Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бактерии рода AZOSPIRILLUM из ризосферы кукурузы и риса и их влияние на продуктивность растений

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Бактерии рода AZOSPIRILLUM из ризосферы кукурузы и риса и их влияние на продуктивность растений"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

ЭЛЬ-коми ХЕШАМ МОХАМЕД АБДАЛЛА

УДК 576.851.151:633

БАКТЕРИИ РОДА А205РШ1ЫЛт ИЗ РИЗОСФЕРЫ КУКУРУЗЫ И РИСА И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ПРОДУКТИВНОСТЬ РАСТЕНИЙ

Специальность: 03.00.07 — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург).

Научный руководитель — кандидат биологических наук., старший научный сотрудник Л. Ф. Васюк.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор М. М. Умароов; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Н. М. Макарова.

Ведущее учреждение -— Московская сельскохозяйственная ¡академия имени К. А. Тимирязева.

Защита диссертации состоится « -АС января 1993 г. в С час мин на заседании Специализированного совета К 020.26.01' по' присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620, г. Санкт-Петербург—Пушкин-6, шоссе Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « » 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

А. Н. Зарецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одна из наиболее вазишх проблем современного земледелия - разработка биологических основ высокоэффективных ресурсосберегающих: агротахнологиЯ, обеспечивающих расширенное воспроизводство плодородия почв и получение высоких, уогойчи-вых урожаев сельскохозяйственных культур. Интенсивное, применение больших доз дорогостоящих минеральных удобрений и химических средств эащиты позволяем увеличить урожайность растений, но часто приводи! х негатив'ньш последствиям - происходит* загрязнение окружающей среды, снижение качества сельскохозяйственной продукции. Именно поэтому во многих странах в настоящее время ставится вопрос о сокращении вносимых доз минеральных удобрений и изыскиваются путй мобилизации питательных элементов^ содержащихся в почве и атмосфере за счет применения препаратов на основе почвенных микроорганизмов. Все это выдвигает на первый план проблему обеспечения сельского хозяйства биологическим азотом за счет использования солнечной энергии. Применение ацетиленового метода в почвенно-микробиологи-ческих исследованиях позволило установить значительную роль ассоциативных азотфикоирущих микроорганизмов, способных к усвоению атмосферного азота в конганте с корнями растений ( oobereiner , 1978). Активные и эффективные штаммы этих бактерий способствуют увеличению уроаайносги важнейших сельскохозяйственных культур: пшеницы,, кукурузы, риса, проса, сорго, ячменя, кормовых трав, нетрадиционных корыовых культур, картофеля, сахарной свеклы, овощей ( Dart, 1936; Еицев с соавт., 1992; Пашка, 1992). Помимо увеличения урожайности применение ассоциативных азотфиксаторов способствует получению экологически чистой продукции. Установлено, что процесс азотфиксации.не является единственным фактором, определяющим повышение урожая. Большое влияние на развитие растений оказывают физиологически активные вещества, продуцируемые микроорганизмами, гормоны стимулирующего типа, способность к подавлению развития фитопатогзнных грибов.на корнях растений, улучшение минерального и водного обмена, повышение коэффициента использования минерального азота (Bashaa , 1992). Эффективность процесса ассоциативной азотфиксаций гораздо ниае, чем у бобово-ризобиальных систем, но ассоциативные диазотрофы распространены повсеместно на корнях широкого круга растений и их общий вклад в баланс азота значителен (Умаров, 1986).

Одним из' активных и эффективных компонентов природных ассоци-'аций микроорганизмов о небобовшш растениями являются бактерии рода Azospirillum , ш уделяется особенно большое внимание. За. последние года проведены опыты по инокуляции азоспириллами растений различных семейств, при этой установлены как положительные результаты, так и отсутствие эффекта.

Несмотря на значительное число публикаций еще мало известно о биологии ааоспирилл, специфике их взаимоотношений с видами и сортами растений. Поэтому сравнительное изучение азоспирилл, обитающих в ризосфере.различных генотипов растений на почвах различию: типов поможет получить дополнительные сведения об экологии этих микроорганизмов, выяснить некоторые механизмы их взаимодействия с высшими растениями.

• Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы было изучение штаммов азоспирилл, выделенных из почв и ризопланы кукурузы и риса, определение их родовой и видовой принадлежности, резистентности к антибиотикам, фунгистатической активности, нитрогеназной активности в чистых культурах и в ассоциациях с растениями,' приживаемости на корнях, эффективности в вегетационных и полевых опыта) В соответствии с целью были определены следующие задачи исследований;

- определить численность азоспирилл в образцах почв АРЕ, России, Молдовы, Венгрии, Болгарии из районов возделывания кукурузы и риса;

- выделить азоспириллы из почв и ризопланы кукурузы и риса при вы-• рацивании растений в стерильных микровегетационных опытах и провести первичный отбор.по величинам нитрогеназной активности la vitro}

- изучить фенотипические и гзносистематичеокие показатели изоля-тов, идентифицировать их;

- выяснить .влияние растительного экстракта и гйстидина на увеличение нитрогеназной активности in vitro 5

- определить фунгистатическую и пектиназнуи активность азоспирилл их резистентность к различным антибиотикам;

- исследовать влияние инокуляции азоспириллами на нитрогеназнув активность in situ , интенсивность "дыхания" листьев, активно-погловдщую поверхность корневой системы в различные сроки развитие растений в вегетационных опытах;

• установить влияние выделенных: штаммов азоопирилл на продуктивность растений в условиях вегетационных и полевых опытов.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное'изучение азо-:пирилл различного происхождения, выделенных из почв и ризопланы )иса и кукурузы, vitro и в ассоциациях с растениями. Лрздложе-ia методика определения нитрогеназной активности азоспирилл в чистых культурах при применении растительного экстракта 'для повышения 1Ктивиостя и з целях видовой дифференциации бактерий. Показана шзмоаность увеличения урожайности кукурузы и риса при инокуляции 'гомологичным;!" штаммами азоспирилл, интенсивности физиологических [роцессов в растениях и антавно-поглощаюцей поверхности корневой ¡истеки.

Практическая ценность. Выделенные штаммы азоспирилл будут ¡ключены в ооста'в коллекции ассоциативных диазотрос&ов ВНИИСХМ для [зльнейшего проведения с ними селекционно-генетических исследова-1ИЙ-. Результаты проведенной,работы могут служить микробиологичео-соЯ основой для решения практических вопросов, связанных с техно-югией возделывания кукурузы'я риса. Гак, например, более эф$ек-:ивна инокуляция штампами азоспирилл, изолированных из ризопланы этих же растений. По данный анализов вегетационных и полевых опытов отобраны наиболее эффективные штаммы, способствующие повышению грожая зеленой массы к зерна кукурузы различных сортов, возделыва-;ыых в Молдове и АРЕ, которые могут быть предложены для создания ¡иопрепаратоз.

Алробация'работы. Результаты работы докладывались на ежегодных юпирантских сессиях ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии и на ГШ Восточно-Европейской симпозиуме (Саратов, 1992).

Публикации. Ло материалам диссертации опубликованы 3 работы.

Объем работы. Диссертация состоит из введения* обзора литературы, главы "Материалы и методы", экспериментальной части, вклю-¡ающей 8 разделов, заключения» выводов и описка литературы. Рабо-:а напечатана на 169 страницах машинописного текста, содержит 25 ;аблиц, 7 рисунков, 4 фото. Список использованной литературы вклю-тет 306 источников, из них 60 - на русском языке.

СОДШАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований - .

Объектом изучения являлись азоспириллы,- выделенные- из I? об-)аацов почв различных эколого-геограйических зон, где культивиро-

■вались кукуруза я рис и ризолланы этих растений. Численность азоспирилл определяли иеходоы серийных разведений с последующим высевом на среду UN (Barber etal., 1976) « содержащую индикатор конго-рот С Eodriquesf-Caoeces, 19В2). Выделение азоспирилл из почв осуществляла после получения накопительных культур. Изоляций азоспирилл из риэоплаьы растений проводили ohoco6ou, разработанный во ВНЙИСХМ (Вас:ок с соавт., 1987). Призшваеиость азоопирилл на корнях кукурузы и риса изучали на средах о конго-рот в различные периоды развития растений на отмытых корнях. Величину нитрогеназ-ной (ацетпленвосстанавливающей) активности в чистых культурах микроорганизмов и в ризосфера растений (in situ ) определяли методой редукции ацетилена на гавовоы хроматографа (Balandreau et al.,19711 Бересхэцкий, Ваоюк, 1983). Культур ально-иорфологические и физиоло-го-биохишческае особенности выделенных штаммов изучали общепринятым тестами при использовании различных иетодических пособий и литературных источников (Практикуи по микробиологии под ред. Егорова, 1976; Методы почвенной микробиологии под ред. Звягинцева, 1Э86; Earrand et al. , 1978).

„ ДНК бактерий .выделяли по методу llapiiypa и по температуре плавления определяли ее нуклеотидный состав-(Мандель, Mapuyp, 1970). Для идентификации бактерий использовали 9-е издание определителя Берги { Bexgey's Uanuel of Systematic Bacteriology, 9-th Edition, T.,1, 1934). ■

Пекаинолитичвскую активность определяли при использовании морковного агара (Вербина, Цоцура, 1968) к ореды о пектином (Васок о ооавз., 1989).'

