Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ассоциативные бактерии Agrobacterium tumefaciens ризопланы овощных культур Вьетнама

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Ассоциативные бактерии Agrobacterium tumefaciens ризопланы овощных культур Вьетнама"

На правах рукописи

ФУНГ тхи ми

АССОЦИАТИВНЫЕ БАКТЕРИИ А СЛОВА СТЕШиМ ТиМЕРАС1Е№ РИЗОПЛАНЫ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР ВЬЕТНАМА

Специальность 03.02.03 - микробиологии

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005569590

3 ИЮН 2015

Москва-2015

005569590

Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Емцев Всеволод Тихонович, доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии и иммунологии ФГБОУ ВО РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева Умаров Марат Мутагарович, доктор биологических наук, профессор кафедры биологии почв факультета почвоведения ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова»

Благовещенская Генриетта Германовна,

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории агрохимии минерального и биологического азота ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт агрохимии имени Д.Н. Прянишникова»

ФГБНУ«Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии»

Защита диссертации состоится «2» июля 2015г. в 11 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д. 220.043.03 на базе ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева» по адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 19, тел/фак 8(499)976-21-84, email: dissovet@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова ФГБОУ ВО РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева на сайте университета www.timacad.ru

Автореферат разослан "_" мая 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Селицкая Ольга Валентиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия число исследований, посвященных ассоциативным азотфиксирующим бактериям, существенно выросло, так как эти бактерии, обитая па корнях растений, не только улучшают их азотное питание, но синтезируют регуляторы роста растений, а также обеспечивают защиту от фитопатогенов, чем способствуют адаптации растений к стрессовым факторам. Во Вьетнаме микробиологические удобрения изучаются с 60-х годов. Однако объём производства микробных биопрепаратов во Вьетнаме все еще не достаточен для удовлетворения практических потребностей сельского хозяйства. Поэтому особое внимание уделяется поиску новых культур микроорганизмов, перспективных для создания новых биопрепаратов, в том числе и полученных на основе ассоциативных бактерий, способных расти на корнях растений и обеспечивать их атмосферным азотом.

К ассоциативным бактериям относят представителей таких родов, как Azospirillum, Enterobacter, Erwinia, Serratia, Alcaligenes, Arthobacter, Acinetobacter, Flavobacterium и Agrobacterium и др. С момента открытия Agrobacterium tumefaciens известно, что эта бактерия является возбудителем корневого рака (Smith, Townsend, 1907), и патогенна для растений (El-Fiki, Giles, 1981). Их патогенность обусловлена наличием Ti-плазмиды, которая способна встраиваться в ядерную ДНК растительных клеток, вызывая их неупорядоченный рост и неконтролируемый синтез опинов, которые служат источником питания для бактерий. Уникальная способность А. tumefaciens трансформировать геном растений в настоящее время широко используется в генной инженерии (Wood, 2001). Это направление исследований приковало к себе внимание ученых, тогда как работ в области экологии А. tumefaciens на данный момент проведено недостаточно. В 1990 году Л. Канвинде и Г.Р.К. Састри показали, что А. tumefaciens может фиксировать атмосферный азот (Kanvinde, Sastry, 1990), однако систематических исследований по изучению потенциала А. tumefaciens как азотфиксатора с тех пор не проводилось. Следовательно, изучение этого организма, обитающего в ризоплане растений, является в настоящий момент интересным и практически важным.

Данная работа была проделана на образцах из Вьетнама, где давно проводятся исследования по выделению бактерий из ризопланы риса, арахиса, кофе, кукурузы и других растений. Однако, изучение азотфиксаторов в ризоплане овощных культур ранее здесь не проводилось, в связи с чем исследования в данной области являются актуальными.

Цель работы состоит в исследовании бактериального населения ризопланы таких овощных культур как водяной шпинат (Ipomoea aquatica) и разнолистная капуста (Brassica integrifolia), выращиваемых в условиях Вьетнама, а также поиск наиболее активных ассоциативных азотфиксаторов, оказывающих наибольшее стимулирующее влияние на развитие культурных растений. Такие микроорганизмы перспективны в плане использования их для создания бактериальных удобрений.

Для релизации поставленой цели в ходе исследования решались следующие задачи:

1. Отобрать образцы корней овощных культур Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia, выращиваемых на почвах Вьетнама.

2. Получить накопительные культуры азотфиксирующих бактерий из ризопланы овощных культур Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia.

3. Определить азотфиксирующую активность полученных накопительных культур.

4. Выделить чистые культуры диазотрофов из накопительных культур, которые показали наиболее высокую азотфиксирующую активность.

5. Провести сравнительную оценку азотфиксирующей активности полученных чистых культур.

6. Определить ростактивирующий эффект чистых культур ассоциативных диазотрофов, показавщих наиболее высокую азотфиксирующую активность.

7. Исследовать влияние чистых культур ассоциативных диазотрофов, показавщих наиболее высокий ростактивирующий эффект, на растение (огурец и разнолистная капуста) в условиях модельного опыта.

8. Изучить морфологические и физиолого-биохимические особенности выделенных чистых культур ассоциативных азотфиксаторов, показавщих самое хорошое влияние на растения в модельном опыте.

9. Определить филогенетическое положение выделенных чистых ассоциативных азотфиксаторов.

10. Изучить влияние разных чистых культур ассоциативных азотфиксаторов на урожай огурца и разнолистной капусты в мелкоделяночном опыте в условиях теплицы.

Научная новизна исследования. Впервые выделены культуры азотфиксирующих бактерий из ризопланы овощных растений Вьетнама. Изучение нитрогеназной активности полученных изолятов показало, что 227 выделенных культур обладают данной способностью, причем многие штаммы этих бактерий характеризуются довольно высоким уровнем связывания азота. Культуры не только проявляли азотфиксирующую

активность, но и оказывали положительный ростовой эффект на растения в условиях модельных и вегетационных опытов, причем инокуляция ими не вызывала изменения обыкновенной структуры корней растений. Определение филогенетического положения выделенных штаммов на основашш секвенирования гена 16S рРНК показало, что они принадлежат к семейству Rhizobiaceae филогенетической группы Alphaproteobacteria и наиболее близки к типовому штамму рода Agrobacterium —А. tumefaciens. По физиолого-биохимическим признакам эти организмы также отнесены к А. tumefaciens. Выделенные нами штаммы данного вида бактерий, известного как фитопатоген, выступают в качестве ассоциативных азотфиксаторов и, более того, оказывают положительный эффект на рост и развитие сельскохозяйственных культур.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты исследований показали, что ассоциативные бактерии Agrobacterium tumefaciens являются весьма перспективными для создания новых высокоактивных биопрепаратов, полученных на основе бактерий, способных расти на корнях растений и обеспечивать их атмосферным азотом, а также оказывать положительный ростовой эффект. Это весьма важно для Вьетнама, так как объем производства микробных удобрений во Вьетнаме все еще недостаточен для удовлетворения потребностей сельского хозяйства.

Результаты работы могут быть использованы в учебных курсах по микробиологии, биотехнологии и почвоведения в высших учебных заведениях.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Среди ассоциативных азотфиксирующих бактерий в ризоплане тропических овощных культур водяного шпината {Ipomoea aqaatica) и разнолистной капусты (Brassica integrifolia) наибольшей активностью обладают представители семейства Rhizobiaceae, отнесенные на основашш анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК и физиолого-биохимических особенностей к Agrobacterium tumefaciens.

2. Штаммы Agrobacterium tumefaciens, известного как фитопатоген, выделенные из ризопланы разнолистной капусты и водяного шпината, выступают в качестве ассоциативных азотфиксаторов и оказывают положительный эффект на рост и развитие культурных растений.

3. Положительное влияние Agrobacterium tumefaciens на разнолистную капусту и огурцы, установленное в условиях модельных стерильных опытов и опытов в производственных условиях, обусловлено улучшением азотного питания растений и способностью к биосинтезу регуляторов роста.

Степень достоверности. Достоверность результатов исследования подтверждена значительным экспериментальным материалом, использованием стандартных методик получения и обработки информации, применяемые в биологии и математической статистике (Statistica 5.5, Excel Microsoft Office 2010).

Личный вклад автора. В диссертации изложены результаты работ, выполненных автором в течение 3 лет. Личный вклад в диссертационную работу заключается в участии и постановке задач исследований, в проведении экспериментов, в обсуждении и обработке результатов, в формулировании основных выводов и подготовке публикаций.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях кафедры микробиологии и иммунологии, и международных научных конференциях: Международная научная конференция молодых учёных и специалистов, посвященная созданию объединённого аграрного вуза (Москва, РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, 3 - 4 июня 2014); XXI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов - 2014" (Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, 7-11 апреля 2014) (диплом за I место на секции «Биология почв», диплом за лучший доклад на факультете почвоведения).

Публикации. Основные результаты и положения работы опубликованы в 3 печатных работах, в том числе 2 статьи - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 115 страницах и состоит из введения, 8 глав, включая обзор литературы; характеристику объектов и методов, используемых в опыте; анализ результатов исследований; выводы; список использованной литературы, приложение. Библиографический список включает 193 наименований, в том числе 125 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 40 рисунками.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. Н.А. Манучаровой, доценту кафедры биологии почв МГУ за консультации по идентификации выделенных бактерий и к.б.н. JI.A. Позднякову, сотруднику кафедры биологии почв МГУ за помощь при определении активности азотфиксации азота и консультации. Автор благодарен генеральному директору ООО "Селекционная станция имени Н.Н. Тимофеева", к.с.-х.н. Г.Ф. Монахосу и заведующему лабораторией защиты растений РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, д.б.н. Джалилову Ф.С. за предоставленную возможность проведения мелкоделяночных опытов в производственных условиях. Автор также признателен всему коллективу кафедры

микробиологии и иммуиолопга РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева за помощь и поддержку.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

Ассоциативные азотфиксирующие бактерии относятся к различным систематическим группам, широко распространёных в природе, причем место их обитания — корневая система растений. Обитание на корнях (ризосфера, ризоплана) обусловлено сложными взаимодействиями типа ассоциатиного симбиоза. При благоприятных условиях в ассоциации, бактерии активно размножаются, фиксируют азот и синтезируют ростактивпрующие вещества, что положительно сказывается на растениях. Эти микроорганизмы нашли практическое использование в качестве бактериальных удобрений. Ризосфера растений, произрастающих во Вьетнаме, расположенном в зонах тропического и субтропического климата, является благоприятной средой для обитания разнообразных диазотрофных бактерий, и, таким образом, представляется перспективной для поиска активных азотфиксирующих штаммов.

