Бинуклеарный микроядерный метод: оценка возможности биологической индикации и дозиметрии радиационного поражения

Михайлова, Галина Федоровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Бинуклеарный микроядерный метод: оценка возможности биологической индикации и дозиметрии радиационного поражения
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Бинуклеарный микроядерный метод: оценка возможности биологической индикации и дозиметрии радиационного поражения"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИЦИНСКИЙ РАДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 612.017.1: 615.276.4: 616.001.28

РГБ ОД

МИХАЙЛОВА ГАЛИНА ФЕДОРОВНА _ ,

БИНУКЛЕАРНЫЙ МИКРОЯДЕРНЫЙ МЕТОД: ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ИНДИКАЦИИ И ДОЗИМЕТРИИ РАДИАЦИОННОГО ПОРАЖЕНИЯ

(03.00.01 - радиобиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск - 2000

Работа выполнена в Медицинском радиологическом научном центре РАМН

Научные руководители - доктор биологических И.Е. Воробцова кандидат биологических наук М.А. Анкина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С.А.Гераськин

доктор биологических наук, профессор Б.И.Сынзыныс

Ведущая организация:

ГНЦ Институт биофизики Минздрава РФ

Защита диссертации состоится "В. " 2000 г.

в /{ час. на заседании диссертационного Совета Д 001.11.01. в Медицинском радиологическом научном центре РАМН (249020 г. Обнинск Калужской обл.. ул. Королева. 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медицинского радиологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан "С " 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук.

профессор В.А. Куликов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. В последнее время в радиационно-цитогенетических исследованиях все большее применение находит микроядерный метод анализа структурных повреждений хромосом. Учитывая простоту и быстроту подсчета микроядер по сравнению с метафазным анализом аберраций хромосом, авторами ряда работ предлагается использовать микроядерный тест в качестве метода биологической дозиметрии при радиационных поражениях организма. Однако применявшиеся ранее методы идентификации микроядер (радиоавтографический, витальная окраска, флюоресцентный) были довольно сложными и неточными, что приводило к большим расхождениям в результатах исследований отдельных авторов. Применение в последнее время цитохалазина-Б для блокирования клеток в конце митоза (на стадии телофазы) позволяет, с одной стороны, более точно идентифицировать клетки с микроядрами, а с другой, попытаться объективно оценить прогностическую значимость микроядерного теста для целей биологической дозиметрии. Но для этого необходимо знать, из каких типов структурных нарушений хромосом формируются микроядра, изучить для них спонтанный уровень и характер дозовых зависимостей в области низких и высоких доз радиации, зависимость эффекта от мощности дозы, вида излучения и др.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы является количественная оценка радиаци-онно-индуцированных микроядер в бинуклеарных клетках в культуре лимфоцитов человека, блокируемых при помощи цитохалазн-на-Б. Намеченной цели предполагалось достичь решением следующих конкретных задач:

- отработать методику получения бинуклеарных клеток в культуре лимфоцитов человека при помощи цитохалазина-Б;

- изучить кинетику появления бинуклеарных клеток с микроядрами в культуре лимфоцитов после облучения нестимулированных (в стадии во) лимфоцитов в зависимости от сроков фиксации клеток;

- изучить частоту бинуклеарных клеток с микроядрами в контрольных культурах различных доноров;

- исследовать зависимость доза-эффект для бинуклеарных клеток с микроядрами в диапазоне доз 0,05 - 2,0 Гр при гамма-облучении 60Со и нейтронами со средней энергией 0,85 МэВ культуры лимфоцитов человека.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые изучен характер дозовых зависимостей для микроядер в бинуклеарных клетках и бинуклеарных клеток с микроядрами при действии редко- и плотноионизирующего излучений в широком диапазоне доз и на этой основе объективно оценена прогностическая значимость микроядерного теста с использованием цитохалазина-Б для целей биологической индикации и дозиметрии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Выход бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл при гамма-облучении культуры лимфоцитов человека в диапазоне низких доз (0 - 0,5 Гр) характеризуется сложной зависимостью с наличием плато на дозовой кривой, возможно, обусловленной действием репарационных систем клетки.

2. Дозовая зависимость выхода бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл при гамма-облучении в диапазоне доз 0 - 2 Гр хорошо описывается линейно-квадратичной функцией.

О - 2 Гр описывается линейно-квадратичной функцией с отрицательным квадратичным коэффициентом в области высоких доз.

4. На радиочувствительность лимфоцитов периферической крови человека при облучении in vitro не оказывает влияние присутствие аутологичной плазмы.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Практическая значимость работы определялась важностью полученных результатов для биологической дозиметрии острого облучения. На основании проведенных исследований разработаны калибровочные кривые для гамма-облучения 60Со в диапазоне доз 0,05 - 2,0 Гр и для нейтронов со средней энергией 0,85 МэВ в диапазоне доз 0,05 - 1,5 Гр. Представлены методические рекомендации по определению величины поглощенной дозы с помощью калибровочных кривых по бинуклеарным клеткам с микроядрами при остром гамма-облучении и по числу мя/кл - при нейтронном облучении.

Результаты диссертационной работы использованы в методических рекомендациях Министерства Обороны Российской Федерации "Диагностика радиационных поражений" (1994). АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертационной работы были представлены и докладывались на VI Всесоюзном совещании по мнкродозиметрии (Канев, 1989), на I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989), Всесоюзной конференции, приуроченной к 90-летию со дня рождения Н.В. Тимофеева-Рессовского (Обнинск, 1990). Диссертация апробирована на научной конференции радиологического сектора МРНЦ РАМН 14 августа 1998 года. ПУБЛИКАЦИИ. Полученные данные представлены в заключительном отчете НИР "Разработка способа определения поглощенной дозы острого облучения у личного состава ВМФ по цитогенетическим показателям лимфоцитов периферической крови", 1989-1990 гг.

Основные результаты работы изложены в 7 публикациях, включая 3 журнальные статьи.

СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальных исследований, обсуждения и выводов. Работа изложена на 89 стр. (включая список литературы), иллюстрирована 17 рисунками и 9 таблицами. Список литературы , использованный в данной работе, содержит 72 наименования, из которых 16 работ отечественных и 56 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа выполнена на лимфоцитах периферической крови человека с использованием цитохалазина-Б, метаболита плесневого грибка. Цитохалазин-Б обладает свойством блокировать деление цитоплазмы, не препятствуя одновременно делению ядра. В результате в культуре лимфоцитов накапливаются бинуклеарные клетки, т.е. клетки прошедшие только первый митоз.

Методика получения бипуклеарных клеток с использованием "чистых" (выделенных на градиенте фиколл-верографин

из цельной крови) лимфоцитов. Выделение лимфоцитов из венозной крови осуществляли на градиенте фиколл-верографин. Посев производили в цилиндрических стеклянных пробирках (диаметр-10 мм, высота-40 мм) в питательной среде, объемом 1 мл при концентрации лимфоцитов 1х106 клеток/мл. Культуральную среду готовили из среды Игла и 20% сыворотки крупного рогатого скота с добавлением ФГА 0,01 мл типа "М" или 0,001 мл типа "Р" из расчета на 1 мл культуры. Пробирки с культурой клеток закрывали стерильными 4-х слойными марлевыми салфетками и помещали в термостат, в камере которого постоянно поддерживалась температура 37°С, 5% концентрация С02 и 95%-ная влажность воздуха. На 44 ч инкубации во флакон с

культурой клеток добавляли 5 мкг цитохалазина-Б. Фиксация и приготовление препаратов производили через 72 ч от начала культивирования. Для этого содержимое флакона (1 мл) переливали в центрифужную пробирку объемом 10 мл, доливали до 10 мл р-ром 0,3% ЫаС1 и сразу же центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин., после чего надосадочную жидкость сливали (через край пробирки) и в оставшейся капле жидкости ресуспендировали осадок с помощью шприца с насаженной тонкой иглой. На обезжиренные, чистые, сухие предметные стекла наносили из шприца по одной капле клеточной суспензии и с помощью стекла со шлифованным краем делали тонкий мазок, после чего стекла высушивали при комнатной температуре в вертикальном положении. Высушенные стекла опускали в фиксатор - абсолютный спирт-ледяная уксусная кислота (3:1) на 30 мин. Стекла с зафиксированными клетками высушивали и красили азур-эозином в течение 12 мин. Окрашенные стекла промывали в водопроводной воде, высушивали, после чего они были готовы для анализа.

Методика получения бннуклеарпых клеток с использованием плазмы крови человека.

Выделение лимфоцитов из цельной крови человека на градиенте' фиколл-верографин достаточно длительная и трудоемкая процедура, требующая соблюдения строгих условий стерильности. Поэтому в "полевых" условиях работы использование выше описанной методики получения бинуклеарных клеток может столкнуться с трудностями. Поэтому нами была разработана более простая методика получения бинуклеарных клеток., Цельную кровь помещали в термостат при 37°С на 30 мин. Затем, после осаждения эритроцитов, плазму с лейкоцитами отсасывали. Посев производили в пеницил-линовые флаконы объемом 10 мл. Культуральную среду готовили из 2 мл среды Игла, 0,5 мл сыворотки крупного рогатого скота,

0,03 мл ФГА типа "М" или 0,003 мл типа "Р" и в нее добавляли С-,3 мл плазмы с лейкоцитами. Флаконы закрывали стерильными 4-х слойными марлевыми салфетками и помещали в термостат при 37°С, 95%-ной влажности и 5% концентрации СО2. На 44 ч инкубации во флакон с культурой клеток добавляли 15 мкг цитохалазина-Б (из расчета 5 мкг/мл). Фиксацию и приготовление препаратов производили через 72 ч от начала культивирования выше описанным способом.

Критерии идентификации и учета микроядер в бинуклеарных клетках

Типичные бинуклеарные клетки содержат два ядра в цитоплазме, окруженной единой цитоплазматической мембраной (рис. 1). Оба ядра в большинстве случаев имеют одинаковые размеры и плотность. Микроядра по размерам много меньше основных ядер и обычно имеют округлую или овальную форму и обладают типичной ядерной окраской. В цитоплазме одной бинуклеарной клетки может присутствовать одно, два и более микроядер (рис. 1а-г). В большинстве случаев микроядра располагаются на некотором расстоянии от основных ядер, но встречаются случаи, когда микроядро соприкасается с главным ядром (рис. 1д).

Проведенные нами сравнительные исследования индивидуальной скорости анализа бинуклеарных клеток показали, что в среднем за 1 ч можно проанализировать около 200 клеток. По сравнению с традиционным метафазным анализом хромосомных аберраций, микроядерный анализ в бинуклеарных клетках позволяет, примерно, в 10 раз ускорить цитогенетический анализ.

Рис. 1. Бинуклеарные клетки: нормальная (а), с одним микроядром (б), с двумя и четырьмя микроядрами (в, г), микроядро соприкасается с главным ядром (д)

Источники излучения и условия облучения культуры лимфоцитов

В качестве редкоионизирующего излучения служила установка "Луч" с источником излучения 60Со (Е=1,25 Мэв) при мощности дозы 0,5 Гр/мин. Диапазон доз в экспериментах был 0,05 - 3 Гр.

В качестве плотноионизирующего излучения служил реактор БР-10 (канал Б-3) с источником нейтронов спектра деления (Е=0,85 Мэв) при мощности дозы 0,22 Гр/мин. Диапазон доз в экспериментах был 0,05 - 2 Гр.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Модификация метода культивирования лимфоцитов крови человека с цитохалазином-Б с целью получения бинуклеарпых клеток Нами были проведены специальные экспериментальные исследования по отработке методики получения бинуклеарных клеток с последующей возможностью исследования в них микроядер. Всего проведено около тридцати опытов, в которых решались следующие задачи:

- определение оптимальной концентрации цитохалазина-Б для культуры лимфоцитов человека;

- определение оптимальной плотности (концентрации) посева клеток;

- изучение кинетики выхода бинуклеарных клеток;

- выбор срока фиксации культуры лимфоцитов, для чего была исследована кинетика выхода бинуклеарных клеток с микроядрами в необлученной (контрольной) и облученной в различных дозах культурах;

- оптимизация последовательности процедур при фиксации культуры: продолжительность центрифугирования и гипотонизации, а также вид гипотонического раствора;

- способ приготовления цитологических препаратов.

В результате нами предложены две методики получения бинуклеар-ных клеток, изложенные в разделе "Материалы и методы исследования".

