Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Асинхронное ядерное и клеточное деление у одноклеточных зеленых водорослей родов SCENEDESMUS и CHLORELLA

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Асинхронное ядерное и клеточное деление у одноклеточных зеленых водорослей родов SCENEDESMUS и CHLORELLA"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На npaßax рукописи

НИКОДОВ Николай НеноВ

АСИНХРОННОЕ ЯДЕРНОЕ И КЛЕТОЧНОЕ ДЕЛЁНИЕ У ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ЗЕЛЕНЫХ

ВОДОРОСЛЕЙ РОДОВ SCENEDESMUS И CHLORELLA

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 1992

)

Работа Выполнена 6 Институте генетики Болгарской академии наук, София

Официальные

оппоненты: доктор биологических наук И.Б. РАЙКОВ

доктор биологических наук Т В. СЕДОВА

доктор биологических наук В.Ю. ПОЛЯКОВ

Ведущее учреждение - Иститут микробиологии АН СССР Защита диссертации состоится „2-Ъ_" иьихурА-^ 1992 года В ( ъ час. Э О мин, на заседании Специализированного СоВета Д 053.05.68 В МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, МоскВа, Ленгоры, МГУ. Биологический факультет

С диссертацией мо>кно ознакомиться В библиотеке Биолоического факультета

Автореферат разослан „ 2-^Г" у-*-^ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного СоВета канд биол. наук

Е.Н. КалистратоВа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

, "Л ',;

Актуальность проблемы

Клеточное деление - уникальное биологическое явление, 6 результате которого осуществляется непрерывность 6 существовании >киВых организмов. Его биологическая сущность и значение заключаются В распределении генетического материала меЖду дочерними клетками и сохранении генетической информации В поколениях.

НеВозмоЖно понять природу клетки, не ВыясниВ процессов, связанных с ее деления и ВоспроизВедением. В силу этих причин, проблема клеточного деления занимает ключеВое место В изучении осноВной структорной и функциональной биологической единицы - клетки.

В сВязи с этим с особой силой стаВится Вопрос, каким образом - синхронно или асинхронно протекают процессы деления ядер и формирование дочерних клеток Во Времени. До сих пор В биологии утвердилась точка зрения, что клеточная репродукция осуществляется синхронно, путем протекания нескольких циклов ядерных делений, В результате которых образуются дочерние клетки, причем их число всегда кратно двум (2п), где (п) обозначает число циклов деления. Эта концепция леЖит В интерпретации многих результатов, полученных в этой области. Koller (1947) Высказал мнение, что синхронность является правилом для всех клеток.

Наряду с этим общепринятыми мнением, 6 литературе Встречаются и сообщения об отдельных случаях асинхронности, наблюдаемой как 6 процессе синтеза ДНК, так и 6 некоторых фазах митоза. Такие данные приведены В работах ряда aßmopoß (Nilova, Sukhanova, 1964; Stubblefield, 1964; Harris, Watkins. 1965; Oftebro, Wolf, 1967; Kato, Sandberg, 1967, 1968, Johnson, Harris, 1969; Krishan, Ray-Chandhury, 1969; Rao, Johnson, 1970; Johnson, Rao, 1971; Heneen, 1971; Ghosh et al., 1978; Ghosh, Paweletz, 1984; Петращук, Онищенко, 1987 и др.) Другие абторы - СедоВа (1972), Stephenson, Gooday, (1984) наблюдали асинхронность В поведении ядер. АндрееВа (1975) сообщает об образовании четного и нечетного числа раВных или разных по Величине аВтоспор В одном спорангии у некоторых представителей рода Chlorella, a Zakrys (1980, 1983) регистрировал клетки, которые делились на нечетное число дочерних клеток у Euglena.

Следует отметить, что Все эти случаи считаются необычными явлениями или исключениями, которые противоречат общепринятому мнению о синхронном ядерном и клеточном делении, В сВязи с чем их биологическая сущность и значение остаются пока невыясненными. Некоторые из Вышеупомянутых aßmopoß (Johnson, Rao, 1971; Ghoch et al, 1978; Ghosh, Paweletz, 1984) считают, что причины этих исключений нуЖно искать В различиях размеров, природе и происхождении ядер, неоптимальных условиях ре>кима питания, метаболизме, компартментализации цитоплазмы и т.д.

Наши исследования одноклеточных зеленых Водорослей дали основание предположить, что процессы

осуществляющие ядерную и клеточную репродукцию, могут иметь асинхронный характер. Доказательством этого предположения является цель настоящей диссертационной работы.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - установить каким способом (синхронно или асинхронно) протекают процессы ядерного и клеточного деления у одноклеточных зеленых Водорослей pogoß Scenedesmus и Chlorella.

Для достижения этой цели мы стабили себе следующие осноВные задачи:

1. Проследить разбитие и деление ядра В определенные интервалы Времени В течение одного Жизненного цикла клеток из синхронизированных клеточных культур.

2. Наблюдать отдельные клетки, приступающие к делению, учитывая число дочерних клеток (аВтоспор) В получившихся клеточных ценобиях после разрыва клеточной оболочки материнских клеток.

Научная нобизна и практическая ценность работы:

Впервые установлено асинхронное ядерное и клеточное деление как естественный биологический процесс у одноклеточных зеленых Водорсолей родоВ Scenedesmus и Chlorella. Наблюдаемые отдельные случаи асинхронности, которые В литературе считаются необычными явлениями или исключениями из общепринятой точки зрения о синхронном делении приобретают значение закономерности. На основании полученных экспериментальных результатов выдвинута

гипотеза, что ядерная и клеточная репродукция у ЖиВых организмов осуществляется асинхронным путем.

Апробация работы

Некоторые полученные результаты были обсуЖдены В Отделе генетики Университета В СеВилье, Испания. Апробация работы сделана В Институте генетики Болгарской академии наук. Научные публикации, связанные с диссертационным трудом, отпечатаны В Докладах БАН, представленные чл.-корр. проф. К. Марковым, которому аВтор ВыраЖает признательность.

Структура и объем работы:

Диссертация состоит из ВВедения, 6 глаВ, В которых рассмотрены основные литературные данные и результаты собственных исследований, ВыВодоВ, дискуссии и списка литературы. Работа содерЖит 145 страниц машинописного текста, 26 рисункоВ и 3 таблицы. Список литературы Включает 151 наименование, из них 112 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектами исследований служили одноклеточные зеленые Водоросли Scenedesmus acutus, Scenedesmus acuminatus и Chlorella vulgaris. Указанные штаммы несколько лет поддерЖиВаются В нашей коллекции при соблюдении оптимальных для них услоВии питательного и сбетобого реЖимоб. Выбор этих объектов исследования сделан на основании следующих более ВаЖных соображений:

- они широко распространены В природе;

- являются типичными представителями как одноклеточных эукариотических организмов, так и соо'тВегпстВующих pogoß Scenedesmus и Chlorella;

- они просто устроенные, одноклеточные гаплоиды;

- имеют короткий цикл разбития и размножения;

- размножение осуществляется только бесполым способом;

- легко синхронизируются В клеточных культурах;

- они использоВаны и ранее В качестВе объектов исследования и полученные данные могут слуЖить базой для интерпретации полученных нами результатов.

Чтобы проследить разбитие и деление ядра В определенные интербалы Времени одного Жизненного цикла клеток из синхронизированных культур, разработанна подходящая методика. Исходным пунктом для этого послуЖил метод окрашивания ядра и хромозом У другой одноклеточной зеленой Водоросли Chlamydomonas reinhordi, описанный Loppes et al.. (1972).

Синхронизация осуществлялась В условиях сВетоВого-темного реЖима (10:14 или 12:12 часоб).

Индекс синхронизации установлен по морфологическим признакам с помощью сВетобого микроскопа и составляет около 95-96 %. Ядра окрашивались разными методами, В основном тионином и флуоресцирующей краской Н-33258. Эта методика представлена в деталях в двух наших публикациях (М1со1оу, 1982, Мсо^, ТсИасаго^ 1984).

Поведение ядра исследовано такЖе с помощью проточной цитофотометрии и на

электронно-микроскопическом уровне. Методики, применяемые в этих исследованиях представлены В других наших публикациях (№со^ е1 а1., 1986, 1987).

С целью исследования деления клеток нами разработана методика, сущность которой заключается в точном подсчете числа аВтоспор, т.е. дочерних клеток Во ВновьполучиВшихся клеточных ценобиях, сразу после разрыва оболочки материнских клеток. Описание этой методики дано в отдельной публикации (МсоЬу, 1990).

Поскольку в литературе не существует единого мнения по отношению понятия „ценобий" у многоклеточных и одноклеточных водорослей, мы применяем этот термин в согласии с Коршиковым (1953), что ценобий состоит из определенного числа клеток одной репродуктивной генерации материнских клеток.

Статистическая обработка данных сделана в Институте математики Болгарскоий академии наук, в Лаборатории компьютерной стохастики, с содействием Лиляны Боневой. Для этой цели использованы таблицы Стрелкова (1966), иод-линейные модели для установления наличия зависимости или

о

независимости, х (xu-kßagpam) критерий и t-kpumepuü по Стьюденту.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование деление ядра у одноклеточных зеленых Водорослей Scenedesmus acutus и Chlorella vulgaris

Из проб синхронизированной культуры, отобранных В определенные часы и окрашенных тионином с использованием соответствующей методики получились цитологические картины клеток, представленные на рис. 1.

На рис. 1 Видно, что кроме клеток с четным числом ядер - с дВумя, четырьями. Восьмью и шестнадцатью (фото 4, 7, 11 и 12) наблюдаются и клетки с нечетным числом - с тремя, пятью и семью (фото 6, 8 и 10). Производит Впечатление и различные В размерах отдельных ядер (фото 4, 6, 8, 9 и 10), даЖе у аВтоспор, находящихся еще В ценобиальном состоянии (фото 1).

На фото 3 показана клетка с одним делящимся ядром. Иногда Видны клетки и с дВумя делящимися ядрами (фото 5). Показаны и хорошо оформленные 4- и 8-клеточные ценобии (фото 13, 14 и 15), В aßmocnopax которых Видно только по одному ядру.

Результаты тест-пробы ДНК-азой (фото 16) положительные. Клетки лишены ядерного материала, что яВляется доказательством сущности наблюдаемых структур.

Чтобы Выяснить, яВляется ли наблюдаемая асинхронность при делении ядер у Scenedesmus acutus

га

m

ш

и

*4 с

m га ш ' ш

I

ш

т.-"! к • ■■" -

Я1-

Ol

,fp-

Puc. 1. Клетки штамма Scenedesmus acutus окрашенные тионином (1600x).

1.ДВе абтоспоры, по одному ядру 6 каждой; j —/ 2. Клетка с одним ядром; 3.Клетка с одним деля'. г' идимся ядром; 4. Клетка с дЗумя ядрами; 5. Клеткг v с дбумя делящимся ядрами; 6. Клетка с тремя ядрами; 7. Клетка с четырьмя ядрами; 8. Клетка ( пятью ядрами; 9. Клетка с шестью ядрами; 10. Клетка с семью ядрами; 11. Клетка с босьмьк I ядрами; 12. Клетка с шестнадцатью ядрами;

13. 4- клеточный ценобий; 14. 4-клеточный цено-бий (более поздняя фаза); 15. 8-клеточный ценобий; ОН 16. Клетки, обработанные ДНК-азой.

специфической особенностью этого организма, окрашивали тионином. и клетки другого, близкого 6 систематическом отношении штамм Chlorella vulgaris. Результаты этих исследований представлены на рис. 2.

Из рис. 2 видно, что и у Chlorella vulgaris наблюдаются клетки как с четным числом ядер - двумя и четырьмя (фото 2, 4), так и с нечетным числом -тремя и пятью (фото 3, 5). Кроме этого зарегистрированы и клетки с шестью (фото 6) и более ядрами (фото 7).

Получение таких цитологических картин, где наблюдать ядра в клетках и учесть их число, позволи.-""1 нам проанализировать большое число клсп'»'-отобранных из проб синхронизированных «ул^.;уи ;; разные интервалы времени в пределах одьоа-; Жизненного цикла. Проанализировано 4000 клеток, данные которых приведены 8 табл. 1.

Данные таблицы несомненно указывают, на наличие клеток с четным числом ядер - двумя, четырьмя, восьмью и шестнадцатью, так и с нечетным числом -тремя, пятью и семью. Число ядер Возрастает по мере увеличения времени культивирования, до завершения Жизненного цикла клеток.

Статистическая обработка данных с применением Log-линейных моделей для установления зависимости ji. = х + х? +х] +xf или независимости (л.. = х+ +х] и - х + /4' показала, что иба ф.зкмооа (А - число ядер и В - время культивирования) '^Р'гч"-'; i с очень высокой степенью вероятности з;<оч?нил х2» 0. Модели независимости дали неудовлетворительные результаты, что такЖе подтверждает показанную связь меЖду двумя факторами.

т

ш

ш

ш

Рис. 2. Клетки штамма Chlorella vulgaris, окрашенные тионином (1600х).

1. Клетка с одним ядром; 2 Клетка с дбумя ядрами; 3. Клетка с тремя ядрами; 4. Клетка с четырьмя ядрами; 5. Клетка с пятью ядрами; 6. Клетка с шестью ядрами; 7. Клетка с бльшим числом ядер.

Ш

ТАБЛИЦА 1

Количество клеток с разным числом ядер, зарегистрированное в определенные часы 6 синхронизированной культуре Scenedesmus acutus

Пробы/ часы 1 п 2п Зп 4п 5п 6п 7п 8п 16п Наблюдаемые клетки. Всего

0-ой час

(аВтоспоры) 584 360 46. 9 1 - - - - 1000

4-ый 305 615 52 20 8 - - - - 1000

8-ой 57 102 127 231 110 107 125 141 - 1000

9-ый 9 18 59 124 137 123 257 272 1 1000

Итоги: 955 1095 284 384 256 230 382 413 1 4000

Анализ данных табл. 1 позволяет нам сделать некоторые заключения: 1) Наличие клеток с нечетным числом ядер мо>кет быть лишь результатом асинхронности 6 процессе деления ядер. 2) Поведение ядер В клетках при оптимальных услоВиях культиВироВания и синхронизации В течение одного Жизненного цикла характеризуется протеканием сильно ВыраЖенных динамических процессов, осуществляющих В короткое Время их разВитие и деление. Доказательством этого яВляется получение Восьмиядерных клеток из одноядерных лишь за 9 часоВ культиВироВания. 3) Индекс синхронизации (В нашем случае 95-96 %), определенный по морфологическим признакам при помощи микроскопа не Вполне достоверен. Это В принципе касается не только нашего случая синхронизации. ОсноВная причина этого, на наш Взгляд, заключается В асинхронности процессов, протекающих при разбитии и делении ядра. В результате этих процессов, ядра ВноВьполученные из одной исходной клетки аВтоспор, хотя и Включают В себе одинокоВый генетический материал, не ВыраВнены В отношении его репликационного состояний. В силу этих причин степень синхронизации долЖна считаться относительной и нельзя определять ее лишь по морфологическим признакам. Необходимо такЖе иметь В Виду число и даЖе фазу разбития ядер В клетках, которые синхронизируются.

Поскольку экспериментальная синхронизация клеточных популяций при изучении клетки превратилась В необходимость, особенно при исследовании процессов, относящихся к ее делению, считаем необходимым указать и на мнение других аВтороВ по этому Вопросу.

В своей монографии Мэзия (1963) отмечает, что еще нет такого метода, при котором получилась бы синхронность, сохраняющаяся на протяжении Всего цикла. При этом он добавляет, что до сих пор никому не удалось заставить клетки расти синхронно и поддерЖиВать такую синхронность В течение какого-нибудь более продолжительного периода. Еще В ВВедении Zeuthen (1964) отмечает, что слоВо „синхронность" нельзя Воспринимать как абсолютную одновременность, а необходимо пользоваться им В качестве относительного термина.

2. Рабочая гипотеза об асинхронном делении

ядер

Полученные нами экспериментальные результаты деления ядер послуЖили основанием выдвинуть следующую гипотезу: ядро одной только что выделившейся дочерней клетки (автоспоры) начинает свое развитие. После нескольких асинхронных циклов деления получается необходимое „критическое" число ядер, когда по внутриклеточным механизмам, эта уЖе многоядерная клетка формирует 2-, 4-, 8- или более клеточных ценобиев, и вслед за этим она приступает к делению. При этом одно из ядер, которое более придвинуто в своем развитии чем остальные, раньше осуществит последующее деление.

3. Подтверждение гипотезы об асинхронном делении ядер другими методами исследования

Так сформулированная гипотеза подтвердилась и результатами полученные другими методами исследования. С этой целью применялись цитохимические реакции для выявления ДНК по

фёльгену, его люминисцентный Вариант по Кастену и флуоресцентной краской бисбензимид Н-33258.

Полученные результаты окрашивания Н-33258 представлены на рис. 3. Из микрофотографии Видно, что, как и при окрашивании тионином, наблюдаются клетки с четным и нечетным числом ядер, которые составляют натуральный ряд чисел 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 (фото 1-8). Тут так>ке наблюдаются различия В размерах ядер 8 одной клетке (фото 3), что мы связываем с асинхронностью 8 процессах их деления.

Асинхронность подтверждается и данными цитофотометрического определения количества ДНК после ее окрашивания бисбензимидом Н-33258. Фотометрированы индивидуальные ядра четырнадцати трехъядерных клеток (3 п). В ходе статистической обработки данных пользовались таблицами Стрелкова (1966), причем границы доверительного интервала вычислялись при Вероятности несовпадения 0.05. Результаты этого исследования, выраЖенные в условных единицах, представлены на диаграмме (рис. 4).

Как видно из диаграммы, количество ДНК В ядрах третьей группы (111-18.22), почти в два раза больше чем в первой группе (I-9.58). Вторая группа ядер намного блиЖе к первой группе (11-11.22 : I-9.58) чем к третьей (11-11.22: 111-18.22).

Достоверность различий, представленных на диаграмме (рис.4) проверена при помощи t-критерия Student. При сравнении трех групп ядер получились следующие результаты:

t(l vs.ll = 0.83< t005 = 2.78 - нет значимой разницы t(lvs.lll= 3.86> t006 = 2.78 - есть значимая разница

а

ш

ГГ

ш

Ш

ш

ш

ш

Рис. 3. Клетки штамма Scenedesmus acutus, окрашенные бисбензимидом Н-33258 (1600х).

1. Клетка с одним ядром; 2. Клетка с дбумя ядрами; 3. Клетка с тремя ядрами; 4. Клетка с четырьмя ядрами; 5. Клетка с пятью ядрами; 6. Клетка с шестью ядрами; 7. Клетка с семью ядрами; 8. Клетка с Восьмью ядрами; 9. Клетки, обработанные ДНК-азой.

И

ю

2 а «о

о

5

£ са

0.

12,46

6,70

13,92

8.52

21.64

14,80

I

9,58-238

6,70*12^6

11

Д22± 2,70 8,52т Д9 2

111

18,22*3,42 14,80*21,64

Рис. 4. Диаграмма результатов цитофотометрического определения количества ДНК по люминесценции связанного с ДНК бисбензимида Н-33258.

t(ll vs.Ill = 3.21 > t005 = 2.78 - есть значимая разница, но она меньше ß срабнении с таковой ме>кду I и III группами.

Эти результаты показыбают, что при наличии трех ядер 6 одной клетке, одно из них находится ß более продвинутой фазе митоза по сравнению с остальными, которые не отличаются существенно друг от друга по количеству ДНК и, по всей вероятности, отстают в своем митотическом делении.

Высказанное нами мнение об асинхронном делении ядер подтверждается и результатами проведенных ультраструктурных исследований. Электронная микрофотография (рис. 5) иллюстрирует наличие пяти ядер в одной клетке, которые существенно различаются по своим размерам. Это, на наш взгляд, является еще одним доказательством их асинхронной репродукции. Основание для такого рода толкования результатов дала нам серия электронно-микроскопических фотографий тонких срезов, сделанных последовательно, начиная с верхней части ядер и кончая их ниЖней частью. Приложенная микрофотография представляет усредненные данные всего этого ряда срезов.

На асинхронность указывают и результаты, полученные методам проточной цитофотометрии (flow cytometry). Представленные гистограммы (рис. 6) иллюстрируют плавный, последовательный процесс количественных изменений ДНК в определенные часы одного Жизненного цикла из синхронизированной культуры Scenedesmus acutus. Этот процесс коррелирует с последовательным развитием и делением ядер, наблюдаемым на цитологических картинах при

I-1

1 мкм.

Рис. 5. Электронная микрофотография клетки штамма Scenedesmus acutus.

соштз/аима.

Л >

О Ю 20 10 20 10 20 30 40 50 60 70 80

COJHTS ¡снлшв.

О 10 20

60 Ю 20

60 10 20

Рис. 6. Гистограммы синхронизированной (1. 2. 3, 4, 5) и несинхро-низированной (6) клеточных культур Scenedesmus acutus.

1-нулеВой час; 2-6торой час; 3-четВертый час; 4-Восьмой час; 5-десятый час; 6-несинхронизироВанная культура.

окрашибании тионином и Н-33258. Отсутствие четко Выраженных пикоВ, которые маркировали бы деление ядер на дВе, четыре. Восемь и т.д. показывает, что ядерная репродукция у этого объекта исследования не протекает синхронно.

Результаты проведенных исследований деления ядер у одноклеточных зеленых Водорослей Scenedesmus acutus и Chlorella vulgaris подтверждают нашу рабочую гипотезу, за одним небольшим исключением, на которое мы хотим обратить внимание. В начале мы допускали, что возмоЖно, асинхронно делятся только ядра и когда образуется необходимое „критическое" число ядер, клетки формируют 2-, 4-, 8- или более клеточных ценобиев, после чего они делятся синхронно. Позднее, когда оказалось, что и деление клеток не протекает синхронно, это предположение пришлось скоррегировать, заменяя формулировку „2-, 4-, 8- или более клеточных ценобиев" со „соотвествуюидими клеточными ценобиями".

Основанием для такого предположения были существующие литературные данные кариологических и цитологических исследований одноклеточных зеленых водорослей родов Scenedesmus и Chlorella. В них четко утверждается точка зрения, что размножение у этих организмов осуществляется синхронно, путем протекания нескольких циклов ядерных делений ведущих к формированию 2-, 4- 8- или более клеточных ценобиев, причем число автоспор в них Всегда кратно дбум (2п).

Результаты исследования деления ядер у одноклеточных зеленых водорослей Scenedesmus acutus и Chlorella vulgaris дали нам основание сделать следующие выводы: 1) Деление ядер осуществляется асинхронно, до

образования необходимого числа ядер, когда по Внутриклеточным механизмам клетки формируют соответствующие клеточные ценобии, после чего они приступают к делению. При этом одно из имеющихся В клетке ядер моЖет опереЖат В сбоем разбитии Во Времени другие и В нем раньше осуществится последующее деление. 2) Наблюдение дВух одновременно делящихся ядер В одной клетке (рис.1, фото 5) не означает синхронности В процессах их деления. Это моЖет происходить как случайного совпадения по Времени, связанного с динамическими процессами, В результате которых за короткое Время получается большое число ядер. 3). НеВозмоЖност получить абсолютно синхронизованные культуры сВязана с асинхронностью В процессе деления ядер.

4. Исследования деления клеток у одноклеточных зеленых Водорослей Scenedesmus acutus, Scenedesmus acuminatus и Chlorella vulgaris

В отличие от изучения поведения ядра В одном Жизненном цикле клеток, где синхронизация клеточных культур яВлялась необходимым условием, В этих исследованиях это не было обязательным. Поэтому использовались как синхронизированные, так и несинхронизироВанные клеточные культуры. Единственным требованием было создание таких условий культивирования, при которых полученные культуры имели бы более высокий индекс клеток с повышеным числом автоспор, что дает возможность наблюдать более широкий спектр клеточных ценобиев. Результаты этих исследований даны на рис. 7, 8 и 9.

На рис. 7 предстаблены клеточные ценобии из штамы Scenedesmus acutus. Видно, что кроме ценобиеВ с четным числом дочерних клеток - четырьмя, Восьмю и шестнадцатью (б, е, з) наблюдаются и ценобии с нечетным числом - тремя, пятью, семью и пятнадцатью (а. В, д. Ж). Кроме того, представлен и один 6-клеточный ценобии (г), который пополняет ряд с одного до Восьми.

Интерес Вызывает наблюдаемое различие В размерах Вновьвозникших дочерних клеток (автоспор) одного ценобия (в, е. Ж). Особенно характерен 15-клеточный ценобии (Ж), где одна из автоспор еще не вполне оформлена, а другая - возле нее, крупнее всех остальных.

НуЖно отметить, что Все представленные на рисунка ценобии получены из расположенных левее их исходных (материнских) клеток.

На рис. 8 представлены ценобии Chlorella vulgaris. В этом штамме тоЖе наблюдаются ценобии как с четным числом аВтоспор- четырьмя, восьмью и шестнадцатью (б, е, й), так и с нечетным числом - тремя, пятью, семью, девятью, одиннадцатью и пятнадцатью(а. В, д. Ж, з, и). Представлен и 6-клеточный ценобий (г).

Как видно на рисунке, здесь различия в величине автоспор в отдельных ценобиях более отчетливы, чем у Scenedesmus acutus. Такие различия наблюдаются почти во всех ценобиях, поэтому трудно обсуЖдать их в отдельности. На этом рисунке представлены такЖе исходные (материнские) клетки, из которых получились вышеуказанные ценобии.

Если считать беспорным наличие ценобиев с нечетным числом клеток у штамов Scenedesmus acutus и Chlorella vulgaris (рис. 7 и 8), у которых ценобии

I'Ji

%„• * •

ж

/ ^ А Л 'Г', г

^ • >• v»

/ " ■ • ,1 • л

r

v ^

л

Puc. 7. Клеточные ценобии штамма Scenedesmus acutus (800x).

а. 3-клеточный; б. 4-клеточный S. 5-клеточный; г. 6-клеточный; g. 7-клеточный; е. 8-клеточный; Ж. 15-клеточный; з. 16-клеточный.

Aj

Рис. 8. Клеточные ценобии штамма Chlorella vulgaris (800 х).

а. 3-клеточный; б. 4-клеточный В. 5-клеточный; г. 6-клеточный; д. 7-клеточный; е. 8-клеточный; >к. 9-клеточный; з. 11-клеточный; и. 15-клеточный; 0.16-клеточный.

сравнительно быстро распадаются на отдельные клетки (автоспоры) непосредстВено за делением материнских клеток. Возникает Вопрос - бывают ли такие ценобии и в типичных ценобиальных штаммах, в которых преобладают хорошо оформление 4- и 8-клеточные ценобии, не распадающихся долгое время, иногда вплоть до нового деления. На основе изучения таких штамоВ (Smith, 1914;Sulek, 1969, 1970, 1972, 1975; Pickett-Heaps, 1975 и др.) слоЖилось Впечатление, что ценобиеВ с нечетным числом клеток у них не Встречается.

Ответ на этот Вопрос мы искали, используя типичный ценобиальный штамм Scenedesmus acuminatus. Зарегистрированные клеточные ценобии представлены на рис. 9, на котором видно, что и у Scenedesmus acuminatus, кроме четырех и восьмиклеточных ценобиев (а, б) встречаются и ценобии с тремя, пятью, шестью и семью клетками (в, г, д, е), как у Scenedesmus acutus и Chlorella vulgaris.

Наличие клеточных ценобиеВ с нечетным числом автоспор, представленных на рис. 7, 8 и 9 моЖно считат неоспоримым фактом. Тогда возникает вопрос, не являются ли они эпизодическими случаями, которые происходят при делении аномальных клеток или в результате неоптимальных услоВий культивирования, а такЖе и какова их частота 8 процентах, по сравнению с ценобиями с четным числом клеток. Мы обращаем Внимание на этот вопрос, так как ряд исследователей при наблюдении подобных случаев, оставляли их без особого внимания, по всей вероятности из-за таких соображений.

ч\\

. л Ч

и.

л •• •

г—

ЛлЧ

л ч

• V ..

Рис. 9. Клеточные ценобии штамма Scenedesmus аситтагиэ (800х).

а. 4-клеточный; б. 8-клеточный; В. 3-клеточный; г. 5-клеточный; д. 6-клеточный; е. 7-клеточный.

С целью получения данных, которые помогли бы Выяснить этот Вопрос, проВедены опыты по учету числа различных ВидоВ ценобиеВ, получившихся при делении материнских клеток из штамоВ Scenedesmus acutus и Scenedesmus acuminatus. Результаты представлены на табл. 2 и 3.

Из данных табл. 2 Видно, что процент ценобиев с нечетным числом клеток у Scenedesmus acutus очень высок - от 7.17 до 27.0 для трехклеточных, от 4.5 до 10.67 для пятиклеточных и от 6.84 до 9.67 для семиклеточных, В зависимости от температуры культивирования и продолжительности периода освещения. Сравнительно высокие значения отмечены и для Scenedesmus acuminatus (табл. 3) - 11.2 % для трехклеточных, 4.0 % для пятиклеточных и 0.5 % для семиклеточных.

Статистическая обработка данных табл. 2 при помощи х2"критерия не Выявляет значимых различий меЖду выборками отдельных вариантов опыта, а картины в различных пробах сходные. Значимая разница обнаружена лишь при различиях в температуре на 10° С (t = 20° С vs . t = 30° С). Это слуЖит указанием, что при более низких температурах получаются ценобии с заниженным числом дочерних клеток и, наоборот, более высокие температуры стимулируют получение ценобиеВ с большим числом дочерних клеток (аВтоспор) в них.

Данные табл. 3 такЖе обработаны при, помощи критерия по которому были получены следующие результаты:

х2= 26.7 < х2005 = 61.7 (К = 45)

ТАБЛИЦА 2

Число различных ценобиеВ у Scenedesmus acutus, 6 зависимости от температурного и сВетоВого режимов культибироВания (100 ценобиев на пробу)

Виды Среднее ценобиеб I II III IV V VI значение _IX± «У!

t° = 20°С. РеЖим освещения (18 : 06 часов)

2-клеточные 16 11 19 10 16 12 13.83 ± 3.43

3-клеточные 32 30 27 28 20 25 27.00 4.19

4-клеточные 29 31 21 35 33 36 30.83 5.45

5-клеточные 10 11 13 8 12 9 10.67 1.88

6-клеточные 4 5 5 5 3 4 4.33 0.82

7-клеточные 4 6 11 4 9 7 6.84 2.79

8-клеточные 5 6 4 10 7 7 6.50 ± 2.07

t° = 25°С. Ре>ким освещения (14 : 10 часов)

2-клеточные 5 6 5 10 8 5 6.50 ■+ 2.07

3-клеточные 23 15 25 18 13 17 18.50 ± 4.64

4-клеточные 53 54 54 42 46 55 50.67 5.35

5-клеточные 2 1 2 7 9 6 4.50 3.27

6-клеточные 3 5 2 4 4 3 3.50 1.05

7-клеточные 6 9 3 10 10 8 7.67 -ь 2.73

8-клеточные 8 10 9 9 10 6 8.66 1.50

t° = 30°С. Редким освещения (12 : 12 часов)

2-клеточные 3 1 2 2 2 3 2.17 0.75

3-клеточные 11 7 10 7 3 5 7.17 2.99

4-клеточные1 50 58 47 48 46 50 49.83 4.31

5-клеточные 8 2 8 6 12 7 7.17 3.25

6-клеточные 3 4 7 8 7 8 6.16 2.14

7-клеточные 7 9 12 11 9 10 9.67 1.75

8-клеточные 18 19 14 18 21 17 17.83 2.32

. ТАБЛИЦА 3

Количество различных клеточных цинобиод штамма Scenedesmus acuminatus

(1С0 uSHOüueG на пробу)

Виды ценобиеВ 1 II III IV V VI VII VIII IX X Среднее значение ! X ±

2-клеточные 6 5 5 3 7 4 3 4 3 2 4.20 ±1.55

3-клеточные 14 8 7 14 10 14 14 11 11 9 11.20 ±2.76

4-клеточные 41 43 34 38 43 39 36 40 34 46 39.40 ±4.00

5-клеточные 3 3 7 3 5 2 2 5 4 6 4.00 ± 1.79

6-клегпочные 5 3 5 4 3 3 6 2 3 3 3.70 ±1.25

7-клеточные 1 2 - i - 1 - - - - 0.50 ±0.57

8-клеточные 30 36 42 37 32 37 39 38 45 34 37.00 ±4.45

i Итоги: 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

На основании этих результатов с достоверностью 95 % моЖно утверждать, что картины, полученные для всех десяти проб, сходны. Частоты 7-клеточных ценобиев не учитывались из-за того, что их теоретические частоты оказались меньше 5.

Это указывает на то, что ценобии с нечетным числом дочерних клеток не представляют каких-либо случайных явлений, имеющих место при неоптимальных условиях культивирования, ошибочных методов синхронизации, отклонений от нормального развития или в результате деления аномальных клеток, как это принимается некоторыми исследователями (Tamiya et al., 1961; Zakrys, 1980, 1983 и др.), а возникают в процессе нормального клеточного деления.

Результаты исследования деления клеток дали нам основание сделать следующие выводы: 1) Деление клеток у одноклеточных зеленых водорослей Scenedesmus acutus, Scenedesmus acuminatus и Chloreila vulgaris протекает асинхронно, аналогично деления ядер. Число автоспор моЖет быть как четным, так и нечетным и не отвечает основному требованию, утвердившейся до сих пор точки зрения о синхронном делении клеток, согласно которой их число долЖно быть кратно двум (2п), где (п) означает число циклов деления. 2) Наличние четного числа дочерних клеток (автоспор) - четырех, восьми, шестнадцати и т.д. в одном ценобие не дает основания считать, что процесс их формирования проходил синхронным путем. И ß этих случаях он мог бы иметь асинхронный характер, поскольку ß данном исследовании регистрируются лишь результаты конечных этапов указанных процессов.

Сделанные нами ВыВоды об асинхронном делении ядер и клеток поднимают три существенных Вопроса, требующих серьезного Внимания. Поэтому остановимся на них более подробно.

1. КакоВ характер хода процессов, осуществляющих асинхронное деление ядер, равномерный ли он, с одинаковыми интервалами Времени ме>кду отдельными митотическими циклами, или неравномерный?

На наш Взгляд, эти процессы характеризуются неравномерным протеканием. Основание для этого моЖно найти В самой сути асинхронности, которая утвердилась В процессе эволюции этих самостоятельно существующих эукариотических клеток, по-Видимому с целью обеспечить их репродукцию путем генераций, дающих большое число дочерних клеток. Этот способ лучше, а, ВозмоЖно, только он соответствует потенциальным возможностям клеток, определяющимся их метаболизмом и энергетическим состоянием. Пока мы не моЖем сказать, в каком количестве энергии нуждается клетка, имеющая четыре или восемь ядер, чтобы синхронным путем превратиться в восьми или шестнадцати ядерную. Для того, чтобы установить, существует ли Вообще В ЖиВой природе такой процесс, необходимо проВести много специализированных и точных исследований.

2. В силу каких причин и механизмов одно ядро „решает" приступить ли к последующему делению или сформировать новую дочерную клетку (автоспору)?

Для нас это является самой большой загадкой, поэтому пока мы обойдемся без Всякого обсуждения.

3. Каким способом осуществляется формирование аВтоспор и распределение цитоплазмы В клетке.

происходит ли это сразу после каЖдого митотического деления или после образования определенного числа ядер?

Это - одна из узловых проблем клеточного деления, требующая такЖе серьезного внимания. Еще Smith (1914) отмечает, что процесс формирования 8-клеточных ценобиев заключается в протекании трех серии одновременных циклов ядерных делений и распределения цитоплазмы после формирования четырех дочерних клеток (автоспор). Дальше он добавляет, что у Scenedesmus acutus и Scenedesmus quadricauda второй митоз осуществляется после первого клеточного деления и затем наблюдается период „созревания", когда автоспоры слегка удлиняются.

Мнение Smith о том, что второй митоз следует за первым клеточным делением, разделяется и другими авторами (Soeder, 1965; Pickett-Heaps, 1970; Nilshammar, Walles, 1974). В связи с этим один из них (Pickett-Heaps) отмечает, что это не всегда происходит и имеет незаконченный характер.

Позднее Pickett-Heaps (1975) по этому вопросу высказывает мнение, что деление клетки задерживается до образования хотя бы четырех ядер и не начинается сразу после формирования двух ядер, лишь в тех случаях, когда формируется двухклеточный ценобий. Такой взгляд разделяют и другие авторы (Sulek, 1975, Nicolov, 1986). В отношении трудностей, которые встречаются при подобном роде исследований, Pickett-Heaps признается, что деления, наступающие после окончание митоза, оказались наиболее трудными для ультраструктурного изучения и не поддаются анализу.

Здесь сталкибаемся со множеством невыясненных Вопросов цитокинеза, т.е. распределения цитоплазмы Вслед за образованием требуемого числа ядер, когда клетка долЖна осуществить акт деления. Цитокинез, характеризуется особой сложностью В клетках, которые в норме образуют больше двух дочерних клеток, как и В случае одноклеточных зеленых водорослей - объектов нашего исследования.

В стремлении глубЖе Выяснить состояние этой проблемы, сноВа сошлемся на высказанное Мэзией (1963). Рассматривая некоторые случаи, когда деление ядер не сопровождается делением клеток, и не находя сВязи меЖду митозом и цитокинезом, автор отмечает: Вслед за появлением многих ядер В результате ряда митотических делений через значительный промеЖдуток Времени, моЖет наступить фаза. Во время которой цитоплазма вокруг каЖдого ядра обособляется путем образования перегородок и образует отдельную клетку, причем это происходит так, как будто новые клетки вырезаются из цитоплазматической массы. Для такого деления путем образования перегородок, по видимому, не существует определенного термина. В немецкой литературе оно обозначается „Zerklüftung", а Во французской -„cloisonnenment".

По нашему мнению, таким способом осуществляется цитокинез у одноклеточных зеленых водорослей. Так как этот способ распределения цитоплазм, как отмечено выше, пока не выяснен, а такЖе из-за отсутствия определенного термина для обозначения этого процесса, мы вынуждены обойти его без обсуждения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании Всех проведенных исследований деления ядер и клеток у некоторых одноклеточных зеленых Водорослей родоВ Scenedesmus и Chlorella, мы приходим к заключению, что ядерная и клеточная репродукция у этих эукариотических микроорганизмов осуществляется асинхронным путем. Зтот способ деления моЖет иметь широкое распространение В Живой природе.

Эта наша концепция, с одной стороны, утВерЖдает асинхронное ядерное и клеточное деление В роли естественного биологического процесса и дает ответ на все случаи наблюдаемой асинхронности при синтезе ДНК, В некоторых фазах митоза, такЖе и В поведении ядер и делении отдельных клеток, которые В литературе рассматриваются как случайные явления или исключения. С другой стороны, она Вступает В противоречие с утвердившейся до сих пор точкой зрения о синхронном ядерном и клеточном делении, которая леЖит В основе интерпретации многих исследований В этой области.

На базе анализа литературных и собственных данных мы предлагаем обобщенную схему синхронного и асинхронного деления ядер и клеток (рис. 10).

Рис. 10. Схемма синхронного (А) и асинхронного (Б) деления ядер и клеток (ориг.).

выводы

1. Одноклеточные зеленые Водоросли pogoß Scenedesmus и Chlorella могут с успехом использоВаться В качестве модельных систем при кариологических и цитологических исследования, связанных с делением ядер и клеток.

2. Деление ядер у одноклеточных зеленых водорослей Scenedesmus acutus и Chlorella vulgaris протекает асинхронно, через несколько циклов деления до образования необходимого числа ядер, когда материнские клетки, вслед за формированием соответствующих клеточных ценобиев, приступают к делению. Причем одно из ядер, более продвинутое в своем развитии, чем остальные, раньше их осуществит следующее деление.

3. Наблюдение двух делящихся ядер в одной клетке нельзя считать доказательством синхронности процессов их деления. Это моЖет быть результатом случайного совпадения во времени, связанного с динамическими процессами, обеспечивающими возникновение в короткое время большого числа ядер, необходимые для получения большого количества дочерних клеток (автоспор).

4. Деление клеток у одноклеточных зеленых водорослей Scenedesmus acutus. Scenedesmus acuminatus и Chlorella vulgaris протекает асинхронно, аналогично делению ядер.

5. Наличие четного числа ядер В одной клетке, как и деление материнских клеток на четное число дочерних клеток (aßmocnop), не является доказательством того, что процессы протекали синхронно. И В этих случаях моЖно считать, что они имеют асинхронный характер, поскольку мы регистрируем лишь результаты конечних этапоВ указанных процессов.

6. Установленное нами асинхронное ядерное и клеточное деление как естественный биологический процесс у одноклеточных зеленых Водорослей родоВ Scenedesmus и Chlorella противоречит существующей точке зрения об их синхронной ядерной и клеточной репродукции. Это моЖет слуЖить отправным пунктом будущих исследований, направленных на выяснение проблем, связанных с клеточными делением.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИСЕРТАЦИИ

1. NICOLOV N.N. (1982) Behaviour of the nucleus in the life cycle of Scenedesmus acutus and problem of its genome. Compt. rend. Acad. bulg. Sei., 35, 6, 823-826.

2. NICOLOV N.N., TCHACAROF E.L. (1984) Cytochemical studies on the dinamics of increase in the number of nuclei in the life cycle of Scenedesmus acutus. Ibid., 37, 5, 669-672.

3. NICOLOV N.N., IGNATOV G., SOULTANOVA E.V. (1986) Ultrastructural study of the nuclear reproduction in Scenedesmus acutus. Ibid., 39, 12, 113-115.

4. NICOLOV N.N., HRISTOV K„ HRISTEVA L„ IVANOVA I.A. (1987) Changes in the quantity of DNA at certain hours of the life cycle of Scenedesmus acutus. Ibid., 40, 10, 115-117.

5. NICOLOV N.N. (1990) Asynchronous cell division in unicellular green algae of the Scenedesmus and Chlorella genera. Ibid., 43, 4, 81-84.

6. NICOLOV N.N. (1991) Asynchronous cell division in the unicellular green alga Scenedesmus acuminatus. Ibid., 44, 10, 113-115.

7. НИКОЛОВ H.H. (1991) Асинхронное ядерное и клеточное деление у одноклеточных зеленых Водорослей. Цитология (В печати).