Глава2. Объекты и методы исследования

Объекты исследования. Объектами исследования стали ассоциативные бактерии ризопланы двух видов овощных культур, выращиваемых в условиях Вьетнама: водяной шпинат (Ipomoea aquatica) и разнолистная капуста (Brassica integrifolia), которые ранее не изучались в подобных исследованиях.

Опыты по инокуляции растений выделенными бактериями проводили на партенокарпическом гибриде Fl огурца (Cucumis sativus) Fl Кассандра селекции Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А.Тимирязева и разнолистной капусте (Brassica integrifolia) сорта «VK 13» агрофирмы «Vinh Nöng».

Методы исследования. Для изучения азотфиксирующих микроорганизмов ризопланы были отобраны образцы корней двух видов овощных культур из Вьетнама - Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia. Корни растений отмывали в стерильной воде, помещали во флаконы с безазотистой питательной средой Федорова-Калининской, затем культуры пересевали в пенициллиновые флакончики с полужидкой средой Федорова-Калининской с сахарозой или малатом. Из накопительных культур, выделяли чистые культуры бактерий на средах DAS и Эшби. Активность фиксации азота определяли ацетиленовым методом с помощью газового хроматографа Chrom-4.

Для выяснения ростактивирующего эффекта выделенных культур был проведен опыт с кресс-салатом. Семена замачивали в течение 30 минут в суточной бактериальной культуре, разведенной в 10, 100, 1000 раз; контроль - вода. После этого в чашках Петри на фильтровальную бумагу раскладывали по 20 обработанных семян и вносили 2 мл воды. Семена проращивали в термостате при 25°С и через 72 ч измеряли длину корешков и стебельков проростков.

Модельный опыт проводился в условиях климатической камеры в течение 40 дней при следующих параметрах: день 16 ч при +25 °С, ночь 8 ч при +18°С. Семена огурцов замачивали в воде в течение 2-х суток, а семена разнолистной капусты сутки при температуре 25°С. Перед посевом проросшие семена выдерживали в суточной бактериальной культуре в течение 2 часов. Титр суточной культуры составлял 7,5ТО8 - 8,0-108 КОЕ/мл. Обработанные проросшие семена высевали в стеклянные сосуды (объем 150 мл) с вермикулитом и смесью Прянишникова, сосуды закрывались ватной пробкой. После 20 дней растения повторно поливали бактериальной суточной культурой в разведении 1:50 (титр суточной культуры - 1,80-108 -2,0-108 КОЕ/мл). Нитрогеназную активность культур в ассоциации с растениями определяли через 10, 20 дней вегетации; нитрогеназную активность на корнях растений, массу стеблей растений через 40 дней вегетации.

Морфологические особенности полученных чистых культур исследовали под микроскопом Axioimager. Измерение размеров клеток бактерий осуществляли с использованием программы Axiovision Rel.4.7. Физиолого-биохимические особенности отобранных культур изучали классическими методами в соответствии с показателями, согласно «Определителю бактерий Берджи». Филогенетическое положение выделенных микроорганизмов определяли на основании секвенирования гена 16S рРНК. Мелкоделяночный опыт в производственных условиях проводился в закрытом грунте на базе ООО «Селекционная станция имени H.H. Тимофеева». Проросшие семена помещали на 3 часа в суспензию соответствующей чистой культуры, приготовленной из суточной культуры на среде DAS, затем высаживали в грунт. После появления первого настоящего листа растения повторно инокулировали суточной бактериальной культурой, разбавленной водой в соотношении 1:50. По фазам развития растения проводилось определение биометрических показателей, нитрогеназной активности на корнях растений, содержания общего азота в листьях во время плодоношения (по Кьельдалю), содержание N03" в урожае

методом прямой потенциометрии. Статистическую обработку полученных данных проводили по критериям Фишера-Стыодента и дисперсионный анализ со сравне1шем средних по критерию Дункана с помощью пакета Statistica 5.5. Корреляционный анализ проводился с использованием программы Ecxel.

Глава 3. Изучение нитрогеназной активности накопительных культур и выделенных чистых культур

Самая высокая нитрогеназная активность среди полученных накопительных культур была выявлена на среде Федорова-Калининской с сахарозой. Она достигала 19,21 наномолъ С2Н4/ч (табл. 1). На среде Федорова-Калининской с манатом уровень нитрогеназной активности был заметно ниже (самое высокое значение составило только 1,24 наномоль С2Н4/4). В целом, образцы из ризопланы Тротоеа aquatica характеризуются более высоким уровнем азотфиксирующей активности, чем из ризопланы Brassica integrifolia.

Из накопительных культур, имеющих самую высокую нитрогеназную активность (A-J), было выделено 227 чистых культур, из которых, 17 наиболее активных изолятов были отобраны для дальнейших опытов (рис. 1,2,3). Такими изолятами стали: А20 с нитрогеназной активностью 29,37 наномоль С2НУч, ВЗО (19,44), В31 (27,81), С7 (44,24), С12 (42,7), С13 (43,2), С19 (42,57), С22 (42,87), С31 (42,65), С37 (43,9), С43 (41,95), D2 (2,58), Е17 (4,13), ЕЗО (2,96), F12 (8,99), J26 (2,41) и J35 (2,27 наномоль С2Н4/ч).

Таблица 1

Нитрогеназная активность накопительных культур из ризопланы Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia, на среде Федорова-Калишшской с сахарозой или с манатом (наномоль С;Н.(/ч)

На среде с сахарозой На среде с манатом

Номе Р образца Из ризоилан ы Ipomoea aquatica Номер образца Из ризоплан ы Brassica integrifolia Номер образца Из ризопла ны Ipomoea aquatica Номер образца Из ризопланы Brassica integrifolia

1 1,15 10 0,71 19 0,15 28 0,82

2 0,92 и 0.59 20 0,29 29 1,11

3 0,87 12 0,69 21 0,05 30 0,95

4 13,00 (А) 13 0,70 22 1,24 31 0,92

5 19,21 (В) 14 0,56 23 0,41 32 0,81

6 13,75 (С) 15 0,50 24 0,32 33 1,11

7 12,32 (D) 16 9,01 (Е) 25 0,91 34 0,96

8 1,06 17 10,29 (F) 26 1.04 35 0,77

9 0,92 18 10,31 (J) 27 0,87 36 0,96

л

ч

о

2

О

а

га

Ж

Л

н

о

о ,—ч

£ X

1 ж

га сГ

«

я

ж

р?

га

I

<D

U

о

&,

Н

S

I

3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 номер изолята

Рисунок 1. Нитрогеназная активность чистых культур, выделенных из накопительной культуры С на среде Федорова-Калининской с сахарозой, полученной из ризопланы 1ротоеа ациайса (наномоль С2Н4/ч)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324252627282930

номер изолята

Рисунок 2. Нитрогеназная активность чистых культур, выделенных из накопительной культуры F на среде Федорова-Калининской с сахарозой, полученной из ризопланы Brassica integrifolia (наномоль С2Н4/ч)

л н о о

m JT а

Ь X

cd

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 номер изолята

Рисунок 3. Нитрогеназная активность чистых культур, выделенных из накопительной культуры Е, на среде Федорова-Калининской с сахарозой,

полученной из ризопланы Brassica integrifolia (наномоль С2Н4/ч)

Глава 4. Изучение ростового эффекта чистых культур ассоциативных азотфиксаторов

В настоящее время установлено, что положительное влияние азотфиксирующих бактерий на продуктивность растений может быть обусловлено не только улучшением азотного питания, но и синтезом диазотрофами ростактивирующих веществ, а также подавлением роста фитопатогенных микроорганизмов. Как показывают результаты наших опытов, большинство полученных штаммов способны к активации роста кресс-салата. При достаточно высоком разведении (1:100, 1:1000) бактериальной культуры наблюдалась существенная стимуляция роста как корней (от 110% до 149%), так и стеблей (от 110 до 139% от контроля). При разведении 1:10 стимулирующий эффект не наблюдался. Во всех вариантах отмечены значения, близкие к контролю. Один из изолятов (D2) ингибировал прорастание семян и развитие проростков кресс-салата в любом из испытанных разведений.

Для проверки влияния полученных культур бактерий на растения в условиях модельного опыта, мы отобрали изоляты диазотрофов, дававшие максимальный ростовой эффект. Это изоляты: El 7, С22 (максимальный ростовой эффект при разведении 1:1000 на корешки, 141% и 149 % от

контроля), С43, F12 (максимальный эффект в варианте 1:1000 на стебельки, 134% и 139% от контроля), J26 (максимальный эффект при 1:100 на корешки, 149% от контроля), С7, С19 (максимальный эффект при 1:100 на стебельки, 122% и 123% от контроля). Изоляты С7, С19, С22, С43 были выделены из ризопланы Iponioea aquatica, а изоляты Е17, F12, J26 - из ризопланы Brassica integrifolia.

Глава 5. Изучение влияния чистых ассоциативных азотфиксаторов на нитрогеназную способность, рост и развитие огурца и разнолистной капусты в модельном опыте

Модельный опыт с огурцом и разнолистной капустой позволил нам оценить способность разных изолятов к развитию в ризосфере растений и снабжению растений азотом.

Установлено, что на огурцах и разнолистной капусте после 10 дней наблюдения, азотфиксирующая активность почти во всех сосудах с растениями, инокулированными исследуемыми изолятами, была низкая и находилась на уровне предела обнаружения. Нитрогеназная активность могла быть измерена только после 20 дней опыта. После завершения опыта (40 дней) измерялась азотфиксация на отобранных и отмытых корнях растений, помещенных в безазотную питательную среду Федорова-Калининской. Корреляции между активностями азотфиксации бактерий в ассоциации с инокулированными растениями огурца и разнолистной капусты после 20 дней выращивания и на корнях растений после 40 дней выращивании не выявлено.

Влияние чистых культур на растения огурца в модельных опытах

В условиях модельного опыта (стерильный субстрат), инокуляция бактериями оказала существенное воздействие на массу стеблей огурца. Однако, зависимости между активностью азотфиксации бактерий в ассоциации с растениями огурца после 20 дней выращивания и увеличением массы стебля растений после 40 дней выращивания выявлено не было. Спустя 20 дней (40 дней выращивания) было отмечено повышение нитрогеназной активности на корнях огурца, которая тесно коррелировала с увеличением массы стеблей (коэффициент корреляции г = 0,9; tr = 9,67 > t05). В условиях модельного опыта, инокуляция следующими изолятами повышала массу стебля огурца: С43 (150% от контроля), F12 (168% от контроля), С22 (179% от контроля), С7 (180% от контроля) и С19 (186% от контроля). Эти изоляты были отобраны для мелкоделяночного опыта с огурцом (рис.4, табл. 2).

F12 С19 С43 Cl E17 C22 J26 кон Контроль и изоляты

■ Активность азотфиксации бактерий в ассоциации с инокулированными растениями огурца после 20 дней выращивания (наномоль С2Н4/ч/сосуд)

■ Активность азотфиксации бактерий на отобранных и отмытых корнях растений огурца (наномоль С2Н4/ч/1 г корней)

■ Масса стебля огурца после 40 дней выращивания

Рисунок 4. Активность азотфиксации бактерий в ассоциации с инокулированными растениями огурца после 20 дней выращивания, активность азотфиксации бактерий на отобранных и отмытых корнях растений огурца, и масса стебля огурца после 40 дней выращивания

Влияние чистых культур на растения разнолистной капусты в модельных опытах

Между активностью азотфиксации на корнях растений и массой стебля после 40 дней выращивания наблюдается слабая корреляция (г = 0,45; tr = 2,37 > tos). Наибольшее увеличение массы стебля растений огурца было

отмечено в вариантах с инокуляцией чистыми культурами: 126 (113% от контроля), Е17 (146% от контроля), С19 (165% от контроля), С22 (167% от контроля) и ¥\2 (177% от контроля) (рис. 5).

К

CN

U л ч о 2 о я

св Я

Я

я

я

«

я -е-н о

о о Я а S н

и <

350 300 250 200 150 100 50

I

о ■

F12 С19 С43 J26 Е17 С22 С7 кон Контроль и изоляты

0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0

I Активность азотфиксации бактерий в ассоциации с инокулированными растениями разнолистной капусты (наномоль С2Н4/ч/сосуд)

| Активность азотфиксации бактерий на отобранных и отмытых корнях растений разнолистной капусты (наномоль С2Н4/ч/1 г корней)

Масса стебля разнолистной капусты после 40 дней выращивания

Рисунок 5. Активность азотфиксации бактерий в ассоциации с инокулированными растениями разнолистной капусты после 20 дней выращивания, активность азотфиксации бактерий на отобранных и отмытых корнях растений разнолистной капусты, и масса стебля огурца после 40 дней

выращивания

Таким образом, в условиях модельного опыта на стерильном субстрате, инокуляция растений изучемыми бактериями оказывает положительное влияние на рост и развитие, как огурца, так и разнолистной капусты. Лучшие показатели были отмечены в вариантах с инокуляцией штаммами С19 в опыте с разнолистной капустой (увеличение биомассы надземной части

растений на 186% от контроля) и Р12 в опыте с огурцом (177% от контроля). Для дальнейших исследований были отобраны следующие изоляты: С43, С7, С22, С19, Б12 для мелкоделяночного опыта с огурцом, и .126, Е17, С19, С22, Б12 для мелкоделяночного опыта с разнолистной капустой.

Таблица 2

Влияние чистых культур азотфиксаторов на массу стебля растений огурца и разнолистной капусты и нитрогеназную активность их корней после 4СГ дней

выращивания в модельном опыте

Варианты Масса Нитрогеназная Масса стебля Нитрогеназная

инокуляции стебля активность в разнолистной активность в

и контроль огурца (г/растение) ризоплане огурца (наномоль С2Н4/Ч/Г корней) капусты (г/растение) ризоплане разнолистной капусты (наномоль С2Н4/4/Г корней)

К 0,445 а 79,93 а 0,084 ab 240,8 Ь

J26 0,617 ab 14,69 а 0,096 abc 63,07 а

С7 0,842 Ьс 204,39 с 0,079 ab 48,20 а

С19 0,870 с 208,57 с 0,139 bc 95,80 а

С43 0,668 abc 142,98 Ь 0,067 a 385,50 с

Е17 0,610 ab 14,23 а 0,122 abc 22,87 а

С22 0,845 bc 193,28 с 0,141 bc 244,01 с

F12 0,792 bc 203, 87 с 0,148 c 315,80 Ьс

Глава 6. Морфологические, физиолого-биохимические особенности выделенных чистых ассоциативных азотфиксаторов

Нами были отобраны 7 штаммов, которые характеризуются наиболее высокой нитрогеназной активностью как на питательных средах, так и в ассоциации с растениями, а также оказывают стимулирующее влияние на культурные растения в модельных опытах. Было определено таксономическое положение данных организмов по морфологическим и физиолого-биохимическнм особенностям (табл. 3).

