Анаэробное окисление аммония и метаногенез в системах аэробной очистки сточных вод с иммобилизацией микроорганизмов

Литти, Юрий Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анаэробное окисление аммония и метаногенез в системах аэробной очистки сточных вод с иммобилизацией микроорганизмов
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Анаэробное окисление аммония и метаногенез в системах аэробной очистки сточных вод с иммобилизацией микроорганизмов"

005055862

На правах рукописи

ЛИТТИ Юрий Владимирович

Анаэробное окисление аммоння и метаногенез в системах аэробной очнсткн сточных вод с иммобилизацией микроорганизмов

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2012

2 9 НОЯ 2012

005055862

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Ножевникова Алла Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Л. М. Захарчук, профессор кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ

доктор биологических наук, Ю.А. Николаев, руководитель группы биотехнологий Инженерно-

технологического центра Мосводоканала.

Ведущая организация:

Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева

Защита диссертации состоится 11 декабря 2012 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1. Тел: 8 (495) 939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического

факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 'Л_2012 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета: к.б.н. Пискункова Нина Фёдоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной из актуальнейших проблем современности является проблема чистой воды, которая неразрывно связана с проблемой качественной очистки сточных вод и предотвращения загрязнения источников чистой пресной воды. Наибольший интерес и перспективу имеют естественные и самые дешевые методы биологической очистки, представляющие собой интенсификацию природных процессов разложения органических соединений микроорганизмами в аэробных или анаэробных условиях, или в их комбинации.

В централизованной очистке хозяйственно-бытовых сточных вод осуществляется аэробная очистка с применением процесса активированного ила, которая наряду с бесспорными достоинствами имеет и ряд существенных недостатков, а именно высокие затраты на аэрацию и утилизацию больших количеств избыточного ила (Ножевникова, 2004). Не менее серьезная проблема состоит в удалении соединений азота, т.к. большинство очистных сооружений изначально проектировалось без расчета на их удаление (Jetten et al., 2002; Николаев и др., 2008). Сброс недостаточно очищенных от соединений азота сточных вод является причиной эвтрофикации водоемов. Присутствие аммиака в водоеме оказывает сильное токсическое влияние на рыб, наличие нитритов в питьевой воде вызывает онкологические заболевания, нитратов — метгемоглобинемию у детей.

В настоящее время азотсодержащие соединения удаляются в специальном блоке доочистки воды методом биологической нитри-денитрификации, однако он достаточно дорог, так как требует значительных затрат на аэрацию и добавление источника органических веществ, необходимых для роста денитрификаторов (Dapena-Mora et al., 2004; Николаев и др., 2008). В конце 80-х годов прошлого века был открыт процесс анаэробного окисления аммония нитритом (анаммокс-процесс) (Broda, 1977), и через 20 лет описана первая анаммокс-бактерия Cand. Brocadia anammoxidans (Strous et al., 1999). В наши дни анаммокс-процесс считается наиболее перспективным, экономически выгодным и эффективным способом удаления аммония из сточных вод, т.к. позволяет исключить стадию гетеротрофной денитрификации и значительно уменьшить стоимость аэробной нитрификации (Jetten et al., 2002; Schmidt et al., 2003; Egli et al., 2003; Zhang et al., 2008; Kartal et al., 2010). Являясь крайне востребованным при очистке высококонцентрированных сточных вод, применению процесса анаммокс при очистке сточных вод с низкими концентрациями азотных загрязнений ранее не уделялось должного внимания. Однако, по мере развития новых технологий очистки анаммокс-процесс может вносить более значимый вклад в удаление азота при очистке сточных вод с низкими концентрациями азотных загрязнений, состав которых отличается от оптимальных для развития сообщества анаммокс-бактерий. Таким образом, исследование процесса анаммокс приобретает новый аспект.

характеризующихся низкими концентрациями загрязнений. Среди них использование анаэробных и аэробных процессов в одном (Irwine et al., 1989; Subbaramaiah et al., 2010) или разных биореакторах (Goncalves and Avanjo, 1999; Garuti et al., 1992), применение рецикла очищаемой воды, изменение режима аэрации и др. для более полного удаления биогенных элементов (Мишуков Б.Г., 2004а), а также применение иммобилизации микроорганизмов активного ила на различных носителях (Yan and Tay, 1997; Zita and Hermansson, 1997; Сироткин,

2007). Иммобилизация микроорганизмов на твердом носителе вследствие развития биопленок позволяет значительно увеличить плотность и биоразнообразие активных микроорганизмов в очистных сооружениях, благодаря чему увеличивается скорость и глубина очистки воды. Увеличение продолжительности пребывания микроорганизмов в реакционной среде имеет немаловажное значение с учетом затрат на утилизацию больших количеств биомассы активного ила. В системах аэробной очистки с прикрепленными микроорганизмами устанавливается равновесие между процессами прироста биопленки и ее вымывания, в связи с чем отпадает необходимость в рециркуляции биомассы, принципиально необходимой при очистке сточных вод в традиционных аэротенках, работающих на свободноплавающей биомассе (Сироткин, 2007).

Перечисленные выше основные преимущества систем аэробной очистки с иммобилизацией микроорганизмов активного ила, перед традиционными аэротенками со свободноплавающей биомассой, в большой степени связаны с важной особенностью строения биопленки - образованию анаэробного слоя вследствие ограниченного доступа кислорода в ее внутренние зоны (Tay et al., 2002; Yu et al., 2002; Плакунов, 2008). Даже в условиях аэрации во внутренних слоях биопленок возникают анаэробные микрозоны, где могут осуществляться анаэробные микробные процессы, в частности денитрификация (Henze et al.,

2008). До настоящего времени до конца не раскрыты процессы, протекающие в анаэробных слоях биоплёнки, а также их влияние на эффективность функционирования сооружений аэробной очистки сточных вод. Исследование метаногенеза, а также анаэробного окисления аммония и денитрификации -процессов, участвующих в удалении основных загрязняющих веществ хоз-бытовых сточных вод, а именно соединений углерода и азота, представляет большой интерес для биотехнологии аэробной очистки сточных вод с участием иммобилизованных биоценозов. Результаты этих исследований имеют важное практическое значение при проектировании новых и реконструировании существующих очистных станций, в частности, для уменьшения образования избыточного ила, а также упрощения и удешевления процесса удаления биогенного азота.

На исследуемых станциях аэробной очистки сточных вод, построенных в поселках строителей Олимпийских объектов в долине реки Мзымта Сочинского региона, было обнаружено существенное снижение прироста избыточного ила и несхождение баланса по азоту, что позволило предположить протекание процессов метаногенеза и анаммокс в биопленках иммобилизованного активного ила.

Цели и задачи работы. Целью работы было исследовать анаэробные процессы образования метана и молекулярного азота в биопленках иммобилизованного активного ила в системах аэробной очистки сточных вод, получить доказательства осуществления процесса анаэробного окисления аммония нитритом и развития анаммокс-бактерий в полномасштабных сооружениях и разработать предложения по оптимизации процессов удаления азота. В задачи работы входило:

1) исследовать разнообразие и относительную численность аэробных и анаэробных микроорганизмов в прикрепленном активном иле;

2) исследовать анаэробную деградацию органических веществ с образованием метана во взвешенном и прикрепленном активном иле из полномасштабных станций очистки сточных вод;

3) исследовать окисление метана в микробных биопленках и во взвешенном иле;

4) исследовать процессы денитрификации и анаммокс в периодических стационарных накопительных реакторах и при проточном культивировании;

5) получить биомассу прикрепленного и свободноплавающего активного ила, обогащенного анаммокс-бактериями;

6) с использованием культуральных, микроскопических, молекулярно-биологических и филогенетических методов охарактеризовать анаммокс-бактерии в хлопьях и биопленках активного ила.

7) разработать рекомендации по оптимизации процессов удаления азота в полномасштабных очистных сооружениях.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено исследование анаэробных процессов (метаногенез и анаммокс) в полномасштабных системах аэробной очистки бытовых сточных вод с иммобилизацией микроорганизмов. Выявлено, что в условиях активной аэрации в биопленках иммобилизованного на ершовом носителе активного ила функционирует метаногенное микробное сообщество, которое осуществляет анаэробную деградацию органических соединений до метана и углекислоты. Показано микробное окисление образующегося метана и реализация метанового цикла при очистке сточной воды, причем образование метана происходит преимущественно в прикрепленном, а окисление в свободноплавающем иле. Установлено, что высокое содержание анаэробных микроорганизмов в активном иле обеспечивает низкий прирост микробной биомассы избыточного ила. Получены доказательства наличия процесса анаммокс при очистке бытовых сточных вод в комбинированной системе с физико-химической предобработкой и биологической очисткой. Впервые показан существенный вклад анаммокс-процесса в удаление азота при очистке сточных вод с низкими концентрациями загрязнений. Получен патент на комплектно-блочную модульную очистную установку с эффективным удалением азота с помощью иммобилизованного аэробно-анаэробного микробного сообщества, включающего анаммокс-бактерии. Выданы рекомендации для оптимизации работы канализационных очистных сооружений КОС ЭКОС.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 9 международных симпозиумах и конференциях: V-ая и VI-ая Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (2009, 2010); III International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld 2009); Конференция «Инновационные технологии и оборудование для очистки сточных вод и обработки осадка» (2010); VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2011); IX Международная специализированная выставка «Мир биотехнологии - 2011»; BIT'S 1st World Congress of Environmental Biotechnology - 2011; Международная конференция «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний»; Конференция «Энергосбережение и энергоэффективность на предприятиях водопроводно-канализационного хозяйства» (2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ (2 опубликованных статьи и 1 статья в печати, 1 патент, 9 тезисов).

Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории микробиологии антропогенных мест обитания Института микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН. Филогенетические исследования проведены в ЦКП "Контроль биобезопасности ГМО, пищевого сырья, продуктов и кормов» ФЦП Роснауки на базе Центра "Биоинженерия" РАН.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, У... глав, общих выводов, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на Jfiiстранице машинописного текста, содешсит 7.9. рисунка, /г?, таблицы и .... приложения. Библиография включает наименования, из которых 7?3f на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Работу проводили с пробами прикрепленного и свободноплавающего активного ила из экспериментальной станции очистки сточных вод в поселке Красная поляна, Сочи; а также из двух станций очистки сточных вод, построенных по технологии компании ЭКОС, включающей физико-химической предобработку коагулянтом и рециклом водно-иловой смеси из аэротенка в микроаэрофильный денитрификатор в начале процесса, в поселках строителей олимпийских объектов вдоль реки Мзымта (канализационное очистное сооружение КОС №3 с одним денитрификатором и КОС №6 с двумя последовательными денитрификаторами). Было исследовано 5 образцов ершей с обрастаниями и 2 образца взвешенного ила. Пробы отбирали 4 раза с интервалом 6 месяцев.

Использованные среды. Для исследования аэробной и анаэробной деградации летучих жирных кислот (ЛЖК), а также метанотрофной активности использовали: 1) ацетат, пропионат и n-бутират натрия до конечной

концентрации 5 мМ; 2) метан до концентрации 8-10% по объему газовой фазы. Модифицированную среду Пфеннига для метаногенов с добавлением витаминов и микроэлементов готовили по стандартной методике (Жилина, 1978). Среду для нитрифицирующих бактерий готовили согласно (Коорэ е! а1., 1991). Среду для анаммокс-бактерий готовили согласно (1лао е1 а1., 2007) с небольшими модификациями. Свежеприготовленную среду продували аргоном. Среда для денитрифицирующих бактерий по составу была аналогичной среде для анаммокс-бактерий, но без добавления ЫН4С1. Для определения численности аэробных бактерий использовали глюкозо-пептонную среду с содержанием глюкозы и пептона по 2.5 г/л.

Краткосрочные опыты. Опыты ставили в 3-х повторностях в герметичных стеклянных флаконах объемом 120 мл. Анализ газов проводили регулярно через 1-3 суток, пробы жидкости для анализа рН, ЛЖК, ионов аммония, нитрита и нитрата отбирали 1 раз в 1-2 недели. Образование метана в пробах активного ила изучали при 9 и 20°С. Объем жидкой фазы (иловая суспензия, разбавленная 1:1 средой для метаногенов) - 20 мл, газовая фаза - аргон. Исследование влияния температуры на скорость анаммокс-процесса проводили в интервале температур от 10 до 40°С с шагом в 5°С. Определение относительной численности аэробных и анаэробных микроорганизмов в биопленках на ершах производили методом предельных разведений. Аэробное окисление аммония исследовали в колбах Эрленмейера при 30°С.

Долгосрочные опыты. Периодическое культивирование проводили в стационарных стеклянных реакторах объемом 1-2.5 л. Не реже 1 раза в неделю, меняли среду или добавляли соли нитрита и аммония, Регулярно, 2-3 раза в неделю, определяли рН, состав газовой фазы, концентрации нитрит- и нитрат-ионов, и иона аммония, каждые 3-4 недели определяли ХПК и ЛЖК. Культивирование производили первые два месяца при 20, следующие два месяца при 25 и затем при 30°С.

Накопление анаммокс-бактерий и исследование условий их активного роста проводили при непрерывном культивировании в лабораторном гибридном проточном реакторе с восходящим потоком среды через слой активного ила (иА8В) и ершовой загрузкой (рис.1) для иммобилизации анаммокс-бактерий при 30°С с постоянным контролем рН, концентрации ионов аммония и нитрита на входе и выходе из реактора.

Рис. 1. Ерш для иммобилизации активного ила.

Химические анализы. Содержание кислорода, азота, метана и водорода определяли на газо-жидкостном хроматографе Кристалл 5000.1 (ЗАО ХРОМАТЕК г. Йошкар-Ола) и на хроматографе СН1ЮМ-5 (Чехословакия). Хроматографический анализ ЛЖК проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе (ВЭЖХ) «Стайер». Химическое поглощение кислорода (ХПК) определяли бихроматным методом (Орлов Д.С., Гришина Л.А, 1981). Нитрат определяли колориметрически по методике

(Bhaudari et al., 1986). Нитрит и аммоний определяли по стандартной методике (Лурье, 1971). Определение pH производили на рН-метре HANNA рН-211 (Германия). Абсолютно сухую массу ила (АСМ) определяли гравиметрически с высушиванием пробы при 105°С.

