Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства Citrobacter Sp. - возбудителя заболевания взрослых медоносных пчел

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства Citrobacter Sp. - возбудителя заболевания взрослых медоносных пчел"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я. Р. КОВАЛЕНКО

(ВИЗ В)

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

(Р А СХ Н)

На правах рукописи

ТАРНУЕВА Елена Юрьевна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА CITROBACTER SP.— ВОЗБУДИТЕЛЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ ВЗРОСЛЫХ МЕДОНОСНЫХ ПЧЕЛ

03.00.07 — Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва— 1994

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор О. Ф. Гробов кандидат биологических наук Б. А. Фомин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук М. М. Интизаров (МВА) кандидат ветеринарных наук К. С, Чернов (НТИММИ)

Ведущее учреждение — Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВСГЭ)

Защита диссертации состоится « /f » ииуъа^ 1994 г. в часов на заседании специализированного совета

Д 020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я- Р. Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ. Автореферат разослан « ^ » 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат ветеринарных наук

Ф. Г. Терешков

I. ОЩЛЯ ХАРЛОТЕЙКТИКА РАБОТЫ

Актуальность темн. Среди многих отраслей сельскохозяйственного производства пчеловодство занимает особое место. Продукты этой отрасли - мед, воск, цветочная пыльца, маточное молочко, прополис - пользуются псе большим спросом у населения, в медицинской, пищевой и в ряде других отраслей промышленности.

В условиях высоких темпов интенсификации и химизации сельскохозяйственного производства медоносные пчелы являются наиболее ценными, перспективными и надежными опылителями важнейших знтомофильных культур.

Знаэдтельный ущерб пчеловодству, особенно в современных условиях развитая крупных пчеловодческих хозяйств наносят инфекционные болезни пчел (В.И.Полтев, 1965; А.М.Смирнов, 1964; 0.5.Гробов, А.М.Смирнов, Е.Т.Попов, 1987; В.А.Триленко, 1977; Р.М.Салимов, 1976; Л.Н.Гузева, 1581; Ю.М.Батуев, 1985; и др.). Из болезней взрослыг пчел в период с 1985 по 1991 гг. в ряде хозяйств Армении, Молдавии, Краснодарского края и Тюменской области из гемолимфы больных пчел при их массовой гибели был выделен микроорганизм, предположительно отнесенный к семейству Е^0гоЬйо4ег1асааэ и высокочувствительный к эритромицину. Выделенную бактерию, условно названную ВасЪег1ит ер., необходимо било идентифицировать.

Цель и задачи исследования.

1. Изучить морфологические, ткнкториалыгае, культуральные, биохимические свойства микроорганизма.

2. Установить 'ГЦ состав ДНК, молекулярную массу к степень гомологии ДЖ с близкородственны».« организмами.

3. Показать некоторые серологические особенности выделенного микроорганизма.

- г -

4. Выявить его патогенные свойства для теплокровных живот-•ньж и пчел. •

Научная новизна. Впервыз изучены культуральные, морфологические, тинкториальные, биохимические, серологические свойства и геномные характеристики (мол% ГЦ; молекулярная масса, уровень гомологий куклеотидных последовательностей) Citгob8otвr вр., выделенного от пчел при их массовой гибели. Показаны его патогенные свойства для лабораторных животных и пчел, выявлены его отличительные особенности от других представителей рода С11;-гоЪао'Ъег.

Практическая значимость работы. По результатам проведенной работы подготовлены "Методические указания по лабораторной диагностике цитробактероза пчел", утвержденные Ученым Советом ВИЭВ (26 августа 1993 г., протокол № 10).'

Дополнения к п. 2.5 Инструкции о мероприятиях по предупреждению и ликвидации заразных болезней пчел, утвержденные ПУВ ГК СМ СССР по п. 3 12 марта 1991 г. (утвержденные Ученым Советом ВИЭВ 19 ноября 1993 г., протокол № 13).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы долокеяы и обсуждены на:

- научно-производственной конференции ветеринарного факультета Бурятского СХИ (Улан-Удэ, 1992);

- юбилейной конференции, посвященной 120-й годовщине со дня основания Казанского ветеринарного института им. Н.Э.Баумана (Казань,' 1993);

- Ученом Совете ВИЭВ (Москва, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и I работа находится в печати.

Структура и объем работы. Диссертация изложена го 121 странице машнг"исного текста и состоит из введения, обзора лите-

ратуры, материалов я методов иселодоагннй, собспзенм« исследований, обсуждения результатов, внгоров, практпчзлккх предложений. Список литературы содержит 244 названий работ отечественна и иностреннкх авторов. Диссертация илякптрирозана 10 таблицами и 14 рисунками.

2. МЛГЕРШЫ И 1ЕЮДЧ

Исследования проводили в период с ISS9 по 1992 годы в лабораториях профилактики болезней и экологической охраны пчел, "элекуллркоА биологии и биохимии, на карантинной пасеки ШЭВ

п лаборатории геохимической деятельности микроорганизмов Института микробиологии РАН.

За указанный период з опытах по заражению находилось I2C0 пчел, ? кроликов, 12 морских свинок и £0 болта мьплзй.

В работе использовали лиофилизированные культуры Bact*-riiJK ар., выделенные в IS35 г. о? больных пчел из Армении и хранившиеся при ~4°С в лаборатории. В последующем из культур указанного микроорганизма были подучены клонц R, S, и Bioterl^cs ар. В опитах по определении генома выделенного микроорганизма и изучению геноеиетематичееких особенностей Bacte-riuns ар. использовали также культуры Citrobacter fraundii, С. divaraue, Escherichia coli К 12, Salmonelle dublin, Kiob-siella speclea, Hnfnio alval, Bacllluo apiarius 1, Бас. epi-arius 2, Вас. alvel ШТ. 333, Вас. paraalvel, Micobaoterium tuberculosie из коллекций культур ВКЭВ и других учреждений.

Изучение нулътурально-биохимичсаких, тинкториальных, морфологических, гсноеистематпческих, серологических и патогенных свойств Bacterium вр. проводили методам! об.цеА бактериологии (М.О.Ккргер, 1981; З.Герхардт и др., KS3-IS34; и др.).Родо-ьуя принадлежность мкгфосргаииома устанавливали по определи-

тел™ (В.И.Полтев, 1564; Берги, 1984) в сравнения с имеющимися •типовыми культурами.

Культуральные свойства изучали на жидких, полужидких, твердых питательных средах. Среды готовили в лаборатории технологии культур клеток и питательных сред ВИЭВ по общепринятым методикам согласно "Методическим рекомендациям по приготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей культивирования клеток и вирусов", утвержденных ВАСХНИЛ, 1986, и другие. Для изучения культуралышх свойств Ва<И;ег:|.ш1 ар. использовали 21 среду: ВДА, МПБ, 5, 10, 20%-ные сывороточный МПА и МПВ (СИЛА, СМПБ), бульон Хоттингера, 5, 10, 20£-ный сывороточный бульон Хоттингера, агар Хоттингера, 5, 10, 20^-ный сывороточный агар Хоттингера, агар Хоттингера с добавлением эритроцитов барана, 2$-ну» среду ферментативного гидролизата мышечных белков (2%-ный ФГМ-с), 10, 20&-ный сывороточный <ЬГМ-с, 10%-ный сывороточный ФГМ-с с добавлением 10?» дрожжевого экстракта, минеральную среду с глюкозой с добавлением 10/5 дрожжевого экстракта, среды Вове с соавторами (БСР), Китт-Тароцци, Эдварда, Мартена, Эндо, Плоскирева, среду 199, среду с гидролиаатом лакгальбумша (0,5%) в растворе Хенкса с сывороткой.

Сывороточные среды готовили добавлением 5, 10, 20$ стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота к бульону или расплавленному и остуженному до 45-50°С агару.

Посевы на среды осуществляли общепринятыми методами по 0,5 мл бактериальной суспензии в концентрации 10^ бак.кл/мл на 5,0 мл испытуемой среды. Интенсивность роста учитывали по оптическим стандартам мутности на 5, 10 единиц общепринятыми методами для жидких и смывам для твердых питательных сред.

Морфологические свойства изучали методами световой и электронной микр -копии при помощи микроскопов Ки-2, Биолам-70,

.ТИ-100. При световой иккрозкопии устанавливали тикнториальныв свойства Еас1;сг1шп ар. на препаратах, окрашенных по Граму, Цилю-Нильсену, Романовекому-Гимза и Пшкоау. Электронную микроскоп!!» проводили совместно с сотрудникам! лаборатории геохимической деятельности микроорганизмов Института микробиологии РАН. Тотальные препараты и ультратснкие срезы для электронной микроскопии готовили в соответствии с описанием в руководстве 5.Гер-хардта "Методы общей бактериологии" (М.: Мир, 1983. - Т. I).

Для изучения биохимических свойств использовали сахара пестрого ряда. Спектр усваиваемых источников углерода и сбраживаемых углеводов определяли на минимальной среде (№ Т) следующего состава (г/л): К^НР04 -.1,.кн4С1 - I, ^зо^^о - 0,5, СвС12 - 0,2, дрожжевой экстракт (Дифко) - I, рН 7,0, Источники углерода стерилизовали отдельно и добавляли к готовой минимальной основе в конечной концентрации 0,5$. Сахара стерилизовали фильтрованием через одноразовые мембрантте фильтры с диаметром пор 0,22 мкм фирмы "Заг^оПиа". В экспериментах е сахарами из большого медицинского набора, а также фирмы "УВН", контролем служил вариант е базовой средой без источника углерода. Рост определяли по мутности через 10 ч инкубации. Аэробную инкубации проводили в 25 мл пробирках с ватной пробкой с 3 мл среды, анаэробную (брожение) - в 20 мл пузырьках с 15 мл среды, продутой стерильным аргоком в течение 10 мин. Температура инкубации 37°С.

В аэробных условиях изучали сбраживание 12 Сахаров на полужидкой среде Гисса (№ 2), концентрация углеводов в ней составляла 0,5$, а индикатора изменения рН среды - 0,002$. Для исследования инокулированные культуры инкубировали в термостате в течение 5-10 дней . до ферментации углеводов, выражающейся в изменении цвета питательной среды.

Применяли такжа itr 3) пластины биохиьг/ческке ^фрореициру-«цие энтеробак-гврий СПЕДЗ) Пзрьковокого НИИ згкдгкиологиа к и>:к-робислогин Минздрава РСФСР.

Молекулярные характеристики ДНК изучали совместно с сотрудникам лаборатории моягхуяггрной биологии к бкохимш ВИЗВ. Выделение ДНК осуществляли методом ферментативной деградации клеточных стенок по Маркуру (1961) (Герхард? "Методы об^ей бактериологии". - М.: Мир, IS84..- Т. 3). Нуклзотвдяый состав ДНК определяли епектроФотометричесзси, придерживаясь методики Марму-pa, Doty (1962). Для определения молекулярной массы ДНК использовали метод Gilles «t ai, (1970). Определение гомологии нуклаотидши последовательностей ДНК проводили реакцией молекулярной ДНК-ДНК-ГкбрИДИЗаф® ПО Da toy, Desntedt (1975), а также B.A.iowKü, Х.А.Ахмедрабаданоа (1568). Стандартные статистические оценки параметров по генной систематике вычисляли по Формулам Pyi.;/r::cKoro (1971).

Серологические свойства Bacterium пр. определяли в реакции агглютинации (FA), придерживаясь методики В.А.Триленко (1953) Гкпериммунныв сыворотки получали иммунизацией кроликов по методу Д.Аль-Аубауди и Ю.Фабриканта (1971), используя антигены штаммов !.®кроорганизмов: Citrobacter ар., С. freundii. Антигены готовили в концентрации 1 шрд. микробных клеток в I и путем ; смыва суточной культуры с поверхности 10%-иого обогащенного сывороткой крови крупного рогатого скота агара Хоттингера. Трижды отмытые микроорганизмы в стерильном физиологическом растворе центрифугированием при 3000 g в течение 10-15 минут в последующем ресуспевдировали до указанной концентрации. Материал разливали во флаконы и хранили по 1-2 мл в замороженном состоянии <-4°С>,

Патогеннье гвойетва исследуемого микроорганизма изучали на

лабораторных ливотшх и пчелах. Для определения патогеннсети Еа^ег1т зр. заражение лабораторных животных проводили интра-перитониально взЕееью суточной культуры в концентрациях 100 млн. бак.кл/мл, 500 или.бак.кл/мл, I гард.бак.клД*л в дозах по I мл кроликам, 0,5 мл свинкам и мшшм. Контрольным животным вводили соответствующие дозы стерильного физиологического раствора. За опытными животными наблюдали в течение 30 дней.

Для заражения пчел использовали суточную взвесь культуры микроорганизма п концентрации 100 млн. к 500 млн.бак.кл/мл. Заражение пчел проводили методами инъекции в гемоцель по 0,03 мкл каждой, скармливанием и нанесением инфицированной суспензии на хоботок. Контрольным группам соответственно вводили, скармливали или наносили на хоботок стерильный буферный раствор. Пчел содержали в энтомологических садках при 30°С. Наблюдение за подопытными насекомыми проводили регулярно в течение 15 дней. С третьего дня погибших пчел собирали во флаконы к хранили при -4°С. Полученные результаты подвергнуты статистической обработке по общепринятым методикам (О.К.Баюн, 1989)..

Идентификации исследуемого микроорганизма проводили по полному определители бактерий Берги (1984, Т. I, Секция 5).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ • • -

3.1. Культуральнне свойства и условия культивирования Взс-teriuп^ вр. Попытки выделения.новых штаммов ЪвсЬатХип вр. из 32 исследованных проб клинически.больных.пчел различных.регионов Российской Федерации (Московская, Омская, Новосибирская области, Красноярский край) и СНГ (Армения, Украина, Молдова) положительных результатов не дали. В связи с этим использовали ранее лиофилизированные .^ультуры этого микрооргенизма из музея • лаборатории. Рост на агаре Хоттингера с добавлением 10$ сывсрот-

ки крови крупного рогатого скота в первоначальном посеве материала из ампул при инкубации при температуре 37°С в аэробных условиях появился через 5 часов. Этот рост характеризовался образованием мелких, округлых, полупрозрачных, серовато-белого цвета колоний разных размеров. Изучение под бинокуляром (хб) через 10 ч показало наличие 2-х основных типов колоний: выпуклых с ровным краем, отражающих свет ( R ),к плоских с неровными краями ,.более прозрачных ( S ). Колонии бесцветные, с гладкой поверхностью, консистенция вязкая. Тип S преобладает. После отсева на бульон Хоттингера из изолированных колоний упомянутых типов был сделан повторный высев на твердую среду. Тип R оказался моноклоном, дал однотипные колонии при рассеве. .При посеве микроорганизмов из колоний типа S был отмечен рост колоний различного размера: s1 - мелкие (2-3 мм) колонии с несколько приподнятым центром и 32 - более крупные (до 5 мм) плоские. Последующая проводка микроорганизмов из этих колоний через жидкую среду с высевом на твердую показала, что типы Sj и S2 также являются моноклонами. Выделенные клоны R, S1 и s2 использовали в дальнейшей работе. На агаре Хоттингера с Ь% эритроцитов барана Bacterium sp. образуют округлые, выпуклые, гладкие, блестящие колонии и более крупные плоские колонии с неров- . ньми краями. Рост исходной культуры на бульоне Хоттингера с добавлением 10$ сыворотки крови крупного рогатого скота выражался равномерным помутнением среды и образованием незначительного легко взбалтываемого осадка. Суточные бульонные культуры R и S, - форм в пробирке образуют равномерную муть без осадка. В аналогичной культуре s2 -форм на дне пробирки возникает рыхлый желто-белый крсшковидный осадок, а над ним просветленный слой питательной среды. При встряхивании осадок поднимается в, гиде "косички", создавая равномерное помутнение среды.

Степень интенсивности роста Bacterium.ар. на испытуемых средах зависела от их.состава. Обильный рост отмечали на агаре и бульоне Хоттингера с добавлением 5, 10, 20$ сыворотки крови крупного рогатого скота, средах Эдварда, Китт-Тароцци, Мартена, агаре Хоттингера с добавлением 5% эритроцитов барана. На этих средах на I-2-й день культивирования в I мл смыва или такого же объема жидкой среды содержалось 10^ бак.клеток, на 3-4 день -

q Q

2x10 и на 6-7 сутки - 6x10 ■ бак. клеток. Менее интенсивный рост 10®—10^ бак.клеток в I мл смыва или жидкой среды та 2-4 день культивирования отмечали на МПА и МПБ с добавлением 5, 10, 20% сыворотки крови крупного рогатого скота, МПА, МПБ, агаре и бульоне Хоттингера, 2^-ном ФГМ-с в растворе Хенкса + 10, 20$ сыворотки крови крупного рогатого скота, 2%-ном ФГМ-с + 10 или ZOfo сыворотки кроет крупного рогатого скота + 10% дрожжевого экстракта, минеральной среде с глюкозой + дрожжевой экстракт (I г/л)

с

и на средах Эндо и Плоекирева. Незначительный рост 6x10 бак. клеток в I ш среды на 6-7-е сутки культивирования был отмечен на 2$-ном ФГМ-е в растворе Хенкса и среде БСР для ыикоплззм. На средах. 199 и в гидролизатом лакгальбуыина (0,5$) в растворе Хснкса с сывороткой отмечали на 6-7 день культивирования только наличие роста в виде легкой опалесцвнции.

Установление необходимой среды для культивирования Bacterium вр. позволило перейти к определению диапазона температур, выяснению температурного оптимума для развития этого микроорганизма. Наличие роста определяли на бульоне Хоттингера. Рост отмечали при температурах 36~37°С (оптимум).

Проведенные исследования по установлению отношения микроорганизма к содержанию.кислорода показали, что Bacterium ар. -факультативный анаэроб. На неебраживаеыых субстратах типа амино-■ кислот и органических кислот он способен расти в аэробных и ана-

аробных условиях за счет сбразкивакия углеводов-мономеров. Доказательством роста в анаэробных условиях и усвоения углерода являются также результаты его культивирования на среде Китт-Тароц-ци для анаэробов, в которой микроорганизм дает обильный рост с выделением газа. Косвенным подтверждением о. способности его размножения в анаэробных условиях говорят данные по содержанию ци-тохрома В в его клетках. В бесклеточно.м экстракте, полученном после ультразвуковой обработки (22 кГц, 50 Вт,.2 мин., прибор "Pye Unicura 1000", Англия) бактериальной массы, на дифференциальном спектре образовывалось три полосы поглощения света с пиками в области 429, 530, 561 км, характерными для типа цито-хрома В. Количество цитохрома В было в 2-2,5 раза меньше по сравнению с обычным содержанием его у аэробов.

Таким образок, в результате изучения.культуральных свойств установлено, что Bocteriwn sp. хорошо растет на средах с мясным экстрактом и в средах с добавлением 5, 10, 20$? сыворотки крови крупного рогатого скота. На твердых питательных средах он образует R- и S -колонии. Рост отмечается в диапазоне температур Г5-48°С, оптимум - 36-37°С. Изучаемый микроорганизм культивируется в аэробных и факультативно в анаэробных условиях, обладает цитохромом В.

3.2. Морфологические и тинкториальные свойства. При микроскопическом исследовании изучаемые микроорганизмы, окрашенные по Романавгкому-Гимза, представляют собой клетки, имеющие форму овоидов и коротких палочек. Встречаются цепочки, состоящие из 4-10 коротких палочек, величиной 1,0-1,2 х 0,4-0,8 мкм. Грам-отрицательные, спор и капсул не образуют. Некислотоустойчивые при окраске ео Цюпо-Нильгену бактерии окрашиваются в синий цвет. Фазовоконтрастная микроскопия материала в раздавленной и вися-

чей каплях выявила отличие в морфологии клеток 2-х типов колоний: в В-колониях в основном одиночные и в парах, неподвижные, палочки, в 3 -колониях - конгломераты укороченных палочек, часто цепочки кокков,.часть подвижна. Подвижность клеток из колоний типа сохранилась только на раннем этапе их формирования (до 10 часов культивирования) в старых колониях подвижные клетки очень редки. В жидкой сывороточной среде Хоттингера растет в виде одиночных и парных укороченных (1,0-1,1 г. 0,4-0,8 мкм) подвижных палочек. Тип 32 - ашлогично указанному вше для з.

Более подробные данные получены яри электронной микроскопии, которая показала наличие перитрихального кгутякопания у яяоноэ и отсутствие выраженной капсула на тотальных препаратах. Жгутики одного норфотипа, толстые, трубчатые. Клеточная стенка га ультратокккх срезах (х400СХ5) имеет типичное для гракотрица-тельных бактерий трехслойное строение. Хореко видна область нукявоида и периплазматаческое пространство. Деление происходит путем первтякки клетки я образованием двух нуклеоидов. На срезах такге установлено наличие на одном конце клетки своеобразной газовой вакуоли, не описанной в литературе для данного типа бактерий.

Проведенные исследования позволяют говорить, что изучаемый микроорганизм представляет собой короткую, грамотрицательную, не образующую спор, капсул и не.обладающую кислотоустойчивостьо палочку размером 1,0-1,2 х 0,4-0,8 мкм. Перитрих в з-формах колоний в фазе логарифмического.роста. Клетки имеют трехслойную оболочку, единаобразные толстые трубчатые жгутики, нуклео-ид, периплазматичеекое пространство и своеобразные вакуоли.

.3.3. Биохимические свойства. Определение биохимических свойств исследуемых микроорганизмов проводили, используя различные методики, которые, несмотря на постановку опытов в разное время

на базе институтов микробиологии РАН и ВИЭВ по общим тестам дали одинаковые результаты. Анализ полученных данных по биохимии позволяет говорить об идентичности микроорганизмов н и s клонов, отличающихся между собой лишь сравнительно слабой утилизацией цитрата натрия с глюкозой бактериальными клетками S-кло-нов при сравнительно хорошем использовании этих соединений микроорганизмами В-клона при определении на ПБДЭ. Остальные биохимические свойства обоих клонов были одинаковыми.

Бактериальные клетки изучаемого микроорганизма в аэробных в анаэробных 'условиях утилизируют цитрат натрия, цитрат натрия с глюкозой (tf «еньаий степени s-клоны), способны расти на средах с добавлением кем. Bacterium sp. усваивал источники углерода: ацетат, тартрат (слабый роет), палат, пропионат, декстрат, пируват, фумарат, глюконат, аргинин (слабо), орнитин, глутамат. Не утилизируют: малонат, бутират, этанол, пропанол, бутанол, глиокеилат, гликолат, кетоглутарат, лактат, лизин, фенилаланин, ацетилыэтилкарбинол (реакция Фогее-Проекауэра - отрицательная). Даот положительный тест е метил-ротом. •

Изучаемый микроорганизм обладает ферментативной активностью, вырабатывая аргинин-дегкдролазу, орнитин-декарбоксилазу, галак--тозид&зу к каталазу. Не содержит фермантов лкзин-дзкарбоксилазы, липазы," ДНКаэы, оксидазы. ■ •

Bacterium sp. активно сбраживает с образованием кислоты и газа многие углеводы и высокоатомные спирты: Д-глюкозу, лактозу, Д-маннит, Д-сорбиг, Д-арабиноэу (с задержкой), Л-рашозу, мальтозу, Д-ксилозу, трэгалозу, мелибиоэу(с задержкой, рост слабый), фруктозу, маннозу, сорбозу, галактозу, Д-рибозу (рост слабый), декстрозу, глицерин. Организм.не ферментирует: сахарозу, дульцит, Д-адонит, мио-инозит, раффинозу, целлобиозу, метил-Д-глвкозид, мелицнтозу, эритрит, инулин, эскулин. крахмал. Про-

политические свойства микроорганизма характеризуются отсутствием разжижения желатины и коагуляции молока. Он также не обладает гемолитической активностью. Восстанавливает нитраты.в нитриты.

Резюмируя полученные данные по этому разделу, необходимо сказать, что такие особенности исследуемого микроорганизма как: небольше грамотрицательные, подвижный (перитрихи) палочки с отсутствием спор и капсул, не кислотоустойчивые; возможность роста в аэробных и факультативно в анаэробных условиях на среде Хоттингера и других средах, содержащих мясной экстракт с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота; сбраживание глюкозы и других углеводов и спиртов с образованием кислоты и газа; наличие положительного теста на каталазу, отрицательного - на оксидазу; способность восстанавливать нитраты до нитритов - все это позволяет отнести.его к семейству Entero-bacteriaceae.

Наличие таких характеристик у изучаемого микроорганизм? как использование цитрата натрия, роста в присутствии . KCN, способность образовывать индол, разлагать орнитин и не использовать лизин и ацетилметилкарбинол (реакция Фогес-Ироскауэра) позволяют ранее выделенного патогена пчел отнести к роду Citrobacter.

Анализ дифференцирующих признаков между представителями рода Citrobacter ..и выделенным из. больных пчел микроорганизмом показывает, что последний отличается от C.freundü способностью продуцировать индол и неспособностью образования сероводорода на TSI.Усвоением Д-тартрата -и неспособностью к гидролизу эскулина исследуемый микроорганизм дифференцируется от С.апа-loneticus. С. dlveraus несходен с исследуемым микроорганизмом

способностью утилизировать малонат, сбраживать Д-адонит и от-

сутствием рогга на средах с кем. В отличие от известных представителей рода Citrobacter исследусг-мЯ микроорганизм не способен сбраживать целлобяозу. Наличие выявленных морфологических (меньший размер бактериальных клеток по сравнению с другими представителями рода Citrobacter, наличие своеобразных вакуолей в них) и биохимических различие изучаемой бактерии не позволяют отнести ее к известным представителям указанного рода и.на данном этапе изученности этот микроорганизм следует , - рассматривать как Citrobacter ар.

3.4.Геномные характеристики изучаемого микроорганизма. Для выявления более четких таксономических признаков было проведено изучение молекулярных характеристик ДНК Citrobacter вр. в сравнении с музейными штаммами энтеробактерий, бацилл, мико-бактерий.

Абсолютные значения содержания ГЦ-пар Citrobacter ар. (52,6+0,2 uarS) были наиболее близкими с с. freundii (51,9+ 0,3 мол%) и с. diversив (52,3+0,3 колЙ. Содержание гуакин- . датозина у других микроорганизмов значительно отличалось от исследуемого объекта и было равно у Eacherichia coli К 12 -51,9+0,2' MOJ$, Salmonella dublin - 53,2+0,4 мсл$, Klebsiella вр. -54,4+0,5 тл%, Hsfnis'alvei - 50,5+0,2 ЫОЛ/»; Bacillus epiarius 1 - 50,2+0,2 кол?б, Вас. apierivus 2 - 43,0+0,4 иоя%, Бас. alvei 50? - 48,4+0,2 Бас. я Ivel 332 - 47,1+0,1

ыол%, Вас. paraalvei - 45,9+0,2 ГЦ. По содержании ГЦ. пар у выделенных R, и s2 клонов Citrobacter эр. существенных различий не установлено (52,8+0,1 мол$ Щ, 52,6+0,3 мол# ГЦ, 52,7+0,3 тд% ГЦ соответственно).

Молекулярная масса ,ПДК_(размер генома) Citrobacter ер. . раеаа 2,9x10^ дальтон, чго соответствует показателям основного массива зктеробактврий ( Gilles et el,, 1970). У с. fretaidii»

С, diversus и Escherichia coli К 12 она одинакова и равна 2 дальтсн. Размер генома у взятых для сравнения других

микроорганизмов бь'Л иным: Klebsiella яр. - 2,6x10^, Hsfnie я Ivel - 3,5xI0y, Bacillus epiarius 1 - 2,7хЮ9, Вас. ipiari-ue 2 - 2,SxI09, Sao. alvei 502- 3,0xI09, Bao. alvei - 2,8xI09, Вас. paraHlvei - 3,1x10^ дзлътсн. В то же время сравнение этого показателя по R. Sj и клонам Citrobacter sp. на дало различий, он бил равен 2,9x10® дальтон.

В реакции ДИК-ДИК гибридизации, проведенной штодами: по кинетике реессоцгации (№ I) и с помощью радиоактивных реперкьэс препаратов Citrobacter sp. имела недболее дыескяе уров-

ни гочологнй я о. Iraundü 72% в первом к 75,3$ во втором случае и_с iiivoraus 51% и 67,2;? соответственно. Проц-зят гомологии исследуского микроорганизма, установленный .по кинетике рв-Зссоциации (№ I), составлял с Sacharichia coli К 12 - 39, Salmonella dublin - 43, Klebsiella ар. £7, Hafnio alvei -XI. Процент гомологии Citrobacter ар., установленный методом а помоцыэ радиоактявномаченых реперных препаратов (F 2), составлял е Escherichia coli К 12 - 36,5+1,1, Salmonelle dublin -44,8+3,3, Klebsiella ар. ^ 23,8+3,2, Hafnia alvei - 14,3+2,1, Bacillus apiariua 1 - 2,8+0,4, Bao. apioriiw 2 - 2,3+0,3, Bao. alvei 502 - 2,6+0,2, Bao. alyei 333 - 2,9+0,1, Bacillua paraalvei - 3,0+0,1, Micobacteriun tuberculoais - 0,9+0,1.

»Реакция ДНК-ДНК гибридизации позволила выявить полнее сходство между тремя клонами Citrobacter эр., процент гомологии реоерной ДНК' читана К с ДНК клонов R, S1t S2, соответственно, составлял. 100$* 98%, 99?а. Учитывая значения по нуклеотидному составу и размеру генома, следует, что культура изучаемого шкроорганизма представлена одним штаммом, независимо от отличиЯ

по подвижности клеток.

Таким образом, геномные характеристики Citrobacter ер. подтверждают заключение, с его принадлежности к роду Citrobacter- и позволяют четко дифференцировать его от других знтеро-бактерий, бацилл и шкобактеркй. Кмеюциеся отличия Citrobacter ар. г; С. frsuiidii и с. ¿iverous, Еыратакщизся в несколько большое показателях нуклеотидного состава (52,7 мол% ГЦ против 51,% кол? ГЦ'и 52,3 моЩ) и разкарах геномов (2,9хЮ9 против 2,4x10^ д), не позволяют отождествлять его с отими видами.

3.5. Некоторые серологические свойства микроорганизма. Дзя изучения некоторых серологических свойств Citrobacter ар. использовали.РА и РДПА (по O.Ouchterlony, 1948).

В процессе иммунизации титры сывороток крови кроликов в РА к гомологичным штаммам изменялись следуюсдем образом: Citrobao-tar ар. чзрез 7 и 14 дней после первого введения антигена -1:400, 21 и 28 дань - 1:800, в иэмент обескровливания - 1:1600, для С. freuadii - на 7 и 14 дни - Г:200, на 21 .и 28 дни' -1:400, в шмант'обескровливания - 1:800,

В реакции агглютинация полученные гипериммунные сыворотки реагировали с гомологичными антигенами в разведении 1:1600 для Citrobacter вр., 1:800 для &. freuadii. Максиыал.ысый положительный титр сывороток с гетерологкчньши внутри рода Citrobacter. антигенами составил 1:100, минимальный - 1:50. При взаимодействии сывороток с песпещфическим гегерологичнки антигеном Hafnia aivei агглютинация не проявлялась во всех случаях.

В РЯДА полосы преципитации Citrobacter вр. с С. freundii образовывали_"шору", что свидетельствует о их неполном серологическом родстве, В ТО же время Citrobacter sp. И С. fröundii .не проявляли серологнчоского родства с Halnis a?vei (линии

преципитации ¡¿заду специфическими для Citrobacter ар. .и С. freundii пЫЕЗроткает и антигеном Hafaia al-voi отсутствовали).

Таши образом, по серологическим свойствам выделенный микроорганизм имеет антигенное родство с представителем рода Citrobacter.

З.б. Патогенные свойства Citrobacter ар. для лабораторных животных.л пчел. При интраперцтонеальном заражении кроликов, морских свинок и белых мышей суточной кикробной взвесью Citrobacter ар. з дозах 1-0,5 мл и концентрации 100 млн.бак.кл/мл, 500 млн.бак.кл/мл, I млрд.бак.кл/мл заболеваний и-гибели животных в течение 30 дней наблюдения на отмечено. Аналогичные результаты были получены в контрольных группах, где животным вводили стерильный буферный раствор в том ке объеме. При введении исследуемого микроорганизма непосредственно в гемолимфу пчел .наблюдали 100^-ную гибель насекомых. Основная масса пчел гибнет на 3-5 день после заражения. При скармливании этого микроорганизма гибель насекомых растягивалась до 20 дней, погибало до 56% пчзл. Болезнь характеризовалась наличием малоподвижных, ползающих пчел, не способных к полету. Пораженные пчелы имели мутную, беловатого цвета гемолимфу. У всех погибших пчел з опытных группах из грудных мышц и гемолимфы выделена исходная культура. Отход насекомых в контрольных группах составлял 4-63.

В естественных условиях представители рода Citrobacter . широко распространены в природе. Их обнаруживали в кишечном содержимом здоровых пчел ВО Франции (Tyaset е., Rousseau И., 1967). Однако о заболевании этих насекомых, вызываемом Citrobacter, сведения отсутствуют. Выделение Citrobacter из гемолимфы пчел при их массовой гибели в Армении, Молдавии, Красно-

дар^ком ftpae и Тюменской области, а такяс результаты опытов по заражению пчел указывают на его роль как возбудителя wietpí-(¿глгаского заболевания - цитрабактероза. Эффективность зрнтроан-лГ.ша при данной болезни явллзтля дополнительным материалом, псдтпгр:-щак;!Ш природу этого микроорганизма ( Bergey, IS84), В условиях семьи пчел в роли естественного инокулятора вообу/д-

теля, вероятно, сыгтупает клещ Vsrroa ¿acobcoai, известный как

i

переносчик многих возбудителей болезней. В теле этого паразит» г-Янарукены Citrofcacter spp. в Польше ( Z.Glinakij J.Oüiüss, „ 1920), что "указывает на их поступление из гв«олии$ы пчзл. В силу чего mo'.íko предполагать, что цитробактероз имеет более ¡игроков распространение.

• ВЫВОДЫ

I- По морфологическим, .тинкторизльньш, культуральнкн, биохимический, геносиетематвчвсюш свойствам выделенный из ret»~ лимфы больных пчел микроорганизм ОТНОСИТСЯ К ро.яу üitrobaot&í*.

2. Выделенные клоны из. R- .к S -колоний изучаемого маиро-ерганизиа по бкогаатчгеюи: свойствам, содержанка ГЦ» молекулярной массе генома и уровни гомологии нуклеотидных последовательностей ДНС идентичны.

3. От известных видов citro'oacter дашшй иикрооргенизи отличается меньшими размерами клеток, их подшжноетью из в-форм колоний в фазе логарифмического роста, наличием вакуоли в клетках, больший уровнен ГЦ (52,6 против 51,9-52,3 кол%), большей молекулярной уассой генсыа (2,9x10^ против 2,¿xIQ9 дальюн) и неспособностью сбраживать целлобиозу. На основании чего он

кденткфицпрован как Citrobac'ssr sp.

4. Гилерииыунная сыворотка к Citrobacter sp. реагирует в реакции агглютинации с антигеном с. f-uatóli в разведенки

1:50. Лнтисыворотка К С. freundii дает реакции с Citrobacter зр. 1:100. Обе сыворотки не реагируот с антигеном Hsf.-Ua olvei. На наличие общих антигенов указывает реакция диффузной преципитации в агаре.

5. Citrobacter ар. Еызыкает 100%-ную гибель пчел np;i пз-рзятлралънои введении и 56%-ную гибель этих насекомых при скармливании, организм апатоген«н для кроликов, морских сбкноя, ми-гей при интраперигониальном введении.

6. Citrobacter ар. являлся возбудителем заболевания взрослых пчел при же кассовой гибели в I9B5-9I гг. в Краснодарском крае и Тюменской области, а также з Армении и Молдавии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДКШШЯ

1. "Методические указания по лабораторной диагностика цит-робактероза пчзл", утвержденные Ученым Советом ЕИЭВ 26 августа Х593 года, протокол № 10.

2. Дрполнзниз к п. 2.5 Инструкции о мероприятиях по предупреждению и ликвидации заразных болезней пчел, утвержденной

ГУВ Г1{ СМ СССР по п. 3 12 марта 1991 г. (утвержденное Учении Советом ВИЗВ 19 ноября 1993 п, протокол № 13).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Морфологические и биохимические свойства бактериум епециес от больных медоносных-пчел // Информационный листок Бурятского ЦНТИ, № 77. - Улан-Удэ, 1993. - С. 1-3.

2. Дитробактероз пчел // Пчеловодство. - М., 1993. - V II, 12. - С. 22-23 (соавт. О.Ф.Гробов, В.А.Фомин, ЮЛЗ.Батуев, Л.Н.Гузева).

3. Цитробактер - возбудитель заболевания взрослых пчел // Ветеринария. - 1994. - № I. - С. 35-36 (соавт. Л.Н.Гузева, 0,5.Гробов, Б.А.Фомин, Ю.М.Батуев).