Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологически активные вещества морских гидробионтов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биологически активные вещества морских гидробионтов"

р г 6 00

2 ? рс[всйсош!г^1 научно - исслщоштскш

ПРСЕКТНО - КОНСТРУКТОРСКИЙ ИШТИТУТ 1ШИКЛАДЖ)Й БИОХШИИ

.'1а правах рукопиои

АШУТСКАЯ ГАЛИНА СПИРИДОНОВА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЩЕСТВА МОРСКИХ ГИДРОШОНТОВ

ОЗ.ОО.йЗ - Биотехнология

• АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискании ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА - 1522 г.

Работа выполнена во Владивостокском государстеенном медицинском институте iu3 "Л>.

Н&учше консультанты:

Доктор медицинских наук, заслуж.деят. науки Pw, профессор ЫОТЛЖША. Н,С<

Доктор медицинских наук,академик АШ, профессор БОРОБЪВЗ A.A.

Официальные оппоненты: д.т.х., академик PA1I, профессор ШШЗ В.Л., д.м.н., профессор ДРАТШК С.А., д.б.н. КОРЯКИН A.B.

Взцу,цее учреждение, дающоо отзшэ о Ш1учно-практической ценности диссертации, - Институт иммунологии концерна "Биопрепарат" (Московская обл., нос. дюоучаны).

Защита диссертации состоится " г.

в "/I?" часов на заседании специализированного совета Д.089.09.01 во Всосоюзноы научно-исследовательском проектко-конотрукторсксм институте прикладной биохимии' (1252а9, Гиосква, ул.Клары Цеткин, 4/6).

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке Всесоюзного науЧно-исододозательстсого кроеотно-конструкторского института прикладной биохимии.

Ученый секретарь специализированного соната кандидат олологических наук

И.'И. ГУОКВА.

ОЩЛД ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем». Резко возросший интерес к морскии организмам как исто'Ишкэн биологически активных веществ (БАБ) . определяется многими причинам«!: суиественши исгонгнпен их назсмннх источников, отиателыал) объемом информации о яс'еб-нон действии гсцеств морокоП прирсдн, иисокоП продуктивностью мирового океана, ^.''лмчитедшыч видовым богатством морской фюр»! н ¿Тлуим со споообраашкл! мвтабслтстия« процессами и слабой иау'-тшюатмо (около .1%) морских органкзшв ни и*. г.пл;;-чио (Ажгнхин И.С. с соаят., 1982 { Иоташэдна ¡{.С. с соавг., Г.'ЗЗ; Гитсльзен О. с соавг.» 1984,- БзськовокцП В.С,, ХГСЧ; Коотвцяий Э.Я., 1901); Единой Г.В., Стокнк Б.Д., 1988). Крена того, практикуемое в настоппоз время одностороннее испольаова-низ бИОЛОГКЧЗОНЛЯС росурсов ¡Ярового окоэ1га для производства только пкнеиык продуктов яляготся недопустим:;.? расточительством, Они трзбуит рпцисчзддймого, шлшгкеного использования с кзкошгалыюЯ уткяпэ-эшеП огходоа нзгп'чевого навг.ичгния п различите обдаст;« народного хааН1стк» а капсство нстс^тнка лошретв. Однако, многпэ биооирьоиыо ресурсы океана обсечен» вниманием исолдюпатслеП. Особенно зто касаатои морских м.тс-копнтчивдх, б-зспоапоночнык, отходоп оиоробоПного нромиокп, морских ыикрооргэннзмоз. В то га срсмп срошителыюо би.охи'.'п-чеспоз ггсслодогпнно БАЗ морских организмов разных зколегизде-кик низ предстовллот большей ниторео для бисдогичвской и 1.*оди-цинскоП науки, ссобонно с учетом оаоеобраэгй усдошй океан?, усугубляет: стрессом экологипооккх катиотро-К о то« числе антропогенной природы, Поэтому именно сейчас очень кыш исследования, расширяйте перспективы развития, освоения и более полного использопания биологических ресурсов М.ропого океана.

Цель работы - разработка научных основ биотехнологии БАВ из отходов морского промысла и нсдико-биологическое обоснование использования их в биотехнологии.

Задачи:

I. Помок БАВ в органах и тканях морских организмов разных таксонов с. выявлением новых , наиболее перспективных,. Источников сырья для их получения.

2. Разработка способов получения БАВ липццной, пептидной и комплексной природы из объектов морского происхождения для производства фармацевтических препаратов различного действия и назначения:

- антибиотиков, их пролонгаторов и синергистов;

- иммуностимуляторов и иммунодепрессантов;

- простаглаидинов (ПГ) и их предшественников;

- аллергенов и десенсибилизаторов;

- противоопухолевых БАВ, цитсстатиков;

- разработка новых и усовершенствование традиционных способов получения БАВ из морских объектов для медицинских и народнохозяйственных целей.

3. Биологическое тестирование полученных препаратов БАВ на различных биологических моделях и их. оценка с позиций перспективности.

4. Модификация и внедрение чувствительных физико-химических методов стандартизации, оценки эффективности и контроля лекарственного биосырья и препаратов морского генеза.

5. Сравнительное изучение особенностей химической природы БАВ морских гидробионтов и наземных животных.

6. Разработка научных основ наиболее полного медико-биологического использования биологических ресурсов Мирового океана, повышения рентабельности морского промысла и смягчения за счет этого воздействия антропогенно-экологического пресса на морскую среду.

7. Выяснение возможных механизмов высокой резистентности и адаптированности морских гидробионтов в условиях морской среды.

Научная новизна. Выявлены новые источники БАВ среди морских организмов млекопитающих, паниирно-позвоночных, хордо-■ вых, беспозвоночных, микроорганизмов, превосходящих их аналоги от наземных животных. Дана Ьценка перспектив биотех-рологических аспектов получения БАВ пептидной, липццной и 'комплексной природы из морских организмов. Определена топография БАВ в органах и тканях различных морских организмов, установлены закономерности в их распределении.

Обнаружено и описано явление самостоятельного антибиотического действия и повшешя активности известных антибиотиков липцдными препаратами морской природы.

Впервые выявлена естественная резистентность простаглан-дннов у морских объектов, показана высокая обеспеченность ими различных органов, определены наиболее перспективные источники получения ПГ и их предшественников.

Установлены важные трофические связи у отдельных морских гидробионтов разной сложности организации, преемственность в перераспределении БАЗ ыегкду ними. Высказана гипотеза о значении условий морской среды для формирования своеобразной физиологической активности адалтагипино-зашитных факторов морских гидробионтов,.

Практическое значение диссертации определяется экспериментальным обоснованием эффективности использования БАВ морской природы, особенно отходов морского промысла в биотехноло. : гии и медицине. Оно выразилось в разработке 7 новых способов получения БАВ разного назначения, защищенными 2 патентами и 5 авторскими свидетельствами. G их помощью экспериментально и в полупромышленном масштабе апробированы иммуномсду-лятори ИСВ, Ю-1, ИСФ-П, полиеновые жирные кислоты, аллергены, полученные из^отходов зверобойного, рыбного промысла и промысла морских беспозвоночных. Изучены на наличие БАВ 125 новых штаммов морских микроорганизмов, один из которых - Р."putida № 34-ТЛО передан во Всесоюзную коллекцию промышленных микроорганизмов как источник БАВ,

Все полученные препараты прошли доклинические испытания и рекомендованы для дальнейшего клинического контроля в качестве корригирующих средств, диагностикумов, реагентов-стандартов. Препарат "крабовый аллерген" широко апробирован в клинических условиях для использования в диагностической практике, Метод одновременного проявления и детектирования про-стаглавдинов внедрен в клинику.

Многие материалы диссертации используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе Владивостокского и Благовещенского медицинских институтов; Тихоокеанского института рыбного хозяйства и океанографии. К ним относятся методы получения иммуностимулирующих веществ (ИСВ), иммуностимулирующее факторы ШСФ)., кейлонсодержащие препараты (КСП), аллергены, проотаглацаины (ПГ), предшественники ПГ и полив-новые жирные кислоты (ЛНЖ), модифицированные способы гель-фильтрации- гормонов тимуса, тонкослойной хроматографии липи-

дов и простагландинов.

Обнаруженное явление синергизма антибиотиков"и липидных препаратов морской природы весьма перспективно для клинической практики как способ предупреядаения лекарственных осложнений и экономии лекарственных средств.

Апробация диссертации. Результаты работы были представлены на ряде научных форумов:

'"на Всесоюзной конференции по проблемам научных исследований в области изучения и освоения Мирового океана (Владивосток, 1983), региональной конференции "Итоги исследований по вопросам рационального использования и охраны биологических ресурсов Сахалина и Курильских островов" (Южно-Сахалинск, 1984), на Всесоюзной конференции по комплексной утилизации ресурсов океана (Владивосток, 1988), по медико-социальным аспектам проблемы "Человек-океан" (Владивосток, 1988), Я Всесоюзной конференции с международным участием ''Реабилитация иммуной системы" (Цхалтубо, 1990), в "Известиях Тихоокеанского научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии (ТИНРО)" (Владивосток, 1990), Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества гидробионтов - новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты" (Владивосток, 1991), Всесоюзных конференциях "Медицина катастроф" (Владивосток, 1991); "Иммуномодуляторы природного происхождения" (Владивосток, 1991),

Публикация. По материалам диссертации опубликовано 34 работы, в том числе 21 - в центральной печати, 5 авторских свидетельств,-2 патента, 13 - в региональной печати. Положения, выносимые на ■защиту.

1. Морские гидробионты обладают ценным комплексом биологически активных вешеств, способствующих их тесным трофическим связям, определяющих высокую адаптивность и жизнестойкость в своеобразных условиях океанической среды.

2. Морские гидробионты различных экологических ниш - перспективные источники биологически активных веществ разного назначения: антибиотиков и их синергистов, иммуномодуля-торов, гормонов и горыоноподобных веществ, простагландинов и их предшественников, кейлонов иммунодепрессируше-го действия, цитостатиков, аллергенов, мембранотропных стабилизаторов, комплексов БАВ, превосходящих по многим

показателям аналоги наземных животных.

3. Разработанные новые препарата, перспективные для лечебно-профилактического и диагностического медико-биологического назначения, разработанные новые и усовершенствованные тради-. циошше способы получения БАВ. '4. Научные обоснования наиболее полного рационального комплексного медико-биологического использования биоресурсов океана л отходов морг.-!го промысла, обеспечения его безотходности и экологической чистоты.

Объем диссертации и структура. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 8 глав собственных экспериментальных исследований, заключения, общих выводов, рекомендаций для внедрения в науку и практику. Она содержит 477 страниц машинописного текста и 144 страницы приложения. Работа иллюстрирована 145 таблицами, 29 рисунками, 22 схемами и 40 фотодокументами. Указатель .литературы включает 660 источников, из них 340 зарубежных.