Изучение морфологии и ультратонкого строения клеток. Морфологию бактерий изучали в световом микроскопе Olympus с фазовым контрастом, а также с использованием сканирующего электронного микроскопа JSM-T300 (Япония). Ультратонкие срезы изучали в электронном микроскопе Jeol JEM -lOOC (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Детекция анаммокс-бактерий молекулярно-биологическим методом FISH. Гибридизацию препаратов с зондами проводили в соответствии с методикой Stahl и Amann (1991) при температуре 46°С и условиях гибридизации для различных зондов (Amann et al., 1990; Amann et al., 1995). Идентификацию клеток планктомицетов осуществляли с зондом PLA46 для всей группы Planctomycetes (Neef et al., 1998) и Amx368 для «апатшох»-планктомицетов (Schmid et al., 2003).

Определение филогенетической принадлежности анаммокс-бактерий. ДНК выделяли модифицированным методом (Birnboim and Doly, 1979) и Wizard-технологии фирмы Promega (США). Гены 16S рРНК амплифицировали с использованием праймеров 11F и 1492R (Lane, 1991). Для амплификации фрагментов генов, специфичных для планктомицетов, использовались праймеры Pia 46F и 1385R. Секвенирование и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили по методу (Sanger et al., 1977) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730. Редактирование полученных сиквенсных спектрограмм проводили с помощью программы Chromas, версия 1.45 (http://mwv.techelysium.com. au./chromas.html). Первичный сравнительный анализ полученных de novo последовательностей с последовательностями базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.html). Выбранные последовательности выравнивали между собой с помощью программы CLUSTAL W v 1.75 (Thompson et al., 1994).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

1. Образование и окисление метана и образование молекулярного азота в системе аэробной очистки сточных вод

Исследование проводили с пробами взвешенного и иммобилизованного на ершах активного ила из экспериментальной станции очистки сточных вод ЦАО МО РФ, пос. Красная поляна, Сочи.

На рисунке 2 представлена фотография микробных обрастаний (биопленки) на волокнах ерша, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа. Очевидно высокое морфологическое разнообразие микроорганизмов в биопленках. На поверхности биопленок присутствуют палочки, кокки и овальные клетки различных размеров. На отдельных снимках

видны агрегаты, похожие на метаносарцины и/или анаммокс-бактерий. Методом предельных разведений обнаружено, что рост микроорганизмов в аэробных условиях наблюдался вплоть до 12 разведения, а в анаэробных до 1112 разведения. В анаэробных условиях образование метана наблюдалось до 4-5 разведений, в разведениях от 6-го до 11-12-го наблюдалось образование водорода и летучих жирных кислот. С помощью комбинации методов предельных разведений и анализа газов, образующихся в анаэробных условиях

культивирования, показано, что даже в биопленках, развивающихся в условиях активной аэрации, анаэробные

микроорганизмы могут составлять не менее 10% от общего числа микроорганизмов.

Рис. 2. Микробные обрастания на волокнах «ершовой» насадки. Сканирующий электронный микроскоп.

Результаты исследований позволяют объяснить существенное уменьшение продукции избыточного ила, наблюдаемое на станциях аэробной очистки воды с иммобилизацией микроорганизмов, по сравнению с традиционной технологией аэробной очистки. Это происходит вследствие увеличения роли анаэробных микроорганизмов в активном иле, образующих гораздо меньше микробной биомассы по сравнению с аэробными микроорганизмами.

В результате посевов прикрепленного и свободноплавающего илов на среду для нитрификаторов, изменялась окраска индикатора в среде, уменьшалась концентрация аммония, и образовывался нитрит и небольшое количество нитрата, что свидетельствует о присутствии нитрификаторов (аэробных аммоний-окисляющих и нитрит-окисляющих бактерий) в исходных илах.

1.1. Анаэробная деградация органических веществ с образованием метана во взвешенном и прикрепленном активном иле. Образование метана возможно лишь при крайне низком окислительно-восстановительном потенциале среды, от -200 мВ (Mah et al„ 1977) до -300 мВ и ниже (Zehnder and Stumm, 1988). Соответственно, присутствие в биопленках на ершах и в хлопьях активного ила метаногенного микробного сообщества является доказательством существования анаэробных условий для развития различных анаэробных микроорганизмов, в том числе анаммокс-бактерий.

Микробные популяции взвешенного и прикрепленного ила в анаэробных условиях при 20°С образовывали метан из эндогенных органических веществ с постоянной скоростью без выраженной фазы задержки. Образование метана наблюдалось даже при пониженной температуре после лаг-фазы. Образование метана и углекислоты происходило, вероятно, за счет анаэробного разложения органических веществ сточной воды и, возможно, лизиса неактивной биомассы. Прикрепленный ил проявил более высокую метаногенную активность, поскольку в сравнении с взвешенным илом в нем содержится большее

количество анаэробных микроорганизмов. Таким образом, исследуемый активный ил содержит аэробные и анаэробные микроорганизмы, включая метаногенные археи, образующие метан.

Как известно, при анаэробной деградации органических веществ основными промежуточными продуктами являются летучие жирные кислоты, в основном уксусная (ацетат), пропионовая (пропионат) и масляная (бутират) кислоты (Ои|'ег, геЬпскг, 1983; Заварзин, 1987). Они могут накапливаться при неполном анаэробном разложении органических веществ. Показано, что в анаэробных условиях метан образовывался из ЛЖК микробными сообществами как прикрепленного, так и взвешенного активного ила (рис. 3, рис. 4). Весь добавленный ацетат потребился прикрепленным илом без фазы задержки через 10 суток, причем из 5 ммолей добавленного ацетата образовалось 5 ммолей метана, что соответствует стехиометрии ацетокластического метаногенеза (рис. За).

б)

0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30

Прикрепленный ил+ацетат Сутки -»-Дисперсный ил+ацетат Сутки

Прикрепленный ил без ацетата Дисперсный ил без ацетата

Рис. 3. Образование метана микробным сообществом прикрепленного (а) и свободноплавающего (б) ила.

Следует отметить, что взвешенный ил потреблял ацетат намного медленнее, чем прикрепленный, с заметной лаг-фазой. Это является свидетельством того, что, благодаря наличию во внутренних слоях биопленок анаэробных микрозон, число активных метаногенов в прикрепленном активном иле выше, чем в

свободноплавающем.

Рис. 4. Образование метана микробным сообществом

взвешенного ила из пропионата и бутирата.

Образование метана из пропионата и бутирата начиналось после непродолжительной лаг-фазы. Количество образованного метана

- Ил+бутират

- Ил контроль

10 15 20

■«- Ил+пропионат

Сутки

хорошо коррелировало с количеством потребленных ЛЖК, учитывая, что из 1 ммоля ацетата, пропионата и бутирата в среднем образуется соответственно 1, 1.75 и 2.5 ммоля метана. Так, из 5 ммолей добавленных пропионата и бутирата образовалось около 9 и 12,5 ммолей метана, соответственно (рис. 4).

Таким образом, во взвешенном и в иммобилизованном иле присутствуют все ключевые группы анаэробных микроорганизмов, способных разлагать продукты кислотного брожения - важных предшественников метана.

1.2. Окисление метана в микробных биопленках на волокнах ершей и во взвешенном иле. Показано, что микробная популяция взвешенного и прикрепленного ила практически полностью окисляла добавленный метан уже через 5 суток, а при истощении кислорода начиналось его образование, вероятно, за счет разложения эндогенных органических веществ. Скорость

окисления метана свежими пробами активного ила была одинаковой в пробах прикрепленного и

свободноплавающего илов, а скорость его образования была выше в пробах прикрепленного ила (рис. 5).

Рис. 5. Окисление и образование метана микробным сообществом взвешенного и прикрепленного ила.

Эти результаты свидетельствуют об одновременном образовании и окислении метана микробной популяцией прикрепленного ила. Метан может образовываться в анаэробной зоне биопленки и окисляться во внешнем аэробном слое, а также свободноплавающим илом. Это указывает на важную роль анаэробного микробного сообщества в деградации органических веществ и на функционирование метанового цикла при аэробной очистке воды.

1.3. Образование молекулярного азота активным илом. С целью исследования образования молекулярного азота был поставлен длительный эксперимент с использованием среды, содержащей нитрит и аммоний. В течение шести месяцев культивирования активного ила нитрит активно потреблялся, а потребления аммония не наблюдалось, а даже происходило увеличение его концентрации за счет разложения азотсодержащих органических веществ биомассы ила (рис. 6). В этот период протекала гетеротрофная денитрификация, что подтверждалось активным образованием молекулярного азота. В дальнейшем содержание растворенных органических веществ снизилось до следовых значений. Хотя потребление нитрита снизилось, но

О 5

- Взвешенный ил

15 20 -Прикрепленный ил

начал потребляться аммоний и шло образование молекулярного азота, что указывает на осуществление процесса анаммокс и развитие анаммокс-бактерий. В пробах ила после 4 месяцев культивирования методом in situ-гибридизации (FISH) с СуЗ-меченым олигонуклеотидным зондом PLA46 показано присутствие физиологически-активных планктомицетов, к которым принадлежат все известные на сегодняшний день анаммокс-бактерии. (рис. 7).

Полученные результаты указывают на то, что в активном иле экспериментальной станции очистки сточных вод в пос. Красная поляна, Сочи, удаление азота происходит преимущественно за счет процессов нитри- и

денитрификации, одна-

ко даже

активной

активном

сутствуют

бактерии,

вероятно,

в условиях аэрации в иле при-анаммокс-которые, вносят опре-

деленный вклад в общее удаление азота.

Рис. 6. Изменение концентрации аммонийного и нитритного азота в реакторе с активным илом.

Рис. 7. In situ гибридизация образца с СуЗ-меченым олигонуклеотидным зондом PLA46 планктомицетов на микрочастице активного ила после 4 месяцев культивирования: А -фазовый контраст, Б - микрофотографии гибридизации с зондом, В - окраска ДАФИ.

2. Удаление азота в результате процессов денитрификации и анаммокс в системе микроаэрофильно-аэробной очистки сточных вод

Как показывает практика очистки сточных вод, для эффективного удаления азотсодержащих загрязнений в рамках традиционной технологии нитри-денитрификации соотношение БПК5/азот в сточной воде должно быть не ниже 6 (Николаев и др., 2009). В результате физико-химической предобработки коагулянтом на КОС «ЭКОС» до половины органических загрязнений удаляется непосредственно перед биологической очисткой, и соотношение БПК5/азот в

очищаемой воде становится меньше 6. В то же время качество очищенной на КОС воды соответствует жестким нормативам сброса в водные объекты рыбохозяйственного значения (Табл. 1).

Несхождение баланса по азоту позволило предположить, что на станциях очистки наряду с традиционной нитри-денитрификацией протекает относительно недавно открытый автотрофный процесс анаммокс, который не нуждается в присутствии органического донора электронов. Для подтверждения этого предположения в биопленках прикрепленного ила методами лабораторного культивирования были исследованы процессы образования молекулярного азота в пробах активного ила из КОС №3 и №6.

Таблица 1. Содержание основных загрязнений в сточной воде, поступающей на очистку на КОС «ЭКОС» и выпускаемой после очистки в реку Мзымта.

Основные загрязнения Концентрация на входе, мг/дм3 Концентрация на выходе, мг/дм3

БПК полное 149.5 2.8

Азот аммонпПный 18.3 0.33

Азот ннтритов 0.1 0.005

Азот нитратов 0.0 4,8

2.1. Процессы денитрификации и анаммокс в периодических накопительных реакторах. Основную работу по исследованию анаммокс-процесса в периодических реакторах проводили с обрастаниями на ершах из денитрификаторов 1-ой и 2-ой ступени (Д-1 и Д-2) станции КОС №6, отобранными после 8 месяцев эксплуатации станции. В предварительных опытах с пробами свежего активного ила из обеих КОС было показано, что в анаэробных условиях идет активное образование метана, а в аэробных его окисление. Во всех реакторах наблюдались очень похожие ход и результаты экспериментов по исследованию образования молекулярного азота (рис. 8, Табл. 2). В течение первого месяца в реакторах шло потребление нитрита и аммония, свидетельствующее об активности анаммокс-бактерий, а так же наблюдалось небольшое образование метана. В последующие три-четыре месяца шло активное потребление нитрита, без уменьшения концентрации аммония. Более того, шло образование аммония из неактивной биомассы, и осуществлялся процесс денитрификации. Тем не менее, из данных таблицы 2 и из полного уравнения (1) анаммокс-реакции

N11/ +1.32М02' + 0.ОббПСОз + 0.131? =1.02Я2 + 0.2N0; + 0.066СН200^ол + 2.03Н20 (1) следует, что вклад анаммокс-процесса в первые2-3недели культивирования мог составлять до 30% от общего удаленного азота, а в период активной денитрификации около 10%. При этом исходные биопленки на ершах разрушились, что свидетельствует об изменении микробной популяции по сравнению с началом эксперимента.

Существенное снижение содержания органических веществ в культивируемой среде к концу пятого месяца эксперимента свидетельствовало об уменьшении интенсивности процессов деградации органических веществ. Только в это время стало возможным создание элективных условий для

анаммокс-бактерий. В обоих реакторах началось потребление нитрита и аммония в соотношении М-Шг/Н-МНд » 1.29, что свидетельствует о процессе анаммокс (Табл. 2).

Таблица 2. Средняя скорость потребления(-) или образования(+) нитрита и аммония в разные периоды культивирования активного ила из 1-го и 2-го денитрификаторов станции №6.

Период измерения, месяц Д1 да

N-N02, мг/(л* сутки) N-N44, мг/(л*сутки) N-N02, мг/(л* сутки) N-N114, мг/(л*сутки)

1 -7,5 -3,5 -7,8 -2,5

2 -7,5 0 -И 0

3 -10,2 0 -10,4 -1,0

4 -12,5 -1,0 -10,3 -1,1

5 -13 -2,1 -11,5 -1,5

Период превалирования процесса анаммокс

6 -1,9 -0,8 -3,5 -2,3

7 -2,5 -2,1 -3,1 -2,5

8 -2,1 -2,2 -2,6 -2,2

9 -2 -2,2 -2,5* -2,4*

10 -2,2 -1,2 -7,9* -5,0*

11 -1,1 -1,3 -4,8* -4,6*

12 -6,7 -2,8 -4,6* -5,1*

13 -6,5 -4,8 -5,2* -4,3*

14 -9,2 -8,0 -7,0* -6,2*

15 -9,5 -10,8 -3,7* -3,5*

Примечание: *- после отбора большей части содержимого из периодического реактора в проточный гибридный реактор.

Рис. 8. Изменение концентрации аммонийного и нитритного азота в реакторе с прикрепленным илом из денитрификатора 2-ой ступени (Д-2) КОС №6.

Образование молекулярного азота уменьшилось по сравнению с периодом де-нитрификации. В целом, сравнивая результаты культивирования проб ершей с обрастаниями из 2-х последовательных денитрификаторов Д1 и Д2 КОС №6, отмечено, что к концу 8 месяца активность анаммокс-процесса была несколько выше в реакторе Д2. К тому же, период активной денитрификации, после которого стало заметно потребление аммонийного азота анаммокс-бактериями, в реакторе Д2 закончился почти на 1 месяц раньше, чем в реакторе Д1 (табл. 2). Для подбора

О 100 200 300 400 500

— -»— МН4-№ СУ™И

условий активного роста анаммокс-бактерий было решено инокулировать проточный реактор прикрепленным илом из денитрификатора Д2.

В реакторе с активным илом из денитрификатора станции №3, отобранном после 10 месяцев эксплуатации станции, в первую неделю эксперимента наблюдалось снижение концентрации аммонийного азота, затем в течение около трех месяцев культивирования потребления аммония не наблюдалось (рис. 9). Более того, шло активное образование аммония вследствие лизиса клеток неактивной биомассы. Потребление аммония постепенно начало превышать его образование примерно к 80 суткам, а впоследствии потребление аммония и нитрита стало близким к эквимолярному. Таким образом, дефицит растворенного кислорода и органических веществ - важные условия для

существования анаммокс-бактерий в системах очистки сточных вод.

Рис. 9. Изменение концентрации аммонийного и нитритного азота в реакторе с активным илом, отобранным из денитрификатора КОС №3 после 10 месяцев эксплуатации.

В результате исследования проб прикрепленного активного ила, отобранных из денитрификатора станции №3 через 17 и 22 месяцев с момента запуска станции, показано, что активность анаммокс-процесса in situ по мере эксплуатации станции увеличивалась. На это указывало увеличение скоростей потребления аммонийного азота в начальный период (2-3 недели) культивирования этих проб. За период эксплуатации станции после отбора первой и последней проб (12 мес.) скорость потребления аммонийного азота повысилась на 8-10 %. Это свидетельствует об увеличении активности анаммокс-бактерий в активном прикрепленном иле. Результаты исследований свидетельствуют о благоприятных условиях для развития анаммокс-бактерий в прикрепленном активном иле станции очистки сточных вод с физико-химической предобработкой и рециклом воды из аэротенка в микроаэрофильный денитрификатор.

2.2. Исследование влияния факторов внешней среды на скорость удаления азота. Процессы удаления азота (анаммокс в сочетании с денитрификацией) протекали в интервале температур от 10 до 40°С с широким оптимумом при 25-35°С (рис. 10а). При температуре 40°С скорость процесса была намного ниже, чем при 35°С, т.е. резко падала. Достаточно высокая скорость процесса наблюдалась при пониженной температуре. При 10 и 15°С она была всего в два

—NQ2-N .....NH4-N Сутки

с половиной раза ниже, а при 20°С в полтора раза ниже, чем при оптимальной температуре.

Исследование влияния рН исходной среды на скорость потребления аммония и нитрита показало, что процесс удаления азота за счет анаммокс-процесса протекал в интервале начального рН от 6 до 9 с оптимумом при рН от 7 до 8. (рис. 106). В вариантах опыта с начальной кислой реакцией среды активность анаммокс-бактерий была ниже в 3 раза. К концу опыта, во всех флаконах, за исключением флаконов с исходным рН 9, произошло подщелачивание среды и рН повысился до величин от 7.82 (исходный рН 6.0) до 8.7 (исходный рН 8.5). Таким образом, скорость процесса анаммокс резко возрастает при повышении рН от 6.5 до 7.0, остается максимальной в интервале рН от 7.0 до 8.0 и снижается при дальнейшем повышении рН.

Рис. 10. Влияние температуры (а) и исходной реакции среды (б) на среднюю скорость потребления нитрита и аммония в процессе анаммокс.

2.3. Исследование процессов образования молекулярного азота и накопления анаммокс-бактерий в проточном гибридном реакторе. В

условиях культивирования при постоянном протоке среды, не содержащей органических веществ и других акцепторов электронов помимо нитрита, создаются элективные условия для развития анаммокс-бактерий. При росте анаммокс-бактерий pH среды повышается (Tang et al., 2009). Другие микроорганизмы в таких условиях погибают или вымываются из реактора. Таким способом были выделены все известные на сегодняшний день культуры анаммокс-бактерий (Zhang et al., 2008). После девяти месяцев культивирования в стационарном периодическом реакторе ерш с прикрепленной и взвешенной биомассой из денитрификатора второй ступени КОС №6 был перенесен в колонку проточного реактора.

2.3.1. Вывод на рабочий режим проточного анаммокс-реактора и исследование его работы при постепенном увеличении нагрузки по азотным субстратам. При переносе ерша из периодического в проточный реактор большая часть биомассы свалилась с волокон ершей, и в нижней части колонки проточного реактора

образовался слой микробного осадка. В первые месяцы культивирования суточное потребление общего азота не превышало 10-20 мг N/л объема реактора, с эффективностью удаления азота около 20% (рис. 11, рис. 12а). Величина ХПК в нижней части реактора на 40-е сутки составляла около 200 мг/л. При дробной подаче среды с невысокой концентрацией субстрата это способствовало развитию гетеротрофных денитрифицирующих бактерий в нижней части реактора и удалению части нитритного азота в процессе денитрификации. Соотношение удаленного нитритного и аммонийного азота было ниже 1 (рис. 12а), что указывало на неполное удаление аммония и в этот период. Только после 4-х месяцев культивирования параллельно с увеличением нагрузки на реактор по азоту началось постепенное увеличение скорости удаления азота. Так за 5-ый месяц по сравнению с предыдущим общее удаление азота выросло в 3 раза, а к концу б-го месяца уже в 26 раз, превысив 200 мг М/(л*сутки) (рис. 11). После 5 месяцев культивирования ХПК в реакторе снизился до предела чувствительности метода, летучие жирные кислоты (ЛЖК) также не определялись, что свидетельствовало о вымывании из реактора продуктов лизиса неактивной биомассы ила. Соотношение удаленного нитритного и аммонийного азота возрастало и приблизилось к 1.3, что соответствует процессу анаммокс, и эффективность удаления азота возрастала (рис. 12а, рис. 126).

На 163-е сутки реактор был переведен на проточный режим с подачей порций среды 16 раз в сутки, постепенно увеличивалась нагрузка повышением концентраций нитритного и аммонийного азота и объема подаваемой среды (табл. 3). При повышении концентрации нитрита до 150-155 мг/л (220-е сутки) произошло снижение скорости потребления азотных соединений и образования молекулярного азота, возможно из-за ингибирования нитритом (рис. 11). Восстановление прежней активности заняло около месяца. Таким образом, анаммокс-бактерии довольно чувствительны к резкому повышению концентрации нитрита. При накоплении культуры анаммокс-бактерий очень важен контроль над процессом адаптации к меняющимся условиям

культивирования, следует избегать резких скачков в увеличении нагрузки на реактор (Tang et al., 2009).

Рис. 11. Изменение скорости удаления азота в проточном реакторе.

Количество образуемого молекулярного азота довольно хорошо

О 100 200 300 400 - N02-NyflaneHHbiM -"— NH4-NyflaneHHbrä

коррелировало с теоретически ожидаемым в течение всего периода культивирования (рис. 13). При уменьшении нагрузки по азоту (410-445 сутки) скорость его потребления биомассой анаммокс-бактерий, а соответственно и количество образованного газа уменьшались (рис. 11, рис. 13). При последующем увеличении концентрации азотных субстратов скорость потребления повышалась без фазы задержки.

К 500-м суткам эксперимента нагрузка по азоту составила 3750 мг И/л в сутки при эффективности удаления более 90%, причем такая величина нагрузки реактора по азоту сравнима с лучшими мировыми достижениями для лабораторных реакторов. Биомасса в реакторе приобрела красноватую окраску, хорошо просматривались обрастания на волокнах ершей в виде скопления колоний красного цвета.

На основании данных о скорости потребления аммонийного азота за период от 262 до 415 суток культивирования (рис. 11) было определено время удвоения анаммокс-бактерий в проточном реакторе, которое составило около 1 месяца.

Таблица 3. Увеличение нагрузки по азоту в проточном реакторе.

Сутки N-N02, мг/л N-N114, мг/л Скорость протока среды, л/сутки Нагрузка по азоту, мг/(л*сутки) Скорость образования N2, л/сутки

0-40 50 50 0.9 112.5 0.045

41-150 50 50 1 125.0 0.070

151-162 50 50 1.2 150.0 0.080

163-176 100 100 1 250.0 0.150

177-205 100 100 2 500.0 0.250

206-220 150 114 2 660.0 0.380

221-224 135 103 2 595.0 0.320

225-228 120 91 2 527.5 0,310

229-231 135 103 2 595.0 0.390

232-234 145 110 2 637.5 0.400

235-277 135 103 2 595.0 0.395

278-308 135 103 3 892.5 0.510

309-316 145 145 3 1087.5 0.720

317-327 155 155 3 1162.5 0.840

328-333 165 165 3 1237.5 0.910

334-345 165 165 3.5 1443.8 0.985

346-373 175 175 3.5 1531.3 1.050

374-380 210 200 3.5 1793.8 1.155

381-409 225 250 3.5 2078.1 1.190

410-445 45 45 3.5 393.8 0.490

446-545 225 225 4.5 2531.3 1.485

545-по н.в. 250 250 6 3750.0 2.220

а)

б)

2,5 ■ 2,0

1,5 ■

1,32 1,0

0,5 ■ 0,0 ■

00 -40 • 20 - ' 0

500 Сутки

О 100 200 300 400 500 0 100 200 300 400

■ - - ■ М02-Мудаленный/14Н4-Мудаленный СУ™ ■ ■ • ■ Средняя эффективность

Рис. 12. Соотношение потребленного нитритного и аммонийного азота (а), а также эффективность удаления азота (б) при проточном культивировании.

Рис. 13. Скорость расчетного и наблюдаемого образования молекулярно го азота в проточном реакторе. Примечание: падение скорости

образования N2 в период с 410-х по 445-е сутки обусловлено уменьшением нагрузки по азоту.

-Теоретически ожидаемое образование N2 Фактическое образование N2

2.3.2. Изменение концентрации азотных субстратов и рН в проточном реакторе по высоте колонки. Для понимания процесса распределения концентраций азотных субстратов и кислотности по высоте колонки были проведены соответствующие измерения до и после подачи свежей среды насосом в реактор (табл. 4).

Показано, что концентрация нитритного и аммонийного азота в верхней части колонки даже в момент подачи среды не превышала 30 -40 мг/л, что в 3 -4 раза меньше, чем в нижней части. Это указывает на то, что по высоте реактора создаются элективные условия для развития анаммокс-бактерий с разными потребностями к концентрации субстратов в среде. В проточном реакторе с увеличением скорости использования азота, а следовательно и скорости роста анаммокс-бактерий, наблюдалось увеличение рН в реакторе, причем увеличение рН было особенно заметно с увеличением скорости потребления азота от 0 до 400-500 мг Ы/л в сутки (рис. 14). Реакция среды, подаваемой в реактор близка к

нейтральной. В верхней части и на выходе из реактора величина pH была около

8.5. При этом на волокнах ершей

х о.

9,5

9 -8,5 -8 7,5 7

500 1000 1500 мг Ы/(л*сутки)

наблюдалось анаммокс-бактерий.

развитие

2000 2500

Рис. 14. Повышение рН среды в реакторе при увеличении скорости удаления азота.

Возможно, в частях реактора, где различаются условия по концентрации субстратов и рН, развиваются разные штаммы или виды анаммокс-бактерий

Таблица 4. Показания рН и концентраций нитритного и аммонийного азота по высоте колонки непосредственно после (1) и перед (2) подачей очередной порции исходной среды.

Анализируемая проба рн N-N02, мг/л N-NH4, мг/л

1 2 1 2 1 2

Исходная среда 7,75 7.79 110,18 108,6 93,10 92.19

Низ колонки 7,98 8.18 81,17 46.25 59,90 17.42

Середина колонки 8,14 8.48 43,22 17.65 38,81 0

Верх колонки 8,27 8.50 33,9 14.82 24,89 0

2.3.3. Идентификация анаммокс-бактерий. В пробах активной биомассы, взятых из нижней части проточного реактора после 9 месяцев культивирования, с помощью зонда Ашх368 были обнаружены скопления красноватых колоний, характерных для анаммокс-бактерий, которые представляли значительную часть активной микробной популяции (рис. 15). При этом в осадке в нижней части реактора анаммокс-бактерии развивались в виде шарообразных микроколоний, окруженных плотной оболочкой, а на поверхности нитей ершей в виде сплошных биопленок с неровной поверхностью.

Электронно-микроскопический анализ ультратонких срезов показал, что анаммокс-бактерии в условиях проточного реактора существуют в виде микроколоний, окруженных плотной оболочкой, и погружены в гликокаликс (рис. 16а). Строение их клеток типично для анаммокс-бактерий: большую часть клетки занимает анаммоксосома, которая ограничена 2-мя клеточными мембранами (рис. 166).

В результате амплификации фрагментов генов и клонирования продуктов амплификации образца биомассы красноватого цвета, взятого из нижней части проточного реактора после 21 месяца его работы, было получено и проанализировано 89 клонов с последовательностями, полученными в результате ПЦР с праймером Pia 46F (две библиотеки), и 46 клонов - с праймером 11F. Из клонов, полученных в результате ПЦР с праймером Pia 46F, 31 клон имели 93% сходство с последовательностями некультивируемых

бактерий, родственных Chloroflexi, 7 клонов имели 82% сходство с некультивируемыми планктомицетами, 48 клонов имели 95% сходство с Candidatus Jettenia asiaíica и 2 оставшихся клона имели 94% сходство с Candidatus Brocadia fulgida (рис. 17). Клоны, имеющие последовательности, полученные с помощью праймера 11F, не имели сходства с последовательностями анаммокс-бактерий.

И Б в

■■■ J FZZJ:^- : ■ '■'Vil МкЖШ^ШШШ!............. fll 11:1 ¡11111 P;í; Е

Рис. 15. Микрофотография анаммокс-бактерий в образцах осадка (А, Б, В) и биопленки (Г, Д, Е), взятых из нижней части проточного реактора после 9 месяцев культивирования: А, Г -фазовый контраст; Б, Д - гибридизация с зондом Атх368; В, Е - окраска ДАФИ.

Рис. 16. Ультратонкий срез микроколонии анаммокс-бактерий (а) и строение клетки анаммокс-бактерии (б) из проточного реактора. 1 - анаммоксосома, 2 - рибоплазма, 3 -парифоплазма.

ОСБ

ICO

36 50

за

клоны анаиыокс-блктерин '■'КОС

■ Candidatos Jettenia asiática (DQ301513>

МЩ uncuttured Ptonctomycetes

Рис. 17. Филогенетическое положение сходства по данным сиквенса 16S рРНК анаммокс-бактерий из проточного реактора.

Эти результаты с большой вероятностью позволяют

предположить, что в проточном реакторе, инокулированном исходно микробной

популяцией из станции очистки сточных вод ЭКОС №6, расположенной в долине реки Мзымта в поселке строителей олимпийского объекта РЖД, присутствует новый вид анаммокс-бактерий (рабочее название «ecos»). Более того, не исключено, что благодаря градиенту рН и концентраций азотных субстратов в верхней части колонки могла накопиться биомасса другого нового вида анаммокс-бактерий. Эти предварительные результаты открывают перспективу дальнейших исследований.

— Candidatos Anammoxojjlobus propionicus (D0317601) ' Candidatos Brocadia anammoxidans (AF375994)

£(Ш_г_0-ti Candidatos Biocadia fulgida (DQ4599I9) ~ R45J_045

-Candidatos Kuenenia stottgartiensis (AF3759t>5>

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью биотехнологических, микробиологических, молекулярных и электронно-микроскопических методов проведено исследование анаэробных процессов (метаногенез и анаммокс), протекающих в системах аэробной очистки бытовых сточных вод с иммобилизацией биомассы активного ила.

Показано, что даже в биопленках, развивающихся в условиях активной аэрации, анаэробные микроорганизмы могут составлять значительную часть прикрепленных микроорганизмов. Вследствие увеличения роли анаэробных микроорганизмов, образующих гораздо меньше микробной биомассы по сравнению с аэробными микроорганизмами, наблюдается существенное уменьшение продукции избыточного ила на станциях аэробной очистки сточных вод с иммобилизацией микробной биомассы. Во взвешенном и в иммобилизованном иле присутствуют все ключевые группы анаэробных микроорганизмов, способных разлагать продукты кислотного брожения -важных предшественников метана. В активном иле функционирует полный метановый цикл: метан может одновременно образовываться в анаэробной зоне биопленки и окисляться во внешнем аэробном слое, а также свободноплавающим илом.

Показано, что удаление азота в системах аэробной очистки бытовых сточных вод с иммобилизацией микроорганизмов происходит в сопряженных процессах нитрификации, денитрификации и анаэробного окисления аммония (анаммокс). При культивировании свежих проб прикрепленного ила в селективной для анаммокс-бактерий среде наблюдается удаление аммонийного азота, что свидетельствует о возможности протекания анаммокс-процесса.

Отмечено, что во взвешенном иле аэробного биореактора условия для развития анаммокс-бактерий относительно неблагоприятные. Вследствие постоянного протока и рецикла водно-иловой массы взвешенный осадок подвергается резкой смене условий среды, таких как аэрация, состав и концентрация соединений азота, окислительно-восстановительный потенциал и др. Для чрезвычайно медленно растущих микроорганизмов смена условий среды имеет отрицательное воздействие. Большая часть аммонийного азота, содержащегося в сточной воде и необходимого для функционирования анаммокс-бактерий, окисляется нитрифицирующими бактериями, которые находятся как в свободноплавающем иле, так и в поверхностных слоях биопленок прикрепленного на ершах ила. Таким образом, в активном иле аэробного биореактора удаление азота происходит преимущественно за счет процессов нитри- и денитрификации, однако даже в условиях активной аэрации в нем присутствуют анаммокс-бактерии, которые вносят определенный вклад в общее удаление азота.

Введение ряда приемов, а именно (1) физико-химической предобработки и (2) рецикла воды из аэробного биореактора в микроаэрофильный денитрификатор, в технологическую схему аэробной очистки с (3) иммобилизацией микроорганизмов позволяет существенно увеличить роль процесса анаммокс в удалении соединений азота. В ходе физико-химической предобработки коагулянтом до половины органических загрязнений изымается из очищаемой воды непосредственно перед биологической очисткой, создавая тем самым дефицит доноров электрона для гетеротрофных денитрификаторов, а следовательно экологическую нишу для развития автотрофных анаммокс-бактерий. Окисленные формы азота, благодаря рециклу очищаемой воды из аэробного биореактора в денитрификатор, выделенного в отдельный блок с микроаэрофильным режимом, удаляются в сопряженных процессах денитрификации и анаммокс (деамокс), причем вклад последнего может составлять до трети от общего удаленного азота. Регулярное исследование проб прикрепленного активного ила в течение года эксплуатации станции очистки сточных вод №3 показало увеличение активности анаммокс-процесса in situ. Показано, что процесс удаления азота за счет анаммокс-процесса протекал в интервале начального рН от 6 до 9 с оптимумом при рН от 7 до 8, а также в интервале температур от 10 до 40°С с широким оптимумом при 25-35°С. На основании данных о скорости потребления аммонийного азота было измерено время удвоения анаммокс-бактерий в проточном реакторе, которое составило около месяца. Невысокая скорость роста анаммокс-бактерий указывает на необходимость повышения нагрузки по азоту путем увеличения скорости протока. Методом проточного культивирования получена биомасса, значительную часть активной микробной популяции которой представляли анаммокс-бактерии, что было подтверждено in situ гибридизацией со специфичным зондом Атх368.

Обнаружение функционирования процесса анаммокс в биопленках активного иммобилизованного ила позволило существенно оптимизировать процесс очистки воды и повысить эффективность удаления азота, за счет

развития анаммокс-бактерий, которые являются наиболее медленно растущими бактериями из известных на сегодняшний день. Это достигнуто, в первую очередь, путем изменения режима аэрации в биореакторах. В денитрификаторе она снижена до интенсивности, необходимой для слабого перемешивания, предотвращающего образование осадка и обеспечивающего контакт иммобилизованного активного ила с очищаемой водой. В аэротенке аэрация снижена до уровня, обеспечивающего преимущественное образование нитрита, являющегося субстратом роста и для анаммокс-бактерий, и для денитрификаторов. При этом была достигнута экономия за счет уменьшения расхода энергии на перемешивание и подачу воздуха. Для поддержания оптимальной слабощелочной среды в денитрификаторе и обеспечения анаммокс-бактерий источником углерода применено добавление небольших количеств бикарбоната.

Получен патент на комплектно-блочную модульную очистную установку с эффективным удалением азота с помощью иммобилизованного аэробно-анаэробного микробного сообщества, включающего анаммокс-бактерии.

В настоящее время продолжается работа по совершенствованию технологии, повышению скорости процесса очистки и накопления биомассы анаммокс-бактерий. В лабораторном анаэробном проточном гибридном реакторе путем постепенного увеличения нагрузки по азоту, достигнуты высокая плотность анаммокс-бактерий и скорость образования молекулярного азота, соответствующая самым высоким достижениям зарубежных исследователей. Разрабатываются методика и рекомендации для практического применения процесса анаммокс для очистки концентрированных стоков с высоким содержанием азотных загрязнений.

Результаты предварительной идентификации анаммокс-бактерий из станций очистки сточных вод ЭКОС, расположенных в долине реки Мзымта в Сочинском регионе указывают на обнаружение нового вида или видов анаммокс-бактерий и открывают перспективу продолжения фундаментальных исследований анаммокс-бактерий.

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований активного ила из станций аэробной очистки сточных вод в Красной Поляне и аэробно-анаэробной очистки сточных вод в двух КОС ЭКОС подтверждена высокая активность микробного ила, иммобилизованного на нитях ершового носителя.

2. В активном прикрепленном иле из обоих типов станций очистки сточных вод показано присутствие аэробных и анаэробных микроорганизмов и обнаружено функционирование метаногенного микробного сообщества, которое осуществляет полную анаэробную деградацию органических соединений до метана и углекислоты.

3. В прикрепленном на ершовом носителе иле происходит одновременное образование и окисление метана. Метан может образовываться в анаэробной

зоне биопленки и окисляться во внешнем аэробном слое, а также свободноплавающим илом.

4. Высокое содержание анаэробных микроорганизмов в активном иле обуславливает низкий прирост микробной биомассы и свидетельствует о наличии в биопленках на ершовом носителе анаэробных микро-зон с низким окислительно-восстановительным потенциалом среды, благоприятным для развития анаммокс-бактерий.

5. Показано, что в процессе БХ-ДЕАМОКС (технология компании «ЭКОС») удаление азота в виде N2 происходит за счет двух анаэробных процессов - денитрификации и анаммокс, функционирование которых показано методами лабораторного культивирования. То есть, получены доказательства наличия процесса анаммокс при очистке бытовых сточных вод в полномасштабных станциях очистки с применением комбинированной системы с физико-химической предобработкой и биологической очистки

6. В результате исследования процесса анаммокс в периодических и проточном реакторах накоплена активная микробная биомасса, обогащенная анаммокс-бактериями, потребляющая азотные субстраты в соотношении N-N02/N-NH4 близким к 1.3, что соответствует процессу анаммокс; достигнута нагрузка по азоту в 3750 мг N/л в сутки с эффективностью удаления около 95%.

7. На основе способности окислять аммоний нитритом и молекулярными методами in situ-гибридизации (FISH) и амплификации фрагментов генов с последующим клонированием продуктов амплификации в биомассе накопительных реакторов обнаружены бактерии, относящиеся к филогенетической группе анаммокс-планктомицетов, с большой вероятностью принадлежащие к новому виду анаммокс-бактерий.

8. Впервые показано, что осуществление процесса анаммокс при низком содержании органических веществ в очищаемой воде обеспечивает эффективное удаление азота и обеспечивает глубокую очистку воды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ножевникова А.Н., Симанькова М.В., Jlummu Ю.В. Использование микробного процесса анаэробного окисления аммония (анаммокс) для биотехнологической очистки стоков II Биотехнология. 2011. № 5. С. 8-31.

2. Ножевникова А.Н., Jlummu Ю.В.. Некрасова В.К., Куличевская И.С., Григорьева Н.В. Обнаружение и характеристика анаэробного окисления аммония (АНАММОКС) в иммобилизованном активном микробном иле локальных станций очистки сточных вод // Микробиология. 2012. Т 81. № 1. С. 28-38.

3. Jlummu Ю.В.. Некрасова В.К., Куликов H.H., Ножевникова А.Н. Образование и окисление метана в иммобилизованном иле в системе очистки сточных вод с активной аэрацией // Микробиология. — 2013. — Т. — в печати.

4. Куликов Н.И., Гвоздяк H.H., Зубов М.Г., Ножевникова А.Н., Jlummu Ю.В. Комплектно-блочная модульная очистная установка заводского изготовления // Патент РФ 94568, U1. 2010.

5. Jlummu Ю.В.. Ножевникова А.Н., Зубов М.Г, Куликов Н.И. Очистка бытовых сточных вод с низкой концентрацией загрязнений с реализацией процесса анаммокс //

Материалы конференции «Энергосбережение и энергоэффективность на предприятиях водопроводно-канализационного хозяйства», 6-7 июня 2012 г., Москва. АКВАТЭК.

6. JIummu Ю.В.. Некрасова В.К., Симанькова М.В., Ножевникова А.Н. Обнаружение метанового цикла в системе аэробной очистки воды с прикрепленным активным илом // Сборник тезисов V Молодежной школы-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии", 26-27 октября 2009 г., Москва, стр. 38.

7. Nozhevnikova A., Litti Yu.. Nekrasova V., Kulikov N.. Simankova M. Methane production and oxidation in immobilized active sludge from aerobic wastewater treatment installation // Book of abstracts III International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld2009), 2-4 December 2009, Lisbon (Portugal), p. 83.

8. JIummu Ю.В.. Некрасова B.K., Григорьева H.B., Куличевская И.С., Ножевникова

A.Н. Обнаружение процесса Анаммокс в иммобилизованном активном иле из очистных станций, работающих по технологии компании ЭКОС // Сборник тезисов 6-ой Молодежной школы-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии", 25-27 октября 2010 г., Москва, стр. 113.

9. JIummu Ю.В.. Некрасова В.К., Куличевская И.С., Ножевникова А.Н. Исследование роли анаэробных микробных процессов при аэробной очистке сточных вод в биореакторах с иммобилизацией активного ила // Материалы VI Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", часть 2, 21-25 марта 2011 г., Москва, стр. 45-46.

10. Ножевникова А.Н., JIummu Ю.В.. Некрасова В.К, Куличевская И.С. «Микробиологическая характеристика сообществ микроорганизмов в биореакторах многоиловой системы. Совместные исследования по использованию бактерий «Анаммокс» в системе доочистки сточных вод на локальных КОС р-на Адлер-Красная поляна» // Тезисы конференции «Инновационные технологии и оборудование для очистки сточных вод и обработки осадка», Сочи, 19-23 октября 2010 г, стр. 5.

11. Ножевникова А.Н., JIummu Ю.В.. Некрасова В. К., Куличевская И.С. Анаэробные микробные процессы в аэробных системах очистки с иммобилизованным активным илом // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием. АВТОТРОФНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ. К 85-летию со дня рождения академика РАН Е.Н.Кондратьевой.МГУ им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет 23-26 декабря 2010 г. Москва, МАКС Пресс 2010, стр. 75

12. Ножевникова А.Н., Каллистова А.Ю.. JIummu Ю.В.. Некрасова В.К. Формирование специфических микробных сообществ в антропогенных экосистемах (на примерах полигонов ТБО и систем очистки сточных вод) // Международная конференция «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» Улан-Удэ (Россия) - Улаанбаатар (Монголия), 5-16 сентября 2011 г., стр. 140-141.

13. Nozhevnikova A., Litti Yu.. Nekrasova V., Kulitchevskaya I. Anaerobic processes (Methanogenesis and Anammox) in aerobic wastewater treatment installations with immobilized microorganisms // BIT'S 1st World Congress of Environmental Biotechnology - 2011, October 1922,2011, p. 87.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н., Ножевниковой А.Н. за всестороннюю поддержку при выполнении диссертации, Некрасовой

B.К. за неоценимую помощь при планировании и выполнении работы, к.б.н. Куличевской И.С. и д.б.н. Кузнецову Б.Б. за помощь в проведении молекулярно-биологических исследований, к.б.н. Григорьевой Н.В. за помощь в проведении химических анализов, Кострикиной H.A. за помощь в проведении электронно-микроскопических исследований, а также всем сотрудникам лаборатории микробиологии антропогенных мест обитания ИНМИ РАН за постоянную поддержку при выполнении диссертационной работы.

Подписано в печать:

01.11.2012

Заказ № 7781 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Литти, Юрий Владимирович

1. Введение.

2. Литературный обзор.

2.1. Биологическая очистка воды.

2.2. Аэробная очистка сточных вод.

2.3. Анаэробная очистка сточных вод.

2.4. Метаногенез.

2.5. Биопленки.

2.6. Удаление азота из сточных вод в процессе анаэробного окисления аммония нитритом (анаммокс).

2.6.1. Характеристика анаммокс-бактерий.

2.6.1.1. Филогения и отличительные особенности анаммокс-бактёрий.

2.6.1.2. Биохимия процесса анаммокс.

2.6.1.3. Физиологические характеристики роста анаммокс-бактерий.

2.6.1.4. Места обитания анаммокс-бактерий.

2.6.2. Биотехнологические аспекты применения процесса анаммокс.

2.6.2.1. Посевной материал для реактора, осуществляющего процесс анаммокс.

2.6.2.2. Типы реакторов, используемые для процесса анаммокс.

2.6.2.3. Иммобилизация активной биомассы в анаммокс-реакторах.

2.6.3. Основные технологические системы удаления азота из сточных вод на основе процесса анаммокс.

2.6.3.1. Процесс с частичной нитрификацией SHARON-ANAMMOX.

2.6.3.2. Процесс CANON.

2.6.3.3. Процесс DEAMOX.

2.6.4. Применение процесса анаммокс для очистки сточных вод с высоким содержанием аммония.

2.6.4.1. Лабораторные исследования.

2.6.4.2. Примеры реализации процесса анаммокс в полномасштабных (промышленных) очистных сооружениях.

2.6.4.3. Цели и задачи работы.

3. Материалы и методы.

3.1. Объекты исследования.

3.2. Использованные среды.

3.3. Краткосрочные опыты.

3.4. Долгосрочные опыты.

3.5. Химические анализы.

3.6. Электронная микроскопия.

3.7. Молекулярно-биологические методы.

3.7.1 Анализ последовательностей генов 16S рРНК.

3.7.1.1. Выделение ДНК.

3.7.1.2. Амплификация фрагментов генов.

3.7.1.3. Клонирование.

3.7.2. Флюоресцентная гибридизация in situ (анализ FISH).

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Образование и окисление метана, и образование молекулярного азота в системах очистки сточных вод с интенсивной аэрацией.

4.1.1. Морфологическое разнообразие микроорганизмов на ершовых обрастаниях.

4.1.2. Относительная численность аэробных и анаэробных микроорганизмов в прикрепленном активном иле.

4.1.3. Анаэробная деградация органических веществ с образованием метана во взвешенном и прикрепленном активном иле.

4.1.3.1. Деградация органических веществ активного ила с образованием метана без добавления субстрата.

4.1.3.2. Деградация летучих жирных кислот (ЛЖК).

4.1.4. Окисление метана в микробных биопленках и во взвешенном иле.

4.1.5. Удаление азота микробной популяцией иммобилизованного активного ила.

4.2. Удаление азота в результате процессов денитрификации и анаммокс в системе очистки сточных вод с физико-химической предочисткой и микроаэрофильными условиями на первой ступени биологической очистки.

4.2.1. Процессы денитрификации и анаммокс в стационарных накопительных реакторах.

4.2.1.1. Прикрепленные илы из денитрификаторов 1-ой и 2-ой ступени

Д-1 и Д- 2) станции №6.

4.2.1.2. Активный ил станции №3.

4.2.2. Исследование влияния факторов внешней среды на скорость удаления азота.

4.2.2.1. Влияние температуры на скорость удаления азота.

4.2.2.2. Влияние начальной кислотности среды на скорость процесса анаммокс.

4.2.3. Исследование процессов образования молекулярного азота и накопления анаммокс-бактерий в проточном гибридном реакторе.

4.2.3.1. Влияние нагрузки по азоту и увеличения скорости протока на скорость процесса анаммокс и на рост анаммокс-бактерий.

4.2.3.2. Изменение концентрации азотных субстратов и рН в проточном реакторе по высоте колонки.

4.2.4. Идентификация анаммокс-бактерий иммобилизованного активного ила из лабораторного проточного гибридного биореактора.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анаэробное окисление аммония и метаногенез в системах аэробной очистки сточных вод с иммобилизацией микроорганизмов"

Проблема чистой воды является одной из актуальнейших проблем современности. Стремительный рост населения Земли, развитие промышленности и сельского хозяйства, которые помимо полезной продукции производят большое количество различных отходов и сточных вод, приводит к нарушению экологического равновесия и загрязнению водоемов и грунтовых вод, являющихся источниками питьевой воды. Глобальная проблема питьевой воды неразрывно связана с проблемой качественной очистки сточных вод и предотвращения загрязнения источников чистой пресной воды. Наибольший интерес и перспективу имеют естественные и самые дешевые методы биологической очистки, представляющие собой интенсификацию природных процессов разложения органических соединений микроорганизмами в аэробных или анаэробных условиях, или в их комбинации.

Производство сточных вод в России достигает в настоящее время 500 литров в сутки на душу городского населения. В крупнотоннажной централизованной очистке сточных вод населенных пунктов с концентрацией загрязнений обычно не превышающей 250 - 350 мг/л осуществляется аэробная очистка с применением процесса активированного ила. Несмотря на такие положительные стороны, как высокая скорость очистки, использование веществ в низких концентрациях и относительная простота технологического процесса, этот метод имеет и ряд существенных недостатков, а именно высокие энергозатраты на аэрацию и проблемы, связанные с обработкой и утилизацией больших количеств избыточного ила (Ножевникова, 2004). Не менее серьезная проблема состоит в удалении биогенных элементов, особенно соединений азота, т.к. большинство очистных сооружений изначально не проектировалось в расчете на их очистку (Jetten et al., 2002). В нашей стране это было связано, прежде всего, с тем, что нормативная база для проектирования очистных сооружений (СНиП 2.04.03-85 и др.) не принимала в расчёт необходимость столь глубокого удаления из очищенных сточных вод биогенных элементов. Поэтому на сооружениях полной биологической очистки сточных вод, не рассчитанных на глубокое удаление соединений азота, содержащийся в очищаемой воде, а также в возвратных потоках аммонийный азот, по сути, поступает в водные объекты (Николаев и др., 2008). Так, например, в Москве-реке в зонах сброса очищенных сточных вод среднегодовая концентрация аммонийного азота местами превышает ПДК в 2, а то и в 16 раз (Сараев, 2007).

Проблема удаления биогенных элементов, а в частности соединений азота, является одной из главных задач при очистке сточных вод. Сброс недостаточно очищенных от соединений азота хозяйственно-бытовых и промышленных сточных вод вызывает в водоемах массовое развитие планктона, водорослей, нарушение кислородного режима и нормальной жизнедеятельности обитателей водной среды. Присутствие аммиака в водоеме оказывает сильное токсическое влияние на рыб, наличие нитритов в питьевой воде при заборе воды из загрязненных поверхностных и подземных водных объектов вызывает онкологические заболевания, нитратов — метгемоглобинемию у детей.

В хозяйственно-бытовых сточных водах концентрация общего азота составляет от 50 до 60 мг/л, а в некоторых промышленных сточных водах может превышать 1000 мг/л (Van Huile et al., 2010). Помимо основного потока сточных вод, поступающих на очистные сооружения, внутри них существуют также и возвратные потоки - сливные или промывные воды от процессов обработки осадка сточных вод, промывки фильтров и т. д. Данные потоки до 30% увеличивают нагрузку по аммонийному азоту, что имеет следствием увеличение количества аммония, попадаемого в водные объекты (Алексеев и др., 2008). Традиционно азотсодержащие соединения удаляются методом биологической нитри-денитрификации, однако он достаточно дорог, так как требует значительных затрат на аэрацию и добавление источника органических веществ, необходимых для роста денитрификаторов (Dapena-Mora et al., 2004; Николаев и др., 2008).

В конце прошлого века с промышленных очистных сооружений (Schmid et al., 2000; Fujii et al., 2002; Toh et al., 2002; Pynaert et al., 2003; Trimmer et al., 2003) и установок по обработке фильтратов полигонов твердых бытовых отходов (Schmid et al., 2000; Egli et al., 2001) начали поступать сообщения о потерях соединений азота, которые нельзя было объяснить в рамках традиционной нитри-денитрификации. Причиной этого явления могла стать реализация реакции анаммокс - анаэробного окисления аммония нитритом, теоретически предсказанного в конце 70-х годов прошлого века (Broda, 1977) и экспериментально доказанного в середине 90-х (Mulder et al., 1995; van de Graaf et al., 1995):

NH4+ + N02" -» N2 + 2H20 (1.1)

В наши дни анаммокс-процесс считается наиболее перспективным, экономически выгодным и эффективным способом удаления аммония из сточных вод, т.к. позволяет исключить стадию денитрификации и значительно уменьшить стоимость аэробной нитрификации (Jetten et al., 2002; Schmidt et al., 2003; Egli et al., 2003; Zhang et al., 2008; Kartal et al., 2010). Для роста анаммокс-бактерий, в отличие от денитрифицирующих микроорганизмов, не требуется добавления органического углерода (Jetten et al., 2001). Поэтому технологии с применением анаммокс-процесса, такие как SHARON, CANON и др., используются в основном для очистки сточных вод, содержащих высокие концентрации азота и низкие - органических веществ (Van Huile et al., 2010), так как уже при соотношении в сточной воде БПК5/азот ниже 6 применение технологии нитри-денитрификации не представляется возможным (Николаев и др., 2009). Таким параметрам соответствуют возвратные воды метантенков, сточные воды ТБО, свиноводческих ферм, и ряда производств (Van Huile et al., 2010). Являясь крайне востребованным при очистке высококонцентрированных сточных вод, применению процесса анаммокс при очистке сточных вод с низкими концентрациями азотных загрязнений ранее не уделялось должного внимания. Однако, по мере развития новых перспективных технологий очистки, анаммокс-процесс мог бы вносить более значимый вклад в удаление азота при очистке сточных вод с низкими концентрациями азотных загрязнений, состав которых отличается от оптимальных для развития сообщества анаммокс-бактерий. Это привело бы к увеличению эффективности очистки, а также уменьшению затрат на аэрацию и добавление источника органического вещества, необходимого для роста денитрификаторов (Dapena-Mora et al., 2004а; Николаев и др., 2008). Отсюда исследование процесса анаммокс приобретает новый аспект.

В настоящее время большое внимание уделяется разработке и развитию новых, а также усовершенствованию существующих методов биологической очистки сточных вод, в том числе хозяйственно-бытовых сточных вод, характеризующихся низкими концентрациями загрязнений. Среди них использование анаэробных и аэробных процессов в одном (Irwine et al., 1989; Subbaramaiah et al., 2010) или разных биореакторах (Goncalves et al., 1999; Garuti et al., 1992), применение рецикла очищаемой воды, изменение режима аэрации и др. для более полного удаления биогенных элементов (Мишуков, 2004), а также применение иммобилизации микроорганизмов активного ила на различных носителях (Yan and Tay, 1997; Zita and Hermansson, 1997; Сироткин и др., 2007). Иммобилизация микроорганизмов на твердом носителе вследствие развития биопленок позволяет значительно увеличить плотность и биоразнообразие активных микроорганизмов в очистных сооружениях, благодаря чему увеличивается скорость и глубина очистки воды. Увеличение продолжительности пребывания микроорганизмов, в силу их прикрепленного состояния, в реакционной среде имеет немаловажное значение с учетом затрат на утилизацию больших количеств биомассы активного ила. В системах аэробной очистки с прикрепленными микроорганизмами устанавливается равновесие между процессами прироста биопленки и ее вымывания, в связи с чем отпадает необходимость в рециркуляции биомассы, принципиально необходимой при очистке сточных вод в традиционных аэротенках, работающих на дисперсной биомассе (Сироткин и др., 2007).

Перечисленные выше основные преимущества систем аэробной очистки с иммобилизацией микроорганизмов активного ила, перед традиционными аэротенками с дисперсной биомассой, в большой степени связаны с важной особенностью строения биопленки - образованию анаэробного слоя вследствие ограниченного доступа кислорода в ее внутренние зоны (Tay et al., 2002; Yu et al., 2002; Плакунов и Николаев, 2008). Даже в условиях активной аэрации во внутренних слоях биопленок возникают анаэробные микрозоны, где могут осуществляться анаэробные микробные процессы, в частности денитрификация (Henze et al., 2008). До настоящего времени до конца не раскрыты процессы, протекающие в анаэробных слоях биоплёнки, а также их влияние на эффективность функционирования сооружений аэробной очистки сточных вод. Исследование метаногенеза, а также анаммокс-процесса наряду с денитрификацией - анаэробных процессов, участвующих в удалении основных загрязняющих веществ хозяйственно-бытовых сточных вод, а именно соединений углерода и азота, представляет большой интерес для биотехнологии аэробной очистки сточных вод с участием иммобилизованных биоценозов. Результаты этих исследований имеют важное практическое значение при проектировании новых и реконструировании существующих очистных станций, в частности, для уменьшения образования избыточного ила, а также упрощения и удешевления процесса удаления биогенного азота.

Целью работы было исследовать анаэробные процессы образования метана и молекулярного азота в биопленках иммобилизованного активного ила в системах аэробной очистки сточных вод, получить доказательства осуществления процесса анаэробного окисления аммония нитритом и развития анаммокс-бактерий в полномасштабных сооружениях и разработать предложения по оптимизации процессов удаления азота.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Литти, Юрий Владимирович

6. выводы

3. В прикрепленном на ершовом носителе иле происходит одновременное образование и окисление метана. Метан может образовываться в анаэробной зоне биопленки и окисляться во внешнем аэробном слое, а также свободноплавающим илом.

5. Показано, что в процессе БХ-ДЕАМОКС (технология компании «ЭКОС») удаление азота в виде N2 происходит за счет двух анаэробных процессов -денитрификации и анаммокс, функционирование которых показано методами лабораторного культивирования. То есть, получены доказательства наличия процесса анаммокс при очистке бытовых сточных вод в полномасштабных станциях очистки с применением комбинированной системы с физико-химической предобработкой и биологической очистки.

6. В результате исследования процесса анаммокс в периодических и проточном реакторах накоплена активная микробная биомасса, обогащенная анаммокс-бактериями, потребляющая азотные субстраты в соотношении ТЧ-М02/1Ч->Щ4 близким к 1.3, что соответствует процессу анаммокс; достигнута нагрузка по азоту в 3750 мг К/л в сутки с эффективностью удаления около 95%.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показано, что даже в биопленках, развивающихся в условиях активной аэрации, анаэробные микроорганизмы могут составлять значительную часть прикрепленных микроорганизмов. Вследствие увеличения роли анаэробных микроорганизмов, образующих гораздо меньше микробной биомассы по сравнению с аэробными микроорганизмами, наблюдается существенное уменьшение продукции избыточного ила на станциях аэробной очистки сточных вод с иммобилизацией микробной биомассы. Во взвешенном и в иммобилизованном иле присутствуют все ключевые группы анаэробных микроорганизмов, способных разлагать продукты кислотного брожения - важных предшественников метана. В активном иле функционирует полный метановый цикл: метан может одновременно образовываться в анаэробной зоне биопленки и окисляться во внешнем аэробном слое, а также свободноплавающим илом.

Показано, что удаление азота в системах аэробной очистки бытовых сточных вод с иммобилизацией микроорганизмов происходит в сопряженных процессах нитрификации, денитрификации и анаэробного окисления аммония (анаммокс). При культивировании свежих проб прикрепленного ила в селективной для анаммокс-бактерий среде наблюдается удаление аммонийного азота, что свидетельствует о протекании анаммокс-процесса.

Отмечено, что во взвешенном иле аэробного биореактора условия для развития анаммокс-бактерий относительно неблагоприятные. Вследствие постоянного протока и рецикла водно-иловой массы дисперсный осадок подвергается резкой смене условий среды, таких как аэрация, состав и концентрация соединений азота, окислительно-восстановительный потенциал и др. Для чрезвычайно медленно растущих микроорганизмов смена условий среды имеет отрицательное воздействие. Большая часть аммонийного азота, содержащегося в сточной воде и необходимого для функционирования анаммокс-бактерий, окисляется нитрифицирующими бактериями, которые находятся как в свободноплавающем иле, так и в поверхностных слоях биопленок прикрепленного на ершах ила. Таким образом, в активном иле аэробного биореактора удаление азота происходит преимущественно за счет процессов нитри- и денитрификации, однако даже в условиях активной аэрации в нем присутствуют анаммокс-бактерии, которые вносят определенный вклад в общее удаление азота.

Показано, что введение ряда приемов, а именно (1) физико-химической предобработки и (2) рецикла воды из аэробного биореактора (аэротенка) в микроаэрофильный денитрификатор, в технологическую схему аэробной очистки с (3) иммобилизацией микроорганизмов на станциях очистки ЭКОС позволяет существенно увеличить роль процесса анаммокс в удалении загрязнений азота. В ходе физико-химической предобработки коагулянтом до половины органических загрязнений изымается из очищаемой воды непосредственно перед биологической очисткой, создавая тем самым дефицит доноров электрона для гетеротрофных денитрификаторов, а следовательно экологическую нишу для развития автотрофных анаммокс-бактерий. Окисленные формы азота, благодаря рециклу очищаемой воды из аэробного биореактора в денитрификатор, выделенного в отдельный блок с микроаэрофильным режимом, удаляются в сопряженных процессах денитрификации и анаммокс (деамокс), причем вклад последнего может составлять до трети от общего удаленного азота.

Показано, что процесс удаления азота за счет анаммокс-процесса протекал в интервале начального рН от 6 до 9 с оптимумом при рН от 7 до 8, а также в интервале температур от 10 до 40°С с широким оптимумом при 25-35°С. На основании данных о скорости потребления аммонийного азота было измерено время удвоения анаммокс-бактерий в проточном реакторе, которое составило около 1 месяца. Невысокая скорость роста анаммокс-бактерий указывает на необходимость повышения нагрузки по азоту путем увеличения скорости протока. Методом проточного культивирования получена биомасса, значительную часть активной микробной популяции которой представляли анаммокс-бактерии, что было подтверждено in situ гибридизацией со специфичным зондом Ашх368.

Результаты исследований, проводимых с лабораторными стационарными и проточным реактором, использовались для выработки рекомендаций по оптимизации работы станций очистки сточных вод ЭКОС. В частности, было рекомендовано:

1. Для обеспечения роста и накопления анаммокс-бактерий следует увеличить концентрацию нитрита и уменьшить концентрацию нитрата, поступающих в денитрификатор. Для процесса денитрификации нитрит также является предпочтительным субстратом. Для этого следует несколько уменьшить интенсивность аэрации в аэротенке и снизить до минимума, необходимого для предотвращения образования осадка, аэрацию в денитрификаторе. Это приводит также к экономии энергии на аэрацию.

2. Для обеспечения оптимальных условий роста анаммокс-бактерий и денитрифицирующих бактерий следует избегать избыточного добавления бикарбоната, которое может приводить к подщелачиванию среды выше величины рН 8.0, т.к. при рН выше 8.5 активность анаммокс-бактерий снижается.

3. Для удержания в реакторе медленно растущих анаммокс-бактерий и других членов микробного сообщества биопленок следует избегать промывки ершей или проводить ее в максимально щадящем режиме, чтобы не повреждать внутреннюю структуру биопленок.

4. При пуске новых очистных установок модули очистки следует частично инокулировать ершовыми наполнителями из действующих установок с уже сформировавшимся устойчивыми микробными сообществами, этим можно существенно уменьшить время запуска.

В результате на станциях ЭКОС были уменьшены интенсивность аэрации и подача бикарбоната, что привело к стабилизации процесса очистки и снижению затрат на аэрацию. Мониторинг биомассы прикрепленного ила в течение двух лет эксплуатации станции очистки сточных вод ЭКОС показал увеличение активности анаммокс-процесса in situ.

Таким образом, удаление азота на станциях ЭКОС происходит в результате процессов нитрификации, денитрификации и анаммокс, то есть практически осуществляется процесс деамокс, и разработанная технология названа БХ-ДЕАМОКС (Ножевникова и др., 2011). Полученные в данной работе результаты имеют важное практическое значение при проектировании новых и реконструкции существующих очистных станций, в частности, для уменьшения образования избыточного ила, а также упрощения и удешевления процесса удаления азотных загрязнений. Разработаны предложения по оптимизации процессов удаления азота в технологии очистки низкоконцентрированных сточных вод. Обнаружение функционирования процесса анаммокс в биопленках активного иммобилизованного ила позволило существенно оптимизировать процесс очистки воды и повысить эффективность удаления азота, за счет развития анаммокс-бактерий, которые являются наиболее медленно растущими бактериями из известных на сегодняшний день. Это достигнуто, в первую очередь, путем изменения режима аэрации в биореакторах. В денитрификаторе она снижена до интенсивности, необходимой для слабого перемешивания, предотвращающего образование осадка и обеспечивающего контакт иммобилизованного активного ила с очищаемой водой. В аэротенке аэрация снижена до уровня, обеспечивающего преимущественное образование нитрита, являющегося субстратом роста и для анаммокс-бактерий, и для денитрификаторов. При этом была достигнута экономия за счет уменьшения расхода энергии на подачу и воздуха и перемешивание. Для поддержания оптимальной слабощелочной среды в денитирификаторе и обеспечение анаммокс-бактерий источником углерода применено добавление небольших количеств бикарбоната.

Получен патент на способ биологической очистки сточных вод с эффективным удалением азота с помощью иммобилизованного аэробно-анаэробного микробного сообщества, включающего анаммокс-бактерии.

В настоящее время продолжается работа по повышению скорости процесса очистки и накоплению биомассы анаммокс-бактерий. В лабораторном анаэробном проточном гибридном реакторе путем постепенного увеличения нагрузки по азоту достигнуты высокая плотность анаммокс-бактерий и скорость образования молекулярного азота, соответствующая самым высоким достижениям зарубежных исследователей. Разрабатываются методика и рекомендации для практического применения процесса анаммокс для очистки концентрированных стоков с высоким содержанием азотных загрязнений

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Литти, Юрий Владимирович, Москва

1. Анюшева М.Г., Калюжный C.B. Анаэробное окисление аммония: микробиологические, биохимические и биотехнологические аспекты // Успехи современной биологии. 2007. Т. 127(1). С. 34-43.

2. Барнас Д., Фитцджеральд П.А. Анаэробные процессы очистки сточных вод // В кн.: Экологическая биотехнология (Ред. Форстер К.Ф., Вейз Д.А. Дж.) Л.: Химия. 1990. 3789 с.

3. Голубовская Э.К. Биологические основы очистки воды // М.: Высшая школа, 1978.271 с.

4. Гудков А.Г. Биологическая очистка городских сточных вод. 2002. 127 с.

5. Данилович Д.Л., Монгайт А.И. Анаэробная очистка концентрированных сточных вод. М., 1989.41 с.

6. Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Методы выделения и культивирования метанобразующих бактерий // Теоретические и методические основы изучения анаэробных микроорганизмов. Пущино: Академия наук СССР. 1978. С. 158-163.

7. Жмур Н.С. Технологические и биохимические процессы очистки сточных вод на сооружениях с аэротенками // M.: АКВАРОС. 2003. 512 с.

8. Заварзин Г.А. Трофические связи в метаногенном сообществе // Изв. АН. СССР. Сер. Биол. 1986. Т.З. С. 341-360.

9. Заварзин Г.А. Глобальные аспекты микробиологии // Изв. АН. СССР. Сер. Биол. 1986. Т.З. С. 824-834.

10. Заварзин Г.А. Биогаз и малая энергетика // Природа. 1987. №1. С. 66-79.

11. Калюжный C.B., Пузанков А.Г., Варфоломеев С.Д. Биогаз: проблемы и решения // М.: ВИНИТИ, Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. Т.21. 1988. 178 с.

12. Калюжный C.B., Данилович Д.А., Ножевникова А.Н. Анаэробная биологическая очистка сточных вод // М.: ВИНИТИ, Итоги науки и техники, сер.

13. Биотехнология. Т.29. 1991. 187 с.

14. Калюжный С.В, Шестакова Н.М., Турова Т.П., Полтараус А.Б., Гладченко М.А., Трухина А.И., Назина Т.Н. Филогенетический анализ микробного сообщества, осуществляющего анаэробное окисление аммонийного азота // Микробиология. 2010. Т. 79. N. 2. С. 260—269.

15. Карякин М.А., Вайссер Т. От очистки сточной воды аэробным способом до получения из нее энергии // Водоочистка. 2007. №2. С. 30-32.

16. Kampaeea И.В. Современные анаэробные аппараты для очистки концентрированных сточных вод // Известия КазГАСУ. 2011. № 2 (16). С. 179184.

17. Кобызева Н.В., Гатауллин А.Г., Силищев H.H., Логинов О.И. Использование иммобилизованной микрофлоры для очистки сточных вод // Вода и экология: проблемы и решения. 2008. № 1. С. 74-79.

18. Лоренц В.И. Очистка сточных вод предприятий пищевой промышленности // Монография. Киев. «Буд1вельник». 1972. 188 с.

19. Лурье Ю.Ю. Унифицированные методы анализа вод // М.: Химия. 1971. 134 с.

20. Мишуков Б.Г. Биологическое удаление азота и фосфора из городских сточных вод // Вода и экология: проблемы и решения. 2004. № 3. С. 31-33.

21. Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Биопленка— «город микробов» или аналог многоклеточного организма? // Микробиология. №76 (2). 2007. С. 149-163.

22. Николаев Ю.А., Данилович Д.А., Мойжес О.В., Казакова Е.А., Грачев В.А. Анаэробное окисление аммония в возвратных потоках от обработки сброженного осадка (анаммокс) // Сб. статей и публикаций московского водоканала. Москва. 2008. вып.1 с. 215-230.

23. Ножевникова А.Н. Биоценоз в природе и промышленных условиях // Пущино-на-Оке, ЦБИ АН СССР, ОНТИ. 1988. С. 93-109.

24. Ножевникова А.Н., Жилина Т.Н. , Соколова Т.Г. Видовой состав метановых бактерий в сброженном навозе крупного рогатого скота // Прикл. биохим. микробиол. 1988. Т.24. вып. 4. С. 555-560.

25. Ножевникова А.Н. Рост анаэробных бактерий в метаногенных ассоциациях и смешанных культурах // Итоги науки и техники, серия Микробиология, М., ВИНИТИ, 1991, с. 129-148.

26. Ножевникова А.Н., Некрасова В.К., Лебедев B.C. Образование и окисление метана микробной популяцией иловых чеков при низких температурах // Микробиология. 1999. №68. С. 267-272.

27. Ножевникова А.Н. Биологическая обработка органических отходов. Экология микрооганизмов (под ред. А.Н. Нетрусова) — М.: Издательский центр «Академия», 2004. С. 175—195.

28. Ножевникова А.Н., Симанъкова М.В., JJummu Ю.В. Использование микробного процесса анаэробного окисления аммония (анаммокс) для биотехнологической очистки стоков // Биотехнология. 2011. № 5. С. 8-31.

29. Орлов Д.С., Гришина Л.А. Практикум по химии гумуса // Учеб. пособие, М.: Изд-во Моск. ун-та. 1981. 272 с.

30. Плакунов В.К., Николаев Ю.А. Микробные биопленки: перспективы использования при очистке сточных вод / // Вода: химия и экология. 2008. №2. С. 11 — 13.

31. Сараев В. Непокоренная клоака // Эксперт. 2007. №32. С. 62-70.

32. Сироткин A.C., Шагинурова Г.И., Ипполитов К.Г. Агрегация микроорганизмов: флокулы, биопленки, микробные гранулы (монография) // АН РТ: ФЭН, 2007. -160 с.

33. Скрябин Г.К., Кощеенко К.А. Иммобилизованные клетки микроорганизмов // Биотехнология. 1984. № 5. С. 70-77.

34. Трухина А.И., Гладченко М.А., Калюжный C.B. Оптимизация условий для Sulphide- и Organic-модификаций DEAMOX процессов // Биотехнология . 2011. №3. С. 82-87.

35. Ahn Y.H., Hwang I.S., Min K.S. ANAMMOX and partial denitritation in anaerobicnitrogen removal from piggery waste // Water Sci. Technol. 2004a. V. 49 (5-6). P. 145-153.

36. Ahn Y.H., Kim H.C. Nutrient removal and microbial granulation in an anaerobic process treating inorganic and organic nitrogenous wastewater // Water Sci. Technol. 2004b. V. 50(6). P. 207-215.

37. Ahn Y.H., Choi H.C. Autotrophic nitrogen removal from sludge liquids in upflow sludge bed reactor with external aeration // Process Biochem. 2006. V. 41(9). P. 19451950.

38. Alphenaar P.A. Anaerobic granular sludge: characterization and factors affecting its functioning // Ph.D. thesis. Wageningen Agricultural University, Wageningen, The Netherlands. 1994.

39. Amann R.I., Krumholz L., Stahl D.A. Fluorescent oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology // J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 762-770.

40. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. 1995. V. 59. P. 143-169.

41. Bhaudari B., Simlot M.M. Rapid micro-method for determination of nitrate in presence of nitrite for biochemical studies // Indian J. Exper. 1986. V. 24. P. 223-327.

42. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 1979. V. 7(6). P. 1513-1523.

43. Broda E. Two kinds of lithotrophs missing in nature // Z Allg Mikrobiol. 1977. V. 17(6). P. 491^193.

44. Carpentier B., Cerf O. Biofilms and their consequences, with particular reference tohygiene in the food industry // J. Appl. Bacteriol. 1993. V. 75. P. 499-511.

45. Castro H., Queirolo M., Quevedo M., Mivci L. Preservation methods for the storage of anaerobic sludges // Biotechnol. Lett. 2002. V. 24. P. 329-333.

46. Chamchoi N., Nitisoravut S. Anammox enrichment from different conventional sludges // Chemosphere. 2007. V. 66(11). P. 2225-2232.

47. Chan Y.J., Chong M.F., Law C.L., Hassell D.G. A review on anaerobic aerobic treatment of industrial and municipal wastewater // Chem. Engineer. Journal. 2009. V. 155. P. 1-18.

48. Chen X.L., Zheng P., Jin R.C. Biological nitrogen removal from monosodium glutamate-containing industrial wastewater with the Anaerobic Ammonium Oxidation (ANAMMOX) process // Acta Scientiae Circumstantiae. 2007. V. 27(5). P. 747-752.

49. Cho S., Takahashi Y., Fujii N., Yamada Y., Satoh H., Okabe S. Nitrogen removal performance and microbial community anlysis of an anaerobic up-flow granular bedanammox reactor // Chemosphere. 2010. V. 78(9). P. 1129-1135.

50. Ciudad G., Rutilar O., Muñoz P., Ruiz G., Chamy R., Vergara C., Jeison D. Partial nitrification of high ammonia concentration wastewater as a part of a shortcut biological nitrogen removal process // Process Biochemistry. 2005. V. 40(5). P. 17151719.

51. Connaughton S., Collins G., O'Flaherty V. Development of microbial community structure and activity in a high-rate anaerobic bioreactor at 18°C // Water Res. 2006. V. 40. P. 1009-1017.

52. Coster ton J. W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., Lappin-Scott H.M. Microbial biofilms // Annu. Rev. Microbiol. 1995. V. 49. P. 711-745.

53. Dalsgaard T., Thamdrup B. Factors controlling anaerobic ammonium oxidation with nitrite in marine sediments // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 3802-3808.

54. Dalsgaard T., Canfield D.E., Peterson J., Thamdrup B., Acuna-Gonzales J. N2 production by anammox reaction in the anoxic water column of Golfo Dulce, Costa Rica // Nature. 2003. V. 422(6932). P. 606-608.

55. Dapena-Mora A., Arrojo B., Campos J.L., Mosquera-Corral A., Méndez R. Improvement of the settling properties of Anammox sludge in an SBR // J. Chem. Technol. Biotechnol. 2004a. V.79. P. 1417-1420.

56. Dapena-Mora A., Campos J.L., Mosquera-Corral A., Jetten M.S.M., Méndez R. Stability of the ANAMMOX process in a gas-lift reactor and a SBR // J. Biotechnol. 2004b. V. 110(2). P. 159-170.

57. Dapena-Mora A., Van Hulle S. W.H., Campos J.L., Mendez R., Vanrolleghem P.A., Jetten. M. Enrichment of anammox biomass from municipal activated sludge: experimental and modelling results // J. Chem. Technol. Biotechnol. 2004c. V. 79. P. 1421-1428.

58. Dedysh S.N., Pankratov T.A., Belova S.E., Kulichevskaya I.S., Liesack W. Phylogenetic analysis and in situ identification of bacteria community composition in an acidic Sphagnum peat bog // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72 (3). P. 2110-2117.

59. Di Iaconi C., De Sanctis M., Rossetti S., Ramadori R. SBBGR technology for minimising excess sludge production in biological processes // Water Research. 2010. V. 44. P. 1825-1832.

60. Egli K., Fanzer U., Alvarez P.J.J., Siegriest H., van der Meer J.R., Zehnder A.J.B. Enrichment and characterization of anammox bacterium from a rotating biological contactor treating ammonium-reach leachate // Arch. Microbiol. 2001. V. 175. P. 198207.

61. Egli K., Longer C., Siegrist H., Zehnder A.J.B., Wagner M., van der Meer J.R. Community analysis of ammonia and nitrite oxidizers during start-up of nitritation reactors // Appl. Env. Microbiol. 2003. V. 69 (6). P. 3213-3222.

62. Engstrom P., Dalsgaard T., Hulth S., Aller C.R. Anaerobic ammonium oxidation bynitrite (anammox): implication for N2 production in coastal marine sediments // Geochim. Cosmochim. Acta. 2005. V. 69(8). P. 2057-2065.

63. Fuerst J.A. The planctomycetes: emerging models for microbial ecology, evolution and cell biology / Microbiology. 1995. V. 141. P. 1493-1506.

64. Fuerst J.A., Damste J.S., Kuenen J.G., Jetten M.S.M., Strous M. The anammoxosome: an intracytoplasmic compartment in anammox bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 2004. V. 233. P. 7-13.

65. Fujii T., Sugino H., Rouse J.D., Furukawa K. Characterization of the Microbial Community in an Anaerobic Ammonium-Oxidizing Biofilm Cultured on Non-woven Biomass Carrier // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2002. V. 94 (5). P. 412418.

66. Fux C., Boehler M., Huber P., Brunner I., Siegrist H. Biological treatment of ammonium-rich wastewater by partial nitritation and subsequent anaerobic ammonium oxidation (Anammox) in a pilot plant // J. Biotechnol. 2002. V. 99(3). P. 295-306.

67. Fux C., Marchesi V., Brunner I., Siegrist H. Anaerobic ammonium oxidation of ammonium-rich waste streams in fixed-bed reactors / // Water Sci. Technol. 2004. V. 49(11). P. 77-82.

68. Gali A., Dosta J., van Loosdrecht M.C.M., Mata-Alvarez J. Two ways to achieve an Anammox influent from real reject water treatment at lab-scale: partial SBR nitrification and SHARON process // Process Biochem. 2007. V. 42(4). P. 715-720.

69. Garuti G., Dohanyos M., Tilche A. Anaerobic-aerobic combined process for the treatment of sewage with nutrient removal: the Anammox process // Wat.Sci.Technol. 1992. V. 25(7). P. 383-394.

70. Goncalves R.F., DE Araujo V.L., BofV.B. Combining upflow anaerobic sludge blanket (UASB) reactors ans submerged aerated biofilters for secondary domestic wastewater treatment // Wat. Sci. Tech. 1999. V. 40(8). P.71-79.

71. Gong Z,, Yang F., Liu S., Bao H., Hu S., Furukawa K. Feasibility of a membrane-aerated biofilm reactor to achieve single-stage autotrophic nitrogen removal based on Anammox // Chemosphere. 2007. V. 69(5). P. 776-784.

72. Grunditz C., Dlhammar G. Development of nitrification inhibition assays using pure cultures of nitrosomonas and nitrobacter // Water Res. 2001. V. 35(2). P. 433-440.

73. Guiot S.R. Process coupling of anaerobic and aerobic biofilms for treatment ofcontaminated waste liquids // Studies in Environ. Sci. 1997. V. 66. P. 591-602.

74. Gujer W., Zehnder A.J.B. Conversion processes in anaerobic digestion // Water Sci. Tech. 1983. V. 15. P. 127-167.

75. Hahn H.H., Hoffmann E., 0degaard H. Chemical water and wastewater treatment VII // Proceedings of the 10th Gothenburg Symposium. 2002. 244 p.

76. Hao X., Heijnen J.J., van Loosdrecht M.C.M. Sensitivity analysis of a biofilm model describing a one-stage completely autotrophic nitrogen removal (CANON) process // Biotechnol. Bioeng. 2001. V. 77(3). P. 266-277.

77. Hellinga C., Schellen A.A.J.C., Mulder J. W., van Loosdrecht M.C.M., Heijnen J.J. The Sharon process: an innovative method for nitrogen removal from ammonium-rich waste water // Water Sci. Technol. 1998. V. 37(9). P. 135-142.

78. Henze M., van Loosdrecht M.C.M, Ekama G.A., Brdjanovic D. Biological Wastewater Treatment: Principles, Design and Modelling // IWA Publishing, ISBN 13: 9781843391883.2008.pp.526.

79. Hong Y.G., Li M., Cao H., Gu J.D. Residence of habitat-specific anammox bacteria in the deep-sea subsurface sediments of the South China Sea: analyses of marker gene abundance with physical chemical parameters // Microb. Ecol. 2011. V. 62 (1). P. 3647.

80. Hsia T.H., Feng Y.J., Ho C.M., Chou W.P., Tseng S.K. PVA-alginate immobilized cells for anaerobic ammonium oxidation (anammox) process // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. — 2008. — V.35. — P. 721—727.

81. Hu Z.-R., Wentzel M.C., Ekama G.A. External nitrification in biological nutrient removal activated sludge systems // Water S.A. 2000. V. 26 (2). P. 225-238.

82. Hulshoff Pol L. W. The Phenomenon of Granulation of Anaerobic Sludge // Ph.D. Thesis, Wageningen Agricultural University, The Netherlands. 1989.

83. Huser B.A., Wuhrmann K., Zehnder A.J.B. Methanothrix soehngenii gen. nov. sp. nov., a new acetotrophic non-hydrogen-oxidizing methane bacterium // Arch. Microbiol. 1982. V. 132. P. 1-9.

84. Hwang I.S., Min K.S., Choi E., Yun Z. Nitrogen removal from piggery waste using the combined SHARON and ANAMMOX process // Water Sci. Technol. 2005. V. 52(10-11). P. 487-494.

85. Irwine R.L., Ketchum L.H. Sequencing batch reactors for biological wastewater treatment // CRC Critical Reviews in Environmental Control. 1989. V. 18. P. 255-294.

86. Isaka K., Date Y., Sumino T., Yoshie S., Tsuneda S. Growth characteristic of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria in an anaerobic biological filtrated reactor // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 70 (1). P. 47-52.

87. Isaka K., Date Y., Sumino T., Tsunede S. Ammonium removal performance of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria immobilized in polyethylene glycol gel carrier//Environ. Biotech. 2007. V. 76. P. 1457-1465.

88. Jetten M.S.M., Wagner M., Fuerst J., van Loosdrecht M., Kuenen G., Strous M. Microbiology and application of the anaerobic ammonium oxidation ('ANAMMOX') process // Current Opinion in Biotechnology. 2001. V. 12. P. 283-288.

89. Jetten M.S.M., Niftrik L., Strous M., Kartal B., Keltjens J.T., Op den Camp H.J. Biochemistry and molecular biology of anammox bacteria. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 2009. V. 44. P. 65-84.

90. Jokela J., Kettunen R., Sormunen K, Rintal J. Biological nitrogen removal from municipal landfill leachate: low cost nitrification in biofilters and laboratory scale in-situ denitrification // Water Research. 2002. V. 36. P. 4079-4087.

91. Kalyuzhnyi S. V., Gladchenko M.A., Sklyar V.I., Kurakova O. V., Shcherbakov S.S. The UASB Treatment of Winery Wastewater under Submesophilic and Psychrophilic Conditions // Environ. Tech. 2000. V. 21. P. 919-925.

92. Kalyuzhnyi S., Gladchenko M. Sequenced anaerobic-aerobic treatment of high strength, strong nitrogenous landfill leachates // Wat. Sci. Technol. 2004. V. 49(5-6). P. 301-312.

93. Kalyuzhnyi S., Gladchenko M., Mulder A., Versprille B. DEAMOX new biological nitrogen removal process based on anaerobic ammonia oxidation coupled to sulphide driven conversion of nitrate into nitrite // Wat. Res. 2006a. V. 40 (19). P. 3637-3645.

94. Kalyuzhnyi S., Gladchenko M., Mulder A., Versprille B. New anaerobic process of nitrogen removal // Wat. Sci. Technol. 2006b. V. 54(8). P. 163-170.

95. Kalyuzhnyi S., Gladchenko M., Kang Ho, Mulder A., Versprille B. Development and optimisation of VFA driven DEAMOX process for treatment of strong nitrogeneous anaerobic effluents // Wat. Sci. Technol. 2008. V. 57 (3). P. 323-328.

96. Kalyuzhnyi S., Gladchenko M. DEAMOX New microbiological process of nitrogen removal from strong nitrogenous wastewater // Desalination. 2009. V. 248. P. 783-793.

97. Kartal B., Rattray J., van Niftrik L., van de Vossenberg J., Schmid M.C., Webb R.I.,

98. Schouten S., Fuerst J.A., Damstle J.S., Jetten M.S.M., Strous M. Candidatus "Anammoxoglobus propionicus" a new propionate oxidizing species of anaerobic ammonium oxidizing bacteria// Syst. Appl. Microbiol. 2007. V. 30(1). P. 39-49.

99. Kartal B., Kuenen J.G., van Loosdrecht M.C.M. Sewage treatment with Anammox // Science. 2010. V. 328. P. 702-704.

100. Kartal B., Tan N.C.G., Van de Briezen E., Kampschreur M.J., Loosdrecht M.C.M., Jetten M.S.M. Effect of nitric oxide on anammox bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2010. V. 76(18). P. 6304- 6306.

101. Kato M.T., Field J.A., Lettinga G. Methanogenesis in Granular Sludge Exposed to Oxygen//FEMS Microbiol. Lett. 1993. V. 114. P. 317-324.

102. Kato M.T., Field J.A., Lettinga G. Anaerobe tolerance to oxygen and the potentials of anaerobic and aerobic cocultures for wastewater treatment // Braz. J. Chem. Eng. 1997. V. 14 (4).

103. Kotsyurbenko O.R., Glagolev M.V., Nozhevnikova A.N., Conrad R. Competition between homoacetogenic bacteria and methanogenic archaea for hydrogen at low temperature // FEMS Microb.Ecol. 2001. V. 38. P. 153-159.

104. Kuenen J.G., Jetten M.S.M. Extraordinary anaerobic ammonium oxidizing bacteria // ASM News. 2001. V. 67. P. 456-463.

105. Kuenen J.G. Anammox bacteria: from discovery to application // Nature reviews Microbiology. 2008. V. 6. P. 320-326.

106. Kuypers M.M.M., Sliekers A.O., Lavik G., Schmid M., Jorgensen B.B., Kuenen J.G., Sinninghe Damstle J.S., Strous M., Jetten M.S.M. Anaerobic ammonium oxidation by anammox bacteria in the Black Sea //Nature. 2003. V. 422 (6932). P. 608-611.

107. Kuypers M.M.M., Lavik G., Woebken D., Schmid M., Fuchs B.M., Amann R., Barker Jorgensen B., Jetten M.S.M. Massive nitrogen loss from the Benguela upwelling system through anaerobic ammonium oxidation // PNAS. 2005. V. 102 (18). P. 64786483.

108. Lane D.J. 16S/23S sequencing // In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics / Stackebrandt E. a. Goodfellow M. (Eds.). Chichester: John Wiley & Sons, Ltd., 1991. P. 115-175.

109. Lens P.N., De Poorter M.-P., Cronenberg C.C., Verstraete W.H. Sulfate reducing and methane producing bacteria in aerobic wastewater treatment // Water Research. 1995. V. 29 (3). P. 871-880.

110. Lettinga G., van Velsen A.F.M., Hobma S.W., De Zeeuw W., Klapwijk A. Use of upflow sludge blanket reactor concept for biological waste water treatment, especially for anaerobic treatment // Biotechnol. Bioengineer. 1980. V. 22. P. 699-734.

111. Lettinga G., Hobma S.W., Hulshoff Pol L.W., de Zeeuw W., de Jong P., Grin P., Roersma R. Design, Operation and Economy of Anaerobic Treatment // Wat. Sei. Tech. 1983. V. 15. P. 177-195.

112. Liang Z., Liu J. Landfill leachate treatment with a novel process: Anaerobic ammonium oxidation (Anammox) combined with soil infiltration system // Journal of Hazardous Materials. 2008. V. 151. P. 2102-212.

113. Liao D., Li X., Yang Q., Zhao Z., Zeng G. Enrichment and granulation of Anammox biomass started up with methanogenic granular sludge // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2007. V. 23. P. 1015-1020.

114. Lindsay M.R., Webb R.I., Strous M., Jetten M.S., Butler M.K., Forde M.J., Fuerst J.A. Cell compartmentalization in planctomycetes: novel type of structural organization for the bacterial cell //Arch. Microbiol. 2001. V. 175(6). P. 413-429.

115. Liu S.X. Food and agricultural wastewater utilization and treatment // Wiley-Blackwell ISBN: 0813814235. 2007. 296 p.

116. Logemann S., Schantl J., Bijvank S., van Loostdrecht M.C.M., Kuenen J.G., Jetten M.S.M. Molecular microbial diversity in a nitrifying reactor system without sludge retention // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. V. 27. P. 239-249.

117. Mah R.A., Ward D.M., Baresi L., Glass T.L. Biogenesis of methane // Ann. Rev. Microbiol. 1977. V. 31. P. 309-341.

118. Meyer H. Leistungsfähigkeit anaerober Reaktoren zur Industrieabwasserreinigung II Hannover: Veröffentlichungen des Institutes für Siedlungswasserwirtschaft und Abfalltechnik der Universität Hannover. 2004. Heft 128. 112 p.

119. Mulder A., van de Graaf A.A., Robertson L.A., Kuenen J.G. Anaerobic ammoniumoxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor // FEMS Microbial Ecol. 1995. V. 16(3). P. 177-184.

120. Neef A., Amann R., Schlesner H., Schleifer K-H. Monitoring a widespread bacterial group: in situ detection of planctomycetes with 16S rRNA-targeted probes // Microbiology. 1998. V. 144. P. 3257-3266.

121. Ni S.-Q., Lee P.-H., Fessehaie A., Gao B.-Y., Sung S. Enrichment and biofilm formation of anammox bacteria in a non-woven membrane reactor // Bioresource Technology. 2010. V. 101 (6). P. 1792-1799.

122. Panton C.R. Anaerobic ammonium oxidation (Anammox) // In: Permafrost soils, Soil Biology 16 Margesin R. (ed) Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 2009. P. 149 -158.

123. Pollice A., Tandoi V., Lestingi C. Influence of aeration and sludge retention time on ammonium oxidation to nitrite and nitrate // Water Res. 2002. V. 36 (10). P. 25412546.

124. Pynaert K., Smets B.F., Beheydt D., Verstraete W. Start-up of autotrophic nitrogen removal reactors via sequential biocatalyst addition // Environ. Sci. Technol. 2004. V. 38(4). P. 1228-1235.

125. Reginatto V., Teixeira R.M., Pereira F., Schmidell W., Jr. Furigo A., Menes R., Etchebehere C., Soares H.M. Anaerobic ammonium oxidation in a bioreactor treating slaughterhouse wastewater // Braz. J. Chem. Eng. 2005. V. 22 (14). P. 593-600.

126. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electronmicroscopy // J. Cell. Biol. 1963. V. 17. P. 208-213.

127. Rysgaad S., Glud R.N., Rysgaad-Petersen N., Dalsgaard T. Denitrification and anammox activity in Arctic marine sediments // Limnol. Oceanogr. 2004. V. 39. P.1493-1499.

128. Saaki Y., Iwabuchi C., Katami A., Kitagawa Y. Microbial analyses by fluorescence in situ hybridization of well settled granular sludge in brewery wastewater treatment plants // J. Biosci. Bioeng. 2002. V. 93. P. 601-609.

129. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 1977. V. 84 P. 5463-5467.

130. XAl.SchinkB. Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. V. 61. P. 262-280.

131. Schmidt I., Sliekers O., Schmid M., Bock E., Fuerst J., Kuenen J.G., Jetten M.S.M., Strous M. New concepts of microbial treatment for the nitrogen removal in wasterwater // FEMS Microbiol. Rew. 2003. V. 27. P. 481-492.

132. Shimamura M., Nishiyama T., Shigetomo H., Toyomoto T., Kawahara Y., Furukawa

133. K, Fujii T. Isolation of a multiheme protein from an anaerobic ammonium-oxidizing enrichment culture with features of a hydrazine-oxidizing enzyme // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P.1065-1072.

134. Simankova M.V., Kotsyurbenko O.R., Lueders T., Nozhevnikova A.N., Wagner B., Conrad R., Friedrich M. W. Isolation and description of the new strains of methanogens from different cold habitats // Syst.Appl.Microbiol. 2003. V. 26. P. 312-318.

135. Sinninghe Damste J.S., Strous M, Rijpstra W.I.C., Hopmans E.C., Geenevasen J.A.J., Van Duin A.C.T., Van Niftrik L.A. Linearly concatenated cyclobutane lipids form a dense bacterial membrane //Nature. 2002. V. 419. P. 708-712.

136. Sirianuntapiboon S., Jeeyachok N., Larplai R. Sequencing batch reactor biofilm system for treatment of milk industry wastewater // J. Environ. Manage. 2005. V. 76 (2). P. 177-183.

137. Sliekers A.O., Derwort N., Gomez J.L.C., Strous M., Kuenen J.G., Jetten M.S.M. Completely autotrophic nitrogen removal over nitrite in one single reactor // Water Res. 2002. V. 36. P. 2475-2482.

138. Sliekers A.O., Third K.A., Abma W., Kuenen J.G., Jetten M.S.M. CANON and Anammox in a gas-lift reactor // FEMS Microbiol. Lett. 2003. V. 218 (2). P. 339-344.

139. Stahl D.A., Amann R. Development and application of nucleic acid probes // Ed. Stackebrandt E., Goodfellow M., Nucleic acid techniques in bacterial systematic. New York, N.Y: John Wiley & Sons, Inc. 1991. P. 205-248.

140. Strous M., van Gerven E., Zheng P., Kuenen J.G., Jetten M.S.M. Ammonium removal from concentrated waste streams with the anaerobic ammonium oxidation (ANAMMOX) process in different reactor configurations // Water Res. 1997. V. 31 (8). P. 1955-1962.

141. Strous M., Heijen J.J., Kuenen J.G., Jetten M.S.M. The sequencing batch reactor as a powerful tool for the study of slowly growing anaerobic ammonium-oxidizing microorganism // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 50. P. 589-596.

142. Strous M., Fuerst J.A., Kramer E.H., Logemann S., Muyzer G., van de Pas-Schoonen K.T., Webb R., Kuenen J.R., Jetten M.S. Missing lithotroph identified as new planctomycete //Nature. 1999. V. 400. P. 446-449.

143. Strous M., Kuenen J.G., Jetten M.S.M. Key physiology of anaerobic ammonium oxidation // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65 (7). P. 3248-3250.

144. Strous M., Kuenen J.G., Fuerst J.A., Wagner M., Jetten M.S.M. The anammox case a new manifesto for microbiological eco-physiology // Antonie van Leeuwenhoek. 2002. V. 81. P. 693-702.

145. Tal Y., Schreier S.B., Watts J.E., Sowers K.A., Schreier H.J. Characterization of the biofilter microbial community associated with a closed recirculated aquaculture system //Aquaculture. 2003. V. 215. P. 187-189.

146. Tang C., Zheng P., Mahmood Q. Start-up and inhibition analysis of anammox process seeded with anaerobic granular sludge // Chen J. 2009. V. 36. P. 1083-1100.

147. Tay J.H., Ivanov V., Pan S., Tay S.T.L. Specific layers in aerobically grown microbial granules // Lett. Appl. Microbiol. 2002. V. 34. P. 254-257.

148. Thamdrup B., Dalsgaard T. Production of N2 through anaerobic ammonium oxidation coupled to nitrate reduction in marine sediment // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V.68 (3). P. 1312-1318.

149. Third K.A., Paxman A.O.J., Schmid M., Strous M, Jetten M.S.M., Cord-Ruwish R. Enrichment of Anammox from activated sludge and its application in the CANON process // Microb. Ecol. 2005. V. 49 (2). P. 236-244.

150. Tijhuis L., Van Benthum W.A.J., Van Loosdrecht M.C.M., Heijnen J.J. Solids retention time in spherical biofilms in a biofilm airlift suspension reactor // Biotechnol. Bioeng. 1994. V. 44. P. 867-879.

151. Toh S.K, Ashbolt N.J. Adaptation of anaerobic ammonium-oxidising consortium to synthetic coke-ovens wastewater // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 59 (2-3). P. 344-352.

152. Toh S.K., Webb R.I., Ashbolt N.J. Enrichment of autotrophic anaerobic ammonium-oxidizing consortia from various wastewaters // Microb. Ecol. 2002. V. 43 (1). P. 154167.

153. Trigo C., Campos J.L., Garrido J.M., Méndez R. Start-up of the Anammox process in a membrane bioreactor // J. Biotechnol. 2006. V. 126 (4). P. 475-487.

154. Trimmer M., Nichols J.C., Deflandre B. Anaerobic Ammonium Oxidation Measured in Sediments along the Thames Estuary, United Kingdom // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P.6447-6455.

155. Vogels, G.D., Keltjens J.T., Van Der Drift C. Biochemistry of methane production // In

156. Zehnder A.J.B. Biology of anaerobic microorganisms. New York: Wiley. 1988. P. 707-770.

157. Volcke E.I.P., van Loosdrecht M.C.M., Vanrolleghem P.A. Controlling the nitrite:ammonium ratio in a SHARON reactor in view of its coupling with an Anammox process // Water Sci. Technol. 2006. V. 53 (4-5). P. 45-54.

158. Waki M., Tokutomi T., Yokoyama H., Tanaka Y. Nitrogen removal from animal waste treatment water by Anammox enrichment // Bioresource Technol. 2007. V. 98 (14). P. 2775-2780.

159. Wang J.L., Yang N. Partial nitrification under limited dissolved oxygen conditions // Process Biochem. 2004. V. 39 (10). P. 1223-1229.

160. Welander T., Olsson l.-E., Fasth C. Nutrient-limited biofilm pre-treatment: an efficient way to upgrade activated sludge plants for lower sludge production and improved sludge separability // Tappi J. 2002. V. 1 (4). P. 20-26.

161. Wett B. Solved up-scaling problems for implementing deammonification of rejection water// Water Sci. Technol. 2006. V. 53. P. 121-128.

162. Yan Y.G., TayJ.H. Characterization of the granulation process during UASB start-up // Water Res. 1997. V. 31 (7). P. 1573-1580.

163. Yamamoto T., Takaki K., Koyama T., Furukawa K. Novel partial nitritation treatment for anaerobic digestion liquor of swine wastewater using swim-bed technology // J. Biosci. Bioeng. 2006. V. 102 (6). P. 497-503.

164. Zehnder A.J.B, Ingvorsen K, Marti T. Microbiology of methane bacteria. // In: Hugnes D.E. et al. (Eds) Anaerobic digestion 1981, Elsevier Biomedical press, Amsterdam. 1981. P. 45-68.

165. Zehnder A.J.B., Stumm W. Geochemisty and biogeochemistry of anaerobic habitats //1.: Zehnder, A.J.B, (ed.) Biology of anaerobic microorganisms. John Wiley&Sons. New York. 1988. P. 1-38.

166. Zhang L., Zheng P., Tang C., Jin R. Anaerobic ammonium oxidation for treatment of ammonium-rich wasterwaters // J. Zhejiang Univ. Sei. B. 2008. V. 9 (5). P. 416-426.

167. Zhang S.H., Zheng P., Hua Y.M. Anammox transited from denitrification in up flow biofilm reactor//J. Environ. Sei. (China). 2004. V. 16 (6). P. 1041-1045.

168. Zhang L., Yang J., Ma J., Li Z., Fujii T., Zhang W.L., Nakashi N., Furukawa K. Treatment capability of an up-flow anammox reactor using polyethylene sponge strips as biomass carrier// J. Biosci. Bioengineering. 2010. V.110 (1). P. 72-78.

169. Zheng P., Lin F.M., Hu B.L., Chen J.S. Performance of Anammox granular sludge bed reactor started up with nitrifying granular sludge // J. Environ. Sei. (China). 2004. V. 16 (2). P. 339-342.

170. Zhu G., Jetten M., Kuschk P.S., Ettwig K.F., Yin C. Potential roles of anaerobic ammonium and methane oxidation in the nitrogen cycle of wetland ecosystems // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 86. P. 1043-1055.

171. Zita A., Hermansson M. Effects of bacterial cell surface structures and hydrophobicity on attachment to activated sludge floes // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63 (3). P. 1168-1170.

Информация о работе

Литти, Юрий Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Анаэробное окисление аммония и метаногенез в системах аэробной очистки сточных вод с иммобилизацией микроорганизмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы