Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аппаратурное и методическое оформление процесса культивирования клеток в условиях пилотируемого космического полета

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Аппаратурное и методическое оформление процесса культивирования клеток в условиях пилотируемого космического полета"

#

#

^ На правах рукописи

Ивакин Олег Викторович

Аппаратурное и методическое оформление процесса культивирования клеток в условиях пилотируемого космического полета.

03.00.23-биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

МОСКВА-1998

Работа выполнена на кафедре промышленной биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ

доктор химических наук, профессор Манаков Михаил Николаевич кандидат технических наук, доцент Марквичев Николай Семенович ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор технических наук профессор Винаров Александр Юрьевич кандидат биологических наук ,с.н.с. Гаязов Ренат Рашидович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Государственный Научный Центр РФ-ИМБП

Защита состоится ' ¿¿о /-/Л* 1998 . ъ/Р^час. На

заседании диссертационного совета Д 053.34.13 в Российском химико-технологическом университете имени Д.И.Менделеева по адресу : 125047,Москва, Миусская пл.,9.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-информационном центре РХТУ им. Д.И.Менделеева.

Автореферат разослан # 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И.И.ГУСЕВА

Актуальность работы.

■ Космическая биотехнология одна из бурно развивающихся в последние годы областей, которая исследует и использует преимущества, возникающие для биологических объектов в условиях микрогравитации, и занимается разработкой принципиально новых биотехнологических процессов предполагаемых к использованию при длительных управляемых полетах. Проведение процессов гибридизации клеток, электрофоретического разделения белков. кристаллизации белков в условиях микрогравитации позволило достичь принципиально новых результатов, невозможных в наземных условиях. В частности, оказалось, что эффективность электрофоретического разделения белков и макромолекул резко возрастает в условиях микрогравитации, как по количественным так и по качественным характеристикам. Кристаллы белков выращенные во время длительных пилотируемых полетов не, имеют аналогов по своим характеристикам и широко используются в дальнейших исследованиях на Земле.

Перспективным научным направлением космической биотехнологии является управляемое культивирование микробных, растительных и животных клеток. Интерес к управляемому культивированию существенно возрастает в условиях длительного космического полета, т.к. это позволяет решить ряд вопросов экономического, экологического, технического и медицинского характера. Применение специальных штамов микроорганизмов и создание соответствующих систем позволяет, в принципе, осуществить систему рециркуляции и переработки газов жидких и твердых отходов в продукты, используемые повторно. Кроме того, возможно использование управляемого культивирования микроорганизмов для создания единой технологической цепи по производству биологически активных веществ и выпуску высоко очищенных препаратов.

Одним из наиболее важных направлений управляемого культивирования в космосе является культивирование клеток тканей человека для исследования влияния длительных воздействий микрогравитации на их генетическую и физиолого-биохимическую устойчивость, с последующим моделированиеми и переносом результатов на органы и ткани человека. Понятно, что это требует, прежде всего, создания соответствующей аппаратуры.

Таким образом разработка и создание систем управляемого культивирования для использования, их в условиях длительного космического полета является весьма актуальной.

Целью данной работы являлось разработка и создание принципиально новой системы непререрывного культивирования клеток в условиях микрогравитации и проведение экспериментов на борту орбитальной станции "Мир" во время пилотируемого полета. В задачи работы входило:

■ разработка принципиально нового подхода и создание системы культивирования в условиях микрогравитации в непре-' рывном режиме;

в создание материально-технической базы системы непрерывного культивирования;

и адаптация созданного оборудования к работе на борту действующей орбитальной станции" Мир";

в создание методической базы подготовки космонавтов;

■ проведение наземного и натурных экспериментов по культивированию клеток;

в анализ и обработка полученных результатов;

Научная новизна работы.

Впервые в мире была разработана и создана аппаратура МКМ-1 (микрокультиватор микроорганизмов) для культивирования клеток в условиях микрогравитации и проведены процессы управляемого культивирования на борту орбитальной станции "Мир" клеток Е.соН как модели микробных и, отчасти . животных клеток.

Впервые в основе системы культивирования был использован полуволоконный мембранный модуль с разделенными вводами и выводами газовой и жидкой питательных сред. Культивирование клеток осуществлялось в межволоконном пространстве в условиях непрерывного подвода газовой и жидкой питательной среды, при одновременном отводе продуктов жизнедеятельности.

Исследована кинетика роста клеток Е.соН в условиях 5 суточного пилотируемого полета и проведено сравнение с наземными результатами, полученными на аналогичной аппаратуре в лабораторных условиях. Показано, что условия микрогравитации оказывают влияние на морфологические' и физиологические характеристики культуры, однако, эти изменения не являются результатом изменения генома.

Практическая значимость

Разработана техническая документация и создано оборудование для культивирования клеток в условиях микрогравитации МКМ-1 ( микрокультиватор микроорганизмов). Оборудование прошло все циклы наземных и предполетных испытаний и было допущено для постановки на борту станции "Мир".

Всего было создано 12. приборов МКМ-1, шесть из которых работали во время экспедиций посещения в течение 5 суток на станции " Мир". (3 экспедиции).

Апробация работы

Материалы работы доложены на Всесоюзной конференции «Космическая биотехнология» (декабрь 1993 г.), конференции молодых ученых РХТУ им. Д.И.Менделеева -1994 г., итоговой конференции по научно- технической программе «биотехнология» ( март 1996 г.).

Публикации

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения экспериментальных

результатов и их обсуждения, выводов. Работа изложена на_

страницах машинописного текста и иллюстрирована рисун-

ками и 3 таблицами. Библиография включает /у ¿7 названий работ, из них ¿'О на иностранных языках.

Результаты и их обсуждение

Исследования по культивированию животных и растительных клеток проводились ранее на борту станции "Салют-5,6" в оборудовании специально разработанном для этих целей. К сожалению все эксперименты, проводимые по этим программам были периодическими в суспензионной культуре или на агаризованной среде. Информативность этих процессов была крайне низка, т.к анализировалась только последняя стадия развития микроорганизмов.

Для реализации процесса культивирования в условиях микрогравитации был разработан и создан микрокультиватор микроорганизмов на основе половолоконного мембранного биореактора. В

По материалам диссертации опубликовано

основу разработки был положен принцип подвода компонентов газовых и жидких сред через гидрофильные и гидрофобные мембраны. Это позволило организовать непрерывный подвод компонентов питания в стерильных условиях к непрерывно растущей культуре при одновременном отборе продуктов жизнедеятельности из зоны культивирования.

На рис.1, показана принципиальная схема реактора для культивирования клеток в котором реализован этот принцип.

В трубчатом реакторе совместно расположены два пучка полых волокон имеющих разные входы и выходы. По пучку волокон гидрофильной природы непрерывно прокачиваются питательная среда содержащая все компоненты питания. По волокнам гидрофобной структуры подается газовая среда заданного состава. Рост клеток осуществляется в межволоконном пространстве и клетки находятся частично в сорбированном состоянии на внешней поверхности мембран либо частично во взвешенном состоянии.

Рис 1

"Vr

12 3 <1 5

Рис. 1. Половоло-конный мембранный биореактор с раздельными вводом и выводом газовой и жидкой фаз.

1-Пробка для крепления гидрофильных волокон

2-Гидрофильное микрофильтрационное волокно

3-Пробка для крепления газовых волокон

4-газовое гидрофобное волокно

5-корпус

А-А штуцера для ввода и вывода жидкой фазы Б-Б штуцера для ввода и вывода газовой фазы С-С штуцера для засева культуры клеток (микроарганизмов)

Транспорт компонентов питания к растущим популяциям микроорганизмов осуществляется по градиенту концентрации и за счет микрофильтрации и диффузии. Одновременно в противоположную

сторону по градиенту конценрацииосухцествляется транспорт продуктов жизнедеятельности клеток.

Таким образом в данном аппарате возможно осуществлять непрерывный подвод компонентов питания при одновременном отводе продуктов жизнедеятельности.

Решение о применении половолоконных мембран в биореакторе выдвинуло к ним ряд специфических требований; прежде всего следовало доказать:

1. Отсутствие отрицательного влияния материала мембран на растущую популяцию микроорганизмов;

2. Отсутствие биодиструктирующего действия со стороны микроорганизмов на материал мембраны.

Нами были исследованы полисульфоновые мембраны с гидрофильной и гидрофобной природой с различным размером пор, разной степенью полимеризации, разной методикой формования и разной активной поверхностью. Биологическую совместимость материалов мембран определяли по изменению кинетики роста клеток Е coly на мясопептонном бульоне в присутствии и отсутствии мембран. Как видно из рисунка 2. кинетика роста клеток практически не отличается

Рис. 2. Кривые роста клеток E.coli культивируемые в периодических условиях в 50 мл. Среды

Отсутствие биодеструкции определяли на волокнах находящихся в жидкости

растущих клеток Е.со11 в течение суток и далее определяли проницаемость мембран по стандартной методике. В том случае если проницаемость мембраны менялась не более чем на 20% то считали , что биодиструкция отсутствует.

Как видно из таблицы 1 проницаемость мембран практически не изменялась под воздействием клеток, что позволило использовать

1 ё

| 0.8 • г

У- Мясо пептонкы» бчгчдн '

C.S г полмсуггвфоиной гидрофильной . мембраны

D.S г пол*сул»фонноС гидрофобной

их нам при разработке и создании системы управляемого культивирования.

Таблица 1

Исследование диструкции мембран под воздействием растущих

клеток E.coli

№ п/п Материал мембран и марка Проницаемость мембран Примечание

до (мл/см2ч"') после (мл/CMV)

1. Полисульфо-ныВГЦ 100 0.2 0.18

2. Полисульфо-ны В ГЦ 15 0.3-10'2 0.25-10"2

3. Полисульфон гидрофобный 0.31* 0.3*

* - г/см2ч"'

Важной характеристикой мембран для их применения в мембранном биориакторе, является скорость диффузии компонентов газовой и жидких фаз через поверхность мембран. Для определения диффузных характеристик мембран нами были проведены эксперименты, в которых определяли скорость диффузии глюкозы, кислорода и углекислого газа через поверхность мембран. Для этого через половолоконный модуль, представленный на рис. За, пропускался стандартный раствор глюкозы с концентрацией 10 г/л.

С другой стороны мембраны пропускалась дистиллированная вода. И тот и другой потоки рециркулировали через мембрану со скоростью не менее 1 м/сек. Скорость диффузии рассчитывали по изменению концентрации глюкозы на внешней стороне мембран.

Изменение скорости движения питательной среды внутри мембраны приводило к изменению скорости диффузии глюкозы. Так при увеличении скорости движения с 0,5 до 1 м/сек скорость возрастает с_4.2 до 7.1 г/см^ч"1 и достигает стационарного состояния при скорости 1,25-1,3 м/сек.

Ж*

Ж

7

1

1

и6

За

36

Рис. 3. Устройство для исследования скорости диффузии жидкости (За) и газов (36) через мембраны

1 -мембранный модуль

2—3- перестальтические насос

4-емкость с глюкозой

5-емкость с дистилированной водой

6- газовый балон

7- монометр

8- ротометр

9- колба с поглощающими растворами

Из этого можно сделать вывод, максимальная диффузионная характеристика мембран достигается тогда, когда снимается эффект концентрационной поляризации при значениях критериях Рей-нольдса около 3000. Диффузия кислорода и углекислого газа через гидрофобную мембрану определяют в аналогичной установке при разных расходах давления газов. Состав газов 20% кислорода, 79,5% азота и 0,5% углекислого газа; в качестве акцептора кислорода и углекислого газа использовали либо пирогалол, либо 10% раствор ЫаОН в воде. Скорость диффузии кислорода определялась по изменению концентрации пирогалола, скорость диффузии углекислого газа по изменению концентрации карбоната и дикарбоната натрия.

Как видно из таблицы 2 скорость диффузии газов возрастала с увеличением порциального давления и достигала максимального значения при значениях (0,6-0,7 Ати). Дальнейшее увеличение давления газов приводило к появлению пузырькового режима фильтрации.

Таблица 2

Скорость диффузии компонентов питания через мембранный модуль

№ Скорость Давление Скорость диффузии компонентов

п/п протока м/сек Ати Глюкоза г/см2 ч"1 С02 г/см2 ч'1 о2 г/см2 ч"1

1. 0 * * *

2. 0.1 2.1 2.3

3. 0.5 4.2 4.5

4. 1.0 6.1 6.4

5. 1.25 6.5 7.5

6. 1.5 7.1 7.8

7. 0.1 0.3 1 0.3 2 0.2 0.2 1

8. 0.3 0.4 1 0.4 5 0.2 8 0.3 1

9. 0.5 0.5 2 0.7 0.3 1 0.3 5

10. 0.7 0.5 4 0.9 0.3 2 0.3 9

* - под воздействием ультрозвуковых колебаний

Так как рост клеток осуществляется в межволоконном пространстве в иммобилизованном или свободном состоянии, то возможно предположить, что в межволоконном пространстве наблюдаются градиенты концентрации компонентов питания и продуктов жизнедеятельности. Для снижения градиентов в межволоконном пространстве и увеличения гомогенности в зоне роста клеток нами были использованы интенсификаторы массобмена ультрозвуковой природы. Для этого в половолоконный реактор вводили интенсификаторы различной конфигурации.

Они вводились, как в корпус реактора в межволоконное пространство, так и в торцы реактора по ходу движения газовых и жидкостных потоков. Накладывание ультразвуковых колебаний разной мощности и частоты приводило к существенному увеличению диффузии газовых и жидкостных компонентов (таблица 2).

Однако, одновременно с увеличением массообменных характеристик возможно влияние ультразвуковых колебаний на морфологические и физиологические характеристики культивируемых клеток микроорганизмов. В связи со стационарной работой прибора МКМ-1 использование ультрозвуковых интенсификаторов в условиях полета не представилось возможным.

ции

1. Пробоотборник для суспензии клеток

2. Пробоотборник для питательной среды 3 н- 4 Краны

5. Фильтр стерилизации газов

6. Мембранный модуль

7 + 8 Перистальтические насосы

9. Емкость для питательной среды с изменяющейся геометрии

10. Адсорбер для очистки выходящих газов

11. Стерилизирующий фильтр

12. Блок регулировки температуры

Проведенные исследования позволили нам создать систему культивирования микробных и животных клеток в условиях микрогравитации. Основой системы является половолоконный мембранный модуль с рассредоточенной подачей компонентов газовых и жидкостных сред. Так как данная система предназначалась для ус-

ловий микрогравитации, и рассчитана на эксплуатацию во время экспедиций посещения, то в основу установки заложены принципы, позволяющие осуществлять непрерывное культивирование микробных и животных клеток в течение 5 суток. На рис.4 представлена принципиальная схема установки МКМ-1.

Исследуемые клетки культивируют в межволоконном пространстве при термостатировании. В волокна гидрофильной природы из емкости 9 перистальтическим насосом с заданной постоянной скоростью передается питательная среда компоненты которой дифун-дируют в межволоконное пространство. Одновременно из межволоконного пространства в питательную среду дифундируют продукты жизнедеятельности организмов. Выходящая из волокон питательная среда возвращается в исходную емкость.

В волокна гидрофобной природы перестальтическим насосом подается газовая смесь с небольшими избыточным давлением и также происходит диффузия газов в жидкую питательную среду.

На выходе газовой питательной среды стоит адсорбер улавливающий остатки влаги.

Особенностями такой конструкции является то что в ходе эксперимента возможен отбор проб питательной среды и суспензии клеток из межволоконного пространства. Для этого емкость питательной среды соединена с 5-ю пробоотборниками, которые перед началом эксперимента вакуумируют и закрывают, все 5 вакуумирован-ных пробоотборников соединены с межволоконным пространством мембранного биореактора. Емкость с питательной средой имеет изменяющийся геометрический объем и скорость изменения этого объема линейна и заранее задана. Конструктивной особенностью установки обусловленной спецификой космических экспериментов является то, что прибор состоит из 2-х модулей : модуля управления и возвращаемого модуля. В состав возвращаемого модуля входит: реактор, пробоотборники, емкость с питательной средой и вся газовые и жидкостные магистрали. При расстыковке модулей герметичность газовых и жидкостных магистралей не нарушается. Стерилизацию всей системы можно проводить облучением с дозой 2,5 (Мрад).

Эксперименты по культивированию клеток в МКМ-1

Следующим этапом наших исследований было проведение культивирования в установке МКМ-1 клеток Е.со1у с целью установления кинетики роста микроорганизмов и отработки режимов культи-

вирования. В качестве объектов исследований были выбраны генно-инженерные клетки Е.со1у способные к продукции ферментов лю-цифиразного комплекса. Наличие у клеток лгоцифиразного комплекса позволило определять физиологическое состояние культуры по интенсивности свечения. Первоначально клетки выращивали в периодических установках на стандартной питательной среде и далее через заправочные штуцера переносили в межволоконное пространство. Аппарат перед засевом клеток готовили и стерилизовали в соответствии с разработанными нами методиками и инструкциями.

Культивирование клеток Е.со1у проводили в течение 5 суток при этом каждые сутки отбирали пробы питательной среды и суспензии клеток из межволоконного пространства. На рис. 5 представлены характерные кривые изменения концентрации субстрата и клеток. Как видно из рис. 5, кривая роста концентрации микроорганизмов и изменение концентрации субстрата описываются э- образной зависимостью. То есть клетки, формально находясь в непрерывном режиме культивирования, развивались в соответствии с экспонециаль-• ным законом и последовательно проходили все стадии развития.

Рис. 5. Рост клеток Е.соН в мембранном биореакторе в наземных условиях при разных начальных объемах питательной среды.

I—»-Объем 100 мл] )-*- объем 120 ил ! '[^^Объвм_150 мл]

Сутки

Стационарность культуры обусловлена тем, что скорость роста клеток становится соизмерима со скоростью отвода суспензии из реак-

тора Проведение экспериментов с разными начальными объемами питательной среды в емкости 9 показало, что количество клеток и форма кривой роста зависят от начального количества питательной среды (рис.5)

Проведение контрольных экспериментов в простых переодических условиях показало, что наша схема культивирования не оказывает существенного влияния на кинетические и физиологические характеристики клеток, о чем свидетельствуют сравнительные характеристики активности и скорости роста микроорганизмов. На следующем этапе исследований были составлены циклограммы полета, когда в наземных условиях моделировались временные интервалы от момента посева до момента прибытия биореактора в научную лабораторию.Примерная циклограмма полета показана на рис.6.

СутКМ

Рис. 6. Температурная циклограмма работы прибора МКМ-1

1. Захалаживание прибора до +4°С.

2. Подключение прибора и начало работы.

3. Отключение прибора, спуск с орбиты, доставка в лабораторию.

В ходе составления циклограммы полета нами исследовались культуры микроорганизмов на всем ее протяжении. В ходе обработки циклограммы полета определяли физиологические характеристики клеток в пробах и непосредственно прирост клеток в аппарате.

Физиологическую активность определяли по % живых клеток в высевах на агаризованные среды и интенсивности свечения в стандартных условиях.

Рост клеток начинался только после включения прибора и начала прокачки питательной среды через полые волокна реактора.

Таблица 3

№ % количество кле- Интенсивность Прирост клеток

п/п ток свечения опт. ед.

1 5 -106 2-1(f 0

2 4,2-Ю6 1,8-10*' 0

3 4,8 -106 1,8-10г 0,02

4 4,5 -Ю" 1,7-10^ 0

Как видно из таблицы 3 клетки E.coli практически не меняли свою физиологическую активность и концентрацию после внесения их в мембранный реактор и двух суточного хранения.

Отработка и проведение наземных экспериментов позволило нам осуществлять управляемое культивирование E.coli в условиях пилотируемой станции "Мир".

Все экипажи прошли специализированный курс подготовки для работы с аппаратом МКМ-1.

Курс подготовки включал в себя теоретические и практические занятия по общей биотехнологии и отработка навыков работы с прибором МКМ-1 . Для проведения экспериментов была разработана специальная бортовая и наземная документация и инструкции.

Эксперименты по культивированию клеток E.coli проводили во время трех полетов на орбитальную станцию «Мир» в течении 5 суток.

Эксперимент проводился в соответствии с полученной ранее циклограммой. Клетки E.coli выращивались в течение суток в периодических условиях, центрифугировали, отмывали физиологическим раствором и переносили в подготовленный и заправленный питательной средой раствор. Дальше весь аппарат захолаживался и помещался в специальный термостатируемый контейнер в котором осуществлялась транспортировка на Байконур. Аппарат загружался в космический корабль за час до закрытия люков. После стыковки космического корабля и станции «Мир» прибор закреплялся в штатном положении и включался космонавтами. Одновременно начинался контрольный эксперимент в лаборатории.

7а

Сутки

76

Рис. 7 Рост клеток Е.соН в мембранном биореакторе в наземных условиях и в условиях микрогравитации.

Каждые сутки космонавт отбирал пробы суспензий клеток и питательной среды. После окончания эксперимента возвращаемый модуль отстыковывался, помещался в контейнер и спускался на Землю.

Через 5-6 часов после приземления результаты анализировались в лаборатории. Аналогичные результаты были получены при проведении 2 других экспериментов. Во втором эксперименте все условия были аналогичны первому, для подтверждения полученных результатов. В третьем эксперименте были изменены объемы начальной питательной среды.

На рис.7приведены результаты эксперимента культивирования клеток в условиях микрогравитации и контрольных экспериментов, проводимых по аналогичной циклограмме в наземных условиях. Как видно из рисунков кинетика роста клеток Е.со1у в контрольных и наземных экспериментах практически не отличаются и соответствуют тем закономерностям, которые были выявлены при отработке циклограммы полета, однако анализ физиологических характеристик клеток полученных из мембранных биореакторов работавших в условиях микрогравитации показали, что метоболическая активность клеток выраженная в люцифиразной активности резко возросла Люцифиразная активность возрастала в 170-200 раз и при последующих посевах клеток на агаризованные среды сохранялась в течение 3-4 генераций на постоянном уровне. Последующие пересевы привели к снижению люцифиразной активности и через 10-11 генераций активность пришла в норму.

Кинетика роста клеток Е.соН практически не отличалась от результатов, полученных нами в наземных условиях.

Таким образом проведенные эксперименты показали , что система культивирования МКМ-1 на основе мембранного половоло-конного модуля работоспособна и надежна к условиям микрогравитации.

ВЫВОДЫ

а Разработана и создана система МКМ-1 для культивирования микробных и других видов клеток в условиях микрогравитации на основе мембранного биореактора (Х-реактора);

о Исследованы массообменные характеристики мембранного биореактора по газовым и растворенным компонентам питательной среды и продуктам жизнедеятельности;

Ш Исследована кинетика роста клеток Е.соН в мембранном X реакторе;

Показано, что кинетика их роста в условиях микрогравитации не отличается от кинетики роста в наземных условиях. Однако морфолого-физиологаческие характеристики клеток в условиях полета меняются; я Исследована биологическая совместимость мембранного реактора с культивированными клетками Е.соН. а Показано, что система культивирования клеток МКМ-1 пригодна для использования в условиях микрогравитации и позволяет исследовать кинетику роста клеток в условиях краткосрочного пилотируемого полета.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Ивакин О.В, Кутепова О.А. Особенности выполнения научной программы биологических исследований и профессиональной подготовки космонавтов.// 3-я международная научно-прктическая конференция "Пилотируемые полеты в космосе "Тезисы докл.,стр.100-102(3вездный городок, 1997 г.)

2. Ивакин О.В, Кутепова О.А., Левинских М.А., Гурьева Т.С. Совершенствование подготовки экипажей орбитальных пилотируемых комплексов необходимое условие для успешной реализации программы космических биологических исследований. // "XI конференция по космической биологии и авиакосмической медицине". Тезисы докл. (Москва, 1998 г.)

3. Ивакин О.В, Богданов М ,Н., Марквичев Н .С. Основы космической биотехнологии.// Учебное пособие для подготовки космонавтов (Звездный городок, 1992 г.)

4. Ивакин О.В, Богданов М .К., Самотойлов В.Н. Космические исследования за рубежом // Учебное пособие для подготовки космонавтов (Звездный городок, 1994 г.)