Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биология и экология бактерий, образующих магнитоупорядоченные соединения железа

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биология и экология бактерий, образующих магнитоупорядоченные соединения железа"

МОСКОВСКИ» ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

УДК 579.083.13 + 579.22 + 579.66

БИОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ, ОБРАЗУЮЩИХ МАП 1ИТОУПОРЯДОЧЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ЖЕЛЕЗА

Специальность - 03.00.07. - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах руко

ФИЛИНА Наталия Юрьевна

Москва 1998

гаоота выполнена на кафедре о от аники и микрооиологии ярославского

Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Н. В. Верховцева

Официальные оппоненты : член-корреспондент РАН,

доктор биологических наук, профессор Г. И. Каравайко кандидат биологических наук, доцент В. В. Морозов

Ведущее учереждение : Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина, РАН, п. Борок Ярославской области

Защита диссертации состоится ' 24_ декабря_1998 г.

в 15 33 на заседании специализированного Ученого Совета Д.053.05.66 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу :

119899 Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, ауд. М1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " 24 " ноября 1998 г.

Ученый секретарь специализированного Ученого совета

/ Л.М. Захарчук

Общая характеристика работы

Актуальность работы

Магнитоупорядоченные соединения - это соединения, для которых характерна упорядоченная ориентация магнитных моментов атомов (ионов, молекул) в их структуре. В настоящее время показана возможность образования таких соединений, в частности, ферромагнитных минералов (магнетита, пирротина и грейгита) прокариотическими, а магнетита - и эу-кариотическими организмами [Биогенный магнетит и магниторецепция, 1989]. Магнитотропные бактерии внутриклеточно синтезируют магнитоупорядоченные соединения железа и реагируют на изменения геомагнитного поля, передвигаясь вдоль его силовых линий (магнитотаксис) [Blakemore, 1975; 1979]. Кроме того, показано внеклеточное образование магнетита как в чистых кулыурах бактерий [Lovlev et al., 1987], гак и. сообществами микроорганизмов [Bell et а!., 1987; Слободкии и др., 1995].

Существуют ли общие пут» образования магнктоупорядочекиых .минералов железа {л частности, магнегпта) для организмов разных уровнен развития, какое физиологическое значение имеет такой биогенез - вопросы, решение которых важно для расширения представлений о биоэнергетических и биохимических аспектах метаболизма и эволюционных процессах в биосфере. ;зк кус вся эволюция жизни на Земле проводила под влиянием геомагнитного поля.

Прикладной аспект данного исследования связан с особенностями биогенных кристаллов магнетита. Они отличаются строго определенной кристаллографической формой с узким размерным распределением в пределах нескольких десятков нм, чистотой, высокой удельной площадью поверхности и специфической структурой. Это позволяет использовать такой магнитный материал для создания совершенных магнитных слоев в микроэлектронике, а также в качестве катализатора химических реакций, адсорбента-носителя для ферментов, антител, лекарственных препаратов [Mann et al., 1990; Matsunaga et al., 1990]. Такие широкие перспективы для кристаллов биогенного (бактериального) происхождения возможны при условии его биотехнологического получения.

Несмотря на большой интерес, который представляет биогенный магнетит с практической стороны, а также общебиологическое значение

познания процесса внутриклеточного биосинтеза этого минерала для фундаментальной науки, в нашей стране проведены единичные работы, свя-заиные с их изучением [Сигалсвич, Кузнецов, 1986; Сигалевич, 1991; Вер-ховцева, 1992].

Относительно формирования магнитоупорядоченных соединений железа остается много неясных моментов, касающихся как физиологических аспектов этого биогенеза для прокариотических организмов, так и вопросов, связанных с экологией бактерий, участвующих в этом процессе в природе. В первом аспекте, в частности, нет окончательных представлений о необходимых органических субстратах, требуемых для образования магнитоупорядоченных соединений, зависимости магнитных свойств бактерий от соответствующего органического вещества в среде и т.д. В аспекте экологии нет подробных исследований по определению значений рН среды, оптимальных для биогенеза магнитоупорядоченных соединений железа, а также представлений о вкладе отдельных физиологических -групп сообщества микроорганизмов, осуществляющих в природе такой процесс.

В связи с вышеизложенным не разработана стратегия и тактика выделения микроорганизмов, образующих мапгатоупорядоченкые соединения железа.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является изучение биогенеза магни-тоупорядоченных соединений железа чистой культурой бактерий и сообществом микроорганизмов.

Исходя из поставленной цели, решали следующие задачи :

1. Определение экологических и микробиологических характеристик илов природных водоемов, в которых происходит образование магнито-упорядоченных соединений железа.

2. Исследование видового разнообразия и структуры сообществ микроорганизмов из ила, обладающего магнитными свойствами.

3. Выделение чистой культуры бактерий, образующей магнитоупоря-доченные соединения железа.

4. Изучение биогенеза магнитоупорядоченных соединений железа в накопительных культурах (влияние рН, ЕЬ и органического субстрата на данный процесс).

Научная новизна работы

1. Рассмотрены наименее изученные вопросы относительно взаимодействия микроорганизмов с железом - образование магнитоупорядочен-ных соединений в процессе жизнедеятельности бактерий в чистой культуре и в микробиоценозе.

2. Впервые проведено детальное исследование влияния рН на биогенез маши гоупорядоченных соединений железа, а также рассмотрена роль окислительно-восстановительного потенциала в этом процессе.

3. Показана зависимость накопления магнитоупорядоченных соединений железа ценозом микроорганизмов от исходного субстрата в среде.

4. Разработана "разделительная" система для магнитной сепарации баетерий, внутриклеточно образующих магнитоупорядоченные соединения

5. Предложена схема синтрофкых взаимодействий в природном микробиоценозе, продуцирующем магнитоупорядоченные соединения железа.

Практическая значимость

Полученные данные представляют интерес для дальнейших исследований в области биоминералогин, для решения проблем охраны окружающей среды, в частности, для магнитной сепарации осадка в железообога-щенных сточных водах. Кроме того, результаты необходимы в биотехнологии для получения высокоочищешшх магнитных препаратов с использованием высокопродуктивных штаммов бактерий, осуществляющих биогенез магнетита.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на IV Международной конференции "Циклы природы и общества" (Россия, Ставрополь, 1996), на Международных конференциях "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы" (Россия, Пермь,1996), "Проблемы загрязнения окружающей среды" (Россия, Москва, 1998); на Международном симпозиуме "Тяжелые металлы в окружающей среде" (Россия, Пущино, 1996); на региональных конференциях "Вузовская наука в решении экологических проблем ВерхнеВолжского региона" (Россия, Ярославль, 1995), "Актуальные проблемы естественных и гуманитарных наук" (Россия, Ярославль, 1995), "Современные проблемы естествознания" (Россия, Ярославль, 1997).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 1 статья и 2 статьи находятся в печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста и содержит 22 таблицы и 20 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Список цитируемой литературы включает 185 наименований (в том числе - 111 на иностранных языках).

Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследования служили накопительные культуры бактерий, участвующих в продуцировании магнитоупорядоченных соединений железа, которые были приготовлены на основе природного материала четырех пресных водоемов:

1. Эвтрофированный пруд в районе Новоселок (Россия, Ярославль). Исходный ил имеет серо-черную окраску. В накопительную культуру (далее - модельный водоем) вносили комплексы железа как источники Fe(II) и Fe(ïïl), а также отвар хвои как природный источник хинной кислоты, обладающей комплексообразующей способностью с ионами Fe(III). Как было показано, сформировавшийся осадок модельного водоема содержит фракцию магнитного материала - магнетита [Бабанин и др., 1995].

2. Река Улейма (Россия, Ярославская область, Углический район). Относится к малым рекам Верхне-Волжского бассейна, закрыта для судоходства. Илы имеют желто-бурую окраску и содержат значительное количество остатков высшей водной растительности. Трофность р. Улеймы на различных участках варьирует, в месте отбора проб река мезотрофна.

3. Высокогорное озеро. Расположено близ вершины горы Малая Ха-типара (Россия, Ставропольский край) на высоте ~2800 м над уровнем моря. Осадки озера имеют желто-коричневую окраску, содержат растительный материал. Озеро олиготрофное.

4. Озеро Давос (Швейцария, Альпы). Олиготрофное высокогорное озеро (~2000 м над уровнем моря). Ил озера имеет преимущественно светлую окраску. Наложение искусственного магнитного поля при помощи

постоянного магнита приводит к визуальному отделению фракции магнитных частиц.

Отбор природного материала и приготовление накопительных культур осуществляли с учетом литературных данных о физиологических особенностях магнитотропных бактерий - микроаэрофилы, местообитание которых приурочено к границе раздела фаз иловые отложения-вода в природных водоемах [Blakemore, 1982; Stolz, 1993). Воду и ил в соотношении 4:1 помещали в сосуд для культивации. К одной из сторон сосуда с внешней стороны на уровне границы раздела фаз иловые отложения-вода прикрепляли южным полюсом постоянный магнит для создания искусственного магнитного поля. При наличии в составе микробиоценоза бактерий, реагирующих на изменения магнитного поля, скопление их популяций происходит в области магнита (далее - магнитная область). Накопительные куль-ауры выдерживали в течение нескольких месяцев до достижения гомеоста-тического состояния [Blakemore, Canale-Parola, 1973].

Культивирогание Aquaspirillum sp. и выращивание иловых микробиоценозов проводили на синтетической среде для магнитотропных бактерий [Schleifer et aL 1991], модифицированной автором (СМТ-2), В качестве источника железа в среду вносили 50-150 мг/л Ре(Ш)-цитрата или Fe(Iil)-гунната (со стабильным изотопом 3'Fe для съемки мессбауэровских спектров), а в качестве источника углерода использовали в большинстве случаев ацетат Na (1 г/л). Количественный учет анаэробных физиологических групп микроорганизмов осуществляли методом предельных десятикратных разведений на соответствующих микробиологических средах [Кузнецов, Дубинина, 1989].

Определение жирно-кислотного состава суммарной биомассы иловых микробиоценозов проводили на хромато-масс-спектрометре НР-5985В фирмы Hewlett-Packard (США) на базе Научного центра сердечнососудистой хирургии РАМН совместно с д.б.н. Г. А. Осиповым. Экстракцию липидов осуществляли по методу Фолча [Folch et al., 1957]. Состав микробных сообществ илов рассчитывали в электронных таблицах "EXCEL" с помощью специально разработанного алгоритма расчета [Осипов, Турова, 1996]. Определение таксономической принадлежности выделенных в работе штаммов микроорганизмов подтверждали при помо-

щи стшщартных микробиологических тестов Ня ба?.е этого же Научного центра выполняли анализ летучих жирных кислот на газовом хроматографе 5880 А фирмы Hewlett-Packard (США).

Измерение значений рН и Eh проводили на рН-метре милливольтметре рН - 121. Величину внутриклеточного значения рН определяли методом рН-метрии [Капнениекс и др., 1983], содержание растворенного органического вещества (РОВ) - фотометрически после необходимой подготовки образцов [Паников и др., 1988]. Общее содержание железа в образцах воды и ила определяли б Межфакультетской лаборатории атомно-адсорбционной спектроскопии МГУ на спектрометре Hitachi 180-80. Измерение магнитных параметров (Хтмр" парамагнитный компонент магнитной восприимчивости и 1нас- намагниченность насыщения) образцов природного ила и биомассы бактерий осуществляли методом Фарадея (в полях от О до 1,2 Тл), съемку мессбауэровских спектров проводили на базе Ярославского технического университета совместно с д.б.н. В. Ф. Бабаниным, у-резонансные спектры снимали на спектрометре ЯГР в режиме постоянных ускорений с источником 57Со в Сг активностью 20 мКи. Запись вели с помощью многоканального анализатора NTA-1024 (Венгрия). Интерпретацию мессбауэровских спектров осуществляли с использованием компьютерной программы [Николаев, Русаков, 1985]. В работе использовали просвечивающий электронный микроскоп JEMV - 100 (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кэВ и при увеличении от 5000 до 20000 без предварительного контрастирования (Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина, РАН, п. Борок, Ярославская обл.).

Результаты исследований и их обсуждение

1. Общая характеристика накопительных культур 1.1. Физико-химические и микробиологические показатели Согласно геохимической модели формирования железосодержащих минералов в водной среде [Bell et al., 1987], условия образования и стабилизирования магнитоупорядоченных соединений железа (магнетита) термодинамически благоприятны при значениях pH выше 7,0 и Eh ниже -200 мВ. Для большинства исследованных накопительных культур (кроме высо-

когорного озера) эта условия выполняются (табл. 1.). Однако, только в образцах осадка модельного водоема и оз. Давос, по данным магнитных измерений (высокие значения 1ШС), присутствуют магнитоупорядоченные соединения железа. Учитывая, что 1„ас магнетита равна 93 Гс-см3/г, можно рассчитать концентрацию этого магнитного минерала в модельном водоеме и оз. Давос, она составляет, соответственно, 1,3 % и 0,2 %. Эти накопительные культуры характеризуются также низким содержанием РОВ и сопоставимым количеством Ре(,бЩ в осадке.

Таблица 1.

Физико-химические параметры осадков накопительных культур

Нако! отельная культура рН Еп, мВ РОВ, мгС/г ила рворщ, мг/г ила Хиар,хЮ'6 см7г 1шс ,х10"3 Гс-см/г

Модельный водоем 7,7 -310 8,2 20,0 - 1252,0+9,0

р Улгйма 8,0 -270 77,8 19,3 4,0+0,05 5,7±0,2

Высокогорное озеро 6,4 -270 36,8 17,0 7,8+0,14 0

ог. Давос 7.3 О 30 1,3 19,6 20,2±0,16 195,0± 1,0

Примечание "-"- при высоких значениях !,,„ нельзя точно определить величину

Отрицательные величины окислительно-восстановительного потенциала свидетельствуют о создании в осадках накопительных культур бескислородных условий. Это область обитания анаэробной части микробиоценоза накопительных культур (табл. 2.). Результаты показали, что в осад-

Таблица 2.

Численность бактерий анаэробных физиологических групп микроорганизмов в осадке накопительных культу р

Накопит, культура Содержание микроорганизмов, кл/г сухого осадка

Железоредукгоры Сульфат-редукгеры Денитри-фикаторы Целлюлозо-разрушающие Бродиль-щики

Г:е:0,-пН20 Ре(ОН)!

Модельный Ю2 107 103 103 Ю10 10"

водоем ю'2

р.Улейма 102 ю5 103 103 10'°

Высокогор _ ю5 102 105 ю7 10ш

ное озеро 10ю

оз.Давос ю2 103 ю2 - ю9

Примечание. "-"- роста нет

ках происходит интенсивное разложение органического вещества при участии бродильных (Бр) и целлюлозоразрушающих бактерий (Цр), а также

сопряженные с ним восстановительные процессы, осуществляемые желе-зоредукторами (Жр), сульфатредукторами (Ср) и денитрификаторами (Дн). Вклад вышеперечисленных физиологических групп бактерий в анаэробное функционирование сообщества по численности можно определить следующим рядом (в кп/г сухого осадка): Бр (до 1012) > Цр (до Ю10) > Жр (доЮ7) > Дн (до 103) > Ср (до 103).

1.2. Видовое разнообразие микробиоценозов Для осадков накопительных культур микробиологическими методами был определен родовой состав целлюлозоразрущающих (табл. 3.) и сульфатвосстанавливающих бактерий (табл. 4). Кроме того, определен видовой состав сообществ микроорганизмов зоны раздела фаз осадок - вода в магнитной и немагнитной областях накопительных культур методом хро-мато-масс-спектрометрни.

Таблица 3.

Родовой состав целлюлозоразрушающих микроорганизмов

Накопительная культура Микроорганизмы

Модельный водоем pp. Cytophaga, Fusarium, Ciosiridium, Bactcroides

р. Улейма pp. Cytophaga, Celhilomonas, Fusarium, Clostridium, Bactcroides

Высокогорное озеро pp. Ccllulomonas, Micrococcus, Clostridium

оз. Давос pp. Cytophaga, Cellulomonas, Bacillus (B.ccreus), Fusarium, Clostridium, Bactcroides

Таблица 4.

Родовой состав сульфатвосстанавливающих бактерий

Накопительная культура Микроорганизмы

Модельный водоем Desulfobacter sp., Desulfotomaculum sp., Desulfovibrio sp.

р. Улейма Desulfobacter sp., Desulfovibrio sp.

Высокогорное озеро Desulfotomaculum sp., Desulfovibrio sp.

оз. Давос Desulfobacter sp.

Микробиоценоз модельного водоема представлен 26 видами эубак-терий, относящимися к 21 роду (табл. 5); озера Давос - 18 видами 15 родов (табл. 6); р. Улеймы - 19 видами 15 родов (табл. 7). В сообщества входят

также микроскопические грибы (р. ¡•шапит), простейшие и микроводоросли.

Таблица 5.

Состав сообщества микрорганизмов из осадка модельного водоема (хЮ9 кл/г сухого осадка)

№ Организм Магн." Немагн.*

1 Acetobacter diazo'rophicus 204 267

2 Acinetobacter sp. 28 103

3 Pseudomonas cepacia 53 58

4 P. putida 24 92

5 Xanthomonas msltophilia 10 35

6 Methvlococcus sd. 11 3

7 Flavobacterium sp. 10 10

а Aouaspinllum sp. 52 77

9 Bdellovibrio sp. 12 8

10 Klebsiella Sp. 110 110

11 C\1oühzoa sp. 22 33

12 Leptothrix pseudoocliracea 0 10

13 Caulobacter vibnoides 79 79

14 Chlamydia rracnomatis 2 0

15 Nitrobacter sp. 54 62

16 Bactercides hypeimegss 2 3

17 S. rumimcola 81 120

18 Eubacterium sp. 31 31

19 Nooardia sp 59 107

20 Streptomyces sp. 20 60

21 Madurcmycetes sp 92 25

22 Streptosporangium sp. 172 193

23 Bacillus sp. n 31

24 Clostridium propionicum 0 6

25 c. difficile 131 7

26 C. perfnngens 1 1

27 Fusarium sp. 167 220

28 Protozoa 6 3

29 Algae 5 10

Примечание *Магн , 'Немагн - Сообщество микроорганизмов соответственно в магнитной и немагнитной области накопительной культуры

О кооперативной метаболической слаженности исследованных микробиоценозов свидетельствует разнообразие экологических и физиологических возможностей отмеченных в ней видов. По отношению к окислительно-восстановительным условиям представители микробиоценозов ге-терогененны (аэробные, факультативно анаэробные и анаэробные виды). Из физиологических групп можно выделить целлюлозоразрушающие, сульфат- и железовосстанавливающие, автотрофные нитрифицирующие бактерии и микроорганизмы, осуществляющие процесс брожения.

Таблица 6.

Состав сообщества микрорганизмов из осадка озера Давос (х]09 кл/r сухого осадка)

№ OcraHW3M *Магн. *Немагн.

1 Acetobacter diazotrophicus , 405 323

2 Aclnetobacter sp. 21 56

3 Pseudomonas cepacia 170 79

4 P. putida 2548 625

5 Ftavobacterium sp. 28 15

6 Leptothrix pseudoochraceae 1 8

7 Aquaspiriiium sp. 1 35

8 Unknown 321 114

9 Cytophaga sp. 65 37

10 Cettutomonas sp. 60 0

11 Caulobacter vibrioides 18 6

12 Bacteroides ruminicola 87 75

13 Citrobacter sp. 18 17

14 Nocardia sp 4 3

15 Maduromycetes sp. 207 73

16 Streptosporangium sp. 10 54G

17 Bacillus cereus 107 32

18 Clostridium difficile 41 24

19 C. propionicum 6 0

20 C. perfringens 2 2

21 Fusarium sp. 7 160

22 Protozoa 11 29

23 Algae 44 42

500 1000 1500

1

t

Л

1

15^

О Магн.

■ Немагн

19

*L

]

23 t

Примечание. *Магн., *Немагн. - Сообщество микроорганизмов соответственно в магнитной и немагнитной области накопительной культуры

о

Часть штаммов из накопительной культуры озера Давос, у которых набор липидньтх маркеров не сопоставим с имеющимся банком данных, мы отнесли в группу Unknown. Состав сообщества в магнитной и немагнитной областях накопительных культур не одинаков как в качественном, так и в количественном отношении. В магнитной области модельного водоема доминируют: Acetobacter diazotrophicus, Klebsiella sp., Ciosiridium difficile, Streptosporangium sp. и микроскопические грибы p. Fusarium; озера Давос - Pseudomonas putida, P. cepacia, Acetobacter diazotrophicus, Madu-romycetcs sp., Bacillus cereus и представители группы Unknoun, только в области магнита отмечены Clostridium propionicum и Cellulomonas sp. В магнитной области накопительной культуры р. Улеймы доминируют Acetobacter diazotrophicus, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas sp., Shewanella putrefaciens, Cytophaga sp., Klebsiella sp., Bacteroides ruminicola, Bacillus subtilis, Clostridium sp., Fusarium sp.

Таблица 7.

Состав сообщества микрорганизмов из осадка реки Улеима (х] (Г кл/г сухого осадка)

N3 Организм x1C9 кл/г

1 Acetcbactsr diazctrophicus 657

2 Pseudomonas sp. 462

3 P. cepacia 206

4 P. putida 55

5 Shewanella putrefaciens 182

6 Flavobactsrium sp. 33

7 Leplothrix pseudoochraceae 60

8 Bdellovibrio sp. 67

9 Cytophaga sp. 216

1С Celiulomonas sp. 93

11 Klebsiella so. 405

12 Chlamydia trachomatis 20

13 Bacteroides hypermegas 8

14 B. ruminicola 143

15 Nocaroia sp. 66

16 Streptomyces sp. 15

17 Bacillus sp. 105

18 B. subtilis 140

19 Clostridium sp. 139

20 Fusarium sp. 131

21 Protozoa 107

22 Algae 14S

Наибольшее сходство видового состава в магнитной области накопительных культур (коэффициент общности видового состава К=68 %) отмечено для сообшесгв модельного водоема и оз. Давос. Напомним, что именно для этих водоемов было показано накопление магнитоупорядочен-ных соединений железа в осадках по данным магнитных измерений (табл.

и

2. Выделение и магнитные свойства Aquaspшllum Бр.

Для выделения чистой культуры бактерий, образующей магнитоупо-рядоченные соединения железа, нами была разработана лабораторная "разделительная" система. Установка основана на принципе магнитной сепарации и дает возможность получить отдельный штамм или микробиоценоз, которые характеризуются высокими значениями 1шс(табл. 8).

Посев инокулюма из области магнита модельного водоема в "разделительную" систему на жидкую среду СМТ-2 привел к выделению магнитотролных бактерий в виде мутного кольца на уровне магнита, из ко-

« »«<* пЛГ1«/<му|| тплл РК^Т-О " ни ЧК/лу IV Д - А.

была выделена чистая культура.

Таблица 8.

Магнитные параметры АдиахртПит хр. и микробиоценозов, полученных методом "разделительной" системы

глплг>л п лонгпг ФЛта пллпаплплппащ »11 «V пап V и ^ 1 и 1 С* 1V llUVavДuUUiW■llUllUtA 11VI-/

Объект исследования Магнитные параметры

Хгар, хЮ 6 СМ3/Г 1нас, хЮ"3 Гс-см3/г

А({иахр1гШит хр. 22,1+0,5 442,0 ±3,2

р. Улейма 18,4 ±0,4 312,0 ±3,1

Высокогорное озеро 20,6 ± 0,4 4,9 ± 1,6

оз. Давос 17,1 ±0,6 300,7 ± 2,8

Данный штамм по морфологическим, фшиолого-биохимическим признакам и жирно-кислотному составу клеточной стенки был отнесен к р. А(]иа$рт11ит. Бактерии способны к внутриклеточному образованию маг-нитоупорядоченных соединений железа. Исходя из значений 1,ас клеток ак-васпириллы (табл. 8.), также как в разделе 1.1., можно рассчитать, что количество образованного магнетита этой культурой может составлять 0,5 %.

2.1. Биогенез магнитоупорядоченных соединений железа в культуре АциахртИит ¡р.

Биогенез магнитоупорядоченных соединений железа выделенной ак-васпириллой зависит от источника железа в среде. Так, для Бе(Ш)-цитрата, являющегося функциональным сидерофором для многих гетеротрофных бактерий [Ыейапск, 1977], транспорт в клетки АдиавртИит хр. происходит без восстановления (табл. 11) и заканчивается накоплением соединений железа с более высокой намагниченностью насыщения и концентрацией, чем для Ре(Ш)-гуината (табл. 9.).

Таблица 9.

Зависимость магнитных параметров АциахртИит Бр. от источника железа в среде

Источник железа в среде Хпар, х 10"6 см3/г 1нас, X Ю"3 ГС-СМ3/Г

Ре(Ш)-цитрат Ре(Ш)-гуинат 1,6 6,0 67,0 32,0

Биогенез магнитоупорядоченных соединений железа в культуре Ац-иаяртИит хр. зависит также от рН среды культивирования (табл. 10). Наибольшая концентрация-магнитоупорядоченных соединений характерна для

ач^аСПИП1*™11 чьтп^шиу ия ппрпр Т^ПП^пытпатлм гти пМ 7 ? я няимрт,.

и.ш«...^,-..., ~ -V"-/ —— - . , ~ ------------

шая - при рН 9,1. Это можно объяснить, с одной стороны, изменением стабильности комплекса железа (Ре(Ш)-цитрат растворим при рН < 7,5), а с другой стороны - изменением энергетического статуса клеток (ЛрН).

При рН среды 7,2 ( наиболее оптимальном для роста ЛдиаярМПит яр.) , условия транспорта Ре(Ш)-цитрата наиболее благоприятны, поскольку Ре(Ш)-циграт находится еще в растворимом состоянии, а составляющая

Таблица 10.

Зависимость магнитных параметров ЛдиахричНит ¡р. от рН среды

рН ЗСпаг. Х 10_Л СМ3/г 1шо> х 10"3 Гс-см3/г

5,9 3,2 ± 0,8 38,4 ± 3,6

7,2 22,1 ±0,5 442,0 ± 3,2

9,1 15,7 + 1,5 18,6 ± 1,7

трансмембранного потенциала ЛрН направлена внутрь клетки (рН Б,!Г,Р7,9 >

рН Это подтверждается самой высокой концентрацией железа

(повышенное значение %пар ), значительная часть которого перешла в маг-нитоупсрядоченное состояние (наиболее высокие значения 1ШС).

Таблица 11.

Зависимость мессбауэровских параметров (КР и ИС)

от источника железа в средс и от рН

Источник железа рН среды К И,

Ре(Ш)-гуинат 7,2 0,648 0,539

0,651 0,295

<283* 1,5<Р0*

Ре(Ш)-цитрат 5,9 0,640 0,300

0,640 0,530

7,2 0,458 -0,335

0,455 0,185

9,1 0,625 0,597

0,639 0,332

Примечание. (*) значения КР я ИС характерны для соединений Ре(П), во всех остальных случаях для соединений Ре(Ш).

Анализ параметров мессбауэровских спектров бактерий (табл. 11.,

рис. 1) по сравнению с контролем показал, что гуинат железа трансформируется акваспириллой с образованием трех форм железа, две из которых со степенью окисления Ре(Ш) и одна - Ре(Н) (рис. 1, А), а цитрат железа -

интенсивность, отн. ед

2 бОк

интенсивность, отн ед.

1 ЗОк

ПОк

90к

О 50 100 150 200 250

Скорость, кап.

О 50 100 150 200 250

Скорость, кан.

интенсивность, отн.ед.

421кг

413к"

Гесп!)

VI тт— п

§

интенсивность, отн.ед.

894к

О 50 100 150 200 250

Скорость, кан.

886к

О 50 100 150 200 250

Скорость, кан.

Рис. 1. Мессбауэровские спектры Адиа.^ри'Шит яр. при выращивании на среде с гуинатом Ре (III) при рН 7,2 (Л) и цитратом Ре (III) при рН 5,9 (В), 7,2 (Б), 9,1 (Г).

только двух форм Fe(IIl) (рис. 1, Б,В,Г)- Величина квадрупольного расщепления (КР) коррелирует с магнитной упорядоченностью образующихся соединений железа. Самые низкие значения величин КР и изомерного сдвига (ИС) получены для бактерий, выращенных при рН 7,2 на среде с Fe(III)-нитратом, что свидетельствует о координационной упорядоченности обеих форм Fe(III) и присутствии магнитоупорядоченных соединений железа.

3. Биогенез магнитоупорядоченных соединений железа в накопительных культурах 3.1. Зависимость магнитных параметров микробиоценозов отрН среды

В качестве посевного материала использовали суспензию микроорганизмов из магнитной области накопительных культур. Иловые микробиоценозы выращивали в микроаэробных условиях на СМТ-2 с Fe(HI)-цитратом (150 мг/л).

Показано, что для высокогорного озера значения 1„аС невелики (рис. 2, Л). Для накопительной культуры р. Улеймы отмечен также незначительный максимум (рН 6,80) (рис. 2, Б). Возрастание 1нас в биомассе мнкробио-ценоза модельного водоема происходит при выращивании ценоза при рН 6,5-6,9 и в диапазоне значений рН 7,2-9,4 (рис. 2, В).

Анализируя полученные данные, можно связать их с устойчивостью комплекса Ре(1П)-цитрата. Кроме того, нами было показано, что при значениях рН, где наблюдалось резкое увеличение концентрации магнитоупорядоченных соединений железа, происходит доминирование определенных видов бактерий и их ассоциаций, ответственных, по-видимому, за данный биогенез (Рис. 3). Вероятно, играет значение также энергетический статус ассоциации микроорганизмов, связанный с АрН. Для снижения (или полного снятия) концентрационной составляющей электрохимического мембранного потенциала клеток (АрН) добавляли в среду бензойную кислоту (10 мкМ). Использовали варианты, где ранее было показано наибольшее концентрирование магнитоупорядоченных соединений железа в биомассе при культивировании биоценоза из зоны магнита модельного водоема. В

результате наблюдали падение величины 1гас вплоть до нулевых значений.

35

30

25 20 15

10

5

0

500 400 300 200 100 0

Хил»

А

п

I

6,50 7,10 - 1|1ЛС

7,25

П.

Л7

7,30

п

,10

,25

,75

II

п

л

20

15

10 5

О

9,10 рН

Хпар -| 25

20

15

■10 5

О

6,45 1цдс

6,55 6,80 7,0О

7,40

7.60

8,10 8,40 рН Хпар

а

а.

20 16 12

О

6,50 6,70 7,00 7,40 7,60 8,20 8,60 8,90 9,15 9,40 рН

Рис.2. Зависимость магнитных параметров биомассы иловых микробиоценозов от рН среды культивирования. А - микробиоценоз высокогорного озера; Б - микробиоценоз р. Улеймы; В - микробиоценоз модельного водоема. Примечание. | | 1цас хЮ'1 Гс-см3/г

^ТрЩ Хпар* 10"* смч/г

ЧиГТТРННЛГТ*, V п /|

4ППП-

зооо-

Рис.З. Изменение численности мик-

роорга1шзмов ценоза модельного водоема в зависимости отрН среды. Примечание. Обозначения:

X.maltophilia Bacillus sp. P. cepacia ..... P.putida

9,4 pH

3.2. Анаэробное образование магнитоупорядоченных соединении железа Выращивание микробиоценозов из накопительных культур проводили на СМ'Г-2 в 500 мл флаконах из темного стекла с анаэробными затворами при начатьном значении рН 7,2. В качестве источников углерода использовали целлюлозу и возможные продукты ее анаэробного разложения в природе.

Как свидетельствуют полученные данные, для каждого исследованного ценоза характерен свой органический субстрат, который благоприятен для образования магнитоупорядоченных соединений при трансформации Бе (Ш)-цитрата (в данных условиях культивирования), о чем свидетельствуют соответствующие максимумы 1цас (табл. 12,): для модельного водоема - при росте на целлюлозе, для высокогорного озера - на пропионате, для р. Улеймы - на пирувате, для оз. Давос - на ацетате, пирувате, сукцинате. С одной стороны, это можно объяснить величиной редокс-потенциала окисляемого органического субстрата, и, соответственно, уровнем поступления восстановительных эквивалентов в анаэробную дыхательную цепь и редукцией Ре (III); с другой стороны - предпочтением того или иного источника углерода анаэробными микроорганизмами ценоза, которые участвуют в процессе биогенеза магнитоупорядоченных соединений железа. В ценозе оз. Давос выбранные условия культивирования наиболее благоприятны для

1К

образования таких соединений, доля магнетита в них может составлять до 1 %.

Таким образом, концентрация соединений железа с магнитной упорядоченностью, накапливаемых иловыми микробиоценозами в анаэробных условиях, зависит от органических субстратов и снижается в следующем ряду по их способности благоприятно влиять на биогенез : ацетат > пиру-ват > сукцинат > пропионат > целлюлоза > этанол > лакгат.

Таблица 12.

Зависимость магнитных параметров микробиоценозов от источника

углерода в среде при анаэробном культивировании

Накопительная культура Модельный водоем р. Улейма Высокогорное озеро оз. Давос

Источник углерода вереде Хмд хЮ"6 см3/г хЮ"3 Гс- см3/г Ххир, хЮ"6 см^г хЮ"3 Гс-см3/г ЗСтр, хЮ"6 см3/г и хЮ"3 Гс-слг/г Хтр, хЮ"6 см3/г х]0"3 Гс-см3/г

ЦЕЛЛЮЛОЗА 4,5 ± 0,7 13,1 ± 0,3 2,1 ± 0,1 0,3 0,8± од 1 8-1-" 0,4 2,3 ± ОД 0

ЛАКГАТ 14,3± 0,01 1,9± 0,1 21,6± ОД 0 15,9± од 0,9+ 0,3 22,1± 0,3 0

АЦЕТАТ 25,6± 1,0 11,0± 1,0 20,1± од 1,7 + о,з 9.0 ± 0,2 9,3 ± 0,9 21,3± 1,3 1131,0+ 8,0

ПРОПИСНАТ 27,0± 0,1 4,1 ± 0,3 49,1 ± 0,4 7,4 ± 1,8 5,8 ± 0,7 35,9± 4,8 11,2+ 0,5 12,0± 1,7

СУКЦИНАТ 28,0± 0,2 3,5 ± 0,8 27,6± од 3,6 ± 1,0 23Д± од 3,6 ± 0,4 - 687,0+ 9,0

ПИРУВАТ 14,7± 0,1 7,7 ± ОД 32,9± 0,7 9,1 ± 3,0 23,3± 0,8 9,6 ± 0,3 23,3± 0,7 858,0± 3,0

ЭТАНОЛ 3,2 ± 0,3 1,6 ± 1,4 6,7 ± од 0 21,8+ од 0 20,0± ОД 2,9 + 0,2

Примечание. (-) - нет данных.

3.3. Образование магнитоупорядоченных соединений железа в накопительных культурах сульфат- и железоредукторов Для того, чтобы изучить вклад сульфат- и железоредукции в биогенез магнитоупорядоченных соединений железа, использовали метод накопительной культуры для соответствующих физиологических групп. В качест-

ве источника железа лля сульфатредукторов в среду вносили Ре(1П)-нитрат (150 мг/л), для железоредукторов - свежеосаждениый гидроксид Ре(ОН)з (с исходными магнитными параметрами : р= 55,62 ±0,13 х 10"6 см3/г и 11ВС= 5,94 + 0,54 х Ю'3 Гс-см'/г).

Таблица 13.

Магнитные параметры биомассы сульфатредукторов

Магнитные параметры МВ* у* ВО* Д*

Хпар, X 10"6 СМ3/Г 1нас, X 10"3 Гс-см3/г 2,3±0,2 49,9+1,0 9,9±0,2 4,7+1,0 5,6±0,7 110,5+3,0 5,5±2,6 432,2±11,1

Примечание (*). МВ-модельный водоем, У-р. Улсйма, ВО-высокогорное озеро, Д- оз. Давос

Таблица 14. Магнитные свойства железоредукторов

Магнитные мв* у* ВО* 7Т*

параметры

Хшр, X 10"6 СМ'7г 11,09±1,07 17,10±0,27 19,33±0,43 13,91±0,62

1нас, X Ю-3 ГС-СМ3/Г 19,23+0,38 5,42±1,16 0 51,71+3,42

Примечание (*). МВ-модслькый водоем, У-р. Улсйма, ВО-высокогорнос озеро, Д- оз Давос

Показано, что разложение лактата в накопительных культурах суль-фатвосстанавливаюших бактерий всех исследованных водоемов сопровождается образованием магнитоупорядоченных соединений железа (табл. 13). Однако, сульфатредукторы оз. Давос наиболее производительны в этом процессе (до 0,4 % магнетита, расчет произведен на основе значений 1„ас магнетита и осадка сульфатредукторов, см. раздел 1.1.).

Процесс Ре(Ш)- восстановления в накопительных культурах железоредукторов модельного водоема и оз. Давос также связан с концентрированием магнитоупорядоченных соединений железа, о чем свидетельствует возрастание 1нас в образцах осадков соответственно: в 3 и 8 раз через месяц культивирования (табл. 14.), по сравнению с исходной величиной 1„ас гид-роксида. Однако, в количественном отношении таких соединений ~ в 10 раз меньше (по сравнению с накоплением магнитоупорядоченных соединений в накопительных культурах сульфатредукторов) ~ 0,05 %. Осадки

именно этих водоемов были "намагничены" (табл.1.). В накопительных культурах железоредукторов р. Улеймы и высокохорного озера процесс восстановления Ре(Ш) не сопровождается образованием магнитоупорядо-ченных соединений.

4. Схема синтрофных взаимоотношений в ценозе бактерий, участвующих в образовании магнитоупорядоченных соединений железа На основании полученных экспериментальных данных можно предложить схему сшпрофных взаимодействий в сообществе микроорганизмов, в состав которого входят бактерии - продуценты магнитоупорядоченных соединений железа (Рис. 4).

В условиях замкнутого потока углерода (в накопительные культуры нет доступа органического вещества извне) аэробные и анаэробные целлю-лозоразрушающие бактерии, деструктурирующие растительный материал в иле, являются первичным звеном в трофической цепи сообщества. Их продукты метаболизма используются в качестве органических субстратов гетеротрофными представителями микребиоценоза (бродклыциками, сульфат- и железоредукторами), процессы жизнедеятельности которых сопровождаются трансформацией Ре(П1) с образованием магнитоупорядоченных соединений железа в условиях невысоких значений концентрации Ог- В результате захоронения таких минералов осадки (илы) водоемов приобретают магнитные свойства, то есть биоостаточную намагниченность.

л

Fe(III) — Fc(II)

Целлюлоза—илюкоза, ацетат, формиаг. С02

Í2 з i

СО2+Н2О <-------v

1. Разложение целлюлозы аэробными целлюло-зоразрушающими микроорганизмами.

2. Образование целлюлозы микроорганизмами.

3. Потребление органических субстратов азроб-нмми гетеротрофными бактериями.

со2,

8 9

7c(III) ->Fe(II) ->[Fe}04].

(Fe(II),Fe(III)-coeimneiiiiM)

органические

- субстраты

(ацетат) /л

Потребление органических субстратов гетеротрофными ' аэробными, микроаэро-фильными, п том числе и магнитотаксн-ческими бактериями (АциазршПшп эр.)

В

Fe(III) >Fc(II) —>[Fei0.i]

10

Целлюлоза"

ГЬ^СОг^-6

- FcS FcS2 Fcx-iS FcjS^

S'' 1 ацетат*-

глюкоза, формиат, этанол, лактат,

___сукципат, пиру пат,

ацетат, СО2, H¿0, бутират, иропиопат. — валериат, нзовале-риат, изобутираг.

5. Разложение целлюлозы в анаэробных условиях.

6. Использование органических субстраюв сульфат1юсстапаплтающими бактериями.

7 Использование органических субстратов анаэробными бактериями.

8. Восстановление соединений Ре(Ш).

9 Биоминсрапизания соединений железа

10. Захоронение магнитоупорядоченных соединений железа. Намагничивание донных осадков

Рис. 4. Схема синтрофиых взаимоотношений в ценозе бактерий, образующих мапнпоупорядоченные соединения железа.

Примечание: [Г'е^Од] - магнитоупорядоченные соединения:

.............> диффузия органического вещества, газов, соединений железа;

А - аэробная, Б - микроаэробная, В - анаэробная зоны водоема.

6

Выводы

1. Образование и накопление магнитоупорядоченных соединений железа в условиях природных иловых отложений происходит при содержании Ре^.ц в осадках в количестве - 20 мг/г ила, при низкой концентрации РОВ (до 10 мгС/г ила), при высокой степени восстановленности среды (ЕИ < -230 мВ). В илах осуществляются редукционные микробиологические процессы, в которых участвуют железоредукгоры, сульфатредукторы, де-нитрификаторы, целлюлозоразрушающие и бродильные микроорганизмы.

2. Сообщества микроорганизмов илов, в которых накапливаются магнитные минералы, включают от 18 до 26 видов микроорганизмов, относящихся к 15-21 роду, но отличаются высоким сходством видового состава (коэффициент общности К=68 %). Они гетерогенны по отношению к источнику углерода (авто- и гетеротрофы, олиго- и копиотрофы), к концентрации кислорода (аэробные, факультативно-анаэробные и анаэробные виды), по выполняемым физиологическим процессам (разрушение целлюлозы, сульфатредукция, железоредукция, нитрификация).

3. Из ила модельного водоема, в котором отмечено накопление магнетита в концентрации 1,3 %, выделена магнитотропная Адиахр'пИит яр., способная образовывать до 0,5 % магнетита в своей биомассе на среде с Ре(Ш)-цитратом при рН 7,2.

4. Количество образуемых магнитоупорядоченных соединений железа ценозом бактерий зависит от исходной величины рН среды, растворимости железа и имеет максимумы п слабокислом - нейтральном (6,5-6,9) и щелочном (7,3-9,4) диапазонах, которые соответствуют изменению численности отдельных видов бактерий.

5. Образование магнитоупорядоченных соединений железа зависит от величины ДрН-составляющей трансмембранного потенциала клеток магнитотропного сообщества бактерий. В большей степени эта зависимость проявляется при выращивании микроорганизмов в щелочных условиях среды.

6. Концентрация соединений железа с магнитной упорядоченностью, накапливаемых иловым микробиоценозом в анаэробных условиях, зависит от органических субстратов, которые можно расположить в следующем ряду по их способности благоприятно влиять на биоминерализацию : ацетат > пируват > сукцинат > пропионат > целлюлоза > этанол > лактат.

7. Остаточная намагниченность осадков пресных водоемов является результатом процессов жизнедеятельности автохтонного сообщества микроорганизмов железосодержащих илов при синтрофной трансформации органического вещества - целлюлозы и продуктов ее деградации. Анаэробные процессы сульфат- и железоредукции являются обязательными для биоминерализации магнитоупорядоченных соединений железа.

Список работ по теме диссертации

1. Филина Н.Ю., Верховцева Н.В. Биотехнология биогенного магнетита // Тез. докл. Региональной научно-практической конференции "Вузовская наука в решении экологических проблем Верхне-Волжского региона" . Ярославль. 1995. С. 85-86.

2. Верховцева Н.В., Филина Н.Ю., Лебедева Н.Г. О природных моделях и модельных системах минералообразования // Труды конф. "Актуальные проблемы естественных и гуманитарных наук". Ярославль. 1995. С. 28-31.

3. Филина НЛО. Цикл углерода в накопительной культуре магнито-такспческих бактерий И Тез. докл. 1У Международной конференции "Циклы природы и общества". Ставрополь.1996. С.354-355.

4. Филина Н.Ю., Верховцева Н.В. О возможное га биогенного образования гематита /7 Тез докл. Международной конференции "Микробное разнообразие • состояние, стратегия сохранения, экологических- проблемы". Пермь. 1996. С. 116-117.

5. Верховцева Н.В., Волкова И.Н., Филина Н.Ю., Бабанин В.Ф. Ценозы микроорганизмов, определяющие адаптационную устойчивость к ферромагнитным загрязнителям ландшафта // Тез. докл. Международного симпозиума "Тяжелые металлы в окружающей среде". Пушино. 1996. С. 100-101.

6. Филина 11.10., Верховцева Н.В. К экологии магнитотаксических бактерий /,/ Труды областной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых " Современные проблемы естествознания". Ярославль. 1997. С.128-130.

7. Филина Н.Ю., Верховцева Н.В., Лебедева Н.Г. Целлюлозоразру-шающие микроорганизмы как компонент накопительной культуры магни-тотаксических бактерий // там же. С. 122-124.

8. Пухов Д.Э., Филина ШО. Выделение и изучение бактерий, ассоциированных с почвенными магнитными конкрециями // Биол. исследования в Ярославском госуниверситете. Ярославль. 1997. С.35-36.

9. Филина Н.Ю., Верховцева Н.В., Осипов Г А. Микробное разнообразие ила реки Улеймы как показатель экологического состояния // Био-

технологозкологические проблемы бассейна Верхней Волги Ярославль. 1998. С. 61-65.

10. Верховцева Н.В., Филина Н.Ю., Осипов Г.А. Ценозы магнетит-продуцирующих микроорганизмов в защите биосферы от токсичных концентраций железа // Тез. докл. Международной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды". Москва. 1998. С. 135.

11. Филина Н.Ю., Верховцева Н.В., Лебедева Н.Г. Средообразующая роль целлюлозоразрушающих микроорганизмов в биогенезе магнитоупо-рядоченных соединений железа // Современные проблемы биологии и химии : Сб. научн. трудов. Ярославль : ЯрГУ. 1998. В печати.

12. Филина Н.Ю., Верховцева Н.В., Бабанин В.Ф., Пухов Д.Э. Био-мииерализация магнитоупорядоченных соединений железа в культуре Ау-иаартИит зр. /7 Биофизика. В печати.

Заказ 2377. Тираж 100. Отпечатано в типографии Ярославского государственного технического университета, г. Ярославль, ул. Советская, 14а. Телефон 30-56-63.