Сравнительный апалнз частоты бипуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл в зависимости от дозы облучения при различных методах культивирования лимфоцитов

Для того , чтобы проверить, не влияет ли модификация методики получения бинуклеарных клеток на радиочувствительность лимфоцитов, было проведено сравнение выхода бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл при использовании методики посева "чистых" лимфоцитов и лимфоцитов с аутологичной плазмой. Сравнивались дозовые кривые для гамма-облучения 60Со. Из экспериментальных данных были получены регрессионные уравнения, описывающие выход бинуклеарных клеток с микроядрами для "чистых" лимфоцитов и лимфоцитов с аутологичной плазмой от дозы, которые были соответственно: У=(0,97±0,33) + (4,5±1,1)В + (1,4±0.5)Б2

У=(0,9±0.2) + (4,9±0,6)0 + (1,2±0,3)Ю2, и с высокой степенью значимости совпадали для всего диапазона доз (х2=0,00291, р>0,98). Аналогичные результаты получены и для числа мя/кл.

Спонтанная частота бипуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл в лимфоцитах крови человека

Количественная оценка частоты бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл была выполнена на основе анализа более 40 ООО бинуклеарных клеток из культуры лимфоцитов 25 клинически здоровых доноров-мужчин в возрасте 21-38 лет. Было получено, что индивидуальная частота бинуклеарных клеток с микроядрами и число мя/кл колебались соответственно в пределах 0,3 - 3,3% и 0,004 - 0,037. Средняя частота бинуклеарных клеток с

микроядрами и число мя/клетку соответственно составляли 1,4 ±0,2% и 0,015 ± 0,002. Статистический анализ распределения индивидуальной частоты бинуклеарных клеток с микроядрами показал ее соответствие нормальному распределению.

По данным разных авторов частота микроядер в бинуклеарных клетках варьирует в пределах 0,002 - 0,05 на клетку. Средняя величина полученного нами спонтанного числа мя/кл хорошо согласуется с данными Fenech and Morley (1989) для доноров в возрасте 20 - 35 лет, для которых авторы получили среднюю частоту микроядер в бинуклеарных клетках равную 0,017 на клетку.

Также было изучено влияние возраста доноров на выход бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл. Полученные данные удовлетворительно описываются уравнениями линейной регрессии Y=(-l,3 ± 0,8) + (0,09 ± 0,03)V, (R=0,56), для бинуклеарных клеток с микроядрами и Y=(-0,015 ± 0,009) + (0,001 ± 0,0003)V, (R=0,56) для числа мя/кл, где V - возраст в годах. Таким образом, несмотря на то, что существует широкий разброс данных по индивидуальной спонтанной частоте, наблюдается значимый (р<0,05) рост частоты бинуклеарных клеток с микроядрами на 0,09% в год и числа мя/кл на 0,001 в год от возраста.

Однако у других авторов (Prosser et al., 1988; Gantenberg et al., 1991) для доноров этой же возрастной группы (20 - 40 лет) не отмечалось роста частоты микроядер в зависимости от возраста. Возможно, это связано с небольшим количеством изученных доноров (12 -14 человек). Только для доноров в более широком возрастном диапазоне 20 - 57 лет (Hall and Wells, 1988; Huber et al., 1989) или 20 - 85 лет (Fenech and Morley, 1986) был обнаружен рост частоты микроядер в бинуклеарных клетках в зависимости от возраста.

Зависимость доза-эффект выхода бинуклеарпых клеток с мшероядрами и числа мя/кл после гамма-облучения культуры лимфоцитов человека

Кривые доза-эффект были изучены на культурах лимфоцитов от 9 доноров-мужчин в возрасте 21 - 35 лет в диапазоне доз 0 - 2 Гр. Дозовые кривые для образцов крови всех доноров в этом диапазоне доз описывались линейно-квадратичным уравнением регрессии. Полученные регрессионные уравнения для выхода бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл равнялись соответственно: Y=(l,4±0,l) + (4,7±0,6)D + (2,5±0,4)D2 df=8, r2=0,995

Y=(0,016+0,001) + (0,047±0,007)D + (0,034+0,004)D2 df=8, r2=0,996 На рис. 2 показана регрессионная кривая выхода бинуклеарных клеток с микроядрами для обобщенных данных по образцам крови 9 доноров. Отношение линейного коэффициента к квадратичному составляло приблизительно 1,5, что говорит о том, что вплоть до дозы 1 Гр линейная составляющая является преобладающей.

На основании данных литературы , микроядра в основном формируются из ацентрических фрагментов, т.о., по-видимому, линейный член зависимости отражает выход микроядер, сформировавшихся из парных фрагментов, а квадратичный член - выход микроядер, сформировавшихся из интерстициальных делеций (точек), которые относятся к классу обменных (двухударных) аберраций (A.B. Севанькаев., 1987). Полученная нами дозовая кривая хорошо согласуется с аналогичной кривой полученной при гамма-облучении 60Со Ban et al. (1991) во всем диапазоне доз, и с данными Mitchel and Norman (1987) - в диапазоне 0 - 1 Гр, однако в диапазоне 1 - 2 Гр согласование значительно хуже: наша кривая идет ниже. Это, возможно, объясняется интерпретацией критериев Countryman and Heddle (1975) по идентификации микроядер, поскольку в диапазоне высоких доз в клетке индуцируются несколько микроядер и в

результате возможно как их взаимное наложение и касание, так и наложение и касание микроядер с основными ядрами.

Рассмотрим далее более подробно действие на лимфоциты человека редкоионизирующего излучения в диапазоне доз 0 -0,5 Гр.

-1-1-1-■-1-■-1-■-г-

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Доза, гр'

Рис. 2. Экспериментальные точки обобщенных данных и регрессионная кривая для бинуклеарных клеток с микроядрами

На рис. 3 представлены объединенные для образцов крови от 9 доноров экспериментальные данные выхода бинуклеарных клеток с микроядрами в диапазоне доз 0 .- 0,5 Гр. Цз этого рисунка видно, что- выход бинуклеарных клеток с микроядрами достоверно превышает средний спонтанный .уровень уже при дозе 0,05 Гр, причем при следующей дозе 0,1 Гр выход бинуклеарных клеток с микроядрами

не увеличивается, т.е. наблюдается плато на дозовой кривой в диапазоне доз 0,05 - 0,1 Гр. Далее выход бинуклеарных клеток с микроядрами возрастает, но вновь замедляется в диапазоне 0,3 - 0,4 Гр образуя практически второе плато, хотя и менее четко выраженное. Аналогичная картина отмечается и для числа мя/кл.

В настоящее время принята концепция линейности и беспоро-говости действия радиации в диапазоне низких доз, о биологической эффективности которых судят путем экстраполяции эффектов с уровня высоких доз на низкие. Однако в последние годы накопилось достаточно большое количество данных о нелинейном характере дозовой кривой в области доз 0 - 0,5 Гр. Так, плато в диапазоне доз 10 - 30 сГр для частоты дицентриков при гамма-облучении соСо культуры лимфоцитов человека в диапазоне 5-40 сГр отмечалось в работе А. В. Севанькаева и Н. В. Лучника (1977). Аналогичное плато для тех же типов аберраций при гамма-облучении 137Сэ и в том же диапазоне доз (10 - 30 сГр) обнаружено на культуре лимфоцитов обезьян и в дозах 20 - 30 сГр на культуре лимфоцитов человека в работе японских авторов (ТакаЬазЫ et а1., 1982). На основании полученных данных А. В. Севанькаев и Н. В. Лучник высказали гипотезу, объясняющую плато на дозовой кривой сменой двух типов репараций - "регулярной", ответственной за репарацию спонтанно возникающих повреждений, ферментативный пул которой быстро истощается при радиационном воздействии, на "аварийную" - индуцируемую радиационным воздействием, которая, однако, при таких низких дозах еще не включается в полном объеме в "работу".

Я 1-га

1 I

0.1 0.2 0.3 0.4 Доза, Гр

Рис. 3. Объединенные экспериментальные данные выхода бинукле-арных клеток с микроядрами в диапазоне доз 0 - 0,5 Гр

Логическое развитие данная гипотеза получила в работах С.А. Гераськина (1995). Автор, анализируя дозовые кривые, полученные на различных объектах (культуре лимфоцитов человека, фибробластах китайского хомячка, культуре фибробластов мыши, проростках конских бобов, листовой меристеме ячменя), отмечает, что для всех этих объектов характерно наличие плато на дозовой кривой, а некоторое различие в значениях доз, при которых наблюдается плато, может объясняться различной радиочувствительностью объектов. На дозовой кривой автор выделяет четыре диапазона доз: зона малых доз (естественный радиационный фон и сопре-

дельные с ним дозы), зона адаптивного ответа, зона БОЗ-ответа и зона аварийного ответа. Смена зон осуществляется путем триггерного (порогового) переключения, в основе которого лежит переход клетки в иной режим функционирования (изменяется система репарации). В зоне адаптивного ответа действует система репарации адаптивного ответа, имеющая антимутагенную направленность. В результате чего при увеличении дозы выход повреждений не только не увеличивается, но может быть даже ниже спонтанного уровня повреждений. Далее, с увеличением дозы , подключается репарационная система вОв-ответа (репрессированная в нормальных условиях), которая обеспечивает восстановление жизнеспособности клеток за счет повышенного выхода генетических повреждений, которые определяются не столько внешним воздействием (индукцией первичных повреждений), сколько мощностью систем БОЗ-репарации. При дальнейшем увеличении дозы мощности систем вОв-репарации оказывается недостаточно для устранения индуцируемых радиационным воздействием повреждений молекул ДНК,, начинается зона аварийного ответа и кривая доза-эффект становится монотонно возрастающей.

Бели рассматривать полученные нами усредненные экспериментальные данные по выходу микроядер в бинуклеарных клетках в диапазоне доз 0 - 0,5 Гр (см. рис. 3) в рамках предложенной концепции, то диапазон доз 0,05 - 0,15 Гр может претендовать на зону адаптивного ответа. Причем начиная с дозы 0,1 Гр система репарации адаптивного ответа перестает справляться с нарастанием повреждений, в результате чего отмечается небольшой рост бинуклеарных клеток с микроядрами до дозы 0,15 Гр, при которой, по-видимому, подключается система ЗОБ-репарации, и в диапазоне доз 0,15 - 0,2 Гр действует совместно с системой адаптивной репарации. Этим можно объяснить снижение выхода бинуклеарных клеток с

микроядрами в этом диапазоне доз. Далее, в диапазоне доз 0,2 - 0,3 Гр, идет опять рост выхода бинуклеарных клеток с микроядрами, что можно интерпретировать как отключение системы репарации адаптивного ответа; при дозах 0,3 - 0,4 Гр работает только система ЗОЭ-репарации, в результате чего формируется плато на до-зовой кривой. Начиная с дозы 0,4 Гр, выход бинуклеарных клеток с микроядрами становится монотонно возрастающим, т.е. начинается зона аварийного ответа. Таким образом, полученные нами данные по выходу микроядер в бинуклеарных клетках при гамма-облучении соСо в диапазоне доз 0 - 0,5 Гр хорошо трактуются в рамках предложенной концепции, которая, по мнению автора, носит универсальный характер действия малых доз ионизирующей радиации на биологические объекты и отражает фундаментальные механизмы обеспечения устойчивости живых систем и возможности их адаптации. Наши данные могут служить дополнительным свидетельством в пользу этой концепции.

Зависимость доза-эффект выхода бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл при облучении культуры лимфоцитов человека нейтронами и ОБЭ Кривые доза-эффект выхода бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл при воздействии нейтронов со средней энергией 0,85 МэВ на лимфоциты человека были изучены на образцах крови от 6 клинически здоровых доноров-мужчин в возрасте 25 - 38 лет в диапазоне доз 0 - 2 Гр. Уже при минимальной дозе 0,05 Гр как количество бинуклеарных клеток с микроядрами, так и число мя/кл в 2,5 раза превышает спонтанную частоту.

На рисунке 4 представлены объединенные экспериментальные данные по образцам крови от 6 доноров и соответствующая регрессионная кривая. Из данного рисунка видно, что до дозы 0,5 Гр выход бинуклеарных клеток с микроядрами характеризуется линейной за-

висимостыо, а затем происходит замедление прироста бинуклеарных клеток с микроядрами и после дозы 1,5 Гр дозовая кривая практически выходит на плато. Это, по-видимому, связано с задержкой деления сильно поврежденных клеток (А. В. Севанькаев, 1987).

На рисунке 5 приведены объединенные экспериментальные данные по выходу числа мя/кл от дозы для образцов крови от 6 доноров и соответствующая регрессионная кривая. Из этого рисунка видно, что до дозы 1 Гр наблюдается линейный рост выхода числа мя/кл, после чего происходит замедление роста числа мя/кл, однако явно выраженного плато в изученном диапазоне доз не наблюдается. Это может быть связано с тем, что микроядра в основном формируются из парных фрагментов, дозовая кривая которых, при облучении культуры лимфоцитов нейтронами со средней энергией 0,85 МэВ, ведет себя аналогичным образом (А. В. Севанькаев, 1987).

0.0

1.0

Доза, Гр

1 5

2.0

Рис. 4. Обобщенные экспериментальные данные леарных клеток с микроядрами и соответствующая кривая У=(3,2±0,96) + (66,5±3,0)0 + (-16,2±1,5)Б2

выхода бинук-регрессионная

Рис. 5. Обобщенные экспериментальные данные выхода числа мя/кл от дозы и соответствующая регрессионная кривая У=(0,020±0,008) + (0,929±0,026)В + (-0Д44±0,013)Б2

На дозовых кривых как для выхода бинуклеарных клеток с микроядрами, так и для выхода микроядер в бинуклеарных клетках отсутствует плато в диапазоне низких доз, что можно объяснить крайне неравномерным распределением поглощенной энергии по клеткам при нейтронном облучении (В. А. Питкевич, В. Г. Виден-ский, 1978) и большей эффективностью действия нейтронов.

Нами были получены значения ОБЭ нейтронов по отношению к гамма-облучению 60Со (см. табл. 1).

Таблица 1. Значения ОБЭ для дозы нейтронов

Доза, Гр 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,75 1,0

Значение ОБЭ 11,9 9,8 7,8 6,7 6,0 5,5 4,7 4,1

Итак, полученные нами экспериментальные данные по выходу как бинуклеарных клеток с микроядрами, так и микроядер в би-нуклеарных клетках при облучении культуры лимфоцитов человека гамма-радиацией соСо и реакторными нейтронами со средней энергией 0,85 МэВ в диапазоне доз 0 - 2 Гр могут быть использованы в качестве калибровочных кривых при оценки поглощенных доз у человека при случайном облучении.

ВЫВОДЫ

1. Изучение различных модификаций методики получения бинуклеарных (БН) клеток позволяет заключить, что на радиочувствительность лимфоцитов периферической крови человека при облучении in vitro не оказывает влияние присутствие аутологичной плазмы.

2. Спонтанная частота БН клеток с микроядрами и число мя/кл увеличивается с возрастом человека примерно линейно.

3. Выход БН клеток с микроядрами и числа мя/кл при гамма-облучении 60Со культуры лимфоцитов человека в диапазоне низких доз (0 - 0,5 Гр) характеризуется сложной зависимостью с наличием плато на дозовой кривой, возможно, обусловленным действием репарационных систем клетки.

4. Дозовая зависимость выхода БН клеток с микроядрами и числа мя/кл при гамма-облучении 60Со культуры лимфоцитов человека в диапазоне доз 0 - 2 Гр описывается линейно-квадратичной функцией, причем до 1 Гр линейная составляющая является преобладающей. Линейный коэффициент отражает, по-видимому, формирование микроядер из парных фрагментов, а квадратичный,- в основном, из интерстициальных делеций.

ентом в области высоких доз, который обусловлен, по всей вероятности, задержкой деления сильно поврежденных клеток.

6.Дозовая зависимость выхода числа мя/кл при облучении культуры лимфоцитов человека нейтронами со средней энергией 0,85 МэВ в диапазоне доз 0 - 2 Гр описывается также линейно-квадратичной функцией с отрицательным квадратичным коэффициентом в области высоких доз, что связано, по всей видимости, с формированием микроядер из парных фрагментов, для которых при высоких дозах наступает эффект насыщения.

7. Изучена биологическая эффективность нейтронов спектра деления со средней энергией 0,85 МэВ по отношению к гамма-излучению 60Со. Получена линейная зависимость между log(OB3) и 1ой(доза нейтронов).

8. Бинуклеарный микроядерный метод дает возможность оценить поглощенную дозу при остром гамма-облучении 60Со начиная с дозы

0.25.Гр и при облучении нейтронами со средней энергией 0,85 МэВ начиная с дозы 0,05 Гр с приемлемой в практическом отношении точностью.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф. - Микроядра в лимфоцитах человека: предварительные данные по облучению быстрыми нейтронами in vitro. В сб.: Нейтроны и тяжелые заряженные частицы в биологии и медицине. Обнинск, 1989, с. 18-22.

2. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф. - Сравнительное изучение микроядерного и метафазного методов анализа радиационно-индуцированных аберраций хромосом. В сб.: Материалы VI Всесоюзного совещания по микродозиметрии. Канев, 1989, с. 114-115.

3. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф. - Изучение кинетики выхода и зависимости доза-эффект для бинуклеарных клеток с микроядрами

в культуре ФГА-стимулированных лимфоцитов человека при использовании цитохалазина-Б. В сб: I Всесоюзный радиобиологический съезд. Москва, 1989, т. 3, с. 659-660.

4. Анкина М.А., Завитаева Т.А., Михайлова Г.Ф., Козлов В.М. -Сравнительное изучение дозовых зависимостей выхода радиацион-но-индуцированных аберраций хромосом при микроядерном и ме-тафазном методах их анализа. В сб.: Актуальные проблемы радиационной биологии и радиационной генетики. Обнинск, 1990, с. 9-13.

5. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф. - Изучение зависимости доза-эффект для частоты бинуклеарных клеток с микроядрами в культуре лимфоцитов человека после гамма-облучения. Радиобиология, 1991, т. 31, вып. 1, с. 71-76.

6. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф., Филимонов A.C. - Изучение зависимости доза-эффект для показателей микроядерного теста при использовании облучения нейтронами спектра деления. Радиобиология, 1991, т. 31, вып. 3, с. 414-417.

7. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф. - Модификация способа посева лимфоцитов в культуру и приготовления препаратов при микроядерном методе, основанном на цитогенетическом блоке. Клиническая лабораторная диагностика, 1992, №3-4, с. 17-22.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Михайлова, Галина Федоровна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. История развития микроядерного метода.

1.2. Природа микроядер.

1.3. Спонтанная частота микроядер в лимфоцитах крови человека.

1.4. Кривая доза-эффект выхода микроядер и эффект мощности дозы при действии редкоионизирующего излучения.

1.5. Кривая доза-эффект выхода микроядер при воздействии нейтронов и ОБЭ.

1.6. Возможность оценки дозы бинуклеарным микроядерным методом.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Методика получения бинуклеарных клеток с использованием "чистых" (выделенных на градиенте фиколл-верографин из цельной крови) лимфоцитов.

2.2. Методика получения бинуклеарных клеток с использованием плазмы крови человека.

2.3. Критерии идентификации и учета микроядер в бинуклеарных клетках.

2.4. Источники излучения и условия облучения культуры лимфоцитов.

2.5. Схема проведенных экспериментов и статистическая обработка результатов.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Модификация метода культивирования лимфоцитов крови человека с цитохалазином-Б с целью получения бинуклеарных клеток.

3.2. Сравнительный анализ частоты бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл в зависимости от дозы облучения при различных методах культивирования лимфоцитов.

