Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МАСЛЯНОКИСЛОГО БРОЖЕНИЯ В МЕЛКИХ СЫЧУЖНЫХ СЫРАХ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МАСЛЯНОКИСЛОГО БРОЖЕНИЯ В МЕЛКИХ СЫЧУЖНЫХ СЫРАХ"

4 -шоу

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А, ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи Геннадий Дмитриевич ПЕРФИЛЬЕВ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МАСЛЯНОКИСЛОГО БРОЖЕНИЯ В МЕЛКИХ СЫЧУЖНЫХ СЫРАХ ( Специальность 03.00.07 — микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 197»

*

Работа, выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте -маслодельной и сыродельной промышленности Научно-производственного объединения «Углич».

Научный руководитель — кандидат биологических наук А. В. Гудков.

Официальные оппоненты: доктор -биологических наук Королева Н. С., кандидат биологических наук Переверзе-ва Г. И.

Ведущее предприятие — Вологодский молочный институт. Министерство сельского хозяйства СССР.

Защита состоятся « ±6* о&уя&фыи 1979 г.

в ¿Я' час. на заседании Специализированного совета K-I20.35.06 в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимн ряэева. Адрес: 127650, Москва, И-550, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться вДХНБ ТСХА.

Автореферат разослан « Й » семТЛ^А) 979 г.

Ученый секретарь Специализированного совета ^—

доцент В. Г Марьенко

Л'J ару

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛВОТЫ

Актуальность проблемы. «Основные направления развития народного хозяйства СССР на 1976—1980 годы», принятые XXV съездом КПСС, предусматривают увеличение к 1980 году выработки сыров в 1,4 раза. Важное значение в условиях увеличения выпуска сыра приобретает проблема повышения его качества.

Качество сыра во многом определяется интенсивностью и направленностью микробиологических процессов в сырной массе. Основной полезной микрофлорой сыра являются молочнокислые микроорганизмы закваски. Однако при современной технике и технологии производства сыра невозможно исключить попадания и полностью подавить развитие микроорганизмов, способных вызвать появление тех или иных пороков,* снижающих качество готового продукта.

Наиболее опасными возбудителями порчи натуральных и плавленых сыров являются спорообразуюшие анаэробные бактерии рода Clostridium Prazmowski 1880. Слоры.этих мик-' роорганизмов, всегда присутствующие в молоке при силосном типе кормления коров, выдерживают тепловую обработку молока, принятую в сыроделии. Существующие способы борьбы с клостриднальнымк брожениями в сырах имеют существенные технико-экономические недостатки.

Одной из причин низкой эффективности имеющихся в сыроделии способов борьбы с клострндпямн является отсутствие достаточно полных данных о биологических особенностях этих микроорганизмов. В литературе мало сведений о влиянии физико-химических условий, характерных для сыров, на жизнедеятельность этих микроорганизмов; не изучена динамика развития клостридий в сырах; недостаточно данных о влиянии молочнокислой микрофлоры на спорообразуюшие анаэробные бактерии рода Clostridium.

Изучение фнзиолого-биохнмических и экологических свойств клостридий, выделенных нз молока и сыров, является необходимым и важным звеном в разработке более эффективных способов подавления развития этих микроорганизмов в сырах.

: ^ЬТгоС i^ra {л. , -

Цель н задачи исследования. Темой исследований явилось изучение биологических свойств маслянокислых бактерий, выделенных из молока и сыров, с целью разработки более совершенных н эффективных методов подавления их развития в наиболее распространенных в нашей стране сырах с низкими температурами второго нагревания.

Для достижения этой цели было намечено решить следующие задачи:

1. Изучить физиолого-бнохнмнческне свойства масляно-кислых бактерий, выделенных из молока и сыров; их отношение к источникам энергии, уровню активной кислотности, концентрации хлорида натрия, температуре.

2. Исследовать влияние некоторых, наиболее активных в биохимическом отношении микроэлементов и молекулярного кислорода на рост и метаболизм маслянокислых бактерий.

3. Разработать питательную среду для учета вегетативных клеток маслянокислых бактерий и определить динамику роста клостридий в сырах с низкими температурами второго нагревания.

4. Выяснить причины антагонистического действия молочнокислых палочек вида Lactobacillus p&ntarum (Orla-Jensen, 1919j;Bt%ey et aJ., 1923) на маслянокислые бактерии.

5. Установить возможность использования молочнокислых палочек, для подавления роста маслянокислых бактерий в сырах с низкими температурами второго нагревания.

6. Создать бактериальный препарат с направленным антагонистическим действием на маслянокислые бактерии и проверить эффективность его действия при производстве сыров. .

Научная новизна. В результате проведения работы впервые получены количественные данные, характеризующие динамику роста различных видов клостридий в процессе выработки и созревания мелких сычужных сыров. Установлено, что наибольшую опасность для этих сыров представляют микроорганизмы вида Clostridium tyrobutyricum van Beynum et Pette, 1935, Изучен рост и метаболизм маслянокислых бактерий в экстремальных для этих микроорганизмов, но характерных для большинства видов мелких сычужных сыров условиях.

Получены количественные данные об ассимиляции молекулярного кислорода и образовании перекиси водорода различными видами и штаммами маслянокислых бактерий. Пока, зано, что токсичность кислорода для спорообразующих анаэробных бактерий рода Clostridium может быть обусловлена образованием перекиси водорода или ОН!раднкалов.

Изучено взаимоотношение молочнокислых палочек вида L. plantarum и маслянокислых бактерий вида С. tyrobutyricum в модельных средах и сырах. Установлено, что иигнбнгорное действие молочнокислых палочек на маслянокислые бактерии

о

обусловлено образованием первыми перекиси водорода в ле-талышх для клостридий количествах.

Практическая ценность. На основании выполненных исследований:

— разработана элективная питательная среда для учета вегетативных клеток лактатсбраживающих клостридий, которая может быть использована в производственных и научно-исследовательских учреждениях при оценке активности указанных микроорганизмов в силосе и сыре;

— разработана и утверждена в установленном порядке норм ативно-техническая документация на сухой бактериальный препарат с антагонистическим действием на маслянокнслые бактерии (ТУ 49 493—78). Производство бактериального препарата организовано в производственной лаборатории бактериальных препаратов НПО «Углич»;

— бактериальный препарат испытан в производстве сыров на заводах Ярославского и Марийского производственных объединений молочной промышленности. Минмясомолпромом СССР утверждено решение на внедрение бактериального препарата с направленным антагонистическим действием на маслянокнслые бактерии {«Биоантибут»). Планируется в 1979— 1980 гг. выработать с бактериальным препаратом «Биоантит-бут» 20000 т сыров. Экономическая эффективность применения бактериального препарата составляет не менее 15,1 руб./т сыра.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены

на:

— конференции с участием специалистов социалистических стран по научно-техническим проблемам мясной и молочной промышленности (г. Углич, 20—26 мая 1976 г.);

— симпозиуме по бактериальным закваскам (г. Углич, 14— 16 июня 1977 г.);

— X Всесоюзной школе «Теоретические и методические основы изучения анаэробных микроорганизмов» (г. Пущнпо, 17—21 октября 1977 г.);

— Всесоюзной научно-технической конференции молодых специалисте)!! «Вклад молодых специалистов в повышение качества и эффективности производства в маслоделии и сыроделии» (г. Углич, 1978).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 статей.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 7 глав, выводов, списка литературы л приложений.

Содержание работы изложено иа 238 страницах машинописного текста (из них 167 страниц основного текста и 71 страница приложений). Основной текст включает 26 таблиц, 12 ри-

суп ко», список л шора тури — 219 наименований, в том числе 114 иностранных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Объектами исследований служили спорообразующие анаэробные бактерии рода Clostridium видов С, tyrobutyricum (штаммы 1754, 1755, I75G, 1757, Гь Kta и Ki3), Clostridium butyricum Prazmowski 1880 (штаммы ЯГЬ. в; и П]), Clostridium pasteurianum Winogradsky 1895 (штзммы МИ-1, CP л K:t$), Clostridium sporogenes (Heller, 1922) Bergey et a!., 1923 (штамм 532), Clostridium lentoputrescens Hartsell and Rettger, 1934 (штамм Mi), ранее выделенные Гудковым Л. В, и Кмцеаим В. Т. из молока, натуральных и плавленых сыров, почвы.

Б опытах было испытано 1С9 штам-мов молочнокислых бактерий видов Streptococcus lactis (Lister, 1873) Lohnis, 1909' (49 штаммов), Streptococcus cremoris Or!a-Jensert, 1919 (11 штаммов), Streptococcus lactis subsp. diacetilactls Deibee et Seeley, 1974 (48 штаммов), Leuconostoc citrovorum (Hammer, 1920) Huckcr et Pcdcrson, 1930 (15 штаммов), L. piantarum (4G штаммов).

Рост микроорганизмов контролировали ло изменению оптической плотности питательной среды, измеряемой на ФЭК-56 (Агапова и др., 1969), а также высевом соответствующих разведений в питательные среды: общее количество жизнеспособных клеток микроорганизмов — в агар с гидролизованным молоком (Богданов, 1969); количество ароматообразующих бактерий— вереду, предложенную Чужовой и Шубиной (1963); количество молочнокислых палочек — в среду Рогозы (Хандак, Гудков, 1973); общее количество спор клостридий — в среду для анаэробов (СДД) (Гудков, 19G6); количество протеолити-ческнх клостридий — в селективной среде для анаэробов (ССД) (Гудков, 1966).

При изучении ферментативных свойств споровых анаэробов » влияния микроэлементов на их рост и метаболизм использовали полусинтетнческую среду (О, О.), основу которой составляли (в %): деминерализованный гидролизат казеина — 50,0; пептон — 5,0; циетеии солянокислый — 0,05; смесь витаминов (содержащую мг/л тиамина — 0,2; рибофлавина — 0,2; пнрндоксин гндрохлорида — 0,3; пантотената кальция — 0,3; биотипа — 0,5) — 1,0. Б питательную среду вносили смесь микроэлементов по Форду.

Концентрацию растворенного в среде кислорода определяли на полярографе LP-60 (Гришина, 1971), уровень перекиси водорода определяли методом Пепикетт и Листср (Penikett, Lister, 1958).

Содержание углекислого газа и водорода контролировали газохроматографическим методом, предложенным Володиным с соавт. (1975).

Летучие жирные кислоты из культуральной жидкости выделяли экстракцией (Мшнустин, Емиев, 1974) или отгонкой па. ром с последующим переводом в натриевые соли. Качественный и количественный состав их устанавливали методом газовой хроматографии после перевода солей летучих жирных кислот в метиловые эфиры (Климовский с соавт., 1971).

Антагонистическую активность молочнокислых палочек по отношению к маслянокнслым бактериям определяли методом перпендикулярных штрихов (Егоров, 1964) и при совместном кул ьтивнрова ник.

Физико-химические показатели сыров контролировали по стандартным методикам.

Органолсптическая оценка сыров осуществлялась в соответствии с ГОСТ 7616—55 «Сыры сычужные твердые».

Статистическая обработка данных ■ ¡доводилась в соответствии с руководством Ракитцкого (1961),

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ:

Фнзиолого-бнохимнчеекие свойства споровых анаэробов рода Clostridium, выделенных из молока и сыров

Среди факторов, от которых зависит развитие микроорганизмов, главную роль играют: состав питательной среды, величина активной кислотности, осмотического давления, тем, пература, парциальное давление кислорода.

Сравнительные исследования роста клострндий в питательных средах с различными энергетическими источниками показали, что одни виды и штаммы способны использовать сравнительно широкий спектр органических соединений, у других — круг потенциально возможных энергетических субстратов ограничен. Из 27 испытанных в качестве энергетических источников соединений штаммы С. tyrobutyricum использовали 13, С. pasteurianum— 15 и С. butyricum —20.

Исследованные культуры сахаролитическнх клострндий не развивались в средах без углеводов, многоатомных спиртов или карбоновых кислот. Наиболее энергичный рост штаммов С. tyrobutyricum наблюдался в средах с глюкозой, фруктозой, маннозой. Штаммы С. butyricum энергично развивались в средах со всеми углеводами, испытанными в качестве энергетических источников. С. pasteurianum, в отличие от С. butyricum, не ферментировали ксилозу, лактозу и крахмал, а в отличие от С tyrobutyricum сравнительно хорошо росли в питательных средах с сахзрозой, декстрином и инулином,

Протеолитическне виды клостридий (С. Брогорепеа и С. 1еп-(ори1ге5сеп5), в отлично от сахцролнтических видов, росли в основной среде без дополнительных источников энергии. Стимулирование роста этих микроорганизмов наблюдали при внесении в основную среду глюкозы, фруктозы н пнрувата натрия.

Количество образуемых маслянокислими бактериями углекислого газа и водорода, а также соотношение между этими газами зависит от природы используемого микроорганизмами энергетического субстрата (табл. I). Наибольшее количество газов культурами С. 1угоЬи1упсит образовано в средах с гек-созами. Соотношение СОг/Н2 в этих средах колебалось в интервале 0,93-^1,10, Общий объем газов, образованных масля-нокнелыми бактериями в средах с лирувагом натрия, был почти в 6 раз меньше, чем с глюкозой; соотношение СОг/Н3 равня* лось 3,1.

Таблица I

Газообразование С. (угоЬиГугкит в ередах с различными источниками энергии

Источники энергии Образование газов (10-* мо.-^л среды) углекислого газа \ водорода

Ксилоза....... . .* . 3,9±0,6 4,22:0,8

15.5 ±>1,3 14,9±1,5

Фруктом.......... 1и±и 10,32:0,8

Глицерин .......... 0,9*0,4 0,8 ±0,4

Пнруват катркя....... 4.0±],0 1.3 ±0.4

Пируэаг натрия + лакгат кальция . е.1±и 4,1*0,8

Лактат кальция+ацетат натрия . 2,4 ±0,8 1.2 ±0,4

В основной среде с лактатом кальция большинство испытанных культур не росло. Введение в состав питательной среды лактата кальция в комбинации с ацетатом, пируватом или цитратом натрия в значительной степени стимулировало рост и газообразование сахаролитнческих клостридий (табл. 1).

Установлено, что наиболее интенсивный рост и газообразование маслянокнслых бактерий в средах с лактатом кальция и ацетатом натрия происходят при рН более 5,5, но менее 6,5 (табл. 2). В средах с рН менее 5,5 наблюдается ингибирование роста, кислою- и газообразования сахаролитнческих клостридий.

Протеолатические виды клостридий не использовали лак-тагы в энергетическом метаболизме. Они оказались более чувствительны к высокой активной кислотности, чем сахаролнтн-ческне виды, и не росли в питательных средах с рН 5,5.