Материалы и методы исследование. Направления, материал и методы исследования подробно суммированы в приложении диссертации.

Основным материалом из числа исследованных морских объектов служили морские млекопитающие - тюлени ( ГЬоса уИиНпа ), МОр:хя ( (МоЬаепив говтагие ), серые КИТЫ ( Eвchritiuв gobЪoвuв егх1еЪег ), белухи ( Ве1рН1парЬвгив'Хиоав ); среди

беспозвоночных - асцидия пурпурная ( Иа1осуп№1а аигапПит ), кукумария японская ( Сиситаг1<1ае оароп!в ), дальневосточный трепанг ( Б^сЬорие ¿аропХсио ве1епка ). КрОЫв ТОГО ИССЛОДО-ваны камчатский краб ( РагаНЪЬойоев сатЪесЬаПса ); рибы-кзм-бала желто-полосатая ( ШтапСа Ьеггепвге1п1 dord et Зпийег сельдь-нваси ( БагсИпора Sagax те1апо8), тихоокеанская сельдь ( С1иреа ра11аа11 ), тихоокеанская треска ( СаЛиа тогйиа тасгооерЬа1ив ) и 125 штаммов микроорганизмов, выделенных из дальневосточного трепанга. Основные направления проводимых исследований включали поиск белково-пептндных комплексов стимулирующего (I), ишлунодепрессивного и цитостатичоского действия (П), иммунопатологического, аллергируадего (Ш) и антибиотического (1У), синергидного (У) эффектов, веществ, Зиостшуллруидих изолированный органы (У1), модуляторов широкого спектра действия (УП).

а

Выделение и стандартизация ЕАВ осуществлялась способами и методами в оригинальных, разработанных ш усовершенствованных наш вариантах.

физико-химические исследования проведены с использованием 40 традиционных и мо.ад^ицйрованных нами методик. Ош могут быть сгруппированы следущим образом: хроматография (тонкослойная, колоночная, ионообменная, газ'ояидкостная, гелъ-хрокатография); электрофорез в полиакрилами.цнаа геле (ПААГ); гравиметркчзсхшз методы анализа; абсорбционная-спектроскопия (слектромотрил); йизическдс метода анализа (атомно-абсориди-оншй, нейтро^шо-аитквацйпнкыа, ядерный магнитный резонанс с , использованием ЛиРН* и ЛйРС^); колебательная спектроскопия (Ж-спектроскопия).

йетодп биологической оденки БАЗ хшгочаяи микробиологическую оценку антибактаригльно^, фунгкцидоой Шедъмина Е.А., Фурср Ь.И., 19о4), дрогивовирузнсы активности (Кахдадош Л; с соавт., ГЭЗО). лммуноонологическое тестирование по клеточным ч гуморальный шраметрам, проаодикш. ..соамеоиго с швдуно-логама ( Ьау т/.н. с сонат.. 1371; ИугЬгап с сОсШО1.,

2съп:агтг д. е сорзт. , 1966 в модификации £>радки-

яе В.А. с соавт., ¿279; Запйп1 К. о г.оавт., 1972; ИугЪгап с со&зт., 1У72; Тга1г.1п X с соавт., 1и34), радкшвдыуноло-гпческоэ опрецедешьа ЦТ (Эфондкев А.Ы., Ломайницкпп Б.Д., 1253), блачох-яческие методы обнаружения и количественного тестирования на пзолдроваклых органах животных (Короза Г.С., 1271; Брагйщдева 1935), ыэт.оде определения протдаоопу-холзбых свойств препаратов (Богословская Б.II. с соавт., 1975; т. 5 Эигик! л., 1955 # модиимкации Нозяшгна С.М. о «авт., 1ЭС0).

Все кодшчесмэешше воказатели подвергну ты обработке вариационной статистики.

ССирРХШЁ РАБОТЫ ' •

Раздил I. ЯБЖО30-ЩГОЩЫШ ЮЖШЕКСЫ ШРСШ ЖВОТШХ, ШУДОЮ^ШРУЩВГО .ДЕЙСТВИЯ 1.1. Хвлкоьо-пеиткднке комплексы морских животных

действия

В настоящее время ларес-юо, что тимус .шшкопнтаадшс -основной орган, ре^длрувдпй развитлэ и дифференцировку З1-ли«|оц11тов - глазных участников иммунологических реакции

а

(Петров Р.В., 19Ы, 1988). Он осуществляет свои функции благодаря выделению комплекса гормонов а гормонопздобных веществ преимущественно полипептидной природа (Михайлова'A.A., Захарова Л.А.1938). Современный этап развития иммунной биотех- • нологии позволяет получить, из тимуса .наземных животных ряд медиаторов шмуннол системы, таких как тимоэин, тимопоэтин, тимашш, Т-актявин и ткмлческий сывороточный фактор (Раевский А.И., Лебедев-М.И., 1971; Костадпнов Д.А., 197Э; Порозов В.Г., Хавинсон В.Х., 13Ы; Савватееьа Л.й. с ссавт., 1963; Кемилева 3., 1984; Tralnin N. с ооавт., I9S9; Hooper J.A. с соавт., 1975; Goldstein A.L.с соавт., 1975). Однако дефи^ цит и дороговизна источников тимуса, низкий выход гормонов из традиционного сырья и недостаточно высокая их эффективность давно определили актуальность поиска новых сырьевых источников. Это и явилось основанием' для необходимости изу-дения гормонов тимуса у таких крупных морских млекопитающих как киты, ыоржи, тюлени. Данные виды морских животных, как потенциальные сырьевые источники гормонов тимуса не имеют себе разных, ибо многократно превышают- размеры большинства из наземных животных и практически кроме иолоней (Ермолин Г.А., Внукова S.A., IS82) в этом плане не исследованы. Ка тимуса китов (взрослых и эмбрионов), моржей, а дял сравнения теднт по разработанным нами сцосоОадл было ваделено 1.0 препаратов иммуностимулирующего и ишуномодулар/ющего действия.

Способ получения иммуностимулирующего вещества (ZiCIi) из тимуса морских и наземных млекопитающих (A.C. lb 1443237 от 18.08.88).

В качестве прототипа для разработки способа била ьгята технология, предложенная A.L.Goldateinc соаат., Ц97и), основными недостатками которой явилось применение высаливания и прогревания, приводящего к выделению веек массы белков и уменьшено её активности при термообработка. Цель нашего способа - его упрощение и новый,ение его эффективности. Она достигалась за счёт вытяжи активного начала физиологическим раствором, центрифугирования, осаадоняя его из еупернатанча ох~ лаздекным ацетоном, отделения осадка н растворения его, з фосфатном буфере. В процессе получения отработаны соотношения рабочих растворов, растрорнталей и сырья, продолжительность эксперимента. Способ отличался от оригинальной техноло-

гик Goldetein A.Ij.c соавт. (1975) тем, что наш не проводился нагрев гомогената и высаливание активного начала сульфатом аммония, что позволило получить возможно большее количество термостабильных и термолабильних БАВ вилочковой железы. Использовали для получения активного начала фосфат ный буфер с рН = 8,0 вместо нейтрального. Б качестве сырья ш использовали тш.гусы тихоокеанского моржа, серого кита и его эмбриона.

Параллельно с помошьо разработанного нами способа ими ностиь^улирующее вещество было получено из традиционного ои 'логического сырья - тимуса теленка.

Способ получения имцуноетицулируюпэро фактора I и иму нпсткмулирущего фактора 2 (А.С. )? IÔ06Ô68 от 08.05.89).

Для лоециспшя активности целевого продукта г оме гена v тимуса в физрастворе центрифугировали, супернатант обрабатывали охяахдаенным ацетоном. Ацетоновый порошок растворяли фосфатном буфере с рН = 12 я подвергали гель-фильтрации t сефадексе.

В процессе разделения КСВ из тимуса серых китов и тех колоночной хроматографией через сефадекс & - 25 за 20 час йлйции собраны в обоих случаях две фракции. За первые II,с часов при скорости 20 см /н выходит препарат иммуностицу; рующий фактор I (ИСФ-I), с II часов до 20 часов эпхщии - г парат иммуносинщишрующий фактор 2 (ИСФ-П). Целевой проду! извлекали из фракций, имеющих максимальный уровень логлоии при 260 км. В'качестве сырья использовали тимус серого киг тихоокеанского моржа и теленка.

Сравнительная биологическая активность препаратов MCI ИОФ-П из тимуса морских и наземных млекопитающих.

Дропарат ИСВ из вилочковой жолезы серых китов предел собой комплекс глико-пептидов с молекулярными массами око; 75,3; 36,0; 10,6; 5,0 -цД. Препарат обнаружил способност превращать кортикальные тимодйты в теофиллинчувствителыш Т-сулрессоры (25 Щ в I ыг препарата) и кортизонрезис-тантные ' кедуллярше тимоциты (50 ВД в I мг препарата), усиливая на клетках экспрессию Е - рецепторов; восстанавл синтез антител к эритроцитам барана у гидрокррт/зоцаепрес ровакных иьшей (10 ООО Ь'Д в 1 мг препарата), восстанавлив число зрелых Т-лиЦюцитов (Ë-Î4K I ООО ВД в I мг препарат

нормализовать нарушенное соотношение ТР-Р0К/ГЧ-Р01С (I ООО ЕД в I мг препарата) в периферической крови иммунодефицитшх больных с Т-клеточным иммунодефицитом. Препарат активнее тимо-зина №В телят - в 10,0 - 17,5 раз (табл. I).

Препарат тимоцитстиыулируюций фактор I из вилочковой железы серых китов, представляющий собой комплекс глико-пеп-тидов с молекулярными массами около 75,3; 36,0; 10,6 «Д.

Препарат обнаружил способность превращать кортикальные тимоциты в кортиаончувствительный - лимфоцита; теофиллинчув-ствительные Т-супрессоры (200 ООО ЗД в I мг препарата при тестировании in vitro , 1 ООО ООО ЕД в I мг препарата при тестировании in vivo , ауто-РСК (200 ООО ВД в I м? препарата), К-клетки (10 ООО ВД в I мг препарата), НК-клетки (2 ООО ВД в I мг препарата), при этом на тимоцитах усиливается экспрессия Е- и FoHh -рецепторов, а снигкается экспрессия и С'З-рецепторов; восстанавливать синтез антител к эритроцитам барана у гидрокортизондепрессированных мышей (2 ООО ООО ВД в I мг препарата); восстанавливать число зрелых Т-лиьфоцитов (Е-РОК - I ООО ООО ЕД в I мг препарата) и нормализовать нарусе-ние ТР-РОК/ТЧ-РОК (100 ООО Щ в I мг препарата) в периферической крови больных с Т-клеточннм иммунодефицитом.

Препарат активнее ИСФ-1 телят - в 20 раз (табл.1), он представляет собой комплекс глико- и липо-протеинов и пептидов с молекулярной массой около 75,6; 32,2; 7,4 цД. При испытании в лабораторных условиях он, хоть и уступил китовому ИСФ-1, но обнаружил способность превращать кортикальные тимоциты в теофиллин-, стеровдо-чуветвительныэ Tj-сулрессоры (10 ООО Щ в I мг препарата), увеличивая экспрессию на. клетках Е-рецепторов.

Фактор I активен в тесте розеткообразования с эритроцитами барана (E-РОК) в концентрации 0,001-0,01 мкг/2хЮ"^. При введении гидрокортиэондепрессированным мышам она восстанавливает антителообразование в дозах 10"^ - 10"^ мкг/мышь. 100%-нов восстановление функции отмечается при использовании 6x10"^ мкг/мышь. Это указывает на повышение активности полученного нами препарата по сравнению с прототипом.

Препарат тимоцитстимулирусаий фактор П из вилочковой железы серых китов, представляет собой глико-лептцпы о молекулярной, массой около 5,0 ^Ц.

Препарат обнаружил способность превращать кортикальные тимоциты в кортизонрезистентные медуллярные тимоциты (20 QQQ

РД в I мг препарата), НК-клетки (I ООО в I мг"препарата), при этом на тимоцигах усиливается экспрессия Е- и 1'сн11-рецеп-торов, а снижается экспрессия Е37-, С'З и ауто-рецепторов; восстанавливать синтез антител к эритроштам барана у гидро-кортизочаепрессированных мышей (10 ООО НД в I мг препарата); факиор Я обладает активностью в тесте Е-РОК в дозе 0,1 мкг/ 2x10^. В дозе 0,05 мкг она защищает от литического действия гидрокортизона 50% кортикальных тимоцитов мышей. Он способен восстанавливать число зрелых Т-лиыфоцитов (Е-РОК - 10 ООО ЗД в I мг препарата) и нормализовать нарушенное соотношение ТР-РОК/ТЧ-РОК (10 ООО ЕД в I мг препарата) в периферической крови больных с Т-клеточным иммунодефицитом. Активнее своего аналога в 20 раз.

ИСФ-П из вилочковой железы телят представляет собой комплекс глико-пептвдов молекулярной массой в пределах 4,7 - 2,5 кД. По биологической активности он уступал китовому ИО&-Л.

Физико-химическая характеристика гормонов тимуса из морского и наземного сырья.

Все перечисленные препараты были подвергнуты нами не только биологическому, но и физико-химическому тестированию в сравнении с аналогами из наземных животных.

Результаты проведениях испытаний показали, что содержание белков в ИСВ морских млеколитакиих в 1,9 раза, в ИСФ-1 -в 2,4 раза, в ИСФ-Л - в 3,0 раза меньше, чем в аналогично выделенных препаратах из тимуса наземного животного теленка.

Колоночная и тонкослойная гель-хроматография позволили разделить ИСВ и его факторы, определить их молекулярные массы, При этом установлено, что массы китового и моржового ИСВ мало отличались друг от друга, но оказались заметно выше таковых у гормонов тимуса теленка.. ИОФ-П, полученный как из наземного, так и из морского сырья, состоял из одной фракции. Молекулярная масса ИСФ-Л составляла 5,0 кД, моржового - 4,5 „ кД, ИСФ-Л - теленка - 4,3 цД._ Разработанный наш вариант гель-хроматографии показал, что по качественному составу китовые ИСВ и ИСФ-1 наиболее гетерогенны и представляют собой

Таблица I

Сравнительное тестирование активности препаратов из тимуса серого кита и теленка -KCw-I, ИС£-П,.йСВ lia тиыоцитах мыши

Способность превращать тимоцитн в тео^иллин-

п^^ттппоти чувствительные ЧС-супрессоры, тест шалыяева црепараты с соавг., 1 i§81.

Способность превращать кортизончувствитель-ные тимоциты в кортизонрезистентные медуллярные тимоциты. тест___. 1974

• действующие дозы n=2U

активности на I кг препарата

китовин препарат активнее своего аналога из тимуса телят

действующие дозп д!; активно- китовып ста на 1 ыг препарат препарата активнее

своего ала/ лога из ти- лога из тимуса телят

Горыош тимуса серых китов:

ИОа °40-60 мкг/2 I06

ИС'5-I х0,005-1,0 мкг/2 I06

хне акт.

Гормоны тимуса телят:_

25 Ш в 10 раз' °20-40 ыкг/2 10° 50 Щ в 17,5 раз

200 ООО ЭД, в 20 раз *He акт. 0»D V,

0,0 ^П), 05-1,0 мкг/2 106 2и ООО ВД в 20 раз £

ИСВ

■ЙС1;.—I ИС5-П

0400-450 мкг/2 I06 XQ, 1-1,0 мкг/2 10е

^е

акт.

2,5 Ж 10 ООО ¡Щ 0,0

0350-400 ккг/2 I06 2,8 ВД *не акт. 0,0

Х1,0-10,0 мкг/2 Ю6 I 030 ЬД

Тимоциты мыаои лшш СНА и беспородных белых °тимоциты беспородных белых мшей

смесь трех кингидринполо;гдтельных фрагментов, один, из кото- ■ рих доэт дополнительно специфическую окраску на сахара ( в основном на пентозы).

С помощью электрофорзтнческого разцзления также показана 'гетерогенность ИСВ и ИСу-1. При это;,; 2 фрагмента морских препаратов совпадают с одним из фрагментов фракции Гольдштеи-на, использованного нами в качестве стандарта. Самое низкое значение молекулярной массы отмечено у фракции ИСд-I теленка. Оно равно 7,4 кД, что на 4,6 кД меньше, чем молекулярная масса фракции а 5. Сравнивая молекулярную кассу ИСФ-П (3,5 кД) с молекулярной кассой (2,5 кД) очищенного тимозлна, полученного '3.Г.Мороаовш и В.л.Хавинсон (1^81), можно отметить, что первая отличается на i,8 кД,

Дальнейшее изучение ИОВ показало, что по набору Ж-по-лос препарат из тимуса серого кита не отличается от ИСВ тихоокеанского моржа, но интенсивность их, особенно в области водородных связей неодинакова. KGB аз эмбриона кита по набору полос поглощения богаче спектра ИСВ теленка (21 против 15). 3 его спектре появились сигкачы в области 2590, 2430, 1460, HID, 1050, IOQO см"1, но зато отсутствуют полосы при 2900, 1370, I24û см"1. На основании анализа Ж-споктров можно заключить, что в иммуностимулирующих веществах разной природы имеют место пептидные я водородные связи, но интенсивность последних в разных, гормонах неодинакова. Это наводит на мысль, что комбинированное влияние сложной совокупности ■ факторов морской среды монет изменять равновесие реакций, • связанных с образованием или разрывом водородных связей.

Принимая во внимание, что ккмунолсгически активными, как раньше считалось, могут быть не только пептиды, но и аиинокаслоты - самые древние в эволюционном плане вещества (Белокрклов Г.А. с соавт., ISS0), мы изучили аминокислотные пулы, установил!! аминокислотную индивидуальность каздого препарата ц выявили закономерности распределения основных их ' молекулярных видов в полученных препаратах. 7 КСВ серых китов и тихоокеанских моркей обнаружено одинаковое содержание гид- ■ рофобных, гядроксилсодержащих, алифатических, меньшее количество - гидрофильных, кислых, основных, нейтральных, заменимых, незамекдшх к ароматических аминокислот.' •

Сопоставление аминокислотного состава ИСф-Г и ИСФ-П ■ ссрых китов,заявило одинаковое количество кислых и основных

аминокислот, но ИОЗ-И в 0,0 раза больше содержал гидрофобных, в 0,64 раза - алифатических, в 0,6 раза ~ сйрусодор;капц:х, в 0,2 раза - ароматических, в 1,74 раза - заменимых. Однако, в нём оказалось в 2 раза меньше гидрофильных, в 3,6 раза - х'ид— роксилсодерхащих, в 6,5 раза основных и в 1,7 раза - незагле-. нямых аминокислот.

В ЫС<>-1 основными кислотами явились: асиарашювая, глутачиновая, лейцин, лизин, но очень низок уровень.серусо-дершздих, нейтральных амииокподи'!. 3 IIGü-11 основные - глутаминовая, леццин, аланлн, валин (табл. 2).

функциональное значение названных аминокислот несомненно, так как некоторые исследователя приписывают дал, в частности аланину и глуталшновоЛ кислоте, обязательное участие в обеспечении юлуномодулкрующек активности синтетического пептида ß - тимозина (Осипов С.Г. с соавт., 1987) и вагауы .роль в восстановлении метаболгеского гомеостаза морских млекопитающих (лачачкаП., Сокоро Л,:".., I9B8).

Сравнивая ИСФ-П и KO&-I с тимозлном ч>-5 Гольдштепна, можно отметить, что у последнего в отличие от первых двух препаратов высоко содер:;сашй аспарагинозой я глутажнозод кислот, нет гистидина, аргинина, пролина, глицина, цистеина, м етиошша, фенилалалипа.

для оценки KGB из тимуса морских животных несомненно в&'ке-н их мякроэдементнип состав, такг.е необходимый .для коррекции иммунного статуса человека (Асмолов A.B., любенко A.A., 1988).

При изучении микроэлог..ентов в наших препаратах получены различия в содержании меди, марганца, мышьяка, брома. •Шаьяк и бром, отнесешша к жизненно вжмвм для человека элементам блока р-элеглентов пориодической системы ДЛ1.¡Менделеева, обнаружены в препаратах ткыуса морских клокошггащих и нз выявлены в их аналогах из тимуса теленка. Причем, в гормонах тимуса серого кита установлено более высокое содерз жание мышьяка.

Бром содержится в морских препаратах и отсутствует в гормонах наземного сырья. Появление новых аминокислот,.различия в микроэлементном составе влекут, очзвпдло, за собой преобразование иммунологических свойств.

Таблица 2

Сравнение молекулярных видов аминокислот активных факторов из тимуса морских и наземных лашотных

Классы препараты аминокислот

Препараты тимуса ИСф-П

серый кит

% от суммы Тимознн Гольдштейна у - 5 теленок

Аминокислоты с различной структурой группы

Алифатические 31,86 49,69 9,69

Гидроксилсодержащие . 22,79 6,39 5,56

Серусодержащие 1,68 1,48 0,38

Ароматические 5,53 29,07 0,23

Иминокислоты - - 0,5

Аминокислоты, разликаюаиеся полярностью

групп

Полярные 66,65 31,74 24,59

Иеполярные 39,07 40,38 5,05

Аминокислоты, имеющие различные ионные свойства группы Кислые 34,95 31,04

Основные . 10,83 1,65

Нейтральные . 54,12 57,65

Аминокислоты, ымещие различную питательную ценность для человека Заменимые , 64,10 . 36,35

Незамеышие для взрослых 38,65 53,48

Незаменимые для детей • 1,31 0,10.

0,29 10,93 10,19

16,38 12,92 0,29

1,2. рплково-пептицные ке;-;лонсодеркад;ие вещества морских 'глдробионтов иммуно.цепресспвного и ццтотатического действия.-

Знакомясь с биологией морских млекопитающих, мы 'обратили внимание на устойчивость их к опухслш, в числе прочих ярктак бтл мо«ет быть обусловлено действием веществ с цито-• статическим эффектом. Среди них, на наш 'взгляд,'наиболее

интересны кейлоны - ингибиторы клеточной пролиферации. £!лоооб_^цйелеиия. и биотостпроаашад ко .тонов дня 'скришшгсшого поиска ке^лоисодвЯагыкх препаратов нами был разработан метод выделения и индикации препаратов квллонного действия (положительное решение Hiíllifií3 от 10.09. 91 г. по заявке на изобретение 44524000/14.1077/211, приоритет 20.05.88). Известно несколько способов оценки биологической активности зоЗлоиоз: гяотосфтогря.^пчйское - по определению количества дНХ-синтезирундих клеток, радиометрическое -по уменьшению включения Зц-тимидшиа в кяайотораотаорамуэ фракцию ДНК, цитометряческое - по сшсхени» мистического индекса, метод локального гемолиза по Erne K.Y,,Nordin A{Ii¡63). Есе они трудоемки, требуют дефицитных условии. аппаратуры, реактивов,, дают довольно поздний результат (Окулоь 13.3., Колобов A.A., 1961).

D основу разработанного нами способа обнаружения калло-нов била положена способность нормальных (неогухолевых) клеток различных органов мыши (печень, селезенка, тимус, легкое) обесцвечивать краситель - ыетяленовуз синь - ноя, цепотвиеп кейлонсодер;лащих экстрактов из органов морских млекопитающих.

KCI1 выделяя» параллельно из органов морских и иазеьшк ;¡uibothux по известному способу Bullough V/. с соавт. (1964) з модификации В.Б.Окулова, Л.;1.'{екулаевоп ЦУ76) спиртовым осая-дением с последующим разделением кеЛлоаоодерхащах препаратов предложенной нами тонкослойной гель-хро^.атограшнп на сизциаль-но полученном для этой цели сшшкагеле.

Постановку основного опита проводили путём соединения клеточной взвеси, KCli и агара с мати.леуов'л; тдокюором. Учёт проводили по степени обесцвечивания столбика среди (в разво-дении 1:50 ООО)-. Способ позволил наити среди многих источников ке11лонсодер;:са14ях препаратов наиболее эффектлышл источник, им оказалась селезенка тшеня-ларга.

2.2. Определение биологической, активности кенлелег,.держащих препаратов..

Одним из наиболее показатолышх параметров функциональной активности кейлонов и кейлонсодер::;авдц1 препаратов является их влияние на синтез рост клеток я их деление. В этой связи для доказательства кейлонной природы экстрактов, ■полученных из селезенка морского животного - гшеня-^аргл -■

бьио исследовано вдояпко ЖЛ.иа wi'A-ctwjyjiupobumiue сплоао-циты мыши и был определен ¿актор, угнитсшщл^ их ыиграциэ (Фролова A.Ö., 1УЬЗ; George V. с соавт., 1332 в ыоди^икацди д.И. Новикова Ц9с)1). ¡¿аксшадыгоо .шгабируацее дойстшю отмечено ври культивировании сшшноцитов с т.алйьш.' в концентрации 10,0 ькг. Средняя арн-Хшточаская размера анер при атом составила 6,4 ± 0,21 мкм. Та :;te доза бычьего препарата доводила его до ± U,4u ыш. Ото наименьшие размеры, которые отменена цра цптоштрди. Upn постепенном сниившш цо-' зы испытуемых веществ размеры здер увеличиваются, но всё ае не достигают контрольного уровня. Причем, при действии тюленьего KGTI макекмалышл диыыеир ддер клеток составлл 9,3 ± 0,62 мкм / доза в 0,005 мкг/, тогда как лрл долетали этой же дозы оычьего Ш1 он р.,вен LI.ö ± 0,70 ккм.

Таким образом, отмечается полное совпадение числа трансформированных клеток с рцааораш ддзр в них.

Результаты проведением сорил экспериментов доказал*, что тшони£ к 0ичи.1 KCJ в до:»ах от 10.0 мкг до ü,i мкг снижают спонтанную выраоотку фактора угнетения миграции («УМ), а в меньших дозах - 0,01 мкг и 0,005 мкг - незначительно увеличивают выработку Однако, выявление различия не имели статистической значимости.

При изменении условий эксперимента и -использовании для испытаний клеток от иммунизированного вакциной Б^ животного и специфического адлергана (губеркуляна), обнаружено четкое шошде ке2лонсоцер.къц;:х препаратов на внраоотку <Л1д. Оно выражалось в полной отмене выработки фактора при использовании кейлонсодор:.;а1цих препаратов в больших дозах /10,и мкг, с>,<} к.»1 н 1,0 мкг/ и сличении ого выработки - при при-, манонил К011 в «оиьших концентрациях /0,0 мкг и 0,0й'ыьт/.

Таков жо действие обнаружено и в отношении клоток, ыашмроашыш'. ф;пюгтеаггд»тпнЛном.

Оле.цуат• цри атом подчеркнуть, что выявленные изменений в BupaöoiiSü фактора миграции и достигнутого супрессирую-Üiero а4\аокта были более выуач;екы у вновь полученного тмлинь-сго KÜU.

В;;чДгВаслЮсть иммунизированных животных при экспериментальном садьмонеллезе зависит, кик г.звестьо, от многих обстоятельств, соадаыщих^напряженный иммунитет к соответству-

¿s¿

•мцок инфекции. Сродл фахторов, опроде-ляядия имлулиуд» реакции организма, следует назвать как сгоци-.„'л"чзскке клоточпо-гуморалънне механкз»ш, так и ц<шы комплекс естественных факторов неспецнфичоекой резпстэьтпостл сргшшзма к hhújk-ции.

При изменении сроков введения К(,'Л, в частности, при их инъецировании за 5 суток до заражения, тюлений KCI1 у:.;е на 5 сутки после заражения обеспечивал элпмлнацла возбудителя на 51,?;». -Нд 10-е сутки это количество снизилось до 22,4%, а к Í5 суткам бактериальная обсемененнссть составляла у«е 11,2% от первоначального уровня, доходя к 21 суткам наблюдения цо 2,4%.

Бактериальная.обесмененность органов бркшо.: полости у подопытных ьышей, вакцинированных сальмоаодасзно! тзрмо-вакцинол, а затем заргазнных возбудителем сальмоноллеза машинного тифа, под действием кчйлонсодерк&дих препаратов различного происхождения значительно изгоняется: за 5 суток до заражения - способствует элиминации возбудителя, у;.<е начиная с 5-х суток ка 48,7 - 49,3,¿, и к последним суткам наблюдения доводит этот показатель до 91,5 - 97,6,1.

Срав1гитз^ьная^з;ако^-хцмичзская характеристика _КСП из морских„млекоп'лтоюцих.

Используя стандарты белковой природы с известными молярными массами и разработанный нами тонкослойный вариант гель-хроматографии, мы определил! ориентировочные молярные массы полученных нами кейлонов - 2,5 кД, 11,0 кД, ЗА кД. Вместе с тем, Щ-спектроскопией KCI1 из различных органов морских животных установили степень убывания набора полос поглощения. Их спектры располагались в порядке: тимус - селезенка - легкое. В них обнаружены колебания групп iS-H, -СН, С=0, C-G и ряд ке идентифицированных полос. Ka-дал спектр проявлял собой индивидуальность. В спектре селезенки имелись 3 характерные только него полосы: 1545, 1330, 1230 см-х; для ' легкого - так;ке 3, но другие полосы - 2725, 905, 780 см~х; .для тимуса - 4 полосы, но инке - 1700, 1730, 1400, 1155 cwT^i По Bceii видимости, области колебаний - 1230, 780 с:.Гх мо.кно отнести к антис1ымет]л!ч.чым валентным колебаниям группы РС^. 'Выявлено, что КСЦ имеют пептидныевязи, ка что указывают области 2926 + 10 и 2870 х см-1 (группа К~Н): 1Ц5-1Г4С

eu""* (группа -Hi) ; III5-II4J c;,i(групда C-0) i .3400-3226 (водородное связи) к сигналы коле0а:шй связей .vil и С~0, а теаг» ±300-1200 С1,ГХ (группа- СООН).

Неодинаковы.; оказался и аминокислотный состав КСП. Для КСП легкого и печени серого кита характерно 2-кратное превы-.шение содержания гидрофильных аккиокиелот над основными, а главная удельная масса приходится на нейтральные аминокислоты. l'ix б 7,2 раза больше, 'че'м"основных. Это характерно как .для легкого, так и для селезенки к печени ткшзня. Меньше . всего в КСП. кислых аминокислот.

Основными аалкоккслоташ явшксь аспарогиковая, глута-киновая, глицин, аланкн. Аминокислоты морских КСП отличаются присутствием серусо,дор;.;а^дих аминокислот л отсутствием прожни.

Помллоксы БАБ морских кквоткь:.; ц^м.ууоратоло'гачэского. (аллергЕзлрук/дего) действия.

Похго'.'овленко аллергена из крабов (Патент л I34I773 от 04.03.32).

Разработанный нами способ 'получзаля аллергена из крабов основан на термической обработке мяса крабов, его гомогенизации, дл$ференцяальиом центрифугирования и обработке полученного осадка ультразвуком.

оценки выхода препарата было проведено параллельно., сравнительное изучение двух вариантов выделенних из 1,5 кг * крабов крабовых аллергенов: один - по методу о.Cartierс соавт. (IS84), а другой - предлагаемым нами, при этом по известному способу получено 0,4 г крабового аллергена, по разработанному нами - 16,0 г, 1о есгь з-40 раз больше.

Для биологического1тестирования йр&оовах аллергенов с кровью больных крабовод аллергией была пссяаалена'реак-ция повреждении нецтрооилов 'по Р.Е.Пьяновой и й.М.Фраикд (I&77). С этой цельэ к 0,1 мл взвеси нейтрофшш обследуемых добавляли 0,1 мл-раствора крабового аллергена, содержащего 100 , 200, .400 , 800 мкг сухого препарата. В итоге подучено равноценное действие ¿00 мкг крабового аллергена, полученного предложенным нами способам, и 400 мкг крабового аллергена, полученного ранее известный способом. Следовательно, разработанной нами способ повышает содержанке ал-лергено-а^знак компонентов'в диагностическом препарате в 4 раза.

Выход алдергзно-активник И-соцоржцих летучих оснований в зависимости от температуры моаст колебаться от 0,50 ± 0,03/ до 1,10 ± 0,07/£.

Биологическая актив!юсть крабового .аллергена в имму-ио-аллоргических тестах

С помощью разработаннгого нами крабового аллергена у работников крабового производства в период работы с крабовым мптпплалоы нами с Н.С.Дубны? (1990) были обнаружены с помощью РНК спощьЬичэские антитела., в высоком титра, порядка 11,5 + 1,6 гем.ед./см3. По прекраценли контакта с крабош у обследованных их уровень спивался до 6,6 £ 1,2 гем.ед./оц3. Следует отметить, что антитела к крабовому аллергену носят исключительно агрессивный' характер, что доказано в опытах непрямой дегрануляции тучных клеток крыс (11дТК у больных и здоровых равен 0,35 + 0,03 од. л 0,12 + 0,01 од.) ив реакции ковраздаемосхи нейтро.,)ллов (Рйл) кроаи работающих с крабами - 80,5 + 5,3 ед. и За,6 + 2,3 од. соответственно, химическая характеристика аллергоко-актииипх комплексов БАВ.дз крабов.

В ИХ-споктрах крабового аллергена была обнаружена сильная полоса поглощения при 3380 С1.ГХ, по всей видимости, свя-. занная с наложение.-.? полос валентных колебании групп 01i.li/-if, СИ Сахаров, азотистых оснований, воды. В области 1080-1450 сг.Г^ обнаружены колебания, проявлящи^ся в виде полос средней и сильной интенсивности. Они били отнесены к группам 0=0, О-.'.'', с-;, (1225, 1075, 740 см"1). По Ж- и /АР-спекТрам чётко просматривается углеводные компоненты. Зажо отметить, что в аллергене определен низкий уровень белка. Электрофорез в ПААГ выявил в крабовом аллергене 2 фрагмента»

Одномерная тонкослойная гс-ль-хроютография на широко пористом силикагело обнаружила гетерогенность аллергена. Специфические красители нкпгкдрин, антрон, орцин, глюко-тест - позволили выявить аминокислоты во всех трёх фрагментах-к сахар.- в двух. Причём, количественное распределение ■ отдельных молекулярных видов аминокислот сохранно" те йе закономерности, что и отмеченные для КСВ, ИСФ-Г, П. Присутствуют серосодержащие аминокислоты, основными аминокислотами были: глицин, серин,глутаминовая кислота.

Варной составной часты» препарата явилась 4 михроэле-.

••о

^ 4/

мента: D.i:Äiiii;i.i, кхлдяа, :;:слрзо, кагш*», uo оолиие вс^го было первого из ¡ьи - 2x10""**. Это ииоолоднмо учитывать, ■гак как сам алюминии вызыиаот ряд нитилогичс оках реакции в ;лтом организме (Авцин Л.П. с соавт., 1291).

Гдриводеюше данные говорят о ток, что омерген представляет собой не индивидуальной вещество, а является комплексом БАВ самой различной природы: углеводов, аминокислот, пептидов, микроэлементов, рибонуклеиновой и дозокси-октоновоп кислот.

Таким образом, при изучении оелкозо-поптицпых комплексов морских млекопитающих разработаны иозые оиотохно-логическне способы получения БАВ, их тестирования, физико-химические и функционально-биологические паспорта, выявлены новые перспективные источники.

' Раздел П. ШРОСТАГЛЛВДШ U üv ЕРЕКШСТШШЖ 3 ЪШК М0РС1Ш 1ОДР0Б140НТ0В 2.1. Нцостаглапдаш морских гицробконтов Практический и научный интерес .для биологии, медицины и народного хозяйства представляют биологически активные вещества лишздов - простаглаццины (Iii') и их предшественники.

Известно, что эволюционное приспособление, сезонная акклиматизация, особенно адаптация к экстремальным условиям среды осуществляются у морских организмов с помощью основного механизма для всех них - изменения состава мембранных липидов, являющихся основной мишенью .для адаптации организма (но Е.М.Крепсу (1981). А регуляции обмена веществ в клетках выполняют на уровне биологических мембран ассоциированные с ними врос1агландины.

В литературе отсутствуют сведения о ПГ морских млекопитающих, но имеются данные по' некоторым рыбам и беспозвоночным {Коротченко О.Д. с соивт., 1984, Исай С.В. .с соавт., I9äd). -Содержание ГШ в разных тканях рыб колеблется от десятков до сотен нг на I г сырой ткани, в беспозвоночных - от I до 45 нг.

Внделоиио я идентификация ПГ традиционными а ^одифи-цировонп илщ методами.

льа;лз концентрационных функций различных органов морских гидробионтов в синтеза а накоплении ПГ позволили

определять наиболее перспективное сырье (табл. 2) и выделить индивидуальные Г1Г (табл. 3).

Так в печени мориа их содержатся 8 мкг/г против 1045 нг/г* - у рыб и 9-100 нг/г - у беспозвоночных. При этом ассортимент КГ в неЛ разнообразен (табл. 2).

По уменьшению содержания активных форм ПК^ в органах морских млекопитающих их мо::шо расположить в следующей последовательности: печень морка, почка кита, легкие "кита, семенники кита, Соде^-Аййке ПК?^ £ другие органах - значительно в печени, почках'(1,5 нг/г), в легких (1,7 нг/г), в яичниках -(0,3 нг/г), в семенниках (0,85 нг/г);

На основании приведенных данных нами разработан "Способ выделения и стабилизации простагландинов классов Е, Ф из органоз морских млекопитающих и другого сырья". Он базируется на проявлении к экстрагенту стабилизатора, увеличивающего в отои связи ■ устойчивость ПГ.

Таблица 2

11ГБ в органах морских млекопитающих

Название орагнизма, органа 11ГБ, мКГ/г массы сырой ткани

'1радициоя-1ши метод ■ Нетрадиционный метод

Ыорх: Семенники - -

Почки - -

Печень 45В, 0 462,0

Серый'кит:

Почки 191,0 188,0

Печень 50,2 54,7

Эмбрионы серогокита:

Почки -

.Печень + +

Принимая во внимание, что печэнь ;<юр;гса может явиться серьезным претендентом на источник получения ПГ натурального рада, мы выделили индивидуальные их виды и определили их структурные характеристики (табл. 3).

Биологические свойства ПГ и их комплексов с липидами наблюдали при действии препаратов па сокращение гладких мышц изолированной матки крыоы. Определено, что ПГ реализуют свой

эййект в течении 1-2 минут после введения в ячейку, 'срдер-ьздую изолированный орган в растворе Тяроде.. Обнаружена так- -. ::;е способность 1ЕГ вступать в радиоиммунологичзские реакции. Оба эти свойства дополнительно к химическому /лализу доказывают природу данных биорегуляторов.

Таблица 3

дизико-химичеекая характеристика Iii' печени моржа

Полосы поглощения групп атомов в СМ-''" ЯК-спектрах, Температура плавления, С даннне yi- • впектро-метрии. 1

ПГ G-0II 0=0 С=С С=С с=с

карсокси- цикл- цис-цикло- пектен транс-

1Ш

1Г№^3400 1702+5,0 -

ЕГЕ2 3359 1700+0,5 -1730+3,5

lu'A 3365 1708+0,8 1615 1356+10 960,0+5,0 масло -1£Г£ 3375 1703+0,3 ¡636 1350+10 950,0+5,0 масло -

1354+10 971,0^7,0 127 128 310,460 1345+10 972,0+7,0 66 65,0 250,330

217

273 щелочь

При анализе липидов, ПГ, лК мы иодафщаровали методику их обнаружения путём совмещения .двух операций: проявления и детектирования, которое достигалось растворением детектирующего соединения - иода в проявляющей системе полярных раствр^телеа. к'.етод апробирован на морском и наземном сырье. Его преимуществом перед существующими аналога',:;! являются улучшение контрастности детектирования, сокращение сроков анализа и оборудования, что делает его незаменимым в экспедиционных условиях.

Оценка концентрирования предшественников ПГ морскими организма-«;:;.

Учитывая, что ненасыщенные мирные кислоты (Ш) являются предпественккамп ПГ, мы цровелн.раскиреннсе их изуче-ы; I различных органах и.тканях морских млексгштаадих, беспозвоночных, рыбах, микроорганизмах, ранее не являвшихся предметом подобного исследования..

Индикация жирных кислот ГНХ н сочетании с КК- и П.'Р-спектроскопией позволили определить уровень полиеновнх жирных кислот, предшественников ПГ в отходах пропиленного ыорзверя, рыбы, беспозвоночных и установить их основные отличия от ¡КК наземных животных. Липидам морских организмов свойственны большое разнообразие Ш по молекулярной массе, структуре и степени кенасыацэнности, у ник обнаружено значительное количество высокомолекулярных полиеновых кислот с 4 и 5 двойными евл-5Я«з? (!5,8?) с 5- (35,35?)« с Л- (23,ОЙ).

В легких содержится значительное количество ненасыщенных КК (у серых китов - 78,7%, у тюленя - 68,1%, у белухи - 65,555, у моржей - 57,4%).

Семенники различных видов морских млекопитающих отличаются по количеству ненасыщенных (75,355 - у моржей, 49,2$ - у серых китов), моносновых (00,3% - у моржей, 31,4% - у белух) и полиеновых (23,4% - у белух, 14,6$ - у моржей) жирных кислот.

В печени вне связи с видом животных содержится большое количество ненасетенных ЖК (ИН-109,1 и 139,4). Содержание полиеновых Ж колеблется в больших интервалах: от 26,0% у тюленя до 13,3$ - у белуги.

По индексу ненасншенности ЖК органы морских млекопитающих можно расположить в следующей последовательности: логкио, сыворотка крови, семенники, почки.

ЭйкозопеАтаеновая кислота (ЭПК) давно привлекает внимание исследователей как предшественник ПГ 3-й серии, а также как вевдэство, ингибирующзе образование простаноидов из арахи-доновой кислоты.

Из органов морских млекопитающих как оказалось, лучшими источниками ЭПК являются легкие и кишечник, где ее уровень колеблется соответственно от 6,5% дс 13,1$ и от 6,0% до 13,0$.

Суммарное содержание предшественников ПГ распределилось в таких соотношениях: в легких тюленей и серых китов (24,0 и 25,2$), в печени моржей, тюленей, серых китов (20,1$, 18,0$ и 18,9$ соответственно), в семенниках моржа (10,9$ и несколько больше у белухи (14,9$).

Морские беспозвоночные и рыбы, их отходы (внутренние ор-ганы)при промысле и обработке больше обеспечены ЭПК, чем ара-

хидоновой. 3 печени тихоокеанской сельди, в частности, содержание ШК монет достигать 13,9 в печени и кишечнике трески 15,5 %. lio степени уменьшения уровня ненасыщенных ¡¿К исследованные органы нокно представить в следу.-оцей последовательности:' кишечник сельди, печень сельди, печень трески, кишечник трески, кишечник сардины, печень сардины. По индексу ;кэ кенасыценности Ж они могут быть расположены несколько иначе: кишечник сельди, печень сельди, печень трески, кишечник трески, печень сардины, кишечник сардины.

Принимая во внимание, что органы морских млекопитающих отличаются высоким содержанием ПГ, мы изучили уровень арахидоно-вой кислоты (АК) - основного их предшественника. Результаты эксперимента показали, что ее уровень может достигать 15 % (см. рис. I). У внутренностей рыб на первое место по содержанию основных предшественников НГ, таким образом, претендует кишечник и печень трески; на второе - кишечник сардины и печень сельди; на третье - кишечник сарцшш и на четвертое -печень сардины иваси.

Сравнивая кирнокислотный состав морских жирных кислот и пищевой хсир наземных., животных можно отметить, что в состав лн-гшдов наземных млекопитающих не входят или содержатся в следовых количествах арахидоновая и линоленова^ кислоты (исключение легкие свиней). Учитывая необходимость расширения промышленной сырьевой базы биопредшественников ЦТ и самих 11Г за счет морских организмов, нами разработан способ выделения последних из отходов морского промысла (патент ВШН ГПЭ от 02.02,92 № 4887036). Он основан на том, что в качество сырья ,для получения полиеновых iLK используются внутренние органы морских млекопитающих, экстракцию липлдов проводили хлороформ-

этанольной смесью, этерификацию солянокислым метанолом, а 'выделение полиеновых üi осуществляли посредством адсорбции на анионите " 1ПА-400" с последующим многократной низкотемпературной перекристаллизацией £К, элшрованием гексаном и упариванием в вакууме.

Б результата исследования получены образцы, содержацие до 80 £ полиеновых

Это позволило выделить АК из органов морйких млекопитающих. и цдеитифодгровазеь ее маюдшаи ТЖ, Ж-спэктроскопии и

i-i

н-

. * 1 * 5 1 ï 3 -,

I

тггтп

i

В

О M

2 В

двойного ядерного магнитного резонанса. Двумя последними методами осуществлена индикация двойных сьяае:! в Предложен прием двойного резонанса, который позволил уточнить константы спин-сплнового взаимодействия сигналов метинких групп при 5,37'м.д. ' Как видно из рисунка ШР- спе'Ктр получен-

ного шли препарата поляеновых SK, содор.-ащого 89 % арахидо-новой кислоты, представлен 9 реэодапсииг.'Ш линиями; одного двойного триплета 1:3 при 5,37 м.д., четпрех триплетов( одного ассиметричиого .дуплета и двух синглетов.

Наличие вдойной связи обнаруживается появлением двойного триплета при 5,37 - 4,40 м.д. Линия резонанса протонов (-СН= ) груши расщепляются косвенной связью с протонаг/и соседних C-CKg-) групп на два триплета eg =5,2 гц ив -3,4 гц соответственно. .для GH2 групп стабилизированных дво^шшц -СН= связями sCH-C&j - и стабилизированных =СК-С?12~CCTrlgJ 'ш; -GH=CII-CHg. Триплет при 2,1 м.д. с расщеплением g =5,2 гц легко относится к резонансу протонов CHg группы, расположенной ¡.ш:;-;цу двумя двойной связями. При насыщении двойного триплета при 2,80 м.д., в слунае двойного резонанса он переходит в синглет. При этом исчезает и несимметричный дуплет при 2,6 м.д., который соответствует протона-.! С^-групгш. При этом константа спен-спинобого взаиыодейтсвия протонов группы =СН- в области сигнала 5,37 - 5,40 ы.д. уточняется в 6 раз.

Антимикробная, адьчвантная. птзотквозетэуоная и противоопухолевая активность липиакых препаратов. содержащих прстаглантт.пны (.О.ШГ)

Лииидные препараты из органов морских организмов получали экстракцией системы растворителей хлороформ-этанол 1:1 по объему. Такое сочетание позволило эстрагировать все липвды и прежде всего ¿оейолипнды и ПГ, к с. помощь» этанола и рН=4,5 стабилизировать сохранность ПГ и поисковый Ж. Дополнительно на основании установленного нами явленна .естетсвенной стабилизации липидов и ПГ у морских млекопитающих был разра-. ботан способ получения липидных препаратов. Состав липидных препаратов из печени морских млекопитащих представлен следующим набором: ПГ 0,02-0,010 , ШПГ 5^(0,08-0,04 %),

i'3 03 ПГ Ф 2лЮ,1<;-0,06 7«), HP (0,003-0,009 %), ГЗ 0л ni' Ю, 11-0,12 %), каротиноидн 1.0,30-0,32), ФЛ 140,0-42,0 Ví), HJl (48,0-50,0 %) и др. до 100 7". Рабочее название комплекса ОЛПГ ^оощие липиды - простагландпны). Растворителями для основных н вспомогательных форм лечебных препаратов являлся ди-метилсульаоксид (.ДМСО),

.Весьма в&уное значение имеет функциональная оценка биологической активности полученных нами препаратов. С этой целью прослеаена противоопухолевая активность различных препаратов из органов морских организмов в условиях культуры опухолевой ткани и в эксперименте на животных с перевиваемыми культурами.

Установлены виды морских млекопитающих (корта, серые киты, белухи, тюлени) и их органы (.селезенка, почки, легкие, эритроциты, подделудочная и щитовидная железа), наиболее перспективные как источники противоопухолевых средств.

Вагшо в определении повышенной выживаемости гидробиоктов в своеобразных условиях морской среды с ее богатейшей фауной и биотой играют антимикробные вещества, обеспечивающие антиби-озис и играющие исключительную роль в борьбе за существование в сложных экологических сообществах, поэтому не случайно наше 'внимание било обращено на изучение подобных БАЗ из числа лыпи-дов.

Среди многочисленных 'проявлений биологической активности липидов морской природы важная роль мо::;ет принадлежать их антимикробным свойствам. Однако последние у липидов различных органов морских гидробионтов, кроме спермацета, в настоящее время почти не известны.

Нами проверено самостоятельное антимикробное деустзие липидов морских организмов в отнопенли грибов, бактерий, вирусов. Исследован их вспомогательный эффект в сочетании с известными препаратами антибиотиков.

Исследовали противобактериальнуа активность липидных препаратов в присутствии индикаторных культур семейства " Enterobac -

teriaoeae I S.flexneri, S.sonnei, s.typhimurium, E.coli "Row") , стафилококков,( S.aureus JS I, 3.aureus Í« 209, S.aureus"Липин", S, aureus js 75), в отдельных экспериментах - спорообразукщих бацилл( b.anthacoides,в.subtilis ). Ö качестве тестов грибов были использованы с.albicans , противовирусные свойства оцз-

зо

давали на модели сальмонелл ( s.typhimurium ) и саяшонел-леэного бактериофага.

Проведенный анализ показал, что липидные препараты морских гидрооионтов обладали самостоятельным антибактериальным, фунгицидным, вирусоотатическш действием. Наиболее чувствительными к ним из числа кишечной группы бактерий s.sonnei Ьа, E.ooli " Rov/ ", из числа граыпололштельных бактерий s. aureus 2u9, S,aureus "Дипин", Б,aureus 75.

Помимо самостоятельной антимикробной.активности липидные препараты из органов и тканей почти всех изученных морских гвдробионтов обладали хорошим стимулирующим эффект мл в отношении бактерицидной активности традиционных антибиотиков, ини усиливали действие стрептомицина, олеандомицина, мономицина, полиыиксина, неомицина в отношении золотистого стафилококка й 2U9 .F. лучшими из них быт липиды селезенки, крови, кишечника, печени, независимо от вида ишвотных и органа, ОЩЦ' усиливали также действие тетерацшшша, пенициллина, левомицетина, стрептомицина, в частности против бактерий кишечной группы, однако наиболее активными оказались липиды печени, селезенки, крови, тимуса, кишечника и поджелудочной железы,.

В объяснении сути, антибактериального действия ОЛ11Г нами была высказана еле,дующая гипотеза. Совокупность компонентов и;шГ, очевидно, вызывает повреждение мембран бактерий о разрывом пленок смешанного,состава, SK и ПГ. Он осуществляется, с одной стороны, за счёт нейтрализации зарядов компонентов мембраны комплексом ОЛПГ, с другой, повышенную транспортирующую способность такого комплекса моано связать с его влиянием на проницаемость липидных слоёв биомембран фазовым переходом, возникающим под влиянием морских полиеновых Ж. ото сокращает их нерациональные потери и за счёт этого изменяет их расход.

Связь шкроэлеыентного состава ЕАВ о их биологическими свойствами привлекает внимание многих исследователей { Borgeeon Ch.E, et al , 1989J. Известно, что медь, необходимая для образования ненасыщенных J£K, снижает синтез каталазы и. глутатиондерокоидазы. Утверздается, что в качестве эндогенного лиганда для цинка ыокет слухшть простахландин Eg. В результате проведенных исследований нами обнаружены металлы в . липидных препаратах ОЛПГ морских млекопитающих, подчиняющиеся следующей последовательности: алюминий (3,5 - 6,0

II)"3;, кальций (2,5 10~2/* - 4,4 10~Ч), магний (2,3 -

6,3 10~3%), медь (1,0 10~2'Л), железо (¡¿,0 - 7 10~3%).

Тагам образом, из морского сырья ¡г,ото получить ряд препаратов как самостоятельного так и вспомогательного действия.

Особенности состава и свойств ПГ и их предшествешшков у'морских организмов в значительной мере мо;::ет объяснить селективную резистентность этих объектов в различных условиях действия факторов морской среды, предъявлящей им повышенные функциональные требования.

Раздел 111. ЖШЛЕКСы БАВ МОРСКИХ ОРГАШЗДОВ

3.1. Липидосоцоргазде. белково-акиноккслотные комплексы биологические активных, веществ в ыорокнх организмах

Помимо БАВ высокоорганизованных морских млекопитающих нами изучены биологически активные вещества, полученные из .других мороких яивотных, в частности, асцвдии пурпурной. Они Исследованы по нескольким параметрам: противоопухолевая активность вытяжек из тканей этих кивотных и их липидных компонентов оказалась достаточно высокой. У мышей с асцигной опухолью Урлиха общая продолжительность жизни увеличилась под их влиянием на 29-30/», а с саркомой - па 37-40%. Это оказа-лооь связанным с цитостатическим эффектом вытяиек.

Спиртовые вытяжки из туники асццдии пурпурной показала широкий спектр противобактериальной активности относительно грамполоаительных и грачотрицательных бактерий.

Комплекс БАВ спиртовой вытяжки из асцидиа пурпурной самыми разнообразными вещества:«; балками, КХ, липидаш, про-стагландинамя, каротиноидами, аминокислотам, микроэлементами, витамином С. Это может иметь вареное практическое значение, хотя до сих пор данное перспективное сырье - асцидия пурпурная - нигде в ншей стреле не используется и откосится к непищевому сырью.

3.2. Биологически активные вещества мороких микроорганизмов. их физико-химическая и биологическая характеристика.

Слабо исследованным остается и огромный млр морских микроорганизмов, обладающих интенсивным обменом веществ, выраженными антагонистическими свойствами яо отношению к наземным штаммам, вызывающи заболевания у человека, и , что особенно важно, являющихся ценным галдевш сырьем для

которых морских ЖИВОТНЫХ.

Биологический скрининг морских микроорганизмов t изолированных из организмов трепангов и придонного ила, на антимикробную активность наземных штаммов.

.Рядом исследователей показано, что морские бактерии обладают выраженными антагонистическими свойствами (Шульгина Д.В., 1984; Шульгин Ю.П,, 1965). Это даёт основание предположить, что морские микроорганизмы - мощный источник антибиотических веществ разного действия.

В качеотве индикаторных систем наземного происхождения "использовали: K.lyeodeioticus, S.aureus 209Р, В.anthacoides, В eubtilis, S. typhimurium, S.flexnei-i, E.coli "Crim", E.coli 0-8| Изучение межмикробного антагонизма с применением морских микроорганизмов показало, что активность различных морфологических групп бактерий неодинакова. Наиболее активной оказалась группа граыполоаительных палочек (90,U + 4,0%)л Несколько меньше - грашегативных бактерий ^38,0 ± 8,U/ь), ещё ниже грампологсителышх бактерий - стафилококков (16,7 ± 11,2/6), микрококков (13,3 ± 9.I/5J-.

Изучение противогрибкового действия морских бактерий, выполненное методой штрихового посева с перпендикулярным подсевом тест-кудьтуры Candida albicans так же обнаружило значительное число Ш,0 ± активных культур. 78,4%

морских штаммов бактерий из пищевого комка кишечников трепангов и среды их обитания обладали противовирусным действием. 06,17» исследуемых культур способны угнетать активность саль-монеллезного бактериофага в 10 раз, 39,'/;* - в'ЮО раз и 2,5% в Iüüü раз, стлан ого лизирущее действие соответственно до

о _о _т

титра IüIü * и 10

ILTaKM Pseudomonas putida ii 34-ТПО - НОВЫЙ ИСТОЧНИК Б AB, Среди микробных культур, изолированных из кишечника трепангов, морокой воды и лридоивого детрита, были отобрана 3 микробных штамма - активные продуценты антибиотических веществ антибактериального, противогрибкового и противовирусного действия для дальнейшего изучения с целью возможного -практического применения.

Из микромеры дальневосточного трепангу совместно с Н.С.Мотавхиной и Д.В.Шульгиной нами бил выделен штамм-продуцент антибиотиков иротЕвоОакториального, противовирусного

и особенно антимикотпческого действия Peeudomonas putida лг ИЮ-34. Из этого штамма нами были выделены и идентифицированы БАЗ типа биологически а:швпых веществ. Это позволило задепонпровать штамм во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов как источник этих видаетн (А.О. Jè I3297Û5) подобной активностью обладали и другие штаммы Uà 39, 72, 48).

У mix изучен состав аминокислот, липидов, МО, 22С. Среди морских штаммов микроорганизмов обнаружены активные продуценты аминокислот - глицина (81,0 + 5,0$), лейцина (.56,4 + 6,5%), opiuiTHHa (61,3 + 6,ОЙ)- 2с1ь среди них и микробы, синтезирущие комплекс аминокислот: глицин + ле^щин + оршгош (39,0 + 6,0/0, глицин + лейцин (18,0 + 5,0$), глицин + орнитин (11,0 + 4,0$) и лейцин + орпнтип (6,0 ± 3,4$).

Методом атомной адсорбции у исследованных бактерий опре-делно содержание в биомассе микроэлементов: бора, марганца, железа, алюминия, меди, никеля, молибдена, кобальта, цинка. Наиболее показательной была концентрация микроэлементов в штамме Р. putida 1110-34. У него оказалось максимальное содержание железа и минимальное - цинка.

Содержание углеводов в исследуемых культурах колебалось в довольно широком .диапазоне - от 2,0 ï 0,4 до 5,0 + 0,5% сухой массы.

Липидн морских бактерий представлены в основном фосфо-лишщаии, в составе которых обнаружены &Э, £>Г, карДиолипин, лизокардиолипин и ряд минорных ФЛ. В липидах идентифицированы также молярные виды нейтральных липидов (Ciili, JU', IV). Общее содержание липидов в расчете на сухое вещество достигает 12,20 + 0,85$. Мы считаем, что комплекс БАЬ морского штамма содержит в своём составе также и стероидные гликозиды, Из ;кирных кислот основными явились пальмитиновая и миристино-вая.

Уровень ДНК и РНК в исследуемой бактериальной массе составил соответственно 0,50 + 0,01$ и 2,50 + 0,05$.

Заключая представленные матехжалы, необходило отметить, что богатство морской г]шоры и фауны гидробиоитами свидетельствует об исключительной биологическойрациональности формирования их биологических сообщодтв. Своеобразие же и исключительная ценность имеющихся у них БАБ, их более выргшзннал биологическая активность, широкий диапазон действия свидетельствуют о явкой причастности БАЗ к процессам адаптации и откри-

зч

Бают перспективы для их использования в морской фармации, медицине, народном хозяйстве. Как основа морской биотехнологии уже сейчас она предлагает отходи морского промцсда рекомендовать как потенциальный источник БАБ, не имеющий оеба равных, так как они многократно превышают массу большинства органов наземных животных и содержат БАЗ с более выраженными фармакологическими свойствами, и может передать их практике целнй комплекс аязне:шо важных препаратов: ИСВ, ИСЙ-1, ИСО-П, аллерген, ХСИ, ИТ, ОЯЦ1, ПНЖЯ, арахадоновую кислоту. Для всех препаратов разработан лабораторный регламент на их получение, предст лены биологические паспорта, технические условия на сырье, оформляются нормативно-техническая документация в Фармксмитет ЫЗРй.

Несомненной научной находкой является и отмеченные трофические связи трапшггов и их микрофлоры, объясняющие один из механизмов их фармакологической, противоопухолевой, биостпму-дирувдэй и дедикатесно-пщевой ценности. Присутствие БАЗ в микроорганизмах, населящих дальневосточный трепанг, косвенно свидетельствует о их трофических связях, что имеет важное, как научное, так и практическое значение, поскольку микробиальный источник ЕАВ - штамм Рвош1опопав рии<1а ^ ТПО-34

- имеет целый ряд преимуществ. К ним следует отнести его дешевизну, управляемость, отсутствие потерь в ценном экспортном сырье - трепанге, идущем на мировой рынок. ;

Нолучешше результаты безусловно имеют значение для науки, так как БАБ, выделенные из организмов морских гвдробионтов разных экологических ниш, в сравнении с их аналогами из наземных кивотиых позволяет объяснить биохимические основы селективной резистентности и дифференцированное участие БАБ в адаптивных процессах в условиях повышенной функциональной активности и нагрузок морской среда.

ВЫВОДЫ

I. В-результате многоплановых исследований экспериментально доказано, Что органы и ткани морских организмов содержат комплексы БАБ иммуносимулируздего, ишуномодулиругацеге, опу- • ходевооупрессоркого, антиботического и сенсибилизирующего действия. Это позволяет расширить сырьевую базу для биотехнологии, так как органы морских животных превосходят по массе аналогич-

ные органы наземных животных, по выходу БАВ или их активности.

2, Лучшими источниками иммуностицулируюших веществ являются тшлус морских млекопитающих; низкомолекулярных биорегуляторов - печень моржа и туника асцидии пурпурной;.вешеств противоопухолевого действия - селезенка тюленя; цитостатиков н антибиотиков - морские организмы различных экологических ниш: морские млекопитающие, беспозвоночные, рыбы, микроорганизмы; аллергенов - крабы и беспозвоночные.

•3. Получено имцуностицулирушее вешество (KGB) из тимуса морских и наземных млекопитающих (A.C. " 1-1-13237), представляющее комплекс пептидов и глика-пептидов с молекулярные массами 75,0 - 80,0 кД; 38-39 кД; II-I3 иД; 5-6 кД. Способ позволяет

■ увеличивать выход ИСВ из тимуса телят в 5 раз. ИСЗ из тицуса морских организмов по активности превосходит их наземные аналоги а разных иммунологических тестах в 17 раз.

4. Разработан способ лолучо)п:я ¡шлуноетимулируиших факторов I и Л из тимуса морских и наземных млекопитающих

(A.C. Ii I50S66Ü), представляющих собой комплекс пептидов. Способ позволяет повысить выход ИС5 из морского сырья в 1,6-2,8 раза по сравнению о извлеченным! из традиционного сырья и увеличить ■их активность в 18-20 раз.

5. Предложен метод скринингового исследования органов морских млекопнтагаих для получения кейлонсодержавих препаратов им-муноыодулиругщего, иитостатического, в частности, опухолевосу-прессорного, органоспецифического действия (полоя.решение ВНИИГПЭ по заявке J? Ч452ЧОО). Физико-химические и биохимические различия в препаратах разной природы обусловливают более выраженный инги-бируищий и стимулирукший аффект у тюленьего КСЛ по сравнению с

■ бычьим.

6. Для индикации профессиональной аллергии впервые разработан диагностический препарат. - крабовый аллерген (патент

№ I34I773). Крабовый аллерген представляет комплекс БАВ, состоящий из углеводов, рибонуклеиновой, дезоксиоктоновой кислот, пептвдов, микроэлементов, аминокислот.

7. Разработана технология получения просгагланаинов из морского сырья*' охарактеризована структура выделенных ÎITEg и ЛГФ^ м9тс^ам" Г^диоиммунологии, хроматографии, ИК-, У5-спектрометрии и .показана их свойства влиять На сократительцую способность гладких, мышц изолированных органов лабораторных яшвоп. •

8. Всесторонне изучен химический состав лшшдных препара- * тов, содержащих IiTEg, DBög^ (ОЛЕГ), обладащих противомикробнымИ, синергидными и противоопухолевыми свойствами. Обнаружена способность ОЛПГ повышать противомикробную активность известных антиботиков в отношении стафилококка, в том числе антиботикорези-стентных, и бактерий кишечной палочки.

9. Топография жирных кислот в морских организмах показала закономерность распределения предшественников ПГ различных серий, что позволило ввделить препараты полиеновых Ж (полож. реш. на получение патента по заявке И 4887036), арахидоновой кислоты и охарактеризовать их структуру, что позволило рекомендовать их в качестве основных или вспомогательных средств для нужд науки, здравоохранения.

10. В вытя?хках из морских хемолюминиодентных бактерий (123 вида) обнаружены комплексы БАВ широкого спектра антибактериальной активности, фунгицвдного и противовирусного действия. Один из штаммов продуцентов БАВ Pseudomonas putida Л ТПО-34, выделен из дальневосточного трепанга, задепонирован в Государственной коллекции микроорганизмов РФ (регистр, номер BKM-B-I583 Д ), как источник ЕАВ (A.C. J* 1329785), БАВ ( A.C. i' I4I0322).

11. Разработаны новые варианты бпотехнологичеокой методики разделения, извлечения, физико-химической характеристики, тестирования ЕАВ морского сырья, определяющего более полное

их экстрагирование, стабилизация и стандартизацию, а также получение некоторых физико-химических констант.

РЕКОЙЕВДАЩ-Ш ДЛЯ ВВДРЕНйЯ В НАУКУ.И ПРАКТИКУ •

1. Апробировать в полупромышленном и промышленном масштабе технологию получения ПШК, ИСВ, ИСФ-I, ИСФ-П, КОП, ОЛПГ, ПГ

д их предшественников из отходов зверобойного, рыбного промысла и промысла морских беспозвоночных.

2. Апробировать в полупромышленном и промышленном варианте получение ЕАВ из морских микроорганизмов.

3. Методическим комиссиям при ТУУЗе Минздрава PS по иммунологии, микробиологии, аллергологии и онкологии рекомендовать включить в учебный процесс медицинских ВУЗов' вопросы диагностик! аллергии к морепродуктам, а также шкунокоррекции с помощью препаратов морского генеза.

4. Провести игроки« клинические испытания,подученных препаратов ЙСЗ, ИСЬ-I, ИСЬ-П в качестве имыуномодуляторов, КСП

- в качестве тшунодепрессантов и цитостатиков, лшзддашх препаратов как диагностикуыов и десенои/билизаторов, аллергенов -в виде депонентов, адьювантов, антиботиков,липосомальной основы.

5. Лабораториям липидологии, биохимии, биоорганической химии предлагается модифицированный олособ детектирования липидов, простагландинов и их предшественников, Реокмендовак прием опя-тия ЯМР-епектров поляеновых жирных киолот,связанный о приемом "сшга-цекаплинг".

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТКМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Патент Je I34I773 от 04.03.92 "Способ получения крабового аллергена" (соавт. Шаронов А.О., Пьянова P.E., др.).

2. Патент (полож. реш. от 02.02.92 по заявке на изобретение J* 4Ö87036/I4/II57I6 (приоритет 04.12.90)"Споооб получения полиеновых жирных кисло?" (соавт. Мотавкина И.О., Каноник Т.К.).

. 3. A.C. $ I4397B5 15.04.87 Иламм Paeudomonas patida

ü ТПО-34 как источник БАБ" (соавт. Мотавкина Н.С., Шульгина ■ Л.В.).

4. A.C. й 39448132 от 31.08.87 "Способ получения иммуностимулирующего вещества" (соавт. Мотавкина И.О., Шаронов A.C. и др.).

5. А.О. ü I4I0322 от I5.D3.88 "Способ получения тритерпеновых

• гликозидов - панаксозидов из корней жень-шоня" (соавт. Москаленко С.А.).

'б. А.О. ä 3948132 от 31.08.87 "Способ получения иммуностимулирую-

щх факторов" (соавт. Мотавкина Н.С., Савдлер Н.Б.). 7. A.C. лсшож. реш. от 10.09.91 по заявке на изобретение й 44 524000/I3I077/2II, приоритет от20.05.88) "Способ получения кейлояов" (соавт. Ыотавкш;а Н.С. и др.).

8. Полярографическое определение макроэлементов в биологических объектах// Изыскание новых способов изготовления лекарств и методы их исследования", Москва, 1983.-с.57 (соавт. Бортов Ю.А. и др.).

9. Изучение основного химического соотава и разработка методов

контроля БАЗ в препаратах ил морских беспозвоночных.-, Москва, 1982.-120 с. (соавт. Йнькова В.И. и др.). IÜ, Микроэлементы органов и биологических активных веществ из морских промысловых млекодитащих// ¡3 кн.: Биологически. активные вецества гидробионтов при комплексной ути-

лизации ресурсов океана.-Владивосток, 1988.-120 с. (соавт. Перлов A.C.).

11. Сравнительная физико-химическая ахарктерцстика гормонов тимуса из морского и наземного сырья// Актуальные проблемы морской медицины,-Владивосток, 1988.-280с. (соавт. Сандлер Н.Б.).

12. Противоопухолевая активность некоторых вытяжек и экстрактов из органов и тканей морских млекоштанцих/Д1едмко-социальные аспекты проблемы "человек-океан" - Владивосток, i960. -

с. 259. (соавт. Федянина JI.H.).

13. Применение подкожного жира морских млекопитающих для ле-чешш варикозных язв, псориаза, герпеса// Медико-социальные аспекты проблемы "человек-океан". - Владивосток, 1988. - с. 260 (соазт. Чеботарев В.В. и др.).

14. К вопросу о минарелыюм и мпкроэлементноы составе асцидии пурпурной//Проблемы научных исследований в области изучения и освоения ¡,¡ирового океана. - Владивосток, 1983. -

с. 135 (соавт. Бузолева А.С., Ннькова В.И.).

15. Аоцидия пурпурная - новый источник простагландинов. Проб-

лемы паучншс исследований в области изучения и освоенля

Мирового океана. - Владивосток, 1983. - с. 149 (соавт. Король H.A. л др.).

16. Новое понимание гормонов тимуса на путях шутритишческой дафференциррвни Т-лшфоцитов//Медико-социальные аспекты проблемы "человек-океан"- Владивосток, 1988. - с.280 (соавт. Сандлер Н.Б.).

17. Антимикробное действие лшшдов морских млекопитающих // Ыедпко-социальные аспекты проблемы "человек-океан". -Владивосток, 1988. - с. 281 (соавт. Бронников Ю.Н.).

18. Биологическая активность лшшдов морских гидробионтов// проблемы научных исследований в области изучения и освоения мирового океана. - Владивосток, 1983. - с. 157 (соазт. Благова Н.В.).

19. Крабовый аллерген и его влияние на организм человека// ¡¿едико-сощальные аспекты проблемы "человек"-океан".-Вдадавосток, 1988. - с. 283 (соавт. Шароусв A.C. и др.).

20. Стихозед морских бактерий - предшественник и трофическая

основа стихозидов трепанга японского//шедико-социальные аспекты проблемы "человек-океан". - Владивосток, 1988.-C.2S4 (соавт. Шульгина Д.З.).

21. Сравнительная характеристика лимфоидных кейлонов морских млекопитающих и перспектива их использования в реабилитации иммунной системы //Материалы 11 Всесоюзной конференции с международным участием "Реабилитация иммунной системы". - Цхал-тубо, 1990. - С. 20 (ооавт. Кустова Н.Р.).

22. К вопросу о биологической активности китового жира //Юбилейный сборник БГШ. - Владивосток, 1982. - С.20.

23. ¡йикрофло ра дальневосточного трепанга как источник БАВ //Итоги исследований по вопросам рационального использования и

охраны биологических ресурсов Сахалина и Курильских островов.

- Южно-Сахалинск, 1984. - С.130 (соавт. Мотавкина Н.С.).

24. Модификация метода ЯМР-опекхроскопии двойных связей жирных кислот липидов //Информационный листок "Местный опыт" й 369-76 ДВ ЦНТИ. - Владивосток, 1976. - С. I (соавт. Бойкова Е.А., Ковун В.Й., Авхутский Л.М.). .

25. Комплексный метод контроля за процессом гидрирования Ж бактерий //Бюллетень 02 рац. преда, здравоохр. Прим.края.

- Владивосток, 1977. С.50 (соавт. Каленик Т.К.).

26. Модификация метода фольча //Бюллетень № 2 предл. и рац.здравоохр. Прим.края. - Владивосток, 1977. - С.52.

27. Иммуномодулирующие и лротдвоопухолыше свойства кейлонов из органов морских млекопитающих //Материалы XI республ. конф.' "Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных 'физиологич. и патологич. состояниях". - Челябинск, 1991. - С. 14 (соавт. Мотавкина 11.С., Кустова Н.В., Фодяшша Л.И.).

28. Эмульгированное лечебное средство //Актуальные проблемы медицины. - Катастрофы. - Владивосток, 1991. - С.124 (соавт.

Мотавкина Н.С., Каленик Т.К.).

29. Внутренние органы дальневосточных ластоногих - мороженные полуфабрикаты //-Технич.условие на сырьё. - Лладивосток, ТШ1Р0, 1989. - С. 10 (соавт. Акулин ii.il., Перлов А.О., Курнаве-ва В. 1-1., Мотавкина И.О.).

30. Антимикробное и синергидное действие липидов морских млекопитающих //Проблемы применения антибиотиков.•- Москва, 1988. - С. 20 (соавт. Котавкина Н.С., Бронников Ю.Н.).

31. Средство ухода за кожей лица //Заявка на изобр. 132444С /13,_ приоритет от 20.01.92 (соавг. Мотавкина Н.С.,

Каленик Т.К., Михайлеяко Т.Н.). %

33. Гетерозис генетических рекомбинантов ишгелл флекснера и эшерихий группы Hfz . ) и особенности ?шрнокислотного оос-тава нейтральных липидов //Статья депонирована ШШ'И iü 78711988. - Москва, 1988. - 10 с.

33. Пути повышения рационального использования морских млекопитающих //Вопросы рационального использования ыороких млекопитающих дальневосточных морей. - Владивосток, 1990. - С.5 (ооавт. Перлов A.C., Берэин A.A.).

34. Жир белухи пищевой //Гехнич.условие на сырьё ТУ 429065004-92. - Владивосток, 1992 (соавт. Мотавкина Н.С. и др.).

35. Липиды мороких млекопитаадих - основа для получения липосомальных препаратов антибиотиков и других лекарственных средств //Всесоюзное совещание "Биологически активные вещества гидробионтов - новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты. - Владивосток, 1991. - С. 44 (соавт. Мотавкина Н.С., Каленик Т.К.)

СОКРАЩЕНИЯ" ИСВ - иммуностимулирующие вещества ИСФ-1 - иммуностимулирующий фактор первый ИСФ-11 - иммуностимулирующий фактор второй KCI1 - кейлонсодержащяй препарат 0Я1Г - общие липиды и простагландшш Ж - шрнне кислоты ЕГ - простаглаццины 'ПШК - полиеновые Ж

Е-рецепторы - рецепторы лимфоцитов к эритроцитам

ЕА-РОК- клетки, образующие розетки с эритроцитами, покрытыми антителами

iia-POK- "активные" РОК

ЕАи-РОК- B-лимфоциты, образущие розетки с эритроцитами (Е) барана и комплементом (С). • '