3.3. Спонтанная частота бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл в лимфоцитах крови человека.

3.4. Зависимость доза-эффект выхода бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл после гамма-облучения культуры лимфоцитов человека.

3.5. Зависимость доза-эффект выхода бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл при облучении культуры лимфоцитов человека нейтронами и ОБЭ.

1У. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Бинуклеарный микроядерный метод: оценка возможности биологической индикации и дозиметрии радиационного поражения"

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. В последнее время в радиационно-цитогенетических исследованиях все большее применение находит микроядерный метод анализа структурных повреждений хромосом. Учитывая простоту и быстроту подсчета микроядер по сравнению с метафазным анализом аберраций хромосом, авторами ряда работ предлагается использовать микроядерный тест в качестве метода биологической дозиметрии при радиационных поражениях организма. Однако, применявшиеся ранее методы идентификации микроядер (радиоавтографический, витальная окраска, флюоресцентный) были довольно сложными и неточными, что приводило к большим расхождениям в результатах исследований отдельных авторов. Применение в последнее время цитохалазина-Б для блокирования клеток в конце митоза (на стадии телофазы) позволяет, с одной стороны, более точно идентифицировать клетки с микроядрами, а с другой, попытаться объективно оценить прогностическую значимость микроядерного теста для целей биологической дозиметрии. Но для этого необходимо знать, из каких типов структурных нарушений хромосом формируются микроядра, изучить для них спонтанный уровень и характер дозовых зависимостей в области низких и высоких доз радиации, зависимость эффекта от мощности дозы, вида излучения и др.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы является количественная оценка радиаци-онно-индуцированных микроядер в бинуклеарных клетках в культуре лимфоцитов человека, блокируемых при помощи цитохалазина-Б. Намеченной цели предполагалось достичь решением следующих конкретных задач: 5

- изучить частоту бинуклеарных клеток с микроядрами в контрольных культурах различных доноров;

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

2. Дозовая зависимость выхода бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл при гамма-облучении в диапазоне доз 0 - 2 Гр хорошо описывается линейно-квадратичной функцией. 6

3. Дозовая зависимость выхода бинуклеарных клеток с микроядрами и числа мя/кл при облучении культуры лимфоцитов человека нейтронами со средней энергией 0,85 МэВ в диапазоне доз 0 - 2 Гр описывается линейно-квадратичной функцией с отрицательным квадратичным коэффициентом в области высоких доз.

4. Радиочувствительность лимфоцитов периферической крови человека при облучении in vitro не зависит от присутствия аутоло-гичной плазмы.

Результаты диссертационной работы использованы в методических рекомендациях Министерства Обороны Российской Федерации "Диагностика радиационных поражений" (1994).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертационной работы были представлены и докладывались на VI Всесоюзном совещании по микродозиметрии (Канев, 1989), на I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989), Всесоюзной конференции, приуроченной к 90-летию со дня рождения Н.В. Тимофеева-Рессовского (Обнинск, 1990). 7

ПУБЛИКАЦИИ. Полученные данные представлены в заключительном отчете НИР "Разработка способа определения поглощенной дозы острого облучения у личного состава ВМФ по цитогенетическим показателям лимфоцитов периферической крови", 1989-1990 гг. Основные результаты работы изложены в 8 публикациях, включая 3 журнальные статьи.

СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, экспериментальных исследований, обсуждения и выводов. Работа изложена на 89 стр. (включая список литературы), иллюстрирована 17 рисунками и 9 таблицами. Список литературы, использованный в данной работе, содержит 72 наименование, из которых 16 работ отечественных и 56 зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Михайлова, Галина Федоровна

ВЫВОДЫ

1. Изучение различных модификаций методики получения бинук-леарных (БН) клеток позволяет заключить, что на радиочувствительность лимфоцитов периферической крови человека при облучении in vitro не оказывает влияние присутствие аутологичной плазмы.

3. Выход БН клеток с микроядрами и числа мя/кл при гамма-облучении 60Со культуры лимфоцитов человека в диапазоне низких доз (0 - 0,5 Гр) характеризуется сложной зависимостью с наличием плато на дозовой кривой, возможно, обусловленной действием репарационных систем клетки.

5. Дозовая зависимость выхода БН клеток с микроядрами при облучении культуры лимфоцитов человека нейтронами со средней энергией 0,85 МэВ в диапазоне доз 0 - 2 Гр описывается линейно-квадратичной функцией с отрицательным квадратичным коэффициентом в области высоких доз, который обусловлен, по всей вероятности, задержкой деления сильно поврежденных клеток.

81 ти высоких доз, что связано, по всей видимости, с формированием микроядер из парных фрагментов, для которых при высоких дозах наступает эффект насыщения.

7. Изучена биологическая эффекттивность нейтронов спектра деления со средней энергией 0,85 МэВ по отношению к гамма-излучению 60Со. Получена линейная зависимость между 1о§(ОБЭ) и 1о£(доза нейтронов).

8. Бинуклеарный микроядерный метод дает возможность оценить поглощенную дозу при остром гамма-облучении 60Со начиная с дозы 0,25 Гр и при облучении нейтронами со средней энергией 0,85 МэВ начиная с дозы 0,05 Гр с приемлемой в практическом отношении точностью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Михайлова, Галина Федоровна, Обнинск

1. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф. Изучение зависимости доза-эффект для частоты бинуклеарных клеток с микроядрами в культуре лимфоцитов человека после гамма-облучения. Радиобиология, 1991, т. 31, вып. 1, с. 71-76.

2. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф., Филимонов A.C. Изучение зависимости доза-эффект для показателей микроядерного теста при использовании облучения нейтронами спектра деления.

3. Радиобиология, 1991, т. 31, вып. 3, с. 414-417.

4. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф. Модификация способа посева лимфоцитов в культуру и приготовления препаратов при микроядерном методе, основанном на цитогенетическом блоке. -Клиническая лабораторная диагностика, 1992, №3-4, с. 17-22.

5. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф. Микроядра в лимфоцитах человека: предварительные данные по облучению быстрыми нейтронами in vitro. - В сб.: Нейтроны и тяжелые заряженные частицы в биологии и медицине.- Обнинск, 1989, с. 18-22.

6. Анкина М.А., Михайлова Г.Ф. Сравнительное изучение микроядерного и метафазного методов анализа радиационно-индуцированных аберраций хромосом.- В сб.: Материалы VI Всесоюзного совещания по микродозиметрии.- Канев, 1989, с. 114-115.83

7. Бей ли Н. Математика в биологии и медицине.- М., 1970.

8. Гераськин С.А. Критический анализ современных концепций и подходов к оценке биологического действия малых доз ионизирующего излучения. Радиационая биология. Радиоэкология, 1995, т. 35, вып. 5, с. 563-571.

9. Гераськин С.А. Концепция биологического действия малых доз ионизирующего излучения на клетки. Радиационая биология. Радиоэкология, 1995, т. 35, вып. 5, с. 571-580.

10. Лакин Г.Ф. Биометрия М., Высшая школа, 1980.

11. Михайлова Г.Ф., Анкина М.А. Тезисы докладов.- Пущино, 1990, с. 86-87.

12. Питкевич В.А., Виденский В.Г. Микродозиметрические характеристики спектра нейтронов деления изотопа 252Cf и пучков П-2, Б-3 реактора БР-10. Мед. радиология, 1978, №10, с. 47-52.

13. Севанькаев A.B. Радиочувствительность хромосом лимфоцитов человека в митотическом цикле М., Энергоатомиздат, 1987.

14. Севанькаев A.B., Лучник Н.Б.- Влияние гамма-облучения на хромосомы человека. YIII. Цитогенетический эффект низких доз при облучении in vitro. Генетика, 1977, т. 13, No3, с.524-532.

15. Ярмоненко С.П. Радиобиология М., Высшая школа, 1988.

16. Aghamohammadi S.L., Henderson L., Cole R.G. The human lymphocyte micronucleus assay. Respons of cord blood lymphocytes to y-radiation and bleomycin.- Mutat. Res., 1984, Afol30, p.395-401.84

17. Almassy Zs., Kanyar B.,Koteles G.J. Frequency of micronuclei in X-irradiated human lumphcytes.- Int. J. Radiat. Biol., 1986, V.49, iVo6, p.719-723.

18. Ban S., Donovan M.P., Cologne J.B., Sawada S. Gamma-ray- and fission neutron-induced micronuclei in PHA stimulatied and unstimulatied lymphocytes.- J. Radiat. Res., 1991, V.32, JVol, p.13-22.

19. Ban S., Cologne J.B., Fujita S., Awa A.A. Radiosensitivity of atomic bomb survivors as determined with a micronucleus assay.- Radiat. Res., 1993, Afol34, p.170-178.

20. Bauchinger M. Cytogenetic effectsin human lymphocytesas a dosimetry sustem. -Biological Dosimetry, 1984, Springer Verlag, p. 15-21, Berlin.

21. Bettega D., Bombana N., Pelucchi T., Poli A. Multinucleate cells and micronucleus formation in cultured human cells exposed to 12 MeV protons and gamma-rays.- Int. J. Radiat. Biol., 1980, V.37, Nol, p. 1-7.

22. Bilbao A., Prosser J.S., Edwards A.A., Moody J.C. The induction of micronuclei in huvan lymphocytes by in vitro irradiation with alpha particles from plutonium-239.- Int. J. Radiat. Biol., 1989, V.56, No3, p.287-292.

23. Catena C., Conti D., Del Nero A., Righi E. Inter-individual differences in radiation respone shown by an in vitro micronucleus assay: effects of 3-aminobenzamide on X-ray treatment.- Int. J. Radiat. Biol., 1992, V.62, No6, p.687-694.

24. Cornforth M.N., Goodwin E.H. Transmission of radiation-induced acentric chromosomal fragments to micronuclei in normal human fibroblasts.- Radiat. Res., 1991, No\26, p.210-217.

25. Counryman P.I., Heddle J.A. The production of micronuclei from chromosome aberrations in irradiated cultures of human lymphocytes.- Mutat. Res. 1976, jVo41, p.321-328.

26. Das H.K. Synthetic capacities of chromosome fragments correlated with their ability to maintain nucleolar material. -J. Cell Biol., 1962, No\5, p.121-130.85

27. Eastmond D.A.,Tucker J.D. Kinetochore localization in micronucleated cytocinesis-blocked Chinese hamster ovary cells: A new and rapid assay for identifying aneuploidy-inducing agents.- Mutat. Res. 1989, No22A, p.521-525.

28. Fenech M., Morley A.A. Measurement of micronuclei in lymphocytes.- Mutat. Res., 1985,7Vol47, p.29-35.

29. Fenech M., Morley A.A. Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in vivo ageing and low dose X- irradiation.- Mutat. Res., 1986, iVol62, p. 193-200.

30. Fenech M., Morley A.A. Ageing in vivo does not influence micronucleus induction in human lymphocytes by X-irradiation. Mech. Ageing Dev., !987, No39, p.113-119.

31. Fenech M., Morley A.A. Kinetochore detection in micronuclei: an alternative method for measuring chromosome loss.- Mutagenesis, 1989, iVo4, p.98-104.

32. Fliedner T.M., Andrews G.A., Cronkite E.P., Bond V.P. Early and late cytologic effects of whole-body irradiation on human marrow.- Blood, 1964, iVo23, p.471-477.

33. Gantenberg H.W., Wuttke K., Streffer C., Muller W.U. Micronuclei in human lymphocytes irradiated in vitro or in vivo.- Radiat. Res., 1991, iVol28, p.276"281.

34. Gosh S., Paweletz N. Synchronous DNA synthesis and mitosis in multinucleate cells with one chromosome in each nucleus.- Chromosoma, 1984, 7Vo89, p. 197-200.

35. Hall S.C., Wells J. Micronuclei in human lymphocytesas a biological dosimeter: preliminary data following beta irradiation in vitro.- J. Radiat. Prot., 1988, V.8, No2, p.97-102.

36. Heddl J. A., Carrano A.V. The DNA content of micronuclei induced in mouse bone marrow by gamma-irradiation: evidence that micronuclei arise from acentric chromosomal fragments.- Mutat. Res., 1977, JV641, p.63-70.

37. Henning U.G.G., Rudd N.L., Hoar D.I. Kinetochore immunofluorescence in micronuclei: A rapid method for the in situ detection of aneuploidy and chromosome breakage in human fibroblasts.- Mutat. Res., 1988, M>203, p.405-414.

38. Huber R., Streng S., Bauchinger M. The suitability of the human lymphocyte micronucleus assay system for biological dosimetry.- Mutat. Res., 1983, iVo 111, p.185-192.

39. Huber R., Braselman H., Bauchinger M. Screening for interindividual differences in radiosensitivity by means of the micronucleus assay in human lymphocytes.- Radiat. Environ. Biophys., 1989, vVo28, p. 113-120.

40. Huber R., Braselman H., Bauchinger M. Intra-and inter-individual variation of background and radiation-induced micronucleus frequencies in human lymphocytes.- Int. J. Radiat. Biol., 1992, V.61, No5, p.655-661.

41. Kenneth L., Pinney S.M., Livingston G.K. Sources of variability in the human lumphocyte micronucleus assay: a population-based stady.- Environ. Mol. Mut., 1995, No26, p.26-36.

42. Kligerman A.D., King S.C. Frequency of micronucleated-binucleated lumphocytes is not significantly affected by the harvest time following Go exposure to X-radiation.- Int. J. Radiat. Biol., 1995, V.68, JVol, p.19-23.

43. Koksal G., Lloyd D.C., Edwards A.A., Prosser J.S. tse dependence of the micronucleus yeild in human lymphocytes on culture and cytokenesis blocking times.-Radiat. Protect. Dos., 1989, No29, p.209-212.87

44. Kolin-Gerresheim I., Bauchinger M. Dependence of the frequency of harlequin-stained cells on BrdU concentration in human lymphocyte cultures.-Mutat. Res., 1981, M>91, p.251-254.

45. Kormos C., Koteies G.J. Micronuclei in X-irradiated human lymphocytes.-MutatRes., 1988,7Vol99,p.31-35.

46. Kramer M. Untersuchungen zur Induktion von Chromosomenaberrationen und Mikrokernen mit durchfluszytometrischen Techniken und einer Immunfluores-zenzmethode zur Anfarbung von Kinetochoren.- GSF-Bericht 10/90, GSF München, ISSN 0721-1694, 1990.

47. Krepinsky A.B., Heddle J.A. Micronuclei as a rapid and inexpensive measure of radiation-induced chromosomal aberrations.- In: Ishihara T., Sasaki M.S. (eds.). Radiation-induced chromosome damage in man, 1983, Liss, New York, p.93-109.

48. Littlefield L.G., Sayer A.M., Frome E.L. Comparison of dose-response parameters for radiation-induced acentric fragments and micronuclei observed in cytokinesis-arrested lymphocytes.- Mutagenesis, 1989, V.4, No4, p.265-270.

49. Miller B.M., Werner T., Weier H.U., Nüsse M. Analysis of radiation-induced micronuclei by fluorescence in situ hybridization (FISH) simultaneously using telomeric and centromeric DNA probes.- Radiat. Res., 1992, iVol31, p.177-185.

50. Mitchell J.C., Norman A. The induction of micronuclei in human lymphocytes by low doses of radiation.- Int. J. Radiat. Biol., 1987, V.52, No5, p.527-535.

51. Perry P., Wolff S. New Giemsa method for the differential staining of sister chromatids.- Nature (London), 1974,7Vo251, p. 156-161.

52. Pincu M., Bass D., Norman A.An improved micronuclear assay in lymphocytes.- Mutat. Res., 1984, M>139, p.61-68.

53. Prosser J.S., Moquet J.E., Lloyd D.C., Edwards A.A. Radiation induction of micronuclei in human lymphocytes.- Mutat. Res., 1988, No 199, p.37-45.88

54. Ramalho A., Sunjevaric I., Natarajan A.T. Use of the frequencies of micronuclei as quantitative indicators of X-ray-induced chromosomal aberrations in human peripheral blood lymphocytes: comparison of two methods.- Mutat. Res., 1988, NolOl, p.141-146.

55. Ruch R. An anomalous lymphocyte: possible diagnostic for exposure to ionizing radiation or radiomimetic agents.-An. J. Roentgenol. Radium. Therapy., 1964, No91, p. 192-201.

56. Savage J.R.K. A comment on the quantitative relationship between micronuclei and chromosomal aberrations.- Mutat. Res., 1988, No207, p.33-36.

57. Schmid W. The micronucleus test.- Mutat. Res., 1975,JV631, p.9-16.

58. Scott D., Evans H.J. Influence on the nucleolus on DNA synthesis and mitosis in Vicia faba.- Mutat. Res., 1967, JVo4, p.579-599.

59. Scott D., Lyons C.Y. Homogeneous sensitivity of human peripheral blood lymphocytes to radiation-induced chromosome damage.- Nature, 1979, iVo278, p.756-758.

60. Takahashi E., Hirai M., Tobari J., Utsugi T.- Radiation-induced chromosome aberrations in lymphocytes from man and crabeating monkey. The dose-responce relationships at low doses.- Mutat. Res., 1982, TVol, p.l 15-1233.

61. Thierens H., Vrai A., De Ridder Biological dosimetry using the micronucleus assay for lymphocytes: interindividual differences in dose response.- Health Physics, 1991, V.61,7Vo6, p.630-632.

62. Thoday J.M. The effect of ionizing radiation on the broad bean root.Chromosome breakage and the lethality of ionizing radiations to the root meristem.- Br. J. Radiol., 1951, V.24, No6, p.572-577.

63. Thomson E.J., Perry P.E. The identification of micronucleated chromosomes: a possible assay for aneuploidy.- Mutagenesis, 1988, V.3, No6, p.415-441.

64. Uchida I.A., Viola L., Byrnes E.M. Chromosome aberrations induced in vitro by low doses of radiation: Nondisjunction in lymphocytes of young adults. -Am. J. Hum. Genet., 1975, V.27, No5, p.419-429.

65. Vral A., Thierens H., De Ridder L. Study of dose rate and split dose effects on the in vitro micronucleus yieldin human lymphocytes exposed to X-ray.- Int. J. Radiat. Biol., 1992, V.61, No6, p.777-784.

66. Vral A., Verhaegen F., Thierens H., De Ridder L. Micronuclei induced by fast neutrons versus 60Co gamma rays in human peripheral blood lymphocytes.-Int. J. Radiat. Biol., 1994a, V.65, No2, p.321-328.

67. Vulpis N., Panetta G., Tognacci L. Radiation-induced chromosome aberrations in radiological protection. Dose-response curves at low dose levels. Int. J. Radiat. Biol., 1976, V.48, No6, p.595-600.

68. Wagner R, Schmid E., Bauchinger M. Application of conventional and FPG staining for the analysis of chromosome aberrations induced by low levels of dose in human lymphocytes.- Mutat. Res., 1983,7Vol09, p. 65-71.

Информация о работе

Михайлова, Галина Федоровна
кандидата биологических наук
Обнинск, 1998
ВАК 03.00.01

Диссертация

Бинуклеарный микроядерный метод: оценка возможности биологической индикации и дозиметрии радиационного поражения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы