Антигемоглобиновая активность микроорганизмов

Ханина, Елена Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Антигемоглобиновая активность микроорганизмов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антигемоглобиновая активность микроорганизмов"

На правах рукописи

ХАНИНА Елена Алексеевна

АНТИГЕМОГЛОБИНОВАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ

03.00.07 - «Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оренбург 2006

Работа выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Научный руководитель

Доктор медицинских наук, профессор Усвяцов Борис Яковлевич Официальные оппоненты

Доктор биологических наук Карташова Ольга Львовна

Доктор медицинских наук Абрамзон Олег Моисеевич

Ведущая организация

Челябинская государственная медицинская академия

Защита состоится^ в Ю часов на заседании диссерта-

ционного совета Д.208.066.03 в Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан « -5~~» ^длХи^ 2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Н.В. Немцева

ZOO Gft

-ЮАЪО 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В настоящее время большое внимание уделяют проблеме развития анемии при инфекционных заболеваниях (Папаян A.B., 2001, Гусева С.А., 2004). В связи с этим, актуально изучение роли микроорганизмов в развитии анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях. Важно изучить механизмы взаимодействия бактерий с эритроцитами при проникновении патогена в кровь (сепсис, бактериемия) (Пархоменко Ю.Г., 2005). Описано взаимодействие с эритроцитами стафилококков (Бухарин О.В., 2002), стрептококков (Дмитриев H.A., 2000), менингококков (Дельвиг A.A., 2000, Гамзулина JI.H., 2003), энтеро-бактерий (Бондаренко В.М., 2002), лептоспир (Авдеева М.Г., 2001) и других микроорганизмов.

Выделяют несколько форм взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами: адгезия, гемолиз и изменение молекулы гемоглобина. Эритроциты имеют на своей поверхности гликофорин - вещество, идентичное гликокалису эпителиальных клеток, на котором расположены рецепторы для адгезинов микробов (Телесманич Н.Р., 2004).

Многие патогенные бактерии вырабатывают экзоферменты и экзотоксины, которые способны повреждать плазматическую мембрану эритроцитов с помощью ферментативного гидролиза или в результате формирования пор (Panchal R.G., 1995). Особое место в ряду факторов патогенности бактерий занимают внеклеточно секретируемые молекулы с мембраноповреждающей способностью, получившие общее название «гемолизины». Микроорганизмы, синтезирующие данные молекулы, обладают гемолитической активностью, в результате чего происходит лизис эритроцитов с последующим освобождением гемоглобина (Walker В., 1995).

Гемолитическая активность (гемолизины) многих микроорганизмов рассматривается на этапе взаимодействия с мембраной эритроцитов, а ее роль в изменении молекулы гемоглобина, с целью обмена железа, изучена недостаточно. Есть данные, что менингококки и холерные вибрионы выделяют гемолизины, которые являются железо-регулирующими белками (Fe-Pb) (Дельвиг A.A., 1999, Меньшикова Е.А., 2004).

Известно, что способность усвоения железа является для большинства патогенных бактерий необходимым фактором сохранения жизнеспособности в организме хозяина - одна ляющих их патогенность (Гаврилова H.A., 2000).

тащщншш-

3 орщиеяметешина С.-Петербург ОЭ 200£акт tj-jf

железо существует в виде комплексов с гемоглобином, гемином и ферритином. Патогенные бактерии, попадая в организм хозяина, должны активно обеспечивать себя ионами железа (Кострова Ю.М., 2005). Сорбируя из среды железо, бактерии приобретают способность лучше противостоять неблагоприятным факторам, а также получают преимущества в конкурентной борьбе (Бухарин О.В., 2005).

Под действием патогенов метаболизм железа нарушается и многие инфекционные заболевания часто сопровождаются развитием анемии. В расшифровке анемии микробной этиологии необходимо изучить роль факторов патогенности бактерий при взаимодействии с эритроцитами и непосредственно с гемоглобином.

Вместе с тем, особенности механизмов взаимодействия бактерий с эритроцитами изучены недостаточно.

Цель исследования. Изучение роли гемолитической и антиге-моглобиновой активностей микроорганизмов при взаимодействии с эритроцитами. Задачи исследования.

1. Разработать методы количественного определения гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов.

2. Изучить распространенность и выраженность гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов с учетом их биологии и экологии.

3. Оценить роль гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов во взаимодействии с эритроцитами при экспериментальной инфекции и в клинико-лабораторных исследованиях.

4. Разработать метод прогнозирования развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях с учетом гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов.

Научная новизна.

Обнаружен новый признак у микроорганизмов - антигемоглоби-новая активность. Разработан метод выявления данного признака, основанный на определении остаточного гемоглобина в субстрате после взаимодействия с бактериальной культурой (патент РФ на изобретение № 2262705 от 20 октября 2005). Выявлено, что частота и уровень экспрессии антигемоглобиновой активности связаны с видовой принадлежностью микроорганизмов и особенностями их экологии. Впервые

установлена связь между изменением концентрации гемоглобина крови и уровнем экспрессии гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов. Впервые установлен феномен внутри-эритроцитарного расположения бактерий. В электронно-микроскопическом исследовании доказано, что стафилококки с высоким уровнем экспрессии гемолитической и антигемоглобиновой активностей способны локализоваться, размножаться внутри эритроцитов, разрушая гемоглобин, тогда как стафилококки с низким уровнем выраженности данных свойств проникали, но подвергались внутри эритроцитов деструктивным изменениям.

По спектральному анализу молекулы гемоглобина показана связь между уровнем гемолитической, антигемоглобиновой активностей микроорганизмов и глубиной конформационных изменений как в белковой, так и в гемовой частях гемоглобина.

Предложен методический ключ для изучения взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами, позволяющий открыть новые подходы к оценке роли факторов патогенности бактерий в механизмах развития анемии при инфекционных заболеваниях. Использование нового методического подхода позволило разработать метод прогнозирования развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях (заявка на изобретение № 2005129824/15(033449)).

Научно-практическая ценность. Полученные данные расширяют теоретические представления о патогенных свойствах микроорганизмов при взаимодействии с эритроцитами.

Практическое значение исследований определяется разработкой методов оценки взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами. Предложенные методические приемы: фотометрические методы количественного определения гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов могут быть использованы в клинико-бактериологических лабораториях для прогнозирования развития анемии при инфекционных заболеваниях, а также в научно-исследовательских лабораториях для изучения механизмов взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами.

Положения, выносимые на защиту

1. Обнаружена антигемоглобиновая активность микро-

организмов. Штаммы бактерий с высоким уровнем экспрессии гемолитической и антигемоглобиновой активностей вызывают снижение концентрации гемо

глобина в крови у экспериментальных животных и у больных гнойно-воспалительными заболеваниями.

2. Патогенные микроорганизмы с гемолитической и ан-тигемоглобиновой активностями способны проникать внутрь эритроцитов, изменяя структуру и функцию гемоглобина.

3. На основе оценки особенностей взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами предложен методический подход к прогнозированию развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях.

Апробация работы.

Результаты работы доложены и обсуждены на: Региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 2003; 2004); IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2004); Конференции по программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки-медицине» (Москва, 2004); Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2005); II межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и медицины» (Ижевск, 2005); Российской научной конференции «Педиатрия: из XIX в XXI век» (Санкт-Петербург, 2005); XIX научном совещании гистологов «Актуальные проблемы учения о тканях» (Санкт-Петербург, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 публикации в рецензируемых научных журналах, получен патент РФ на изобретение № 2262705 от 20 октября 2005 года.

Объем и структура диссертационной работы.

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, приложение. Указатель литературы содержит 142 отечественных и 42 зарубежных источника литературы. Текст иллюстрирован 10 таблицами и 24 рисунками.

Связь работы с научными программами.

Диссертационное исследование является фрагментом научно-исследовательской работы, проводимой в рамках темы открытого плана НИР ИКиВС УрО РАН «Изучение симбиотических взаимоотношений в микробиоценозах тела человека» (№ гос.регистрации 01.2.00

104756) и программ Президиума Российской академии наук «Научные основы сохранения биоразнообразия России» («Биоразнообразие»), а также «Фундаментальные науки - медицине».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использовано 349 штаммов микроорганизмов разных таксономических групп: Staphylococcus (318 штаммов), Enterobacteri-асеае (16 штаммов), Bacillus (11 штаммов), Pseudomonas (2 штамма), Streptococcus (2 штамма). Среди них 109 клинических штаммов, выделенных от больных с различными формами гнойно-воспалительных заболеваний (ГВЗ); 110 штаммов, выделенных со слизистой оболочки миндалин и носовой полости клинически здоровых людей и 130 штаммов, выделенных со слизистой оболочки миндалин и носовой полости от больных анемией смешанной этиологии. Выделение и идентификацию штаммов микроорганизмов проводили на основании общепринятых методов по морфологическим, тинкториальным, куль-туральным и биохимическим свойствам (Биргер М.О., 1982). Для идентификации использовали стандартные системы StreptoTest, StaphyTest, EnteroTest (LaChema, Чехия).

У выделенных штаммов микроорганизмов изучали факторы па-тогенности: плазмокоагулазную (КоА), лецитовителлазную (ЛецА) и антилизоцимную (АЛА) активности по общепринятым методикам (Биргер М.О., 1982; Бухарин О.В. и соав., 1999). Гемолитическую активность (ГА) оценивали при помощи разработанного фотометрического метода с использованием калибровочной кривой гемолиза. Для получения калибровочной кривой процента гемолиза использовали раствор сапонина с разной концентрацией от 0,1% до 9,3-10"11 %. Каждое разведение сапонина в объеме 1 мл смешивали с 5% взвесью эритроцитов объемом 0,5 мл и мясо-пептонным бульоном в объеме 1 мл. Затем с помощью фотометра «ИФА-ОЭП» (длина волны 492 нм, синий светофильтр) замеряли изменение оптической плотности исследуемых растворов с разными концентрациями сапонина и вычисляли процент гемолиза. Гемолитическую активность микроорганизмов определяли следующим образом: супернатанты исследуемых культур в объеме 1 мл смешивали с 5% взвесью эритроцитов объемом 0,25 мл и инкубировали 3 часа при t=37°C. В качестве контроля использовали мясо-пептонный бульон (1 мл) в смеси с 5% взвесью эритроцитов (0,25 мл). Далее замеряли оптическую плотность исследуемых растворов и по калибровочной кривой определяли % гемолиза. Данный ме

тод, в отличие от чашечного, повышает достоверность количественного определения ГА. Микроорганизмы по уровню ГА с учетом калибровочной кривой гемолиза разделили на две группы: 1>70% гемолиза - высокий уровень ГА; 2.<70% гемолиза - низкий уровень ГА.

Для определения антигемоглобиновой активности (АнтиНЬА) использовали супернатанты исследуемых микроорганизмов в объеме 0,2 мл и смешивали с 0,02 мл раствора гемоглобина в концентрации 120 г/л, взятого из набора реагентов для определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом (Кушаковский М.С., 1968). В качестве контроля брали 0,2 мл мясо-пептонного бульона, смешанного с 0,02 мл раствора гемоглобина. Далее опытные и контрольную пробы добавляли к 5 мл трансформирующего раствора (смесь натрия углекислого кислого, 1,0 г; калия железосинеродистого, 200 мг и ацетонци-ангидрина 0,5 мл в 1 л дистиллированной воды) и инкубировали 15 мин при t=18-25°C. Затем по разнице концентраций гемоглобина в опытных и контрольной пробах определяли антигемоглобиновую активность исследуемых микроорганизмов. Штаммы по уровню экспрессии АнтиНЬА разделили на две группы: >3 г/л - высокий уровень; <3 г/л - низкий уровень.

Материалы, полученные в результате экспериментальных исследований, были подвергнуты статистической обработке с использованием параметрических и непараметрических методов (Урбах И.Ю., 1975; Лакин Г.Ф., 1990). Корреляционный анализ проведен методом Пирсона. Расчеты осуществлялись с использованием компьютерных программ SPSS 8.0 for Windows, Microsoft Excel.

Результаты исследования

Изучено видовое разнообразие представителей микрофлоры различных биотопов тела человека. Микрофлора слизистых оболочек миндалин и носа здоровых людей, по сравнению с группой обследованных больных, характеризовалась, в основном, представителями рода Staphylococcus, тогда как микрофлора слизистых оболочек носа и миндалин у больных анемией смешанной этиологии была представлена бактериями рода Staphylococcus (86,7±2,6%), а также встречались представители родов Bacillus (8,5±3,0%) и Klebsiella (4,8±2,3%). Микрофлора очагов гнойно-воспалительных заболеваний была представлена 6 родами бактерий. Из них первостепенное место занимал род Staphylococcus (83,2±3,5%), представители семейства Enterobacteri-асеае (роды Escherichia, Klebsiella) выделялись в 10,2±2,8% случаев. Штаммы рода Bacillus встречались в 2,8±1,5% случаев. В равном про

центном соотношении наблюдали распространение представителей родов Pseudomonas и Streptococcus, что составило 1,9±1,3%.

В связи с тем, что было обнаружено новое свойство - антигемо-глобиновая активность, то представляло интерес изучить распространение данного признака среди микроорганизмов. Разные виды бактерий обладали способностью инактивировать гемоглобин (табл.1).

Таблица 1.

Распространенность и выраженность антигемоглобино-вой активности среди разных видов микроорганизмов

№ п/п Вид микроорганизма Количество изученных штаммов (n) Распространенность АнтиНЬА,% Выраженность АнтиНЬА, г/л

1. S.aureus 88 70,2±4,8 8,9±0,6

2. S.epidermidis 83 57,6±5,4 5,9±0,4

3. S. saprophytics 38 48,6±8,1 4,8±0,6

4. S.cohnii 31 53,5±8,9 5,1±0,7

5. S.xylosus 21 45,0±10,8 3,9±0,8

6. S.simulans 16 43,8±12,4 2,1 ±0,8

7. S.capitis 15 28,5± 11,6 0,8±0,4

8. S.caprae 12 33,3±13,6 1,2±0,8

9. B.subtilis 11 78,5±10,9 6,4±0,5

10. E.coli 7 71,4±17,1 7,5±1,4

11. K.pneumoniae 9 66,6±15,7 3,2±0,8

12. P.aeruginosa 2 100 9,6±3,5

Первостепенное место по распространенности изучаемого признака среди Гр- бактерий занимали E.coli, что составляло 71,4±17,1%, среди K.pneumoniae обнаружено 66,6±15,7% активных штаммов. У представителей Гр+ палочек (B.subtilis) наблюдали наиболее высокие значения АнтиНЬА по частоте встречаемости (78,5±10,9%). Среди бактерий рода Staphylococcus наиболее часто встречалась АнтиНЬА у

S.aureus - 70,2±4,8%. В группе коагулазоотрицательных стафилококков наиболее выражена АнтиНЬА по распространенности у S.epidermidis и S.cohnii, что составило 57,6±5,4% и 53,5±8,9% соответственно. У остальных видов частота встречаемости колебалась от

28,5±11,6% до 48,6±8,1 посредине значения антигемоглобиновой активности микроорганизмов варьировали от 0,8 до 9,6 г/л. Среди рода Staphylococcus выраженность изучаемого признака преобладала у S.aureus и составила 8,9±0,6г/л. В группе коагулазоотрицательных стафилококков наиболее выражена АнтиНЬА у S.epidermidis и S.cohnii: 5,9±0,4г/л и 5,1±0,7г/л соответственно. У остальных видов стафилококков наблюдался средний уровень изучаемого признака, который колебался от 0,8±0,4г/л до 4,8±0,6г/л. Высоких показателей достигла АнтиНЬА у штаммов кишечной палочки, средний уровень которых составил - 7,5±1,4 г/л. Значение изучаемого признака у B.subtilis составило в среднем 6,4±0,5 г/л. Наиболее высокий уровень выраженности антигемоглобиновой активности оказался у Pseudomonas aeruginosa и составил 9,6±3,5 г/л. При исследовании антигемоглобиновой и гемолитической активностей микроорганизмов оказалось, что некоторые штаммы обладали только одним свойством и не проявляли другой признак. У 2 штаммов S.aureus наблюдали только одну активность - ГА (48,4±2,6% гемолиза) и не обнаружили АнтиНЬА (0 г/л). 5 штаммов S.epidermidis, 2 штамма S.saprophyticus, 2 штамма S.xylosus и S.cohnii выделялись с уровнем выраженности ГА равной 62-84% гемолиза, но без АнтиНЬА (0 г/л).

Полученные результаты позволяют предполагать, что гемолитическая и антигемоглобиновая активности микроорганизмов два разных свойства, однако это требует дальнейшего изучения.

На следующем этапе была изучена связь ГА и АнтиНЬА с источником выделения и биотопом. Установлены различия в экспрессии факторов патогенности и антигемоглобиновой активности у штаммов, выделенных от больных и здоровых людей (рис.1). Наиболее часто плазмокоагулазной активностью обладали штаммы, выделенные из групп больных с ГВЗ и больных анемией смешанной этиологией (39,0±4,7% и 29,7±4,2% соответственно) по сравнению со штаммами от здоровых лиц (19,1 ±3,7%). В 2 раза чаще выделялись штаммы с ле-цитовителлазной активностью от больных с ГВЗ, чем от больных анемией смешанной этиологии и от здоровых лиц (45,3±4,9% против 25,6±4,0% и 20,9±3,8%, р<0,05). Штаммы с высоким уровнем ГА (>70% гемолиза) и АнтиНЬА (>3г/л) в 2 раза чаще выделялись от двух

групп обследованных больных: больных ГВЗ и больных анемией смешанной этиологии, чем от здоровых лиц, что составляло: ГА -68,7±4,4% и 71,8±3,9% против 36,4±4,6%, р<0,05; АнтиНЬА - 72,3±4,2 и 60±4,1 против 34,3±4,5 г/л, р<0,05. В 2 раза чаще выделялись штаммы с высоким уровнем АЛА от больных с ГВЗ (49,4±4,8%) и от больных анемией смешанной этиологии (46,2±4,6%), чем от здоровых лиц (23,3±4,0%), р<0,05.

^ (яЛ

В Больные ГВЗ

D Больные анемией смешанной этиологии к Здоров ые

Примечание 1,2,3 - достоверность отличий при р<0,05

Рисунок 1 - Распространенность и выраженность факторов патогенности микроорганизмов, выделенных от больных и здоровых лиц

При анализе биоразнообразия микроорганизмов различных биотопов по двум исследуемым признакам, - гемолитической и антигемо-глобиновой активностей, - получили следующие данные. Оказалось, что в 1,4-3,3 раза чаще высокими значениями ГА и АнтиНЬА обладали штаммы S.aureus, выделенные из очага воспаления, по сравнению со штаммами из микробиоценозов миндалин и носовой полости от больных анемией смешанной этиологии.

Среди условно-патогенных видов в 1,4-2,5 раза чаще выделялись штаммы S.epidermidis с высоким уровнем экспрессии данных свойств из очага воспаления, чем из микробиоценоза миндалин и носовой полости больных анемией.

Установлена прямая корреляционная зависимость между гемолитической, антигемоглобиновой активностей исследуемых микроорганизмов с некоторыми факторами патогенности. Штаммы, обладающие высоким уровнем гемолитической и антигемоглобиновой активностью, характеризовались высокими значениями плазмокоагулазной, лецитовителлазной и антилизоцимной активностями (г= 0,46). В связи с этим, антигемоглобиновую активность мы рассматривали как один из возможных факторов патогенности микроорганизмов.

Известно, что многие инфекционные заболевания сопровождаются развитием анемии, но роль факторов патогенности в развитии анемии изучена недостаточно. Для этого на следующем этапе данной работы были исследованы гемолитическая и антигемоглобиновая активности микроорганизмов при взаимодействии с эритроцитами в условиях in vitro и in vivo. В условиях in vitro проводили взаимодействие стафилококков с эритроцитами крови человека. Был отобран штамм Staphylococcus epidermidis с высоким значением как ГА (83,5% гемолиза), так и АнтиНЪА (6,5 г/л). Смешивали отмытые буферным раствором эритроциты в концентрации 106 кл/мл объемом 1 мл с 1 млрд. взвесью штамма S.epidermidis объемом 3 мл, после чего добавляли 1мл среды 199 и инкубировали 6 ч при t=37°C. Затем три раза отмывали с помощью центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 мин с применением 0,2 н фосфатного буфера (рН=7,2). Часть полученных осадков обрабатывали для световой микроскопии по известной методике (Предтеченский В.Е., 1960). Другую часть полученных осадков обрабатывали методами для электронной микроскопии (Hayat М.А., 1989).

При световой микроскопии, была обнаружена адгезия S.epidermidis. На поверхности и около эритроцитов были видны многочисленные кокки. В некоторых эритроцитах обнаруживались вакуоли, внутри которых локализовались бактерии. Было сделано предположение о внутриклеточной локализации стафилококков.

С помощью электронной микроскопии наблюдали скопление кокков между эритроцитами. При этом бактерии имели признаки ци-тотомии, что свидетельствовало об их делении. Сами эритроциты находились в состоянии пойкилоцитоза и анизоцитоза. Одновременно

наблюдались «опустошенные» эритроциты, не имеющие ультраструктурных эквивалентов гемоглобина («тени» эритроцитов). Такое изменение формы и размера эритроцитов могло свидетельствовать о начале развития анемии (Павлова М.П., 1988; Гусева С.А., 2004).

Вопрос о возможном проникновении стафилококков внутрь эритроцитов оставался открытым.

Была воспроизведена экспериментальная генерализованная инфекция путем внутривенного заражения стафилококком 15 белых нелинейных мышей, массой 18-20 г.

Для заражения были получены (методом популяционного анализа (Lederberg J. Lederberg Е.М., 1958)) изогенные клоны штамма Staphylococcus epidermidis, выделенного из очага гнойно-воспалительной инфекции. Один клон (№5) обладал высоким уровнем ГА (73,2% гемолиза) и высоким уровнем АнтиНЬА (10,6 г/л). Другой клон (№9) обладал низкими значениями как ГА (39,4% гемолиза), так и АнтиНЬА (0 г/л). Внутривенное инфицирование 2-х групп мышей проводили 0,1 мл взвеси суточной агаровой культуры S. epidermidis в концентрации 85 млн. КОЕ/мл. После заражения через 2,4,6,10,24-360ч проводили забор крови, затем обрабатывали ее для световой и электронной микроскопии по известным методикам. Уровень гемоглобина в крови определяли гемиглобинцианидным методом (Кушаковский М.С., 1968). Проводили посев зараженной крови на кровяной и жел-точно-солевой агар. В качестве контроля использовали кровь здоровых мышей. Всего в опыте было исследовано 235 проб.

По результатам световой микроскопии, через 48 часов после заражения, наблюдали пойкилоцитоз и анизоцитоз эритроцитов. На поверхности эритроцитов и около них было видно большое количество кокков. Электронно-микроскопические исследования крови мышей через 48 ч после заражения показали возможность проникновения клона № 5 с высокими уровнями гемолитической и антигемоглобино-вой активностей в цитоплазму эритроцитов (рис.2).

В основе проникновения штамма S.epidermidis в цитоплазму эритроцитов лежит механизм эндоцитоза. В доступной нам литературе процесс эндоцитоза описывается только для эпителиальных клеток и нет данных для соматических клеток (Петровская В.Г., 1982; Hale Т., 1979; Stephens D., 1983).

Рисунок 2 - Внутриклеточное проникновение и размножение стафилококка (клон №5) в эритроците. Увеличение 24 500 А - процесс эндоцитоза

Б - размножение стафилококков внутри эритроцита

Эндоцитоз стафилококка доказывается следующими фактами. После адгезии 8.ер1(1епшсН5 к клеточной мембране эритроцитов происходило нарушение целостности плазмолеммы эритроцитов и постепенное погружение штамма 8.ер1с1ептисН5 в цитоплазму с формированием эндоцитозных профилей, что может трактоваться как ультраструктурные доказательства феномена внутриэритроцитарного расположения кокков. При этом у кокков сохранялась клеточная оболочка и наблюдали деление бактериальной клетки.

Участки цитоплазмы эритроцитов, прилежащие к зоне внутриклеточного расположения кокков, претерпевали ультраструктурные изменения. Это проявлялось в снижении электронной плотности цитоплазмы, появлении микровезикул и остаточных телец, что могло свидетельствовать о разрушении гемоглобина при внутриэритроцитарной локализации клона №5 (рис.3).

Рисунок 3 - Разрушение гемоглобина внутри эритроцита стафилококком (клон №5). Увеличение 25 ООО. А - стафилококк

Б - зона разрушения гемоглобина в эритроците

При проникновении клона № 9 штамма 8.ер1с1егт!сП5 с низким уровнем гемолитической и антигемоглобиновой активностей в цитоплазму эритроцитов наблюдали видимое нарушение целостности клеточной оболочки кокка. В месте его локализации разрушается, но в меньшей степени, чем у клона № 5, цитоплазма эритроцита (рис.4).

В связи с этим, можно сделать предположение, что проникшие внутрь эритроцитов кокки могут сохранять свою ультраструктуру, а также размножаться, разрушая гемоглобин (клон № 5) или подвергаться деструктивным изменениям (клон № 9).

Рисунок 4 - Локализация внутри эритроцита стафилококка (клон №9). Увеличение 25 ООО.

А - зона разрушения гемоглобина в эритроците Б - разрушение клеточной оболочки кокка

При исследовании показателей гемолитической и антигемогло-биновой активностей у клонов, выделенных при экспериментальной генерализованной стафилококковой инфекции, наблюдали циклические изменения в экспрессии изучаемых факторов. Выявлена обратная корреляционная зависимость между экспрессией ГА и АнтиНЬА. При повышении значений ГА (через 48, 168 и 240ч после заражения) понижался уровень АнтиНЬА, при понижении ГА у исследуемых клонов (через 24ч) уровень АнтиНЬА увеличивался (г = -0,54; -0,7 соответственно).

Обнаружены различия в показателях уровня гемоглобина в крови у зараженных животных. Установлена обратная корреляционная зависимость между уровнем экспрессии ГА, АнтиНЬА и концентрацией гемоглобина в крови у мышей при экспериментальной инфекции (г = -0,48). Причем, на протяжении 48-168 часов у мышей, зараженных клоном №5, уровень гемоглобина понижался более значительно до -

52,5 г/л, тогда как у мышей, зараженных клоном №9 в меньшей степени - до значений 64,3 г/л (норма 96-98 г/л) (рис.5).

г/л

» клон №5 - - • - • клон №9 — -а- - контроль

Примечание' * - достоверность различий при р<0,05

Рисунок 5 - Уровень гемоглобина в крови у мышей при экспериментальной инфекции

На основе спектрального анализа молекулы гемоглобина выявлены выраженные изменения в структуре под влиянием микроорганизмов. Причем, изменения наблюдали как в диапазонах 500-700 нм, характерных для полос поглощения гемовой части гемоглобина, так и в диапазонах 230-450 нм, характерных для белковой части. Под действием штамма с высоким уровнем ГА и АнтиНЬА процесс метгемогло-бинообразования был более выражен, чем под действием штамма с низким уровнем экспрессии исследуемых свойств. При анализе динамики спектров белковой части гемоглобина под действием клона №5, по сравнению с клоном №9, наблюдали более выраженные конформа-ционные изменения в белковой части, которые были связаны с положением ароматических (триптофан, тирозин, фенилаланин) и серосодержащих аминокислот, что может приводить к развитию гипоксии. При данной длине волны под действием клона с высоким уровнем ГА

и АнтиНЬА наблюдали более выраженные изменения оптической плотности спектров поглощения в диапазоне порфиринового кармана, что говорило о начале образования метгемоглобина.

При оценке роли гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов в клинико-лабораторных исследованиях была установлена связь в динамике между изменением концентрации гемоглобина в крови у людей с гнойно-воспалительными заболеваниями и уровнем экспрессии гемолитической, антигемоглобиновой активностей микроорганизмов (табл.2). Среди больных без анемии (НЬ=120-140 г/л) в 9,8 раза чаще выделялись штаммы микроорганизмов с низким уровнем выраженности ГА и АнтиНЬА и в 5,9 раза реже выделялись штаммы микроорганизмов с высоким уровнем выраженности ГА и АнтиНЬА, чем штаммы среди больных с анемией (НЬ=70-90 г/л). Штаммы микроорганизмов с уровнем выраженности ГА>70% гемолиза, АнтиНЬА <3 г/л и ГА<70% гемолиза, АнтиНЬА >3 г/л выделялись с одинаковой частотой, как от больных, у которых концентрация гемоглобина крови была в норме, так и от больных, у которых концентрация гемоглобина была ниже нормы.

Таблица 2.

Уровень выраженности гемолитической, антигемоглобиновой активностей микроорганизмов и концентрация гемоглобина в крови у людей с локализованной гнойно-воспалительной инфекцией

Группы Количество Из них % штаммов с уровнем экспрессии:

больных с выделенных ГА>70% ГА<70% ГА>70% ГА<70%

разной штаммов гемолиза гемолиза гемолиза гемолиза

концен- АнтиНЬА АнтиНЬА АнтиНЬА АнтиНЬА

трацией >3 г/л <3 г/л <3 г/л >3 г/л

НЬ в крови (г/л)

120-140 62 12,9±4,2 67,8±5,9 11,2±4,0 8,1±3,4

(норма)

70-90 145 76,6±3,5 6,9±2,1 8,9±2,4 7,6±2,2

(анемия)

Р <0,05 <0,05

Таким образом, было показано, что микроорганизмы с высоким уровнем гемолитической и антигемоглобиновой активностями могут

играть роль в развитии анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях. В связи с этим, был разработан «Способ прогнозирования развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях» (заявка на изобретение № 2005129824/15(033449)).

Оценивая полученный фактический материал в целом, следует выделить три основных момента:

Во-первых, обнаружен новый признак у микроорганизмов - ан-тигемоглобиновая активность. Разработан метод выявления данного признака, основанный на определении остаточного гемоглобина в субстрате после взаимодействия с бактериальной культурой.

Во-вторых, впервые в эксперименте установлен феномен внут-риэритроцитарного расположения бактерий. Стафилококки с высоким уровнем гемолитической и антигемоглобиновой активностей способны находиться и размножаться внутри эритроцитов, разрушая гемоглобин, тогда как стафилококки с низким уровнем выраженности данных свойств подвергались внутри эритроцитов деструктивным изменениям.

В-третьих, выявлена связь в динамике между изменением концентрации гемоглобина крови и уровнем экспрессии гемолитической, антигемоглобиновой активностей микроорганизмов. Чем выше уровень гемолитической и антигемоглобиновой активностей бактерий, тем ниже концентрация гемоглобина в крови у экспериментальных животных и у больных гнойно-воспалительными заболеваниями, что может привести к развитию анемии при инфекционных заболеваниях. На основе полученных данных был разработан метод прогнозирования развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях.

Выводы

1. Предложен количественный фотометрический метод определения гемолитической активности микроорганизмов с использованием калибровочной кривой гемолиза. Данный метод, в отличие от чашечного, позволяет в короткие сроки достоверно определять количественные показатели гемолитической активности у микроорганизмов различных групп.

2. Обнаружен новый признак у микроорганизмов - антигемоглобино-вая активность. Разработан метод выявления данного признака, основанный на определении остаточного гемоглобина в субстрате после взаимодействия с бактериальной культурой (патент РФ на изобретение № 2262705 от 20 октября 2005 года).

3. Различные виды микроорганизмов оказались способными инакти-вировать гемоглобин - обладали антигемоглобиновой активностью. Высокие показатели по частоте встречаемости и уровню выраженности АнтиНЬА наблюдали у штаммов З.аигеиэ (70,2±4,8%; 8,9±0,6г/л) и Е.соИ (71,4±17,1%; 7,5±1,4 г/л). Средние значения антигемоглобиновой активности микроорганизмов варьировали в пределах от 0,8 до 9,6 г/л.

4. Штаммы, выделенные от больных ГВЗ и больных анемией смешанной этиологии, чаще характеризовались высокой гемолитической и антигемоглобиновой активностями, чем штаммы, выделенные от здоровых лиц.

5. Выявлена прямая корреляционная зависимость между гемолитической, антигемоглобиновой активностями микроорганизмов и экспрессией ряда факторов патогенности. Штаммы, обладающие высоким уровнем экспрессии гемолитической и антигемоглобиновой активностей, чаще характеризовались плазмокоагулазной, лецито-вителлазной активностями и высокими значениями антилизоцим-ной активности.

6. Впервые в эксперименте при электронной микроскопии установлен феномен внутриэритроцитарного расположения бактерий. Стафилококки с высоким уровнем экспрессии гемолитической и антигемоглобиновой активностей способны находиться и размножаться внутри эритроцитов, разрушая гемоглобин, тогда как стафилококки с низким уровнем выраженности данных свойств подвергались внутри эритроцитов деструктивным изменениям.

7. Спектральный анализ молекулы гемоглобина показал, что штамм с высоким уровнем экспрессии ГА и АнтиНЬА, по сравнению со штаммом с низким уровнем выраженности исследуемых свойств, вызывал наиболее выраженные конформационные изменения в белковой и гемовой части гемоглобина, а также усиление метге-моглобинообразования.

8. Обнаружены различия в показателях уровня гемоглобина крови у зараженных животных в зависимости от свойств клонов. Установлена обратная корреляционная зависимость между уровнем экспрессии ГА, АнтиНЬА и концентрацией гемоглобина в крови у мышей при экспериментальной инфекции. У мышей, зараженных клоном с высоким уровнем ГА и АнтиНЬА, концентрация гемоглобина снижалась более значительно - до 52,5 г/л, тогда как у

мышей, зараженных клоном с низким уровнем ГА и АнтиНЬА в меньшей степени - до значений 64,3 г/л.

9. Выявлена связь в динамике между изменением концентрации гемоглобина в крови у больных гнойно-воспалительными заболеваниями и уровнем экспрессии гемолитической, антигемоглобино-вой активностей микроорганизмов. Чем выше уровень гемолитической и антигемоглобиновой активностей бактерий, тем ниже концентрация гемоглобина в крови у больных гнойно-воспалительными заболеваниями.

10. Использование нового методического подхода в оценке механизмов взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами позволило разработать способ прогнозирования развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях (заявка на изобретение № 2005129824/15(033449)).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ханина Е.А. Определение гемолитической активности микроорганизмов фотометрическим методом с использованием сапонина / Е.А. Ханина // Сборник материалов региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов,-Оренбург: РИКГОУ ОГУ. - 2003. - С.174-175.

2. Ханина Е.А. Характеристика факторов патогенности стафилококков при гнойно-воспалительных заболеваниях / Е.А. Ханина // Сборник материалов региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов,- Оренбург: РИК ГОУ ОГУ. - 2004,-С.31-32.

3. Ханина Е.А. Характеристика факторов патогенности микроорганизмов при гнойно-воспалительных заболеваниях в детской хирургии / Е.А. Ханина // Тезисы докладов IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине», Казань: Изд-во «Карпол». - 2004.- С. 77.

4. Усвяцов Б.Я. Межбактериальные взаимодействия и их роль в формировании стабильных биоценозов верхних дыхательных путей человека / Б.Я. Усвяцов, Л.М. Хуснутдинова, Л.И. Паршута, Е.А. Ханина // Тезисы докладов конференции по программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине». М.- 2004,- С.66-67.

5. Ханина Е.А. Характеристика микробиоценозов миндалин и носовой полости у детей с анемией смешанной этиологии / Е.А. Ханина // Вестник РГМУ. Периодический медицинский журнал. - М.: РГМУ. - 2005.- №3 (42) - С. 192

6. Арсенева А.Ю. Морфофункциональная характеристика эритроцитов при их взаимодействии со Stahylococcus epidermidis in vitro и in vivo/ А.Ю. Арсенева, Е.А. Ханина// Вестник РГМУ. Периодический медицинский журнал. - М.: РГМУ. - 2005.- №3 (42) - С. 155.

7. Ханина Е.А. Исследование биологических свойств микробного биоразнообразия различных биотопов тела человека / Е.А. Ханина // Сборник тезисов докладов II межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и медицины», ИГМА. - 2005. - С.3-5.

8. Ханина Е.А. Микробиологические критерии в диагностике анемии у детей при инфекционных заболеваниях / Е.А. Ханина // Сборник тезисов докладов Российской конференции «Педиатрия: из XIX в XXI век». С-Пб.- 2005. - С. 199-200.

9. Ханина Е.А. Ультраструктурные изменения эритроцитов при их взаимодействии с микроорганизмами различной вирулентности / Е.А. Ханина, А.Ю. Арсенева, A.A. Стадников // Сборник тезисов докладов Российского научного совещания гистологов «Актуальные проблемы учения о тканях». С-Пб. - 2006. - С. 104-105.

10. Бухарин О.В. Взаимодействие бактерий и эритроцитов / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов, Е.А Ханина // Журн. микробиол.- 2005,- №4,-С. 89-96.

11. Бухарин О.В. Способ определения антигемоглобиновой активности микроорганизмов / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов, Е.А. Ханина / Патент РФ № 2262705,- Бюл,- №29, 2005.

Ханина Елена Алексеевна АНТИГЕМОГЛОБИНОВАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оригинал-макет изготовлен с помощью текстового редактора Microsoft Word 2000 for Windows. Подписано в печать 26.04.06. Гарнитура Тайме. Печать оперативная. Усл. печ. л. - 1,0. Формат 64x84 1/16.

Тираж 100 экз.

ЛООбА

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ханина, Елена Алексеевна

Введение.

Глава 1. Механизмы взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами (обзор литературы).

1.1 Формы и факторы взаимодействия микроорганизмов с J эритроцитами.

1.2 Бактериальные механизмы связывания железа.

Глава 2. Материалы и методы исследования. ф 2.1. Характеристика исследуемого материала.

2.2. Методы изучения биологических свойств микроорганизмов.

2.2.1. Определение факторов патогенности микроорганизмов. и 2.2.2. Определение факторов персистенции микроорганизмов.

2.3. Модель оценки взаимодействия бактерий с эритроцитами in vitro

2.4.Метод воспроизведения экспериментальной генерализованной стафилококковой инфекции.

2.5. Методы гистологической обработки крови для электронной микроскопии.

2.6. Методы спектральной характеристики гемоглобина.

2.7. Методы статистической обработки результатов.

Глава 3. Распространенность и выраженность гемолитической и антигемоглобиновой активности микроорганизмов, выделенных из различных биотопов больных и здоровых лиц.

3.1. Таксономическое разнообразие микроорганизмов, выделенных из • очагов гнойно-воспалительных заболеваний.

3.2. Таксономическое разнообразие микроорганизмов, выделенных со слизистых оболочек носа и миндалин от здоровых людей и больных анемией смешанной этиологии.

3.3 Распространенность и выраженность факторов патогенности микроорганизмов, выделенных от больных и здоровых лиц.

3.4. Распространенность и выраженность антигемоглобиновой активности таксонов микроорганизмов, выделенных из различных биотопов больных и здоровых лиц.

3.5. Связь гемолитической, антигемоглобиновой активностей микроорганизмов с другими факторами патогенности.

Глава 4. Изучение биологической роли гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов.

4.1. Роль гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов при их взаимодействии с эритроцитами in vitro и на модели экспериментальной инфекции.

4.2. Динамика экспрессии гемолитической и антигемоглобиновой активностей клонов штамма S. epidermidis при экспериментальной генерализованной инфекции.

4.3. Изменения спектральной характеристики гемоглобина под действием исследуемых клонов с разными уровнями экспрессии гемолитической и антигемоглобиновой активностей штамма S. epidermidis.

Глава 5. Микробиологические критерии прогнозирования развития анемии при инфекционных заболеваниях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антигемоглобиновая активность микроорганизмов"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время изучение новых факторов патогенности микроорганизмов остается актуальным как в биологии, так и в медицине. Большое внимание уделяют роли микроорганизмов в развитии анемии при инфекционных заболеваниях [93,51]. В связи с этим, необходимо изучить механизмы взаимодействия бактерий с эритроцитами при проникновении патогена в кровь (сепсис, бактериемия) [94]. Описано взаимодействие с эритроцитами стафилококков [32], стрептококков [130], менингококков [44,84], энтеробактерий [23,24], лептоспир [1,2] и других микроорганизмов.

Многие патогенные бактерии вырабатывают экзоферменты и экзотоксины, которые способны повреждать плазматическую мембрану эритроцитов с помощью ферментативного гидролиза или в результате формирования пор [173]. Особое место в ряду факторов патогенности бактерий занимают внеклеточно секретируемые молекулы с мембраноповреждающей способностью, получившие общее название «гемолизины». Микроорганизмы, синтезирующие данные молекулы обладают гемолитической активностью, в результате чего происходит лизис эритроцитов с последующим освобождением гемоглобина [183].

Гемолитическая активность (гемолизины) многих микроорганизмов рассматривается на этапе взаимодействия с мембраной эритроцитов, а ее роль в изменении молекулы гемоглобина, с целью обмена железа, изучена недостаточно. Есть данные, что только менингококки и холерные вибрионы выделяют гемолизины, которые являются железорегулирующими белками (Fe-Pb) [54,107].

Известно, что способность усвоения железа является для большинства патогенных бактерий необходимым фактором сохранения жизнеспособности в организме хозяина - одна из функций, определяющих их патогенность [43]. В организме хозяина железо существует в виде комплексов с гемоглобином, гемином и ферритином. Патогенные бактерии, попадая в организм хозяина, должны активно обеспечивать себя ионами железа [67]. Сорбируя из среды железо, бактерии приобретают способность лучше противостоять неблагоприятным факторам, а также получают преимущества в конкурентной борьбе [80].

Вместе с тем, особенности механизмов взаимодействия бактерий с эритроцитами изучены недостаточно.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования явилось изучение роли гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов при взаимодействии с эритроцитами.

Для реализации этой цели были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Обнаружен новый признак у микроорганизмов - антигемоглобиновая активность. Разработан метод выявления данного признака, основанный на определении остаточного гемоглобина в субстрате после взаимодействия с бактериальной культурой (патент РФ на изобретение № 2262705 от 20 октября 2005). Выявлено, что частота и уровень экспрессии антигемоглобиновой активности связаны с видовой принадлежностью микроорганизмов и особенностями их экологии. Впервые установлена связь между изменением концентрации гемоглобина крови и уровнем экспрессии гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов. Впервые установлен феномен внутриэритроцитарного расположения бактерий. В электронно-микроскопическом исследовании доказано, что стафилококки с высоким уровнем гемолитической и антигемоглобиновой активности способны локализоваться, размножаться внутри эритроцитов, разрушая гемоглобин, тогда как стафилококки с низким уровнем выраженности данных свойств проникали, но подвергались внутри эритроцитов деструктивным изменениям.

По спектральному анализу молекулы гемоглобина показана связь между уровнем антигемоглобиновой активности микроорганизмов и глубиной конформационных изменений как в белковой, так и в гемовой частях гемоглобина.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Полученные данные расширяют теоретические представления о патогенных свойствах микроорганизмов при взаимодействии с эритроцитами.

Практическое значение исследований определяется разработкой методов оценки взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами. Предложенные методические приемы: фотометрические методы количественного определения гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов могут быть использованы в научно-исследовательских лабораториях для изучения механизмов взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами, а также в практике здравоохранения (Акт внедрения №1085 от 17 февраля 2006 г. - Оренбургская Муниципальная городская клиническая больница №5 и №1032 от 20 февраля 2006 г. - Областная детская клиническая больница).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Обнаружена антигемоглобиновая активность микроорганизмов. Штаммы бактерий с высоким уровнем экспрессии гемолитической и антигемоглобиновой активностей вызывают снижение концентрации гемоглобина в крови у экспериментальных животных и у больных гнойно-воспалительными заболеваниями.

2. Патогенные микроорганизмы с гемолитической и антигемоглобиновой активностями способны проникать внутрь эритроцитов, изменяя структуру и функцию гемоглобина.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы доложены и обсуждены на: Региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 2003; 2004); IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2004); Конференции по программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2004); Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2005); II межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и медицины» (Ижевск, 2005); Российской научной конференции «Педиатрия: из XIX в XXI век» (Санкт-Петербург, 2005); XIX научном совещании гистологов «Актуальные проблемы учения о тканях» (Санкт-Петербург, 2006).

Диссертационное исследование является фрагментом научно-исследовательской работы, проводимой в рамках программ Президиума Российской академии наук «Научные основы сохранения биоразнообразия России, 2003 - 2005» и «Фундаментальные науки - медицине, 2003-2005».

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 публикации в рецензируемых научных журналах, получен патент РФ на изобретение «Способ определения антигемоглобиновой активности микроорганизмов» № 2262705 от 20 октября 2005 года, оформлена заявка на изобретение № 2005129824/15 (033449) «Способ прогнозирования развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях».

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ханина, Елена Алексеевна

ВЫВОДЫ

Предложен количественный фотометрический метод определения гемолитической активности микроорганизмов с использованием калибровочной кривой гемолиза. Данный метод, в отличие от чашечного, позволяет в короткие сроки достоверно определять количественные показатели гемолитической активности у микроорганизмов различных групп. Обнаружен новый признак у микроорганизмов антигемоглобиновая активность. Разработан метод выявления данного признака, основанный на определении остаточного гемоглобина в субстрате после взаимодействия с бактериальной культурой (патент РФ на изобретение № 2262705 от 20 октября 2005 года).

Различные виды микроорганизмов оказались способными инактивировать гемоглобин - обладали антигемоглобиновой активностью. Высокие показатели по частоте встречаемости и уровню выраженности АнтиНЬА наблюдали у штаммов S.aureus (70,2±4,8%; 8,9±0,6г/л) и E.coli (71,4±17,1%; 7,5±1,4 г/л). Средние значения антигемоглобиновой активности микроорганизмов варьировали в пределах от 0,8 до 9,6 г/л.

Штаммы, выделенные от больных ГВЗ и больных анемией смешанной этиологии, чаще характеризовались высокой гемолитической и антигемоглобиновой активностями, чем штаммы, выделенные от здоровых лиц.

Выявлена прямая корреляционная зависимость между гемолитической, антигемоглобиновой активностями микроорганизмов и экспрессией ряда факторов патогенности. Штаммы, обладающие высоким уровнем гемолитической и антигемоглобиновой активностей, чаще характеризовались плазмокоагулазной, лецитовителлазной активностями и высокими значениями антилизоцимной активности. Впервые в эксперименте при электронной микроскопии установлен феномен внутриэритроцитарного расположения бактерий. Стафилококки с высоким уровнем гемолитической и антигемоглобиновой активностей способны находиться и размножаться внутри эритроцитов, разрушая гемоглобин, тогда как стафилококки с низким уровнем выраженности данных свойств подвергались внутри эритроцитов деструктивным изменениям.

Спектральный анализ молекулы гемоглобина показал, что штамм с высоким уровнем экспрессии АнтиНЬА, по сравнению со штаммом с низким уровнем выраженности исследуемого свойства, вызывал наиболее выраженные конформационные изменения в белковой и гемовой части гемоглобина, а также усиление метгемоглобинообразования.

Обнаружены различия в показателях уровня гемоглобина крови у зараженных животных в зависимости от свойств клонов. Установлена обратная корреляционная зависимость между уровнем экспрессии ГА, АнтиНЬА и концентрацией гемоглобина в крови у мышей при экспериментальной инфекции. У мышей, зараженных клоном с высоким уровнем ГА и АнтиНЬА, концентрация гемоглобина снижалась более значительно - до 52,5 г/л, тогда как у мышей, зараженных клоном с низким уровнем ГА и АнтиНЬА в меньшей степени - до значений 64,3 г/л.

Выявлена связь в динамике между изменением концентрации гемоглобина в крови у больных гнойно-воспалительными заболеваниями и уровнем экспрессии гемолитической, антигемоглобиновой активностей микроорганизмов. Чем выше уровень гемолитической и антигемоглобиновой активностей бактерий, тем ниже концентрация гемоглобина в крови у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями. Использование нового методического подхода в оценке механизмов взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами позволило разработать способ прогнозирования развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях (заявка на изобретение № 2005129824/15(033449)).

117

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время изучение новых факторов патогенности микроорганизмов остается актуальным как в биологии, так и в медицине. Большое внимание уделяют роли микроорганизмов в развитии анемии при инфекционных заболеваниях [18,51,93]. Одним из звеньев анемии при инфекционных заболеваниях является взаимодействие бактерий с эритроцитами [94].

Выделяют несколько форм взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами: адгезия, гемолиз и изменение молекулы гемоглобина. Бактериальное воздействие на эритроциты осуществляется посредством факторов патогенности (адгезины, гемолизины). Особое место в ряду факторов патогенности бактерий занимают внеклеточно секретируемые молекулы с мембраноповреждающей способностью, получившие общее название «гемолизины» [165,183].

По данным литературы, гемолитическая активность (гемолизины) многих микроорганизмов рассматривается на этапе взаимодействия с мембраной эритроцитов, а ее роль в изменении молекулы гемоглобина, с целью обмена железа, изучена недостаточно [173,23,130].

Под действием патогенов метаболизм железа нарушается и многие инфекционные заболевания часто сопровождаются развитием анемии. Данная проблема достаточно актуальна и за последнее время значительно возросло число работ, посвященных развитию анемии при инфекционных заболеваниях [51,76,93,135].

Известно, что способность усвоения железа является для большинства патогенных бактерий необходимым фактором сохранения жизнеспособности [43]. Сорбируя из среды железо, микроорганизмы приобретают способность лучше противостоять неблагоприятным фактором, а также получают преимущества в конкурентной борьбе [80]. Вместе с тем, особенности механизмов взаимодействия бактерий с эритроцитами изучены недостаточно.

Целью настоящего исследования явилось изучение роли гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов при взаимодействии с эритроцитами. Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи: разработаны методы количественного определения гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов, изучена распространенность и выраженность гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов с учетом их биологии и экологии, оценена роль гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов во взаимодействии с эритроцитами при экспериментальной инфекции и в клинико-лабораторных исследованиях, разработан метод прогнозирования развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях с учетом гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов.

При проведении настоящего исследования использовано 349 штаммов микроорганизмов различных групп (стафилококки, энтеробактерии, бациллы, псевдомонады). Среди них 109 клинических штаммов, выделенных от больных с различными формами гнойно-воспалительных заболеваний (флегмоны, фурункулы, абсцессы, перитонит, сепсис); 110 штаммов, выделенных со слизистой оболочки миндалин и носовой полости клинически здоровых людей и 130 штаммов, выделенных со слизистой оболочки миндалин и носовой полости от больных анемией смешанной этиологии. У выделенных штаммов микроорганизмов изучали факторы патогенности: плазмокоагулазную, лецитовителлазную и антилизоцимную активность по общепринятым методикам [33,119].

При выполнении настоящего исследования был разработан фотометрический метод определения гемолитической активности микроорганизмов. Данную активность оценивали с помощью калибровочной кривой гемолиза. Для получения калибровочной кривой процента гемолиза использовали раствор сапонина с разной концентрацией от 0,1% до 9,3-1 О*11 %. Каждое разведение сапонина в объеме 1 мл смешивали с 5% взвесью эритроцитов объемом 0,5 мл и мясо-пептонным бульоном в объеме 1 мл. Затем с помощью фотометра «ИФА-ОЭП» (длина волны 492 нм, синий светофильтр) замеряли изменение оптической плотности исследуемых растворов с разными концентрациями сапонина и вычисляли процент гемолиза. Гемолитическую активность микроорганизмов определяли следующим образом: супернатанты исследуемых культур в объеме 2 мл смешивали с 5% взвеси эритроцитов и инкубировали 3 часа при t= 37 °С. В качестве контроля использовали мясо-пептонный бульон с эритроцитами. Далее замеряли оптическую плотность исследуемых растворов и по калибровочной кривой определяли % гемолиза. Данный метод, в отличие от чашечного, повышает достоверность количественного определения ГА. Стафилококки по уровню ГА с учетом калибровочной кривой гемолиза разделили на две группы: 1.>70% гемолиза - высокий уровень ГА; 2.<70% гемолиза - низкий уровень ГА.

Для определения антигемоглобиновой активности разработали способ, основанный на выявлении остаточного гемоглобина в субстрате после взаимодействия с бактериальной клеткой. Использовали супернатанты исследуемых микроорганизмов в объеме 0,2 мл и смешивали с 0,02 мл раствора гемоглобина в концентрации 120 г/л, взятого из набора реагентов для определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом [72]. В качестве контроля брали 0,2 мл мясо-пептонного бульона, смешанного с 0,02 мл раствора гемоглобина. Далее опытные и контрольную пробы добавляли к 5 мл трансформирующего раствора (смесь натрия углекислого кислого, 1,0 г; калия железосинеродистого, 200 мг и ацетонциангидрина 0,5 мл в 1 л дистиллированной воды) и инкубировали 15 мин при t=18-25 °С. Затем по разнице концентраций гемоглобина в опытных и контрольной пробах определяли антигемоглобиновую активность исследуемых микроорганизмов. Штаммы по уровню экспрессии АнтиНЬА разделили на две группы: >3 г/л -высокий уровень; <3 г/л - низкий уровень.

Материалы, полученные в результате экспериментальных исследований, были подвергнуты статистической обработке с использованием компьютерных программам Microsoft Excel, SPSS 8.0 for Windows, с применением стандартных методов вариационной статистики и корреляционного анализа [74,127].

Изучено видовое разнообразие представителей микрофлоры различных биотопов тела человека, в частности, микробиоценозов слизистых оболочек носа и миндалин здоровых лиц, больных анемией смешанной этиологии, а также микрофлоры очагов гнойно-воспалительных заболеваний. Микрофлора слизистых оболочек миндалин и носа здоровых людей, по сравнению с группой обследованных больных, характеризовалась, в основном, представителями рода Staphylococcus, тогда как микрофлора слизистых оболочек носа и миндалин у больных анемией смешанной этиологии была представлена родом Staphylococcus (86,7±2,6%), а также встречались бактерии родов Bacillus (8,5±3,0%) и Klebsiella (4,8±2,3%). Микрофлора очагов гнойно-воспалительных заболеваний была представлена 6 родами микроорганизмов. Из них первостепенное место занимал род Staphylococcus (83,2±3,5%), микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae (роды Escherichia, Klebsiella) выделялись в 10,2±2,8% случаев. Штаммы рода Bacillus встречались в 2,8±1,5% случаев. В равном процентном соотношении наблюдали распространение представителей родов Pseudomonas и Streptococcus, что составляло 1,9±1,3%.

Анализ частоты встречаемости и выраженности антигемоглобиновой активности показал широкое распространение данного признака у разных видов микроорганизмов. Первостепенное место по распространенности изучаемого признака среди Гр- бактерий занимали E.coli, что составляло 71,4±17,1%. У представителей Гр+ палочек (B.subtilis) наблюдали наиболее высокие значения АнтиНЬА по частоте встречаемости (78,5±10,9%). Среди рода Staphylococcus наиболее часто наблюдали распространенность АнтиНЬА у S.aureus - 70,2±4,8%. В группе коагулазоотрицательных стафилококков наиболее выражена АнтиНЬА по частоте встречаемости у S.epidermidis и S.cohnii, что составляло 57,6±5,4% и 53,5±8,9% соответственно. У остальных видов частота встречаемости колебалась от 28,5±11,6% до 48,6±8,1%.

Средние значения антигемоглобиновой активности микроорганизмов варьировали от 0,8 до 9,6 г/л. Среди рода Staphylococcus выраженность изучаемого признака преобладала у S.aureus и составляла 8,9±0,6г/л. Высоких показателей достигла АнтиНЬА у штаммов кишечной палочки, средний уровень которых составил - 7,5±1,4 г/л. Значение изучаемого признака у B.subtilis составило в среднем 6,4±0,5 г/л. Наиболее высокий уровень выраженности антигемоглобиновой активности оказался у Pseudomonas aueroginosa и составил 9,6±3,5 г/л. При исследовании антигемоглобиновой и гемолитической активностей микроорганизмов оказалось, что некоторые штаммы обладали только одним свойством и не проявляли другой признак. У 2 штаммов S.aureus наблюдали только одну активность - ГА (48,4±2,6% гемолиза) и не обнаружили АнтиНЬА (0 г/л). 5 штаммов S.epidermidis, 2 штамма S.saprophyticus, 2 штамма S.xylosus и S.cohnii выделялись с уровнем выраженности ГА равной 62-84% гемолиза, но без АнтиНЬА (0 г/л).

В результате анализа спектра биоразнообразия микроорганизмов по двум исследуемым признакам - гемолитической и антигемоглобиновой активностей получили следующие данные. Оказалось, что штаммы S.aureus с высокими значениями ГА и АнтиНЬА в 1,4 - 3,3 раза чаще выделялись из очага воспаления, чем штаммы со слизистых оболочек миндалин и носовой полости от больных анемией смешанной этиологии. Среди условнопатогенных видов в 1,4-2,5 раза чаще выделялись штаммы S.epidermidis с высоким уровнем экспрессии данных признаков из очага воспаления, чем из микробиоценоза миндалин и носовой полости больных анемией.

При изучении свойств у других видов коагулазоотрицательных стафилококков, выделенных из различных источников, достоверной разницы не отмечено.

При анализе связи гемолитической, антигемоглобиновой активностей исследуемых микроорганизмов с некоторыми факторами патогенности установили прямую корреляционную зависимость. Оказалось, что штаммы, обладающие высоким уровнем АнтиНЬА, чаще характеризовались плазмокоагулазной, лецитовителлазной активностями и высокими значениями антилизоцимной активностью. В связи с этим, антигемоглобиновую активность рассматривали как один из возможных факторов патогенности микроорганизмов.

Штаммы, обладающие высоким уровнем ГА характеризовались высокими значениями антигемоглобиновой и антилизоцимной активностями. Плазмокоагулазной и лецитовителлазной активностями обладали штаммы как с высоким уровнем ГА, так и с низким. Подобная закономерность, описанная Абрамзоном О.М. с соавт., показавшим, что гемолитическая активность у штаммов, выделенных при гнойно-воспалительных заболеваниях, коррелировала с наличием у бактерий других факторов патогенности и персистенции (КоА, ЛецА, АЛА, АКА) [20].

Оценка роли гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов при экспериментальной инфекции позволила получить данные о функционировании системы «прокариот-эукариот» с учетом уровня экспрессии свойств микроорганизмов и внутриклеточного их проникновения. Впервые был установлен феномен внутриэритроцитарного расположения бактерий. По мнению Петровской В.Г. и Маракуши Б. И. [97], инвазия патогена в эпителиальную клетку недостаточно изучена, хотя известно, что этот процесс зависит от активности как клетки-хозяина, так и возбудителя.

Находясь в эритроците, прокариоты оказывались под воздействием эукариота. Нами было показано, что штаммы стафилококка с низким уровнем выраженности гемолитической и антигемоглобиновой активности подвергались внутри эритроцитов деструктивным изменениям, а штаммы с высоким уровнем изучаемых свойств могли находиться и размножаться внутри эритроцита. С другой стороны, бактерии тоже вызывают повреждения в эритроцитах. На электронограмме было обнаружено снижение оптической плотности цитоплазмы эритроцита, появление микровезикул и остаточных телец, что может свидетельствовать о разрушении гемоглобина при внутриэритроцитарном расположении бактерий. По данным литературы известно, что многие виды бактерий способны паразитировать внутриклеточно. Так, в работах Терновской J1.H., методом электронной микроскопии была показана инвазия стафилококков в эпителиоциты слизистой носа [123]. В работах Козловой А.Н., Стадникова А. А. с соавторами [121] электронно-микроскопические наблюдения процессов инвазии стафилококков показали, что первоначально они «прилипали» к плазмолемме клеток мерцательного эпителия. Затем в местах микробной адгезии происходила инвагинация плазмолеммы и формировалась фагосомоподобная вакуоль. Также авторам удалось наблюдать частичное разрушение стафилококков, локализованных в просвете воздухоносных путей. Кроме того, при прямом контакте со стафилококками клетки мерцательного эпителия тоже подвергались реактивным изменениям. Полученные результаты говорят о наличие механизмов самоорганизации в системе эукариотическая клетка -прокариотические клетки в процессе эндосимбиоза [140]. D. Stephens с соавторами [177] для изучения внутриклеточного паразитирования менингококков применили органную культуру из носоглоточной ткани человека. Известны работы по внутриэритроцитарному паразитированию малярийного плазмодия [89]. Внедрение паразита в эритроцит и дальнейший процесс жизнеспособности малярийного плазмодия приводят к нарушению гомеостатических механизмов клетки (переход гемоглобина в метгемоглобин, снижение активности каталазы и др.) и в итоге к ее гибели [27,98]. Но данных по внутриклеточному паразитированию бактерий в эритроцитах в доступной нам литературе не найдено.

На основании полученных результатов можно предположить, что эритроцит, который в ходе эволюции приобретал структуру для выполнения функции газообмена, при инфекционном процессе начинает действовать как фагоцит.

Таким образом, эволюция не дает существенных селективных преимуществ ни одному из взаимодействующих видов, она направлена на достижение динамического противоречивого равновесия [34,62,78,99,116].

При исследовании показателей гемолитической и антигемоглобиновой активностей у клонов, выделенных при экспериментальной генерализованной стафилококковой инфекции, наблюдали динамические изменения в экспрессии изучаемых факторов. Установили обратную корреляционную зависимость между экспрессией ГА и АнтиНЬА. При повышении значений ГА понижался уровень АнтиНЬА, при понижении ГА у исследуемых клонов уровень АнтиНЬА увеличивался. Обратная зависимость в динамике исследуемых свойств позволяет сделать предположение о разной природе ГА и АнтиНЬА. Динамические изменения в экспрессии факторов патогенности подтверждаются данными литературы [55,120,134]. Обнаружили различия в показателях уровня гемоглобина крови у зараженных животных. Установлена обратная корреляционная зависимость между уровнем экспрессии ГА, АнтиНЬА и концентрацией гемоглобина в крови у мышей при экспериментальной инфекции (г = -0,48). Причем, у мышей зараженных клоном №5 с высоким уровнем ГА и АнтиНЬА, уровень гемоглобина понижался более значительно - до 52,5 г/л, чем у мышей, зараженных клоном №9 с низким уровнем ГА и АнтиНЬА - до уровня 64,3 г/л.

Так как эритроциты на 95% от своей массы состоят из гемоглобина, то необходимо было изучить влияние микроорганизмов на структуру молекулы гемоглобина. Для этого использовали спектрофотометрические методы исследования. В результате проведенных опытов обнаружили выраженные изменения в спектральных характеристиках гемоглобина. Причем, изменения наблюдали как в диапазонах 500-700 нм, характерных для полос поглощения гемовой части гемоглобина, так и в диапазонах 230-450 нм, характерных для белковой части. Под действием штамма с высоким уровнем АнтиНЬА процесс метгемоглобинообразования был более выражен, чем под действием штамма с низким уровнем выраженности исследуемого свойства. При анализе результатов спектров белковой части гемоглобина, необходимо отметить, что под действием клона №5, по сравнению с клоном №9, наблюдали более выраженные конформационные изменения в глобине, которые связаны с положением ароматических (триптофан, тирозин, фенилаланин) и серосодержащих аминокислот, что может приводить к развитию гипоксии. При данной длине волны под действием клона с высоким уровнем АнтиНЬА наблюдали значительные изменения оптической плотности спектров поглощения в диапазоне порфиринового кармана, что говорило о начале образования метгемоглобина. Ранее, рядом авторов, было показано изменения в молекуле гемоглобина под действием УФ-света, также приводящее к повышению образования метгемоглобина [9,101,102].

В дальнейшем была оценена роль гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов в клинико-лабораторных исследованиях. Проведенные исследования позволили установить связь в динамике между изменением концентрации гемоглобина в крови у людей с гнойно-воспалительными заболеваниями и уровнем экспрессии гемолитической, антигемоглобиновой активностей микроорганизмов. Оказалось, что чем выше уровень выраженности гемолитической, антигемоглобиновой активностей микроорганизмов, выделенных из очага локализованной гнойно-воспалительной инфекции, тем ниже концентрация гемоглобина в крови у больных, что приводило к развитию анемии при инфекционных заболеваниях. Действие бактериальных токсинов на эритроциты рассматривается в работах многих авторов, изучавших развитие анемии при инфекционных заболеваниях [17,51,93,114]. Результаты, полученные в клинико-лабораторных исследованиях, положены в основу разработанного «Способа прогнозирования развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях» (заявка на изобретение № 2005129824/15(033449)).

Выявленные особенности позволяют предложить методический ключ для изучения взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами, открывающий новые подходы к оценке роли факторов патогенности бактерий в механизмах развития анемии при инфекционных заболеваниях.

Подводя итог проведенной работы, следует отметить несколько положений. Во-первых, обнаружен новый признак у микроорганизмов -антигемоглобиновая активность. Разработан метод выявления данного признака, основанный на определении остаточного гемоглобина в субстрате после взаимодействия с бактериальной культурой.

Во-вторых, впервые в эксперименте установлен феномен внутриэритроцитарного расположения бактерий. Стафилококки с высоким уровнем гемолитической и антигемоглобиновой активностей способны находиться и размножаться внутри эритроцитов, разрушая гемоглобин, тогда как стафилококки с низким уровнем выраженности данных свойств подвергались внутри эритроцитов деструктивным изменениям.

В-третьих, установлена связь в динамике между изменением концентрации гемоглобина крови и уровнем экспрессии гемолитической, антигемоглобиновой активностей микроорганизмов. Чем выше уровень выраженности гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов, тем ниже концентрация гемоглобина в крови у мышей при экспериментальной инфекции и у больных гнойно-воспалительными заболеваниями, что может привести к развитию анемии при инфекционных заболеваниях. На основе полученных данных был разработан способ прогнозирования развития анемии при инфекционных заболеваниях.

114

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ханина, Елена Алексеевна, Оренбург

1. Авдеева М.Г. Гематологические параметры в характеристике анемии при лептоспирозе. / М.Г. Авдеева, Д.Л. Мойсова // Клин.лаб.диагностика. -2001.-№5.- С. 8-11.

2. Авдеева М.Г. Костно-мозговое кроветворение при лептоспирозе и его роль в патогенезе анемии. // М.Г. Авдеева, Д.Л. Мойсова // Клин.лаб.диагностика. -2003.- №1.- С. 38-40.

3. Адгезивные и некоторые другие свойства Vibrio cholerae tcp+ ctx ", изолированных из объектов внешней среды Ростовской области в 2002 году / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов, И.Х. Бардых, Н.И. Винокур // Журн. микробиол.- 2004.- №6.- С. 3-6.

4. Азнабаев Г.К. Некоторые биологические свойства бактерий рода Citrobacter, выделенных при моно- и ассоциированных бактериальных инфекциях. Автореф. дис. . канд. мед. наук.-Оренбург, 2003.- 26с.

5. Акатов А.К. Проблемы инфектологии./ А.К. Акатов, Ю.В. Ананьина, А.О. Андерсон, М.: Медицина,-1991.- 398с.

6. Акатов А.К. Стафилококки / А.К. Акатов, B.C. Зуева.- М.: Медицина, 1983.- 250с.

7. Альберт А. Избирательная токсичность. Физико-химические основы терапии: Пер. с англ. В 2 томах. Т.2.- М.: Медицина, 1989. - 432с.

8. Анемии у детей: диагностика и лечение / Под ред. А.Г. Румянцева, Ю.Н. Токарева.- М., 2000.- 256с.

9. Артюхов В.Г. УФ-чувствительность димеров гемоглобина в свободном состоянии и в составе гибридов валентности: модификация серотонином / В.Г. Артюхов, Г.А. Вашанов, И.Е. Козлова // Радиационная биология. Радиоэкология.- 2001.- Т.41, №2.- С. 190-194.

10. Балашов В.И. Соединение гемоглобина и его дериватов в крови детей, проживающих в населенных пунктах санитарно-защитной зоны астраханского защитного комплекса / В.И. Балашов, А.А. Резаев, В.В. Ярыга // Педиатрия.- 1995.- №2.- С. 75-77.

11. Белки / Под ред. Г. Нейрата и К. Бэйли, Шт., I ч. Биохимия белковых веществ перевод с англ..- М: Изд-во иностр. лит-ры, 1958.- 844с.

12. М.Белобородова Н.В. Дискуссия о бактериемии и сепсисе./ Н.В. Белобородова. // Антибиотики и химиотерапия.- 2002. Т47, №8.- С. 2027.

13. Белобородова Н.В. Поиск методов и объективных критериев оптимизации антимикробной терапии гнойно-воспалительных заболеваний / Н.В. Белобородова // Вестник РАМН.- 2003.- №9.- С. 10-18.

14. Белобородова Н.В. Хирургическая инфекция у новорожденных / Н.В. Белобородова, Т.В. Красовская.- М.: Медицина, 1993.- 285с.

15. П.Белокуров Ю.Н. Сепсис./ Ю.Н. Белокуров, А.Б.Граменицкий, В.М.Молодкин, М.: Медицина. 1983. -128с.

16. Белошевский В.А. Анемии при хронических заболеваниях / В.А. Белошевский, Э.В. Минаков.-Воронеж, 1995.- 178с.

17. Березов Т.Т. Биологическая химия: Учеб. пособие / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин.- 3-е изд., перераб. и доп.- М.: Медицина, 1998.- 704с.

18. Биологические свойства микроорганизмов как основа прогнозирования тяжести гнойно-воспалительных заболеваний легких и плевры / О.М. Абрамзон, O.JI. Карташова, А.В. Валышев и др. // Журн.микробиол.- 2004. № 3. - С. 7-10.

19. Бовдей Н.А. Сравнительное исследование жирной кислоты и некоторых спиновых эффекторов на четвертичную структуру и спиновое состояниеметгемоглобина / Н.А. Бовдей, С.Н. Киселева, П.А. Киселев // Биохимия.-1996.- Т.61, вып. 9.- С. 1570-1577.

20. Бондаренко В.М. Острова патогенности бактерий / В.М. Бондаренко. // Журн.микробиол.- 2001.- №4.- С.67-74.

21. Бондаренко В.М. Сериновые протеазы грамотрицательных бактерий: структура, механизмы секреции, биологическая активность / В.М. Бондаренко, А.Р. Мавзютов, О.В. Агапова // Журн.микробиол.- 2002.-№6.- С.80-85.

22. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса / В.М. Бондаренко. // Журн.микробиол,- 1999.-№5.- С.34-39.

23. Бондаренко В.М., Голубев А.В. Гемолизины энтеробактерий и их связь с вирулентностью возбудителя. / В.М.Бондаренко, А.В. Голубев.// Журн. микробиол.-1988.- № 11С. 103-109.

24. Борисенко А.Н. Некоторые особенности течения воспаления при экспериментальной анемии / А.Н. Борисенко // Патолог.физиология и эксперим.терапия.- 1972.- №5.- С. 71-75.

25. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология: Учеб. пособие. / Л.Б. Борисов.-М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2001.- 736с.

26. Брилене Т.А. Адгезия лактобацилл влагалища и половые гормоны. Автореферат дисс. канд.мед.наук.- Москва, 1990.-22с.

27. Бугланов А.А. Метаболизм железа и металлопротеиды (обзор) / А.А. Бугланов // Вопросы медицинской химии.- 1988.- №3.- С.2-7.

28. Бургасов П.Н. Антимикробный конституциональный иммунитет / П.Н. Бургасов, С.Н. Румянцев /АМН СССР. М.: Медицина.-1985.- 256с.

29. Бухарин О.В. Бактерионосительство (медико-экологический аспект) / О.В.Бухарин, Б .Я. Усвяцов, Екатеринбург: УрО РАН.- 1996.- 207с.

30. Бухарин О.В. Биология патогенных кокков / О.В.Бухарин, Б.Я. Усвяцов, О.Л. Карташова, М.: Медицина, Екатеринбург: УрО РАН.- 2002.-282с.

31. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий / О.В. Бухарин.- М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 1999.- 367с. ISBN 5-7691-0689-4.

32. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий: теория и практика / О.В. Бухарин //Журн. микробиол.- 2000.- №4. Прилож.- С. 4-7.

33. Быховский В.Я. Биосинтез порфиринов микроорганизмами (обзор) / В.Я. Быховский, Н.И. Зайцева, О.В. Полулях // Прикладная биохимия и микробиология .- 1987.- T.XXIII, вып. 6.- С.725-739.

34. Васильева Е.М. Биохимические особенности эритроцита. Влияние патологии (обзор) / Е.М. Васильева // Биомедицинская химия.- 2005.- Т.51, №2.-С. 118-127.

35. Верховцева Н.В. Трансформация соединений железа гетеротрофными бактериями / Н.В. Верховцева // Микробиология.- 1995.-Т.64, №4.- С.473-478.

36. Взаимовлияние Klebsiella pneumonia и лактобацилл на их цитадгезию / А.А.Ленцнер, Л.А Левков, Х.П. Ленцнер, В.М. Бондаренко // Антибиотики и химиотерапия.- 1989.- №6.- С. 430-432.

37. Войно-Ясенецкий М.В. Биология и патология инфекционных процессов / М.В. Войно-Ясенецкий.- Л.: Медицина, 1981.- 208с.

38. Воробьев А.И. Некоторые незавершенные работы по физиологии крови / А.И. Воробьев// Вестник РАМН.- 2004.- №10.- С. 11-14.

39. Габидуллин З.Г. Энтеротоксигенная способность гемолизин-продуцирующих штаммов протеев, выделенных при острых кишечных инфекциях у детей. / З.Г.Габидуллин, Р.А. Батыршин //Журн.микробиол.-1990.-№8.- С.49-53.

40. Габитова Р.З. Изменение порфиринового обмена у детей при анемии, сопровождающей сепсис / Р.З. Габитова, Д.Х. Джурабекова // Здравоохранение Таджикистана.- 1974.- №3.- С. 28-30.

41. Гаврилова Н.А. Влияние природы источников железа на рост различных штаммов Corynebacterium diphtheriae / Н.А. Гаврилова, И.М. Грубер, Т.Н. Филатова // Журн. микробиол.- 2000.- №1.- С. 27-30.

42. Гамзулина JI.H. Антитела к железорегулируемому белку (Fbp А) и минорным белкам менингококков в сыворотке больных менингококковым менингитом / JI.H. Гамзулина, Т.Н. Филатова // Журн. микробиол.- 2003.-№1.- С. 68-70.

43. Гершанович В.Н. Биохимия и генетика транспорта ионов у бактерий / В.Н. Гершанович.- М., Медицина.-1995,- 250с.

44. Горбенко Р.П. Флуоресцентные исследования изменения структуры метгемоглобина при взаимодействии с липосомами / Р.П. Горбенко, В.И. Древаль // Биофизика.- 1990.- Т.35, вып. 6.- С. 925-927.

45. Горлина М.Х. Железо и патогенность бактерий /М.Х. Горлина // Журн. микробиол.-1998.- № 3.- С. 103-107.

46. Господарьов Д.В. Обмен железа у дрожжей / Д.В. Господарьов, B.I. Лущак // Украинский биохимичний журнал.- 2005.- Т.77, №3.- С.5-20.

47. Гринев М.В. Септический шок / М.В. Гринев, С.Ф. Багненко // Вестник хирургии им И.И. Грекова.- 2004.- Т. 163, №2.- С. 12-17.

48. Губський Ю.У. Вивчення компоненте системи гемоглобину та антиоксидантних ферменн в за кад Miaeoi штоксикацп / Ю.У. Губський, Г.М. Ерстенюк // Украинский биохимичний журнал.- 2002,- Т.74, №5.-С.124-127.

49. Гусева С.А. Болезни системы крови / С.А. Гусева, В.П. Вознюк.- М.: МЕДпресс-информ.- 2004.- 488 с. ISBN 5-98322-018-7

50. Далин М.В. Адгезины микроорганизмов. / М.В. Далин, Н.Г.Фиш.- М.-1985.- 107с.

51. Далин М.В. Белковые токсины микробов / М.В. Далин, Н.Г.Фиш.- М.: Медицина.- 1980.- 178с.

52. Дельвиг А.А. Структурно-функциональная характеристика рецептора трансферрина патогенных нейссерий / А.А. Дельвиг, Б.Ф. Семенов // Журн. микробиол.- 1999.- №6.- С. 94-98.

53. Дерябин Д.Г. Вирулентность и персистенция стафилококков: фенотипические проявления и механизмы генетического контроля / Д.Г.

54. Дерябин, И.А. Шагинян // Журн. микробиол.- 2000,- №4. Прилож.- С. 3643.

55. Дерябин Д.Г. Стафилококки. Экология и патогенность / Д.Г. Дерябин, Екатеринбург: УрО РАН.-2000.-238с.

56. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул / Ю.В. Езепчук.- М.: Медицина.- 1985.-240с.

57. Езепчук Ю.В. Функциональные критерии патогенности / Ю.В. Езепчук // Журн. микробиол.- 1988.- №5.- С. 113-116.

58. Железозависимые микобактерии / A.JI. Лазовская, З.Г. Воробьева, Л.В. Смирнова, Т.В. Гончарова // Успехи современной биологии.-1991.- T.III, №1.- С. 101-107.

59. Жемчугов В.Е. Механизмы сохранения и распространения патогенных микроорганизмов (гипотеза) / Е.В. Жемчугов // Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2004.- №5.-С. 54-58.

60. Иванов Н.Р. Молекулярно-клеточные аспекты гемолитического действия стафилококкового а -токсина / Н.Р. Иванов, Г.Е. Брилль // Журн. микробиол.- 1984.- № 9.- С. 3-9.

61. Иванова В.В. Закономерности взаимоотношений макроорганизма и возбудителей инфекционных болезней у детей / В.В. Иванова, Е.А. Корнева // Вестник РАМН.- 2000.- №11.- С.35-40.

62. Игнатов В.В. Биохимия стафилококка / В.В. Игнатов,- Изд-во Саратовского университета, 1975.- 120с.

63. Идельсон Л.И. Гипохромные анемии / Л.И. Идельсон.- М.: Медицина, 1981.- 278с.

64. Клер К. Шмит. Бактериальные токсины: друзья или враги? Болезни и возбудители / Клер К.Шмитт, Карен С. Мейсик, Алисон Д. О'Браэн.- М.-2003.- 245с.

65. Кобозев Т.В. Патология системы крови и кровообращения / Т.В. Кобозев, Н.А. Троицкая, В.И. Куприенко.- Симферополь, 1978.- С. 49-51.

66. Кострова Ю.М. Антибиотикорезистентность гемолитических бактерий в зависимости от содержания железа в бактериальных клетках / Ю.М. Кострова, Н.В. Шеховцева//Журн. микробиол.- 2005.- №4.- С. 75-77.

67. Кострова Ю.М. Влияние железонасыщения бактерий на поглотительную способность нейтрофилов / Ю.М. Кострова, Н.В. Шеховцева // Журн. микробиол.- 2006.- №1.- С. 75-76.

68. Костюкова Н.Н. Молекулярно-биологические механизмы менингококкового бактерионосительства / Н.Н. Костюкова // Журн. микробиол.- 2000.- №4. Прилож.- С. 17-22.

69. Красильников О.В. Изучение гемолитического действия стафилотоксина / О.В. Красильников, А.Ш. Ташпулатов, Ю.М. Мусаев // Вопросы мед. химии.- 1985.- Т. 31, №6.- С. 64-67.

70. Кузнецова Ю.В. Оценка эритроцитарных параметров автоматического анализа крови и их применение для диагностики анемий / Ю.В. Кузнецова //Гематология и трансфузиология.- 1996.- №5.- С. 44-47.

71. Кушаковский М.С. Клинические формы повреждения гемоглобина / М.С. Кушаковский.-Д., 1968.- 263с.

72. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С. Лабинская.- М. «Медицина», 1978.- 394с.

73. Лакин Г.Ф. Биометрия (учебное пособие для биологических специальностей университетов) / Г.Ф. Лакин.- М.: Высшая школа, 1990.-288с.

74. Литвин В.Ю. Факторы патогенности бактерий: функции в окружающей среде / В.Ю. Литвин, В.И. Пушкарева // Журн. микробиол.- 1994.- №4. Прилож.- С. 84-87.

75. Луговская С.А. Патогенез и диагностика анемий при хронических заболеваниях / С.А. Луговская // Клин. лаб. Диагностика.- 1997.- №12.С. 19-22.

76. Лягина И.А. Экспресс-методики в микробиологическом исследовании крови / И.А. Лягина, Т.К. Корнева // Клин.лаб.диагностика.- 1995.- №5.- С. 48-49.

77. Маргелис Л. Роль симбиоза в эволюции клетки / Л. Маргелис.- М.: Мир, 1983.-351с.

78. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнер, А.А. Ленцнер // Лабораторное дело.- 1986.-№4.- С.210-212.

79. Механизмы выживания бактерий / О.В. Бухарин, А.Л. Гинцбург, Ю.М. Романова, Г.И. Эль-Регистан.-М.: Медицина, 2005.- 367с. ISBN 5-22504856-0; 5-7691-1549-1.

80. Миронов А.Ю. Микрофлора гнойно-септических заболеваний у больных в Московской области / А.Ю. Миронов, К.И. Савицкая, А.А. Воробьев // Журн. микробиол.- 2000.- №5.- С. 11-15.

81. Морозова В.Т. Гематологические исследования в диагностике заболеваний / В.Т. Морозова // Клиническая лабораторная диагностика.-1996.-№6.- С. 3-7.

82. Нарушение деформируемости эритроцитов у больных острыми гнойно-септическими заболеваниями легких и плевры / С.А. Шалаев, А.Н. Тулупов, В.И. Попов и др. // Вестник хирургии им. И.И. Грекова.- 1991.-Т.146, №2.- С. 12-15.

83. Neisseria meningitides: от антигенной структуры к новому поколению вакцин/ А.А.Дельвиг, Б.Ф.Семенов, Э.Розенквист, Д.Г. Робинсон.- М.: Медицина.- 2000.-258с.

84. Некоторые аспекты влияния антибиотиков на адгезивные свойства микроорганизмов и доступная модель его изучения / В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Л.А. Левков, Х.П. Ленцнер и др. // Антибиотики и мед. Биотехнология.- 1986.- Т.31, №5.- С.353-357.

85. Никитин И.К. Вирусная и бактериальная инактивация клеточных компонентов крови / И.К. Никитин, Г.И. Козинец // Гематология и трансфузиология.- 2001.- №3.- С. 91-93.

86. Новицкий В.В. Показатели обратимой агрегации эритроцитов периферической крови у детей с острой пневмонией / В.В. Новицкий // Клин.лаб.диагностика.- 2001.- №6. С. 36-37.

87. Овчинников Н.М. Ультраструктура возбудителей венерических заболеваний и ее клиническое значение / Н.М. Овчинников, Делекторский

88. Павлова И.П. Электронно-микроскопическое исследование адгезивности бактерий / И.П. Павлова, Е.М. Ленченко // Журн. микробиол.- 2002.- №1.1. C.3-6.

89. Павлова М.П. Руководство по гематологическим болезням у детей / М.П. Павлова.- Мн.: Выш.шк., 1988.- 271с. ISBN 5-339-00047-8.

90. Папаян А.В. Анемии у детей: руководство для врачей / А.В. Папаян, Л.Ю. Жукова.- СПб: Питер, 2001.-3 84с.- (Серия «Современная медицина»).

91. Пархоменко Ю.Г. Сепсис: современное состояние проблемы, диагностика и спорные вопросы классификации / Ю.Г. Пархоменко // Архив патологии.- 2005.- Т.67, №6.- С. 53-57.

92. Петровская В.Г. Общие закономерности взаимодействия в системе паразит-хозяин и проблема смешанных инфекций / В.Г. Петровская // Журн. микробиол.- 1982.- №8.- С. 24-31.

93. Петровская В.Г. Ранние этапы инфекционного процесса (достижения и проблемы) / В.Г. Петровская, В.Б. Маракуша // Журн. микробиол.- 1987.-№10.- С. 107-116.

94. Поздеев O.K. Медицинская микробиология / O.K. Поздеев / Под ред. акад. РАМН В.И. Покровского.- М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.- 768с.

95. Покровский В.И. Человек и микроорганизмы. Здоровье и болезнь / В.И. Покровский // Вестник РАМН.- 2000.-№11.- С.3-6.

96. Предтеченский В.Е. Руководство по клиническим лабораторным исследованием / В.Е. Предтеченский. Под ред. Л.Г. Смирновой, Е.А. Кост.- М.: Изд-во мед. лит-ры МЕДГИЗ., I960.- 673с.

97. Путинцева О.В. Изменения спектральных свойств растворов нитрозогемоглобина, индуцированные УФ-светом / О.В. Путинцева, В.Г. Артюхов, Е.А. Калаева // Биофизика.- 2003.- Т.48, вып. 3,- С. 411-416.

98. Радзивиловская Э.Г. Некоторые вопросы патогенеза анемии, связанной с инфекцией и воспалением / Э.Г. Радзивиловская // Гематология и трансфузиология.-1968.- №8.- С. 39-45.

99. Ратгауз Г.Л. Об образовании и секреции а-токсина патогенным стафилококком / Г.Л. Ратгауз // Журн. микробиол.- 1970.- №10.- С. 37-41.

100. Реброва Р.Н. О лизоцимной активности грибов рода Candida / Р.Н. Реброва, В.И. Горохов // Журн. микробиол.- 1989.- №3.- С. 45-46.

101. Рожавин М.А. Исследование патогенности Pseudomonas aeruginosa./ М.А. Рожавин. // Журн. микробиол.- 1988.- №3.- С. 107-111.

102. Роль ионов железа в продукции гемолизина токсигенными и нетоксигенными холерными вибрионами различных серогрупп / Е.А. Меньшикова, А.В. Миронова, JI.C. Подосинникова и др. // Журн. микробиол.- 2004.- №3.- С. 78-81.

103. Роль фибронектина в патогенезе менингококковой инфекции. / А.Б.Алексеев, М.Х.Горлина, В.В. Гостева и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1990.- № 11.- С. 510-513.

104. Руководство по инфекционным болезням / Под. ред. Лобзина Ю.В. -СПб. -2000.- 458с.

105. Ряпис Л.А. Классификация стрептококков и стрептококковых болезней человека / Л.А. Ряпис, Н.И. Брико // Журн. микробиол.- 2000,- №2.- С. 7479.

106. Сабодаха М.А. Экспериментальная модель сепсиса / М.А. Сабодаха, Ж.Т. Турганбаев // Здравоохранение Киргизии.- 1991.- №1.- С. 33-35.

107. Самойлов М.В. Трансформированные и патологические эритроциты при эндогенной интоксикации и экстракорпоральной детоксикации / М.В. Самойлов // Архив патологии.- 2002.- №5.С. 36-39.

108. Сахаров П.П. Лабораторные животные их болезни, некоторые биологические особенности и зоотехнические основы содержания, кормления и разведения / П.П. Сахаров.- Гос. изд-во биологической и медицинской литературы. Москва-Ленинград, 1937.- 278с.

109. Светухин A.M. Хирургический сепсис: клиника, диагностика и лечение./ А.М.Светухин, А.О. Жуков. // Инфекции и антимикробная терапия,- 1999.- №2.- С. 56-63.

110. Семенович В.Н. Патогенные свойства лептоспир в связи с патологией лептоспироза / В.Н. Семенович, Ю.Е. Полоцкий // Журн. микробиол.-1983.-№2.- С. 13-16.

111. Сидоренко С.В. Инфекционный процесс как «диалог» между хозяином и паразитом / С.В. Сидоренко // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.- 2001.- Т. 4, №3.- С. 301-315.

112. Современные аспекты патогенеза сепсиса / С.В. Грачев, С.Г. Пак, В.А. Малов, Е.А. Городнова // Терапевтический архив.- 2003.-№11.С. 84-89.

113. Современные представления о патогенезе инфекционных заболеваний / Е.В. Пименов, А.А. Тотолян, А.А. Бывалов и др. // Вестник РАМН.- 2003.-№6.- С.3-9.

114. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / М.О. Биргер.- М. «Медицина», 1982.- 462с.

115. Сравнительная характеристика некоторых экспериментальных моделей стафилококковой инфекции / С.А. Анатолий, И.И. Антоновская, С.Я. Таек, Е.М. Падерина //Журн. микробиол.- 1971.- №9.- С. 60-63.

116. Структурно-функциональная реорганизация стафилококков и воздухоносной системы при интратрахеальном введении патогена в эксперименте / А.Н. Козлова, А.А. Стадников, JI.B. Ковбык, Н.Н. Шевлюк // Журн. микробиол.- 2003.- №4.- С. 55-58.

117. Тепляков В.Г. Морфологические изменения внутренних органов при экспериментальном стафилококковом сепсисе / В.Г. Тепляков // Архив патологии.- 1987.- №2.- С.32-37.

118. Терновская JI.H. Персистенция золотистых стафилококков в клетках слизистой оболочки передних отделов носа материальная основа длительного носительства / JI.H. Терновская // Стафилококковые инфекции.- СПб.-1991.- С. 21-26.

119. Тимошинова С.В. Исследование гемоглобина методом спектрального анализа / С.В. Тимошинова, С.И. Красиков // Тезисы конференции «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов до внедрения в клиническую практику».- Оренбург, 2003.- С. 117-119.

120. Ткач Ю.И. Лабораторная диагностика анемий с нарушением обмена железа / Ю.И. Ткач // Лабораторное дело.- 1990.- №2.- С.40-45.

121. Тотолян А.А. Пути дальнейшего изучения патогенности стрептококка группы А. / А.А.Тотолян, Л.А.Бурова, К.Б. Грабовская. //Стрептококковая инфекция и ревматизм. Саратов.- 1987.- С.67.

122. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях/В.Ю. Урбах.- М.: Медицина, 1975.- 295с.

123. Усачева JI.H. Биологические свойства микробов-ассоциантов, населяющих дыхательные пути больных нагноительными заболеваниями легких. Автореф. дис. канд. биол. наук.- Москва, 1990.- 22с.

124. Файнштейн Ф.Э. Болезни системы крови / Ф.Э. Файнштейн.- Ташкент, 1987.- 458с.

125. Факторы и генетика патогенности стрептококков группы В / Н.А.Дмитриев, М. Кантикова, И. Микула, А.А. Тотолян // Журн. микробиол.- 2000.- №5.- С. 92-97.

126. Федоров В.В. Бактериемия: клинико-бактериологические аспекты проблемы (обзор литературы) / В.В. Федоров, М.А. Куликова // Клин.лаб. диагностика.- 1995.- №3.- С. 3-7.

127. Фельдман Ю. М. Количественное определение бактерий в клинических материалах / Ю.М. Фельдман // Лаб. Дело.- 1984.- №10.- с. 616-619.

128. Физиология человека / Под ред. Г.И. Косицкого.- М.: Медицина, 1988.-544с.

129. Характеристика антилизоцимного и антикомплементарного признаков у бруцелл при экспериментальной инфекции / Н.В. Шеенков, А.Г. Яковлев, М.В. Скачков и др. // Журн. микробиол.- 2002.- №3.- С. 12-16.

130. Циммерман Я.С. Анемии. Вопросы этиологии, патогенеза, клиники, классификации, диагностики и дифференцированного лечения / Я.С. Циммерман, Г.Д. Бабушкина.- Пермь: 111 МА, 2004.- 125с.

131. Чаленко В.Г. Менингококковая инфекция / В.Г.Чаленко, И.А. Шабаров.- Л.- 1989.- 198с.

132. Чубуков В.Ф. Круговорот химических элементов в природе и его взаимосвязь с экологией и жизнедеятельностью микроорганизмов / В.Ф. Чубуков, В.Ю. Литвин // Успехи современной биологии.- 1989.- Т. 108, вып.2(5).- С.261-278.

133. Шавловский Г.М. Роль железа в регуляции синтеза белков у микроорганизмов / Г.М. Шавловский, Е.М. Логвиненко // Успехи микробиологии.- 1988.- №2.- С.108-133.

134. Электронно-микроскопическое исследование крови больных с гнойными ранами, осложненными сепсисом и бактериальным шоком / Б.В. Втюрин, Г.Н. Дудникова, Н.В. Червонская, A.M. Светухин // Архив патологии.- 1987.- №5.- С.32-39.

135. Яковлев A.M. Роль железо- и медьсвязывающих белков в резистентности к инфекции / A.M. Яковлев, В.В. Туркин, Т.В. Толмазова // Журн. микробиол.- 1988.- №10.- С. 75-78.

136. Adherence of Streptococcus pneumoniae to respiratory epithelial cells is inhibited by sialylated oligosaccharides / R. Barthelson, A. Mobasseri, D. Zopf, P. Simon // Infection and immunity.- 1998.- V. 66, №4.- P. 1439-1444.

137. An iron-regulated sortase anchors a class of surface protein during Staphylococcus aureus pathogenesis / Mazmanian Sarkis K., Ton-That Hung, Su Kenneth, Schneewind Olat // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 2002.- 99, №4,- P. 2293-2298.

138. Antibacterial activity of pepsin-derived bovine hemoglobin fragment / R. Froidevaux, F. Krier, N. Nedjar-Arroume et al. // FEBS Letters.- 2001.- 491.-P.159-163.

139. Bezkorovainy A. The effect of metal chelators and other metabolic inhibitors on the growth of Bifidobacterium Bifidus var. Pennsylvanicus / A. Bezkorovainy, N. Topouzian// Clin. Biochem.-1981.- V. 14, №3.-P. 135-141.

140. Bhakdi S. Decomplementation antigen, a possible determinant of staphylococcal pathogenicity. / S. Bhakdi, M. Muhly // Infect. Immun. 1985.1.- P. 41-46.

141. Booth B.A. Vibrio cholerae soluble hemagglutinin/protease is a mettalloenzyme / B. A. Booth, M. Boesman-Finkelstein, R. A. Finkelstein // Infect. Immun.- 1983.- V. 42, №2.- P. 639-644.

142. Both lactoferrin and iron influence aggregation and biofilm formation in Streptococcus mutans / B. Francesca, M. Ajello, P. Bosso et al. // Biometals.-2004.-V. 17, №3.-P. 271-278.

143. Bullen S.S. Iron and infection / S.S. Bullen.- New York: A. wiley-infection Publication, 1988.- 275p.

144. Coagulase-negative staphylococcus isolated from two case of toxic shock suidrome lack superantigenic activity, but induce cytokine production / G. Lina, A. Flee, J. Tnienne et al. // FEMS Immunol. And Med. Microbiol.- 1996.- V. 13, №1.- P. 81-86.

145. Development of Methods to Monitor Exposure to 1-Nitropyrene / El Bayoumy К, B. Johnson, A.K. Roy, et al // Env. Health Persp.- 1994.- Vol.102, Sup. 16, ref45.-P. 31-37.

146. Foster T.J. Surface-associated proteins of Staphylococcus aureus: their possible roles in virulence. / T.J. Foster, D. McDevitt // FEMS Microbiol. Lett. 1994.-3.-P. 199-205.

147. Galmiche A. Toxines bacteriennes. Facterus de virulence et outiles debiologie cellulaire / A. Galmiche, P. Boquet // Med. Science.- 2001.- V. 17, №6-7.- P. 691-700.

148. Greene C. Adhesion properties of mutants of Staphylococcus aureus defective in fibronectin-binding proteins and studies on the expression of fnb genes. / C. Greene, D. McDevitt. // Mol. Microbiol. 1995.- 6.- P. 258-271.

149. Growth and adsorption of Streptococcus mutans 6715-13 to hydroxyapatite in the presence of lactoferrin / P. Visca, F. Berlutti, P. Vittorioso // Med. Microbiol. Immunol. (Berl).- 1989.- V. 178, №2.- P. 69-79.

150. Hale T. Shigella infection of henle intestinal epithelial cells: Role of the hostcell / T. Hale, R. Morris, P. Bonventre // Infect.Immun.- 1979.- V.24, №3.- P. 887-894.

151. Hapelman I.M. Bacterial Iron Enhances Oxygen Radical-mediated killing of S.aureus by Phagocytes / I.M. Hapelman, A.B. Withelmina // Infect. Immun.-1990.- V.60, №1.- P. 26-31.

152. Hase C.C. Comparison of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease and the Pseudomonas aeruginosa elastase / C.C. Hase, R. A. Finkelstein // Infect. Immun.- 1990.- V. 58, №12.- P. 4011-4015.

153. Hayat M.A. Principles and Techniques of Electron Microscopy / M.A. Hayat.- Macmillan press, London, 1989.- 354p.

154. Impact of proteases on iron uptake of Pseudomonas aeruginosa pyoverdin from transferring and lactoferrin / G. Doring, M. Pfestorf, K. Botzenhart, M.A. Abdallah // Infect. Immun.- 1988.- V. 56, №1.- P. 291-293.

155. Korchev Y.E. Staphylococcus aureus alpha-toxin-induced pores: channellike behavior in lipid bilayers and patch clamped cells / Y.E. Korchev, G.M. Alder, A. Bakhramov//J. Membr. Biol.- 1995.- V. 143, №2.- P. 143-151.

156. Lactoferrin inhibits Bacillus cereus growth and heme analogs recover its growth /N. Sato, H. Kurotaki, S. Ikeda et al. // Biol. Pharm. Bull.- 1999.- V. 22, №2.-P. 197-199.

157. Lederberg J. Lederberg E.M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants / J. Lederberg E.M. Lederberg // J. Bacterid.- 1952.- 63.- P. 399-406.

158. McDevitt D. Molecular characterization of the clumping factor of Staphylococcus aureus. / D. McDevitt //Mol. Microbiol. 1994.- 2.- P. 237-248.

159. Naidu A.S. Identification of a human lactoferrin-binding protein in S. aureus / A.S. Naidu // Med. Microbiol.- 1992,-V. 36.-P. 177-183.

160. Neisseria meningitides produces iron-regulated proteins related to the RTX-family of exoproteins./ S.A. Thompson, L.L. Wang, A. West et al. // J.Bacteriol.- 1993.- 175.-P. 811-818.

161. Otto B. R. Transferrins and heme-compounds as iron sources for pathogenic bacteria / B. R. Otto, A. M. J. J. Verweij-van Vught, D. M. McLaren // Critical Reviews in Microbiol.-1992.- V. 18, №3.- P. 21-26.

162. Panchal R.G. Interactions between residues in staphylococcal alpha-hemolysin revealed by reversion mutagenesis. / R.G. Panchal, H. Bayley //J. Biol. Chem. 1995.- 39.- P. 272-276.

163. Seifert H. Questions about gonococcal pilus phase- and antigenic variation. Mol. Microbiol. 1996.- Vol. 21, № 3.- P. 433-440.

164. Shi Y. Human lactoferrin binds and removes the hemoglobin receptor protein of the periodontopathogen Porphyromonas gingivalis / Y. Shi, W. Kong, K. Nakayama // J. Biol. Chem.- 2000.- V. 275, №39.- P. 30002-30008.

165. Singh P. K. Iron sequestration by human lactoferrin stimulates P. aeruginosa surface motility and blocks biofilm formation / P. K. Singh // Biometals.-2004.-V. 17, №3.- P.267-270.

166. Stephens D. Interaction of Neisseria meningitidis with human nasopharyngeal mucosoc. Attachement and entry into columnar epithelial cells / D. Stephens, L. Hoffman, McGeez // J. Infect. Dis.- 1983.- V. 148, №3.- P.369-376.

167. Talbot J. A. Cleavage of proteins of reproductive secretions by extracellular proteinases of Tritrichomonas foetus / J. A. Talbot, K. Nielsen, L.B. Corbeil // Can. J. Microbiol.-1991.- V.37, №5.- P. 384-390.

168. The pH dependence of naturally occurring low-spin forms of methemoglobin: an EPR Stady / D.A. Svistunenko, A. Martyn, P. Sharpe et al // J. Biochemistry.- 2000.- Vol. 351.- P. 595-605.

169. Thulin K.E. Agglutination of bacteria by haemoglobin / К. E. Thulin // Acta Rheumatol. Scand.- 1957.-3.-P. 154-168.

170. Transformation competence and typ-4 pilus biogenesis in Neisseria gonorrhoeae a review. / M. Fussenegger, T. Rudel, R. Barten et al. // Gene. 1997.- V. 192, № 1.- P. 125-134.

171. Viswanathan V.K. Role of iron acquisition in Legionella pneumophila virulence / V.K. Viswanathan, Cianciotto Nicholas P. // ASM News.- 2001.- 67, №5.- P. 253-258.

172. Walker В., Bayley H. Key residues for membrane binding, oligomerization, and pore foming activity of staphylococcal alpha-hemolysin identified by cysteine scanning mutagenesis and targeted chemical modification. J. Biol. Chem. 1995, 39: 235-239.

173. Wikstrom M.B. Detection of microbial proteolytic activity by a cultivation plate assay in which different proteins adsorbed to a hydrophobic surface areused as substrates / M.B. Wikstrom // Appl Environ Microbiol.-1983.- 45 (2), Feb.- P. 393-400.1. Pi

Информация о работе

Ханина, Елена Алексеевна
кандидата биологических наук
Оренбург, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Антигемоглобиновая активность микроорганизмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы