Yang Y., Wang Y. Comment on "Simulation of the

208. Optical Absorption Spectra of Gold Nanorods as a Function of their Aspect Ratio and the Effect of the Medium Dielectric Constant" // J. Phys. Chem. B. 2003. V. 107. P. 9159.

209. Swanson N.L., Billard B.D. Optimization of Extinctionfrom Surface Plasmon Resonances of Gold Nanoparticles // Nanotechnology. 2003. V. 14. P. 353-357.

210. Ung T., Liz-Marzän L.M., Mulvaney P. Gold Particles Thin

211. Films // Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Asp. 2002. V. 202. P. 119-126.

212. Hall S.R., Davis S.A., Mann S. Co-Condensation of

213. Organosilica Hybrid Shells on Nanoparticle Templates: A

214. Direct Synthetic Route to Functionalized Core-Shell Colloids // Langmuir. 2000. V. 16. P. 1454-1456.

215. Ung T., Giersig M., Dunstan D., Mulvaney P.

216. Spectroelectrochemistry of Colloidal Silver // Langmuir. 1997. V. 13. P. 1773-1782.

217. Ung T., Liz-Marzän L.M., Mulvaney P. Optical Propertiesof Thin Films of Au@Si02 Particles // J. Phys. Chem. B. 2001. V. 105. P. 3441-3452.

218. Klar T., Perner M., Grosse S., von Plessen G., Spirkl W.,

219. Feldmann J. Surface-Plasmon Resonances in Single Metallic Nanopartides // Phys. Rev. Lett. 1998. V. 80. P. 42494252.

220. Al-Rawashdeh N., Foss C.A., Jr. UV/Visible and Infrared

221. Spectra of Polyethylene/Nanoscopic Gold Rod Composite Films: Effects of Gold Particle Size, Shape and Orientation // Nanostruct. Mater. 1997. V. 9. P. 383-386.

222. Al-Rawashdeh N.A.F., Sandrock M.L., Seugling C.J., Foss

223. C.A., Jr. Visible Region Polarization Spectroscopic Studies of Template-Synthesized Gold Nanoparticles Oriented in Polyethylene // J. Phys. Chem. B. 1998. V. 102. P. 361-371.

224. Linden S., Christ A., Kühl J., Giessen H. Selective

225. Suppression of Extinction within the Plasmon Resonance of Gold Nanoparticles // Appl. Phys. B. 2001. V. 73. P. 311316.

226. Linden S., Kühl J., Giessen H. Controlling the1.teraction between Light and Gold Nanoparticles: Selective Suppression of Extinction // Phys. Rev. Lett. 2001. V. 86. P. 4688-4691.

227. Ahmadi T.S., Logunov S.L., El-Sayed M.A. Picosecond

228. Dynamics of Colloidal Gold Nanoparticles // J. Phys. Chem. B. 1999. V. 100. P. 8059-8056.

229. Hartland G.V., Hu M., Sader J.E. Softening of the

230. Symmetrie Breathing Mode in Gold Particles by Laser-Induced Heating // J. Phys. Chem. B. 2003. V. 107. P. 7472-7478.

231. Fujiwara H., Yanagida S., Kamat P.V. Visible Laser1.duced Fusion and Fragmentation of Thionicotinamide-Capped Gold Nanoparticles // J. Phys. Chem. B. 1999. V. 103. P. 2589-2591.

232. Takeuchi Y., Ida T., Kimura K. Colloidal Stability of

233. Gold Nanoparticles in 2-Propanol Under Laser Irradiation // J. Phys. Chem. B- 1997. V. 101. P. 1322-1327.

234. Satoh N., Hasegawa H., Tsujii K., Kimura K. Photoinduced

235. Coagulation of Au Nanocolloids // J. Phys. Chem. 1994. V. 98. P. 2143-2147.

236. Mafune F., Kohno J.-Y., Takeda Y., Kondow T. Dissociationand Aggregation of Gold Nanoparticles under Laser Irradiation // J. Phys. Chem. B. 2001. V. 105. P. 90509056.

237. Westcott S.L., Oldenburg S.J., Lee T.R., Halas N.J.

238. Construction of Simple Gold Nanoparticle Aggregates with Controlled Plasmon-Plasmon Interactions // Chem. Phys. Lett. 1999. V. 300. P. 651-655.

239. Eck D., Helm C.A., Wagner N.J., Vaynberg K.A. Plasmon

240. Resonance Measurements of the Adsorption and Adsorption Kinetics of a Biopolymer onto Gold Nanocolloids // Langmuir. 2001. V. 17. P. 957-960.

241. Chandrasekharan N., Kamat P. V., Hu J., Jones G., II.

242. Dye-Capped Gold Nanoclusters: Photoinduced Morphological Changes in Gold/Rhodamine 6G Nanoassemblies // J. Phys. Chem. B. 2000. V. 104. P. 11103-11109.

243. Nath N., Chilkoti A. Interfacial Phase Transition of an

244. Environmentally Responsive Elastin Biopolymer Adsorbed on Functionalized Gold Nanoparticles Studied by Colloidal

245. Surface Plasmon Resonance // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 8197-8202.

246. Huang S., Minami K., Sakaue H., Shingubara S., Takahagi

247. T. Optical Spectroscopic Studies of the Dispersibility of Gold Nanoparticle Solutions // J. Appl. Phys. 2002. V. 92. P. 7486-7490.

248. Thomas K.G., Zajicek J., Kamat P.V. Surface Binding

249. Properties of Tetraoctylammonium Bromide-Capped Gold Nanoparticles // Langmuir. 2002. V. 18. P. 3722-3727.

250. Swami A., Kumar A., Sastry M. Formation of Water

251. Dispersible Gold Nanoparticles Using a Technique Based on Surface-Bound Interdigitated Bilayers // Langmuir. 2003. V. 19. P. 1168-1172.

252. Malikova N., Pastoriza-Santos I., Schierhorn M., Kotov N.

253. A., Liz-Marzán L.M. Layer-by-Layer Assembled Mixed Spherical and Planar Gold Nanoparticles: Control of Interparticle Interactions // Langmuir. 2002. V. 18. P. 3694-3697.

254. Aizpurua J., Hanarp P., Sutherland D.S., Kail M., Bruant

255. G.W., Garcia de Abajo F.J. Optical Properties of Gold Nanorings // Phys. Rev. Lett. 2003. V. 90. P. 057401-1057401-4.

256. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман JI.А., Мельников А.Г.

257. Спектральные свойства коллоидного золота // Оптика и спектроскопия. 1996. Т. 80. № 1. С. 128-137.

258. Davis V.A., Schwartz L. Electromagnetic propagation inclose-packed disordered suspensions // Phys. Rev. B. 1985. V. 31. № 8. P. 5155-5165.

259. Doyle W.T. Optical properties of a suspension of metalspheres // Phys. Rev. B. 1989. V. 39. № 14. P. 98529858.

260. Ding K.H., Tsang L. Effective propagation constants inmedia with densely distributed dielectric particles of multiple sizes and permittivities // In: Progress in Electromagnetic Research / Ed. Kong J.A. -N.Y.: Elsevier. 1989. V. 1. P. 241-295.

261. Granqvist C.G.,Hindery 0. Optical properties of ultrafinegold particles // Phys. Rev. B. 1977. V. 16. № 8. P. 3513-3554.

262. Kerker M. The optics of colloidal silver something oldand something new // J. Colloid Interface Sci. 1985. V. 105. № 2. P. 297-314.

263. Doyle W.T. Absorption of light by colloids in alkali halide crystals // Phys. Rev. 1958. V. 111. № 4. P. 10671072.

264. Doremus R.Y. Optical Properties of Small Gold Particles

265. J. Chem. Phys. 1964. V. 40. № 8. P. 2389-2396.

266. Caro R.A., Nicolini J.O., Radicella R. Determination ofgold sol concentrations from spectrophotometric data // Int. J. Appl. Radiat. Isotop. 1967. V. 18. P. 329-331.

267. Turkevich J., Garton G., Stevenson P.S. The color ofcolloidal gold // J. Colloid Sci. (Suppl.l). 1954. V. 9. P. 26-35.

268. Skillman D.C., Berry C.R. Optical Absorption of Small

269. Silver Spheres in Water // J. Appl. Phys. 1971. V. 42. № 7. P. 2818-2822.

270. Золотарев B.M., Морозов B.H., Смирнова E.В. Оптическиепостоянные природных и технических сред. -JI.: Наука. 1984. 216 с.

271. Otter М. Optical constants of gold, copper and silver //

272. Z. Phys. 1961. Bd. 161. S. 163-178.

273. Hagemann H.-J., Gudat W., Kunz C. Optical Constants fromthe Far Infrared to the X-Ray Region: Mg, Al, Cu, Ag, Au, Bi, C, A1203 // Deutsches Elektronen-Synchrotron, 2

274. Hamburg 52, Notkestieg 1, DESY SR-74/7, May 1974.

275. Canfeld L.R., Hass A., Hunter W.R. The Optical Propertiesof Evaporated Gold in the Vacuum Ultraviolet from 300 A to 2000 A // J. Phys. 1964. V. 25. P. 124.

276. Schulz L.G. The optical constants of Ag, Cu, and A1 //

277. JOSA. 1954. V. 44. № 5. P. 357-368.

278. Irani G.B., Huen T., Wooten F. Optical Properties of Agand alpha -Phase Ag-Al Alloys // JOSA. 1971. V. 61. № 1. P. 128-129.

279. Киттель Ч. Введение в физику твердого тела. -М.: Мир.1978 .

280. Romer H., Fragstein С. Bestimmung des

281. Absorptionskoeffizienten und des Brechungsquotienten von kolloidalem Gold // Z. Phys. 1961. Bd. 163. S. 27-43.

282. Пушников A.A., Максименко 3.3. Квантовая оптикаметаллической частицы // ЖЭТФ. 1993. Т. 103. № 3. С. 1010-1044.

283. Василенко В.А. Сплайн-функции: теория, алгоритмы,программы. Новосибирск. 1983. 211 с.

284. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г., Щеголев СЮ.

285. Спектротурбидиметрия дисперсных систем с учетом спектральной зависимости показателя преломления / / Коллоидн. журн. 1991. Т. 53. С. 928-933.

286. Хлебцов Н.Г. Ослабление и рассеяние света хаотическиориентированным ансамблем: точное решение в Т-матричном подходе // Опт. и спектр. 1991. Т. 71. С. 151-153.

287. Khlebtsov N.G. Orientational averaging of lightscattering observables in the T-matrix approach // Appl. Opt. 1992. V. 31. P. 5359-5365.

288. Мищенко M.M. Расчет интегральных характеристиксветорассеяния для ансамбля хаотически ориентированныхнесферических частиц // Кинем, физ. неб. тел. 1990 Т. б С. 95-96.

289. Mishchenko M.I. Light scattering by randomly orientedaxially symmetric particles // JOSA. A. 1991. V. 8. P. 871-882.

290. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г. Спектротурбидиметриядрожжевых суспензий // Журнал прикладной спектроскопии. 1987. Т. 47. С. 807-810.

291. Jeppesen М.А., Barlow R.B. Determination of particle sizeof colloidal gold from absorption spectra // J. Opt. Soc. Am. 1962. V. 52. P. 99-101.

292. Moradian A. Photoluminiscencs of Metals // Phys. Rev.1.t. 1969. V. 22. P. 185-187.

293. Huang Т., Murray R.W. Visible Luminescence of Water

294. Soluble Monolayer-Protected Gold Clusters // J. Phys. Chem. B. 2001. V. 105. P. 12498-12502.

295. Hwang Y.-N., Jeong D. H., Shin H.J., Kim D., Jeoung S.

296. C., Han S.H., Lee J.-S., Cho G. Femtosecond Emission Studies of Gold Nanoparticles // J. Phys. Chem. B. 2002. V. 106. P. 7581-7584.

297. Chen M.M.Y., Katz A. Steady-State Fluorescence-Based1.vestigation of the Interaction between Protected Thiols and Gold Nanoparticles // Langmuir. 2002. V. 18. P. 24132420.

298. Hu J., Zhang J., Liu F., Kittredge K., Whitesell J.K.,

299. Fox M.A. Competitive Photochemical Reactivity in a Self-Assembled Monolayer on a Colloidal Gold Cluster // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 1464-1470.

300. Wang Т., Zhang D., Xu W., Yang J., Han R., Zhu D.

301. Preparation, Characterization, and Photophysical Properties of Alkanethiols with Pyrene Units-Capped Gold Nanoparticles: Unusual Fluorescence Enhancement for the

302. Aged Solutions of These Gold Nanoparticles // Langmuir. 2002. V. 18. P. 1840-1848.

303. Thomas K.G., Kamat P.V. Making Gold Nanoparticles Glow:

304. Enhanced Emission from a Surface-Bound Fluoroprobe // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. P. 2655-2656.

305. Sarathy V.K., Narayan K.S., Kim J., White J.O. Novel

306. Fluorescence and Morphological Structures in Gold Nanoparticles Polyoctylthiophene Based Thin Films // Chem. Phys. Lett. 2000. V. 318. P. 543-548.

307. Xu P., Yanagi H. Fluorescence Patterning in Dye-Doped

308. Sol-Gel Films by Generation of Gold Nanoparticles // Chem. Mater. 1999. V. 11. P. 2626-2628.

309. Makarova O.V., Ostafin A.E., Miyoshi H., Norris J.R.,

310. Jr., Meisel D. Adsorption and Encapsulation of Fluorescent Probes.in Nanoparticles // J. Phys. Chem. B. 1999. V. 103. P. 9080-9084.

311. Dulkeith E., Morteani A.C., Niedereichholz T., Klar T. A., Feldmann J. Fluorescence Quenching of Dye Molecules near Gold Nanoparticles: Radiative and Nonradiative Effects // Phys. Rev. Lett. 2002. V. 89. P. 203002-1203002-4.

312. Gu T., Whitesell J.K., Fox M.A. Energy Transfer from a

313. Surface-Bound Arene to the Gold Core in ¿y-Fluorenyl-Alkane-l-Thiolate Monolayer-Protected Gold Clusters // Chem. Mater. 2003.-V. 15. P. 1358-1366.

314. Dubertret B., Calame M., Libchaber A.J. Single-Mismatch

315. Detection Using Gold-Quenched Fluorescent

316. Oligonucleotides // Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. P. 365370.

317. Imahori H., Fukuzumi S. Porphyrin Monolayer-Modified Gold

318. Clusters as Photoactive Materials // Adv. Mater. 2001. V. 13. P. 1197-1199.

319. Imahori H., Arimura M., Hanada T., Nishimura Y., Yamazaki1., Sakata Y., Fukuzumi S. Photoactive Three-Dimensional Monolayers: Porphyrin-Alkanethiolate-Stabilized Gold Clusters // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 335-336.

320. Lakowitcz J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy.-N.Y.: Kluwer. 1999.

321. Link S., El-Sayed M.A. Shape and Size Dependence of

322. Radiative, Non-Radiative and Photothermal Properties of Gold Nanocrystals // Int. Rev. Phys. Chem. 2000. V. 19. P. 409-453.

323. Wilcoxon J.P., Martin J.E., Parsapour F., Wiedenman B.,

324. Kelley D.F. Photoluminescence From Nanosize Gold Clusters // J. Chem. Phys. 1998. V. 108. P. 9137-9143.

325. Mohamed M.B., Volkov V., Link S., El-Sayed M.A. Thelightning' Gold Nanorods: Fluorescence Enhancement of Over a Million Compared to the Gold Metal // Chem. Phys. Lett. 2000. V. 317. P. 517-523.

326. Bigioni T.P., Whett'en T.P., Dag 0. Near-Infrared1.minescence from Small Gold Nanocrystals // J. Phys. Chem. B. 2000. V. 104. P. 6983-6986.

327. Ipe B.I., Mahima S., Thomas K.G. Light-Induced Modulation of Self-Assembly on Spiropyran-Capped Gold Nanoparticles: A Potential System for the Controlled Release of Amino Acid Derivatives // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. P. 7174-7175.

328. Eversole J.D., Broida H.P. Size and Shape Effects in1.ght Scattering from Small Silver, Copper, and Gold Particles // Phys.'Rev. B. 1977. V. 15. P. 1644-1655.

329. Jones A.R. Light Scattering for Particle Characterization

330. Progress in Energy and Combustion Science. 1999. V. 25. P. 1-53.

331. Yguerabide J, Yguerabide E. Light-Scattering

332. Submicroscopic Particles as Highly Fluorescent Analogsand Their Use as Tracer Labels in Clinical and Biological Applications I. Theory // Anal. Biochem. 1998. V. 262. P. 137-156.

333. Yguerabide J., Yguerabide E. Light-Scattering

334. Submicroscopic Particles as Highly Fluorescent Analogs and Their Use as Tracer Labels in Clinical and Biological Applications II. Experimental Characterization // Anal. Biochem. 1998. 262. P. 157-176.

335. Лансберг. Оптика. Учебник для вузов. -М.: Наука. 1969.926 с.

336. Liu X., Yuan Н., Pang D., Cai R. Resonance lightscattering spectroscopy study of interaction between gold colloid and thiamazole and its analytical application // Spectrochimica Acta Part A. 2004 V. 60. P. 385-389.

337. Dragnea В., Chen C., Kwak E.-S., Stein В., Kao| C.C. Gold Nanoparticles as Spectroscopic Enhancers for in Vitro Studies on Single Viruses // J. Am. Chem. Soc. A. 2003. V. 125. P. 6374-6375.

338. Kahlau T., Quinten M., Kreibig U. Extinction and angleresolved light scattering from aggregated metal clusters // Appl. Phys. A. V. 62. P. 19-27.

339. Roll D., Malicka J., Gryczynski I., Gryczynski Z.,1.kowicz J.R. Metallic Colloid Wavelength-Ratiometric Scattering Sensors // Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 34403445.

340. Wang Y.F, Pang D.W., Zhang Zh.L., Zheng H.Zh., Cao J.P.,

341. Shen J.T. Visual Gene Diagnosis of HBV and HCV Based on Nanoparticle Probe Amplification and Silver Staining Enhancement // J. Med. Vir. 2003. V. 70. P. 205-211.

342. Zhiliang J., Zhongwei F., Tingsheng L., Fang L., Fuxin

343. Bogatyrev V.A., Medvedev B.A., Dykman L.A., Khlebtsov

344. N.G. In: Optical Technologies in Biophysics and Medicine II / Ed. Tuchin V.V. Proc. SPIE. V. 4241. -Washington, Bellingham: SPIE Publ. 2001. P. 42.

345. Nowicki W. Kinetic behaviour of the system composed ofnanosized gold particles and very-high-molecular-weight polyacrylamide // Colloids and Surfaces A: 2001. V. 194. P. 159-173.

346. Doron A., Joselevich E., Schlitter A., Willner I. AFMcharacterization of the structure of Au-colloid monolayers and their chemical etching // Thin Solid Films. 1999. V. 340. P. 183-188.

347. Уайтсайдс Дж., Эйглер Д., Андерс Р., и др. Нанотехнологияв ближайшем десятилетии. Прогноз направления исследований./ Под ред. М.К. Роко, Р.С. Уильямса и П. Аливисатоса. Пер. с англ. М.: Мир. 2002. 292 с. Copyright Kluver Academic Publisher 2000.

348. Башурова B.C., Камха M.A., Пусеп А.Ю., Федоренко С.Г.

349. Экспериментальные особенности исследования функции распределения дисперсной фазы методом автокорреляционной спектроскопии // Коллоид, журн. 1993. Т. 55. № 1. С. 1015.

350. Berne B.J., Pecora R. Dynamic light scattering withapplications to chemistry, biology, and physics. Mineola -N.Y.: Dover Publications. 2000.

351. Pecora.R (Ed.) Dynamic light scattering. Applications ofphoton correlation spectroscopy. -N.Y., London: Plenum Press. 1985.

352. Камминс Г., Пайк Э. Спектроскопия оптического смешения икорреляция фотонов. -М.: Мир. 1978.

353. Носкин В.А. Изучение макромолекул и надмолекулярныхструктур методом квазиупругого рассеяния. Дисс. доктора физ.-мат. наук. -J1. : ЛИЯФ. 1983.

354. Кленин В. И. Термодинамика систем с гибкоцепнымиполимерами. -Саратов: Изд-во. Сарат. ун-та. 1995.

355. Brown R.G.W., Burnett J.G., Mansbridge J., et al.

356. Miniature laser light scattering instrumentation for particle size analysis. // Appl. Opt. 1990. V. 29. N. 28. P. 4159-4169.

357. Liu S., Leech D., Ju Hu, Application of Colloidal Gold in

358. Protein Immobilization, Electron Transfer, and Biosensing // Anal. Lett. 2003. V. 36. No. 1. .P. 1-19.

359. Thiele H., Hoppe K., Moll G. Uber das kolloide Gold //

360. Kolloid-Z. u. Z. Polymere. 1962. Bd. 185. Ht. 1. S. 4552.2 65 Баран А. А. Полимерсодержащие дисперсные системы. -Киев:

361. Наук. Думка. 1986. 204 с. 2 66 Щукин Е.Д., Перцов А.В., Амелина Е.А. Коллоидная химия:

362. Letsinger R.L., Elghanian R., Viswanadham G., Mirkin C.A.

363. Use of a steroid cyclic disulfide anchor in constructing gold nanoparticle-oligonucleotide conjugates // Bioconjug Chem. 2000. V. 11. P. 289-291.

364. Li Z, Jin R.C., Mirkin C.A., Letsinger R.L. Multiplethiol-anchor capped DMA-gold nanoparticle conjugates // Nucleic Acids Res.2002. V. 30. P. 1558-1562.

365. Cao Y.W., Jin R., Mirkin C.A. DMA-modified core-shell

366. Ag/Au nanoparticles // J Am Chem Soc. 2001. V.123. P. 7961-7962.

367. Storhoff J.J., Elghanian R., Mirkin C.A., Letsinger

368. R.L. Sequence-dependent stability of DMA-modified gold nanoparticles // Langmuir. 2002. V. 18. P. 6666-6670.

369. Walton I.D., Norton S.M., Balasingham A., He L., Oviso

370. D.F., Gupta D., Raju P.A., Natan M.J., Freeman R.G. Particles for multiplexed analysis in solution: detection and identification of striped metallic particles using optical microscopy // Anal Chem 2002. V. 74. P. 22402247.

371. Mandal T.K., Fleming M.S., Walt D.R. Preparation ofpolymer coated gold nanoparticles by surface-confined living radical polymerization at ambient temperature // Nano Letters. 2002. V. 2. P. 3-7.

372. Radloff C., Halas N.J. Enhanced thermal stability ofsilica-encapsulated metal nanoshells // Appl Phys Lett. 2001. V. 79. P. 674-676.

373. Quaroni L., Chumanov G. Preparation of polymer-coatedfunctionalized silver nanoparticles // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 10642-10643.

374. Caruso F. Nanoengineering of particle surfaces // Adv.

375. Mater. 2001. V. 131 P. 11-22. .

376. Clusters and Colloids / Ed. Schmid G. -Weinheim: VCH.1994 .

377. Kreibig U., Vollmer M. Optical Properties of Metal

378. Clusters / -Berlin: Springer-Verlag. 1995.

379. Metal NanoparticlessSynthesis, Characterization and

380. Applications // Eds.Feldheim D.L., Colby A.F., Jr., -N.Y.: Marcel Dekker. 2002.

381. Katz E., Willner I., Shipway A.N. Nanoparticle Arrays on

382. Surfaces for Electronic, Optical and Sensor Applications // Chem. Phys. Chem. 2000. V. 1. P. 18-52.

383. Niemeyer Ch. M., Nanoparticles, proteins, and nucleicacids: Biotechnology meets materials science // Angew. Chem. Int. Ed. 2001. V. 40. P. 4128-4158.

384. Shenton W., Davies S.A., Mann S. Directed Self-Assemblyof Nanoparticles into Macroscopic Materials Using Antibody-Antigen Recognition // Adv. Mater. 1999. V. 11. P. 449-452.

385. Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy

386. Ed. Donbrow M. Boca Raton: CRC Press, 1992. - 360 p.

387. Gestwicki J.E., Strong L.E., Kiessling L.L.,

388. Visualization of single multivalent receptor-ligand complexes by transmission electron microscopy // Angew. Chem. 2000. Bd. 112. S. 4741-4744.

389. Grabar K., Deutsch J., Natan M. Polymer-supoted goldcolloid monolayers: a new approach to biocompatible metal surfaces // Polym. Prepr. 1995. V. 36. P. 69-70.

390. Connolly S., Fitzmaurice D., Programmed Assembly of Gold

391. Nanocrystals in Aqueous Solution // Adv. Mater. 1999. V. 11. P. 1202 1205.

392. Yang X., Wenzler L.A., Qi J., Li X. Seeman N.C. Ligationof DNA Triangles Containing Double Crossover Molecules // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 9779-9786.

393. ShaiuW.-L., Larson D.D., Vesenka J., Henderson E. Atomicforce microscopy of oriented linear DNA molecules labeled with 5nm gold spheres // Nucleic Acids Research. 1993. V. 21(1) P. 99-103.

394. Park S.-J., Lazarides A. A., Mirkin C. A., Brazis P. W.,

395. Kannewurf C. R., Letsinger R. L., Living Templates for the Hierarchical Assembly of Gold Nanoparticles // Angew. Chem. 2000. V. 112. P. 4003-4006.

396. Bardea A., Dagan A., Ben-Dov I., Amit B., Willner I.

397. Amplified Microgravimetric Quartz-Crystal-Microbalance Analyses of Oligonucleotide Complexes: A Route to a Tay-Sachs Biosensor Device // Chem. Commun. 1998. P. 839-840.

398. Patolsky F., Ranjit K. T., Lichtenstein A., Willner I.

399. Dendritic of DNA Analysis by Oligonucleotide-Functionalized Au-Nanoparticles // Chem. Commun. 2000. P. 1025-1026.

400. Safer D., Bolinger L., Leigh J.S. Undecagold clusters forsite-specific labeling of biological macromolecules: Simplified preparation and model applications // J. Inorg. Biochem. 1986. V. 26. 77-91.

401. Hainfeld J. F., Furuya F. R. A 1.4-nm gold clustercovalently attached to antibodies improves immunolabeling // J. Histochem. Cytochem. 1992. V.40. P. 177-184.

402. Keating C.D., Kovaleski K.M., Natan M.J. Protein: Colloid

403. Conjugates for Surface-Enhanced Raman Scattering: Stability and Control of Protein Orientation // J. Phys. Chem. B. 1998. V. 102. P. 9404-9413.

404. Broderick J., Natan M.J., Van Duyne R.P., O'Halloran T.V.

405. Evidence for Retention of Biological Activity of a Non-Heme Iron Enzyme Adsorbed on a Silver Colloid: A Surface

406. Enhanced Resonace Raman Scattering Study // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 13771-13776.

407. Schultz S., Smith D. R., Mock J. J., Schultz D. A.,

408. Single-target molecule detection with nonbleaching multicolor optical immunolabels Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97, 996 1001.

409. MacDonald I. D. G., Smith W. E. Langmuir Orientation ofcytochrome с adsorbed on a citrate-reduced silver colloid surface. 1996, 12, 706 713.

410. Rospendowski K., Kelly C., Wolf R., Smith W.E. Surfaceenhanced resonance raman-scattering from cytochromes-p-450 adsorbed on citrate-reduced silver sols // J. Am. Chem. Soc. 1991. V. 113. P. 1217-1225.

411. Dykman L.A., Matora L.Yu., Bogatyrev V.A. Use ofcolloidal gold to obtain antibiotin antibodies // J. Microbiol. Meth. 1996. V. 24. No 3. P. 247-248.

412. Дерягин Б.В., Чурае.в Н.В. Муллер В.М. Поверхностные силы-М.: Наука, 1985, 399 с.

413. URL: http://molbiol.ru/scripts/0118.html

414. Уильяме В., Уильяме X. Физическая химия для биологов.-М.:, Мир, 1976, 600 с.

415. Дыкман JI.A., Сумарока М.В., Староверов С.А., Зайцева

416. И.С., Богатырев В.А. Иммуногенные свойства коллоидного золота // Известия АН, Сер. биол. 2004. Т. 31. No 1. С. 86-91.

417. Дыкман J1.A. Коллоидное золото в биохимических имикробмологических-исследованиях / Диссертация на соиск. ст. д.б.н. 2005. -Саратов:. 335 с.

418. Сумарока М.В., Дыкман J1.A., Богатырев В.А., Зайцева И.С.,

419. Соколов О.И., Щеголев С.Ю., Харрис У. Получение, селекция и иммунодетекция антител к гаптенам с использованием конъюгатов коллоидного золота и комбинаторных фаговыхбиблиотек I ! Аллергология и иммунология. 2000. Т. 1. No 2. С. 134-135.

420. Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Staroverov S.A., Ermilov

421. D.N., Shchyogolev S.Yu. The adjuvanticity of colloidal gold // б-th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology: Molecular Basis of the Immune Response, Pushchino, Russia, Sept. 15-22, 2002. P. 25-26.

422. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J.

423. Phage antibodies: Filamentous phage displaying antibody variable domains // Nature. 1990. V. 348. P. 552-554.

424. Molloy P.E., Harris W.J., Strachan G., Watts C.,

425. Cunniugham C. Production of soluble single-chain T-cell receptor fragments in Escherichia coli trxB mutants // J. Mol. Immunol. 1998. V. 35. P. 73-81.

426. McCurdy D.W., Sammut M., Gunning B.E.S. Immunofluorescentvisualization of arrays of transverse cortical actin microfilaments in wheat root-tip cells // Protoplasma. 1988. V. 147. P. 204-206.

427. Koropp K., Volkmann D. Monoclonal antibody CRA against afraction of actin from cress roots recognizes its antigen in different plant species // Eur. J. Cell Biol. 1994. V. 64. P. 153-162.

428. Dancker P., Low I., Hasselbach W., Wieland T. Interactionof Actin with Phalloidin: Polymerization and Stabilization of F-Actin // Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 400. P. 407-414.

429. Andersland J.M., Parthasarathy M.V. Characterization of amonoclonal antibody prepared against plant actin // Cell Motil. Cytoskel. 1992. V. 22. P. 245-249.

430. Schmit A.C., Lamber.t A.M. Microinjected fluorescentphalloidin in vivo reveals the F-actin dynamics andassembly in higher plant mitotic cells // Plant Cell. 1990. V.2. P. 129-138.

431. Tewinkel M., Kruse S., Quader H., Volkmann D., Sievers A.

432. Visualization of actin filament pattern in plant cells without pre-fixation. A comparison of differently modified phallotoxins // Protoplasma. 1989. V. 149. P. 178-182.

433. Cleary A.L. F-actin redistributions at the division sitein living Tradescantia stomatal complexes as revealed by microinjection of rhodamine-phalloidin // Protoplasma. 1995. V.185. P. 152-165.

434. Schmit A.C., Lambert A.M. // Characterization anddynamics of cytoplasmic F-actin in higher plant endosperm cells during interphase, mitosis, and cytokinesis J. Cell Biol. 1987. V. 105. P. 2157-2166.

435. Свиткина T.M. Организация цитоскелета эпителиальныхклеток в культуре // Цитология. 1989. Т. 31. С. 14351440.

436. Дыкман JI.A., Богатырев В.А., Зайцева И.С., Соколова М.К.,

437. Иванов В.В., Соколов О.И. Использование конъюгатов коллоидного золота для идентификации актинов различного происхождения // Биофизика. 2002. Т. 47. No 4. С. 632640.

438. Дыкман J1.A., Богатырев В.А. Коллоидное золото втвердофазных методах анализа // Биохимия. 1997. Т. 62. С. 411-418.

439. Богатырев В.А. Физико-химические свойства клеточнойповерхности бактерий рода Azospirilium-, цитохимический и электрооптический анализ /Диссертация на соискание ученой степени к.б.н. -Саратов: 1995. 201 с.

440. Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Khlebtsov B.N., Khlebtsov

441. N.G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin // Anal. Biochem. 2005. V. 341. P. 16-21.

442. Roth J. The colloidal gold marker system for light andelectron cytochemistry // In: Techniques in immunocytochemistry. V.2. / Eds. Bullock G.R. and Petrusz P. -London: Academic Press. 1983. P. 217-284.

443. Kursanov A.L., Thurkina M.V., Sokolov O.I,. Khulikova

444. A.L., Bogatirev V.A. Actin and myosin filaments from conducting tissues of Heracleum sosnowskyi // Plant Physiol. Biochem. 1987. V. 25(6). P. 689-696.

445. Poglazov B.F., Ivanov G.G., Metlina A.L. Chemicalsuturing of myosin and actin to capron fiber // Mol. Biol. 1976 V. 10. P. 175-81.

446. Lowey S., Slayter H.S., Weeds A.G., Baker H. Substructureof the myosin molecule I. Subfragments of myosin by enzymic degradation // J. Mol. Biol. 1969. V. 42. P. 129.

447. Stoschek C.M. Protein assay sensitive at nanogram levels // Anal. Biochem. 1987. V. 160. P. 301-305.

448. Valentine R. C., Green N. M. Electron microscopy of an antibody-hapten complex // J. Mol. Biol. 1967. V. 27. P. 615-617.

449. Jürgens L., Nichtl A., Werner U. Electron density imagingof protein films on gold-particle surfaces with transmission electiron microscopy // Cytometry. 1999. V. 37. P. 87-92.

450. Templeton A. C., Pietron J. J., Murray R. W., Mulvaney P.

451. Solvent refractive index and core charge influences on the surface plasmon absorbance of alkanethiolate monolayer- protected gold clusters // J. Phys. Chem. B. 2000, V. 104. P. 564-570.

452. Kelly K.L., Jensen T R., Lazarides A A., Schatz G C.

453. Metal nanoparticles: Synthesis, characterization and applications / Eds. Feldheim D., Foss C. -N.Y.: Marcel-Dekker, 2002. P. 89.

454. Birdi K.S. (Ed.) Handbook of Surface and Colloid Chemistry. Boca Raton: CRC Press. 2002.

455. Hubbard A. (Ed.) Encyclopedia of Surface and Colloid

456. Science. -N.Y.: Marcel-Dekker. 2002.

457. Fleer G.J., Cohen Stuart M.A., Scheutjens J.M.H.M.,

458. Cosgrove T., Vincent B. Polymers at Interfaces. -London: Chapman & Hall. 1993.

459. Kneipp K., Kneipp H., Itzkan I., et al. Surface-enhanced

460. Raman scattering and biophysics // J. Phys. Condens. Matter. 2002. V. 14. P. R597-R624.

461. Shalaev V.M. (Ed.). Topics in Applied Physics. Optical

462. Properties of Nanostructured Random Media. BerlinHeidelberg: Springer-Verlag. 2002.

463. Mullett W.M., Lai E. P. C., Yeung J.M. Surface plasmonresonance-based immunoassays // Methods. 2000. V. 22. P. 77-91.

464. Bao P., Frutos A.G., Greef Ch., Lahiri J., Muller U.,

465. Peterson T.C., Warden L., Xie X. High-sensitivity detection of DNA hybridization on microarrays using resonance light scattering // Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 1792-1797.

466. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Krasnov

467. Ya.M., Melnikov A.G. Optical properties of colloidal-gold bioconjugates // Izv. Vuz. Applied Nonlinear Dynamics. 2002. V. 10. No. 3' (Special English Issue). P. 172-187.

468. Ciesiolka T., Gabius H.-J. An 8 to 10 fold enhancement insensitivity for quantitation of proteins by modified application of colloidal gold // Anal. Biochem. 1988. V. 168. P. 280-283.

469. Englebienne P., van Hoonacker A., Verhas M. Highthroughput screening using the surface plasmon resonance effect of colloidal gold nanoparticles // Analyst. 2001. V. 126. P. 1645-1648.

470. Cosgrove T., Hone J.H.E., Howe A.M., Heenan R.K. A smallangle neutron scattering study of the structure of gelatin at the surface of polystyrene latex particles // Langmuir. 1998. V. 14. P. 5376-5383.

471. Vaynberg K.A., Wagner N.J., Sharma R., Martic P. Structure and extent of adsorbed gelatin on acrylic latex and polystyrene colloidal particles // J. Colloid. Interface. Sci. 1998. V. 205 P. 131-140.

472. Griffiths P.C., King S.M. Small-angle neutron scatteringstudies of adsorbed polymer layers // Encyclopedia of surface and colloid science / Ed. by. A. Hubbard. -N.Y.: Marcel Dekker. 2002. P. 4700-4717.

473. Seelen'meyer S., Ballauff M. Investigation of theadsorption of surfactants on the poly(styrene) latex particles by small-angle X-ray scattering // Macromol. Symp. 1999. V. 145. P. 9-20.

474. Martin J.M.C., Pâques M., van der Velden-de Groot T.A. M,

475. Beuvery E.C. Characterization of antibody labeled colloidal gold particles and their applicability in a sol particle immunoassay (SPIA) // J. Immunoassay. 1990. V. 11. P. 31-47.

476. Parfitt G.D., Rochester C.H. (Eds.) Adsorption fromsolution at the solid/liquid interface. -N.Y.: Academic Press. 1983.

477. Khlebtsov N.G., Dykman L.A., Krasnov Ya.M., Melnikov A.G.

478. In: Electromagnetic and Light Scattering by Nonspherical Particles: Theory and Applications / Eds. Obelleiro F., Rodriguez J. L., Wriedt T. -Vigo: Vigo Univ. Press. 1999. P. 43.

479. Dykman L.A., Krasnov Ya.M, Bogatyrev V.A., Khlebtsov N.

480. G. // In: Optical Technologies in Biophysics and Medicine II / Ed. Tuchin V.V., Proc. SPIE, V. 4241, Bellingham, Washington: SPIE Publ., 2001. P. 37.

481. Lyon L. A., Musick M. D., Natan M. J. Colloidal Auenhanced surface plasmon resonance immunosensing // Anal. Chem. 1998. V. 70. P. 5177-5183.

482. Wu Z.C., Wang Y.P. Electromagnetic scattering formultilayered sphere: recursive algorithms // Radio Sci. 1991. V. 26. N 6. P. 1393-1401.

483. Измайлова B.H., Ямпольская Г.П., Сумм Б.Д. Поверхностныеявления в белковых системах -М.: Химия. 1988.

484. Likos C.N., Vaynberg К.A., Lowen Н., Wagner N.J.

485. Colloidal stabilization by adsorbed gelatin // Langmuir. 2000 V. 16. P. 4100-4108.

486. Фихман Б.А. Микробиологическая рефрактометрия. -M.:1. Медицина. 1967.

487. Иоффе Б. Ф. Рефрактометрические методы химии. -JI.: Химия,1983.

488. Дмитриев Д.А., Массино Ю.С., Сегал 0.JI. и др. Анализсвязывания биспецифических моноклональных антител с иммобилизованными антигенами с помощью оптического сенсора // Биохимия. Т. 67. № 12. С. 1643-1654.

489. Englebienne P. Use of colloidal gold surface plasmonresonance peak shift to infer affinity constants from the interactions between protein antigens and antibodies specific for single or multiple epitopes // Analyst 1998. V. 123. P. 1599-1603.

490. Englebienne P., van Hoonacker A., Valsamis J. Rapidhomogeneous immunoassay for human ferritin in the Cobas Mira using colloidal gold as the reporter reagent // Clin. Chem. 2000. V. 46. P. 2000-2003.

491. Hainfeld J. F., Powell R. D. New Frontiers in Gold1.beling // J. Histochem. Cytochem. V. 48. P. 471-480. 2000.

492. Csäki A., Maubach G., Born D., Reichert J., Fritzsche W.

493. DNA-based Molecular Nanotechnology // Single Mol. 2002. 3. V. 5-6. P. 275-280.

494. Csäki A., Möller R., Fritzsche W. Gold nanoparticles asnovel label for DNA diagnostics // Expert Rev. Mol. Diagn. 2002. V. 2(2). P. 89-94.

495. Nanobiotechnology: Concepts, Applications and

496. Perspectives / Eds. Niemeyer C.M., Mirkin C.A. -Weinheim: Wiley-VCH, 2004. 491 p. 3 63 Плотников B.K. Генетико-физиологическая детерминацияраспада мРНК злаков in vitro // Усп. совр. биол. 2003. V. 123. Р. 98-109.

497. Glynou К., Ioannou P.C., and Christopoulos Т.К.,

498. Syriopoulou Oligonucleotide-Functionalized Gold Nanoparticles as Probes in a Dry-Reagent Strip Biosensor for DNA Analysis by Hybridization // Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 4155-4160.

499. Wu M., Davidson N. Transmission Electron Microscopic

500. Method for Gene Mapping on Polytene Chromosomes by in situ Hybridization // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1981. V. 78. P. 7059-7063.

501. Ulman A. Formation and Structure of Self-Assembled

502. Monolayers // Chem. Rev. 1996. V. 96. P. 1533-1554.

503. Parak W.J., Gerion .D., Pellegrino Т., Zanchet D., Micheel C., Williams S.C., Boudreau R., Le Gros M.A., Larabell C.A., Alivisatos A.P. Biological applications of colloidal nanocrystals // Nanotechnology. 2003. V. 14. P. R15-R27.

504. Markel V.A., Shalaev V.M., Stechel E.B., Kim W.,

505. Armstrong R.L. Small-particle composites. I. Linearoptical properties // Phys. Rev. B. 1996. V. 53. P. 2425-2436.3 69 Хлебцов Н.Г., Дыкман Jl.А., Краснов Я.М., Мельников А.Г. // Коллоидный журнал. 2000. V. 62. Р. 844-859.

506. Storhoff J.J., Lazarides A.A., Mucic R.C., Mirkin С.А.,1.tsinger R.L., Schatz G.C. What Controls the Optical Properties of DNA-Linked Gold Nanoparticle Assemblies? // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. P. 4640-4650.

507. Lazarides A.A. Schatz G.C. DNA-Linked Metal Nanosphere Materials: Structural Basis for the Optical Properties // J. Phys. Chem. B. 2000. V. 104. P. 460-467.

508. Khlebtsov N.G., Melnikov A.G., Bogatyrev V.A., Dykman

509. A. (2004) in Photopolarimetry in Remote Sensing (Videen, G., Yatskiv, Ya.S. Mishchenko, M.I. eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, II. V.161, P. 265308 .

510. Englebienne P., Van Hoonacker A., Verhas M., Khlebtsov

511. N.G. Biomolecular Interaction Monitoring in Real-Time with Colloidal Metal Nanoparticles // Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 2003. V. 6. P. 777-787.

512. McFarland A.D. Van Duyne R.P. Single Silver Nanoparticlesas Real-Time Optical Sensors with Zeptomole Sensitivity // Nano Lett. 2003.V. 3. P. 1057-1062.

513. Mirkin C.A., Letsinger R.L., Mucic R.C., Storhoff J.J.,

514. Elghanian R. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and used therefore // US Patent № 6,417,340. 2002.

515. Park S.Yo., Stroud D. Theory of the optical properties ofa DNA-modified gold nanoparticle system // Physica B. 2003. V. 338 P. 353-356.

516. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. -М.: Мир. 1984.

517. Zarudnaya M.I., Kolomiets I.M., Potyahaylo A.L., Hovorun

518. D.M. Downstream elements of mammalian pre-mRNA polyadenylation signals: primary, secondary and higherorder structures // Nucleic Acids Research. 2003. V. 31. P. 1375-1386.

519. Hansma H.G., Revenko I., Kim K., Laney D.E. Atomic force microscopy of long and short double-stranded, single-stranded and triple-stranded nucleic acids // Nucleic Acids Research. 1996. V. 24. P. 713-720.

520. Sato K., Hosokawa K., Maeda M. Rapid Aggregation of Gold Nanoparticles Induced by Non-Cross-Linking DNA Hybridization // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. P. 81028103.

521. Petrovykh D.Y.,. Kimura-Suda H., Whitman L.J., Tarlov M.J. Quantitative analysis and characterization of DNA immobilized on gold // J. AM. CHEM. SOC. 2003. V. 125. P. 5219-5226.

522. Mallin M.P., Murphy C.J. Solution-Phase Synthesis of Sub10 nm Au Ag Alloy Nanoparticles // Nano Lett., 2002. V. 2. P. 1235-1237.

523. Preparation, Characterization, and Enzymatic Activity // Langmuir. 2001. V. 17/. P. 1674-1679.

524. Gole A., Vyas S., Phadtare S., Lachke A., Sastry M.

525. Studies on the formation of bioconjugates of Endoglucanase with colloidal gold // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2002. V. 25. P. 129-138.

526. Wang Zh., Kanaras A.G., Bates A.D., Cosstick R., Brust M.

527. Enzymatic DNA processing on gold nanoparticles // J. Mater. Chem. 2004. V. 14. P. 578-580.

528. Чумаков М.И., Дыкман Jl.А., Богатырев В.А., Курбанова И.В.

529. Изучение внеклеточных структур агробактерий, участвующих в контактах с бактериальными и растительными клетками // Микробиол. 2001. Т. 70. No 2. С. 275-282. 3 90 Селиванов Н.Ю., Шкодина О.Г., Галицкая А.А., Богатырев

530. B.А., Игнатов В.В. Проточный ферментолиз пектиновых полисахаридов // Химия и технология растительных веществ. III Всероссийская конференция. Тез. докл. Саратов, изд. Саратовской губернской торгово-промышленной палаты. 2004. с. 33-34.

531. Hermann R., Walther P., Mtiller M. Immunogold labeling inscanning electron microscopy // Histochem. Cell Biol. 1996. V. 106. P. 31-39.

532. Faulk W., Taylor G. An immunocolloid method for theelectron microscope // Immunochemistry. 1971. V. 8. P. 1081-1083.

533. Polak J.M., Van Noorden I.M. Immunocytochemistry.

534. Practical applications in pathology and biology. -Bristol: Wright. 1983. 74 p.

535. Рехтер М.Д., Миронов А.А. Коллоидное золото в электронной микроскопии // Успехи современной биологии. 1990. Т. 109.1. C. 467-480.

536. Tokuyasu. Immunocryoultramicrotomy. In: Polak J.M.,

537. Varndell M (eds) Immunolabeling for electron microscopy / -Amsterdam: Elsevier. 1984. P. 71-82.

538. Lackie P.M. Immunogold silver staining for lightmicroscopy // Histochem. Cell Biol. 1996. V. 106. P. 917 .

539. Neagu C., van der Werf K.O., Putman C.A.J., Kraan Y.M.,de Grooth B.G., van Hulst N.F., Greve J. Analysis of immunolabeled cells by atomic force microscopy, optical microscopy, and flow cytometry // J. Struct. Biol. 1994. V. 112. P. 32-40.

540. Schuk P. Use of surface plasmon resonance to probe theequilibrium and dynamic aspects of interactions between biological macromolecules // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1997. V. 26. P. 541-566.

541. Schalkhammer Th. Metal nano clusters as transducers for bioaffinity interactions // Chem. Monthly. 1998. V. 129. P. 1067-1092.

542. Haes A. J., Stuart ;D. A., Nie S., Van Duyne R. P. Using

543. Solution-Phase Nanoparticles, Surface-Confined Nanoparticle Arrays and Single Nanoparticles as Biological Sensing Platforms // Journal of Fluorescence. 2004. V. 14 (4). P. 355-367.

544. Stuart D.A., Haes A.J., Yonzon C.R., Hicks E.M., Van

545. Duyne R.P. Biological applications of localised surface plasmonic phenomenae // IEE Proc. Nanobiotechnol. 2005. V. 152. P. 13-32.

546. Gribnau T.J.C., Leuvering J.H.W., van Hell H. Particlelabelled immunoassays. A review // J. Chromatogr. 1986. V. 176. P. 175-179.

547. Moeremans M., Daneels G., de Raeymaeker M., de Mey J.

548. Colloidal metal staining of blots // In: Handbook of1.munoblotting of Proteins, V. I / Eds. Bjerrum O.J., Heegaard N.H.H. -Orlando: CRC Press, 1988. P. 137-144.

549. Fowler S.J. The detection of proteins on blots using gold or immunogold. Review // Methods Mol. Biol. 1994. V. 32. P. 239-255.

550. Kurien B.T., Scofield R.H. Protein blotting: A review // J. Immunol. Meth. 2003. V. 274. P. 1-15.

551. Дзантиев Б.В., Жердев А.В., Попов В.О., Венгеров Ю.Ю.,

552. Старовойтова Т.А., Тогузов Р.Т. Системы экспрессной иммунодетекции биологически активных соединений // Клин, лаб. диагн. 2002. № 8. С. 25-32.

553. Han A., Dufva М,, Belleville Е., Christensen C.B.V. Detection of analyte binding to microarrays using gold nanoparticle labels and a desktop scanner // Lab. Chip. -2003. V.3. P. 329-332.

554. Новые методы иммуноанализа / под ред. Коллинза У.П. -М.:1. Мир. 1991. 280 с.

555. Chaiet L., Wolf F.J. The propertiesof streptavidin, abiotin-binding protein prodused by Streptomycetes // Arch. Biochem. Biophys. 1964. V. 106. P. 1-5.

556. Егоров A.M., Диков M.M. Структура и механизм действия антител // Ж. Всес. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. 1982. Т. 27. С. 381-388.

557. Juarez-Salinas Н., Ott G.S. Process for binding IgG to protein A // US Patent № 4704366, 1987.

558. Horisberger M., Rosset J., Bauer H. Colloidal goldgranules as markers for cell surface receptors in the scanning electron microscope // Experientia 1975. V. 31 P 1147-1149.

559. Walther P, Ariano BH, Kriz SR, Muller M High resolution

560. SEM detection of protein-A gold (15 nm) marked surface antigens using backscattered electrons // Beitr.

561. Elektronenmikroskop Direktabb. Oberfl. 1983. Bd. 16 S. 539-545.

562. Walther P., Muller M. Detection of small (5-15 пш) goldlabeled surface antigens using backscattered electrons. In: The science of biological specimen preparation // SEM Inc., AMF O'Hare. 1986 P. 195-201.

563. Nagatani Т., Saito S., Sato M., Yamada M. Development ofan ultrahigh resolution scanning electron microscope by means of a field emission source and in-lens system // Scanning Microsc. 1987. V. 1. P. 901-909.

564. Erlandsen S.L., Frethem C., Autrata R. Workshop on highresolution immunocytochemistry of cell surfaces using field emission SEM // J. Histochem. Cytochem. 1990. V. 38. P. 1779-1780.

565. Muller M., Hermann R. Towards high resolution SEM ofbiological objects. In: Peachy LD, Williams DB (eds) Proceedings of the Xllth International Congress of Electron Microscopy. V. 3. -San Francisco: San Francisco Press. 1990. P. 4-5.

566. Hermann R., Schwarz H., Muller M. High precision im-munoscanning electron microscopy using Fab fragments coupled to ultra-small colloidal gold // J. Struct. Biol. 1991. V. 107. P. 38-47.

567. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Matora L.Yu., Schwartsburd

568. B.I. The serotyping of Azospirillum Spp by cell gold immunoblotting // FEMS Microbiol. Lett. 1992. V. 96. No 2-3. P. 115-118.

569. Матвеев В.Ю., Богатырев В.А., Дыкман JI.А., Матора Л.Ю.,

570. Lloyd C.W. The plant cytoskeleton: the impact offluorescence microscopy // Annu. Rev. Plant Physiol. 1987. V. 38. P. 119-139.

571. Lachapelle M., Aldr.ich H.C. Phalloidin gold complexes:

572. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методыэлектронной микроскопии в биологии и медицине / С.-Пб.: Наука. 1994. 400с.

573. Danscher G., Norgaard J.O.R. Light microscopicvisualization of colloidal gold on resin-embedded tissue // J. Histochem. Cytochem. 1983. V. 31. P. 1394-1398.

574. Birrel G.B., Hedberg K.K. Immunogold labeling with smallgold particles: Silver enhancement provides increaseddetectability at low magnifications // J. Electron Microsc. Techn. 1987. V. 5. P. 219-220.

575. Sonnichsen C., Alivisatos A.P. Gold Nanorods as Novel

576. Nonbleaching Plasmon-Based Orientation Sensors for Polarized Single-Particle Microscopy // Nano letters. 2005. V. 5. P. 301 304.

577. Практическая химия белка / под ред. Дарбре А., -М.: Мир,1989. 621 с.

578. Khlebtsov N.G., Trachuk L.A., Melnikov A.G. Effect of thesize, shape, and structure of metal nanoparticles on the dependence their optical properties on the refractive index of the external medium // Opt. Spectrosc. 2005, V. 98. P. 82-89.

579. Mock J.J., Smith D.R., Schultz S. Local refractive index dependence of plasmon resonance spectra from individual nanoparticles // Nano Lett. 2003. V.3. P. 485-491. 435 Vale R.D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular

580. Transport // Cell 2003. V. 112. P. 467-480. 4 36 Соколов О.И. Актиновый цитоскелет высших растений:структура и функции / Диссертация на соискание ученой степени д.б.н. -Саратов: 2002. 232 с.

581. Соколов О.И., Богатырев В.А., Туркина М.В. Миозин изпроводящих тканей Heracleum sosnovskyi: взаимодействие с мышечным актином и образование филаментов // Физиология растений. 1986. Т. 33. С. 421-431.

582. Turkina M.V., Kulikova A.L., Sokolov O.I., Bogatyrev

583. V.A., Kursanov A.L. Actin and Myosin from the Conducting Tissues of Heracleum sosnowskyi // Plant Physiol. Biochem. 1987. V. 25. P. 886-982.

584. Haes A.J., Zou S., Schatz G.C., Van Duyne R.P. A

585. Nanoscale Optical Biosensor: The Long Range Distance Dependence of the Localized Surface Plasmon Resonance of

586. Noble Metal Nanoparticles // J. Phys. Chem. B. 2004. V. 108. P. 109-116.

587. Haes A.J., Zou S., Schatz G.C., Van Duyne R.P. Nanoscale

588. Optical BiosensorShort Range Distance Dependence of the Localized Surface Plasmon Resonance of Noble Metal Nanoparticles // J. Phys. Chem. B. 2004. V. 108. P. 69616968.

589. Стародуб Н.Ф., Артюх В.П., Назаренко В.И., Коломиец Л. И.

590. Белковый иммуноблот и иммунодот в биохимических исследованиях // Украинский биохимический журнал. 1987. Т. 59. С. 108-120.

591. Galimand М., Vieille С., Perroud В., Onyeocha I.,

592. Elmerich С. Advances in genetics of Azospirillum brasilense Sp 7: ube of Tn5 mutagenesis for gene mapping and identification / Azospirillum IV: Genetics, Phyziology, Ecology. -Berlin, Haidelberg: Springer Verlag. 1988. P. 1-9.

593. Matthysse A.G. Role of bacterial cellulose fibrils in

594. Agrobacterium tumefaciens infection // J. Bacterid. 1983. V. 154. P. 906-915.

595. Vanstockem M., Milcamps A., Michels K., Vanderleyden J.,

596. Van Gool A.P. Tn5-mutagenesis in Azospirillum brasilense / Azospirillum IV : Genetics, Phyziology, Ecology /Ed. W. Klingmuller, -Berlin: Springer-Verlag. 1988. P. 32-39.

597. Leuvering J.H.W., Thai P.J.H.M., van der Waart M.,

598. Schuurs A.H.W.M. Sol particle immunoassay (SPIA) // J. Immunoassay. 1980. V. 1. P. 77-91.

599. Sorensen C.M. Light Scattering by Fractal Aggregates: A Review // Aerosol Sci. Technol. 2000. V. 35. P. 648-687.

600. Souza G.R., Miller J.H. Oligonucleotide detection usingangle-dependent light scattering and fractal dimension analysis of gold-DNA aggregates // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 6734-6735.

601. Thi N., Thanh K., Rosenzweig Z. Development of an Aggregation-Based Immunoassay for Anti-Protein A Using Gold Nanopartides // Anal. Chem. 2002. V. 74. P. 16241628 .

602. Liu J. Lu Yi. A Colorimetric Lead Biosensor Using

603. DNAzyme-Directed Assembly of Gold Nanoparticles // J. Am. Chem. Soc. 9. 2003. V. 125. P. 6642-6643.

604. Storhoff J.J., Mirkin C.A. Programmed Materials Synthesiswith DNA // Chem. Rev. 1999. V. 99. P. 1849-1862.

605. Niemeyer C.M. Nanoparticles, Proteins, and Nucleic Acids:

606. Biotechnology Meets Materials Science // Angew. Chem. Int. Ed. 2001. V. 40. P. 4128-4158.

607. Hilliard L.R., Zhao X., Tan W. Immobilization ofoligonucleotides onto silica nanoparticles for DNA hybridization studies // Anal. Chim. Acta. 2002. V. 470. P. 51-56.

608. Pan Т., Uhlenbeck О.С. A Small Metalloribozyme with a Two-Step Mechanism // Nature. 1992. V. 358. P. 560-563.

609. Breaker R.R., Joyce G.F. A DNA enzyme that cleaves RNA //

610. Chem. Biol. 1994. V. 1. P. 223-229.

611. Cuenoud В., Szostak J.W. A DNA metalloenzyme with DNAligase activity. Nature 1995, 375, 611-614.

612. Carmi N., Shultz L.A., Breaker R.R. In vitro selection ofself cleaving DNAs // Chem. Biol. 1996. V. 3. 1039- 1046.

613. Li J., Zheng W., Kwon A. H., Lu Y. In vitro selection andcharacterization of a highly efficient Zn(II)-dependent RNA-cleaving deoxyribozyme // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 481-488.

614. Santoro S.W., Joyce G.F., Sakthivel K., Gramatikova S.,

615. Barbas C.F., III. RNA Cleavage by a DNA Enzyme with Extended Chemical Functionality // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. P. 2433-2439.

616. Breaker R.R. Engineered allosteric ribozymes as biosensorcomponents // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. 13. P. 31-39.

617. Breaker R.R. In vitro selection of catalyticpolynucleotides //Chem. Rev. 1997. V. 97. P. 371-390.

618. Joyce G. F. In The RNA World, 2nd ed., Gesteland, R. F.,

619. Cech, Т. R., Atkins, J. F., Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, -N.Y.: 1999. V. 37. P. 687-689.

620. Егоров A.M., Диков М.М. Структура и механизм действияантител // Журн. ВХО им. Менделеева. 1982. Т. 27. № 4. С. 381-388.

621. Lazarides A.A., Kelly L.K., Jensen T.R., Schatz G.C.

622. Optical properties of metal nanoparticles and nanoparticle aggregates important in biosensors // Theochem. 2000. V. 529. P. 59-63.

623. Schatz G.C. Electrodynamics of nonspherical nobelnanoparticles and nanoparticle aggregates // Theochem. 2001. V. 573. P. 73.

624. Lazarides A.A., Schatz G.C. DNA-linked metal nanospherematerials: Fourier-transform solutions for the optical response // J. Chem. Phys. 2000. V. 112. P. 2987- 2993.

625. Kelly K.L., Lazarides A.A., Schatz G.C. Computational

626. Electromagnetics of Metal Nanoparticles and Nanoparticle Aggregates // Computing in Science & Engineering. 2001. V. 3. P. 67-73.

627. Lazarides A.A., Kelly K.L., Schatz G.C. Effective Medium

628. Theory of DNA-linked Gold Nanoparticle Aggregates: Effect of Aggregate Shape // Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 2001. V. 635. P. C.6.5.1-10.

629. Draine B.T., Goodman J.J. Beyond Clausius-Mossotti Wavepropagation on a pölarizable point lattice and the discrete dipole approximation // Astrophys. J. 1993. V.405. P. 685-697.

630. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Krasnov Ya.M., Plotnikov

631. Markel V.A., Muratov L.S., Stockman M.I., George T.F.

632. Theory and numerical simulation of optical properties of fractal clusters // Phys. Rev. B. 1991. V. 43. P. 81838195.

633. Tsai D.R., Kovacs J., Wang Zh., Moskovits M., Shalaev

634. V.M., Suh J.S., Botet R. Photon scanning tunneling microscopy images of optical excitations of fractal metal colloid clusters // Phys. Rev. Lett. 1994. V.72. P. 41494152.

635. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновыхкислот /-М.: Мир, 1987. 584 с.

636. Niemeyer С. М. Self-assembled nanostructures based on

637. DNA: towards the development of nanobiotechnology // Cur. Op. in Chem. Biol. 2000. V. 4. P. 609-618.

638. Kohler J.M., Csäki A.; Reichert J., R. Möller W.F.,

639. Straube W. Selective labeling of oligonucleotide monolayers by metallic nanobeads for fast optical readout of DNA-chips // Sensors and Actuators B. 2001. V. 76. P. 166-172.

640. Niemeyer C.M., Ceyhan В., Hazarika P. Oligofunctional

641. DNA-Gold Nanoparticle Conjugates // Angew. Chem. Int. Ed. 2003. V. 42. P. 5766 -5770.

642. Taton T.A., Mirkin C.A., Letsinger R.L. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes // Science. 2000. V. 289. P. 1757-1760.

643. Ma Z., Sui S.-F. Naked-eye sensitive detection ofimmunoglubulin G by enlargement of Au nanoparticles in vitro // Angew. Chem. Int. Ed. 2002, V. 41, P. 2176-2179.

644. Oldenburg S.J., Genick С.С, Clark К.A., Schultzb D.A.

645. Base pair mismatch recognition using plasmon resonant particle labels // Anal. Biochem. 2002. V. 309. P. 109116.

646. Zhao H.Q., Lin L., Li J.R., Tang J.A., Duan M.X. Jiang L.

647. DNA biosensor with high sensitivity amplified by gold nanopartides // J. Nanopart. Res. 2001. V. 3. P. 321323.

648. Liu Т., Tang J., Zhao H., Deng Yo., Jiang L. Particle

649. Size Effect of the DNA Sensor Amplified with Gold Nanoparticles // Langmuir. 2002. V. 18. P. 5624-5626.

650. Stevenson K.A., Muralidharan G., Maya L., Wells J.C.,

651. Barhen J., Thundata T. Covalent Attachment of Gold Nanoparticles to DNA Templates // J. Nanosci. Nanotech. 2002. V. 2. P. 397-404.

652. Plotnikov V.K., Bakaldina N.B. Differential stability of zein mRNA in developing corn kernel // Plant. Mol. Biol. 1996. V. 31. P. 507-515. 4 93 Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Бибишев В.А. Способдиагностики физиологического состояния зерновых культур

653. Российский патент на изобретение № 2084133 от 20 июля 1997 г.

654. URL: http://ibppm.saratov.ru/katalog.html