Все исследованные штаммы показали способность к образованию 3-кетолактозы при росте на лактозе, что характерно исключительно для А. Пипе/айет и Л. гасНоЬас1ег. Отнесение штамма к одному из этих видов осуществляется исключительно по признаку фитопатогенности, в остальном они идентичны. Однако, как уже отмечалось, данный признак связан с наличием или отсутствием Тьплазмиды и поэтому не может рассматриваться как видоопределяющий. Поскольку ДНК типовых штаммов А. 1ите/аает и А. гасИоЬаМег проявляют высокую степень гомологии, их можно рассматривать как один вид.

Таблица 3

Морфология и физиолого-биохимические особенности чистых культур, выделенных из ризопланы тропических овощных культур Ipomoea aquatica (штаммы С7, С19, С22, С43) и Brassica integrifolia (штаммы Е17, F12, J26)

Изучаемые признаки штаммы

С43 С22 С7 С19 Е17 Р12 126

Форма колонии на среде DAS Круглая с валиком по краю, выпуклая, гладкая Концентри ческая, выпукла, гладкая Круглая с валиком по краю, выпуклая, гладкая. Концентричес кая, выпуклая, гладкая, Концентричес кая, выпуклая, гладкая. Круглая с валиком по краю, выпуклая, гладкая Круглая с валиком по краю, выпуклая, гладкая

Окраска по Граму - - - - - - -

Форма клеток Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки Прямые палочки

Длина клеток (мкм) 0,6-1,0 0,6-1,0 0,6-1,0 0,6-1,0 0,6-1,0 0,6- 1,0 0,6-1,0

Подвижность в жидкой среде + + + + + + +

Образование кислоты из глюкозы + + + + + + +

Оксидаза + + + + + + +

Рост при 35°С + + + + + + +

Образование 3-кетолактозы + + + + + + +

Подкисление среды при использовании этанола - + - - - - -

Ростактивирующий эффект + + + + + + +

Фиксация азота + + + + + + +

Изменение обыкновенной структуры корней растения - - - - - - -

Глава 7. Определение филогенетического положения выделенных чистых ассоциативных азотфиксаторов

Было установлено, что все выделенные чистые культуры принадлежат к семейству RJüzobiaceae филогенетической группы Alphaproteobacteria. При этом наиболее близкой (99,8% гомологий) к полученным последовательностям гена 16S рРНК была аналогичная последовательность типового штамма представителя рода Agrob acter кип — A. tumefaciens. Для определения точной филогенетической позиции исследуемых штаммов внутри семейства Rhizobiaceae, и его родства с А. tumefaciens были использованы доступные из базы данных GenBank последовательности представителей других родов семейства Rhizobiaceae.

Последовательности гена 16S рРНК изучаемых штаммов оказались практически идентичными (99,8% гомологий) с последовательностью типового штамма А. tumefaciens (рис. 6). Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 1 нуклеотвдной замене на каждые 10 нуклеотидов. Цифрами показана достоверность ветвления, установленная с помощью "bootstrap" - анализа 1000 альтернативных деревьев Таким образом, выделенные нами штаммы являются представителями вида Agrobacterium tumefaciens, который хорошо известен как фитопатоген. К настоящему времени известно (Kanvinde, Sastry, 1990), что A. tumefaciens может фиксировать азот в свободном состояшш, расти на безазотистой среде, восстанавливать ацетилен до этилена и включать в состав биомассы 15N2. Как и для большинства других, хорошо охарактеризованных диазотрофных бактерий, присутствие NH/ в среде и аэробные условия подавляют фиксацию азота A. tumefaciens. Нитрогеназная система содержит молибден. Некоторые особенности фиксации азота у A. tumefaciens напоминают другие хорошо изученные диазотрофные бактерии, такие как Klebsiella pneumonia (Robert, Brill, 1981). Последовательности ДНК структурных генов, ответственных за нитрогеназу (nifH, nifD, и nifK) высоко консервативны (Ruvkun, Ausubel, 1980).

Надо полагать, что при отсутствии или повреждении Ti-плазмиды А. tumefaciens не может вызывать заражение растений но, как свидетельствуют наши данные, оказывает положительное воздействие на растеши в ассоциации с ним. Помимо снабжения растений азотом и синтеза ростактивирующих веществ, можно ожидать, что данные штаммы конкурируют с патогенными за одни и те же сайты связывания, защищая таким образом растение от болезнетворных агентов.

Agrabacterium sp. ЕР R1816S ribosom... Agrobacterium tumefeciens gi|57703055... Rhizobium sp. gi|586830625|gb|KF9Q613... Agrabacterium tumefeciens gi|60878614... Agrobacieritm taefeciens gi|58586563... Agrobacterium tumefeciens gi|57703055(2)

■ Rhizobium sp. gi|586830630|gb|KF90614..

H 1

___Agrobacterium tumefeciens gi|58586563...

Uncultured Agrabacterium sp. clone Ag... Agrobacterium tumefeciens strain SM14... Agrobacterium tumefeciens strain R9-7...

-Agrobacterium sp. #57710113|gb|KJ6...

Agrabacterium tumefeciens strain SWFU(2) Agrobacterium tumefeciens strain D254... Agrabacterium tumefeciens strain SWFU... Agrobacterium sp. gi|570554466|gb|KF7... -6

1-1

0.5

Рисунок 6. Филогенетические дендрограммы, построенные на основе анализа нуклеотидных последовательностей 16S рРШС видов бактерий, способных к процессу фиксации молекулярного азота.

а) штамм, выделенный из ризоиланы разнолистной капусты (F12)

б) штамм, выделенный из ризопланы водяного шпината (С43)

Глава 8. Изучение влияния разных штаммов Agrobacteriчm Ште/аает на урожай огурца и разнолистной капусты в мелкоделяночном опыте в условиях теплицы

Влияние разных штаммов Agrobacterium Ште/аает на урожай огурца в мелкоделяночном опыте

Измерение биометрических показателей через две недели после закладки мелкоделяночного опыта с огурцом показало, что длина стебля была выше у инокулированных растений только в двух вариантах (Т: 12 и С43). В этих же вариантах (С43 и И12) был отмечен прирост массы побегов растения по сравнению с контролем на 13,4 и 15,0 % (рис. 7). Инокуляция штаммом С22 привела к замедлению роста стебля и снижению биомассы по сравнению с контролем.

Контроль и варианты инокуляции

Рисунок 7. Влияние штаммов Agl■obacterium Ште/аЫет на массу растения огурца через 2 недели после посадки, г/растение

На пятой неделе вегетации, длина стеблей растений у всех вариантов с инокуляцией не отличались от контроля, хотя в варианте с инокуляцией штаммом Б12 были, как и в первый срок наблюдений, отмечены самые высокие значения длины и массы стебля. Эти отличия были связаны исключительно с развитием растений в первые недели жизни.

Не наблюдалось корреляции между нитрогеназной активностью на корнях огурца после 2 и 5 недель опыта. Более того, также между нитрогеназной активностью на корнях огурца после 2 недель выращивании и массой стебля огурца по результатам того же периода, корреляции не обнаруживается. Мы объясняем это тем что, в отличие от модельного опыта, на нитрогеназную активность на корнях растений, выращиваемах в производственных условиях в защищенном грунте, оказывает влияние микробиота грунта в теплице.

Определение содержания общего азота в листьях инокулированных и контрольных растений в период плодоношения показало, что все испытанные штаммы в той или иной степени оказывали положительное влияние на азотное питание растений. Штаммы Р12 и С7 давали наиболее существенное повышение содержания общего азота в листьях огурца. Например, содержание общего азота в листьях растений, инокулированных этими штаммами, в среднем было на 0,42-0,57% выше, чем в контроле (прирост от 26,6 до 35,9% относительно контроля), что свидетельствует о более благоприятном режиме азотного питания (рис. 8). Содержание нитратов в зеленцах оставалось в пределах допустимой нормы (меньше 400 мг/кг).

Контроль и варианты инокуляции

Рисунок 8. Содержание общего азота в листьях инокулированных разными штаммами А%гоЪас1ег1ит Ште/аает и контрольных растений огурца в периоде цветения, % от сухой массы

Урожай зеленцов огурца, полученный с инокулированных исследуемыми штаммами Л^гоЬааегЫт Ште/аЫет растений, сушествено не отличался от контроля (табл. 4).

Таблица 4

Влияние разных штаммов Agrobacterium ште/аает на растении огурца в

мелкоделяночном опыте в условиях теплицы

Варианты инокуляции и контроль Длина стебля через 2 недели после посадки, см Масса стебля через 2 недели после посадки, г/растение Урожай, г/растение Общий азот в листьях, % от массы абсолютно сухого в-ва

К 26,83 b 10,77 Ь 1581,46 1,59 а

С19 25,67 b 8,57 а 1548,55 1,82 ab

С22 19,25 а 7,94 а 1544,89 1,81 ab

F12 33,25 с 12,39 с 1686,46 2,01 Ьс

C43 28,58 Ьс 12,21 с 1681,30 1,65 а

С7 25,25 b 10,26 Ь 1581,46 2,16с

F,j¡ < F os

Влияние разных штаммов Agrohacterium tumefaciens на урожай разнолистной капусты в мелкоделяночном опыте

В мелкоделяночном опыте с разнолистной капустой было выявлено, что масса стебля и нитрогеназная активность на грамм корней после 2 недель опыта коррелируют (коэффициент корреляции г = 0,65; 1= 5 > tos)- Самыми эффективными штаммами, положительно влияющими на массу стебля разнолистной капусты, являются С22 и особенно F12, инокуляция которым дает прирост биомассы в 20% от контроля.

После 30 дней выращивания разнолистной капусты, урожай собранных с инокулированных растений, значимо не отличался от контроля, поскольку наблюдался большой разброс значений между повторностями (рис.9). Однако инокулированные растения содержали значительно больше азота, чем растения контрольного варианта, в частности, содержание азота в варианте, инокулированном штаммом F12, оказалось на 3,43% больше, чем в контрольном (что соответствует более чем двукратному приросту) (рис. 10). Содержание нитратов в товарной продукции находится в пределах допустимой нормы (меньшее 900 мг/кг).

К Е17 126 С19 С22 Р12

Контроль и варианты инокуляции

Рисунок 9. Влияние штаммов А^оЬасГеггит Ште/айет на урожай разнолистной капусты, (г/растение)

Контроль и варианты инокуляции

Рисунок 10. Содержание общего азота в листьях инокулированных А^гоЪааегтт Ште/аЫет и контрольных растений разнолистной капусты во время уборки урожая, % от сухой массы

Таким образом, влияние выделенных штаммов А. Ыте/аЫет на урожай огурца и разнолистной капусты показали, что некоторые из них (прежде всего, штамм И12, выделенный из ризопланы В. Ше^/оНа) оказывает положительное влияние на условия азотного питания растений и содержание азота в листьях (табл.4, 5). Однако, надо полагать, что образуемая бактериально-растительная ассоциация неустойчива, поэтому

оказывает эффект только на ранних стадиях развития огурца, и может быть перспективна для применешш на культурах с коротыш вегетационным циклом.

Таблица 5

Влияние разных штаммов Л^оЬаШгшт Пипе/аасю на растении

разнолистной капусты в мелкоделяночном опыте в условиях теплицы

Варианты шюкуляци и и контроль Масса стебля через 20 дней после посадки, г/растение Нитрогеназная активность на 1 г корней после 20 дней выращивания (наномоль С:Н,'/ч/1г корни) Урожай г/растен ие Общий азот в листьях, % от массы абсолютно сухого в-ва

К 0,66 Ьс 46,06 abc 140,00 3,14 а

Е17 0,52 а 37,12 а 135,67 5,128 abc

J26 0,63 abc 46, 03 abc 129,00 3,880 ab

С19 0,573 ab 41,01 а 130,00 4,444 ab

С22 0,75 cd 54,24 с 163,33 4,982 abc

F12 0,79 d 57,89 с 185,00 6,569 bc

F* < F05

ВЫВОДЫ

1. Впервые из ризопланы тропических овощных культур Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia получено 227 изолятов ассоциативных азотфиксирующих бактерий.

2. Установлено, что уровень нитрогеназной активности у изучаемых чистых культур колеблется в широких пределях (от 0,02 до 44,24 наномоль С2Н4/4). Самая высокая азотфиксация выявлена у культур, выделенных из ризопланы Ipomoea aquatica.

3. Определена ростактивирующая способность ряда микробных культур, выделеных из ризопланы Ipomoea aquatica и Brassica integrifolia. Наиболее активно стимулировали рост кресс-салата изоляты С7, С19, С22, C43, выделенные из ризопланы Ipomoea aquatica и изоляты El7, Fl2, J26 из ризопланы Brassica integrifolia. Эти наиболее активные изоляты были отобраны для модельных опытов с огурцом и разнолистной капустой.

4. В условиях модельного опыта с огурцом и разнолистной капустой (стерильный субстрат) инокуляция изолятами оказывает положительное влияние на массу стебля растения, наиболее эффективны С19 (186% от контроля на разнолистной капусте) и F12 (177% от контроля на огурце).

5. Исследование филогенетического положения выделенных культур (7 наиболее активных азотфиксаторов), проведенное на основании

секвенирования гена 16S рРНК, показало, что они принадлежат к семейству Rhizobiacea филогенетической группы Alpharoteobacteria. Последовательности гена 16S рРНК изучаемых культур оказались практически идентичными (99,8% гомологий) с последовательностью типового штамма Agrobacterium tumefaciens. Филогенетические особенности и физиолого-биохимические тесты изученных культур, в частности, образование 3-кетолактозы, дают нам основание утверждать, что изученные штаммы относятся к Agrobacterium tumefaciens.

6. Влияние выделенных штаммов А. tumefaciens на урожай огурца и разнолистной капусты показали, что некоторые из них (прежде всего, штамм F12, выделенный из ризопланы В. integrifolia) оказывает положительное влияние на условия азотного питания растений и содержание азота в листьях. Однако надо полагать, что образуемая бактериально-растительная ассоциация неустойчива, поэтому оказывает эффект только на ранних стадиях развития растений, и может быть перспективна для применения на культурах с коротким вегетационным циклом.

7. Результаты наших опытов показали, что взаимоотношения непатогенных штаммов Agrobacterium tumefaciens с тропическими овощными культурами строятся на основе ассоциативного симбиоза. Выделенные нами штаммы могут быть использованы для создания бактериальных препаратов, стимулирующих рост овощных культур.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фунг Т.М. Азотфиксирующая активность ассоциативных бактерий, выделенных из ризопланы овощных культур Вьетнама Ipomoea apuatica и Brassica integrifolia /Т.М. Фунг // Сб. XXI международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов 2014": секция "Почвоведение". - М.: МАКС Пресс, 2014. - С 33- 34.

2. Фунг Т.М. Биологическая активность ассоциативных бактерий, выделенных из ризопланы овощных растений, выделенных из Вьетнама Ipomea aquatica L. и Brassica integrifolia L. / Т.М Фунг, В.Т. Емцев, Л.А. Поздняков, О.В Селицкая // Известия ТСХА. - 2014. - вып. 5. - С. 24 - 35.

3. Фунг Т.М. Ассоциативное взаимодействие почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens с высшими растениями / Т.М. Фунг, H.A. Манучарова, А.Л. Степанов, Л.А. Поздняков, О.В. Селицкая, В.Т. Емцев // Вестник Московского университета. Почвоведение. - 2015. - № 3. - С. 46 -52.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Подписано в печать 6.05.2015 г. Формат 60x84 1/16. Усл.печ.л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 273.

Издательство РГАУ-МСХА 127550, Москва, Тимирязевская ул., 44 Тел.: (499) 977-00-12, 977-40-64