Таким образом, наибольшую опасность для сыров представляют сахаролцтические виды клостридий, способные сбражи-6

Таблица 2

Влияние уровня активной кислотности на рост некоторых видов клостридий в питательных средах с лактатом кальции н ацетатом натрия

Начальный рН Прирост оптической плотности срелы после 90 часов культивирования штаммов

среды С. tyro-butyrícum С. buty-ricum С, pasteu-rianum С. íporo-genes С. lento- . putrescent

7.0 ±0.03 6.6±0,07 6,0±0,05 5,5 ±0,04 5.0 ±0.01 0,13 ±0,03 0,26 ±0,01 0,38±0.05 0.33*0.08 0,11 ±0,02 0.10 ±0,03 0.17± 0,02 0,26±0,0ú 0,31 ±0,01 0.06 ±0.02 0.03±0.01 0,20 ±0,02 0,22 ±0,06 0.19 ±0,05 0,09±0,01 0,»6±0,06 0.14 ±0,07 0,07 ±0.02 0.03 ±0,02 0 0,13±0,03 0,07 ±0.03 0,02 ±0.01 0 0

вать лактаты в присутствии ацетатов при рН = 5,0-7-5,5 (то есть активной кислотности, характерной для твердых сыров).

Хлорид натрия, оказывающий значительное влияние на интенсивность и направленность микробиологических процессов в сыре, ингнбировал рост, газо- и кнслотообразование клостри. дий при относительно высоких концентрациях (более 3% в водной фазе). Действие его на клостри дин зависело от штаммовых особенностей исследованных культур и проявлялось в увеличении продолжительности лаг-фазы, снижении количества образуемых клостридиями газообразных и кислых продуктов обмена. Особенно сильно тормозилось образование водорода и масляной кислоты.

Существенное влияние на рост и газообразование клостри. дий оказала температура (табл. 3). Температурный порог раз-

Таблица 3

Влияние температуры культивирования на рост споровых анаэробных бактерий рода tCoitS-iatutn

Прирост опт н ческой плотности

Температура культивирования, 1С среды при выращивании в течение 5 суток

С. tyro. С. btity-

С, pa Me li- С. sporo С. lento-

butyricum ricum ria num penes put rescens

8 ±2 0.05 ±0,01 0.0 0.0 0.0 0.0

13*2 0.26*0.03 0,14 ±0.03 0,07 ±0.02 0,05 0.0

22±2 1.41 ±0,05 0,72±0.31 1,24 ±0,04 0,72

30±2 1,70 ±0.04 1,46 ±0,06 1.52±0,12 0.97 0.93

37±2 1,76 ±0.09 1,36±0.1S 1.40*0,13 1.20 1.07

42±2 1.41 ±0,13 0,41*0,03 0.50±0,15 0.82 _

4$±2 0,32 ±0,07 0,01 ±0,03 0,15±0,11 0,26 —

вития различен у разных видов клостриднй: у лротеолитиче-ских.видов он выше (колеблется в пределах 13-Ы5°С), у саха-ролитическнх видов — ниже (варьирует в интервале 8-И1°С), .Сыры обычно созревают при температурах КМ-12°С. В этих условиях практически полностью подавляется рост протеолн-тических видов клострилий и в значительной степени ингиби-рустся рост маслянокислых бактернй вндов С. Ьикупссшги С. раз1еипапцт. Наибольшие возможности для развития в условиях температурного режима, характерного для созревающих мелких сычужных сыров, имеют микроорганизмы вида С. 1угоЬ1Нупсит,

Интенсивность роста и метаболизма микроорганизмов завн. сит от минерального состава питательных сред. Наблюдения за накоплением биомассы С. 1угоЬи1упсит в полусинтетической среде с различными дозами микроэлементов (табл. 4)

Таблица 4

Влияние микроэлементов на накопление биомассы С, 1угоЬи1уг!сшп в полусинтетической среде с лактатом кальция и ацетатом натрия

Варианты сред Прирост оптической плотности среды (в % от прироста оптнчсскоЛ плотности среды без микроэлементов) при содержании в среде микроэлементов в концентрации, мг/л

* 0.011*0.025 0,110-5-0,250 1.10СЦ-2,500 11,000-125,000 110.000-7250.000-

Бор Марганец Железо (11) Железо (ИГ. Кобальт Медь Цинк 117 114 95 112 114 179 *■ 152' 124 140 105 131 155 167 140 133 (138 164 176 * 124 100 107 * 155 100 150 183 95 40 69 107 69 76 133 58 8 33

показали, что для каждого микроэлемента можно выделить зону «стимулирующего» действия и зону «ннгнбнрующего» действия, интервалы которых зависят от природы микроэлемента. В питательных средах с глюкозой или лактатом кальиня и ацетатом натрия наиболее энергичное накопление биомассы, продуцирование газообразных и кислых продуктов обмена наблюдалось при внесении в среду без микроэлементов 1,1-411,0 мг/л бора, 0,234-2,30 мг/л марганца, 1,9-5-19.0 мг/л двухвалентного или 2,1-^-21,0 мг/л трехвалентного железа, 0,21ч-2,10 мг/л кобальта. 0,025^-0,250 мг/л меди, 0,17-М,70 мг/л цинка. Более низкие концентрации исследованных микроэлементов не оказывали заметного влияния на рост и метаболизм

С. 1угоЬи1упсит, более высокие— тормозили жизнедеятельность тест-культуры.

Громадное влияние на рост и метаболизм клострндий оказывает растворенный в среде кислород (Ог). Опытами в жидких питательных средах установлено, что наиболее энергичное развитие маслянокислых бактерий наблюдается при начальной концентрации Ог, равной 2,44±0,13 мг/л; Повышение начального уровня Оа привело к увеличению продолжительности лаг-фазы, ннгнбнрованию газо- и кислотообразующей активности исследован них культур. Особенно сильно тормозилось образование водорода и масляной кислоты (табл. 5).

Таблица 5

Влияние начального уровня растворенного в среде кислорода на продолжительность лаг-фазы н количество основных продуктов обмена

С, |угоЬ^уг1сит

Начальная концентрация растворенного в среде кислорода, мг/л Продолжительность лаг-<Ъ азы. час. Количество выделенных газов, 10-* молей/л среды Количество летучих кислот, мкг/мл

углекислого газа водорода уксусной масляной

7,3-4-7.5 62+8 13 ± 1,5 5±1.0 44,1 ±6.3 21,2*4,5

5,4 т-5,6 30 ±6 23*1,9 13*1,7 _ —1

2,4ч-2.8 18±2 33±3.7 29±2,6 55,7 ±4,8 61,3*6.3

Клостридии независимо от видовой принадлежности во время лаг-фазы снижают уровень 02. Скорость поглощения Ог клостридиями, а также их способность развиваться в средах с различным начальным уровнем Oj зависят от видовых.н штаммовых особенностей исследованных культур, размера посевной дозы.

Наблюдения за развитием клострндий в средах с предельными для роста концентрациями Ог показали, что введение в состав сред каталазы в значительной степени стимулирует рост и метаболизм этих микроорганизмов (табл. 6).

Подобный эффект наблюдался при введении в состав питательных сред по 0,01% маннита, формата натрия или этанола. Учитывая, что эти соединения предупреждают образование ОН-раднкалов, можно предположить, что одним из продуктов, обуславливающих токсичность молекулярного кислорода для Clostridium, являются ОН-радикалы.

Стимулирование развития клострндий каталазой показывает на участие перекиси водорода (HaOj) в процессах взаимодействия клеток Clostridium с молекулярным кислородом.

Таблица 6

Влияние пата л азы на рост и газообразование С. tyrobutyricum 1755 я СДА

Показатели развития культуры Единицы измерения Варианты сред

без катала-зы с 10 ед/мл каталаш

1 2 3 4

Концентрация кислорода в среде: мг/л 6.52 6.52

начальная ........

конечная ........ 2.14 2,02

Продолжительность лаг-фазы . . час более 72 21

Прирост количества жизнеспособ- млн/мл 191,6

ных клеток за первые 3 суток . 0

Образовано: Ю-' моль/л 19.1

0

водорода ........ среды 0 17,е

В этом нас убеждает накопление. Hs02 в культурах сахароли-тических видов кл остр иди й при выращивании их в средах с повышенным начальным уровнем Ог (более 3,37 мг/л). Не исключено, что HjOj является предшественником ОН-раднка-лов.

ИЗУЧЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ РАЗВИТИЯ

КЛОСТРИДИП В СЫРАХ С НИЗКИМИ ТЕМПЕРАТУРАМИ ВТОРОГО НАГРЕВАНИЯ

Основная трудность при изучении развития клострндий в сырах заключалась в отсутствии среды для учета вегетативных клеток этих микроорганизмов в присутствии молочнокислых бактерий, которые численно преобладают в сырах и хорошо растут на оптимальных для анаэробов средах.

Основываясь на результатах изучения биологических свойств маслянокислых бактерий, мы разработали селективную среду для учета вегетативных клеток этих микроорганизмов в сырах, которая имела следующий состав (%): мясопеп-тонный бульон — 91,0^-93,0; дрожжевой автолиэат — 3,0-4-5,0; агар—1,5-5-2,0; лактат кальция — 0,54-1,0; ацетат натрия — 0,5^-1,0; солянокислый цнстеин — 0,054-0,10; тетроборат натрия— 0,000^-0,0002; хлорное (III) железо —0,0001-н0,0002; гидрокарбонат натрия — 0,01ч-0,02, нейтральрот — 0,0004, pH срелы = 5,70 ±0,05.

Проведенными исследованиям и-установлено, что прорастание спор и деление вегетативных клеток клострндий начинается во время прессования сырной массы. К концу прессования число жизнеспособных клеток этих микроорганизмов возра-

стает в 45-н700 раз. В сырах 1-5-15-суточного возраста размножения клостридий не происходит. Более того, количество их вегетативных клеток в этот период уменьшается. Вымирание большинства исследованных культур клостридий происходило и на более поздних стадиях созревания сыра. Только штаммы С. tyrobutyricum были способны к вторичному размножению, которое обычно начиналось в 25ч~15-суточных сырах.

Динамика развития клостридий в мелких сычужных сырах соответствует физиологическим особенностям отдельных видов клостридий. Исследования физико-химической обстановки, складывающейся в сырах на различных стадиях их производства, показали, что наиболее благоприятные для прорастания спор и деления вегетативных клеток условия имеются в сырной массе во время выработки сыра в ванне и прессовании. Высокая активная кислотность (рН = 5,1-:-5,2) и низкие температуры (lO-f-12'C) в сырах 1-4-15-суточного возраста полностью подавляют рост С, sporogenes, С. pasturianum и С. butyricum, В этих условиях только С. tyrobutyricum способны к медленному развитию. Небольшое повышение рН сырной массы, происходящее за счет накопления продуктов протеолнза, стимулирует размножение С. tyrobutyricum в сырах 25-*-45-суточного возраста. Кроме этого, проросшие споры С. tyrobutyricum также могут подготавливать условия для более интенсивного размножения: медленно сбраживая лактаты, они будут постепенно повышать рН в непосредственной близости около клетки. Об этом свидетельствует очаговость в распределении жизнеспособных клеток С. tyrobutyricum в сырах н повышение рН при росте в средах с лактатом кальция и ацетатом натрия.

АНТАГОНИСТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ UPLANTARUM НА МАСЛЯНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ

Установленная динамика развития клостридий в сырах показывает на .важность подавления их роста на первых этапах выработки сыра. Это может быть достигнуто включением в состав закв а сочной микрофлоры антагонистов споровых анаэробов рода Clostridium.

Ранее выполненные во ВПИИМСе исследования (Алексеева, Гудков, 1970; Хандак, Гудков, 1973) показали, что наибольшее количество антагонистов маслянокнслых бактерий обнаруживается среди молочнокислых палочек вида L. plante-rum. В литературе имеются материалы, указывающие на то, что антагонистическое действие L. plantarum на масляно-кнелые бактерии может быть обусловлено Н202 (Гудков, Алексеева, 1973).

Исследование способности молочнокислых бактерий образовывать НгОз в молоке показало, что HjOj обнаруживается

в культурах практически всех исследованных видов и штаммов молочнокислых бактерий. Однако скорость образования и максимальное количество ее зависит от вида и штамма микроорганизма. Молочнокислые стрептококки и лейконостоки накапливали в молоке 1,03ч-С, 14 мг/л Иг02, которая быстро разрушалась и в 24-7-48-часовых культурах не обнаруживалась. Способность образовывать И^Ог I*. р1ап1агиш зависела от штамма: 58,7% исследованных культур образовывали в молоке 0,8-г-5,9 мг/л На02. 26,1 % —от 8,0 до 17,0 мг/л и 15,2% — накапливали 21,5 мг/л ШОз и более.

Опытами в модельных средах и сырах было установлено, что степень подавления роста маслянокнслых бактерий-при совместном культивировании их с молочнокислыми палочками пропорциональна количеству перекиси водорода, образуемой последними в- питательных средах.

Разработка способа подбора и технологии получения; бактериального препарата'для мелких сычужных сыров, обладающего антагонистическим действием■ на маслянокислые бактерии.(биоантибут»)

Молочнокислые палочки— антагонисты маслянокнслых бактерий в чистой культуре — не могли служить в качестве заквасок для сыров, так как обладали, в большинстве случаев, низкой кислотообразующей активностью в молоке и не обеспечивали нужного нарастания кислотности на начальных этапах выработки сыра.

Было решено в состав заквасок для сыров с низкими температурами второго нагревания: включить обычно используемые для этой цели молочнокислые стрептококки и лейконосто* ки, а также штаммы молочнокислых палочек, продуцирующие достаточное для. подавления роста маслянокнслых бактерий количество перекиси водорода.

Сравнительными исследованиями чувствительности молочнокислых бактерий к перекиси водорода, а также опытами по совместному культивированию в молоке было установлено, что молочнокислые палочки, накапливающие в питательных средах перекись водорода в количествах, достаточных для подавления роста маслянокнслых бактерий, не оказывают инглбнторного •действия.на рост и кислотообразованпе большинства исследованных видов и штаммов мезофильных молочнокислых стрептококков и лсйконостоков.

Из подобранных по соответствующим биохимическим и ор-ганолсптическим показателям комбинаций молочнокислых стрептококков, лсйконостоков и палочек вырабатывали сухие бактериальные препараты. Основные технологические режимы выработки этих препаратов соответствовали таковым для бактериального препарата ЛЬ. 2 (Белова, 1972).

Сухие бактериальные препараты, получившие, условное название «Биоантибут», содержали в среднем 350000± 37000 млн. к.о.е./г. Закваски, приготовленные из этих препаратов беспересадочным способом, содержали все исходные компоненты микрофлоры, необходимые для нормального протекания молочнокислого процесса в сыре, обладали требуемой биохимической активностью.

Результаты применения бактериального препарата «Биоантибут» при производстве мелких сыров

Бактериальный препарат «Биоантибут» был испытан при производстве сыров с низкими температурами второго нагревания {голландского, костромского, пошехонского и российского) в условиях экспериментально-технологической лаборатории ВНИИМСа и на заводах Ярославского и Марийского производственных объединений молочной промышленности. Применение бактериального препарата «Биоантибут» способствовало значительному повышению качества вырабатываемых сыров (табл. 7): полностью ликвидирован выпуск сыров, бра-

Таблица 7

Качество сыров, выработанных с обычными заквасками (контрольные) и бактериальным препаратом «Бноантнбут» (опытные)

Вид сыра* Количество сыроз (% от общего объема выработанных)

контрольных опытных

высшего сорта Первого сорта СТЛ1- дарт-ных нестандарт-ных высшего сорта первого сорта стандартных нестанДарт-ных

Голландский 91,7 8.3 0 100 0 0

Костромской 42,9 47,6 — 9,5 84,4 15.6 — 0

Пошехонский , . — — 76.0 24,0 — — 100 0

Российский . . — — 94,0 6,0 — ■— 99,1 0,9

* Сиры голландский н костромской — сортовые; российский и пошехонский — несортовые.

куемых по порокам, вызываемым маслянокислымн бактериями; значительно увеличился выпуск сыров высшим сортом. Повышение качества сыров, вырабатываемых с применением бактериального препарата «Биоантибут», происходило за счет подавления маслянокислого брожения в продукте.

Экономический эффект от применения бактериального препарата «Биоантибут» составляет, в зависимости от вида сыра, 15,1^-72,3 руб/т сыра.

Выводы

К Маслянокнслые бактерии могут использовать в качестве источников энергии различные углеводы, некоторые многоатомные спирты, пируваты, лактаты в присутствии ацетатов или цитратов. Благодаря способности сбраживать лактаты в сирах, они обеспечены источниками энергии на всем протяжении выработки и созревания продукта. Выход биомассы на единицу субстрата в средах с лактатами в среднем в 6 раз ниже, чем в средах с глюкозой.

2. Активная кислотность (рН = 5,1-г-5,35), концентрация соли (3,54-5,5% в водной фазе), температура (114-1241), характерные для созревающих сыров, находятся в зоне резкого ингибирозання развития маслянокнслых бактерий. Комбинация этих факторов полностью подавляет рост протеолитнческих видов клостридий в мелких сычужных сырах во время созревания. Незначительное развитие С. Ьи1упсиш и С. ра51еипз-пиш в этих условиях не оказывает влияния на качество сыра. С.ЧугоЬи1упсит может вызвать порчу мелких сычужных сыров, выра-ботанных по принятой технологии.

3. Маслянокнслые бактерии давали рост в средах с начальным содержанием растворенного кислорода не выше 7,546,3 мг/л. Во время лаг-фазы они связывзли молекулярный кислород; активное размножение маслянокнслых бактерий начиналось после снижения концентрации растворенного в среде кислорода до 2,054-3,25 мг/л.

Повышение начальной концентрации кислорода в среде в интервале 3,254-7,50 мг/л увеличивало продолжительность лаг-фазы, снижало скорость накопления бномассы, ингибиро-вало образование маслянокислыми бактериями углекислого газа и водорода, уксусной и масляной кислот.

4. Связывание молекулярного кислорода маслянокислыми бактериями обычно сопровождалось появлением в среде перекиси водорода (0,87-4-1,31 мг/л). Каталаза, ноны железа или меди (1-г-5 мг/л) подавляли образование перекиси водорода, сокращали продолжительность лаг-фазы и ускоряли накапливание биомзссы маслянокнслых бактерий. По-видимому, образование перекиси водорода маслянокислыми бактериями является одним из факторов, обуславливающих их высокую чувствительность к молекулярному кислороду. Определенную роль в токсичности кислорода может играть образование и других продуктов, в частности ОН-радикалов, па что указывает стимуляция развития маслянокнслых бактерий в питательных средах с относительно высоким начальным уровнем растворенного кислорода (более 3,25 мг/л) при внесении 0,01% манни-та, этанола или муравьинокислого натрия, дезактивирующих радикалы ОПТ

н

5. Внесение п полисинтетическую среду 0,23-^2,30 мг/л марганца, 1,1-5-11,0 мг/л бора, 1,94-19,0 мг/л двух- и 2,1421,0 мг/л трехвалентного железа, 0,21'-5-2,10 мг/л кобальта, 0,0254-0,250 мг/л меди, 0,174-1,70 мг/л цинка стимулирует накопление биомассы С. 1угоЬи1упсит. Более высокие дозы указанных микроэлементов оказывают отрицательное действие на рост этих микроорганизмов.

6. Предложена питательная среда для учета в сырах мас-лянокислых бактерий, имеющая следующий состав (%): мясо-пептонный бульон — 91-5-93, дрожжевой автолнзат — 34-5, агар—1,5-^2,0, лактат кальция — 0,54-1,0, ацетат натрия — 0,5-И,0, солянокислый цистеин — 0,03-5-0,10, тетроборат натрия— 0,0001-5-0,0002, хлорное (III) железо —0,00014-0,0002, гидрокарбонат натрия — 0,014-0,02, иейтральрот — 0,004-г-0,005.

7. Выявлены штаммы молочнокислых палочек, в основном вида Ь. р1агиагит, подавляющие рост масляпокнслых бактерий в питательных средах н сырах. Культуры-антагонисты образовывали в питательных средах в зависимости от штамма от в,0 до 64,6 мг/л перекиси водорода. Степень ингибирующего действия молочнокислых палочек на маслянокислые бактерии пропорциональна количеству образуемой Ь. р1ап!агшп перекиси водорода. При добавлении в среду каталазы ингибитор-ное действие исчезает.

8. Разработаны технология- производства и применения бактериального препарата «Биоантибут», подавляющего рост мэслянокислых бактерий в мелких сычужных сырах, в состав которого включены уезофильные молочнокислые стрептококки, лейконостоки и Ь. рТап1агит. На препарат согласована с Минздравом СССР и утверждена Минмясомолпромом СССР нормативно-техническая документация (ТУ 49 493-78) .

По материалам диссертации опубликованы следующие работы

1. Влияние микробиологических процессов и новых видов заквасок на качество сыров. Тезисы докладов к конференции с участием специалистов стран по научно-техническим проблемам мясной и молочной промышленности (г. Углич, 20—26 мая 1970), М., 1976, 66—69, в соавторстве.

2. Питательная среда для учета спор и вегетативных клеток маслянокислых бактерий в молоке и сирах. Авторское свидетельство Кг 596618 от 15 ноября 1977 г., в соавторстве,

3. Определение возбудителей маслянокислого брожения в сырах. Молочная промышленность, 1978, Кз 1, 15—18, в соавторстве.

4. Физнолого-биохимические свойства молочнокислых бак-

терий, входящих в состав закваски для сыра. Труды ВНИИМСа, М., «Пищевая промышленность», 1977, вып. 21, 9—16,в соавторстве.

5. Чувствительность к бактериофагам мезофильных .молочнокислых стрептококков, входящих в закваски для сыра. Труды ВНШШСа, М., «Пищевая промышленность», 1978, вып, 23, 8—12, в соавторстве.

6. Влияние ионов железа на рост и метаболизм возбудителей масля но кислого брожения в сырах. Труды В НИИ MC а, М„ «Пищевая промышленность», 1978, вып. 23, 72—77, в соавторстве.

7. Содержание кислорода в костромском сыре. Труды ВНИИМСа, М., «Пищевая промышленность», 1978, вып. 23, 82—86, в соавторстве.

8. Развитие маслянокнслых бактерий в костромском сыре. Тезисы докладов Всесоюзной научно-технической конференции «Вклад молодых специалистов в повышение качества и эффективности производства в маслоделии и сыроделии», Ярославль, 1978, 95—97, в соавторстве,

9. Свойства молочнокислых палочек, обладающих антагонистическим действием на возбудителей маслянокнслого брожения в сырах. Тезисы докладов Всесоюзной научно-технической конференции «Вклад молодых специалистов в повышение качества и эффективности производства в маслоделии и сыроделии», Ярославль, 1978, 97—99, в соавторстве.

10. Образование перекиси водорода молочнокислыми палочками вида L. plantarum. Тезисы докладов Всесоюзной научно-технической конференции «Вклад ^юлодых специалистов в повышение качества и эффективности производства в маслоделии и сыроделии», Ярославль, 1978, 99—100, в соавторстве.

И. Роль кислорода в жизнедеятельности бактерий рода Clostridium. Тезисы докладов Всесоюзной научно-технической конференции «Вклад молодых специалистов в повышение качества и эффективности производства в маслоделии и сыроделии», Ярославль, 1978, 100—101, в соавторстве.

12. Количественный учет споровых анаэробов Clostridium в чистых культурах и в силосе. Тезисы докладов Всесоюзной научно-технической конференции «Вклад молодых специалистов в повышение качества и эффективности производства в маслоделии н сыроделии», Ярославль, 1978, 102—103, в соавторстве.

13. Изучение действия перекиси водорода на микроорганизмы молока и подсьгрной сыворотки. Труды ВНИИМСа, Ярославль, 1978, вып. 26, 33—39, в соавторстве.

Л 107740 4/VII—79 г. Объем 1 п. л. Заказ 1116, Тираж 100

Типография Московской с,-*, академии им, К. Л, Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44