Сунгкстатическув активность азоспирилл исследовала методом агаровых блоков (Красильвиков, 1966). В качестве тест-объектов использовали 5 видов фиюпатогенных грабов рода Fuaariua и один вид фагоюксичнбго граба Peolotlllum canescens . На поверхность картофельной среды или сусло-агара, засеянных, аультураии грибов, помечали агаровые блоки 3-х суточных культур азоспирилл. Просмотр зон оюуготвяя роозга теот-обьекюв проводили через .3, 5, 7, 10 оуток. По диаметру зон судили о фунгистагической активности.

Для изучения чувствительности штампов азоопирилл к антибиотикам использовали метод отбора спонтанно возникающих мутантов.на среде с градиентом концентрации антибиотика от 0 до 100 мкг/мл.

'''Дыхание" лиогьев или потенциальный фотосинтез определяли на газовой хроматографе по выделению COg выоечкой листьев после ин-

кубации в течение I часа при температуре г7°С. (Методические реко-иендации ВН0ИОХЫ, 1935)."'

';. АМИвно-поглсдакауп поверхность корней исследовали при использовании метилеиовой оияи на фотоэлекгроколоркнетре ФЭК-26 по методу Колосова (Малийпрактикум по Физиологии растений, 1983).

Вегетационные спытылроводшш а гегоЩе с кукурузой гибридов Пионер и Гиза-2 а риооы сорта.Дубовояий 129. Растения' выращивали на пеоке в сооудахемкосгью 800 ил, рио - й уояовиях затопления. Для питания растений использовали сиесь йрянишниковас добавлением иикроэлевентов й дробныа внесением- 0,5 дозы азота. Инокуляцию осуществляли штаммаяи в стационарной фазе роста на среде ДАС (Берес-тецкий о соавт., 1985) из расчета 1-10 ют клеток на сэия. П-овтор-норть опыта * б-ти кратная,

. Полевой опыт бил поставлен'в АРЕ йа экспериментальной базе Университета В г.Эль-Миньяо Гибридом Гиза-2, йлодадь опытной делянки - I и2, повторное»* - 4-х кратная, почва участка - оазисная аллювиальная, д'оэыг вносимых минеральных удобрений - из расчета

,250р70 на га< • '

Полевой опыт о кукурузой (гибриды Пионер и М-411) был 8ало*ен

в Молдове на базе НИЛ полевых культур (¿«Бельцы), размер опытной делянки — 14 и^, повторное« - 3-х красная, почва учаотка - черно-зеи обыкновенный тяжелооуглинистнй, дойн мияаралвнше удобрений -1^?60к60 . Азоспирйллы вносили из расчета 1-10, ¿гая клеток аа оеия.

В вегетационных и полевых опытах учитывали величины зеленой насоы, зерна, копией, накопления азота» Содержание ааотй в растениях определяли методом Кьельдаля на приборе "ЦеГЬеь-аи-Ъо",

Экспериментальные данные были обработаны математически при применении дисперсионного и корреляционного анализа (Доопехов, 1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И Ж ОБСУЖДЕНИЕ

I. Численность аэоопйрллл в образцах почв различных -эколого-географических зон Наиболее благоприятные условия для процесса ассоциативной азотфикоации складываются в почвах рисовйиков, но, вместе о тем, количество корневых экссудатов в ризосфере кукурузы значительно■ больше, чей в ризосфере риса* т.к. кукуруза относится к растения« с С^ типом фотосинтеза. В связи о поставленными задачами были отобраны образцы почв о 17 полей различных стран, где культивировались кукуруза и рис. Изучаемые почвы отличались как по генезису,

1&к и величинами рН, содержанием общего и ниграгного азота. По данным таблицы I видно, что & большинстве образцов численность азоспирилл в почвах, где выращивали рис, бала выше, чей в почвах под кукурузой, хотя число клеток этих бактерий было относительно низкий по сравнению с общий количвствоидругих микроорганизмов на среде, ш (<1 ]&). Более высоким показателями отличались некоторм почвы АРЕ, России» Болгарии. Очень мало азослирилл обнаружено в лочзе Молдовы. Какой-либо эавиоиыооти'меаду численность*) азосли-рюш, типоц почвы и агрохииичеокиыи локазателяыи не установлено.

Таблица I

Чиолеякссгь азослирилл в почвах различных аколого-географическихаон

Рис

Кукуруза

еыыа рас- индексы количество еиые рао- индексы количество

тения образцов азоспирилл теаия образцов азоолирилл

почв 1ЫО.ВЛ/Г почз гые.кл/г

Стэаны почвы Страны почвы

АРЕ Д, 18,7 1РЕ 8,7

. Я2 •: 18,7 н 7,3

Е3 5,3 н 7,3

В4 5,3 \ ' 14,7

»<5 " 21,3 н 18,0

8»? ч 4,7 .

«7 10,0

Россия К? . 18,0 Молдова Ыо . 1,3

Венгрия н ' 7,3

Болгария Вч 18,0

2. Выделение азосгшрилл из почв и рйэопланы растений Выделение ааоопирилл из образцов почв проводили о испольэова-киеи метода накопительных культур, длительность инкубации зависел от численности бактерий, изучаемой группы в почвенной образце и колебалась от I до 2-х недель. Азосяириллы были выделены из всех образцов почв АРЕ, Венгрии, Болгарии, не удалось изолировать азо-опирилди на образцов почв Роосии и IIолдовы. Колонии азоспирилл не агаризб&еишой орзде ,Ш отбирали по признакам, характерным для

этих микроорганизмов - форме, консистенции наличию в некоторых злучаях розового пигмента» Бактерии, изолированные ив почв АРЕ, того отличались по характеру колоний от типичных ¡«таймов азоспирилл - они были более мелкие, суховатые, не Образовывали розового тигмента. ' . ,

Из ризопланы растений азоог.иряллы были выделены при обработке проростков всеми исследуемыми почвами. В меньшем количестве азо-зпириллы населяли корни риса' при обработке почтами АРЕ. И в этом злучае по характеру колоний азоспириллы ризопланы риса и кукурузы отличались от колоний типовых штаммов.

Всего было изолировано 105 штаммов^ для дальнейших исследовав яий оставлено 24. Азоспириллы, выделенные из почв, получили ■буквенные индексы, выделенные из ризопланы - числовые индексы.

, • 3. Фенотипическив и геносиотематичёокиа показатели штаммов азоспирилл ' На основании изучения кулыгурально-морфологических признаков, а также физиолого-биохимических свойств, у 24 штаммов, таких как наличие окислительного или бродильного типа метаболизма, рост с аминокислотами как единственным источником углерода й .азота, синтез спиробантина, образование кислот из'сахароВ, редукция нитратов и нитритов, гидролиз крахмала, и желатины и др., выделенные микроорганизмы были отнесены к роду А.гоар1гШшп , двум его видам 1аозр.ъ??,аз11впав и Агозр.Нро1егищ . Все штаммы бактерий I группы, 5лизких к А.ЬгазИепзе , мало отличались от типового штамма А.Ьга-зИепзе Вр7 » За исключением штата гб/2., способного к разжижению келатины. 2-ая группа штаммов, близких ал 1ро£егит , оказалась бо-нее гетерогенной," одни из них проявляли признаки как А.ЬгааНеаво, гак и А,11ро£егшй , другие обладали ферментативной активностью по отношению к желатине, крахмалу, что не является характерным для азоспирилл. Штаьшы с измененными свойствами отличались и нетипич-выми формами колоний, как уже упоминалось ранее. По остальным признакам - росту в присутствии биотина или,дрожжевого экстракта, £орме и характеру движения клетки, использованию солей органических кислот и др.признакам, эти штампы были близки аэоспириллам.. 3 принадлежности к этой группе.бактерий свидетельствует а содержание ГЦ-пар в ДНК выделенных штаммов С.табя. 2). Температура плавления всех образцов ДНК находилась.в пределах.97,7-99,1°С, что соответствовало, содержанию ГЦ-пар 69,3-73,0 мол.Эти Данные подт-

верждают принадлежность исследуемых бактерий к роду ¿gospiriuun.

" .Таблица 2

Состав ДНК выделенных ааорвдфилл Штаты reiajepajjrpa ллевлевмя Ноя* 51 ГЦ-пар (t I %)

, , .,! ,. . И.1.: ,;;•„,-."■■ С /,, -,, •

Ж.ЬхазИепзе Бр? МД - 70,1

3/3 99,2 73,0

4/2 97,7 69,3

6/1 . 98,2 70,5

6/5 . 90,4' 71,0

В2/2 93,1 70,4

В5/2. 98,1 70,1

Z6/2 '' 99,2 73,0

A.lipoferum 137 98,3 70,5

11/2 97,7 . 69,3

11/3 57,8 69,5

12/5 97,8 69,5

•19/6 * •■ 97,9 69,9

20/2 98,1 70,2

й?/1 99,0 . 72,4

4. Нитрогенааная активность ааоспирилл в. чистых

• symypax;

Нитрсгаваэная активность, определенная у выделенных щташов азоспирилл, колебалась 8 внроках пределах. Так, у азоспирилл, Слизких A.braatlense ^ активное« менялась от 300 до 1500 пИ эти-лена/чао/фл} у азсслирилл груши A.lipoferun - от 1,0 до 170 пМ ; этилена. По нашему мнению, ниакая натрогеназнаа активность обу- • оловлена отсутегвиви г среде факюров, способствующих проявлению ■ активном« у бактерий, находящихся в тесных ассоциативных отноиа-ннях о растениями. йагеатно, что нитрогеназная активность у ааоопи-рилл индуцируется яекхином паеницы, обнаруженным г корнях проростков растенийДАнгонвк о ооавг. , 1992). В наших исследованиях был использован экстракт кукуруз», добавленный в среду Ш . Предварительно была проведена нет одическая работа по подбору Доз вносимого экстракта и времени инкубации, В дальнейшей работе нитрогеназная активность la vitro была определена у 24 итаммов аэоопирилл с добавлением к среде пи 0,1 ил 10 % растительного экстракта при ин-

кубации часа. Результаты опытов показали, что у штаммов, близких A.brasilense ( нитрогеиазная активность повышаласьпри добавлении экстракта в 1,5*-3 раза, в то время как у ааоспщмлл, близких ¿.llpoierum , активность резко возрастала в 7-18 раз. Применение растительного экстракта поэволгао разделить выделенные штампы азосшгрилл нэ на 2, а на. 3 группы. В оосгав J-ей группы ВОШЛИ ИЗОЛЯТЫ как вида A.braslleflse , так й вида A.lipoferua «являющиеся измененными формами азоспирилл со слабой нитрогеназной активностью, которая не изменялась при. добавлении экстракта.

Дополнительным признаком, которые может быть использован для такооиЬиической характерио^йки азрслирялл, является орошение в аминокислоте ь-гастидаку у различных видов этих бактерий (Hartmann. et ai 1983). Результат анализа показали, что внесение в среду од 10аИ ' - ь -гистядина озииуляроваяо нитрогеназнуа активность и увеличивало биомассу изолятов, стсяодхоя К группе А.ьга-stlense , в то же время ингибировало развитием активноств штаммов A.lipoferma. ■,

5. Неполитическая и фунгиотатическая активность аэоспирилл '••'.'

Влияние ааоспирилл на активность обменных процессов в растениях во многом зависят отскОростя проникновения бактерий л ткана корня. So время инфицирования корней важную роль играю; лектолити-ческие ферменты, в частности, пектинмвгилоогераза. Как показали анализы, пеминиегалаотеравкая актявностъвыявлеиа у большинства штаммов группы Ji.brastlenae , зоны гидролиза пектина по размеру были близки йа 2-х исвдтуемых средах. Только у б штаммов из 14 группы A.lipoferua удалооь обнаружить наличие пеминиетилэотеразы и лишь ка среде о шиивоя.

.Положительный эффект азоопиршш определяется также их антагонистическим действием по отношении к фитопатогенным грибам. При определении фунгистатичеокой активнооти иоолэдуеиых штаммов аэоспирилл по отношению к 5 грибаы-фитойаао'генам и одаому фятотоксич-ному грибу било установлено, что все изучаемые штаммы подавляли poor грибов, хогЛ и а равной степени; Не обнаружено корреляции между фунгистахической акаивноегью и видовой принадлежностью аэоспирилл, различия кабтшдаййсь скорее на уровне иамиов. Наиболее чувствительными тест-объектами были PeniclLlium' canesceaa и Fusarium grami^earam , зоны подавления роста грибов достигали 11-12 мм.

б..Чувствительность азоспирилл к различным антибиотикам

Для опр^ления чувствительности азоспирилл к антибиотикам .были иопользоЬаны рифампицин, стрептомицин, хлорамфеникол и ампициллин, обладающие широкий спектром действия. Из полученных данных (табл. 3) иозшо сделать вывод о том, что выделенные штаммы обладали различной степенью чувствительности к антибактериальный'препаратам, йзоляты, отнесенные 1: А.11ро£егит , оказались более устойчивыми, чем йзоляты, отнеоенные к А.ЬгазИепзе . У последних наблюдалась высокая чувствительность к рифампицину и стрептомицину. На фоне исследуемых 24 шташов выделяются штаммы 26/2 А.ЬгазИеп-зц 3/2 и 20/2 А.Ирогехша, у которых отпечена комплексная резистентность к максимальным концентрациям всех используемых антибиотиков так, как для большинства азоспирилл такая устойчивость не является характерной, то природа ее, вероятно, связана с наличием у данных итоымов полирезистенгной к-плазииды. Необходимо отметить, что шташы 26/2 , 8/2 и 20/2 относятся к 3-ей группе изолятов, характеризующихся слабой нитрогеназной активностью, более мелкими 'суховагмш колониями и измененной фэнментагивной активностью. Ко-вффицизнт корреляций между показателями нигрогеназной активности и резиогенхностк к антибиотикам был равен г - 0,55.

Интересно отметить, что антибиотикоустойчивые штаммы обнаружены в почвах АРЕ, характеризующихся высокими величинами рН, значительным содержанием нитратного азота с. высокими дозами применяемых минеральных.удобрений (200-300 кг/га).

-?. Активность и эффективность азоспирилл в ассоциациях с ранениями в условиях вегетационных и полевых опытов

Для'оценки влияния выделенных штаммов азоспирилл на продуктивность и активность физиологических процессов растений были отобраны 12 штаммов, изолированных, из почв й ризопланы кукурузы и 9 втаммов, выделенных из почв рисовников и ризопланы риса. Инокуляция риса и 2-х гибридов кукурузы проводилась только "гомологичными" штаммами. Определение численности интродуцированных азоспирилл на корнях растений через 20, 40 и 60 суток показало, что бактерии хорошо приживаются в корневой зоне, достигая десятков млн клеток в г корня через 40 дней при испытании штаммов ризопланы 12/5 А.11-рогегшп у кукурузы и 4/2 А.ЪгааШпае у риса. Численность азоспирилл, изолированных из почв, была несколько ниже.

В период вегетации растений триады у 2-х гибридов кукурузы и .

■ ■ 1С

Таблица 3

Спектр чувствительности н антибиотика« штампов ааоспирилл •

Индексы Azospirillum braaileuse Azospirilium lipoferum шт auu OB ___

Антибиотики Bp? 3/3 6/1 6/6 26/2 22/2 137 8/2 11/2 12/5 15/3 20/2 2V1 КЗ/1 B6/1

(100 15ЕГ/Ш1

среды)

Рифзшшцин • ± - - . + ± - + + ± + + + +

Стрептомицин + _ - + - - + + - + + + + +

Хлораибеникол ± -' - • + + + +• + + + + + - +

Ампициллин +• t + + + + + + + + + + + + + +

Условные обозначения: (+} - хороший, рост} (i) - рост отдельных копаний; (-) - отсутствие роста

риоа била определена иитрогеназная активность на интактных растениях. Для исследования активности были выбраны те же варианты, которые иопользовалиоь.для изучения приживаемости азоспирилл. Данные , анализов свидетельствуют о низкой нитрогеназной активности в разо-. сфере контрольных растений и о резком ее возрастании при внеоении азоопирилл. Если количество азоспирилл на корнях растений опытных вариантов было близким у кукурузы и риса, то нитрогеназная активность гибрида Пионер была в 4-5 раз выше, чем у гибрида Гиза-2. Максимум активности был зафиксирован на 45 сутки после постановки опыта и достигал 5 хио. п!,! этилена/сут/сосуд. Наиболее высокой активностью характеризовались растения, инокулированные штаммом 12/5 i.Hpoferdte у обоих гибридов кукурузы. Менее высокая активность (3,5 тыс. Ш С^Н^/оуг/сосуд) наблюдалась в ассоциации кукурузы со

. штаммом Z6/.2 i.braaiiense , отличавшмся слабой нитрогеназной активностью в чистых культурах.

Определение нитрогеназной активности in eitu у риса позволило установить наиболее высокую активность, превыиащую .активность у кукурузы - растений, инокулированных также штаммами ризопланы.

Ответная реакция растений на инокуляцию азослириллами проявилась не только в повышении активности процесса ассоциативной азот-фиксации,' влияние бактерий сказалось и на интенсивности ''дыхания" листьев (потенциальном фотосинтезе). "Дыхание" листьев, определенное трижды в течение вегетации.растений, выявило гораздо большие величины выделения COg (в десятка раз) у кукурузы по сравнению с рисом* Активность "дыхания" листьев под действием инокуляции у кукурузы возросла в 3-4 раза через 1,5 месяца* менее заметно у риса и. только в'начальный период развития растений.

Интенсивность поглощения элементов питания и воды из почвы за' висит от размеров- площади активно-поглощаюдей поверхности корневой системы. На основании,результатов проведенных анализов можно отметить, -что под влиянием инокуляции штаммами азоспирилл происходит несомненное увеличение активно-поглощающей поверхности у раса и кукурузы через 45 суток после, постановки опыта,, особенно в вариантах с инокуляцией штаммом Z6/2 A.brasileaäe . Можно отметить, что активно-поглощающая поверхность корневой системы риса была несколько больше, чем у кукурузы. Штаммы азоспирилл, выделенные из ризопланы и почвы проявляли одинаковую активность.

Таким образом, выделенные итаммы азоспирилл, хорощо прияившие-

•ся на корнях кукурузы и риса, сказали заметное влияние на физиологические процессы, происходящие в растениях - повысилась активность ассоциативной азотфиксации, интенсивность потенциального фотосинтеза, кроме того возросла площадь активно-поглощающей поверхности. Все это не могло не сказаться на повышении продуктивности растений. Инокуляция азоспириллаии 2-х гибридов кукурузы и риса в условиях вегетационных опытов, проводившихся в течение 2-х лет, выявила позитивное действие бактерий: произошло увеличение вегетативной массы, содержания общего азота.

Испытание. 12 штаммов азоспирилл в 1-ом вегетационном опыте о кукурузой гибрида Пионер показало, что все штаммы эффективно взаимодействуют о растениями, способствуя увеличению надземной'цаосы на 13-32 % и массы корней на 10-37,8 %. Более высокие прибавки были получены о азоспириллаии ризопланы. Как среди азослирилл почв, так и среди азоспирилл ризопланы встречались бактерии, инокуляция которыми приводила к повышению содержания азота в растениях с 0,66 % в контроле до 0,77 % при инокуляции. Во 2-ом вегетационном опыте о кукурузой било проведено сравнение эффективности азоспирилл с двумя гибридами кукурузы - Пионер и Гиза-2, По результатам опыта видно , что более высокая отзывчивость на инокуляции наблюдалась у гибрида Пионер, как и более высокая нигрогеназная активность 1п аЗ/Ьи. в ассоциациях о двумя гибридами кукурузы лучшие результаты показал штамм 12/5 А.11ро£егиш.

В первом вегетационном опыте о рисом инокуляция была проведена 9 шташани азоспирилл. Влияние бактерий сказалось положительно только на увеличении массы корней и особенно на повышении содержания в них азота, благодаря чему накопление азота возросло в корнях растений опытных вариантов на 70-169

. Во втором вегетационном опыте с рисом 6 штаммов азослирилл иэ 9 испытуемых способствовали увеличению урожая зеленой массы растений на 13,8-24,5 % и все штаммы без исключения повысили накопление азота от 24 % до 46 в основном за счет увеличения содержа- ' ния общего азота (табл. 4).

Наиболее эффективные штаммы встречались "как среди азоспирилл почв, так и среди азоспирилл ризопланы - это В5/2, 4/2 1.Ьгаа1-1епае а Й6/3 А.11ро£егит.

На основании результатов 2-х вегетационных-опытов был проведен корреляционный анализ зависимости накопления азота в вегетативной массе растений и величинам его определяющими - размером

■биомассы и'содержанием азота. Коэффициент корреляции свидетельствует, что интенсивное накопление азота в надземной ыассе и корнях риса происходило^ или за счет равномерного возрастания обеих величин, или за счет большего увеличения содержания азота. У кукурузы преобладающее влияние на накопление азота оказывало увеличение надземной иассы.

Таблица 4.

Эффективность инокуляции риса сорта Дубовокий 128 штаммами-азоспиршм в .вегетационном опыте

Варианты Урожай сухой Отклонение Общий Накопление'Отклонение

инокуляции надземной от конгро- азот, азота, от контроля,

(индекс * массы, ля, % иг/сосуд % .

штатов) г/сосуд

Контроль ■ 2,32 0,70 16,2' _

(без иноку-

ляции)

В2/2 2,57 10,7 0,79 20,3 25,3

R5/2 2,89 24,5 .0,77 22,2 37,0

R6/3 2,64 13,8 0,78 20,3 25,3

1/6 . 2,57 10,8 0,79 ■ 20,1 24,1

з/з 2,57 10,8 0,88 22,6 39,5

4/2 2,69 15,9 0,88 23,7 46,3

6/5 2,67 15,1 0,83 22,2 37,0

6/6 2,68 15,5 0,83 22,3 37,7

8/2 ' 2,77 19,4 0,82 22,7 40,1

нср05 0,27г 2,15мг

Отбор штаммов аэоспирллл в условиях вегетационных опытов с песчаными культурами не давал возможности судить о той, будет ли эффективность штаыма повторяться при'внесении его в почву. С этой целью были поставлены полевые деляночные опыты в АРЗ с гибридом кукурузы Гиза-2 и в Иолдове с гибридами Пионер и M-4II. В АРЕ инокуляция' семян при посеве была проведена штампами II/6, 12/5 A.lipoferum и н5/2 i..bi-Esilense . Первые два штамма изолированы из ризопланы кукурузы, последний из почвы рисовников. Все испытуемые. штаммы показали хорошие результаты в вегетационном опыте. Для сравнения в опыте испытывали препараты ассоциативных азогфиксато-роз - флавобактерия и мизорпн. По результатам опыта можно отметить, что все испытуемые ытаьшы к препараты способствовали досто-

верному увеличении урожая сухой зеленой массы кукурузы в условиях АРЕ. Прибавки урожая достигали 23-29 % Различия по вариантам проявились более резко при анализе содержания "сырого" белка в растениях, равного у растений контрольного варианта - 14,25 % и достигающего 16,0 % и lb, 0 % под влиянием инокуляции миэорином и штаммами II/S и 12/5. В урожае кукурузы отмеченных вариантов достоверно повысилось накопление "сырого" белка на 50,6; 46,9 и 63,9 % соответственно.

■ Во втором полевом опыте, проведенном в Молдове, были пойманы 2 штамма азоспирилл - 12/5 A.lipoferum и 26/2 A.brasilense одновременно с гремя препаратами - флавобактерином, мизорином и азоризином. Как показали результаты опыта, под влиянием инокуляции достоверно возрос урожай зеленой массы кукурузы гибрида M-4II на 4,6-15,9 % Наибольшую эффективность проявили штаммы 12/5, Z6/2 и препарат мнзорин. Урожай зерна в опыте с гибридом Пионер достоверно увеличился только в двух вариантах - при инокуляции штаммом Z6/2 и ыазорявоц на 5,0 %

Результаты, полученные при проведении вегетационных и полевых опытов, еще раз подтверждают положение о сп'ецифичновти взаимодействия азоспирилл различного происхождения с разными генотипами растений.

ВЫВОДЫ

1. В образцах почв различных зколого-географических зон (АРЕ, Россия, Молдова, Венгрия, Болгария), где выращивали рис и кукурузу', определена численность бактерий рода Azospirillum . Показано преобладающее количество азоспирилл в почвах рисовников.

2. Из почв и ризоплайьг растений выделено 100 и изучено 24 штамма, которые на основании .фенотипичеоких, геносисгематических показателей, данных пентиназной активности отнесены к двум видам -Azoap.braailenaa И Azosp.ltpofегиш.

3. Для повышения нитрогеназной активности в чистых культурах и в целях видовой дифференциаций азоспирилл предлоязно применение растительного экстракта. Штаммы вида А.ЬгвзИепзе увеличивали активность в 1,5-2,1 раза, вида A.lipoferum - в 8-18 раз.

4. В почвах районов интенсивного применения пестицидов и минеральных удобрений АРЕ обнаружены изолягы, отличающиеся от типовых штаммов азоспирилл некоторыми кульгурально-физиологическими признаки, комплексной устойчивостью к антибиотикам и слабой нитрогеназной активностью in vitro.

5. Показано, что изучаемые штаммы азоспирилл не только способны к

• усвоении атмосферного азота, но и проявляют фунгистатическую

активность, влияют на интенсивность физиологических процессов в растениях, повышают величину актизно-поглощающей поверхности корней, что приводит к увеличению вегетативной массы и содержания общего азота у растений.

6. Специфичность взаимодействия азоспирилл с резко различными генотипами растений. - кукурузой и рцром - проявилась в большем влиянии инокуляции на содержание азота в вегетативной массе ри-

. са и увеличении надземной массы у кукурузы.

7. В двух полевых опытах о кукурузой гибридов Пионер, M-4II в Молдове »Гиза-2 в АРЕ проведено определение сравнительной еффек-тивности азоспирилл о препаратами ассоциативных диазотрофов, созданных во В1ШИСХМ - флавобактерином и мизорином. Шташы 12/5 A.llpoferum и Z6/2 A.brasllense оказали положительное влияние на урокай кукурузы, что было адекватно или превышало действие ыизорина.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Зль-Хсмл Х.И.А, Азослиряллы ризосферы риса и их влияние на био. массу растений.)УБкшетень ВНШСХЫ, 1991, 1й 54, с. 30-31.

2. Васюк Л.Ф., Эль-Коми Х.М.А., Хальчицкий А.Е. Азоспириллы ризосферы кукурузы и их влияние на продуктивность растений.¡Г/Бад-

. летонь вкииош, 1991, № 54, с. 26-29.

J. Vassuylc Lyudaila, Bl-Komу Hesham, Khalchitslcii Andrei, Fopova Tamarai' and. Tchebotar Vladimir. Azospirillum bacteria aa an in- . dicator of soil pollution.//Vlll-th Eastern Europe Syapoaium ■ on biological Kitr6gen fixation, iiitrogenfix-92. 22-26 September, 1992. 1992. Abstracts. Saratov. P.58«

РТП. Тип.В2P . Ca::. J3 5. Тлр. ICQ.