Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез белков хлопчатника в экстремальных температурных условиях и водном дефиците

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез белков хлопчатника в экстремальных температурных условиях и водном дефиците"

ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ АН РУз

На правше рукописи.

УДК 581.19:577.122:58.03:633.51)

УСМА1ЮВ РУСТАМ МАХМУДОВИЧ

БИОСИНТЕЗ БЕЛКОВ ХЛОПЧАТНИКА В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУРНЫХ УСЛОВИЯХ И ВОДНОМ ДЕФИЦИТЕ

03.00.12 - физиология достенкП 03.00.04 - бнохииия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ташкент 1997

Работа выполнялась в лаборатории люлекулярной генетики хлопчатника и лаборатории водного обмена и засухоустойчивости хлопчатника Института экспериментальной биологии растений НПО "Биолог" АН Руз.

Официальные оппоненты

Член-корреспондент АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук, профессор Якубова М.М.

Член.-корреспондент УзАСХН, доктор биологических наук Рахманкулов С.Р. Доктор биологических наук, Шалманов Р.К.

Ведущее учреждение: Ташкентский Государствепщт Университет

Защита диссертации состоится , 1997г.

в часов на заседании Специализированного совета Д 015.80.01 по

лрисуадению,ученой степени доктора биологических наук при Институте Генетики АН РУз. ('702151, Ташкентская область, Кибрайский район, п/о Юкори-Юз).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Генетики АН РУз. , ( , ' '

Автореферат разослан и ¡3 " ^Я^угЛ-ЯЛ' . 1997г.

Ученый секретарь Специализированною совета, доктор биологических наук

нусханов Ш.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Адаптация к постоянно меняющимся условиям внешней среды является важнейшим отличительным свойством псех живых организмов. Любое отклонение от оптимальных условий приводит к глубоким изменениям в протекании многих физиолого-биохимических процессов, обратимость которых зависит как от глубины и продолжительности стрессового воздействия, так и от индишщуалышх особенностей организма.

Ухудшающаяся экологическая обстановка вследствии загрязнения окружающей среды, дефицита влаги, засоления почв и т.д. делает проблему адаптации одной из самых актуальных как с теоретической, так и с практической точек зрения, так как существует взаимосвязь между потенциальной продуктивностью и приспособительными возможностями растений. Сложившаяся неблагоприятная обстановка диктует необходимость создания новых сортов, способных без существенного ущерба переносить экстремальные условия среды, а также разработки технологий выращивания, снижающих нк негативное воздействие. Целенаправленные работы в этом направлении невозможно проводить без знания молекулярных и физиолого-биохимических механизмов адаптационного процесса.

В настоящее время установлено, что адаптивные перестройки контролируются геномом клетки путем репрессии и лерспресеип отдельных генов, в результате чего происходят изменения в транскрнпционно-трансляционной активности, количественном содержании и качественном составе мРНК к белков.

Большие >спехи в иследованиях молекулярных механизмов адаптационных процессов были достигнута благодаря открытию белков теплового ыока (ЫIII), синтез которых индуцируется в условиях экстремально высоких темпера 1>р (АМтЬигпег, 1970, Т^егй е! а|., 1974). Впоследствии было показано, чт образование стрессовых белков в ответ на неблагоприятное воздействие предсивтяет собой универсальный одаптнвный ответ, характерный для всего многообразия живого от бактерий до человека (АИзсЬикг, \1ascarenhas, 19Я2).

Хотя проведенные в последние годи исследования свидетельствуют о существовании связи устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды с синтезом белков, в настоящее время нет определенного мнения о механист реализации такой связи. Наряду .с зек, что пыяачены конкретные функции отдельных стрессовых белков, следует отмстить, что п большинстве рай»!, касающихся изменений в синтезе белков, показана корреляция этих процессов и очень маю известно о неносредстегшюм участии стрессовых белков * адаишжи растений. В то же рремя более стабильный и чысокий уровень нелоксинтезирукиией активности у устойчншк растений по сравнению с неустойчивыми, специфические особенности инлуинроваиия стрсссптд

белков у контрастных форм дают основание предполагать о тесной взаимосвязи синтеза белков с формированием устойчивости. Об этом свидетельствуют многочисленные работы с применением различных ингибиторов транскрипции и трансляции. Однако конкретные биохимические механизмы участия большинства образующихся стрессовых белков неизвестны.

К настоящему времени показано, что стрессовые белки образуются в ответ на многие неблагоприятные воздействия - низкие температуры, тепловой и осмотический шок, засуху и т.д. Установлены некоторые закономерности их образования - триггерный характер, тратитность, зависимость от величины и длительности воздействия, кинетика и локализация.

Хлопчатник в этом отношении изучен в значительно меньшей степени. Лишь а последние годы в литературе появились разрозненные и фрагментарные работы, посвященные этой проблеме (Вигке е1 а1. 1985, Кузнецов и др. 1990, РагИасИ, Мл\, 1990). В этой-связи проведение исследований реакции генома хлопчатника на такие стрессовые воздействия как низкие положительные температуры, засуху и тепловой шок, индукции синтеза специфических белков в этих условиях могли бы способствовать пониманию биохимических и молекулярно-биологических механизмов устойчивости. С другой стороны, исследования синтеза стрессовых белков представляют теоритический интерес, так как такие индуцибельные системы представляют собой удобную модель для выяснения регуляторных механизмов дифференциальной активности генома.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение влияния экстремальных температурных воздействий (низкие положительные температуры, тепловой шок) и дефицита влаги на синтез белков различных органов хлопчатника, а также особенностей протекания этого процесса у отдельных представителей видов хлопчатника, приспособленных к разным экологическим условиям произрастания. Исходя из этого ставились следующие задачи:

-изучение влияния пониженных температур на некоторые физиологические процессы 2-х дневных проростков хлопчатника;

-изучение влияния температурных стрессов на белоксинтезирукмцую активность и компонентный состав белков хлопчатника 2-х дневных проростков, семядольных листьев и созревающих семян;

-идентификация стрессовых белков, синтезирующихся в экстремальных 1е»)пературных условиях, выяснение кинетики и локализации их синтеза;

-выявление особенностей синтеза белков теплового шока у различных по и шйчивосш сортов хлопчатника;

-определение влияние дефицита влаги на биосинтез белков в различные т риоды онтсненеза в естественных и моделируемых условиях засухи;-

изучение некоторых биохимических процессор в созревающих семенах л'1<>ич»гш!ка в норме и в неблагопрняшмх условиях среды.

Научная новизна. Проведено комплексное исследование влияния экстремальных температур и водного дефицита на синтез белков п различных органах хлопчатника. Показано, что интенсивность синтеза белков зависит 01 температуры, длительности неблагоприятного фактора, возраста и генотипа растения.

Впервые выявлены стрессовые белки хлопчатника, синтез которых индуцируется низкотемпературным воздействием. Обнаружены качественные различия в составе синтезирующихся белков двух изученных сортов хлопчатника (О.ЫгеиШпд н О.ЬагЪаскше) в холодовых условиях.

Показано, что низкие положительные температуры и тепловой шок индуцируют синтез различных стрессовых белков.

Установлено, что основные компоненты БТШ, синтезирующиеся в условиях теплового шока в прорастающих и созревающих семенах, 2-х дневных корешках и семядольных листьях, идентичны по молекулярной массе. Не обнаружена видоспецифичность в компонентном составе основных БТШ у 3 изученных видов хлопчатника.

С помощью ингибиторного анализа получены доказательства того, что синтез отдельных БТШ осуществляется в митохондриальной белоксинтезируюшей системе.

Выявлена временная зависимость синтеза индивидуальных компонентов БТШ, а также видовые различия в кинетике синтеза отдельных БТШ при кратковременном воздействии теплового шока.

Основные положения, выносимые па защиту;

1,Низкие положительные температуры и тепловой шок оказывают ингибирующее влияние на биосинтез белка во всех изученных стадиях онтогенеза. Белоксинтезируюшая активность различных органов хлопчатника свидетельствует о большей толерантности представителей вгаа О. ЫгсШшп к холодовому воздействию к О.ЬагЬаскпве - к высокотемпературному стрессу.

2.0тветная реакция генома хлопчатника на низкие положительные температуры и тепловой шок выражается в индукции разных групп температурочувствительных генов и синтезе качественно различных стрессовых белков.

З.Отсутствие видо- и органоспецифичности в компонентом составе БТШ Локализация генов отдельных белков комплекса БТШ в. геноме митохондрий н видоспецифичность в кинетике синтеза отдельных компонентов при кратковременном тепловом шоке.

¿Умеренный дефицит Л1аги не оказывает существенного влияния на общий синтез белка созревающих семян и качественный состав синтезирующихся за пасных белков.

Иаучш-пракпыческая значимость работы. Полученные результата раскрывают некоторые особенности ответных реакций хлопчатника двух видов в неблагоприятных условиях среды на молекулярном уровне. Обнаруженные различия в интенсивности общего синтеза белков, составе стрессовых белков при низкотемпературном воздействии, кинетике синтеза отдельных компонентов БТШ при кратковременном тепловом шоке у различных видов хлопчатника имеют важное значение в понимании молекулярных механизмов адаптационного процесса, при разработке критериев устойчивости, а также поиске путей направленного повышения адаптивного потенциала хлопчатника.

Полученные результаты при выявлении белков, индукция синтеза которых осуществляется как на определенной стадии онтогенеза (синтез запасных белков), так и при воздействии экстремальных факторов среды (стрессовые белки), могут служить основой для идентификации, выделения и клонирования кодирующих их генов, изучения молекулярно-генетических механизмов регуляции генетической активности.

Работа выполнялась в лаборатории молекулярной генетики хлопчатника и лаборатории физиологии водообмена и засухоустойчивости хлопчатника НПО "Биолог" АН РУз, руководителям которых чл.-корр. АН РУз Ибрагимову А.П. и чл.-корр. УзАСХН Самневу X. выражаю искреннюю благодарность за помощь и содействие при выполнении данной работы.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на II, III, IV, V конференциях биохимиков Средней Азии и Казахстана (Фрунзе, 1976, Душанбе, 19SI, Ашхабад 1986, Ташкент, 1991); на V съезде ВОГиС (Москва, 1987); II съезде ВОФР (Минск 1991); 1 съезде УзОФР (Ташкент 1991); Goklen jubilee symposium (Mew Delhi, India, 1991);

Biochemical society congress, (Turkey, 1994), Frontiers in sexual plant reproduction research. International Association (1994, Austria, Vienna); на научной конференции " Биологические основы оптимизации скороспелости и продуктивности растений" ( Ташкент, 1996 ).

Диссертация обсуждена и одобрена на заседании Ученого совета ИНЭБР АН РУз (протокол N> 8 от 20 июня 1995г.), на совместном заседании кафедр физиологии растений, биохимии и биофизики биолого-почвенного факультета ГашГУ, объединенном научном семинаре лабораторий химии хлопчатника, физико-химических методов исследования, химии ферментов, химии белков и пептидов ИГ»ОХ им. A.C. Садмксва АН РУз, совместном семинаре лабораторий

■биохимии белка, биохимии лнпидов и молекулярной биологии unci тута биохимии АН РУз, заседании Ученого совета института генетики АН РУз.

машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и рекомендаций. Иллюстративный материал включает 36 рисунков и 19 таблиц. Список литературы содержит 370 источников.

Объект, асслс.чокчшй. В работе были исиальювани следующие сорта хлопчатника: 108-Ф, 175-Ф, Юлдуз, АН-Баяуг-2, АН-415, С-6524 вида Со&уршш ШгздШш; С-6037, Лш-25. вида Ооззуршт ЪлЛЫепйе; С-7085 вида Оо^уршш кегЬасеиш. Материалом исследований служили двухдневные прорастающие семена, семядольные и настоящие листья, а также созревающие семена различного возраста.

14 дневные проростки хлопчатника переносили а факторосгатные камеры с гемперагурой 15°, 10° и 5° С на различные интервалы времени.

Влияние высокотемпературного воздействия. 10 мм корешки и семядоли двухдневных прорастающих семян, высечки из семядольных листьев )4-дневных проростков и разновозрастные семена подвергали ноздейатш повышенных температур - 3.4°, 36°, 39°, 42° а 45° С - в течении 2 часов.

прорастающими семенами и 14-дневным и проростками водный дефицит создавали с помощью 14% (вес/объем) раствора ПЭГ. Дефицит влаги в вариантах со взрослыми растениями, выращенными в вегетационных сосудах, создавали путем снижения нормы тюлива до 50%; в полевых условиях - прекращением полива на различные периоды времени.

Мечение белков после воздействия холода и волною дефицита осуществляли путем погружения прорастающих и созревающих семян (беа кожуры) и высечек листьев в водный раствор 358-метионина (2-6 МКк), содержащем I мМ PMSF на 2-3 ч. при 28° С. Мечение белков при высокотемпературном воздействий проводили в водном растворе }5S-MeTiioiiilna при указанных температурах в течении 2 ч. Определение включения метьи в белки проводили по методу Mans, Novelly, (1961). Радиоактивность просчитывали на ещншиллишюнном счетчике " Как Bella LKB "(Швеция) и СКС-20 (СССР). Брали среднее значение из 5 гюпгорностей в пределах опыта.

Кинетика синтеза белков теплового moka. Первичные корешки подьерш.ш воздействию тепловою шока ( 39" С) в течении различною периода -времени - 5,

Материал и методы

2-х дневные прорастающие семена, а также

В модельных опытах с 2-дневными

lü, 15, 30, 60 и 120 мин. По окончании инкубации, белки метили в течения 2 ч. при 28° С.

Локализация синтеза БГШ. Определение локализации синтеза БТШ проводили по методу Nebiolo, White, (1985) с использованием 1мМ хлорамфеникола.

Выделение легкорастворимых белков проводили в 50 мМ Трис HCl буфере (pH 7,5), содержащем ImM PMSF. Количественное содержание легкорастворимых белков определяли по методу Lowry et al., (1951).

Выделение суммарных белков проводили ло ХЛп et al. (1984). Количественное содержание суммарной фракции белков определяли по Sliaiher, Weissman (¡973).

Водо-и солерастворимые белки и 7S глобулин выделяли по методу Ибрагимова и др. (1969). Иммуннохимический анализ проводили методом двойной иммуннодиффузии (Конарев 1973) на пластинках 1% агарового геля.

Электрофорез суммарных белков прорастающих и созревающих семян, двухдневных корешков и семядольных листьев проводили в пластинках геля по методу Laeramly (1971) с некоторыми модификациями (Скаженннк и др. 1981). Использовали различные концентрации ПААГ-10%, 12%, градиенты концентрации геля - 10-15%, 12-15% ПААГ.

Выявление на электрофореграммах зон псшшептидов, содержащих радиоактивность, проводили по методу Bonner, Laskey,(1974). Гели высушивали на гельдрайере на бумаге "Watmann ЗММ". Высушенные гели .экспонировали с рентгеновской пленкой "FM-B" • при -20°С. Время экспонирования варьировало в зависимости от нанесенного на гель количества радиоактивности от одной до четырех недель. Денситограммы электрофореграми и радиоавтографов получали с помощью денситометров "Карл Цейс" (ГДР) и "Ultrascan" (Швеция).

Полисомы из созревающих семян выделяли в буфере с высокой ионной силой по методу Larkins et al. (1976). Профиль полисом получали с помощью улырацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы - 12,5-50% (вес/вес). Выделение суммарной и полисомалыюй РНК проводили по методу Verma et al. (1974). Поли-А содержащую мРНК выделяли методом афинной хроматографии на колонке поли-У- сефарозы 4В ("Pharmacia") по Aviv, Leder, (1972).

Матричную активность выделеных поли-А мРНК определяли в бесклеточной бадоксинтезируюшей системе зародышей пшеницы.

Элегрофорешческий анализ продуктов трансляции поли-А мРНК пропалили но Weher, ОьЬогп/(1969) в 10% ПААГ.

Мл!елшическую обработку полученного материала проводили с помощью ПК по программе "Лексикон" и "Microsoft Excel".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние хтодопого стресса на хлопчатник на ранних стадиях онтогенеза.

1.1. Синтез белков в двухдневных проростках хлопчатника.

Активный рост н развитие сельскохозяйственных культур ограничивается не только средними климатическими показателями, но и короткими периодами воздействия неблагоприятных факторов среды. Часто наблюдаемое похолодание в весений период, особенно при ранних посевах, приводит к задержке роста н развития хлопчатника, к сдвигу в прохождении ее отдельных фаз в сторону ira удлшшения и в конце концов к потерян в урожайности. В результате проведенных исследований нами было установлено, что по интенсивности роста и накоплению белка сорта вида G.hirsvtvm проявляют большую толерантность к холодовому воздействию по сравнению с сортами G.barbadense. Учитывая то, 'по устойчивость к неблагоприятным условиям среды является генетически детерминированным признаком н контролируется геномом клетки путем активации и деактивации генетической активности нами были проведены исследования влияния низких положительных температур на синтез белков хлопчатника на ранних стадиях онтогенеза.

Околонулевые и даже отрицательные температуры не прекращают синтез белков в растениях, хотя и приводят к его значительному ингибированию (Войников и др., 1986).

Поступление радиоахтивного предшественника в корешки при 15° и 10° С составляло 50% от уровня контроля и не зависало ни от вида хлопчатника ни от продолжительности холодового стресса. Дальнейшее снижение (до 5° С) несколько уменьшает поступление 35S-MeTifoHima в ткани.

Сходная картина наблюдается и при инкубации семядолей в указанных условиях. Однако следует отметить, что поступление метки в ткани семядо'тей G.hirsutum и G.barbadense за 24 и 48 часов незначительно превынтс аналогичные показатели, наблюдаемые у первичных корешков.

5 10 15 28 С«

Температура

Рис.1 Включение 355-метионина в белки хореииков и семядолей прорастающих семян хлопчатника сорта 108-Ф при 24 часовом воздействии низких положительных температур.

Наибольшее влияние холодовое воздействие оказывает на включение радиоактивного предшественника в белки прорастающих семян. На рис. 1 и 2 показана динамика биосинтеза белков при 28°, 15°, 10° и 5° С в семядолях и зародышевых корешках сортов 108-Ф и С-6037.

24 часовое прорастание при 15° и 10° С приводит к снижению уровня включения метки (84 и 74% от уровня контроля соответственно) и резкому падению синтеза белка в корешках сорта 108-Ф при 5° С - менее 30% включения по сравнению с контролем. (Рис. 1). 48 часовое холодовое воздействие привело к дальнейшему снижению включения метки , в ТХУ-нер'астворимый осадок во всех анализированных температурных режимах. Максимальное подавление белоксинтезируюшей активности (по включению радиоактивной метки) наблюдалось при 48 часовом воздействии 5° С температуры, и составляло всего 23% от уровня контроля.

о о

§

о

£ X

1М> 80 8070-

4-Л

«г-

¿г:

в* .. . ^ ь*^

Вкорешки Осемядоли

5 10 15 28 С°

Температура

Рис. 2. Включение 355-метионина в белки корешков и семядолей двухдневных проростающих семян хлопчатника сорта С-6037 при 24 часовом воздействии низких положительных температур.

Синтез белков в прорастающих семядолях, хотя и в меньшей степени, также подавляется. Длительность экспозиции при низких температурах на семядолях, в отличие от корешков, на данном показателе практически не отражалась.

Сходная картина наблюдается при низкотемпературном воздействии на прорастающие семена сорта С-6037 вида СЛшЬайепье (рис.2). Ингибирование синтеза белков в корешках и семядолях при 15° и 10" С происходит уже за 24 ч. экспозиции, причем в корешках в большей степени чем н семядолях.

При более длительном воздействии (48 ч.) указанных температур наблюдается дальнейшее снижение белоксинтезирующей активности в корешках, тогда как н семядолях в тех же температурных условиях интенсивность синтеза белка остается на прежнем уровне.

Наиболее существенные изменения биосинтетических процессов а проростках происходят при 5° С. 5-кратное снижение синтеза белков в корешках наблюдается при 24 часовой экслозннии. 2 х суточное воздействие

69

604

40

X

20

10

■а

О-

приводит к еще большему ингибпрованию белоксинтезирующей активности (до 19% от контроля).

При сопоставлении данных рис. 1-2 можно прийти к заключению, что (ленень ншнбирошшш синтеза белков в прорастающих семенах сорта С-6037 G.barbadense выражена в большей степени, чем у сорта 108-Ф вида G.hirsutum.

Аналогичные исследования проведенные нами на прорастающих семенах ярус их представителей видов G.hirsutum и G.barbadense выявили ту же закономерность.

1.2. Влияние холодового стресса на синтез белков семядольных листьев.

Метаболические процессы в молодых семядольных листьях, как и в прорастающих семенах, замедляются. В табл. 1 приведены данные по поступ-иению радиоактивного мешонина в семядольные листья двух видов хлопчатника при 28°, 15°, 10° и 5° С.

Снижение температуры уменьшает поступление 35S-Menionnna в ткани семядольных листьев, причем приблизительно в одинаковой степени как для copia вида G.hirsutum, так и для сорта вида G.barbadense.

Таблица 1.

Поступление 358-мет)юнина в семядольные листы! 14 дневных проростков чмончатиика сортов 108-Ф и С-6037 при 24 и 48 часовом воздействии пониженных температур (имл./лшн. мг. ткана к 10"3).

Сорт Темпе 24 часа %от 48 часов % от

рагура контр. KOllrp.

28 863,40±32,20 782,20±33,00

108-Ф 15 748,60±30,10 86,70 620,20±29,00 79,30

10 474,00±19,20 54,90 376,70±19,10 48,10

5 346,20112,00 40,10 304,30*21,00 38,90

28 934,90±36,00 845,60*43,00

С-6037 15 779,60*21,00 83,40 686,60ir2 J,00 81,20

10 527,20tl9,00 56,40 402,50120,00 47,60

5 366,40±17,00 ■ 39,20 317,90í 13,00 37,60

1>-0,05

С.' ¡¡|1>юи сюроны. анализ данных I/o иключешко 3lS мепюншш )) белки li-'iDiíio'H.HbK лпс г ьов г>ыяш|;| различия меж ту двумя со|)К1ми в отстой реакции н i 'ю híW i' ¡riiiBwi II îfj'iHwa'ercH существенное mu »Строении.: сшит Ьглков

семядольных листьев при 5° С. В первые сутки интенсивность синтеза белков у сорта 108-Ф О.ЫгяЛит составляла приблизительно 37% от уровня контроля, превышая данный показатель, наблюдаемый у С-6037 О.ЬагЬайепхе (26% по сравнению с контролем). На 2 сутки происходит дальнейшее снижение включения 358-метионина в белки, составляя 28 и 19% от контроля соответственно. Анализируя полученные данные и рассматривая активность белоксинтезирующего аппарата клеток растений как один ш показа гелей устойчивости к неблагоприятным факторам (Федина и др., 1987; Кузнецов и др 1991), можно заключить, что сорт 108-Ф СШпшит проявляет Солирую толерантность к низкотемпературному воздействию, чем сорт С-6037 О.ЬагЬайеше.

2. Влияние повышенных температур на хлопчатник на разных стадиях онтогенеза.

2.1. Влияние повышенных температур на биосинтез белков 2-х и 14 дневных проростков хлопчатника.

Нами проводились исследования влияния повышенных температур па поступление в ткани и включение 3!3-метиошша в белки 2-х дневных проростков и семядольных листьев хлопчатника. Как видно из данных табл. 2. повышенные температуры (33-39' С) стимулируют поступление метки в ткани как семядолей, так и первичных корешков сорта 108-Ф.

При температурах 42° и 45° С поступление метки резко снижается и фактически достигает уровня контроля (97,77% и 94,44% дая семядолей; ¡05,6% 'и 91,43% для первичных корешков по сравнению с контролем).

Таблица 2.

Поступление '-З-мезионина в семядоли и корешки двухдневных пророегкоп хлопчатника сорта 108-Ф при воздействии повышенных темпера (имл./мим. мг. ткани).

семядоли корешки

темп. С0 поступи. % отК посту! п. %от К

28 78805+6300 97756 ±7149

33 102579+8920 130,18 125055+9305 128,23

36 11257419131 ¡42.85 141232+13807 144,45

39 146968±12195 186,50 182433Ы4991 186,66

42 74684±6733 97,77 10320119264 105,60

45 69700+3407 41,44 74613+8513 91,43

Р-0,05

Антогцчныс лянниг поднчепм ч дгш сорт С-6037,

Увеличение поступления меченой аминокислоты в ткани при умеренно высоких температурах отмечено и на других культурах (Пастухова и 'Гарабрина, 1991, Мо1чу;ий, Иагпнцюп, 1989). Сходная картина наблюдалась при воздействии повышенных температур на 14 дневные проростки и теплового шока на созревающие семена.

Для сравнения теплоустойчивости двух видов нами изучалась иненсивность общего синтеза белка, которая наиболее интегрально отражает функциональную активность клеток 1! проявляет четкую температурную зависимость, резко снижаясь при температурах, значительно превышающих оптимальные. (Рис. 3).

Максимальный синтез белков наблюдался в интервале температур 33°-360 С для обоих изученных сортов. Увеличение температуры инкубации до 39° С приводит к снижению, а при 42°-45° С резкому подавлению общего синтеза белка. Следует отметить, что отклонения в уровне ццтесивности синтеза белков от оптимального значения в проростках сорта С-6037 выражены в меньшей степени, чем у сорта 108-Ф.

Температура С0

Рис. 3. Включение 35S-Meraowma в белки корешков двухдневных проростков хлопчатника сортов 108-Ф и С-6037 при двухчасовом воздействии повышенных температур, (в % от контроля).

Хотя значения температур, при которых наблюдается как максимальный, так и минимальный уровень трансляционной активности' для обоих сортов одинаковы, степень инпуцировпния - 169,4% для 108 -Ф и 142% для copra С-6037- и ингнСшровання биосинтеза белка - 16% для 108-Ф, 22% для С-6037 по

сравнению с кЬнгролсм - ниже у сорта С-6037, чго свидетельствует о способности этого сорта поддерживать метаболическую активность на более стабильном уровне.

Аналогичные данные были получены при изучении влияния повышенных температур на синтез белков прорастающих семядолей н семядольных листьев 14-днсшилх проросткоп (рис. 4). В этих экспериментах также показана большая толерантность сорта С-6037 к зкстремачыю-ьысокнм температурам по сравнению с сортом 103-Ф по белоксинтезирующей активности.

Температура С0

Рис.4, Включение ^-метноннна в белки семядольных листьев 14 дневных проростков хлопчатника сортов 108-Ф и С-6037 при двухчасовом воздействии

2.2. Влияние повышенных температур на биосинтез белков созревающих семян хлопчатника. Созревающие семена также характеризуются снижением белокемшеэируюшей акшьности при тепловом шоке (рис.5). Максимальная степень шпнопроп.шнч синтеза белка ¡1|>и воздействии теплового шока наблюдается

и 108-Ф ас-6037

повышенных температур, (в % от контроля).

л

Дни со дня оплодотворения

Рис. 5. Включение ЭД-метионииа в белки созревающих семян хлопчатника i.opra 108-Ф при двухчасовом воздействии теплового шока (39° С). В % от кошроля.

у 24 дневных семян и составляет 35% по сравнению с контролем.

Степень ингибирпваштя включения метки в белки 27 и 30 дневных семчн iicjHV'une.iLHo отличается от предыдущего варианта и составляет 39,0-39,5% по (.равнению с контролем. 35-40 дневные семена характеризуются снижением интенсивности белоксинтезируюшей активности до 50%. Наименьший эффект íeinoBoro шока наблюдается на семенах 45 дневного возраста (62% по сравнению с контролем). Проведенные эксперименты показали наибольшую чуксчьшельность к неблагоприятному воздействию в отношении биосинтеза i>e.'ib,i ь семян молодого возраста. По мере созревания степень ишибиротыния q i'K.ihi'ieiHHi метки в белки снижается.

3 Стрессовые белки хлопчатника.

3.1. Питукцня новообразования белков при холодовои стрессе.

ílpi'K.ieHiiue выше данные о содержании леткорастворимых белков, ¡/п. i имении радиоактивною предшественника и активности бедоксин-к- 1ир>н)шею аппарата клеток различных органов хлопчатника дают 11) шчеетенн>ю характеристику изменений в белковом обмене при действии t-'fM.iiíinpHHiiiux факторов среды и не затрагивают качественных иокашелей

этого процесса. В экстремальных условиях снижение уровня метаболических процессов является адаптивным механизмом, необходимым для формирования защитных индуцибельных систем и сопровождающимся изменением состава транскрибируемых мРНК и синтезом стрессовых белков.

При электрофоретическом анализе белков было установлено, что одно и двухсуточное воздействие низкой положительной температуры не приводило (но окраске KyMaccn-R-250) к видимым изменениям в качественном составе белков корешков и семядолей прорастающих семян хлопчатника в связи с крайне низким количественным содержанием, синтезируемых в данных температурных условиях, полипептидов и относительно низкой разрешающей способностью используемого метода.

Для идентификации этих белков нами был использован общепринятый подход с введением в растение in vivo -^й-метионина во время или после действия неблагоприятного фактора, электрофореза в денатурирующих условиях и флюорографией, который позволяет получить информацию о конкретных изменениях в наборе синтезирующихся белков п строго контролируемом и ограниченном интервале времени. Условия проведения экспериментов исключают возможность ферментативного расщепления и агрегации синтезирующихся молекул. Холодовое воздействие 'S° С) приводит к появлению нескольких полипептидов, отсутствующих в контрольном варианте.(Рис.б).

i i ¡

*-<

94 67

аз

[_ 30

20.1.

И. 4

Рис. 6. Флюорограмма ДДС-Ыа электрофореза белков корешков 2 дн. проростков хлопчатника сортов 108-Ф и С-6037, синтезирующихся пол воздействием холодового

стресса (5® С в течении 24 часов).

1,2, 6-С-6037; 3, 4, 5-108-Ф: 1,3- 28°С; 2, 4, 5, б - 5°С. 12,5% ПААГ; Справа мол. массы белков стандартов.

В данных условиях опыта в корешках сорта 108-Ф обнаруживаются стрессовые белки с мол. массой 49, 46, 44 и 35,5 кД. Некоторые минорные различия отмечены в высокомолекулярной (85-120 кД) и низкомолекулярной (16-19 кД) частях спектра.

Охлаждение проростков хлопчатника сорта C-6Q37 также приводит к синтезу de novo белков с мол.массой 50, 47 и 37 кД, отсутствующих в контрольном варианте. Как и у сорта 108-Ф, наблюдаются минорные различия в области высокомолекулярных и ниэкомолекуляртшх педашептпдов.

Таким образом результата элсктрофореппеского анализа позволяют сделать заключение, что у хлопчатника в условиях гипотермии штудируется синтез стрессовых белков, различающихся у двух изученных сортов по мол. массе, что свидетельствует о специфичности в реакции различных по чувствительности к холоду видах хлопчатника.

3.2. Индукция БТШ.

На рис. 7 представлена флюорограмма белков корешков хлопчатника сорта 108-Ф, синтезирующихся при 28° и 399 С.

94 т-ч

94 G7

Рис. 7. Флюорограмма ДДС-Na электрофореза белков корешков 2

35 ДН. проростков хлопчатника сорта

108-Ф, синтезирующихся под 30 ' воздействием теплового шока.

23,5 22

1 - 28°С; 2 - 39°С. Справа мат. массы белков стандартов. 12,5% ПААГ.

20.1

19 17

14.4

2 I

Отмечено незначительное ингиьированне синтеза белков, характерных для контрольного п.гчпнта в области 25-40 кД. Одновременно на флюорограммах

появляются несколько интенсивных полос, соответствующих полнпептндам с мол.массами 94, 85, 70, 62, 42, 23,5, 22, 21, 20,5, 19 и 17 кД, когорые представляют собой белки теплового шока хлопчатника. В условиях нашею опыта наибольшее включение метки происходит в низко-и высокомолекулярные БТШ хлопчатника. Полилептиды с мол.массой 21, 22, 23.5 и 42 кД представляют собой минорные компоненты БТШ хлопчатника.

При исследовании синтеза белков в условиях теплового шока в корешках других сортов 3 видов хлопчатника каких-либо существенных качественных различий в спектрах индуцируемых тепловым шоком БТШ не наблюдали, ß семядольных листьях и созревающих семенах в условиях теплового шока также были выявлены стрессовые белки, аналогичные БТШ корешков.

Следует отметить наличие в составе стрессовых белков хлопчатника БТШ с молекулярной массой 70 кД, который характерен для всех изученных животных и растительных организмов и комплекса низкомолекулярных белков 17-20.5 кД, индукиия синтеза которых до последнего времени наблюдалась только и растительных организмах. Представленные здесь результаты свидетельствуют oft изменении экспрессии генома хлопчатника и индукции генов тепловою шока, не функционирующих в нормальных температурных условиях и об orcycimni строгой органоспецифичностк в составе БТШ.

Сопоставление электрофоретических спектров стрессовых белков хлопчатника, синтезирующихся при холодовом воздействии и тепловом ниже, позволяет сделать заключение, что экстремальные темперагурные условия (н зависимости от типа стресса) индуцируют разные группы юмпературо чувствительных генов. В условиях холодового стресса <5° С в течении ! суток i БТШ как единая иидуцибельная система не функционировала.

3.3. Внутриклеточная локализация синтеза БТШ.

Одним из этапов в работах по выяснению воможных функций Б'11U является определение локализации их синтеза. Для этой цели в наших экспериментах был использован хлорамфеникол (ХФ) - специфический ингибитор трансляции на 70S рибосомах клеточных органелл.

Из данных рис. 8 видно, что ХФ подавляет синтез БТШ с мол. массой 62 и 42 кД. На интенсивность синтеза низкомолекулярных компонентов ингибитор трансляции не оказывал заметного ингибируютего действия. Так как ХФ блокирует трансляцию мРНК. только на 70S рибосомах и не окатывает влияния на биосинтез белка на цитоплазматическнх (80S) рибосомах, го можно включить, что указанные компоненты являются првдуктами трансляции мигохондриальной белоксинтезирующей системы,

В связи с тем, что ХФ был добавлен в инкубационную сроду до дсйсшия теплового шока, произошла блокировка трансляционной активности

митохондрий в результате чего на радиоавтографе проявляются только БТШ, синтезирующиеся на цитоллазматических рибосомах. Сказанное ьыше позволяет сделать вывод о том, что информация о структуре БТШ с мол.массой 62 и 42 кД кодируется в молекуле ДИК митохондрий.

fSj к"

i > • 4 i $ *?

Ik§

- ' l\A

62 42

Рис. 8, Влияние хлорамфеникола на синтез Б'ГШ первичных корешков 2 дневных проростков хлопчатника 108-Ф. ХФ добавляли в инкубационную среду за 10 мин. до начала воздействия теплового шока. 1 - 39° С+ХФ; 2 - 39° С; 3 -28°С.

I 2 3

19

Полученные результаты согласуются . литературными данными, свидетельствующими об участии этих органеля в зашитно-пришособигельных реакциях клетки, (Sinibaldi, Тигреп 1985, Nebiolo, White. 1985, Cooper, Ho. 1987, Войников, Рудиковский. 1988). Дальнейшие исследования экспрессии миго-чондриального ¡енома в ответных реакциях клетки могут способствовать пониманию роли генетического аппарата органелл в стрессовых условиях и его нкчада в адаптационных процессах.

3.4. Кинетика синтеза БТШ хлопчатника.

Учитывая универсальность (синтез стрессовых белков у практически всех изученных организмов) и консервативность (идентичность основных классов БТШ у различных организмов), прсдстаалялось важным изучение особенностей синтеза стрессовых белков для выяснения их возможных функций в термоадаптационных процессах. В связи с этим, нами проведены эксперименты, связанные с ответной реакцией генома хлопчатника на различное лремя воздействия теплового шока.

На рис. 9 представлена флюорограммз белков, синтезирующихся в тканях корешков сорта 108-Ф при 39° С в течении различного периода времени. Уже в первые 15 мин. воздействия теплового шока наблюдается появление компонентов с мол.массой 120, 94, 80, 70, 23,5, 19-17 кД, отсутствуюших в контрольном варианте. При 30 мин. экспозиции в условиях повышенной температуры спектр БТШ в основном сохраняется.

п .а

т

и

94

67

30

20.1

Рис 9.Кииетика синтеза БТШ двухдневных кореш -ков хлопчатника под воздействием теплового шока различной длитель -ности (флюореграмма геля). 1 - 28° С, 2 -=39° С в тече -нии 15 мин., 3 - 39° С в течении 30 мин., 4 - 39° С в течении 60 мин., 5 - 39° С в течении 120 мин.

5 4 3 2 1

14.4

При воздействии теплового шока в течении 60 мин. наряду с сохраняющимся интенсивным синтезом компонентов БТШ с мол.массой ПО, 94, 70, 17-23.5 , характерных для трех экспозиций, наблюдается индукции новообразования компонентом, отсутствующих не только в контрольном варианте, но и при теплооом шоке дпигетьностыо 15 и 30 мин. -бепкн с-

мол.массой 42, 46 и 62 кД и комплекс низкомолекулярных полипептидов (мол.масса ниже 15 кД). >

120 мин. тепловой шок оказывает общее ингибирукнцее влияние на белоксинтезнрующую активность - данное воздействие в значительной мере снижает включение 353-метиошша не только в "нормальные" белки (синтезирующиеся при оптимальном температурном режиме) но и почти во все компоненты БТШ. Исключение составляет компонент с мол.массой 62 кД.

Временная зависимость синтеза отдельных компонентов стрессовых белков я зависимости от длительности воздействия стрессируюшего фактора отмечена и для других культур (Айтхожнн и др. 1989, ЫессЫ е1 о1, 1987)

V' < I г

И" I

I 2

ТЯ1

■а

"» рч

' V г \ - 4

* »• 4 Г-.-» '

) .1

I *'• а * Г ¿1

■1

-36 г 30

9 10

-94

.¿у Рис. 10. Флюорограмма ДЦС-N.1 электрофореза белков корешков 2 дн, проростков хлопчатника сортов 108-Ф (А) и С-6037 (Б) при воздействии теплового шока различной длительности.

Образцы подвергали тепловому шоку в течении 5 шт. - дорожки 4, 8; 15 мин. - дорожки 20 л 3, 7; 30 мин. - дорожки 2, б. По окончании времени инкубации растительный материал переносили в нормальные температурные условия (28° С), белки метили 355-метионином в течении 2 часов. Дорожки 1 и 9 -• мечение белков в условиях теплового шока в течении 2 часов. 5 и 10 дорожки-контроль.

Бнолотическнй смысл этого феномена, до сих пор до конца не ясен, хотя предполагается участие "ранних" БТШ о процессах, предотвращающих необратимые нарушения на самых первых этапах вомействня неблагоприятною фактора.

i

А

Представлялось интересным сравнить реакцию на кратковременным тепловой шок представителей двух видов хлопчатника, различающихся по отношению к высокой температуре.

Как оказалось, уже в первые 5 мин. теплового шока наблюдается появление компонентов, отсутствующих в кошролытом варианте. Это касается и сорта 108 Ф (дорожки 1-5) и С-6037 (дорожки 6-10). Рис.10.

У сорта С-6037 прежде всего следует отмстить интенсивный синтез низкомолекулярных компонентов БТШ (17-19 кД). Одни из этих белков в следовых количествах присутствуют в контрольном варианте (даже 5 мин. тепловой шок в значительной мере интенсифицирует синтез этих компонентов -рис.10 дорожка 8). Значительные изменения наблюдаются в высокомолекулярной области спектра. Начинается синтез БТШ 94, 85, 70 кД, интенсивность образования которых остается приблизительно на том же уровне и в других вариантах.

Несмотря на то, чго спектры БТШ по нашим данным, в основном, сформировались уже в первые 5 мин. теплового шока следует отметить и некоторые особенности синтеза отдельных компонентов в зависимости от длительности температурного стресса.

Прежде всего обращает на себя внимание отсутствие компонента БТШ с пол 62 кД, наблюдаемый в спектре белков при 2-х часовом воздействии теплового шока - дорожка 9. Этот компонент не обнаруживается в составе синтезирующихся белков корешков хлопчатника при 5, 15 и 30 мин экспозициях.

. При 5 мин. экспозиции в корешках С-6037 БТШ 74, наблюдаемый как при 2 ч., так и при 15 мин. воздействии, не индуцируется. При сохраняющемся спектре синтезирующихся БТШ в области 36-45 кД наблюдаются различия в интенсивности включения радиоактивного предшественика в отдельные полипептиды этого комплекса БТШ в разных вариантах опыта (9, 8, 7 дорожки) Отмечаются также незначительные различия в синтезирующихся минорных БТШ.

30 мин. экспозиция характеризуется отсутствием (либо существенным ингибированием) некоторых компонентов, наблюдаемых в других вариантах теплового воздействия, а также в контроле (свыше 120'кД, 40-70 кД).

У сорта Ю8-Ф также наблюдается синтез основных компонентов БТШ уже в первые 5 мин. воздействия теплового шока, за исключением белка с молмаегпН 62 кД. Отмечается синтез ннзкемолекулярных БТШ, хотя их синтез протек-.ег с меньшей интенсивностью по сравнению с сортом С-6037. Спектры Ы'Ш первичных корешков итого сортами основном, сохраняются во всех, вариант >< температурного стресса. Как мы уже отмечал» гыше, при 5 мин. тенчопом'ои'чч-в спектре еннкчнрующч^ся Ьсткпв иолнпенгид мол. массой 74 кД у со;-".:

С-6037 не обнаружен. У 108-Ф, в отличие cvt С-6037 такое кратковременное воздействие вызывает индукцию синтеза этого белка. Следует также отметить менее интенсивный синтез комплекса БТШ 17-21 у сорта 108-Ф по сравнению с сортом С-6037.

Полученные данные по кинетике синтеза БТШ позволяют сделать заключение о временной регуляции этого процесса. Тепловой шок различной длительности (от 5 мин. до 120 мин.) индуцирует образование различных по молекулярной массе полипептидов, причем в течение этого времени одни компоненты наиболее интенсивно синтезируются на ранних этапах теплового шока, лрутие - на более поздних. Кинетические характеристики синтеза БТШ у изученных сортов выявили ввдоспецифичность в ответной реакции на тепловой шок двух видов хлопчатника.

Таким образом установлено, что экстремальные температуры вызывают у хлопчатника блокирование нормального метаболизма (ингибирование биосинтеза белка) и индукцию систем шокового ответа, обеспечивающих кратковременное выживание на первых этапах адаптационного ответа.

Следует отметить, что для индукции генов теплового шока определяющее значение имеет не просто резкая смена температурного режима произрастания. Необходимым условием является превышение определенного температурного порога. В наших экспериментах по холодовдму воздействию, когда растения подвергались влиянию низких температур (5° С) в течении 24 и 48 часов, практически мгновенное повышение температуры на 23° С (до 28° С -температуры инкубации растительного материала с эз5-метионином) не индуцировало образование БТЩ. С другой стороны, инкубация при 39° С (всего на 11° С выше контрольного варианта) приводила к существенным изменениям в качественном составе транскрибированных мРНК и синтезе de novo БТШ.

4. Влияние засухи на хлопчатник.

4.1, Влияние водного дефицита на белсксинтезирующую активность проростков и листьев хлопчатника.

Возделывание хлопчатника в нашем регионе сопряжено со многими неблагоприятными климатическими условиями, в частности, дефицитом влаги. Такое воздействие, создаваемое с помощью различных методических приемов (ПЭГ различной концентрации, задержка и прекращение полива) оказывает ишнбирухмпес влияние на белоксинтезирующую активность на всех наученных

стадиях развитой хлопчатника. В таблицах 3 и 4 представлены результат проведенных экспериментов.

Таблица 3.

Влияние моделируемой почвенной засухи на синтез белков 2 дневных проростков хлопчатника, (по включению радиоактивной метки в ТХУ-нерастворимын материал; в нмп./мнн. х мкг. белка).

Условия опыта семядоли % от К. корешки % от К

контроль 1941 ± 101 3032 ± 111

опыт(ПЭГ 2ч.) 1288 ± ИЗ 66,4 1200 ± 96 39,6

контроль 1539 ± 95 3292 ± 106

опыт(НЭГ 5ч.) 372 ± 39 24,2 609 ± 41 18,5

Р-0,05

2 часовая моделируемая засуха (14% ПЭГ) прицела к подавлению синтеза белка, хотя и в разной степени, как в корешках, так и в семядолях табл. 3. Увеличение экспозиции (до 5 часов) в еще большей мере подавляет белоксилтезируюшую акгьивность п обоих изученных органах (24,2% и 18,5% от уровня контроля для семядолей и корешков соответственно). Аналогичные данные получены для семядольных листьев 14 дн. проростков (Табл.4).

Таблица 4.

Влияние моделируемой засухи на синтез белков семядольных листьев 14 дневных проростков хлопчатника (по включению радиоактивной метки а ТХУ-нераетворимый материм; имп./мин. х мкг.белка).

условия вариант включение То огК

контр. 4032 ± 108

ПЭГ 2 часа опыт 3153 i 126 78,2

контр. 4326 ± 207

ПЭГ Зчасов опыт 917 + 51 21,2

задержка полива колтр. 3972 ± 91

2 дня опыт 3550 t 136 89,5

задержка полива ко игр. 4602 t 197

4 дня ОПЫТ 1293 ±104 28,5

Р=0.05

Подавление белоксинтезируюшей активности семядольных листьев наблюдается ухе в первые 2 часа в условиях, моделирующих засуху. Увеличение времени экспозиции в данных условиях (ло 5 часов) значительно cmiaaei уровень включиишейся радиоактивной аминокислоты и составляет около 20й по сравнению с контролем.

При задержке полива (2-х дневная засуха) синтез белка в семядольных чнетьях составлял около 90% по сравнению с контрольным вариантом (нормальный полив). Удлинение воздействия дефицита влаги (до 4 дней) приводило к более чем 70% снижению синтеза белка.

Аналогичное воздействие засухи наблюдали и на взрослых растениях. Снижение (до 50% от нормы полива) водообеснеченности растений, растущих в веге-I анионных сосудах приводит к существенному снижению поступления радиоактивной метки в ткани листьев. Уже на 10 день засухи поступление метио-ннна составляет около 40% по сравнению с контролем. Поступление метки в последующий срок (13 дн. засуха) остается практически на том же уровне (рис. 11).

Следует отметить, что подавление активности белоксинтезирующего аппарата ¡шаьев хлопчатника происходит в большей мере и за более короткое время в опытных вариантах в пегетацционных сосудах, чем в опытах по засухе в полевых условиях. Уже за 10 дней в условиях дефицита маги в вегетационных сосудах

19 11

Дни

Рис.И. Поступление и включение ЭД-метионина в белки листьев Vюнчатника под воздействием дефицита влаги (10 и 13 дневная засуха). В % от кошроля. Засуха создавалась путем.сокращения нормы полива (вегетационные

сосуды!

включение метки п белок составляет всего 20% по сравнению с контрольным вариантом, тогда как растения, выращенные в полевых условиях (делянка) сохраняют способность поддерживать белокеиитезируюшуга активность на более высоком уровне довольно продолжительное время.

Полученные данные свидетельствуют о том, что чем жестче условия засухи, тем большее ннгнбирующее влияние на белоксинтезируюшую активность оказывает дефицит влаги.

4.2. Влияние засухи на синтез белхов созревающих семян хлопчатника. Учитывая то, что запасные белки являются источником азота и аминокислот п процессе прорастания семян, а также в связи с гем, что важнейшие характеристики растений в период автотрофного развития хлопчатника - всхожесть и энергия прорастания - формируются на стадии созревания семян н зависят от количества п качества запасных питательных веществ, представлялось важным исследование нх биосинтеза в условиях дефицита влаги - одного из лимитирующих факторов роста н развития растений в нашем регионе.

м->о

к г; о

| «Д а

М во' н о

& «<Ч й

• Г <0

Я

5

30 30 100

В!0 □ 13

Дни со дня цветения Рис.12. Включение 353-метионина в белки созревающих семян хлопчатник.» иод воздействием почвенной засухи рахшчиой длительности.(в % от контроля).

Г-ьпо устаиоптено, что 10 ¡1 13 дневная засуха (ограничение полила в ■ м\ сосудах) практически не отражалась на поступлении меченной

аминокислоты в 30 - 45 дневные созревающие семена (около 90% от уровня контроля). Небольшое ингибирование этого процесса обнаружено в более молодых 24-27 дневных семенах (60 - 65 % от уровня контроля).

Степень ингибирования белкового синтеза в условиях водного дефицита у разновозрастных семян также зависит от возраста семян.(Рис. 12). Наибольшее влияние дефицит влаги оказывал на 24 и 27 дневные семена. В семенах, достигших 35 дневного возраста и выше, уровень белоксинтезирующей активности снижается в значительно меньшей степени.

Полученные данные свидетельствуют о том, что разновозрастные семена по разному реагируют на одинаковый по напряженности стресс. По мере созревания семян негативное воздействие засухи на их белоксинтезирующуто активность снижается.

Результаты, полученные при исследовании- чувствительности процесса синтеза белка в созревающих семенах иллюстрируют организменный уровень адаптационных процессов, то есть приспособительные изменения во взаимоотношениях между органами в неблагоприятных условиях.

Достаточно высокий и стабильный уровень метаболизма „ в созревающих •семенах, в даном случае синтез белка, свидетельствует о перераспределении питательных веществ и воды в генеративные органы. Кроме того, различия в белоксинтезирующей активности у разновозрастных семян иллюстрируют конкурентные взаимоотношения между плодоорганами - поток питательных веществ и воды преимущественно направлен в более зрелые плодоорганы, что позволяет поддерживать их метаболическую активность на более стабильном уровне.

4.3. Синтез запасных белков при созревании семян хлопчатника.

Биологический смысл увеличения атграгирующей способности более зрелых плодооргаиов, по сравнению с молодыми заключается в сохранении и развитии более жизнеспособных семян. Этот качественный показатель во многом определяется количеством и составом запасных питательных веществ, в том числе запасных белков, биосинтез которых является главной отличительной чертой метаболизма созревающих семян хлопчатника. Запасные белки представлены преимущественно глобулинами, состоящими по крайней мере из 3 иммуинологически различных белков.

При электрофорезе суммарного глобулина в денатурирующих условиях выявляется ряд полипептидов (12-53 кД), основные компоненты которых (47 и 53 кД), являются компонентами 7Б глобулина.

Таблица 5. *

Количественное содержание подо- и солеизвлекаемых белков созревающих семян разного возраста (дни со дня цветения). Сорт 108-Ф.

возраст количество белка(мг./г. ткани)

водорастворимые солерастворимые

20 4б,80±1,32 8,06±1,04

25 49,13±2,01 12,11±1,01

30 56,14±2,04 61,48±1,32

35 51,81±1,96 123,78t2,13

40 62,01±3,16 132,01±1,34

Р-0,05

При исследовании синтеза и накопления водо- и солеизвлекаемых белков созревающих семян было установлено, что наиболее интенсивно эги процессы протекают в период 25-35 дней со дня цветения. Табл.5, Рис.13.

Ю 50

и 25 30 35 40

Дни со дня оплодотворения

Рис.13. Включение |4С-лейшша в различные по растворимости фракции белков созревающих семян хлопчатника сорта 108-Ф

о

Интенсивный синтез запасных белкой в семенах хлопчатника в период с 25 по 35 день со дня цветения обусловлен синтезом больших количеств мРНК для запасных белков семян. Наиболее достоверным критерием идентификации мРНК является программирование этой матрицы в бесклеточных бе-локсшпезирующих системах.

Нами была использована бесклеточная система зародышей пшеницы, оптимизированная по концентрации К1" и Мг2+, температуре и времени инкубации. В результате проведенных исследований усгановленно, что наибольшее включение радиоактивной метки наблюдалось при концентрациях К' и Мц2' равных 90мМ и ЗмМ соответствено (рис. И), температуре 28-30° С и времени инкубации 60 мин.

4

т

о 26

Концентрация Мц2*"

Рис. 14 Зависимость активности бесклеточной белоксинтезирукяцей сиисмм зародышей пшеницы от концентрации К+ и Мй2''.

Улектрофоретический анализ синтезированных белков позволил обнаружить и,шор полипептидов с молекулярными массами в пределах от 80000 до 15000 да.чыон. 1'ис.15.

Молекулярные млссы некоторых полннешидов, еннгезирешшшах в бссклсточной системе, соипадают с таковыми субт,единиц запасных белкой, выделенных из семин»25- 30 дневного возраста.

Обращает на себя внимание наличие в составе продуктов трансляции компонентов и области мол. масс 60-75 кД, обнаруженных также в созревающих

семенах разного возраста. Судя про включению радиоактивной метки они составляют основную массу синтезирующихся белков, что свидетельствуют п том, что основные компоненты запасных белков ( 52 и 48кД) яшшогп продуктами

Рис.15. ДДС-Na электрофорез тотального продукта трансляции поли-А чРНК созревающих семян хлопчатника в бесклеточной белоксинтеэируюшей сисюче зародышей пшеницы. (10% ПАлГ)

_ - деиситограмма СГ-30 яи.семян

--------- . радиоактивность продукта трансляции

носттрансляцинной модификации высокомолекулярных предшественников. Полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей (Юиусханов, Ибрагимов, 1988, Dure et al., 1981).

На рис. 16. представлены электрофорегрзммы созревающих семян хлопчатника разного возраста, подвергнутых 10 дневной засухе, в условиях вегетационных сосудов. Во всех вариантах происходит интенсификация электрофоретических полос в области 75, 53, 47, 14-24 кД, что свидетельствует о продолжающемся синтезе и накоплении в тканях запасных белков. Особенно следует отметить значительное (более чем в два раза) увеличение содержания полипептидов с мол.массой 53 и 47 кД как в контроле, так и в опыте.

Такие же темпы накопления по мере созревания наблюдаются у полипептидов с низкой мол.массой как в контроле, так и в варианте с 10 дневной засухой. Исходя из представленных данных можно заключить, что к каким-либо качественным изменениям в составе накапливающихся запасных белков созревающих семян, дефицит влаги в наших условиях опыта не приводит.

U

. 67

"О

¡Г" «И» «МИМВ»-»«»»'

' **< № 1т <0 ♦">

V "'"

? «г г- --

Г 2 345 б ? в 9 10

Рис. 16. Электрофореграмма белков созревающих семян хлопчатника под воздействием 10 дневной засухи. ДДС-№ электрофорез, 12,5% ПААГ.

Справа мол. массы белков -стандартов.

1,3,5,7- контроль (нормальный полив)

2, 4, 6, 8 - опыт (засуха): 9,10 - воздействие теплового шока;

1,2 - 24 дн. семена; 3,4 - 27 дн.семена;5,6-30 дн.семена; 7, 8 - 35 дн. семена; 9, 10 - 27 дн. семена.

Иная картина наблюдается при анализе синтезирующихся в этих условиях белков. (Рис. 17).

Во всех вариантах отмечен синтез в следовых количествах вы сокомолекулярных белков (80-94 кД). Синтез этих белков у 24 дн. семян, подвергнутых дефициту влаги заметно превышает уровень контрольных растений. В целом же, в опытном варианте, наблюдается некоторое ингибирование синтеза всех элеирофоретических компонентов созревающих семян 24 дневного возраста. Обращает на себя внимание практически полное ингибирование синтеза низкомолекулярных белков (следовые количества в области 14-20 кД).

Такое же ингибирование синтеза низкомолекулярных белков наблюдается в подвергнутых 10 дневной засухе семенах 27 дневного возраста. С другой стороны водный дефицит в значительной мере индуцирует синтез компонента с мол. массой 28 кД. .

Спектры синтезирующихся белков созревающих семян 30 дневного возраста (дорожки 5 и 6) контрольного и опытного вариантов практически не отличаются. Па синтез низкомолекулярных белков созревающих семян дефицит влаги практически не оказывает ингибирующего действия.

94 — 50

. 35 30

Рис.17. Флюорограмма белков созревающих семик хлопчатника, синтезирующихся в условиях водного дефицита """" (10 дн. засуха ).ДДС-Ыа

ЦЭ электрофорез, 12,5% ПААГ.

Справа - мол. массы белков Щ —20 Д стандартов. 1,3,5,7-

'Ф „ контроль. 2, 4, 6, 8 - опыт

'ц, '4. . 1,2-24 дн. семена;3,4*27

— — — дн.семена; 5.6-30 дн.семена;

7, 8 - 35 дн семена;

в 7 6 5 -1 3 2 I

«в»

При анализе синтезирующихся белков 35 дневных семян прежде всего следует отметить существенное снижение синтеза высокомолекулярных компонентов - 67-75 кД, как в контрольном, так и в опытном варианте, по сравнению с семенами более молодого возраста. Наблюдается снижение у контрольное варианта и практически полное ингибирование у опытного варианта (дорожки 7 и 8 соответственно) синтеза компонента с мол.массой 47 кД. По мшимому, в семенах данного возраста синтез запасных белков близится к тавершению.

Относительно стабильный спектр синтезирующихся белков созревающих lc-мяи свидетельствует о том, что засуха, в условиях нашего опыта, не вызывает существенных качественных изменений в их синтезе. Исходя из представленного рисунка видно, что в созревающих семенах продолжается трансляция мРНК запасных белков без заметных изменений в транскрипционных продуктах. На достаточно высоком уровне находится функциональная активность полисом.

Можно привести два следующих объяснения полученных результатов: во-iiepsux, в коробочках сохраняется на достаточно высоком уровне количество ьлаш при таком кратковременном воздействии засухи. Во-вторых, известно, что репродуктивные органы при недостаточном водоснабжении оттягивают иоду из близлежащих листьев, обеспечивая нормальное протекание всех фи.чиолошческих и биохимических процессов формирующихся семян.

Условия засухи конечно же отражаются на состянии метаболических процессов в созревающих семенах. Это видно по общему, хотя и не столь значительному как у листьев, снижению активности белоксинтезируюшеш аппарата. Такое снижение отмечено во всех вариантах, причем негативное воздействие в большей степени выражено у 24 дневных семян.

Заключение

В результате проведенных исследований показано, чго холодовое ы: ¡действие ингибируег один из важнейших метаболических процессов -ппоешпет белка, и как следствие, приводит к подавлению ростовых процессов. Степень выраженности этих физиологических и биохимических параметров .«штента от абсолютною значения температуры и времени экспозиции. Схожая мрпша наблюдается при воздействии тепловою шока на двух-и •и шриаштатидттевиые проростки, листья взрослых растений и созревающие

.TML'Ild.

Установлено, что в молодых, растущих органах (с изначально высоким Н'окнем метаболизма) интенсивность синтеза белков подвержена негативному к ,№ншм в большей степени. Такие данные были получены как при холодовом и.нкнетыш, так и при тепловом iuokç. Показано, что copia вида G.hirsutum по степени подавления белоксингезируюшей активности н условиях холодового

стресса проявляют большую толерантность по сравнению с сортами G.barba dense. При тепловом шоке, наоборот, сорта G.barbadense проявляют большую толерантность по сравнению с сортами вида Ф G.hirsutum.

Исследования по воздействию засухи на белоксинтезируюшую активность хлопчатника на разных стадиях онтогенеза подтвердили существование однотипного характера реакции растений на уровне синтеза белка на разные стрессы абиотической природы. Жесткая, хотя и кратковременная засуха (с использованием ПЭГ) приводит к значительно большему подавлению включения метки в белки листьев хлопчатника, чем в других вариантах опыта (снижение нормы полива а вегетационных сосудах, прекращение полива на делянке).

Показано, что засуха приводш к ингибированию белоксинтезирующей активности созревающих семян, причем его степень варьирует в зависимости от ьозраста семян - негативное воздействие засухи выражено в большей степени у более молодых плодоорганов.

Данные по накоплению белков, поступлению в ткани и включению в белок радиоактивного предшественника в различные органы хлопчатника при низкотемпературном стрессе, тепловом шоке и водном дефиците дают информацию о степени нарушений белкового обмена в неблагоприятных условиях, позволяют судить о толерантности изученных сортов к том или иному стрессу по их способности поддерживать метаболическую активность на относительно стабильном уровне.

Установлено, что температурный стресс вызывает перепрограммирование генетической активности, выражающейся в блокировании в той или иной мере ."нормального" метаболизма и включении индуцибельных защитных систем (в данном случае синтез стрессовых белков). В наших экспериментах новообразование белков обнаружено при суточном воздействии 5° С температуры. Индукция белков холодового стресса наблюдается у обоих сортов, причем отмечается видоспецифичность в их компонентном составе. Синтез tie novo стрессовых белков хлопчатника при низкотемпературном воздействии показан нами впервые. Тепловой шок также приводит к образованию не выявляемых в контрольном варианте полипептидов во всех изученных органах. Отмечена идентичность по мол. массе основных компонентов БТШ изученных видов. Аналогичные спектры БТШ обнаружены и в различных органах (2х дневных корешках, семядольных листьях и созревающих семенах) одного сорта.

Характерным является очень быстрая ответная реакция генома на тепловой шок - уже через 5 мин. после резкого изменения температурных условий наблюдается новообразование стрессовых полипептидов. С помощью метода ингиби-торного анализа впервые установлено, что информация о некоторых БТШ хлопчатника колируется в геноме митохондрий и транслируется в ее бе.тжерн-тезируюшей системе.

Выявлена зависимость синтеза стрессовых полипептвдов от времени воздействия теплового шока. По этой характеристике синтеза БТЩ нами впервые обнаружены различия между сортами двух изученных видов при действии кратковременного теплового шока.

На наш взгляд, существенным моментом является то, что крайние значения температурного стресса - иизкие положительные температуры и тепловой шок -индуцируют включение качественно различных систем, отличающихся прежде всего неидентичностыо синтезирующихся de novo белков и скоростью их образования. Полученные данные свидетельствуют о том, что при адаптационном ответе на эти неблагоприятные воздействия индуцируются и зксирессируют разные группы температуре чувствительных генов.

Действие водного дефицита не приводило в наших экспериментах к кардинальным изменениям в качественном составе синтезирующихся белков. Отмечаются небольшие отклонения в шггенсивностн синтеза отдельных компонентов при относительно стабильном алектрофоретическом спектре запасных белков в пределах изученных стадий созревания семян.

На наш взгляд представляется перспективным проведение исследований по следующим направлениям:!. Выделение индивидуальных генов стрессовых белков. Индуцибельный характер и особенности экспрессии этих генов, обнаруженные в нашей работе, способствуют их успешному выделению и идентификации. Клонированные последовательности генов стрессовых белков могут быть использованы в исследованиях молекулярных механизмов регуляции генетической активности, ядсрно-цитоплазматического взаимодействия геномов клетки в неблагоприятных условиях среды и в качестве молекулярно-генетическнх маркеров. 2. Проведение комплексных исследований влияния физиологически активных веществ на генетическую активность растительной клетки в стрессовых ус-виях. Знания о молекулярных механизмах регуляции экспрессии генов синтетическими препаратами могут служить основой для направленного изменения активности генов или комплекса генов, определяющих толерантность растения к тому или иному неблагоприятному воздействию. В этой связи представляется необходимым целенаправленный поиск и использование препаратов не только поддерживающих метаболические процессы хлопчатника на достаточно высоком уровне, но и разработка новых, нетрадиционных подходов н методов по искусственному индуцированию защитных механизмов самого растения по принципу сенсибилизации растительной клетки. -

ВЫВОДЫ

I. Низкие положительные температуры приводят к замедлению ростовых процессов и увеличению количественного содержания легкорастворимых белков. При длительном холодовом воздействии (10 суток при 5-7° С) наблюдались обратимые изменения в ферментной системе лероксидазы.

Показано ингибнрование активности белоксннтезируюшего аппарата прорастющих семян и семядольных листьев, степень которого зависит от температуры, длительности низкотемпературного стресса и генотипа растения. Данные по накоплению белков, росту первичных корешков и интенсивности белкового синтеза свидетельствуют о большей толерантности сортов вида G.hirsutum к низким положительным температурам.

2. Тепловой шок (39° С) приводит к существенному ингибпропанию синтеза белка в 2-х и И- дневных проростках и созревающих семенах. Показана зависимость белоксинтезирующей активности от температуры, стадии развития и генотипа хлопчатника. Данные по поступлению в ткани и включению в белок радиоактивной метки свидетельствуют о большей толерантности сортов вила G. barbadense к высокотемпературному стрессу по сравнению с сортами вида G. liirsutum.

3. Экстремальные температуры (5° С и 39° С) индуцируют синтез стрессовых белков, отсутствующих, либо синтезирующихся в клетках контрольных растений в минорных количествах. Сопоставление электрофорс гических спектров стрессовых белков свидетельствует о функционировании в условиях низких положительных температур и теплового шока различных индупибельных систем и о наличии в геноме хлопчатника разных групп температурочувствнтельных генов.

4. Показана специфичность в компонентном составе индуцируемых Холодовым стрессом (5° С) белков у двух сортов изученных пидон. Для сорта С-6037 характерны полипептиды 50, 47 и 37 кД, для copra 108-Ф - 49, 46, 44 и 35,5 кД. Тепловой шок приводит к образованию БТШ, мол. массы которых (94, 85, 70, 62 и 17-19 кД) идентичны у сортов 3 различных видов хлопчатника Показано отсутствие специфичности по основным компонентам ElUJ различных органов - корешков,' семядольных листьев и созревающих семян.

5. С помощью ингнбйторного анализа показано, что некоторые гены БТШ первичных корешков хлопчатника локализованы в ДНК клеючкых орпшед.т Использование хлорамфеникола позволило заключить, что индуцируемые тепловым шоком компоненты БТШ с мол.массой 62 и 42 кД транслирую^« и белокешгтезирующей системе митохондрий.

6. Установлена зависимость синтеза отдельных компонентов Б ГШ от времени воздействия теплового шока. Иыяшена специфичность реакции к-нома хлопчатника двух изученных сортов по кинетике синтеза БТШ при кратковременном тепловом шоке.

7. Синтез запасных белков осуществляется в период с 25 по 45 день со дня цветения. Показано, что компоненты запасных белкон (53 и 47 кД) синтезируются в форме высокомолекулярны* предшественники«.

Исследования матричной активности мРИК инренпкчши семян ь беекпеточной бежжеинтезирующей ciicteue зародышей покипим пом кии

преобладание в продуктах трансляции полипептидов с мол .массой 60-75 кД -предшествеников компонентов 7Б глобулина.

8. Дефицит влаги оказывает ингибирующее влияние на биосинтез белков на всех изученных стадиях онтогенеза. Степень ингибирования белоксинтезирующей активности зависит от стадии развития, жесткости И длительности ьоздействия неблагоприятного фактора. Дефицит влаги в условиях нашего опыт, существенным образом не отражается на качественном составе синтезирующихся белков. Относительно стабильный спектр синтезирующихся иелков в созревающих семенах свидетельствует о продолжающейся трансакции мРНК. запасных белков без заметных изменений в трансляционных продуктах.

Рекомендации

1. Полученные данные по локализации и кинетическим характеристикам синтеза отдельных компонентов БТШ могут быть использованы в дальнейшем в исследованиях регуляции экспрессии генома клетки в стрессовых условиях, для выяснения роли клеточных органелл в адаптационных процессах и выявлении маркерных белков.

2. Результаты исследований синтеза запасных белков и индукции стрессовых белков в экстремальных температурных условиях мотут служить основой для выделения, идентификации и клонирования кодирующих их генов.

3. Степень изменения общего синтеза белков в условиях темпера турнот о стресса и водного дефицита может быть использована в качестве критерия толерантности хлопчатника к различным неблагоприятным фак юрам среды.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

БТШ - белки гегшового шока,

11оли-АмРНК - псшнаденилированная мРНК,

ПЭГ - полштиленгликоль,

ХФ - хлорамфеникол,

РМБР - фенилмстилсульфанштфлюорид,

кД- килодальтон

2-МЭ - 2 - меркаптоэтанол

11ААГ - иолиакрштамидный гель

Ноли АмРНК-полиаденилированная мГНК.

ПЭГ - нот» яилентликоль

ХФ - хлорпмфеиикол ■ '

РМЧГ - фе11|1Пметттсуш.фанилфлк>орн;1 коистата седиментации

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Набиев Л.Г., Усманов P.M. Действие низкой положительной температуры на активность пероксидазы в семядольных листьях хлопчатннка.//Узб. биол. ж. 1984, №3, с. 56-57.

2. Ибрагимов ФА., Усманов P.M. Влияние хлората магния на биосинтез РНК в листьях хлопчатника.//Узб. биол. ж. - 1935, Ms2, с. 58-59.

3. Набиев А.Г., Усманов P.M., Закиров A3. Влияние низкой положтгтелмюй температуры на фракционный состав легкорастворимых белков в корешках хлопчатника.// Узб. биол. ж. 1986, N»3, с. 21-22.

4. Набиев А.Г., Усманов P.M., Козубаев 111. С. Авторэднографическое исследование синтеза белков в проростках хлопчатника при пониженных температурах.// Узб. биол. ж. - 1987. Nil, с. 71-72.

5. Усманов P.M., Самиев Х.С., Нуртаев 5С.С. Синтез стрессовых белков хлопчатника при тепловом шоке. //ДАН УзССР - 1989. №7, 53-55.

6. Усманов P.M., Самиев Х.С., Нургаев Х.С. Синтез некоторых БТШ на 70S рибосомах корешков хлопчатника.// ДАН УзССР - 1991, №4, с. 46-47.

7. Усманов P.M., Самиев Х.С., Нуртаев Х.С. Высокотемпературная индукция синтеза стрессовых белков хлопчатника.// Узб. бмл. ж. - 1991. №2, 33-35.

8. Усманов P.M., Самиев Х.С,, Нургаев Х.С. Синтез белков хлопчатника при низкотемпературном стрессе. //Узб. биол. ж. - 1996, N¡¡3, с. 44-46.

9. Усманов P.M. Синтез белков созревающих семян хлопчатника в условиях водного дефицита . // Узб. биол. ж. - 1996, №4, с. 32-35,

• 10. Усманов P.M. Кинетика синтеза белков теплового шока хлопчатника.

// Узб. биол. ж. - 1996, №5, с. 44-46.

Тезисы докладов.

11. Усманов P.M. Выделение и обращая транскрипция поли-А мРНК созревающих семян хлопчатника.// Тез. докл. IV конф. биохимиков Ср. Азии и Каз.- 1986, Ашхабад, с. 40-41.

12. Усманов P.M., Самиев Х.С., Нуртаев Х.С. Воздействие температурного стресса на синтез белков проростков хлопчатника.// И съезд ВС1ФР-1990, Минск. Тез. докл., ч. 2 - М. 1992, с. 186.

13. Usmanov R.M., Samiev Kh.S., Nurtaev Kli.S. Heaf shock protein synthesis in some species of cotton.// Golden jubilee symposium- fndia, New-Defili, 1991, p. 753 754.

14. Усманов P.M., Самиев X.C., Нуртаев Х.С. Стрессовые белки хлопчатника Тез. докл. V конф. биохимиков Ср. Азии и (Саз,- 1991, Ташкент, с. 242.

15. Усманов P.M., Самиев Х.С., Нуртаев Х.С. Влияние пониженной температуры но синтез белков проростков хлопчатника // Тез. докл. V конф биохимиков Ср. Азии н Каз - 1991, Ташкент, с. 212.

16. Ибрагимова Э.А., Усманов P.M., Юсупова Э.Р., Бабаев Т.А., Нуртаев Х.С. Влияние стимулятора Т на биосинтез белка хлопчатника при действии высокой и низкой температуры.// Тез. докл. V конф. биохимиков Ср. Азии и Каз.- 1991, Ташкент, с. 179.

17. Усманов P.M., Самиев Х.С., Нуртаев Х.С. Синтез стрессовых белков при пшо-и гипертермии.// Тез. докл. I съезд УзОФ.Р -Ташкент, 1991, с. 131.

18. Halilova G., Usmanov R.M. Protein and peroxidase isoenzime patterns in generative organs of Gossypium species. Frontiers in sexual plant reproduction research. 1994, Austria, Vienna, p. 134.

19. Usmanov R.M., Samiev Kh., Halilova G.B., Nurtaev Kh.S., Induction of heat shock protein in cotton. Biochemical society congress. Turkey, 1994, D-02.

20.Самиев X.C., Нуртаев X.C., Усманов P.M. Влияние засухи на синтез белков хлопчатника. //Материалы научи, конф. "Биологические основы оптимизации скороспелости и продуктивности растений." - Ташкент, 1996. с.51.

Усмонов P.M.

Экстремал харорат ва сув танкислиги шароитларида гуза о^силларнинг биосинтези.

Тад^ш^этларимиз натижаларига Караганда паст ^арорат таъсири остида кузада усиш ва о^сил биосинтези жараёнлари сезиларли даражада сусавди. Рузанинг 2 ва 14 кунлик нн^олларнга ^амда пишиб етилаётган чигитларига юк,ори харорат (олтимал шароитдан 8-17° С ортш;) таъсир этганда хам шунга ухшаш ходиса кузатилди. ¡-'

G.hirsutum ва G.barbadense турларининг навлари паст харорат таьсирига бир хнлда муносабатяа булсада, ингичка толали нз^ларда о^сил биосинтезининг сусайиш даражаси урта толали навларга писбатан ю^ориро^дир. G.hirsutum навлари G.barbadense навларига ннсбатан паст хароратли стрессга узининг чидамлилигини намоён этдн.

Урганилган турларда паст ва ю^орп хароратли стресс таьсирида оцсил биосинтезининг жараёни бир хил, яни камайиш томонга силжинш руй берсада, мнуюр жн^атпдан турличадир. Бу жараёншшг угнш жадаллиги G.hirsutum нааларнаа G.barbadense навларига ннсбатан ищзлрок кузга ташланади. Олинган м.плумотларга асосан С-6037 навн исси^ликиипг салбий таъсирига 108-Ф навига ннсбатан чидамли эканлиги курсатилди.

^ар хил усуллар билэн ^осил »¡илинган цурго^чилик гуза онтогенезининг турли бос»у)1чл.трзша унинг о^сил синтезлпш хусусиятига салбий таъсир этиб, о^сил еннтезляш фасщияти даражаси но^улай омилларнинг таъсир этиши даржасн мудлатн ва гузанинг ривожланиш бос^ичларша богликдир.

Цургоцчнлнк ва харорат стрессларига чпдамлилик ирсий детерминант белги оу.шб, у хужайра геноми тараф)щан маъдум генлар фаоллипнш ошнрши екм

камайтириш йули билан амалга оширилади ва натижада стресс о^силлар синтезланади. Биэнинг тад^н^отларимизда бир сутка давоивда 5° С хароратли шароитда янги o^ciui ^осил булди. Иккала навда хам паст хароратли стресс о^силларининг шшукциясц кузатилди. Шунингдек уларнинг турларга хос компонент таркиби аншршщи (108-Ф навила - 49, 46, 44 ва 35 кД, С-6037 навида - 50, 47 ва 37 кД). Паст харорат таъсири осгида гузада стресс о^снлларининг синтеапаниши биринчи марта биз тамонимиздан курсатилди.

Иссш$ликнинг салбий таъсири иатижасида назорат вариантларида булмаган иолипептидлар de novo узсил булди. Гуза урганилган органлардаги иссШуЧик шоки оксилларшшнг (ИШО) асоснй компонентлари 94, 85, 70, 62 ва 17-19 кД мол. массалн полипептидлардан ташхил этилиши ати>ланди.

Иссшршкнинг салбий таъсирига геномиинг жуда тезкорликдаги жавоб реакциясн характерлидир - ^ароратшшг кеекин узгариши иатижасида 5 минутдан сунг янги стресс оксилларшшнг у>сил булиши кузатилди. Ингибиторли та^лил усулн билан анш^панганда 62 ва 42 кД мол. массали ИШО митохондрия геномида кодланнб ва у ерда синтезланиши ^айд ^илиндн.

Стресс о^силларининг ало^ида компонентлари синтезланишинннг но^улай омилларининг таъсир этиш мудаашта бомиклиги курсатилди. ИШО сннтезининг кинетик характернстикаси буйича биз урганган икки турда tjuctjci муддатли иссш^лик шоки таьсиршшнг турлича булншини аншумдик.

Паст ва гокори харорат таъсири остида сифаг жнхатидан турли стресс оксилларшшнг ^осид булииш усимлнк органнзмнинг но^улай шароитга мослашувп жараёнида харорагга сезувчан турли ген гурухларишшг фао/шятн тукриснда гуво.хлнк беради.

Курюкчклпк о^сплларнннг сшпех'п цишида сифат-жихатидан тубдан узгариш келтириб чи^армади. Захира (запас) оксилларшшнг эле:арофоретик спектри нисбатан барт;арорлилйгига ^арамасдан, унинг айрим компонентларнши синтезланиш жддаллипйа баъзи узгаришлар борлиги аншрянди. Бу эса ^урго^шлик чигит пишишиниит биз ургашиган бос^чларига сезнларлн даражада таъснр эшаганлиги ва транскршшия ва трансляция махсулотларндати арзимаган узгаришлар булиши тугрисида па захира о>;силн синтезлана'ётганидан далолат беради.

Утказилгпн тад^тн;отлар натижаларига биноан куйидаш тавсиялар берилдн:

-ИШО ало^ида компонентлари синте-шшшг локализацняси аа кинетик характиристикаси >(а^идаги маълумотлар стресс шароитларда хужайра геноми экспрессиясини мунтазамлашгирпш тад^и^отлари, мослашув жараеиларила хужайра органелларинннг ролиии ва маркер о^снллариинг ани^лашда ^уллаиишн мумкин.

-Захира о^снлпари сингези ва стресс о^силларминг экстремал хароратла индукцияси таци^отларнинг иатижаралари узига хос тенларни ажратиб о.шшла, идентификация ^илишда ва уларни клонларштща фойдалаинш мумкин.

-XapopaT CTpeccif Ba cyB xan^jicjiuni tuapoiiTiiaa o^cmuiap yMyuufi cumeajianiiui ;iapa«acnuiinr y3rapnuinnaH FyaaHtuir Myximimir Typjui noijyjiaii mapoinjiapiira 'liiAaMJWJitiniHiiur mc:iohh ciKjianina iJ'oi'wajiaHHai wyMKinr.

Usiuanov R.M.

Biosynthesis of cotton proteins in conditions of extreme temperatures and watei deficit.

Results of tlie teseaich showed that cold substantially depresses growth and protein biosynthesis of'tlie cotton. Similar results were obtained from tlie excessive temperature ( 8-17° C more than optimal) application on two- and fourteen-day sprouts, leaves of the adult plants and ripen seeds.

Despite the influence of tlie cold stress is similar on the sorts G.hirsutum and U .barbadense, degree of the protein biosynthesis oppressing of fine fiber cotton is higher than that of middle fiber cotton. G.hirsutum is more tolerant to the influence of the cold temperatures in comparison to G.barbadense.

Similarly to the cold stress trial, the reaction of the studied sorts, on the level oi protein biosynthesis, has a common tendency to get depressed, however the process of G.hirsutum ¡5 more intense in comparison to G.barbadense. On tlie base of the obtained results, it was shown that C-6037 is more tolerant to heat shock than 108-F G.hirsutum.

'lite influence of the drought on the cotton protein synthesis process on tlie different stages of ontogenezis calculated by means of different applications led to the oppressing of protein synthesizing activity, degree of which depended on raggedtiess and duration of unfavorable factor and the level of its development.

Water and temperature stiess resistance is genetically determined pattern and ii controlled by cell genome by activation and deactivation of specific genes, that leads to the synthesis of stiess proteins.

Synthesis de novo was discovered at the day-lime interaction of 5° C temperature in u"ir trial. 'Die cold stress proteins induction was obseived in the both sorts, however tlieie was sort-specification in their consistencies ( sort 108-F - 49, 46, 44 and 35k 1>, soil C-MJ37 - SO, 47 and 37kD) The*synthesis of the cold stress proteins v.iih an influence of the cold temperatures was shown at the first time in our experiment.

1 he heat shod, also had., to the tie novo synthesis" of polypeptides, which arc at>sem in control plants. Main components of the cotton {ISP, observed in all studied oigans, are polypeptides with molecular masses of 94,85,70,62 17- l';H>.

One of the features is response reaction of fc.enoiu to the heat shock - shortly, .ippiovimately after 5 minutes of the heat shook, the synthesis of tlie stiess proteins is ch.vii-vd The usage of the inhibition method anal)sis presented that information nbotii IISI' with iih'.I masses of 62 and 421.0 is located in genomes ot miHichondim and is ltmi4-itcd in their protein synthesizing system.

Dependence between synthesis of some components of stress proteins and dilution of unfavorable factor was discovered. The difference between sorts of two studied kinds under the influence of short-time heat shock was observed on kinetic characteristics of HSP synthesis.'

The synthesis of qualitative different stress proteins under the influence of cold temperatures and heat shocks made on evidence that at the period of adaptation these unfavorable factors are inducted and expressed different groups of temperature-sensitive genes.

An influence of the water shortage did not lead to the entire changes in the qualitative content on synthesizing proteins. Several changes in the intensity of synthesis of some components subject to comparatively stable elctrophoretic spectrum of storage proteins were noted, that showed minor influence of the water deficit in our experiments within limits of searched stages of seeds development and continuing synthesis of storage proteins without substantial changes in transcriptional and translational products.

On the base of conducted research the following recommendations were given:

- Data oil localization and kinetic characteristics of HSP's several components synthesis might be used in the further research of genom expression regulation of sells in the stress conditions, for clarification of the role of cell organelles in adaptional processes and for find of marker proteins in a future.

- Resuts of investigations of storage proteins synthesis and induction of stress proteins in extreme temperature conditions might be a base of separation, identification and cloning of coding genes.

■ - Degree of changes of common protein synthesis in temperature stress and water shortage conditions, might be applied as a criterion of cotton tolerance to different unfavorable factors of the environment.

1/ ^

IUw»««* K n»i»M 10.02.97r. . 3at»ir 20 Tup»» IOOsics. OcSbM 3 n/jt. 0m»4vr*u« x* poTtnuwiTs i>EAHP<!onyd*itica ^»¿»km«™» r.TinKSKT.